Спосіб ідентифікації сортів цукрових буряків

Изобретение относится к биохимическим способам идентификации сортов растений по компонентному составу белков и может быть использовано в селекции свеклы для регистрации видов, форм и сортов, изучения их генетической структуры Цель изобретения — повышение точности и надежности идентификации. Отбирают семена без околоплодника Каждое семя помещают в пробирку и экстрагируют суммарные белки. Затем из белкового экстракта методом криопрецштитации выделяют глобулины, которые фракционируют с помощью электрофореза Перед электрофорезом в белковую смесь вводят два дезагрегирующих агента ( 1 % дод ей ил сульфата натрия и 5% 2-меркаптоэтанола). и электрофорез осуществляют в вертикальных пластинах 2 ил , б табл 1 Изобретение относится к биохимическим способам идентификации сортов растений по компонентному составу белков и может быть использовано в селекции свеклы для регистрации видов, форм и сортов, изучения их генетической структуры Цель изобретения — повышение точности и надежности идентификации сортов са харной свеклы На фиг I представлено II типов спектров глобулинов, выявленных у 3-сортов сахарной свеклы, на фиг 2 — эталонный элект рофоретический спектр глобулинов сахарной свеклы Способ осуществляется следующим образом У изучаемого сорта отбирают 100 семян без околоплодника Каждое семя помещают в пробирку, тщательно раздавливают его стеклянной палочкой и заливают 0,2 м 1 М NaCl для экстракции суммарных белков (альбуминов и глобулинов), которую проводят в течении ночи (15—16 ч) Затем глобулины осаждают из суммарного белкового экстракта охлажденной дистиллированной водой (методом криопреципитации). Перед электрофорезом в белковую смесь вводят два дезагрегирующих агента 1%-ный ^одецилсульфат натрия и 5%-ный 2-меркаптоэтанол Полученные глобулины фракционируют с помощью электрофореза. Электрофорез проводят в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия Глобулины диссоциируют до полипептив нагретом до 100°С О.25М трис-НС1 О5 GO СО О 1463190 буфере (рН 6, 8), содержащем 1%-ный додецилсульфат натрия и 5%-ный 2-меркаптоэтанол. Продолжительность электрофореза 3 ч при силе тока 50 мА на пластину и напряжении 200 В. Электрофорез осуществляют в вертикальных пластинах. В табл. 1—3 приведены данные результатов испытания режимов экстракции и электрофоретического фракционирования глобулинов, позволивших, получить четкие и многокомпонентные спектры. В табл. 1 приведены результаты изучения электрофоретических спектров, полученных при фракционировании глобулинов семян сахарной свеклы с околоплодником и без него. Как видно из приведенных данных, использование для экстракции глобулинов семян без околоплодника позволяет получать электрофоретические спектры более четкие и с большим числом компонентов, чем для глобулинов семян с околоплодником. В табл 2 показано влияние условий экстрагирования и продолжительности электрофоретического фракционирования на полноту извлечения компонентов глобулинов из семян сахарной свеклы сорта Белоцерковская односеменная 34. Из приведенных данных видно что объем экстрагирующего буфера 0,1 мл не достаточен для проявления субъединиц глобулинов с Rf 0,02, 0,10, 0,18, 0,21, 0,26, 0,35, 0,75. Объем — 0,3 мл — великоват, поэтому на электрофоретических спектрах зоны с Rf 0,42 и 0,64 плохо разделяются. Вместе с тем при использовании для экстрагирования белков 0,2 мл буфера были получены четкие электрофоретические спектры с 23 компонентами. Из табл 2 видно также, как влияет продолжительность экстракции на качество получаемых электрофоретических спектров. Часовая и трехчасовая экстрации не достаточны для извлечения из одного семени всех Субъединиц глобулинов, Только экстрагирование белков в течение ночи (15—16 ч) обеспечило получение электрофоретических спектров с наибольшим числом компонентов (23). При трехчасовой (сокращенной) продолжительности электрофореза получен электрофоретический спектр с 23 компонентами. При продолжительности разгонки 7 ч часть субъединиц глобулинов свеклы (Rf 0,73, 0,76, 0,78, 0,82, 0,87, 0,92, 0,96) выходит из геля. Следовательно, наибольшее число компонентов в спектрах обнаружено при использовании объема экстрагирующего буфера 0,2 мл, продолжительности экстракции «на ночь», продолжительности электрофореза 3 ч. В табл. 3 представлены результаты сравнения электрофоретических спектров глобулинов, описанных известным и предлагаемым способами. 5 1П 15 2Q 30 35 4П 45 Как видно из табл. 3 электрофоретические спектры суммарных белков в нативной системе геля имеют в своем составе только 6 компонентов глобулинов: три из них основные (Rf 0,13, 0,20, 0,28), а три минорные (Rf 0,03, 0,09, 0,48). Применение одного дезагрегирующего агента (SDS) повышает разрешающую способность фракционирования глобулинов (12 компонентов). Но она все же недостаточна. Введение двух дезагрегирующих агентов — SDS и 2-меркаптоэтанола — значительно улучшает электрофоретическое фракционирование и позволяет получить четкое разделение 23 субъединиц глобулинов. Предлагаемым способом изучено три сорта сахарной свеклы: Белоцерковская односеменная 45 (БЦ 45), Веселоподолянская 29 (ВП29), Индустриальная. В каждом сорте проанализировано от 100 до 150 семян. При этом выявлено 11 типов спектров глобулинов (фиг I), которые различаются числом компонентов в спектре, интенсивностью окраски и относительной электрофоретической подвижностью некоторых компонентов. Полученные электрофоретические спектры изучаемого сорта (100 спектров) записывают в виде белковых формул при сравнении их с эталонным электрофоретическим спектром глобулинов сахарной свеклы. Эталонный электрофоретический спектр глобулинов сахарной свеклы представлен на фиг. 2, его белковая формула ^ 123 Л (1)23456 Г 12345678910 W 123(4)56789. В табл. 4 представлены белковые формулы 11 типов спектров, обнаруженных у трех сортов сахарной свеклы. Записанные в виде белковых формул электрофоретические спектры глобулинов отдельных семян разделяют на группы по типам спектров и определяют частоту их встречаемости для каждого сорта в данной выборке семян Спектры изученных сортов сахарной свеклы приведены в табл. 5 Как видно из табл. 5, сорт БЦ 45 имеет следующие типы спектров: 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11; сорт ВП29 - спектры 1, 2, 3, 5. 6, 7, 8, а сорт Индустриальный — спектры 1, 2. 3, 4, 5, 6, 7, 8. Некоторые типы спектров обнаружены только у сорта Белоцерковской селекции — 9, Ю, ІІ, а спектры 1, 2, 5 — только у сортов БП29 и Индустриальный. Из данных табл. 5 видно также что каждый сорт характеризуется неодинаковым распределением частот встречаемости основных типов спектров Так, наиболее час55 то встречаемым спектром у сорта БЦ 45 является спектр 9 (35, 60°/0), а наиболее редко встречаемым — спектр 6 (4, 40%), который однако у сорта ВП29 встречается чаще других (32,30%). Для сорта Индустри 1463190 альный наиболее часто встречаемым являвстречаемости электрофоретических спектется спектр I (26, 60%). ров глобулинов в выборке 100 семян Способ Таким образом, каждый сорт отличаетпозволяет наряду с идентификацией изуся от другого не только наличием разных тичать генетическую структуру популяции, оппов спектров, но и частотой их встречаемос- 5 ределять оригинальность и константность ти. При этом каждый сорт имеет наиболее сорта характерный для него тип спектра (наиболее часто встречаемый). Двухфакторный Формула изобретения дисперсионный анализ показал, что различия между сортами достоверны — НСР 0,05 1Q Способ идентификации сортов сахарной = 0,136. свеклы, включающий электрофорез белковой вытяжки семян без околоплодника и послеТакая характеристика сорта может быть дующий анализ полученных электрофоретинаглядно представлена в сортовой решетке. ческих спектров, отличающийся тем, что, В верхней графе этой решетки указаны хас целью повышения точности и надежности рактерные для данного сорта типы спект- 15 идентификации, электрофорезу подвергают ров, а в нижней — частота их встречаемосглобулины отдельного семени, которые выти в процентах (табл. 6) деляют методом криопреципитации, при этом Применение предлагаемого способа в сеперед электрофорезом в белковую вытяжку лекции сахарной свеклы дает возможность вводят два дезагрегирующих агента — дочетко идентифицировать сорта по частоте децилсульфат натрия и 2-меркалтоэтанол Т а б л и ц а 1 Показатели Электрофоретические спектры глобулинов семян сорта Белоцерковская односеменная 34 С околоплодником Без околоплодника 16 23 Число электрофоретических компонентов Четкость электрофоретическомпонентов Четкое проявление всех компонентов Диффузное проявление 6 компонентов Т а б л и ц а Показатели Объем экстрагирующего буфера, мл 0,1 Число электрофоретических компонентов Не проявляющиеся компоненты (Rf) 23 Продолжительность Продолжительность экстракции, ч электрофореза, ч 0,2 I 0,3 18 21 2 Ночь IZE 21 17 0,10 0,87 0,73 0,Ю 0,18 0,92 0,76 0,18 0,18 0,96 0,78 0,21 0,23 0,26 0,82 0,26 0,26 0,87 0,35 0,37 0,70 0,92 16 19 0,02 0,02 0,10 0,75 23 23 0,96 1463190 Продолжение табл. 2 Показатели Объем экстрагирующего буфера, мл О,1 Продолжительность Продолжительность экстракции, ч электрофореза, ч | 0,2J О, Не разделившиеся зоны (Rf) 1 0,42 LTI Ночь 0,64 Ш 0,64 Т а б л и ц а 3 Компонент Относительная электрофоретическая подвижность компонентов глобулинов в электрофоретических спектрах (Rf) Нативная система геля известный способ С применением одного дезагрегирующего агента (SDS) опробованное решение С применением двух дезагрегирующих агентов (SDS и 2-меркаптоэтанол) предлагаемый способ 1 2 0,03 0,02 0,02 0,09 0,30 0,10 3 о, 13 о,20 о, 28 о,48 0,32 0,18 0,36 0,22 0,39 0,24 0,54 0,28 0,59 0,34 0,80 0,40 0,83 0,42 0,88 0,46 0,93 0,48 0,95 0,52 0,54 0,58 0,62 0,68 0,70 0,73 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 _ 0,76 1463190 10 Продолжение табл. 3 Компонент Относительная электрофоретическая подвижность компонентов глобулинов в электрофоретических спектрах (Rf) Нативная система геля известный способ С применением одного дезагрегирующего агента (SDS) опробованное решение ч С применением двух дезагрегирующих агентов (SDS и 2-меркаптоэтанол) предлагаемый способ 0,78 21 0,82 22 0,87 20 23 Общее число компонентов 0,94 12 6 23 Т а б л и ц а 4 Основные типы электрофоретических спектров глобулинов трех сортов сахарной свеклы (белковые формулы) t Спектр [ 1 123 (1)23456 2456(7)89 12356789 2 пъ 23456 (2)4568910 123(4)5678 У Ґ23 (1)(2)(3)456 (4)569а10 123(4)5679 (1)23456 (2)45689 12356789 4 л 5 Ггз 23456 (2)4568910 23(4)567(8)9 6 123 (1)23456 (2)45679а10 12356789 (1)С2) (3)456 (2)456910 235679 7* ' Л 3 123 (0(2)3456 (2)4569 235679 9 Ш (1)23456 (1)2(3)45678910 12(3)5789 10 /л 123 (023456 (4)5689 1235679 11 123 23456 1 456789 123457 'Ч ' 1463190 и Тип Сорт., фактор А спектра фактор Б БЦ 45 Т а б л и ц а Частота встречаемости типов спектра в сортопопуляции I повторность II повторность Среднее Эффекты уровней факторов и эффекты взаимодействий 0,00 0,00 0,00 -13,80 2 0,00 0,00 0,00 -8,65 3 4 15,20 16,00 15,57 3,93 6,90 6,50 6,70 3,72 5 0,00 0,00 0,00 -6,64 6 4,80 4,00 4,40 -12,34 7 3 4,10 4,70 4,40 -4,73 13,00 13,60 13,30 1,46 9 35,90 35,30 35,60 23,72 10 13,60 13,00 13,30 8,85 11 6,50 6,90 6,77 4,47 1 14,90 14,50 14,70 0,90 ' 2 6,80 5,00 5,90 2,75 3 5,00 6,80 5,90 -5,70 4 0,00 0,00 0,00 -2,98 5 17,00 18,20 17,60 10,97 6 32,80 32,00 32,00 15,63 7 6,00 5,40 5,76 -3,36 8 17,40 18,10 17,70 5,87 9 0,00 0,00 0,00 -11,88 10 0,00 0,00 0,00 -4,45 11 ВП 29 1 0,00 0,00 0,00 -2,22 1 27,00 26,20 26,67 4,71 2 20,60 19,40 20,00 -0,44 3 13,90 12,70 13,37 2,55 4 2,60 1,80 2,20 -6,11 5 2,00 2,60 2,27 -2,45 6 13,00 13,70 13,40 7,65 7 16,50 17,70 17,17 0,04 8 4,40 5,00 4,46 2,75 Индустриальный ' 5 1463190 13 14 Продолжение т а б л . 5 Тип Сорт, фактор А спектра фактор В 9 Частота встречаемости типов спектра в сортопопуляции I повторность 10 о, 00 о, 00 о, 00 0,00 0,00 11 I I повторность 0,00 П р и м е ч а н и е . Эффекты уровней факторов и эффекты взаимодействий Среднее 2, 79 0,00 \„; о,оо • • 0,00 • 4 ,64 -6 ,83 НСР 0 , 0 5 д л я сравнения частных средних 0 , 1 3 6 . Т а б л и ц а Спектр (сорт ВП29) Частота встречаемости, % 14,70 5 , 9 0 5 , 9 0 17,60 32,30 5 , 7 6 Спектр (сорт БЦ 45) Частота встречаемости, % 1 7 , 7 0 10 15,57 6,70 4,40 4,40 13,30 35,60 13,30 11 6,77 6 1463190 10 Фиг. г Составитель E Шіфадюк Редактор В Данко Техред И Верес Корректор В Романенко Заказ62!/3 ТиражбіЙ Подписное ВПИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР И3035, Москва, Ж- 35 Ра>шская ьаб , д \\Ь Пршпводственно издательский комбинат «Патент», г Ужгород у л Гагарина Ю! 71