Спосіб підвищення стійкості до засухи у рослин шляхом порушення експресії функціонального білка upl3

Реферат: Винахід стосується способу покращення стійкості рослини до засухи порівняно з контрольною рослиною, де вказаний спосіб включає порушення експресії функціонального білка UPL3 в рослині шляхом мутації послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує вказаний функціональний білок UPL3. Винахід також стосується способу скринінгу стійкості рослин до засухи та рослин і рослинних продуктів із порушеною експресією функціонального білка UPL3. UA 115441 C2 (12) UA 115441 C2 UA 115441 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузі техніки Даний винахід стосується нового способу підвищення засухостійкості у рослин. Спосіб охоплює ослаблення експресії гена або генів або функціонального білка(ів) у вказаній рослині. Порівняно з рослиною, яку не модифікують для ослаблення експресії вказаного гена(ів) або функціонального білка(ів), рослини за даним винаходом показують підвищену засухостійкість. Також описані рослини і рослинний продукт, які можуть бути отримані способом згідно з даним винаходом. Рівень техніки Абіотичні стреси, такі, як засуха, засолення, екстремальні температури, хімічна токсичність і оксидантний стрес становлять загрози сільському господарству, і вони є основними причинами втрат урожаїв сільськогосподарських культур у всьому світі (Wang et al. (2003) Planta 218(1) 114). У галузі техніки доступні декілька звітів про біохімічний, молекулярний і генетичний фони абіотичних стресів (Wang et al. (2003) Planta 218(1) 1-14 or Kilian et al (2007) Plant J 50(2) 347363). Модифікація рослини для боротьби з абіотичними стресами часто основана на маніпуляції з генами, які захищають і підтримують функцію і структуру клітинних компонент. Однак, через генетично складні реакції на умови абіотичних стресів, контролювати і проектувати такі рослини виявляється важче. Wang, (Wang et al. (2003) Planta 218(1) 1-14), серед іншого, вказує, що одна зі стратегій інженерії базується на застосуванні одного або декількох генів, які або залучені до передачі сигналів і регуляторні шляхи, або які кодують ферменти, що беруть участь у шляхах, приводячи до синтезу функціональних і структурних захисних речовин, таких, як осмоліти і антиоксиданти, або які кодують білки, що надають стійкість до стресу. Незважаючи на те, що позитивні зрушення у забезпеченні рослин, стійких до абіотичного стресу, були опубліковані, природа генетично складних механізмів, які лежать в основі цього, складає постійну необхідність в додатковому просуванні в цій галузі. Наприклад, опубліковано, що генетично трансформовані стійкі до засухи рослини, загалом, можуть демонструвати більш повільний ріст і знижену біомасу (Serrano et al (1999) J Exp Bot 50:1023-1036) через нестійкість у розвитку і фізіології, таким чином, потребуючи значних витрат для підтримки їх росту порівняно з рослинами, які не є трансформованими (Kasuga et al. (1999) Nature Biot. Vol. 17; Danby and Gehring (2005) Trends in Biot. Vol.23 No.11). Запропоновано декілька біотехнологічних підходів для отримання рослин, які ростуть в умовах стресу. Рослини з підвищеною стійкістю до сольового стресу, наприклад, розкриті в WO03/020015. Цей документ розкриває трансгенні рослини, які стійкі до сольового стресу за допомогою 9-цис-епоксикаротиноїдної діоксигенази нуклеїнових кислот і поліпептидів. Рослини з підвищеною стійкістю до засухи розкриті, наприклад, в патенті США 2009/0144850, патенті США 2007/0266453 і WO 2002/083911. US2009/0144850 описує рослину, яка демонструє фенотип стійкості до засухи завдяки зміненій експресії нуклеїнової кислоти DR02. Патент США 2007/0266453 описує рослину, яка демонструє фенотип стійкості до засухи завдяки зміненій експресії нуклеїнової кислоти DR03, і WO 2002/083911 описує рослину, яка має підвищену стійкість до засухи завдяки зниженій активності ABC транспортера, яким експресується в замикаючих клітинах. Іншим прикладом є робота Kasuga зі співавторами (1999), які описують те, що надмірна експресія кДНК, яка кодує DREB1A в трансгенних рослинах, активувала експресію багатьох генів стійкості до стресів у нормальних умовах росту і приводила до підвищення стійкості до засухи, сольового навантаження і заморозків. Однак, експресія DREB1A також приводила до сильної затримки росту в нормальних умовах росту (Kasuga (1999) Nat Biotechnol 17(3) 287-291). Залишається необхідність у новій, альтернативній і/або додатковій методології для підвищення стійкості до абіотичних стресів, зокрема, абіотичного стресу, такого, як засуха. Метою даного винаходу є надання нових способів збільшення засухостійкості у рослин. З такою рослиною, наприклад, можливо отримати більше біомаси і/або більше сільськогосподарської культури і рослинного продукту, який отримується з неї, при вирощуванні в умовах низької доступності води/засухи порівняно з рослинами, не підданими способу згідно з даним винаходом. Суть даного винаходу Даний винахід надає спосіб отримання рослини, яка має підвищену засухостійкість порівняно з контрольною рослиною, який включає стадію ослаблення експресії білка UPL в рослині, вказаний білок UPL включає послідовність амінокислот, що включає щонайменше один Pfam НЕСТ-домен згідно з PF00632 і щонайменше один повтор ARM суперсімейства згідно з моделлю SSF48371, і, за бажанням, відновлення вказаної рослини. 1 UA 115441 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому аспекті даний винахід надає спосіб отримання рослини, яка має підвищену засухостійкість порівняно з контрольною рослиною, що включає стадію ослаблення експресії функціонального білка UPL3 в рослині, рослинній клітині або протопласті рослини, де вказаний функціональний білок UPL3 включає послідовність амінокислот, що має щонайменше на 30 % ідентичність з послідовністю амінокислот SEQ ID NO:2, і, за бажанням, відновлення вказаної рослини. Вказаний функціональний білок UPL3 може включати послідовність амінокислот, яка включає щонайменше один Pfam НЕСТ-домен згідно з PF00632 і щонайменше один повтор ARM суперсімейства згідно з моделлю SSF48371. Функціональний білок UPL3 може бути білком, який при експресії в лінії Arabidopsis thaliana з Т-ДНК вставкою, що містить зруйнований ендогенний ген UPL3, приводить до ослабленої засухостійкості рослини порівняно із засухостійкістю вказаної лінії Arabidopsis thaliana з Т-ДНК вставкою, що містить зруйнований ендогенний ген UPL3, де вказаний функціональний білок UPL4 не експресується. Даний винахід додатково направлений на спосіб отримання рослини, яка має підвищену засухостійкість порівняно з контрольною рослиною, який включає стадію ослаблення експресії функціонального білка UPL3 в рослині, рослинній клітині або протопласті рослини, де вказаний функціональний білок UPL3 включає послідовність амінокислот, що містить щонайменше один Pfam НЕСТ-домен згідно з PF00632, і щонайменше один повтор ARM суперсімейства згідно з моделлю SSF48371, і, за бажанням, відновлення вказаної рослини. Даний винахід також стосується способу отримання рослини, яка має підвищену засухостійкість порівняно з контрольною рослиною, який включає стадію ослаблення експресії функціонального білка UPL3, де вказаний функціональний білок UPL3 кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, яка включає послідовність нуклеїнової кислоти, що має щонайменше 60 %у ідентичність з послідовністю нуклеїнової кислоти з SEQ ID NO:1, і, за бажанням, відновлення вказаної рослини. Функціональний білок UPL3 може бути білком, який при експресії в лінії Arabidopsis thaliana з Т-ДНК вставкою, яка містить зруйнований ендогенний ген UPL3, приводить до ослабленої засухостійкості рослини порівняно із засухостійкістю вказаної лінії Arabidopsis thaliana з Т-ДНК вставкою, що містить зруйнований ендогенний ген UPL3, де вказаний функціональний білок UPL3 не експресується. Стадія ослаблення експресії функціонального білка UPL3 може включати мутування послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує вказаний функціональний білок UPL3. Мутування вказаної послідовності нуклеїнової кислоти може включати вставку, видалення і/або заміну щонайменше одного нуклеотиду. Стадія ослаблення експресії може включати пригнічення активності гена. Стадія ослаблення експресії може включати ослаблення експресії двох або більше функціональних білків UPL3 у вказаній рослині. Спосіб може додатково включати стадію отримання рослини або рослинного продукту з рослини, яка має підвищену засухостійкість. Даний винахід також стосується застосування послідовності амінокислот, яка має щонайменше 30 %-у ідентичність з послідовністю амінокислот з SEQ ID NO:2, або послідовності нуклеїнової кислоти, яка має щонайменше 60 %-у ідентичність з послідовністю нуклеїнової кислоти з SEQ ID NO:1 в скринінгу на засухостійкість у рослин. Даний винахід направлений на застосування послідовності амінокислот UPL3 з SEQ ID NO:2 або послідовності нуклеїнової кислоти UPL3 з SEQ ID NO:1 в скринінгу на засухостійкість у рослин Arabidopsis thaliana. Даний винахід також стосується застосування щонайменше частини послідовності нуклеїнової кислоти UPL3 з SEQ ID NO:1 або щонайменше частини послідовності амінокислот UPL3 з SEQ ID NO:2 як маркерного гена для розведення засухостійких рослин Arabidopsis thaliana. Даний винахід додатково описує застосування функціонального білка UPL3, як визначено в даному описі, для модулювання, переважно, підвищення засухостійкості у рослин. В іншому аспекті винахід описує застосування рослини, рослинної клітини або рослинного продукту, де експресія функціонального білка UPL3 ослаблена, де функціональний білок UPL3 являє собою білок, який при експресії в лінії Arabidopsis thaliana з Т-ДНК вставкою, яка містить зруйнований ендогенний ген UPL3, приводить до ослабленої засухостійкості рослини порівняно із засухостійкістю вказаної лінії Arabidopsis thaliana з Т-ДНК вставкою, що містить зруйнований ендогенний ген UPL3, де вказаний функціональний білок UPL3 не експресується, для вирощування в умовах засухи, де вказані умови засухи примушують контрольну рослину, рослинну клітину або рослинний продукт, в якому експресія вказаного функціонального білка 2 UA 115441 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 UPL3 не ослаблена, виявляти ознаки стресу від засухи, такі, як ознаки в'янення, раніше, ніж рослина, рослинна клітина або рослинний продукт, в якому експресія функціонального білка UPL3 ослаблена. Даний винахід також описує рослину, рослинну клітину або рослинний продукт Solanum lycopersicum, Gossypium hirsutum, Glycine max, Triticum spp., Hordeum vulgare., Avena sativa, Sorghum bicolor, Secale cereale або Brassica napus, в яких експресія функціонального білка UPL3 ослаблена, де функціональний білок UPL3 являє собою білок, який при експресії в лінії Arabidopsis thaliana з Т-ДНК вставкою, що містить зруйнований ендогенний ген UPL3, приводить до ослабленої засухостійкості рослини порівняно із засухостійкістю вказаної лінії Arabidopsis thaliana з Т-ДНК вставкою, що містить зруйнований ендогенний ген UPL3, де вказаний функціональний білок UPL3 не експресується. Вказана рослина, рослинна клітина або рослинний продукт можуть включати зруйнований ендогенний ген UPL3. Короткий опис креслень Фігура 1 показує результати типового експерименту, описаного в прикладах 1 і 2. Фігура 2 показує засухостійкий фенотип з вимкненим UPL3 (мутант Arabidopsis зі вставкою At4g38600) порівняно із засухочутливим фенотипом (дикий тип) контрольної рослини. Фігура 3 показує виживання в засусі мутанта зі вставкою At4g38600 (UPL3). Мутант Arabidopsis thaliana зі вставкою At4g38600 пережив засуху значно краще (р