Спосіб одержання вакцини проти колібактеріозу молодняка сільськогосподарських тварин

Способ получения вакцины против колибактериоза молодняка сельскохозяйственных животных, включающий использование штаммов - продуцентов адгезивного антигена К99, веществ, содержащих адгезивный антиген К88, и термолабильного энтероток сина, культивирование в жидкой питательной среде, получение свободных от бактериальных клеток адгезивных антигенов и термолабильного знтеротоксина, последующую инактивацию антигенов формалином и объединение полученных компонентов, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что дополнительно используют штаммы - продуценты адгезивных антигенов Att25, 987P, F41 и термостабильного знтеротоксина, в качестве веществ, содержащих адгезивный антиген К88, используют сероварианты К88ас, К88ас, K88ad, а в качестве жидкой питательной среды - бульон Хоттингера, причем культивирование штаммов - продуцентов адгезивных антигенов осуществляют до накопления биомассы с концентрацией 50 • 109 100* 1019 бакт./мл, из которой выделяют адгезивные антигены, инактивируют их 0,4% раствором формалина и обьединяют с коньюгированным энтеротоксином, полученным из штаммов - продуцентов термолабильного и термостабильного энтеротоксинов в соотношении 1:0,5-2. Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности, к способам получения вакцин против колибактериоза молодняка с.-х. животных и может найти широкое применение на предприятиях биологической промышленности при производстве вакцинных препаратов для профилактики колибактериоза. Колибактериоз - широко распространенное во всем мире инфекционное заболевание молодняка сельскохозяйственных животных, проявляющееся в виде диареи, сепсиса, сопровождающееся высокой забо С > о ОС* 10812 ются от молодняка разных видов с.х. живолеваемостью, смертностью и снижением тных от 4,1 до24,3% случаев,-Art25-от 12,5 привесов у переболевших животных, до 40,5%; К88 ав - от 16,8 до 30,5%; К88 ас Наиболее близким по технической сущ-от 16,2 до38,8%; К88ad-от 10,8до 19,4%; ности является способ получения вакцины против колибактериоза поросят, включаю- 5 987Р-от2до5,4%. Термостабильный энтеротоксин продущий получение препаратов фимбрий К99, К88, термолабильного эитеротоксина, сме- цируют до 70% выделяемых от телят, поросят и ягнят штаммов Е.соІІ. шивание данных антигенов, с последующим Из этого следует, т.к. отмеченные антидобавлением к ним адъюванта - гидроокиси алюминия, Для инактивации антигенов в 10 гены не входят в состав вакцины, приготовленной по известному способу (прототипу), прототипе используется 0,5% формалина. но имеют важное патогенетическое значеИспользование фимбрий К99, К88 (одноние, то препараты не смогут обеспечивать го серотипа) и термолабильного энтеротокзащиту против энтеротоксигенных Е.соП, сина в прототипе, является совпадающими признаками с заявляемым способом. 15 несущих данные факторы патогенности. В связи с чем их иммуногенная и профилактиОсновными недостатками прототипа ческая активность ниже, чем вакцины, приявляется то, что приготовленный по данноготовленной в соответствии с заявляемым му способу препарат предназначен для исспособом. пользования лишь при профилактике колибактериоза поросят и не рекомендован 20 Использование 0,4% формалина для для специфической профилактики колибакинактивации антигенов позволяет получать териоза телят и ягнят. Кроме того, в состав стерильный, безвредный и активный препавакцины, приготовленной по известному рат. Снижение концентрации формалина до способу не входят фимбриальные адгезины 0,25% не обеспечивает полной инактивации F41, Att25, 987P, сероварианты К88 и термо- 25 компонентов, в результате чего выявляется стабильный энтерогоксин. Хотя, в тоже вре- остаточная токсичность. Повышение конмя, Е.соП, их продуцирующие играют важную центрации формалина до 0,5% - снижает патогенетическую роль в колибактериозе моантигенную активность вакционных комполодняка с.х. животных. Не использование нентов. Следовательно оптимальной конуказанных антигенов значительно снижает 30 центрацией формалина является - 0,4%. иммуногенную активность вакцины и спектр Вакцину готовят следующим образом. ее профилактического действия. Берут штаммы - продуценты адгезионных антигенов К99, F41, Att25, 987P, К88ав, Задачей изобретения является получеК88ас, K88ad (референтные или полевые ние вакцины, обеспечивающей повышение иммуногенных свойств вакцины, расшире- 35 культуры Е.соП, реагирующие в реакции агние профилактического спектра действия на глютинации со стандартными моноспециразличные разновидности возбудителей кофическими антиадгезивными сыворотками либактериоза молодняка сельскохозяйств титрах 1:320 - 1:1280 и выше) и обладаювенных животных: телят, поросят и ягнят. щие иммуногенными свойствами, засевают Поставленную задачу достигают тем, 40 в бульон Хоттингера (или любую другую сречто дополнительно используют штаммы ду, способствующую экспрессии адгезивпродуценты адгезивных антигенов Att25, ных антигенов). Культивирование проводят 987Р, F41 и термостабильного энтеротоксипри 37° - 38°С в течение 6 - 8 час. Полученна, вместо адгезивного антигена К88, исную-бульонную культуру центрифугируют пользуют его сероварианты К88ав, К88ас, 45 при 3000-5000 об/мин, в течение 30 - 40 K88ad, а в качестве жидкой питательной сремин. при температуре 4-10°С. Надосадочды - бульон Хоттингера, причем культивироную жидкость удаляют, а осадок ресуспенвание штаммов - продуцентов адгезивных дируют в 1,5-2,0 М растворе фосфатно-мочеантигенов осуществляют до накопления биеинного буфера до концентрации 50 • 109 9 омассы с концентрацией 50* 10 - loo* 10 50 100 • 10 микробных тел/мл. Полученную бакт./мл, из которой выделяют адгезивные суспензию прогревают в водяной бане при антигены, инактивируют их 0,4% раствором температуре 60 - 64°С в течение 20-25 мин. формалина и объединяют с коныогированпри периодическом встряхивании, после ченым знтеротоксином, полученным из штамго охлаждают и центрифугируют при 10000 мов - продуцентов термолабильного и 55 - 15000 об/мин, в течение 10-20 мин. термостабильного энтеротоксинов в соотНадосадочную жидкость сливают в стеношении 1:0,5-2. рильную посуду, инактивируют путем добавления 0,3 - 0,4% формалина и По обобщенным литературным данным, выдерживают при 37 - 38°С в течение суток. Знтеротоксигенные Ё.соН, экспрессирующие фимбриальные адгезины F41 выделя 10812 11 12 Таблица 2 Результаты изучения протективных свойств вакцины против колибэктериоза на ягнятах 1 8158 Ьк ягненка 2 1 Дата проведения Заражающий Заражающая Результат опыта Г> овцематки * штамм 4 264 (0 78 К80) доза острого опыта 6 Клинические признаки забо 3 февраль 1990 г 5 ' 1.5-10* левания отсутствуют, ягне3653 8729 8521 8361 8526 8521 3653 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 _ ' _ _» _ -"февраль 1991 г. -' - •~ • _ - " - " _ » _ — • — 2.0-10' -"-" 2.0 -109 264(078К80) 3.0 Ю 9 866 (09 Ж?) 3,0 Ю' 264 264 866 264 866 264 264 866 нок здоров _ - 3.0 Ю 9 1.5-10» 3,0- 10 е 3.0 Ю 9 2.О-109 -"_-_ --_ " _ -*_ « _ 2,0 Ю 9 3,0-10 9 3,0-10' -*- * 3.0-10 9 Продолжение табл 1 1 2 3 4 Контрольная группа 264 февраль 1990 г. 5 6 1.5-10* Сильная диарея, повышение Сильная диарея, повышение 8722 1 8110 2 _ *_ 264 2.0 10 9 8158 3 февраль Т991 г. 866 2,0-10 9 температуры, пал на 3 сутки температуры, пал на 2 сутки Сильная диарея, температура повышена, общее угнетение. После дачи жома, молозива начал выздоравливать 4 -" 866 3.0-10 9 Состояние общего угнетения, сильная диарея. обезвоживание, пал на 3 сут ки 6144 1 апрель 1991 г. 866 (09:К?.ЛТ) 30 Ю 9 Клинические признаки заболевания отсутствуют, теле 6116 2 1926 1 1029 2 -•Конт рольная группа 866(09:К?:ЛТ) . апрель 1991 г. -' нок здоров _ »_ ЗО-10а Сильная диарея, обезвоживание, пал на вторые сутки -" -" Сильная диарея, общее угнетение, пал на третьи сут ки 10812 10 путем использования одного биологичеПредложенная вакцина найдет примеского препарата с высокими иммуногеннынение в неблагополучных по колибактериоми свойствами, что подчеркивает его зу хозяйствах и позволит снизить перспективность и экономическую эффекзаболеваемость новорожденных животных тивность. 5 колибактериозом. \ Таблица! Результаты определения специфических антител в сыворотках крови и молозива овец и ягнят, иммунизированных и неиммунизированных вакциной против колибактериозэ Исследуемый материал К99 F41 Титры антител к адгезивным антигенам и энтеротоксинам К88ав K88ad 987 Р | Att25 К88ас Токсин опытная группа N: 1 кровь овец до иммунизации кровь через 21 д после 2-ой иммунизации молозиво после окота кровь ягнят через 24 ч после рождения кровь овцематок молозиво после окота кровь ягнят через 24 ч после рождения 1:45 1:3 0 1-35 1.40 1:18 1:18 0 1:1760 1:12960 1:400 1:640 1:6400 1:12800 1:3840 1:6720 1.5120 1:4160 1 2320 1:7040 1:440 1:1680 1:3 1:3 1:1792 1:768 1:4224 1:1344 1:448 1:4 1:84 1:160 1:4 VM 1:18 1:20 1:8 1:80 1:16 0 0 1:48 V.5 1:41 1:18 1:3 0 1:7168 1:5376 контрольная rpvnna fsb 1:82 1:26 1:42 У.Ю 16 1:22 1:50 Продолжение табл. 1 Исследуемый материал К99 F41 Титры антител к адгезивным антигенам и энтеротоксинам 987 Р Att25 Шав K88ad К88ас Токсин опытная группа № 2 кровь овец до иммунизации кровь через 21 л после 2-ой иммунизации молозиво после окота кровь ягнят через 24 ч после рождения кровь овцематок молозиво после окота кровь ягнят через 24 ч после рождения 1:25 1:377 1:178 1:365 1:288 1:302 1:7 0 V.503 1:1280 1:13897 1:18432 1:4388 1:7680 1:13166 1:18432 1:9371 1:15360 1:20480 1-.20480 1:366 1:28В 1:2 V.4 1:1442 1:13368 1:4978 1:19342 1:338 1:4 V.16 1:27 1:60 1:60 1:80 1:40 1:160 1:80 1:10 1:10 0 0 1:20 1:105 1:80 У.90 V.W