Антибіотик широкого спектру дії

Застосування адсорбенту на основі полімеру вінілпіролідону як антибіотика широкого спектру дії. (19) (21) 97105112 (22) 20.10.1997 (24) 15.11.2000 (33) UA (46) 15.11.2000, Бюл. № 6, 2000 р. (72) Бех Микола Дмитрович, Дем'яненко Василь Васильович, Климнюк Сергій Іванович, Малярчук Ганна Романівна 29915 Очевидно, при наявності високих сорбційних властивостей у молекул взаємодіючої з мікроорганізмом речовини остання здатна проявити значну антимікробну активність: мікробна клітина з заблокованою адсорбентом поверхневою мембраною (оболонкою) втрачає можливість мобілізувати захисні механізми й, перш за все, синтезувати специфічний по відношенню до адсорбенту руйнуючий його фермент. А активація системи комплементу щойноутвореним макромолекулярним комплексом адсорбент-мікроб довершує процес незворотного порушення внутрішньоклітинного метаболізму мікроорганізму, зумовлюючи його наступну руйнацію та елімінацію з організму [6]. Виходячи з визнання фундаментальності основних закономірностей поверхневих явищ [7] і припущення про те, що поверхня адсорбенту має незрівнянно більшу площу, ніж та, що її має адсорбат, наприклад, мікробна клітина, і що діють тільки адитивні дисперсійні сили, можна погодитись, що загальна енергія взаємодії при адсорбції (Vадс) визначається сумою енергій взаємодіючої структурної одиниці адсорбата, наприклад, у вигляді окремої мікробної клітини, з усіма атомами адсорбенту. Енергія взаємодії адсорбата з усіма молекулами адсорбенту при цьому описується формулою: Vадс = - p Cn /(6 x 3 ) , де: х - віддаль між адсорбованою структурною одиницею, наприклад, окремим мікробом, і поверхнею сорбенту; n - число атомів (молекул) в одиниці об'єму адсорбенту; С - константа, яка визначається за відповідними для кожного ефекту формулами. З наведеної формули видно, що енергія притяжіння при дисперсії убуває із збільшенням віддалі, але Vадс залежить від віддалі х всього лише в третій степені замість шостої, як це було б при взаємодії мікробної клітини лише з одним атомом адсорбенту. Така залежність вказує на більш повільне зменшення енергії при адсорбції, на властивість адсорбційних сил поширювати свій вплив на значну відстань та на зв'язок адсорбції з властивостями адсорбованих молекул - мікробних клітин і сорбенту. Наведені аргументи свідчать про доцільність використання речовин з властивостями адсорбенту в ролі антибіотика. Особливо слід прийняти до уваги здатність молекул адсорбентів приєднувати активні форми кисню, що забезпечує оксигенованим сорбентам при контакті з токсинами інактивацію останніх [8]. З врахуванням відомої властивості активних форм кисню стимулювати макрофаги, тучні клітини і нейтрофільні лейкоцити з наступним вивільненням біологічно активних сполук, здатних посилювати протеоліз, стає очевидною можливість посилювати антимікробну (за рахунок мобілізації механізмів імунокомпетентної системи макроорганізму) і антитоксичну (шляхом оксидантної інактивації молекул токсичних речовин) активність антибіотика-адсорбента. Поставлена мета досягається тим, що сировиною для отримання антибіотика беруть синтетичний полімер вінілпірролідона, антибіотична активність якого здійснюється шляхом адсорбції мікробних клітин і їх токсинів, а посилення антимікробної і антитоксичної активності синтетичного антибіотика здійснюють шляхом попередньої обробки його активними формами кисню. При цьому збагачення антибіотика активними формами кисню здійснюють шляхом дії на речовину енергією оптичного випромінювання в ультрафіолетовій області спектру: під впливом ультрафіолетових променів з молекул води водяної пари утворюються активні форми кисню [9]: hv 2O 2 ¾¾ ® O * + O 2 ® O 3 + O . ¾ 2 Молекулярний (О2), синглетний збуджений (О2*) і атомарний кисень (О) та озон (О3) модифікують детермінантні групи полімерної макромолекули в напрямку підвищення її сорбційної активності, очевидно, за рахунок розриву її численних водневих зв'язків. При цьому адсорбований на молекулі полівінілпірролідона активний кисень забезпечує стійкий антимікробний ефект за рахунок: 1) адсорбції і блокування детермінантних груп функціональних мембранних стр уктур на поверхні мікробної клітини; 2) прямої оксидантної дії на ліпідні компоненти мембран мікроорганізмів [10]. з пошкодженням структури мікробної клітини і блокадою її захисних механізмів; 3) денатурації молекул нуклеїнових кислот за рахунок розриву водневих зв'язків між ланцюгами спіралей [11], блокуючи глибинні процеси життєдіяльності мікроорганізму. Важливими в зазначеному аспекті є сорбційні властивості води, а також здатність енергії оптичного випромінювання в ультрафіолетовій області спектру потенціювати явища гідросорбції, перш за все, за рахунок утворення при фотогідролізі вільних водневих зв'язків [7, 12], здатних посилювати адсорбційну активність полівінілпірролідону у водному розчині. Ультрафіолетове опромінення антибіотика проводили за допомогою пристрою, загальний вигляд якого представлений на кресленні. Пристрій складається з джерела ультрафіолетових променів у вигляді розрядної трубки 1, виготовленої із кварцового скла, та індуктора 2, вставлених в заглиблення кришки 4 опромінювальної кювети 3. На внутрішній поверхні кришки 4 розміщена кругова виїмка 5 для закріплення пористого гігроскопічного матеріалу, наприклад, у вигляді поролонової смужки 6, яку перед опроміненням зволожують водою. Потужність ультрафіолетового випромінювання 5 Вт, довжина хвилі: l1maх=194,8 нм (6%), l2maх=253,7 нм (80%). Конкретно збагачення макромолекул полімеру вінілпірролідону активними формами кисню шляхом впливу на субстрат ультрафіолетовими променями здійснюють у такий спосіб. В скляну кювету 3 вносять субстрат у вигляді порошкоподібного полімеру вінілпірролідону або його водного розчину з то вщиною шар у 10-15 мм, зволожують кругову смужку поролону 6 дистильованою водою (джерело водяної пари), накривають кришкою 4 і вводять опромінювач в заглибину кришки 4. З допомогою індуктора 2 збуджують розряд в трубці 1 і опромінюють шар субстрату 7 на протязі 10-15 хвилин. Властивість антибіотика оцінювали по антимікробній дії на виділенні з клінічного матеріалу від хворих 80 штамів патогенних мікроорганізмів по критерію мінімальної пригнічуючої концентрації (МПК) антибіотиків за методикою серійних розведень [13]. 2 29915 Для цього готували ряди серійних розведень полівінілпірролідону в м'ясо-пептонному бульйоні, починаючи з концентрації 250 мг/мл: в одному ряду - інтактний досліджуваний антибіотик – полівінілпірролідон, в другому - опромінений. В кожну пробірку засівали по 20 тис. мікробних тіл в 0,2 мл. Посіви інкубували на протязі доби при 37°С, після чого визначали мінімальну пригнічуючу концентрацію. Після висіву вмісту пробірок, де не було росту мікробів, на чашки Петрі з м'ясо-пептонним агаром визначали мінімальну бактерицидну концентрацію (МБцК) препарату. В табл. 1 наведені результати мікробіологічних досліджень бактеріостатичної і бактерицидної активності інтактного і фотоактивованого полівінілпірролідону щодо патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів. З наведених в табл. 1 даних видно, що інтактний полівінілпірролідон в різних дозах забезпечував в основному лише бактеріостатичну дію, а бактерицидний ефект мав місце лише по відношеннню до двох видів мікроорганізмів з 8 (25%). При цьому забезпечення бактерицидної дії по відношенню до білого стафілококу (S. epidermidis) вимагало збільшення дози інтактного полівінілпірролідону більше як в 4 рази. Навпаки, опромінений полівінілпірролідон забезпечував не тільки бактеріостатичну, але й виражену бактерицидну дію на сім із восьми видів мікроорганізмів (87,5%), причому співвідношення доз антибіотика для забезпечення бактеріостатичного і бактерицидного ефектів становить у всіх дослідах 1:2. Незважаючи на те, що опромінений полівінілпірролідон не виявив бактерицидної дії по відношенню до синєгнійної палички (Ps. aeruginosa), його бактеріостатична активність зросла в два рази. Фотоактивований полівінілпірролідон посилює антимікробну активність інших антибіотиків не менше, як в два рази, про що свідчать результати досліджень, наведені в табл. 2. З наведених в табл. 2 даних видно, що в найбільшій мірі фотоактивований полівінілпірролідон посилював антимікробну дію оксацикліну по відношенню до золотистого стафілокока (S. aureus) у 8 разів, до білого стафілококу (S. epidermidis), клебсієли (Klebsiella) і синєгнійної палички (Ps. аeruginosa) - в 4 рази. В такій же мірі посилювалася бактерицидна дія біфеніколу по відношенню до клебсієли (Klebsiella) і синєгнійної палички (Ps. aeruginosa). Також у 4 рази посилювався бактерицидний ефект ампіциліну на протея (P. vulgaris) і кишечну паличку (Е. соlі), клебсієлу (Klebsiella), синєгнійну паличку (Ps. aeruginosa) і цитробактер (Citrobacter pps.). Очевидно, цей ефект можна поставити в залежність від сорбційних властивостей молекул полівінілпірролідону, які також посилюються під впливом ультрафіолетового опромінення: внаслідок деформації поверхневих оболонок адсорбентом мікробна клітина з заблокованим внутрішньоклітинним метаболізмом стає більш чутливою до пошкоджуючого впливу іншого антибіотика. Оптимальні умови фотоактивації субстрату полімеру вінілпірролідону, а саме: тривалість опромінення і товщина шару в кюветі, були визначені експериментально відповідно до конкретних параметрів опромінювальної кювети і опромінюва ча за критерієм мінімальної пригнічуючої концентрації по відношенню до 10 штамів золотистого стафілококу (S. aureus). Результати представлені в табл. 3. Як видно з наведених в табл. 3 даних, оптимальними умовами фотоактивації полівінілпірролідону незалежно від вихідного стану субстрату порошкового чи в розчині в конкретних умовах фізичного впливу ультрафіолетового випромінювання слід визнати такі: тривалість впливу 10-15 хвилин при товщині шару субстрату 10-15 мм. Отже, речовина - полімер вінілпірролідону в результаті ультрафіолетового опромінення крім посилення бактеріостатичних набуває виражених бактерицидних властивостей. Приклад застосування способу 1 серія. В одну скляну кювету внесли субстрат у вигляді порошкоподібного полімеру вінілпірролідону, а в другу кювету - водний розчин полівінілпірролідону з товщиною шару 10-15 мм. В скляній кюветі з порошком полівінілпірролідону зволожили кругову смужку поролону дистильованою водою для забезпечення пароутворення, накривали кришкою, вводили опромінювач, збуджували розряд і опромінювали субстрат на протязі 10-15 хвилин. Властивість антибіотика - фото активованого полівінілпірролідону - оцінювали за його антимікробною дією на виділенні з клінічного матеріалу від хворих штамів патогенних мікроорганізмів, а саме золотистого стафілокока (S. aureus), білого стафілокока (S. epidermidis) та протея (P. mirabilis) за критерієм мінімальної пригнічуючої концентрації антибіотиків по методиці серійних розведень [13]. Для цього готували ряди серійних розведень полівінілпірролідону в м'ясо-пептонному бульйоні, починаючи з концентрації 250 мг/мл: в одному ряду інтактний полівінілпірролідон, в другому – опромінений порошкоподібний, в третьому - опромінений в розчиненому стані. В четвертому ряду готували розведення речовини з антимікробною активністю - сормантолу - як контроль по відношенню до інтактного полівінілпірролідону. В кожну пробірку засівали по 20 тис. мікробних тіл в 0,2 мл. Посіви інкубували на протязі доби при 37°С, після чого визначали мінімальну пригнічуючу концентрацію. Шляхом висіву вмісту пробірок, де не було росту мікробів, на чашки Петрі з м'ясо-пептонним агаром визначали мінімальну бактерицидну концентрацію препарату. Результати мікробіологічних досліджень наведені в табл. 4-6. З наведених прикладів видно, що фото активований полівінілпірролідон має більш високу антимікробну активність порівняно з інтактним. Так, МПК опроміненого полімеру для досягнення бактеріостатичного ефекту по відношенню до патогенних стафілококів вдвоє менша, ніж у інтактного полівінілпірролідону. Фотоактивований полімер викликає бактерицидний ефект в концентраціях, які не можуть забезпечити аналогічного ефекту при використанні інтактного полівінілпірролідону. Антимікробна активність полімерного антибіотика, як і усіх інших відомих антибіотиків, в неоднаковій мірі проявляється по відношенню до різних видів мікроорганізмів. На рівень антимікробної активності полімеру вінілпірролідону впливає спосіб (технологія) його фотоактивації. Так, для досягнення бактерицидно 3 29915 го ефекту (в наведеному прикладі - по відношенню до білого стафілокока (S. epidermidis) вимагається вдвічі менше антибіотика при фотоактивації його в розчиненому стані порівняно з порошком. Серія 2. Визначали спільну антимікробну активність фото активованого полівінілпірролідону в комбінації з іншими антибіотиками, а саме: стрептоміцином сульфатом, оксацилліном натрію і ампіоксом натрію, для чого готували паралельні ряди розведень з рівних співвідношень зазначених антибіотиків з фото активованим, полівінілпірролідоном та наступним засіванням мікроорганізмами (по 20 тис. мікробних тіл в 0,2 мл). Посіви інкубували на протязі доби при 37°С, після чого визначали мінімальну пригнічуючу концентрацію. Результати досліджень наведені в табл. 7-9. Результати наведених прикладів свідчать про позитивний антимікробний ефект комбінованого використання фотоактивованого полімеру полівінілпірролідону з відомими антибіотиками, зокрема стрептоміцином, оксацилліном і ампіоксом, який проявляється підвищенням чутливості мікрофлори до антимікробних препаратів в 2-8 разів. З наведених прикладів видно, що активація ультрафіолетовими променями молекул полімеру вінілпірролідону у порошковому стані чи розчині надає препарату виражених властивостей антибіотика широкого спектру, які реалізуються прямою антимікробною дією, а посилення антимікробних і антитоксичних властивостей полімеру, зокрема вінілпірролідону, під впливом енергії оптичного випромінювання можна розглядати як принциповий шлях до керування активністю антибіотика як такого. Принцип збагачення макромолекул синтетичного сорбенту-антибіотика активними формами кисню на основі фотофізичної та фотохімічної обробки може започаткувати новий напрям у виробництві та використанні антибіотиків, основною відмінністю якого стало б створення і використання в широкій медичній і ветеринарній практиці антибіотиків комплексної (антимікробної і антитоксичної) дії з керованим рівнем активності. Перспективність даного технічного рішення стає більш окресленою з зазначенням позитивного впливу трансфузій фотоактивованого полівінілпірролідону на реологічні властивості крові [14], що суттєво підвищує цінність застосування винаходу в комплексному ліку ванні складної патології, наприклад, поширених і глибоких опіків, тяжких травматичних поражень та ін., особливо, при наданні медичної допомоги в районах сти хійних лих і катастроф. Джерела інформації 1. Антибіотики. Под ред. П.Н. Кашкина и Н.П. Блинова. - Л., 1970. 2. Гров Д.С. и Рендалл В.А. Руководство по лабораторным методам исследования антибиотиков. - М., 1958, БМЗ., 1975. - Т. 1. - С. 5-15. 3. Попкиров С.Т. Основные принципы лечения местной и общей хир ургической инфекции. Клин. хирургия. - 1980. - № 1. - С. 4. 4. Norman Sigurd. Function of the reticuloendothelial system. Evidence for two types of particle-induced reticuloendothelial paralysis. "Infect. and immun", 1970, 1, № 4. - P. 327-333. 5. Вершигора А.Е. Основы иммунологии: Руководство, - 2-е изд., испр. и доп. – К.: Ви ща школа, 1980. - 540 с. 6. Фролов Ю.Г. Курс коллоидной химии. Поверхностные явления и дисперсные системы. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Химия, 1988. - 464 с. 7. Способ получения углеродного сорбента / А.с. СССР № 1607121 (1990). 8. Мешков В.В. Основы светотехники. - М.: Энергия, 1979. - Ч. 1. - С. 283-297. 9. Проблеми космической биологии / Под ред. акад. В.Н. Черниговского. Действие гипербарической среды на организм человека и животных. - М.: Наука, 1980. – Т. 39. - С. 90-129. 10. Ашмарин И.П. Молекулярная биология. Избранные разделы / Изд-во 11. Лениградского ун-та. Л: 1974. - С. 44-46. 12. Дем'яненко В.В., Бех М.Д., С.М. Дем'яненко, С.І. Стародуб, І.І. Мельник / Фізико-хімічні основи методу фото потенційованої гідроентеросорбції // Актуальні питання клінічної і експериментальної медицини. Тези наук. конф. - Тернопіль, 1994. С. 43-44. 13. Навашин М.Н., Фомина И.П. Справочник по антибиотикам. – М., 1988. 14. Демьяненко В.В., Ульянычев Н.В., Саушев С.В. и др. Потенцирование реологических свойств кровезаменителя общим ультрафиолетовым облучением организма. / Кровезаменители в комбустиологии и интенсивной терапии. Межвуз. сб. Науч. тр. Саранск. Изд-во Мордов. ун-та, 1983. - C. 5-6. 4 29915 Таблиця 1 Антимікробна активність інтактного і фотоактивованого полівінілпірролідону Вид мікроорганізмів S. aureus S. epidermidis P. mirabilis P. vulgaris E. coli Citrobacter spp. Klebsiella spp. Ps. aemgmosa Мінімальна концентрація полівінілпірролідона інтактного опроміненого бакт.-стат. бакт.-цидн. бакт.-стат. бакт.-цидн. 12,50±0,04 6,25±0,06 12,50±0,01 1,50±0,02 6,25±0,03 0,78±0,07 1,50±0,03 6,25±0,15 6,25±0,05 12,50±0,10 6,25±0,07 6,25±0,10 І2,50±0,08 12,50±0,08 6,25±0,00 12,50±0,08 6,25±0,05 12,50±0,05 6,25±0,09 12,50±0,10 12,50±0,09 6,25±0,07 12,50±0,10 12,50±0,06 6,25±0,03 Таблиця 2 Антимікробна активність фотоактивованого полівінілпірролідону в комбінації з іншими антибіотиками бензилВид збудника пеніцил. ант. пвп* S. aureus 3.8 1.9 S. epidermidis 3.8 1.9 P. mirabilis 61.5 15.3 P. vulgaris 125 61.5 E. coli 30.7 15.4 Citrobacter 15.4 7.69 Klebsieila 8000 4000 Ps. aeruginosa 8000 4000 Мінімальна пригнічуюча концентрація, мкг/мл стрептомі- канаміцин Ампіцилін біфенікол оксацилін ампіокс цин ант. пвп* ант. пвп* ант. пвп* ант. пвп* ант. пвп* ант. пвп* 1.9 1.0 562 281 250 31.2 3.12 1.56 3.9 1.95 15.6 7.8 1.25 61.5 140 70 62.5 15.8 3.12 1.56 3.9 1.95 31.2 15.8 3.8 1.9 562 284 2000 1000 100 25 500 250 15.8 7.8 7.69 1.9 280 140 2000 1000 100 25 250 125 15.8 7.8 15.4 3.8 140 70 125 62.5 5.25 3.12 15.6 3.9 15.8 7.8 7.69 1.9 35 17.5 62.5 31.2 6.25 3.12 7.8 3.9 15.8 7.8 2000 500 1000 250 4000 1000 2000 400 1000 500 4000 2000 2000 500 5000 1125 4000 1000 2000 800 1000 500 4000 2000 Умовні позначення: ант - інтактний антибіотик; пвп* - фотоактивований полівінілпірролідон. Таблиця 3 Залежність антимікробної активності фотоактивованого полівінілпірролідону від умов ультрафіолетового опромінення по відношенню до S. aureus, Х±s, n=10, Р