Спосіб вимірювання електрохемілюмінесцентних явищ, спосіб визначення речовини, що аналізують, та реактив

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ измерения электрохемилюминесцентных явлений в растворе или на твердой фазе, граничащей с раствором, в результате приведения в контакт способного к электрохемилюминесценции компонента с окисляемым амином и подачи электрического напряжения для индукции электрохемилюминесценции и обнаружения электромагнитного излучения, отличающийся тем, что раствор содержит детергент (моющее средство), выбранный из группы этоксилатов спирта жирного ряда, плантарена и октилглюкозида или их смеси.

2. Способ по пункту 1, отличающийся тем, что в качестве этоксилата спирта жирного ряда применяется полидоканол, С14-Е09, генапол или С8-Е09.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что раствор содержит один или несколько щелочных или щелочноземельных галогенидов.

4. Способ по любому из пунктов 1-3, отличающийся тем, что величина рН раствора находится между 6,5 и 9,0.

5. Способ по любому из пунктов 1-4, отличающийся тем, что электрохемилюминесценция возбуждается в результате подачи напряжения прямоугольной формы максимально 2,2 вольта или максимальное напряжение рампы 3,0 вольта.

6. Способ определения анализируемого вещества по одному из пунктов 1-5, отличающийся тем, что способный к электрохемилюминесценции компонент - это маркировка анализируемого вещества, аналога анализируемого вещества или специфического для анализа вещества, причем обнаруживаемое излучение представляет собой критерий для присутствия анализируемого вещества.

7. Реактив, представляющий собой раствор для измерения электрохимических явлений, содержащий окисляемый электрохимическим способом амин, который в окисленном состоянии представляет собой сильный восстановитель, отличающийся тем, что содержится детергент, выбранный из группы этоксилата спирта жирного ряда, плантарена и октилглюкозида или их смеси.

8. Реактив по п. 1, отличающийся тем, что детергент содержится в концентрации от 0,001 до 1%.

9. Реактив по п. 7 или 8, отличающийся тем, что дополнительно содержится щелочной хлорид в концентрации от 0,05 ммоль/л до 0,5 моль/л.

10. Реактив по любому из пунктов 7-9, отличающийся тем, что он имеет рН между 6,5 и 9,0.

Текст

1 Способ измерения электрохемилюминесцентных явлений в растворе или на твердой фазе, граничащей с раствором, в результате приведения в контакт способного к электрохемилюминесценции компонента с окисляемым амином и подачи электрического напряжения для индукции электрохемилюминесценции и обнаружения электромагнитного излучения, отличающийся тем, что раствор содержит детергент (моющее средство), выбранный из группы этоксилатов спирта жирного ряда, плантарена и октилглюкозида или их смеси 2 Способ по пункту 1, отличающийся тем, что в качестве этоксилата спирта жирного ряда применяется полидоканол, С14-Е09, генапол или С8 Е09 3 Способ по п 1 или 2, отличающийся тем, что раствор содержит один или несколько щелочных или щелочноземельных галогенидов 4 Способ по любому из пунктов 1-3, отличающийся тем, что величина рН раствора находится между 6,5 и 9,0 5 Способ по любому из пунктов 1-4, отличающийся тем, что электрохемилюминесценция возбуждается в результате подачи напряжения прямоугольной формы максимально 2,2 вольта или максимальное напряжение рампы 3,0 вольта 6 Способ определения анализируемого вещества по одному из пунктов 1-5, отличающийся тем, что способный к электрохемилюминесценции компонент - это маркировка анализируемого вещества, аналога анализируемого вещества или специфического для анализа вещества, причем обнаруживаемое излучение представляет собой критерий для присутствия анализируемого вещества 7 Реактив, представляющий собой раствор для измерения электрохимических явлений, содержащий окисляемый электрохимическим способом амин, который в окисленном состоянии представляет собой сильный восстановитель, отличающийся тем, что содержится детергент, выбранный из группы этоксилата спирта жирного ряда, плантарена и октилглюкозида или их смеси 8 Реактив по п 1, отличающийся тем, что детергент содержится в концентрации от 0,001 до 1% 9 Реактив по п 7 или 8, отличающийся тем, что дополнительно содержится щелочной хлорид в концентрации от 0,05ммоль/л до 0,5моль/л 10 Реактив по любому из пунктов 7-9, отличающийся тем, что он имеет рН между 6,5 и 9,0 Предмет данного изобретения - это способы для измерения электрохемилюминесцентных явлений, способов определения анализируемого вещества посредством таких способов, реактивы в виде растворов, которые могут быть использованы в этих способах, и аппарат, особенно пригодный для осуществления такого способа Способы измерения электрохемилюминесцентных явлений известны в течение нескольких лет В таких способах используется способность специальных комплексов металлов попадать в результате окисления в такое состояние, из которого они при выделении электромагнитного излучения снова впадают в нормальное (основное) О ю 44245 состояние Такие способы и пригодные для этого электрод), которые во время измерения находятся комплексы металлов описаны, например, в WO в контакте с раствором реактивов, и один детек86/ 02734 тор для измерения производимого посредством электрохемилюминесценции света В общем, в Эта технология постоянно усовершенствоваэтих способах сначала к раствору подается вылась в публикации WO 90/ 05296 к составу пробы ходное напряжение (преполяризация добавляют амин, предпочтительно трипропила/подготовительная поляризация) После этого это мин, который в окисленной форме представляет напряжение повышается через окислительнособой сильный восстановитель Электрохимичевосстановительный потенциал содержащегося в ская реакция происходит в электролите, в котором растворе вещества, например, амина Посредстостаток электрохемилюминесценции (ECL), т е вом окисляемого в результате этого вещества комплекс металлов, способный к электромагнитматериал, способный к хемилюминесценции, наному излучению, и амин могут окисляться Как пример, определенные рутениевые комплексы, соответствующий электролит в водном растворе возбуждаются для излучения света Свет, улавлиописывается фосфатный буфер при рН-величине ваемый детектором в течение определенного 6 - 9, преимущественно 7 - 7,5 времени, - это и есть мера (критерий) для присутВ WO 90/ 05302 к этому составу пробы для ствия определенного количества электрохемилюповышения электромагнитного излучения добавминесцентного материала Поскольку при наличии ляют моющее средство (детергент) тритон X - 100 электрохемилюминесцэнтного материала речь или тритон № 401 В WO 90/ 05411 описано усоидет о маркировке для анализируемого вещества, вершенствование аппарата для измерения элеканалога анализируемого вещества или специфитрохемилюминесценции ческого для анализа веществу, например, в иммуДалее удалось использовать технологию опно-анализе, то принимаемый свет - это критерий ределения (обнаружения) анализируемого вещедля присутствия, анализируемого вещества ства в результате того, что маркировки электрохемилюминесценции на анализируемых Оказалось, что известное из публикации WO веществах, аналогах анализируемых веществ или 90/ 05302 и обычно добавляемое до настоящего на веществах, специфических для анализа, были времени моющее средство тритон X -100, которое соединены Электрохемилюминесценцию примена практике в большинстве случаев использованяли для определения количества присутствуюлось в сочетании с моющим средством "твин" ( щего испытуемого вещества В частности были Tween) - 20, не является оптимальным С одной описаны такие иммуно-анализы, в которых обычстороны, тритон X - 100 плохо расщепляется и, ные маркировки заменены на электрохемилюмиследовательно, неблагоприятно переносится окнесцентные маркировки ружающей средой С другой стороны, неожиданным образом выяснилось, что совершенно опреДальнейшие усовершенствования и случаи деленные другие моющие средства (детергенты) применения этой технологии описаны в публикапо сравнению с тритон X - 100 способствуют усоциях WO 87/ 06706, WO 89/ 04392, WO 89/ 10552, вершенствованию электрохемилюминесцентного WO 89/10551, WO 90/ 05301 и WO 90/11511 Расспособа С помощью этих специальных моющих крытия в названных публикациях имеют предпосредств обеспечивается повышенный выход сигсылку в нижеследующем изложении налов лучшее соотношение сигнал/шум и, таким Задача настоящего изобретения заключалась образом, повышенная чувствительность способа в том, чтобы усовершенствовать предварительно определения и понижение нижнего предела обнаизвестные способы, особенно относительно чувружения, а также лучшая точность ствительности определений анализируемых веществ, которые возможны с помощью технологии электрохемилюминесценции Предметом данного изобретения является способ измерения электрохимических явлений в растворе или на твердой фазе, граничащей с раствором При этом такой раствор содержит моющее средство (детергент), выбранный из группы этоксилатов спирта жирного ряда, "плантарена" и октилглюкозида или смеси из этих веществ Далее предмет данного изобретения - это способ определения анализируемого вещества с помощью этих способов, а также соответствующие реактивы для осуществления названного способа В предмете изобретения речь идет о техническом решении, созданном на вышеназванном уровне техники Общие основы электрохимических люминесцентных способов подробно описаны в этом уровне техники Приборы для осуществления измерений электрохемилюминесценции содержат измерительный узел с емкостью для раствора реактивов, по меньшей мере, два электрода (один рабочий и один противоположный Для указанной задачи пригодными оказались моющие средства, выбранные из группы этоксилатов спирта жирного ряда, среди которых, например, следует понимать полидоканол (додецилполи-(этиленгликольэфир)п), С 14 Е09 (поли(этиленгликоль-эфир)п), геналол (изотридецил-поли (этиленгликольэфир)п), С 8 - Е09 (октанол-поли (этиленгликольэфир)п), плантарен® (алкилполиглюкозид) и октилглюкозид (октил-бета-Dглюкопиранозид) или смесь из них Моющие средства используются в концентрациях от 0,001 до 1,0% Наиболее пригодная концентрация может быть легко определена для каждого моющего средства Концентрации от 0,1 до 0,5% оказались наиболее пригодными Для консервации до сих пор к составу пробы добавляли азид натрия обычно в концентрации 5 - 10мм Оказалось, что этот вредный для окружающей среды реагент можно заменить биобаном, или оксабаном, которые в значительной мере благоприятнее для окружающей среды, чем азид Неожиданным образом обнаружилось, что эти консерванты оказывают дальнейший положитель 44245 6 генидов в концентрации от 0,05ммол/л до 0,5мол/л в растворе Предпочтительно используется хлорид натрия Вышеназванные меры сами по себе приводят уже к значительным усовершенствованиям известного способа Помимо этого, однако, в особенно значительной степени может быть повышена чувствительность и/или динамический диапазон измерения определения анализируемого вещества в результате комбинации этих мер Повышение чувствительности определения анализируемых веществ, например, в иммунопробах, как по сэндвичевому или по конкурентному способу, позволяет дальнейшие упрощения способа или применяемых аппаратов Например, теперь возможно как детектор применять фотодиод, упрощать калибрацию системы, из-за незначительного времени измерения при повышенном сигнале увеличивать число проведенных тестов за единицу времени или уменьшать объемы проб Точно также предметом данного изобретения является раствор реактивов для измерения электрохимических явлений и в частности для определения анализируемого вещества, содержащего окисляемый электрохимическим способом амин, который в окисленном состоянии представляет собой сильный восстановитель, который содержит моющее средство, выбранное из группы этоксилатов спирта жирного ряда, "плантарена" и "октилглюкозида" или смесь из них Дополнительно может Оказалось, что предпочтительным концевое содержаться еще щелочной хлорид в концентравыгодным напряжение прямоугольной формы по ции от 0,1ммол/л до 0,5мол/л, и/или рН - величина сравнению с Ag (AgCI), подаваемое на рабочий может находиться в пределах между 6,8 - 8,0 Даэлектрод, ограничить до максимальной величины лее могут содержаться еще обычные добавки, как, между окислительно-восстановительным потеннапример, буферные вещества, стабилизаторы и циалом окисляемого вещества и 2,2 вольт Осоконсерванты бенно предпочтительным является напряжение в пределах между 1,2 - 2,2 вольт Особенно предРаствор реактивов подлежит консервации попочтительны 1,4 вольт Эти величины действисредством биобана или оксабана тельны для применения платиновой или золотой Аппарат для осуществления определения попары электродов средством электрохемилюминесценции подробно описан, например, в примере 1 публикации WO В случае если подается обычное до сих пор 90/ 05302 Аппарат, помимо этого, может содернапряжение рампы, например, напряжение между жать средство для охлаждения измерительного фазами (или линейное напряжение при соединеузла и/или емкости для жидкости до температур в нии треугольником), то концевое напряжение (по пределах между 0 - 25°С, если способ должен сравнению с Ag/ AgCI) ограничивается до максибыть осуществлен при этих низких температурах мальной величины 3,0 вольт Как измерительный узел здесь следует понимать Неожиданным образом можно было достичь ячейку, в которой осуществляется измерение также повышения сигнала в ходе того, что напряэлектролюминесценции Под емкостью для жиджение на выходе перед возбуждением электрохекости можно понимать сборник или однако ввод, милюминесценции составляло на рабочем элекнапример, шланг, для раствора реактивов, имеютроде между + 400 и - 400/ mV/ мв, по сравнению щегося во время измерения в измерительс Ag/ AgCI - электродом Особенно предпочтином узле тельной является величина в пределах между + Омв и + 200мв Также и здесь действительны веТакже предметом изобретения является споличины для применения пары платиновых или соб определения анализируемого вещества позолотых электродов Потенциалы для других масредством электрохемилюминесцентной маркитериалов электродов могут быть легко рассчировки При этом применяется один из таны вышеназванных способов измерения электрохемилюминесцентных явлений Точно также и повышение сигнала можно рассчитать в результате регулирования рН - величиСледующие примеры должны пояснить данны между 6,5 - 9,0, предпочтительно 6,5 - 7,5, ное изобретение более подробно особенно предпочтительно 6,8 Это происходит Пример 1 надлежащим образом благодаря применению рН В (одной) серии опытов был установлен эфбуфера, пригодного для этого диапазона , Дополфект используемых согласно изобретению моюнительно могут содержаться еще один или нещих средств (детергентов) Для того чтобы можно сколько щелочных или щелочноземельных галобыло определить влияние моющих средств на ный эффект на электрохемилюминесцентный способ По сравнению с азидом наблюдается повышение измерительного сигнала Оксабан и биобан используются при этом в концентрациях от 0,01 до 1%, предпочтительно 0,1 до 0,5% Предложенный способ измерения электрохимических явлений в растворе или на граничащей с раствором твердой фазе может быть осуществлен при температурах, находящихся выше точки замерзания раствора, но ниже чем 40°С Дальнейшее улучшение чувствительности может быть достигнуто в ходе того, что на измерительный узел подается напряжение, прохождение которого по времени - прямоугольно Это означает, что исходя из напряжения, на выходе осуществляется непосредственный подъем напряжения (в течение максимально 0,4 секунд) до напряжения на конце Для времени возбуждения это напряжение поддерживается в основном постоянным Спустя это время, напряжение снова возвращается непосредственно до напряжения ниже окислительно-восстановительного потенциала системы В результате этих мер получается, кроме того, расширение динамического диапазона измерения, то есть того диапазона, в пределах которого могут быть измерены концентрации анализируемого вещества определенной иммуно-пробы На случай низких температур предпочтительна солевая добавка образование сигналов по возможности независимо от отдельных параметров теста, т е к определенным анализируемым веществам, использовались покрытые стрептавидиновой оболочкой магнитные частицы, на которых было соединено биотинилированное и одновременно рутенилированное антитело (HSAP "hot-Streptavidin-Partikel" горячие частицы стрептавидина) Для измерения использовали аппарат, каким он описан в примере 1 публикации WO 90/ 05302, который далее в измерительной ячейке содержал постоянный магнит (Ongen 1,0 от IJEN, Rockville, USA или Magnalyber) (магнитный анализатор) Этот инструмент содержит далее фотоэлектронный умножитель, стабилизатор напряжения, электрохимическую расходную ячейку, средство для передачи жидкости и пробный (испытательный) ротор для 50 туб Для определения соединяли в одной тубе HSAP (лиофилизированные HSAP растворяли в трис / полидоканол-буфере (ЮтМ, 0,1%) рН 9,0, так что получался рабочий раствор в количестве 600гд/мл) 50rl PBS - буфер (50тМ КН2РО4, ЮОтМ NaCI, 0,1% RSA, рН 7,0) 200ГІ Раствор реактивов (200ntM KH2PO4 - буфер, ЮОтМ ТРА, рН 7,5, соответственно испытанный реактив) Эту смесь добавляли пипеткой в измерительную тубу, а затем переводили в измерительную ячейку HSAP промывали буфером (АВ) и в этом буфере измеряли выход сигналов Применяемое антитело биотинилировали посредством биотин-DDS (биотинил-амино-3,6диоксаоктаноил-амиинокарбонил-гептановая кислота-Ы-оксисукцинимид-эфира) (Трис) (2',2'бипиридил) рутенийхлоридгексагидрат связывали 44245 8 с помощью DSS/06157 (дисукцинилсуберат) с антителом Магнитные частицы, покрытые стрептавидиновой оболочкой, были получены от фирмы "Deretsche Dynal GMBH" ("Дойче Динал ГмбХ"), Германия (Dynabeads М-280 Streptavidm) Буфер (АВ), который применяли при измерении, имел следующий состав КН2РО4 * 2Н20 0,2М КОН 0.076М NaCI 0,05mM ТРА (трипропила0,1М мин) в концентрациях, Моющее средство указанных в таблице Оксабан/биобан 0,1 /0,3% 7,5 рН Как контроль использовали обычные до сих пор моющие средства Tween 20 (твин 20) и тритон X -100 соответственно в концентрации 0,05% Для сравнения в таблице 1 выход сигнала, полученный посредством этого моющего средства, рассматривали как 100% Как следующую величину измерения определяли неспецифический выход сигнала в буфере (АВ) и таким образом устанавливали отношение выхода сигнала HSAB / АВ Это отношение между выходом сигнала с HSAP и без HSAP представляет собой хороший признак для чувствительности теста Из результатов таблицы 1 ясно можно увидеть, что предложенные моющие средства (детергенты) являются наиболее подходящими, Полидоканол и С8 - Е09 показывают наилучшее влияние на отношение HSAP/ АВ Другие моющие средства по сравнению с твнни^нтои X 100 вызывают ухудшение выхода сигнала Таблица 1 Испытанные моющие средства для электрохемилюминесцентного (ECL) испытания - буфер электрод BPt З РМТ 700в 0,05% 0,05% 0,1% 0,4% 0,2% 0,1% 0,05% 0,4% 0,2% 0,1% 0,05% 0,4% 0,2% 0,1% 0,05% 0,025% 0,2% 0,2% 0,1% 0,05% 0,2% Детергент в буфере HSAP (%) твин 100 тритон полидоканол 295,1 С14-Е09 289,2 С14-Е09 346,2 С14-Е09 382 С14-Е09 402,5 генапол 360,1 генапол 377,2 генапол 386,5 генапол 361,5 С8 - Е09 481,4 С8 - Е09 402 плантарен 219,1 плантарен 270,6 плантарен 295,3 октил глюкозид 286,8 Не пригодные для использования детергенты твин 20 106,9 твин 20 114,9 твин 20 124,8 тритон Х-100 62,6 HSAP / АВ(%) 100 414,5 292,8 308,2 343,4 342,4 117,8 129,6 126 140,1 530,3 394,7 200,7 276,3 292,1 390,8 176,3 184,5 213,2 68,8 9 0,1% 0,05% 0,2% 0,05% 0,2% 0,1% 0,2% 0,1% 0,2% 0,1% 10 44245 тритон Х - 1 0 0 тритон Х - 1 0 0 С16-Е09 С16-Е09 додецил-мальтозид додецил-мальтозид SDS SDS ралуфон 3 - 1 4 ралуфон 3 - 1 4 83 115,6 17,3 50 17,7 46,9 4,1 22,9 27,3 27,8 154,3 195,4 36,8 98 50 112,5 5,6 32,9 29 31,3 Обозначение использованных детергентов С8 - Е09 С14-Е09 С16-Е09 Додецилмальтозид Генапол Октил глюкозид Плантарен Ралуфон 3 - 1 4 SDS Полидоканол Тритон Х - 1 0 0 Твин (Tween) октанолполи (этиленгликолевыи эфир)п поли (этиленгликолевыи эфир)п цетилполи (этиленгликолевыи эфир)п додецил-р-О-глюкопиранозил (1 - > 4) - a -D - глюкопиранозид изотридецилполи (этиленгликолевыи эфир)п октил-р-О-глюкопиранозид алкилполиглюкозиды (С14-С16) n-тетрадецил-п, п-диметил-З-амино-1-пропансульфонат содийлаурилсульфат додецилполи (этиленгликолевыи эфир)п октилфенолполи (этиленгликолевыи эфир) п поли (окскэтилен) п-сорбитан-монолаурат Пример 2 На примере не зависимого от параметров теста (HSAP) воспроизводится действие температуры ячейки на нахождение сигнала и динамику на случаи напряжения рампы при 28 - 35°С в измерительной ячейке в зависимости от NaCI Этот тест был осуществлен, как показано в Примере 1 Вместо буфера (АВ) применяли буфер BMJ 2 со следующим составом, Н3Р04 0,2М Полидоканол 0,1% Оксабан 0,1% Трипропиламин 0,16М КОН 0,12М рН NaCI 6,8 концентрация, указанная в таблице Результаты представлены в таблице 2 В результате повышения температуры и концентрации соли увеличиваются электрохемилюминесцентные (ECL) сигналы, которые были получены с помощью буфера (BMJ 2) только лишь и с помощью HSAP Отношения HSAP / АВ, HSAP / FC и FC / АВ почти независимы от температуры, во зависимы от концентрации соли Таблица 2 а) Температурно / солевая зависимость ECL - сигнала Температура, °С Концентрация соли BMJ2 FC HSAP HSAP/BMJ 2 HSAP/FC FC / BMJ 2 Концентрация соли BMJ 2 FC HSAP HSAP/BMJ 2 HSAP/FC FC / BMJ 2 Концентрация соли BMJ 2 FC HSAP 28 NaCI 0% 2479 4378 3160000 1257 722 1,77 NaCI 0,2% 1963 5072 3940000 2007 777 2,58 NaCI 0,9% 2208 5280 5130000 30 NaCI 0% 2111 3426 2550000 1208 744 1,62 NaCI 0,2% 2169 4281 4030000 1858 941 1,97 NaCI 0,9% 2367 4954 5940000 35 NaCI 0% 3165 6856 3610000 1141 626 2,17 NaCI 0,2% 2930 4137 4450000 1519 1076 1,41 NaCI 0,9% 3610 7487 6940000 11 HSAP/BMJ 2 HSAP/FC FC / BMJ 2 Концентрация соли BMJ 2 FC HSAP HSAP/BMJ 2 HSAP/FC FC / BMJ 2 Температура, °С Концентрация соли BMJ 2 FC HSAP HSAP/BMJ 2 HSAP/FC FC / BMJ 2 Концентрация соли BMJ 2 FC HSAP HSAP/BMJ 2 HSAP/FC FC / BMJ 2 Концентрация соли BMJ 2 FC HSAP HSAP/BMJ 2 HSAP/FC FC / BMJ 2 Концентрация соли BMJ 2 FC HSAP HSAP/BMJ 2 HSAP/FC FC / BMJ 2 BMJ 2 44245 2323 2510 972 1199 2,39 2,09 NaCI 1,8% NaCI 1,8% 2691 2970 5805 6129 4200000 4750000 1561 1599 724 775 2,16 2,06 в) Оценка в % в расчете на 28°С, 0% NaCI 28 30 NaCI 0% NaCI 0% 100,0 85,2 100,0 78,3 100,0 80,7 100,0 94,8 100,0 103,1 100,0 91,9 NaCI 0,2% NaCI 0,2% 79,2 87,5 115,9 97,8 124,7 127,5 157,5 145,8 107,6 130,4 146,3 111,8 NaCI 0,9% NaCI 0,9% 89,1 95,5 120,6 113,2 162,3 188,0 182,3 196,9 134,6 166,1 135,4 118,5 NaCI 1,8% NaCI 1,8% 108,6 119,6 132,6 140,0 132,9 150,3 122,4 125,5 100,2 107,4 122,1 116,9 контроль посредством буфера пробы BMJ 2 контроль посредством свободFC ного конъюгата (связи) (биотинилированное и рутенилированное антитело) горячие частицы стрептавидиHSAP на Понижение температуры ниже 20°С требует добавки щелочного хлорида и рН-величины Реактив КН 2 РО 4 х 2Н2О Н3РО4 Детергент Консервант Трипропиламин КОН рН і ;> 1927 927 2,06 NaCI 1,8% 4453 6507 5830000 1309 896 1,46 35 NaCI 0% 127,7 156,6 114,2 89,5 72,9 122,7 NaCI 0,2% 118,2 94,5 140,8 119,1 149,0 80,0 NaCI 0,9% 145,3 171,0 219,6 151,2 128,4 117,7 NaCI 1,8% 179,6 148,6 184,5 102,7 124,1 82,7 предпочтительно 7,25 - 7,75 Пример 3 Определение Тз На примере иммуно-анализа для определения трийодтиронина (Тз) предложенный состав теста BMJ 1 сравнивается с составом теста уровня техники (BMJ 0) Растворы реактивов имеют следующий состав BMJ0 0,2М тритон Х - 100 0,005% твин (Tween) 0,05% NaN 3 7 8mM 0,1М 0.076М 7,5 BMJ 1 0,2М полидоканол 0,1% оксабан 0,1% 0,1М 0.076М 7,5 13 Следующие другие реагенты использовались HEPES - буфер 7,0 HEPES -Na рН 7,0 0,1 М 0,06% ANS 0,1% IgJ - крупного рогатого скота 0,5% Вусо (бико) 50mM NaCI РАК - RU (ругенилированное поликлонарное антитело) (Трис) (2,2' -бипиридил) рутенийхлоридгексагидрат, связанный посредством DDS с РАК против Тз в HEPES - буфере 7,0 100нг/мл HP - BI (Тз-полигаптен биотинилированный) РН РАК К - IgJ (DE) ВОС - Т3 - ІВі в HEPES буфере 7,0 600нг/мл Пробы стандарт а - е концентрация Тз а 0,24нг/мл в 0,88нг/мл с 1,90нг/мл d 3,05нг/мл е 6,65нг/мл 3 сыворотка человека 2 сыворотка человека без (с 500мг/дц гемоглобина (Нв) Магнитные частицы, покрытые оболочкой из стрептавидина 44245 14 Dynabeads М - 280 Streptavidm (Дшабеадс М 280 Стрептавидин (Deutsche Dynal GMBH, Германия) "Дойче Динал ГмбХ" в HEPES - буфере 7,0 600мкг/мл Для (проведения) определения были соединены PAK-RU 50мкл (re) Dynabeads M - 280 50мкл Проба ЗОмкл РН - Bi 50мкл BMJ 0 или 1 500мкл Эту смесь инкубировали в течение 16 минут при температуре 28°С, после этого переводили в измерительную ячейку с поддерживаемой равномерной температурой до 28°С, а частицы промывали с помощью BMJ 0 или 1, в зависимости от композиции теста, и осуществляли в ней измерение Было подано напряжение рампы между фазами Напряжение измерения составляло 0,565в, а РМТ720мв Результаты представлены в таблице 3 Оказалось, что нарушение гемоглобина, которое можно наблюдать в BMJ 0, предотвращается в BMJ 1 Нижний предел обнаружения не испытывает никакого влияния Таблица 3 BMJ0 0,Знг/мл 100% 307% UNJ (2J) человеческая сыворотка без гемоглобина человеческая сыворотка с гемоглобином UNJ (2J) = нижний предел обнаружения Пример 4 Определение HBJ Ад Предложенный состав теста BMJ 1 испытывали по сравнению с BMJ 0 на примере сэндвичевого иммуно-анализа для обнаружения HBJ Ag BMJ 0 и 1 имели составы, указанные в Примере 3 Следующие реактивы использовались HEPES - буфер рН7,5 HEPES - Na 0.05M сывороточный альбумин крупного рогатого скота 1% генаполХ080 0,1% IgJ - крупного рогатого скота (R) 0,1% IgM - мыши 10мкг/мл САМ (хлорацетамид) 0,1% MIT (метилизотиазолон) 0,01% АК - Bi (антитело, биотинилированное посредством биотин-DDS) МАК М5АЮ - IgJ -Bi (DDS) 1 7,5 в HEPES - буфере рН7,5 300нг/мл TAJ (рутенилированное антитело) МАК М5АЮ - F (ав1) 2 - BPR U (Трис) (2, 2'-бипиридил) рутенийхлоридгексагидрат, связанный посредством DDS с моноклональным антителом против HBJ 5J (F (ав1)-фрагмент) в HEPES - буфере рН7,5 500нг/мл Пробы стандарт а - h концентрация HBS Ag а ОЕ/мл b 0,22Е/мл с 0,52Е/мл d 1,08Е/мл е 2,30Е/мл f 4,50Е/мл BMJ 1 0,Знг/мл 100% 106% д Ю.ЗОЕ/мл h 22,20Е/мл Магнитные частицы, покрытые оболочкой из стрептавидина (Динабеадс) Dynabeads M - 280 стрептавидин в HEPES - буфере рН 7,5 600мкг/мл Для определения были соединены Dynabeads М - 280 50мкл (re) АК-Ві 50мкл TAJ 40м кл проба 50мкл HEPES - буфер рН7,5 20мкл BMJ 0 или 1 150мкл Эту смесь инкубировали в течение 16 минут при температуре 28°С, после этого переводили в измерительную ячейку с установившимся температурным режимом до 28°С, а частицы промывали с помощью BMJ 0 или 1 и осуществляли в ней измерение Результаты представлены в таблице 4 В результате применения BMJ 1 можно было заметно улучшить нижний предел обнаружения Также по сравнению с BMJ 0 был понижен VK (коэффициент вариации) Отношение величин стандартных проб h к а калибровочной кривой повышено при BMJ 1, в результате чего достигается лучшее дифференцирование калибровочной кривой Таблица 4 UNJ (Е/мл) BMJ0 0,21 BMJ 1 0,06 15 44245 16 онном буфере 3,0мкг/мл Стандарт h/a 40 78 TAJ VK (%) 6,9 4,3 (Трис) (2,2'-бипиридил) рутеUNJ = нижний предел обнаружения нийхлоридгексагидрат, связанVK = коэффициент вариации ный посредством DSS с МАК Пример 5 против TSH в инкубационном Определение TSH буфере 1,2м кг/мл 40ге На примере (сэндвичевого) многослойного Жидкость для проб и/или станиммуно-анализа для определения TSH (тироиддарт 50мкл стимулируемый гормон) предложенные составы Повторная суспензия / добавка теста BMJ 1 и BMJ 1 без оксабана сравнивались состава реактивов (BMJ 1) ЮОмкл по отношению к составу теста согласно уровню Эту смесь инкубировали в течение 16 минут техники BMJ 0 MBJ 0 и 1 имели состав, описанпри комнатной температуре (21 °С), а после этого ный в примере 3 переводили в измерительную ячейку, доведенСтимулируемый тироидом гормон (TSH) опные до желаемой температуры измерения, имределяли посредством сэндвичевого иммуномобилизующие частицы промывали раствором анализа Для осуществления (определения) исреактивов BMJ 1 и измеряли в BMJ 1 пользовали при этом аппарат, описанный в приКак пробу применяли стандарты а - е с TSH мере 1 концентрациями Для определения были соединены a OrU/ml инкубационный буфер (содерb 0,39rU/ml жащий 6,06г/л (Трис) Tns х HCI с 3,54rU/ml 1г/л хлорацетамида, 0,1 г/л меd 12,4rU/ml тил изотиазолон, рН8,0, 50г/л e 44,3rU/ml сывороточный альбумин, Юг/л R - IgJ) 50мкл Результаты отражены в таблице 5 Благодаря (использованию) BMJ 1 по сравнению с BMJ 0 Магнитные частицы, покрытые достигается лучший предел обнаружения В рестрептавидиновой оболочкой зультате применения консерванта оксабана ниж(динал, 2,8мкм) в инкубационний предел обнаружения снижается еще Одноном буфере 600мкг/мл 40ге значно в обоих примерах (BMJ 1 + / - оксабан) биотинилированное посредсттакже улучшается вариационный коэффициент вом DSS (дисукцинидил суберат) моноклональное антитело (МАК) против TSH в инкубаци40ге Таблица 5 UNJ(2J) (mill/ml) VK (%) BMJO 0,049 3,35 BMJ 1 0,028 2,28 BMJ 1 без оксабана 0,041 2,38 Сокращения имеют названные в примере 4 значения ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90

Дивитися

Додаткова інформація

МПК / Мітки

МПК: G01N 27/42, G01N 21/76, G01N 33/58, G01N 33/533, G01N 21/66, G01N 33/536, G01N 27/416, G01N 33/531, G01N 21/78, G01N 33/52, G01N 33/532

Мітки: визначення, вимірювання, електрохемілюмінесцентних, аналізують, спосіб, явищ, речовини, реактив

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/8-44245-sposib-vimiryuvannya-elektrokhemilyuminescentnikh-yavishh-sposib-viznachennya-rechovini-shho-analizuyut-ta-reaktiv.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб вимірювання електрохемілюмінесцентних явищ, спосіб визначення речовини, що аналізують, та реактив</a>

Подібні патенти