Вакцини проти живого вірусу prrs з низькою патогенністю і способи їх одержання

1 Вакцина, яка вміщує вірус Північноамериканського свинячого репродуктивного та респіраторного синдрому і який має позначення ATCC VR2509 2 Вакцина згідно з п 1, яка відрізняється тим, що вірус є живий 3 Вакцина згідно з п 1, яка відрізняється тим, що доза вакцини містить від 104 до 108 БУО 4 Спосіб імунізації свині проти Північноамериканського свинячого репродуктивного та респіраторного синдрому, який включає етапи уведення свині вакцини згідно з п 1 5 Спосіб згідно з п 4, який відрізняється тим, що вірус є живий 6 Спосіб згідно з п 4, який відрізняється тим, що свиня є зрілою свиноматкою-виробником 7 Спосіб згідно з п 4, який відрізняється тим, що свиня є поросям 8 Спосіб згідно з п 4, який відрізняється тим, що вакцина уводиться внутрішньом'язово штраназально або перорально 9 Спосіб отримання вакцини, який включає етапи (A) отримання за допомогою тонування бляшок штаму Північно-американського вірусу PRRS, та (B) отримання вакцини із штаму, отриманого на етапі (а), у якому штам дає бляшки, які мають середній діаметр менше 2 мм, коли бляшки отримані за допомогою способу, який включає етапи (а) інфікування аліквоти клітин штамом, у якої клітини мають позначення CRL 12219, причому аліквота отримана з конфлюентного моношару клітин, підтримуваних у мінімальному головному середовищі Ігла з додаванням 3% фетальної сироватки теляти та 0,15% карбонату натрію, при цьому аліквота вміщує 1-2x10 клітин на мл мінімального головного середовища Ігла з додаванням 2% фетальної сироватки теляти та 0,15% карбонату натрію, (б) інкубації аліквоти при 37°С протягом 60 хвилин, (в) видалення шокуляту з аліквоти, (г) промивання аліквоти мінімальним головним середовищем Ігла, (д) повторного суспензування аліквоти у 5 мл 2Х мінімального головного середовища Ігла та 1,6% кип'яченого агару Noble з додаванням 250 мкг діетиламшоетил (ДЕАЕ)-декстрану, (є) розміщення аліквоти на чашки, та (ж) подальшої інкубації аліквоти при 37°С протягом 5 днів у СОг інкубаторі для отримання бляшок 10 Спосіб згідно з п 9, який відрізняється тим, що вакцина включає живий штам Північноамериканського вірусу PRRS 11 Спосіб згідно з п 9, який відрізняється тим, що спосіб отримання вакцини включає етап отримання штаму в очищеній формі 12 Спосіб згідно з п 9, який відрізняється тим, що штам має позначення ATCC VR2509 13 Вакцина, яка включає штам Північноамериканського вірусу PRRS, причому штам дає бляшки, які мають середній діаметр менше 2 мм, коли бляшки отримані за допомогою способу, який включає етапи (а) інфікування аліквоти клітин штамом, у якої клітини мають позначення CRL 12219, причому аліквота отримана з конфлюентного моношару клітин, підтримуваних у мінімальному головному середовищі Ігла з додаванням 3% фетальної сироватки теляти та 0,15% карбонату натрію, при цьому аліквота вміщує 1 — 2 x 1 0 клітин на мл мінімального головного середовища Ігла з додаванням 3% фетальної сироватки теляти та 0,15% карбонату натрію, О со го 47433 (б) інкубації аліквоти при 37°С протягом 60 хвилин, (в) видалення шокуляту з аліквоти, (г) промивання аліквоти мінімальним головним середовищем Ігла, (д) повторного суспензування аліквоти у 5 мл 2Х мінімального головного середовища Ігла та 1,6% кип'яченого агару Noble з додаванням 250 мкг діетиламшоетил (ДЕАЕ)-декстрану, (є) розміщення аліквоти на чашки, та (ж) подальшої інкубації аліквоти при 37°С протягом 5 днів у СОг інкубаторі для отримання бляшок 14 Вакцина згідно з п 13, яка відрізняється тим, що включає живий штам Північно-американського вірусу PRRS 15 Вакцина згідно з п 13, яка відрізняється тим, що штам має позначення АТСС VR2509 16 Виділений та очищений штам Північноамериканського вірусу PRRS, у якому штам має позначення АТСС VR2509 17 Штам згідно з п 16, який відрізняється тим, що штам є живий 18 Виділений та очищений штам Північноамериканського вірусу PRRS, причому штам дає бляшки, які мають середній діаметр менше 2 мм, коли бляшки отримані за допомогою способу, який включає етапи (а) інфікування аліквоти клітин штамом, у якої клітини мають позначення CRL 12219, причому аліквота отримана з конфлюентного моношару клітин, підтримуваних у мінімальному головному середовищі Ігла з додаванням 3% фетальної сироватки теляти та 0,15% карбонату натрію, при цьому алік Даний винахід широко пов'язаний з низькопатогенними живими вірусними вакцинами для уведення свиням з метою вироблення ефективного імунітету у свиней проти інфекцій вірусом репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (PRRS) Більш конкретно, винахід стосується таких живих вакцин спільно зі способами імунізації свиней проти вірусу PRRS і способами отримання таких вакцин Новий, по суті виділений і очищений вірус PRRS із низькою патогенністю, під №VR2509 доступу у базу даних АТСС, також становить частину винаходу PRRS виникнув в останні декілька років як важливе вірусне захворювання свиней PRRS викликає важку репродуктивну недостатність у вагітних свиноматок, яка виявляється у формі передчасних опоросів, збільшення КІЛЬКОСТІ мертвонароджених, муміфікованих та слабких поросят, зниженої частоти опоросів та затримки відновлення тічки На уражених фермах гострі ознаки репродуктивних розладів при PRRS у цілому продовжуються 2-4 місяця, але респіраторні симптоми захворювання можуть продовжуватися протягом багатьох років, спричиняючи значні продуктивні втрати Були опубліковані декілька досліджень патогенезу інфекції вірусом PRRS у вагітних свиноматок/підсвинків на ПІЗНІХ термінах вагітності (77-95 днів вагітності) У кожному з цих досліджень була продемонстрована спроможність вірусу PRRS викликати трансплацентарну інфекцію та патологічний стан плоду Проте у свиноматок у середні терміни вагітності патологічний стан плоду не розвивався, і плоди, інфіковані внутрішньоутробно у середні терміни вагітності, залишалися у цілому нормальними вання, але які є серологічно позитивними на PRRS Причини відсутності КЛІНІЧНИХ СИМПТОМІВ захворювання у таких випадках недостатньо зрозумілі Було висловлене припущення, що можуть існувати штами вірусу PRRS з низькою патогенністю, і що вони відповідальні за інфекції у популяції свиней, які не виявляють КЛІНІЧНИХ симптомів У польових умовах є декілька ферм, на яких не було виявлено ні гострих репродуктивних розладів, ні хронічної респіраторної форми захворю вота включає 1 — 2 x 1 0 клітин на мл мінімального головного середовища Ігла з додаванням 3% фетальної сироватки теляти та 0,15% карбонату натрію, (б) інкубації аліквоти при 37°С протягом 60 хвилин, (в) видалення шокуляту з аліквоти, (г) промивання аліквоти мінімальним головним середовищем Ігла , (д) повторного суспензування аліквоти 5 мл 2Х мінімального головного середовища Ігла та 1,6% кип'яченого агару Noble із додаванням 250 мкг діетиламіноетил (ДЕАЕ)-декстрану, (є) розміщення аліквоти на чашки, та (ж) подальшої інкубації аліквоти при 37°С протягом 5 днів у СОг інкубаторі для отримання бляшок 19 Штам згідно з п 18, який відрізняється тим, що штам є живий PRRS РІЗНІ ДОСЛІДНИКИ ПОВІДОМЛЯЛИ про ряд ІЗО ЛЯТІВ вірусу PRRS Було показано, що усі вони мають РНК та оболонки, які містять ЛІПІДИ, але не мають спроможності до гемаглютинації еритроцитів різноманітних видів тварин Даний винахід долає вказані вище проблеми і надає удосконалені живі або модифіковані живі вакцини проти PRRS для уведення свиням Вакцини винаходу включають достатню КІЛЬКІСТЬ ЖИВОГО або модифікованого живого вірусу для вироблення ефективного імунітету у свиней проти інфекції вірулентним PRRS дикого типу Використовуваний тут термін "ефективний імунітет" належить до спроможності вакцини запобігти у свиней інфекції PRRS, які викликають розвиток істотних КЛІНІЧНИХ ознак захворювання Тобто, імунізована свиня може бути або може не бути серологічне позитивною за PRRS, але у неї немає прояви будь-яких істотних КЛІНІЧНИХ симптомів У кращі форми вакцини винаходу включають новий живий вірус, позначений як MN-Hs, який був депонований в Американській колекції типових культур (АТСС), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, і йому був привласнений №VR2509 доступу у базу даних АТСС Було показано, що цей вірус є по суті авірулентним і викликає ефективний імунітет Його вакцини можна уводити свиноматкам-плідникам, підсвинкам, кабанам або відлученим поросятам, і таке уведення може здійснюватися будь-яким зручним способом, таким як 47433 внутрішньом'язова ІН'ЄКЦІЯ або пероральноштраназальне уведення У цілому, дози вакцини повинні містити від приблизно 10 4 до приблизно 10 8 одиниць вірусу, які утворюють бляшки Більш узагальнено, винахід також стосується способу отримання свинячих вакцин проти PRRS, який включає спочатку отримання за допомогою методу т о н у в а н н я бляшок штаму або ізоляту вірусу PRRS, який має середній діаметр бляшки не менше приблизно 2мм на конфлюентному газоні клітин MARC-145, та отримання живої вакцини з такого штаму ЛІНІЯ КЛІТИН MARC-145 була депонована в АТСС, і їй був привласнений № доступу у базу даних АТСС Переважно, вакцини винаходу мають по суті такий вірус з маленьким діаметром бляшки, який отриманий в очищеній формі Кращий вірус №VR2509 доступу у базу даних АТСС має такий маленький діаметр бляшки і, як вказано, є по суті цілком авірулентним, у той же час викликаючи вироблення імунітету Стислий опис креслень Фіг 1 являє собою фотографію, яка ілюструє морфологію та розмір бляшки ізоляту MN-Hs вірусу PRRS (< 2мм) на лінії клітин MARC-145, Фіг 2 являє собою фотографію, яка ілюструє морфологію, та розмір бляшки ізоляту MN-HL вірусу PRRS (3-5мм) на лінії клітин MARC145, та Фіг 3 являє собою фотографію, яка ілюструє морфологію, і розмір бляшки ізоляту MN-W вірусу PRRS (2-Змм) на лінії клітин MARC-145 Докладний опис кращого варіанта реалізації Наведені приклади подають кращі методики виділення, ідентифікації та т о н у в а н н я низькопатогенного штаму вірусу PRRS, а також кращу методику виробництва вакцин із нього, варто розуміти, що ця інформація надана тільки як ілюстрація, і ніщо в ній не варто розцінювати як обмеження загального обсягу домагань винаходу Згадані літературні джерела включені в опис як посилання Прикладі Реферат У цьому прикладі був досліджений патогенез утворюючого дрібні бляшки варіанта (MN-Hs) вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (PRRS) у вагітних свиноматок Штам MNHs спочатку т о н у в а л и з вірусу MN-H, який являє собою суміш вірусів, які утворюють дрібні та великі бляшки (MN-H) У першому експерименті для порівняння патогенності для плоду по 2 вагітні свиноматки, кожну на 86 день вагітності, штраназально інокулювали ВІДПОВІДНО M N - H S , MN-HL, польовим ізолятом (MN-W) або уводили середовище для культури клітин (контрольні) Усім свиноматкам давали можливість опороситися по закінченні їхньої вагітності, за винятком контрольних свиноматок На 7 день після інокуляції (ПІ) у інфікованих свиноматок спостерігали вірусемію, і на 14 день ПІ за допомогою реакції непрямої імунофлюоресценцм (НІФ) виявляли сероконверсію Дві свиноматки, інфіковані вірусом MN-Hs, народили 14 живих та 5 мертвих поросят, тоді як 2 свиноматки, інфіковані вірусом MN-HL, опоросилися 25 мертвими поросятами при відсутності живих поросят Дві свиноматки, інфіковані MN-W, опоросилися 10 живими та 20 мертвими поросятами У двох контрольних свиноматок при забої на 107 день вагітності було 16 нормальних плодів Вірус був виділений у 16 (66,7%) із 24 живонароджених, 9 (64,3%) із 14 мертвонароджених і 3 (12,0%) із 25 муміфікованих поросят від 6 інфікованих свиноматок У сироватці в шести з 13 мертвонароджених поросят від 4 свиноматок, інфікованих MN-HL або MN-W, титри антитіл проти вірусу PRRS були, за даними визначення за допомогою НІФ, у діапазоні від 1 16 до 1 1,024 У наступному експерименті для повторення результатів, отриманих з вірусом MN-Hs, 2 вагітних свиноматки, кожну на 86 день вагітності, інфікували ВІДПОВІДНО інтраназально MN-Hs, внутрішньом'язово MN-Hs та інтраназально другим польовим ізолятом (OVL-173), і усім свиноматкам давали можливість опороситися по закінченні їхньої вагітності Дві свиноматки, інфіковані інтраназально та внутрішньом'язово вірусом MN-Hs, опоросилися ВІДПОВІДНО 15 живими і 6 мертвими та 25 живими і 5 мертвими поросятами, тоді як 2 свиноматки, інфіковані OVL-173, народили 6 живих і 24 мертвих поросяти Ці результати свідчать про те, що серед виділених вірусів патогенність вірусу PRRS різна для плодів свиней, і штам MN-Hs вірусу PRRS являє собою слабко патогенний вірус Було встановлено, що виявлення антитіла проти вірусу PRRS у сироватці мертвонароджених поросят є способом діагностики інфекції плоду, який можна застосовувати Матеріали та методи Вірус та клітинна культура У цьому дослідженні використовувалися три різні ізоляти вірусу PRRS Ізолят MN-H був отриманий із сироватки здорового поросяти, який утримується в розпліднику, на фермі із субклінічною ознакою інфекції вірусом PRRS Спочатку вірус MN-H являв собою суміш популяцій вірусів із розмірами бляшок, які варіюють Віруси, які утворюють дрібні (MN-Hs) та великі (MN-HL) бляшки, т о н у в а л и с я окремо від вірусу MN-H, і кожний вірус чотири рази виділяли з бляшки для нового експерименту і шість додаткових разів для наступного експерименту за допомогою методу т о н у в а н н я бляшок ВІДПОВІДНО ДО Him et al Am J Vet Res , 52 1649-1652 (1991) При кожному такому пасажі бляшок конфлюентні моношари клітин MARC-145 (пермісивний т о н , отриманий із клітинної лінії нирок зеленої африканської мартишки (МА-104)) вирощували у чашках Петрі розміром 60мм х 15мм (клітини підтримували у мінімальному головному середовищі Ігла (МГС) із додаванням 3% плодової баранячої сироватки (ПБС), 0,15% карбонату натрію та антибіотиків (Кіт et al , Arch Virol , 133 477-483 (1993)) та інфікували ВІДПОВІДНИМ вірусом Культури інкубували протягом 60 хвилин при 37°С, після чого інокулят видаляли і культури одноразово промивали МГС Після ЦЬОГО у кожну чашку додавали 5мл аліквоту рідкого культурального середовища, яке складається з рівного об'єму 2Х МГС і 1,6% кип'яченого агара Noble (Disco Laboratories) з добавкою 50мкг діетіламшоетіл (ДЕАЕ)-декстрану/мл Чашки продовжували інкубувати протягом 5 днів при 37°С у СОг інкубаторі Наприкінці періоду інкубації бляшечні культури візуалізували за допомогою додавання в них Змл фізіологічного розчину з фосфатним буфером із додаванням 1 % нейтрального червоного Відібрані бляшки т о н у в а л и за допомо 47433 8 (МаггаЫе et al , J Agnc Sci, 69 443-447 (1967)) Зразки крові та легенів брали та аналізували, як описано у першому експерименті Виділення та серологія вірусу Для виділення вірусу кожний зразок сироватки або надосадової рідини легеневого гомогенату розміщали у лунках 24-лунковоі пластини і додавали клітини MARC145 (1-2х105клітин/мл), суспендовані в МГС із додаванням 3% ПБС Культури спостерігали протягом 5-7 днів для виявлення цитопатичних ефектів (ЦПЕ), типових для вірусу PRRS Планшети ДВІЧІ заморожували і відтавали, і зразки надосадової рідини інокулювали у лунках 96-лункових пластин свіжою суспензією клітин MARC- 145 і шкубували протягом 3-4 днів Дані за вірусну інфекцію досліджували за допомогою спостережень як за СПЕ, так і специфічною флюоресценцією з використанням еталонної свинячої сироватки, яка містить вірус PRRS гою взяття стерильною пастерівською піпеткою та переносу шляхом інокуляції на неінфіковані моношари клітин MARC-145 Для постійного забарвлення агар обережно видаляли і КЛІТИННІ моношари забарвлювали 2мл 1% кристалічним фіолетовим в 20% етанолі протягом 10 хв Чашки обполіскували водопровідною водою для полегшення дослідження бляшок Штам MN-W вірусу PRRS виділяли із сироватки хворих свиноматок ферми з типовими ознаками гострого PRRS, a OVL-173 одержували з Oxford Veterinary Laboratories, Worthington, MM Тварини і структура експерименту Вагітних свиноматок приблизно на 80 день вагітності одержували на фермі, де в минулому не було КЛІНІЧНИХ або серологічних даних за інфекцію вірусом PRRS Свиноматок ДВІЧІ на рік вакцинували проти свинячого парвовірусу (PPV) і видів Leptospira на фермі Одержували точні дані про дати виведення кожної свиноматки Після закупівлі кожну свиноматку тримали окремо в ізольованому помешканні в університеті Міннесоти На 86 день вагітності, кожну з двох свиноматок штраназально інокулювали ВІДПОВІДНО вірусом MN-Hs, MN-HLTa MN-W (2мл,10 55 ТСЮ5о/мл) Двох свиноматок, які залишилися, інокулювали середовищем для культури клітин і вони слугували контролем Зразки сироватки від кожної свиноматки брали через інтервали часу для виділення вірусу та серологічного дослідження Шести інфікованим свиноматкам дали можливість опороситися природним шляхом, а двох контрольних свиноматок забивали на 107 день вагітності для дослідження плодів Після опоросу для виділення вірусу та серологічного дослідження брали зразки крові та легенів живих та мертвонароджених поросят та рідини із грудної порожнини в муміфікованих плодів У другому експерименті перед інокуляцією вірус MN-Hs шість додаткових разів виділяли з бляшок Двох вагітних свиноматок, на 86 день вагітності кожну, штраназально інокулювали MN-Hs та штраназально іншим польовим ізолятом (OVL-173), і усім свиноматкам давали можливість опороситися по закінченні термінів їх вагітності Після опоросу в муміфікованих або мертвонароджених плодів вимірювали вшцеву-крижову довжину для оцінки часу смерті Сироватку від свиноматок та поросят випробували на наявність антитіл за допомогою реакції непрямої імунофлюоресценцм (НІФ) (Yoon et al , JVetDiag Invest,, 4 144-147 (1992)), 96-лункові пластини, які тестують, готували з використанням ЛІНІЙ клітин MARC-145 Деякі зразки сироватки випробували на наявність антитіл проти PPV (вірусу прогресуючої пневмонії овець) за допомогою тесту придушення гемаглютинації (HL), як описано раніше (Joo et al , Aust Vet J , 52 422-424(1976)) Результати При початковому виділенні ізоляти вірусу PRRS давали різні розміри бляшки Ізолят MN-H по розміру їхньої бляшки тонували на дві різні популяції MN-Hs та MN-HL Після тонування ВІДПОВІДНІ розміри MN-Hs і MN-HL, СТІЙКО знаходилися в діапазоні від < 2мм до 3-5мм у діаметрі, тоді як ці розміри в MN-W складали 2-Змм (див фігури) Крім незначної анорексм, виявленої у свиноматок 112 і 153 протягом 5 днів після інокуляції (ПІ), у свиноматок після інфекції ізолятами вірусу PRRS не спостерігалися виражені КЛІНІЧНІ ознаки Вірус виділяли зі зразків сироватки у шести із шести свиноматок через сім днів ПІ та в однієї із шести свиноматок через 14 днів ПІ Як наведено у таблиці 1, у всіх інфікованих свиноматок через 14 днів ПІ були виявлені високі титри антитіл Таблиця 1 Віремія та імунна реакція у вагітних свиноматок при 86-денній вагітності після експериментальної інфекції ізолятами вірусу PRRS Свиноматка № 17 53 Інфекція вірусом MN-Hs MN-Hs Дні ПІСЛЯ інокуляції 0 -/-а -/ Вірус виділяли у одного або більше плодів у кожного приплоду інфікованих свиноматок Результати виділення вірусу в окремих поросят від шести інфікованих свиноматок в експерименті 1 показали, що приблизно половина досліджуваних плодів (28 із 63 поросят) була позитивною по виділенню вірусу Серед поросят, досліджуваних на присутність вірусу, 16 (66,7%) із 24 живонароджених поросят, 9 (64,3%) із 14 мертвонароджених поросят та 3 (12,0%) із 25 муміфікованих поросят 7 +/-/ 14 -/1,024 -/1,024 21 -/1,024 -/1,024 28 -/256 -/1,024 були вірус-позитивними 3 28 поросят, віруспозитивних по зразках їхньої сироватки, 10 поросят були негативними по вірусу, коли на виділення вірусу досліджували зразки їхніх легенів Зразки сироватки від мертвонароджених поросят свиноматок 153, 147, 68 та 112 досліджували на наявність антитіл до вірусу PRRS за допомогою НІФ та PPV за допомогою HL, і результати наведені у таблиці З У шести з 13 зразків від мертвонароджених поросят і в 2 із 25 зразків рідини від 10 47433 муміфікованих поросят було антитіло до вірусу PRRS Титри НІФ варіювали від 1 16 до 1 1,024, тоді як у жодному зі зразків сироватки не було антитіла до PPV У тринадцятьох із 14 живонаро джених поросят від свиноматок 17 і 53 були антитіла і до вірусу PRRS (титри НІФ 1 64 до 1 1,024), та PPV (титри HL 1 512 1 16,384) Таблиця 2 Результати опоросу та виділення вірусу у свиноматок із вагітністю терміном 86 днів, інфікованих різними ізолятами вірусу PRRS № свиноматки | Дні 0 вірус/шлях усього плоди L3 S3 M Діапазон Сг довж ° експеримент І 6 0 3 27-32 8 1 1 25-35 виділення вірус 0 17 53 115 113 MN-Hs/IN MN-Hs/IN g 10 153 147 114 112 MN-HL/IN MN-HL/IN 13 12 0 0 2 4 11 8 24-32 15-3G 2/11 3/7 55 112 112 113 MN-W/IN MN-W/IN 15 15 8 2 3 4 4 9 25-23 24-31 5/15 5/11 124 95 107 е 107 е контроль контроль 14 12 14 12 ND ND 0/14 0/12 155 49 115 114 MN-Hs/IN MN-Hs/IN 11 10 експеримент II 7 3 1 8 2 0 28-35 34-37 8/11 9/10 175 110 112 113 MN-Hs/IM MN-Hs/IM 15 15 12 13 2 2 1 0 15-35 32-34 3/15 2/15 800 44 108 108 OVL-173/IN OVL-173/IN 12 13 1 5 0 10 2 3 27-26 25-25 1/12 10/13 День вагітності при опоросі або забої Вшцево-крижова довжина (см) муміфікованих або мертвонароджених плодів °КІЛЬКІСТЬ виділених зразків вірусу/кількість випробуваних зразків d CBHHOMaTOK забивали на 107 день вагітності дослідження плодів ь 6/9 5/10 LB - живонароджені, SB - мертвонароджені, М - муміфіковані, IN - штраназально, ЇМ - внутрішньом'язово, ND - не визначалася Таблиця З Виявлення антитіл до вірусу PRRS та PPV у сироватці мертвонароджених поросят свиноматок, інфікованих вірусом PRRS № свиноматки 153 вірус, який інфікує Історія приплоду MN-HL O L B 2 S B , 11М 147 MN-HL OLB 4SB, 8М 63 MN-W 8LB, 3SB, 4М 112 MN-W 2LB 4SB, 9М досліджені плоди a SB(32) SB (27) SB SB SB SB SB SB SB SB SB SB SB (30) (30) (29) (23) (27) (25) (28) (31) (29) (25) (24) НІФ PPVHL