Виділений полінуклеотид brachyspira hyodysenteriae, що кодує поліпептид, та його застосування

Реферат: Винахід належить до виділеного полінуклеотиду Brachyspira hyodysenteriae і виділеного поліпептиду, які застосовуються для терапії та профілактики захворювань, викликаних В. hyodysenteriae у тварин. UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується нових генів в анаеробному мікроорганізмі Brachyspira hyodysenteriae та кодованих в них протеїнів. Крім того, даний винахід стосується застосування вказаних нових генів та протеїнів для діагностики захворювання B. hyodysenteriae, створення вакцини проти B. hyodysenteriae і для скринінгу складів, які вбивають B. hyodysenteriae або блокують патогенні дії B. hyodysenteriae. Ці послідовності також можуть бути використані для діагностики та лікування і/або як профілактичний засіб від хвороб у тварин, які викликані іншими різновидами спірохет (дрібних змієподібних бактерій) Brachyspira, включаючи B. suanatina, B. intermedia, B. alvinipulli, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii та B. pilosicoli. Свиняча дизентерія є серйозним ендемічним захворюванням свиней не тільки в Австралії, але й у всьому світі. Свиняча дизентерія являє собою інфекційне шлунково-кишкове захворювання (mucohaemorrhagic diarrhoeal), що характеризується поширеним запаленням та некрозом епітеліальної поверхні товстої кишки. Економічні втрати із-за свинячої дизентерії відбуваються, головним чином, від уповільнення зростання витрат на лікування та від летального результату хворих. Збудник свинячої дизентерії первинно у 1971 році був ідентифікований як анаеробна (кишкова) спірохета (Трепонема hyodysenteriae), але недавно він був переведений у категорію роду Brachyspira як B. hyodysenteriae. Там, де виявлена свиняча дизентерія у свинарниках, спектр захворювання може змінитися від помірного, перехідного або неочевидного до важкого, і навіть фатального. Стратегія лікування в індивідуальних свинарниках може маскувати клінічні симптоми, а в окремих приміщеннях хвороба може пройти непоміченою або тільки підозрюватися. Незалежно від того, є хвороба очевидною чи ні, B. hyodysenteriae може зберігатися у заражених свинях або в інших господарях басейну, наприклад, у гризунах, чи у навколишньому середовищі. Всі ці джерела інфекції мають у своєму розпорядженні потенціал передачі хвороби неінфікованим тваринам. Товарна свійська птиця також може бути колонізована за допомогою B. hyodysenteriae, хоча поки залишається нез'ясованим, як це відбувається в реальних умовах утримування живих організмів. Колонізація за допомогою B. hyodysenteriae виявляє сильну імунологічну реакцію проти спірохети, отже, непрямий доказ чутливості відносно спірохети може бути одержаний при вимірюванні циркулюючих титрів антитіл у крові заражених тварин. Повідомлялося, що ці титри антитіл підтримувалися на низьких рівнях навіть у тварин, які видужали від свинячої дизентерії. Тому серологічні тести на виявлення антитіл володіють значним потенціалом виявлення субклінічної інфекції у свиней-носіїв, що видужали, у товстій кишці яких є невиявлені спірохети. Ці тести були б особливо цінні у вигляді зручного у застосуванні комплекту, яким є твердофазовий імуноферментний аналіз. Було розроблено безліч методів, що демонструють наявність циркулюючих антитіл, спрямованих проти B. hyodysenteriae, включаючи непрямі тести з флуоресціюючими антитілами, реакції гемаглютинації, тести аглютинації мікротитрування, реакції зв'язування комплементу, і твердофазовий імуноферментний аналіз (ELISA), що використовує або ліпополісахарид, або повністю зруйновані ультразвуком спірохети як антиген. Для всіх цих тестів існує проблема специфічності, оскільки зв'язані непатогенні кишкові спірохети можуть спровокувати утворення перехресно-реактивних антитіл. Дані тести корисні для виявлення стад, де хвороба очевидна і є в наявності титри високоциркулюючих антитіл. Проте вони проблематичні для ідентифікації субклінічно інфікованих стад та окремих інфікованих свиней. Отже, виходячи з існуючого рівня техніки, до цього часу не існує абсолютно чутливих та високо специфічних проб, доступних для виявлення антитіл проти B. hyodysenteriae. Недостатня кількість ефективних діагностичних тестів заважає контролювати ситуацію із свинячою дизентерією. Для контролю ситуації із свинячою дизентерією використовується цілий ряд способів, починаючи від застосування профілактичних антимікробних засобів і закінчуючи повним вибраковуванням заражених стад та запобіганням поверненню заражених свиней-носіїв. Всі ці методи дорогі. Щоб досягти повної ефективності, вони потребують використання складних діагностичних тестів, які могли б здійснювати моніторинг протікання захворювання. В даний час виявлення свинячої дизентерії у стадах з субклінічними інфекціями та у окремих здорових тварин-носіях залишається головним питанням, від вирішення якого залежить впровадження ефективних заходів контролю. Постановка точного діагнозу свинячої дизентерії традиційно вимагає виділення та ідентифікації B. hyodysenteriae з фекалій або слизистої оболонки хворих свиней. При цьому основними проблемами, пов'язаними із згаданим захворюванням, є сповільнене зростання та велика розбірливість у виборі поживних засобів даних анаеробних бактерій. Крім того, можна зустрітися з дезорієнтацією у постановці діагнозу із-за наявності морфологічно подібних спірохет у нормальній флорі свинячої кишки. Значне поліпшення процесу діагностики інфікованих свиней було досягнуте з розвитком методу полімеразно-ланцюгової реакції (PCR) для виявлення спірохет у фекаліях. На жаль, обмеження, 1 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що виникають у процесі використання PCR на практиці, не дозволяють застосовувати даний метод для виявлення тварин-носіїв субклінічних інфекцій. Внаслідок вказаних діагностичних проблем, у даний час існує гостра необхідність в розробці простого та ефективного діагностичного інструменту, здатного виявляти інфекцію B. hyodysenteriae як на рівні стада, так і в окремої свині. Після колонізації за допомогою B. hyodysenteriae настає сильна імунологічна реакція, спрямована проти спірохети, і свині, що видужали від свинячої дизентерії, виявляються захищеними від повторного інфікування. Незважаючи на це, спроби розробити вакцини для контролю над свинячою дизентерією повною мірою не увінчалися успіхом або з тієї причини, що вони не забезпечували надійного захисту на рівні стада, або тому, що вони були настільки дорогими та складними щодо технологічності, що не змогли стати комерційно вигідними. Бактерини (вбиті бактерійні вакцини) забезпечують деякий рівень захисту, але вони тяжіють до ліпополісахаридних серогрупоспецифічних вакцин, які в подальшому потребують використання багатовалентних бактеринів. Крім того, вони складні та дорогі у виготовленні, що не дозволяє організувати їх великомасштабне виробництво через складність задоволення високоспецифічних вимог до анаеробного зростання спірохети. Було зроблено декілька спроб у розробці атенуйованих живих вакцин від свинячої дизентерії. Такий спосіб характеризується одним недоліком, який полягає у тому, що атенуйовані штами виявляють ослаблену (зменшену) колонізацію, а отже, викликають понижену імунну стимуляцію. Крім того, з боку виробників та ветеринарів спостерігається небажання використовувати живі вакцини від свинячої дизентерії із-за імовірності повернення до вірулентності, тим більш, що ще дуже мало відомо про генетичну регуляцію та структуру B. hyodysenteriae. Використання рекомбінантних субодиничних вакцин – приваблива альтернатива вирішення питання, оскільки продукт міг би бути добре ідентифікованим (що є суттєвим при реєстрації) та відносно технологічним для організації великомасштабного виробництва. Як відомо із даного рівня техніки, перше використання рекомбінантного протеїну з B. hyodysenteriae як кандидата на вакцину (протеїн 38-kilodalton flagellar) було не в змозі запобігти колонізації свиней. Така невдача, напевне, пов'язана, зокрема, з використанням специфічного рекомбінантного протеїну, а також з іншими більш просунутими по ходу транскрипції виходами систем доставки та шляхів, діапазонами доз, вибором ад'ювантів тощо (Gabe, JD, Chang, RJ, Slomiany, R, Andrews, WH and McCaman, MT (1995) Isolation of extracytoplasmic proteins from Serpulina hyodysenteriae B204 and molecular cloning of the flaB1 gene encoding а 38-kilodalton flagellar protein. Infection and Immunity (Виділення екстрацитоплазмових протеїнів із Serpulina hyodysenteriae B204 та молекулярне клонування гена flaB1, що кодує протеїн kilodalton flagellar protein. Інфекція та імунітет, 63:142148). Першим відомим частково захисним рекомбінантним протеїном B. hyodysenteriae, використаним для вакцинації, став зовнішньо мембранний ліпопротеїн 29.7 kDa (Bhlp29.7, відомий також як BmpB і BlpA), який мав гомологію з метіонінзв'язувальними ліпопротеїнами різних патогенних бактерій. Використання гіс-міченого рекомбінантного протеїну Bhlp29.7 для вакцинації свиней, супроводжуваного експериментальним контрольним зараженням за допомогою B. hyodysenteriae, привело до того, що у 17-40 % вакцинованих свиней розвинулася хвороба порівняно із розвитком захворювання у 50-70 % невакцинованих контрольних свиней. Оскільки рівень захворювання у вакцинованих Bhlp29.7 свиней був значно менше (P=0,047), ніж у контрольних свиней, Bhlp29.7 виявив себе як компонент, що має потенціал компонента вакцини проти свинячої дизентерії мею (La, T, Phillips, ND, Reichel, MP and Hampson, DJ (2004). Protection of pigs from swine dysentery by vaccination with recombinant BmpB, а 29.7 kDa outermembrane lipoprotein of Brachyspira hyodysenteriae) (Захист свиней від свинячої дизентерії шляхом вакцинації за допомогою рекомбінантного BmpB, 29.7 kDa зовнішньо-мембранного ліпопротеїну Brachyspira hyodysenteriae), Veterinary Microbiology 102:97-109). Було зроблено цілий ряд інших спроб ідентифікації зовнішніх обволікаючих протеїнів з B. hyodysenteriae, які могли б бути використані як рекомбінантні вакцинні компоненти, однак і ці спроби не увінчалися успіхом – ефективна вакцина до цього часу так і не була створена. Для ідентифікації потенційно корисних імуногенних рекомбінантних протеїнів з потрібен набагато глибший, концептуальний підхід. Із даного рівня техніки відоме тільки одне дослідження з використанням ДНК для вакцинації. У цьому дослідженні ген B. hyodysenteriae ftnA, що кодує передбачуваний феритин, був клонований у E. coli плазміду, а ДНК плазміди була використана як покриття золотих бусинок для балістичної вакцинації. Мишача модель для свинячої дизентерії використовувалася, щоб визначити захисну природу вакцинації з використанням ДНК і/або рекомбінантного протеїну. 2 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вакцинація з використанням рекомбінантного протеїну викликала добру системну реакцію проти феритину. Проте вакцинація з використанням ДНК викликала лише системну реакцію, що піддається виявленню. Вакцинація з використанням ДНК проходила за імунізацією рекомбінантним протеїном, що викликає системну імунну реакцію стосовно феритину тільки після повторної імунізації протеїном. Однак жоден з досліджуваних режимів вакцинації не був здатний забезпечити мишам захист від колонізації B. hyodysenteriae і пов'язаних з нею пошкоджень. Цікаво те, що вакцинація мишей з використанням однієї тільки ДНК закінчувалася значним загостренням хвороби (Davis, A.J., Smith, S.C. and Moore, R.J. (2005). The Brachyspira hyodysenteriae ftnA gene: DNA vaccination and real-time PCR quantification of bacteria in а mouse model of disease (Ген Brachyspira hyodysenteriae ftnA: Вакцинація з використанням ДНК і визначення кількості PCR в реальному часі бактерій у мишачій моделі хвороби), Current Microbiology 50: 285-291). Об'єктом даного винаходу є нові гени з B. hyodysenteriae та протеїни, що кодуються вказаними вище генами. Ще одним об'єктом винаходу є застосування названих нових генів та протеїнів, що кодуються даними генами, з лікувальною та діагностичною метою. Згадані вище гени і/або протеїни можуть бути використані у вакцинах проти B. hyodysenteriae та для діагностики інфекцій B. hyodysenteriae. Об'єктом даного винаходу є нові гени B. hyodysenteriae, що мають нуклеотидну послідовність, яка міститься у SEQ ID №№: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 і 65. Об'єктом даного винаходу є також нуклеотидна послідовність, яка є ідентичною SEQ ID №№: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 і 65, де відсоток ідентичності може складати, щонайменше, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % і 70 % (та кожне ціле число від 100 до 70). Даний винахід також поширюється на вакцину ДНК або на імуногенну композицію ДНК, нуклеотидну послідовність SEQ ID, що містить №№: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 і 65 та послідовності, які, щонайменше, на 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % і 70 % (та кожне ціле число від 100 до 70) є ідентичними даним послідовностям. Крім того, даний винахід поширюється на діагностичні проби, що містять ДНК з нуклеотидною послідовністю SEQ ID №№: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 і 65 та послідовностями, які, щонайменше, на 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % і 70 % (та кожне ціле число від 100 до 70) є ідентичними даним послідовностям. Об'єктом даного винаходу є також плазміди, що містять ДНК з послідовністю SEQ ID №№: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 і 65; прокаріотичні і/або еукаріотичні вектори експресії, що містять ДНК з послідовністю SEQ ID №№: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 і 65; та клітина, що включає плазміди, які містять ДНК з послідовністю SEQ ID №№: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 і 65. Ще одним об'єктом даного винаходу є нові протеїни B. hyodysenteriae, з амінокислотною послідовністю, що міститься у SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 і 66. Ще одним об'єктом даного винаходу є протеїни, які, щонайменше, на 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % і 70 % (та кожне ціле число від 100 до 70) є гомологічними послідовності, що міститься у SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 і 66. Ще одним об'єктом даного винаходу є те, що вакцина або імуногенна композиція містить протеїни, які мають амінокислотну послідовність, що міститься у SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 і 66, або амінокислотні послідовності, які, щонайменше, на 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % і 70 % (та кожне ціле число від 100 до 70) є гомологічними послідовності, що міститься у SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 і 66. Ще одним аспектом даного винаходу є діагностичний набір, що містить один або декілька протеїнів, які мають послідовність, що міститься у SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 і 66, або які, щонайменше, на 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % і 70 % є гомологічними послідовностям, що містяться у SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 і 66. Ще одним аспектом даного винаходу є нуклеотидні послідовності, які кодують протеїни з амінокислотною послідовністю, що міститься у SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 і 66, а також кодують 3 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотні послідовності, які, щонайменше, на 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % і 70 % (та кожне ціле число від 100 до 70) є гомологічними послідовностям, що містяться у SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 і 66. Даний винахід також поширюється на плазміди, еукаріотичні та прокаріотичні вектори експресії, а також вакцини ДНК, які містять ДНК з послідовністю, що кодує протеїн, яка має амінокислотну послідовність, що міститься у SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 і 66, а також кодують(є) амінокислотні послідовності, які, щонайменше, на 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % і 70 % (та кожне ціле число від 100 до 70) є гомологічними послідовностям, що містяться у SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 і 66. Клітини, що містять вказані плазміди та вектори експресії, також включені в обсяг захисту даного винаходу. Даний винахід також поширюється на моноклональні антитіла, які зв'язані з протеїнами, які мають амінокислотну послідовність, що міститься у SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 і 66, або зв'язані з протеїнами, які, щонайменше, на 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % і 70 % (та кожне ціле число від 100 до 70) є гомологічними послідовностям, що містяться у SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 і 66. Діагностичні набори, що містять моноклональні антитіла, які зв'язані з протеїнами, що мають амінокислотну послідовність, що міститься у SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 і 66, або зв'язані з протеїнами, які, щонайменше, на 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % і 70 % (та кожне ціле число від 100 до 70) є гомологічними послідовностям, що містяться у SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 і 66, також включені в обсяг захисту даного винаходу. Дані діагностичні набори можуть виявляти наявність B. hyodysenteriae у тварин. Такими тваринами є, переважно, будь-який ссавець чи птах; більш прийнятно, курча, гусиня, качка, індичка, папуга, собака, кішка, хом'як, піщанка, кролик, тхір, кінь, корова, вівця, свиня, мавпа, і людина. Даний винахід також пропонує спосіб запобігання або лікування хвороб, викликаних інфекцією B. hyodysenteriae у тварин, шляхом введення тварині вакцини ДНК, що містить одну або декілька нуклеотидних послідовностей, перелічених у SEQ ID №№: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 і 65, або послідовностей, які, щонайменше, на 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % і 70 % (та кожне ціле число від 100 до 70) ідентичні згаданим вище послідовностям. Даний винахід також поширюується на спосіб запобігання або лікування захворювання, викликаного інфекцією B. hyodysenteriae, у тварини шляхом введення тварині вакцини, що містить один або декілька протеїнів, які мають амінокислотну послідовність, що міститься у SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 і 66, або послідовності, які, щонайменше, на 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % і 70 % (та кожне ціле число від 100 до 70) є гомологічними вказаним послідовностям. Такою твариною є, переважно, будь-який ссавець чи птах; більш прийнятно, курча, гуска, качка, індичка, папуга, собака, кішка, хом'як, піщанка, кролик, тхір, кінь, корова, вівця, свиня, мавпа, і людина. Даний винахід також пропонує спосіб генерування імунної реакції у тварини шляхом введення їй імуногенної композиції, що містить одну або декілька нуклеотидних послідовностей, перелічених у SEQ ID №№: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 і 65, або послідовностей, які, щонайменше, на 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % і 70 % (та кожне ціле число від 100 до 70) ідентичні таким послідовностям. Даний винахід також поширюється на спосіб генерування імунної реакції у тварини шляхом введення тварині імуногенної композиції, що містить один або декілька протеїнів, які мають амінокислотну послідовність, що міститься у SEQ ID №№: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 і 66, або послідовності, які, щонайменше, на 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % і 70 % (та кожне ціле число від 100 до 70) є гомогенними таким послідовностям. Такою твариною є, переважно, будьякий ссавець чи птах; більш прийнятно, курча, гуска, качка, індичка, папуга, собака, кішка, хом'як, піщанка, кролик, тхір, кінь, корова, вівця, свиня, мавпа, і людина. Артиклі "a" та "an" використовуються у цьому документі, щоб назвати один або більше одного (тобто, як мінімум, один) граматичних об'єктів. Наприклад, слово "елемент" ("an element") означає один елемент або більше одного елемента. Термін "амінокислота" означає поняття, що охоплює всі молекули, як природні, так і синтетичні, які володіють як амінними, так і кислотними функціональними можливостями і 4 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можуть бути включеними у полімер природних амінокислот. Перелік прикладів амінокислот включає природні амінокислоти; їх аналоги, похідні та представники того ж класу; аналоги амінокислот, що мають різні бічні ланцюги; а також всі стереоізомери будь-якого з названих вище компонентів. Тварина може бути представлена ссавцем чи птахом. Приклади ссавців включають собаку, кішку, хом'яка, піщанку, кролика, тхора, коня, корову, вівцю, свиню, мавпу, і людину. Приклади птахів включають курча, гуску, качку, індичку і папугу. Термін "збережений залишок" належить до амінокислоти, яка є елементом групи амінокислот, що мають певні загальні властивості. Термін "консервативна заміна амінокислоти" стосується заміни (концептуально або інакше) амінокислоти з однієї такої групи іншою амінокислотою з тієї ж самої групи. Функціональний спосіб визначення загальних властивостей окремих амінокислот полягає у тому, щоб проаналізувати нормалізовані частоти змін амінокислот між відповідними білками гомологічних організмів (Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure (Основи структури протеїну), Springer-Verlag). Відповідно до цих досліджень можуть бути визначені групи амінокислот, в яких амінокислоти у межах групи обмінюються, переважно, одна з одною, і тому у більшості своїй нагадують одна одну за принципом своєї дії на всю структуру протеїну (Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Приклади амінокислотних груп, визначених цим методом, включають: (i) позитивно заряджену групу, що містить Lys, Arg і His, (ii) негативно заряджену групу, що містить Glu та Asp, (iii) ароматичну групу, що містить Phe, Tyr і Trp, (iv) групу азотного кільця, що містить His та Trp, (v) велику аліфатичну неполярну групу, що містить Val, Leu та De, (vi) злегка полярну групу, що містить Met та Cys, (vii) група малого залишку, що містить Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln і Pro, (viii) аліфатичну групу, що містить Val, Leu, De, Met і Cys, та (їxню) малу гідроксильну групу, що містить Ser та Thr. Термін "злитий протеїн" або "злитий поліпептид" стосується рекомбінантного (химерного) протеїну. Саме під такою назвою даний протеїн відомий з рівня техніки і може бути одержаний з використанням способів, також відомих з рівня техніки. У багатьох прикладах злитого протеїну спостерігаються дві різні поліпептидні послідовності, а в окремих випадках їх може бути і більше. Полінуклеотидні послідовності, що кодують злитий протеїн можуть бути операбельно зв'язані у рамці (зчитування) таким чином, щоб злитий протеїн міг бути коректно трансльований. Злитий білок може включати поліпептидні послідовності із одного і того ж виду або з різних видів. У різних прикладах здійснення злитий поліпептид може містити одну або декілька амінокислотних послідовностей, зв'язаних з першим поліпептидом. У тому випадку, якщо більше однієї амінокислотної послідовності зливається з першим поліпептидом, злиті послідовності можуть бути багаторазовими копіями однієї і тієї ж послідовності або, як альтернатива, можуть виявитися різними амінокислотними послідовностями. Злиті поліпептиди можуть бути сплавлені з N-точкою закінчення, C-точкою закінчення, або N- і C-точкою закінчення першого поліпептиду. Перелік прикладів злитих протеїнів включає поліпептиди, що містять мітку глютатіону Sтрансферази (GST-мітку), мітку гістидину (His-мітку), домен імуноглобуліну або імуноглобулін, що зв'язує домен. Термін "виділений (ізольований) поліпептид" стосується поліпептиду, в одному з прикладів здійснення винаходу, приготовленого з рекомбінантної ДНК або РНК, або синтетичного, або природного походження, або будь-якої їх комбінації, який (1) не зв'язаний з протеїнами, з якими він зазвичай виявляється у природі, (2) виділений з клітини, в якій він зазвичай зустрічається, (3) вільний від дії інших протеїнів з одного і того ж клітинного джерела, (4) експресований клітиною з різних видів або (5) не зустрічається у природі. Існування виділеного поліпептиду можливе, проте він не кваліфікується як очищений поліпептид. Термін "виділена (ізольована) нуклеїнова кислота" і "виділений (ізольований) полінуклеотид" стосується полінуклеотиду, представленого як геномна ДНК, cДНК, mРНК, tРНК, rРНК, iРНК, або полінуклеотиду, одержаного або з клітинної органели (наприклад, мітохондрії та хлоропласту), або синтетичного походження, який (1) або не зв'язаний з клітиною, в якій "виділена (ізольована) нуклеїнова кислота" знайдена у природі, або (2) операбельно зв'язана з полінуклеотидом, з яким вона не зв'язана у природі. Існування виділеного (ізольованого) полінуклеотиду можливе, проте він не кваліфікується як очищений полінуклеотид. Термін "нуклеїнова кислота" і "полінуклеотид" стосується полімерної форми нуклеотидів, або рибонуклеотидів, або деоксирибонуклеотидів, або модифікованої форми нуклеотиду будьякого типу. Слід розуміти, що терміни поширюються як еквіваленти на аналоги будь-якої РНК або ДНК, приготовлені з аналогів нуклеотидів, а також і застосовувані у прикладі здійснення винаходу, описаному у цьому документі, одноланцюжкові (наприклад, змістові та антизмістові) і дволанцюжкові полінуклеотиди. 5 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін "нуклеїнова кислота за винаходом" і "поліпептид за винаходом" стосується нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид за даним винаходом. Полінуклеотид за винаходом включає всю або частину підпорядкованої послідовності нуклеїнової кислоти; нуклеотидну послідовність, щонайменше, на 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичну підпорядкованій послідовності нуклеїнової кислоти (та кожне ціле число від 60 до 100); нуклеотидну послідовність, яка в жорстких умовах схрещується з підпорядкованою послідовністю нуклеїнової кислоти; нуклеотидні послідовності, що кодують поліпептиди, які функціонально еквівалентні поліпептидам за даним винаходом; нуклеотидні послідовності, що кодують поліпептиди, які, щонайменше, на 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % гомологічні або ідентичні підпорядкованій амінокислотній послідовності (та кожне ціле число від 60 до 100); нуклеотидні послідовності, що кодують поліпептиди, які володіють активністю поліпептидів за винаходом та характеризуються, щонайменше, на 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % або більше гомологією чи ідентичністю відносно підпорядкованої амінокислотної послідовності (та кожне ціле число від 60 до 100); нклеотидні послідовності, які відрізняються діапазоном від 1 до 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50, 75 або більше нуклеотидних заміщень, додавань або делецій, наприклад, алельних варіантів підпорядкованої послідовності нуклеїнової кислоти; нуклеїнові кислоти похідні підпорядкованої послідовності нуклеїнової кислоти, еволюційно з нею зв'язані; а також комплементи та нуклеотидні послідовності, одержані в результаті дегенерації генетичного коду, для всіх перелічених вище, а також інших нуклеїнових кислот за даним винаходом. Нуклеїнові кислоти за винаходом включають також гомологи, наприклад, ортологи та паралоги, підпорядкованої послідовності нуклеїнової кислоти, а також варіантів підпорядкованої послідовності нуклеїнової кислоти, які виявилися кодоном, оптимізованим для експресії у специфічному організмі (наприклад, у клітині-господарі). Термін "операбельно зв'язаний" при описанні взаємодії між двома ділянками нуклеїнової кислоти виражає суть розуміння взаємодії вказаних ділянок, природа якої дозволяє їм функціонувати за заданим сценарієм. Наприклад, контрольна послідовність, "операбельно зв'язана" з кодуючою послідовністю, лігована таким чином, щоб експресія кодуючої послідовності досягалася за умов, сумісних з контрольними послідовностями, наприклад, коли відповідні молекули (наприклад, індуктори та полімерази) зв'язані з контрольною(ими) або регуляторною(ими) послідовністю(ями). Термін "поліпептид", а також терміни "протеїн" і "пептид", які, взаємозамінюючись, поперемінно використовуються у цьому документі, належать до полімеру амінокислот. Зразки поліпептидів включають генні продукти, природні протеїни, гомологи, ортологи, паралоги, фрагменти та інші еквіваленти, варіанти і аналоги згаданих раніше елементів. Терміни "фрагмент поліпептиду" або "фрагмент" при використанні з посиланням на еталонний поліпептид належать до поліпептиду, в якому залишки амінокислоти стерті порівняно з самим еталонним поліпептидом, але де залишкова послідовність амінокислоти зазвичай ідентична відповідним положенням в еталонному поліпептиді. Таке стирання може спостерігатися у точці аміно-закінчення або у точці карбокси-закінчення еталонного поліпептиду, або, як альтернатива, – в обох. Зазвичай існують фрагменти завдовжки, щонайменше, 5, 6, 8 або 10 амінокислот; завдовжки, щонайменше 14 амінокислот; завдовжки, щонайменше, 20, 30, 40 або 50 амінокислот; завдовжки, щонайменше, 75 амінокислот або завдовжки, щонайменше, 100, 150, 200, 300, 500 чи більше амінокислот. Фрагмент може зберігати один або більше типів біологічної активності еталонного поліпептиду. В окремих прикладах здійснення фрагмент може включати домен, що володіє заданою біологічною активністю, і, довільно, додаткові амінокислоти з однієї або обох сторін домену. При цьому додаткові амінокислоти можуть налічувати від 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 або до 100, чи більше залишків. Крім того, фрагменти можуть включати субфрагмент специфічної ділянки, причому даний субфрагмент зберігає функцію ділянки, похідним якої він є. В іншому прикладі здійснення фрагмент може володіти імуногенними властивостями. Термін "поліпептид за даним винаходом" стосується поліпептиду, що містить підпорядковану амінокислотну послідовність, або її еквівалент, або фрагмент. Поліпептиди за винаходом включають поліпептиди, що містять всю або частину підпорядкованої амінокислотної послідовності; підпорядковану амінокислотну послідовність з від 1 до 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50, 75 або більш консервативними (інваріантними) амінокислотними заміщеннями; амінокислотну послідовність, яка, щонайменше, на 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, або 99 % гомологічна підпорядкованій амінокислотній послідовності (та кожне ціле число від 60 до 100); а також функціональні фрагменти згаданого. Поліпептиди за винаходом також включають гомологи, наприклад, ортологи та паралоги, підпорядкованої амінокислотної послідовності. 6 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Існує можливість удосконалення (зміни) структури поліпептидів за винаходом, з метою як підвищення терапевтичної або профілактичної ефективності або стабільності (наприклад, ex vivo підвищення терміну придатності, стійкості до протеолітичної деградації in vivo, і так далі). Такі модифіковані поліпептиди, будучи розробленими з метою збереження, щонайменше, однієї активності природно існуючої форми протеїну, розглядаються як "функціональні еквіваленти" поліпептидів, детальніше описаних у даному документі. Такі модифіковані поліпептиди можуть бути одержані, наприклад, шляхом амінокислотного заміщення, за допомогою делеції або доповнення, причому такі заміщення можуть бути повними або частковими і здійснюватися у процесі консервативних (інваріантних) амінокислотних заміщень. Наприклад, є підстави очікувати, що ізольоване консервативне (інваріантне) амінокислотне заміщення, наприклад, заміщення лейцину ізолейцином або валіном, аспартату глутаматом, треоніну серином, не виявить несприятливої дії на біологічну активність одержаної молекули. Чи приведе зміна в амінокислотній послідовності поліпептиду до одержання функціонального гомолога, може бути остаточно визначено при оцінці здатності варіантного поліпептиду забезпечити реакцію, подібну тій, яка забезпечується природним протеїном. Поліпептиди, в яких мало місце більше одного заміщення, можуть бути успішно протестовані з використанням такої ж методики. Термін "очищений" стосується виду об'єкту, в якому переважають ознаки, що становлять суть виду (тобто, на молярній основі він присутній у композиції в більшій кількості, ніж будь-який інший індивідуальний вид). Термін "очищена фракція" поширюється на композицію, в якій вид об'єкта складає, щонайменше, 50 відсотків (на молярній основі) від всіх присутніх видів. При визначенні чистоти або виду у розчині або дисперсії розчинник або матриця, в якій вид розчинений або розсіяний, зазвичай не включається у таке визначення; навпаки, беруться до уваги лише розчинені або розсіяні види (включаючи й заданий). Як правило, очищена композиція матиме один вид, який складає більше, ніж, приблизно, 80 % всіх присутніх у композиції видів, більше, ніж приблизно 85 %, 90 %, 95 %, 99 % або більше від всіх присутніх видів. Вид об'єкта може бути очищений до суттєвої однорідності (забруднюючий вид не може бути виявлений у композиції звичайними методами виявлення), де композиція, по суті, являє собою єдиний вид. Будь-який кваліфікований фахівець може очистити поліпептид за винаходом, використовуючи стандартні методи очищення протеїну відповідно до даного винаходу. Чистота поліпептиду може бути визначена цілою низкою способів, відомих кваліфікованому фахівцеві з рівня техніки, включаючи, наприклад, аналіз амінокислотної послідовності в амінотерміналі, гелевий електрофорез, мас-спектрометричний аналіз і методи, описані у цьому документі. Терміни "рекомбінантний протеїн" або "рекомбінантний поліпептид" стосуються поліпептиду, який одержаний з використанням методів рекомбінантної ДНК. Прикладом таких методів є метод, при якому ДНК, що кодує експресований протеїн, вставлена у відповідний вектор експресії, який, у свою чергу, використовується, для трансформації клітини-господаря з метою одержання протеїну чи поліпептиду, що кодується ДНК. Термін "регуляторна послідовність" є загальним терміном, використовуваним всюди в описі щодо поліпептидних послідовностей, наприклад, сигналів ініціювання, підсилювальних агентів, регуляторів та промоторів, які необхідні або бажані для спричинення дії на експресію кодуючих та некодуючих послідовностей, з якими вони операбельно зв'язані. Зразки регуляторних послідовностей описані у Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology (Технологія генної експресії: методи в ензимології), Academic Press, San Diego, CA (1990), і включають, наприклад, ранній та пізній промотори SV40, виключно ранній промотор аденовірусу або цитомегаловірусу, lac-систему, trp-систему, TAC- або TRC-систему, T7промотор, експресія якого скеровується T7 РНК-полімеразою, головний оператор та промоторні ділянки фага лямбди, контрольні ділянки для fd – вірусний протеїн (протеїн, що бере участь у формуванні зовнішньої оболонки вірусної частки), промотор для 3-фосфогліцерату кінази або інших гліколітичних ензимів, промотори кислотної фосфатази (наприклад, Pho5), промотори дріжджових α – взаємодіючих факторів, поліедриновий промотор бакуловірусної системи та інші послідовності, відомі як контролери експресії генів прокаріотичних або еукаріотичних клітин чи їхніх вірусів, а також різні їх комбінації. Природа та використання таких контрольних послідовностей можуть відрізнятися, залежно від організму-господаря. У прокаріотах такі регуляторні послідовності, в основному, включають промотор, рибосомальний зв'язувальний сайт і послідовності термінації транскрипції. Термін "регуляторна послідовність" поширюється, як мінімум, на компоненти, присутність яких може впливати на експресію, а також може включати додаткові компоненти, присутність яких сприятлива, наприклад, для лідерних послідовностей та послідовностей партнерів по злиттю. В окремих прикладах здійснення 7 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 транскрипція полінуклеотидної послідовності знаходиться під контролем послідовності промотору (або іншої регулятивної послідовності), яка керує експресією полінуклеотиду у такому типі комірки, для якого призначена експресія. Слід також розуміти, що полінуклеотид може контролюватися регуляторними послідовностями, які є ідентичними або відрізняються від послідовностей, керуючих експресією природно існуючої форми полінуклеотиду. Термін "гомологія послідовності" стосується пропорції основних сумісностей між двома послідовностями нуклеїнової кислоти або пропорції амінокислотних сумісностей між двома послідовностями амінокислоти. Коли гомологія послідовності експресована як процентний вміст, наприклад, 50 %-ний вміст означає пропорцію сумісностей за довжиною послідовності від заданої послідовності, яка порівнюється з деякою іншою послідовністю. Гепи (у будь-якій з двох послідовностей) дістають можливість довести до максимуму перехресне типування; зазвичай використовують довжини гепів 15 основ або менше; 6 основ або менше використовуються частіше, але 2 основи або менше використовуються ще частіше. Термін "ідентичність послідовності" означає, що послідовності ідентичні (тобто, на підставі положення нуклеотид за нуклеотидом (nucleotide-by-nucleotide) для нуклеїнових кислот або на підставі положення амінокислота за амінокислотою (amino acid-by-amino acid) для поліпептидів)) за вікном порівняння. Термін "процент ідентичності послідовності" розраховується шляхом порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей за вікном порівняння, визначаючи число положень, в яких ідентичні амінокислоти або нуклеотиди опиняються в обох послідовностях, щоб одержати кількість суміщених положень, виконуючи ділення кількості суміщених положень на загальну кількість положень у вікні порівняння та помножуючи результат на 100, щоб одержати процент ідентичності послідовності. Методи розрахунку ідентичності послідовності відомі кваліфікованим фахівцям з рівня техніки і детальніше описані далі за текстом. Термін "розчинний" у контексті даного опису стосовно поліпептиду за винаходом або іншого протеїну означає, що після експресії у клітинній культурі, щонайменше, деяка частина поліпептиду або протеїну експресованого залишається у фракції цитоплазми клітини і не фракціонує з клітинними осколками після лізису та центрифугування лізату. Розчинність поліпептиду може бути збільшена безліччю визнаних методів з рівня техніки, включаючи злиття в гетерологічну амінокислотну послідовність, стирання залишків амінокислоти, заміщення амінокислоти (наприклад, збагачуючи послідовність залишками амінокислоти, що мають гідрофільні бічні ланцюги), і хімічну модифікацію (наприклад, доповнення гідрофільних груп). Розчинність поліпептидів може бути виміряна, використовуючи безліч визнаних методів, включаючи динамічне розсіювання світла для визначення стану агрегації, ультрафіолетову абсорбцію, центрифугування для відокремлення з'єднаного від нез'єднаного в одне ціле матеріалу та електрофорез гелю за присутності SDS (дедоцилсульфату натрію), (наприклад, кількість протеїну у розчинній фракції порівнюється з кількістю протеїну у розчинних та нерозчинних об'єднаних фракціях). Будучи експресованими у клітині-господарі, поліпептиди за винаходом можуть бути розчинними, щонайменше, на 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % або більше, наприклад, щонайменше, близько 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % або більше від загальної кількості протеїну, експресованого у клітині, виявлено у цитоплазматичній фракції. В окремих прикладах здійснення винаходу один літр культури клітини, що експресує поліпептид за даним винаходом, забезпечить одержання, щонайменше, близько 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10; 20; 30; 40; 50 міліграмів або більше розчинного протеїну. В одному з прикладів здійснення поліпептид за даним винаходом є, щонайменше, на 10 % розчинним і забезпечить одержання, як мінімум, біля одного міліграма протеїну з одного літра клітинної культури. Термін "специфічно схрещує" стосується виявлюваного та специфічного зв'язування нуклеїнової кислоти. Полінуклеотиди, олігонуклеотиди та нуклеїнові кислоти за винаходом селективно схрещуються з ланцюгами нуклеїнової кислоти в умовах гібридизації та промивки, які мінімізують помітні кількості виявлюваного зв'язування з неспецифічними нуклеїновими кислотами. Як відомо з рівня техніки і буде розкрито далі за текстом у цьому документі, для забезпечення умов селективної гібридизації можуть бути використані жорсткі режими. В принципі, ідентичність послідовності нуклеїнової кислоти між полінуклеотидами, олігонуклеотидами та нуклеїновими кислотами за винаходом та обговорюваною послідовністю нуклеїнової кислоти складає, щонайменше, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % або більше (та кожне ціле число від 30 до 100). В окремих прикладах виконання режими схрещування та промивання здійснюються в жорстких умовах відповідно до звичайних методик схрещування, умови виконані за строгих умов згідно із звичайними процедурами схрещування та як описано далі за текстом цього документа. 8 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Терміни "жорсткі умови" або "жорсткі умови схрещування" стосуються умов, які активізують специфічне схрещування між двома додатковими полінуклеотидними ланцюгами для формування дуплекса. Жорсткі умови можуть бути обрані так, що однією з їх характеристик є вибір температури на 5 °C нижче точки термального плавлення (Tm) для даного полінуклеотидного дуплекса при певній іонній силі та pH факторі. Довжина комплементарних ланцюгів полінуклеотиду та вміст їх GC визначить Tm дуплекса і, таким чином, умови схрещування, необхідні для одержання заданої специфіки схрещування. Tm являє собою температуру (при заданій іонній силі та pH факторі), при якій 50 % послідовності полінуклеотиду схрещуються з точно підібраним комплементарним ланцюгом. В деяких випадках бажано підвищити жорсткість умов схрещування з метою забезпечення відповідності Tm для окремого дуплекса. Існують різні способи визначення Tm. Зазвичай основні пари G-C у дуплексі визначаються для внесення біля 3 °C у Tm, тоді як основні пари A-T визначаються для внесення біля 2 °C до теоретичного максимуму, що складає біля 80-100 °C. Проте існують більш складні моделі Tm, в яких беруться до уваги формування G-Cвзаємодій, вплив розчинника, задана температура досліджень. Наприклад, дослідження можуть бути розроблені з урахуванням температури розкладання (Td), дорівнюючої, приблизно, 60 °C, використовуючи формулу: Td = (((3 x #GC) + (2 x #AT)) x 37) – 562) / #bp) – 5; де #GC, #AT та #bp – кількість гуанін-цитозинових основних пар, кількість аденін-тимінових основних пар і кількість цілих основних пар, відповідно, залучених до формування дуплекса. Гібридизація може бути проведена у 5x SSC, 4x SSC, 3x SSC, 2x SSC, 1x SSC або 0,2x SSC протягом, щонайменше, близько 1 години, 2 годин, 5 годин, 12 годин або 24 годин. Температура гібридизації може бути збільшена для настроювання на задану жорсткість реакції, наприклад, з 25 °C (кімнатна температура) до, приблизно, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C або 65 °C. Реакція гібридизації може також включати інші агенти, що впливають на жорсткість режимів. Наприклад, гібридизація, проведена за присутності 50 % формаміду, підвищує жорсткість гібридизації при певній температурі. За реакцією гібридизації може йти єдина операція промивки або дві, чи навіть більше, операцій промивки, які можуть проводитися при одній і тій же самій або при різних температурах та солоностях. Наприклад, температура промивки може бути збільшена при настроюванні на задану жорсткість режимів від, приблизно, 25 °C (кімнатна температура) до, приблизно, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C або вище. Операція промивки може проводитися за присутності миючого засобу, наприклад, 0,1 або 0,2 % SDS. Наприклад, за гібридизацією можуть проводитися дві операції промивки при 65 °C кожна протягом близько 20 хвилин у 2x SSC; 0,1 % SDS, і, довільно, дві додаткові операції промивки при 65 °C кожна протягом близько 20 хвилин у 0,2x SSC; 0,1 %SDS. Приклади жорстких умов гібридизації включають процес гібридизації протягом 12 годин (всієї ночі) при 65 °C, у розчині, що містить 50 % формамід, 10x Denhardt (0,2 % Ficoll, 0,2 % полівінілпіролідон, 0,2 % альбумін бичачої сироватки) і 200 µг/мл денатурованого носія DNA, наприклад, фрагментованою ДНК сперми лосося, після чого йдуть дві операції промивки при 65 °C кожна протягом 20 хвилин у 2x SSC; 0,1 % SDS, а також дві операції промивки при 65 °C кожна протягом 20 хвилин у 0,2x SSC; 0,1 % SDS. Гібридизація може складатися з гібридизування двох нуклеїнових кислот у розчині або нуклеїнової кислоти у розчині з нуклеїновою кислотою, приєднаною до твердої опори, наприклад, фільтра. Коли одна нуклеїнова кислота знаходиться на твердій опорі, перед гібридизацією може бути проведена попередня гібридизація. Попередня гібридизація може бути виконана протягом, щонайменше, приблизно 1 години, 3 годин або 10 годин в одному і тому ж розчині та при одній і тій же самій температурі, що й розчин гібридизації (без додаткового ланцюга полінуклеотиду). Відповідні жорсткі умови відомі кваліфікованому фахівцеві з рівня техніки або можуть бути визначені таким фахівцем експериментальним шляхом. Див. наприклад, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-12.3.6; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; S. Agrawal (ed.) Methods in Molecular Biology, volume 20; Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization With Nucleic Acid Probes, e.g., part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York; and Tibanyenda, N. et al., Eur. J. Biochem. 139:19 (1984) and Ebel, S. et al., Biochem. 31:12083 (1992). Термін "вектор" стосується нуклеїнової кислоти, здатної до транспортування іншої нуклеїнової кислоти, з якою вона була зв'язана. Одним з типів векторів, які можуть бути використані відповідно до винаходу, є епісома, тобто нуклеїнова кислота, що виявляє здатність 9 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до екстра-хромосомної (позахромосомної) реплікації. Перелік інших векторів включає вектори, здатні до автономної реплікації та експресії нуклеїнових кислот, з якими вони зв'язані. Вектори, здатні спрямовувати експресію генів, з якими вони функціонально зв'язані, згадані у цьому документі як "вектори експресії". В принципі, вектори експресії, використовувані у технологіях рекомбінантної ДНК, часто присутні у формі "плазмід", що мають відношення до кільцевих дволанцюжкових молекул ДНК, які в їх векторній формі не зв'язані з хромосомою. У даному описі терміни "плазміда" та "вектор" використовуються поперемінно, являючись взаємозамінними, оскільки плазміда – це найбільш часто використовувана форма вектора. Однак винахід поширюється й на інші форми векторів експресії, які володіють еквівалентними функціями і які можуть стати відомими у подальшому рівні техніки. Нуклеїнові кислоти за винаходом можуть бути використані як діагностичні реактиви для виявлення присутності або відсутності цільових ДНК або РНК послідовностей, з якими вони специфічно зв'язуються, для визначення рівня експресії нуклеїнової кислоти за винаходом. В одному з аспектів даний винахід розкриває спосіб виявлення присутності нуклеїнової кислоти за винаходом або її частини у зразку. При цьому даний спосіб включає операції, при яких: (a) забезпечують наявність олігонуклеотиду завдовжки, щонайменше, у вісім нуклеотидів, причому даний нуклеотид є доповненням (комплементом) до ділянки нуклеїнової кислоти за винаходом; (b) забезпечують контакт олігонуклеотиду із зразком, що містить, щонайменше, одну нуклеїнову кислоту, в умовах, які дозволяють здійснити гібридизацію олігонуклеотиду з нуклеїновою кислотою за винаходом або її ділянкою; (c) виявляють гібридизацію олігонуклеотиду відносно до нуклеїнової кислоти у зразку, виявляючи, таким чином, присутність нуклеїнової кислоти за винаходом або її ділянки у зразку. В іншому аспекті даний винахід розкриває спосіб виявлення присутності нуклеїнової кислоти за винаходом або її ділянки у зразку, що включає операції, при яких: (a) забезпечують наявність пари одноланцюжкових олігонуклеотидів, кожен з яких завдовжки, щонайменше, у вісім нуклеотидів, при цьому дані нуклеотиди є додатковими відносно до послідовностей нуклеїнової кислоти за винаходом, причому послідовності, відносно до яких дані олігонуклеотиди є додатковими, відокремлені від них, щонайменше, десятьма нуклеотидами; (b) забезпечують контакт нуклеотидів із зразком, що містить, щонайменше, одну нуклеїнову кислоту в умовах гібридизації; (с) підсилюють нуклеотидну послідовність між двома затравками олігонуклеотидів; і (d) виявляють присутність посиленої послідовності, забезпечуючи, таким чином, виявлення присутності нуклеїнової кислоти за винаходом або її ділянки у зразку. Ще в одному аспекті винаходу полінуклеотид за винаходом забезпечений у векторі експресії, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид за винаходом та операбельно зв'язана, щонайменше, з однією регуляторною послідовністю. Мається на увазі, що конструкція вектора експресії може залежати від таких факторів, як вибір клітини-господаря, яка повинна бути трансформована, і/або тип протеїну, який бажано експресувати. Повинні бути розглянуті питання, пов'язані з числом копій вектора, здатністю керувати таким числом копій та експресією будь-якого іншого протеїну, що кодується вектором, як, наприклад, антибіотичні маркери. Вектор експресії, що містить полінуклеотид за винаходом, може використовуватися як фармацевтичний засіб для лікування тварин, заражених B. hyodysenteriae, або як вакцина (а також як фармацевтичний засіб) для профілактики зараження тварини B. hyodysenteriae, або як засіб, що знижує симптоми та полегшує перебіг хвороби, якщо тварина дійсно вже заражена. Одним із способів використання вектора експресії як фармацевтичного засобу є введення нуклеїнової кислоти тварині у випадку існування для неї небезпеки зараження або тварині, яка вже заражена. Технологія вакцини нуклеїнової кислоти широко висвітлена у рівні техніки. Деякі з таких описів можна знайти у патенті U.S. 6,562,376 (Hooper et al.); патенті U.S. 5,589,466 (Felgner, et al.); патенті U.S. 6,673,776 (Felgner, et al.) і патенті U.S. 6,710,035 (Felgner, et al.). Вакцини нуклеїнової кислоти можуть бути введені внутрішньом'язово або внутрішньошкірно, можуть бути введені в організм тварини з використанням електрофорезу (див. WO 01/23537, King et al.; і WO 01/68889, Malone et al.), за допомогою ліпідних композицій (див. патент U.S. 5,703,055, Felgner, et al) або з використанням інших механізмів, відомих з рівня техніки у даній галузі. Вектори експресії можуть також бути трансфіковані у бактерії, які можуть вводитися цільовій тварині для того, щоб викликати імунну реакцію на протеїн, кодований нуклеотидами за даним винаходом, що знаходяться на векторі експресії. Вектор експресії може містити еукаріотичні послідовності експресії, щоб нуклеотиди за даним винаходом були транскрибовані та трансльовані в організм тварини-господаря. Як альтернатива, вектор експресії може бути транскрибований у бактеріях і потім трансльований в організм тварини-господаря. Бактерії, 10 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 використовувані як носій вектора експресії, повинні мати понижену вірулентність, але все ще залишатися інвазивними. Можна назвати декілька рекомендованих до застосування засобів, зокрема, Shigella spp., Salmonella spp., Escherichia spp. і Aeromonas spp., вірулентність яких була знижена але вони все ще залишалися інвазивними. Приклади таких способів можуть бути знайдені у патентіU.S. 5,824,538 (Branstrom et al); патенті U.S. 5,877,159 (Powell, et al.); патенті U.S. 6,150,170 (Powell, et al.); патенті U.S. 6,500,419 (Hone, et al.) і патенті U.S. 6,682,729 (Powell, et al.). Як альтернатива, полінуклеотиди за винаходом можуть бути поміщені у певні віруси, які впливають на вектор. Вірусні вектори можуть або експресувати протеїни за даним винаходом на поверхні вірусу, або нести полінуклеотиди за винаходом у клітину тварини, де полінуклеотид транскрибується та транслюється у протеїн. У тварини, зараженої вірусними векторами, може розвинутися імунна реакція відносно протеїнів, що кодуються полінуклеотидами за даним винаходом. Таким чином, можна полегшити або запобігти розвитку інфекції B. hyodysenteriae у тварині, яка отримала вірусні вектори. Приклади вірусних векторів можуть бути знайдені у патенті U.S. 5,283,191 (Morgan et al.); патенті U.S. 5,554,525 (Sondermeijer et al) і патенті U.S. 5,712,118 (Murphy). Полінуклеотид за винаходом може бути використаний для того, щоб викликати експресію та надекспресію поліпептиду за винаходом у клітинах, розмножених у культурі, наприклад, з метою одержання протеїнів або поліпептидів, включаючи злиті протеїни або поліпептиди. Даний винахід стосується клітини-господаря, інфікованої рекомбінантним геном для експресування поліпептиду за винаходом. Клітина-господар може бути будь-якою прокаріотичною або еукаріотичною клітиною. Наприклад, поліпептид за винаходом може бути експресований у бактерійних клітинах, таких як E. coli, клітинах комахи (бакуловірус), дріжджових клітинах, клітинах рослини або клітинах ссавця. У тих випадках, коли клітинагосподар є клітиною людини, вона може або не може бути у живого суб'єкта. Фахівцям, кваліфікованим у даній галузі техніки, відомі інші приклади підхожих клітин-господарів. Додатково клітина-господар може бути підкріплена молекулами тРНК, нетиповими для господаря, щоб оптимізувати експресію поліпептиду. Як альтернатива, нуклеотидна послідовність може бути змінена для оптимізації експресії у клітині-господарі, та все ж одержаний протеїн повинен мати високу відповідність первинно кодованому протеїну. Фахівцеві з рівня техніки і надалі може надходити інформація про інші методи, підхожі для максимізації експресії поліпептиду. Даний винахід також стосується способів виробництва поліпептидів за винаходом. Наприклад, клітина-господар, інфікована вектором експресії, що кодує поліпептид за винаходом, може бути культивована за відповідних умов, що забезпечують появу експресії поліпептиду. Поліпептид може бути секретований та виділений із суміші клітин та живильного середовища, що містить поліпептид. Як альтернатива, поліпептид може бути утриманий цитоплазматичним методом, а клітини зібрані, лізовані та виділений протеїн. Клітинна культура включає клітини-господарі, живильні середовища та інші супутні продукти. Живильні середовища, підхожі для клітинної культури, відомі з рівня техніки. Поліпептид може бути виділений із живильного середовища клітинної культури, клітингосподарів або обох, використовуючи технології, відомі з рівня техніки, для очищення протеїнів, включаючи іонообмінну хроматографію, гель-хроматографію, ультрафільтрацію, електрофорез та імуноафінну очистку з антитілами, визначеними для специфічних епітопів поліпептиду за винаходом. Таким чином, нуклеотидна послідовність, що кодує усього або відібрану ділянку поліпептиду за винаходом, може бути використана для виробництва рекомбінантної форми протеїну за допомогою мікробних або еукаріотичних клітинних процесів. Лігування послідовності у конструкцію полінуклеотиду, наприклад, вектор експресії, і трансформування або трансфекція у клітинах-господарях, або еукаріотичні (дріжджів, пташині, комахи або ссавця), або прокаріотичні (бактерійні) клітини є стандартними операціями. Подібні операції або їх модифікації можуть використовуватися для приготування рекомбінантних поліпептидів за винаходом із застосуванням мікробних засобів або технологій культури тканин. Підхожі вектори для експресії поліпептиду за винаходом є плазміди всіх типів: pTrcHisпохідні плазміди, pET- похідні плазміди, pBR322-похідні плазміди, pEMBL- похідні плазміди, pEX-похідні плазміди, pBTac-похідні плазміди і pUC-похідні плазміди для експресії у прокаріотичних клітинах, таких як E. coli. Різні способи, застосовувані у приготуванні плазмідів та трансформації організмів-господарів добре відомі з рівня техніки. Що стосується інших відповідних систем експресії як для прокаріотичних, так і для еукаріотичних клітин, а також 11 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 основних рекомбінантних операцій, див. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Chapters 16 and 17. Кодуючі послідовності для даного поліпептиду можуть бути інкорпоровані як частина гена злиття, що включає нуклеотидну послідовність, яка кодує різний поліпептид. Даний винахід розглядає виділений полінуклеотид, що містить нуклеїнову кислоту за винаходом і, щонайменше, одну гетерологічну послідовність, яка кодує гетерологічний (невідповідний) пептид, зв'язаний у структурі (рамці) з нуклеотидною послідовністю нуклеїнової кислоти за винаходом для кодування злитого протеїну, що містить гетерологічний поліпептид. Гетерологічний поліпептид може бути злитий з (a) C-точкою закінчення поліпептиду за винаходом, (b) N-точкою закінчення поліпептиду за винаходом або (c) C-точкою закінчення та Nточкою закінчення поліпептиду за винаходом. У певних випадках гетерологічна послідовність кодує поліпептид, дозволяючи виявлення, виділення, солюбілізацію і/або стабілізацію поліпептиду, з яким він злитий. В інших прикладах здійснення гетерологічна послідовність кодує такий поліпептид, як полі-His tag, myc, HA, GST, протеїн A, протеїн G, кальмодулінзв'язувальний пептид, тіоредоксин, мальтоза-зв'язувальний протеїн, полі-аргінін, полі-His-Asp, FLAG, ділянка протеїну імуноглобуліну і трансцитозний (transcytosis) пептид. Системи експресії злиття можуть бути використані у тих випадках, коли бажано одержати імуногенний фрагмент поліпептиду за винаходом. Наприклад, VP6 капсидний протеїн ротавірусу може використовуватися як імунологічний протеїн носія для ділянок поліпептиду або у мономерній формі, або у формі вірусної частки. Послідовності нуклеїнової кислоти, відповідні ділянці поліпептиду за винаходом, до якої повинні бути підняті антитіла, можуть бути інкорпоровані у генну конструкцію злиття, яка включає кодуючі послідовності для пізнього структурного протеїну вірусу коров'ячої віспи, щоб одержати ряд рекомбінантних вірусів, що експресують злиті протеїни, які включають ділянку протеїну як частину віріону. Поверхневий антиген гепатиту B також може бути використаний у цій функції. Так само для підвищення імуногенності можуть бути створені химерні конструкції, кодуючі для злитих протеїнів, які містять ділянку поліпептиду за винаходом та капсидний протеїн поліовірусу (див., наприклад, публікацію заявки EP № 0259149; and Evans et al., (1989) Nature 339:385; Huang et al., (1988) J. Virol. 62:3855; and Schlienger et al., (1992) J. Virol. 66:2). Злиті протеїни можуть полегшити експресію і/або очистку протеїнів. Наприклад, поліпептид за винаходом може бути генерований як злитий протеїн глютатіон-S-трансферази (GST). Такі GST злиті протеїни можуть використовуватися для спрощення очистки поліпептиду за винаходом. Те ж саме можна сказати й про глютатіон-похідні матриці (див., наприклад, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., (N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)). В інших прикладах здійснення злитий (гібридний) ген, що кодує для лідерної послідовності очистки, наприклад, послідовність сайта розпаду полі-(His)/ентерокінази в N-точці закінчення заданої ділянки рекомбінантного протеїну може забезпечити очистку експресованого злитого протеїну 2+ методом афінної хроматографії, використовуючи металеву смолу Ni . Згодом лідерна послідовність очистки може бути видалена шляхом обробки ентерокіназою для одержання очищеного протеїну (наприклад, див. Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411: 177; and Janknecht et al., PNAS USA 88:8972). Технологія приготування злитого гена добре відома з рівня техніки. По суті приєднання різних фрагментів ДНК, які кодують для різних послідовностей поліпептиду, виконується відповідно до звичайних технологій, що використовують метод лігування тупих кінців або метод ступінчастих розривів для зшивання, ферментативне переварювання рестрикції (обмеження), щоб забезпечити адекватні закінчення, адекватне заповнення здатних до зчеплення кінців, обробку лужною фосфатазою для уникнення небажаного приєднання і ферментативне лігування. В іншому прикладі здійснення винаходу злитий ген може синтезуватися з використанням звичайних технічних та технологічних засобів, включаючи автоматизовані синтезатори ДНК. Як альтернатива, ампліфікація PCR (полімеразно-ланцюгової реакції) генних фрагментів може бути виконана, використовуючи якірні затравки (ініціатори), які дають початок додатковим виступам між двома наступними генними фрагментами, які в подальшому можуть бути ренатуровані для одержання химерної генної послідовності (див., наприклад, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992). В інших прикладах здійснення винахід передбачає нуклеїнові кислоти за даним винаходом, іммобілізовані на твердій поверхні, включаючи пластини, планшети мікротитратора, мікроскопічні препарати, бусинки, частки, сфери, плівки, нитки, преципітати, гелі, листи, трубки, контейнери, капіляри, прокладки, зрізи тощо. Нуклеїнові кислоти за винаходом можуть бути іммобілізовані на чіп як частина ранжируваного ряду. Ранжируваний ряд може містити один або більше полінуклеотидів за винаходом, як описано у даному документі. В одному прикладі 12 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здійснення чіп містить один або більше полінуклеотидів за винаходом як частину ранжируваного ряду полінуклеотидних послідовностей одних і тих самих патогенних видів, що й полінуклеотид(и). У переважному варіанті даного винаходу подані описані вище виділені B. hyodysenteriae поліпептиди, а також полінуклеотидні послідовності, що кодують дані поліпептиди. Більш прийнятними є B. hyodysenteriae поліпептиди, представлені в істотно очищеній формі. Переважні поліпептиди за винаходом мають одну або більше біологічних властивостей (наприклад, in vivo, in vitro або імунологічні властивості) природного непроцесованого поліпептиду. Нефункціональні поліпептиди також включені в обсяг захисту винаходу, оскільки вони можуть використовуватися як, наприклад, антагоністи функціональних поліпептидів. Біологічні властивості аналогів, фрагментів або похідних відносно природного типу можуть бути визначені, наприклад, за допомогою біологічних проб. Поліпептиди, включаючи аналоги, фрагменти та похідні, можуть бути приготовлені синтетичним шляхом (наприклад, використовуючи відомі технології твердофазового пептидного синтезу або пептидного синтезу у рідкій фазі). Переважно використовуються технології твердофазового синтезу. Як альтернатива, поліпептиди за винаходом можуть бути приготовлені з використанням відомих методів генної інженерії, як описано інфра. Ще в одному прикладі здійснення поліпептиди можуть бути очищені (наприклад, методом імуноафінної очистки) від біологічного плинного середовища, наприклад, плазми, фекалій, сироватки, сечі тварин, включаючи, але не обмежуючись переліком: свині, курчати, гуски, качки, індички, папуги, людини, мавпи, собаки, кішки, коня, хом'яка, піщанки, кролика, тхора, великої рогатої худоби і вівці. Тварина може бути представлена будь-яким ссавцем чи птахом. Аналоги поліпептиду B. hyodysenteriae включають такі поліпептиди, що мають амінокислотну послідовність, в яких одна або більше з переліку амінокислот заміщені іншою амінокислотою, причому таке заміщення суттєво не змінює біологічну активність молекули. Згідно з винаходом, поліпептиди за винаходом, одержані рекомбінантним шляхом або методом хімічного синтезу, а також їхні фрагменти або інші похідні чи аналоги, включаючи злиті протеїни, можуть бути використані як імуноген для генерування антитіл, які розпізнають поліпептиди. Молекула є "антигенною", якщо вона здатна специфічно взаємодіяти з молекулою імунної системи, що забезпечує розпізнавання антигена, наприклад, імуноглобуліном (антитіло) або рецептором антигена Т-клітини. Антигенна амінокислотна послідовність містить, щонайменше, приблизно 5 і, переважно, щонайменше, приблизно 10 амінокислот. Антигенна ділянка молекули може бути ділянкою, яка є імунодомінантною для розпізнавання антитіла чи рецептора Т-клітини, або це може бути ділянка, використовувана для генерування антитіла до молекули шляхом кон'югування антигенної ділянки до молекули носія для імунізації. Молекула, яка є антигенною, не повинна сама бути імуногенною, тобто здатною до виявлення імунної відповіді без носія. Термін "антитіло" поширюється на будь-який імуноглобулін, включаючи антитіла та їхні фрагменти, який зв'язує специфічний епітоп. Термін охоплює поліклональні, моноклональні та химерні антитіла, останні з яких детально описані у патентах США №№ 4 816 397 та 4 816 567, а також антигензв'язувальні ділянки антитіл, включаючи Fab, F(ab') 2 та F(v) (включаючи одноланцюжкові антитіла). Відповідно, фраза "молекула антитіла" в її різних граматичних формах, використовуваних у цьому документі, припускає як інтактну молекулу імуноглобуліну, так й імунологічно активну ділянку молекули імуноглобуліну, що містить антигензв'язувальний активний центр антитіла. "Антигензв'язувальний активний центр антитіла" являє собою структурну ділянку молекули антитіла, складену із змінного важкого і легкого ланцюга та гіперзмінної ділянки, яка специфічно зв'язує антиген. Прикладами молекул антитіла є інтактні молекули імуноглобуліну, суттєво інтактні молекули імуноглобуліну і ті ділянки молекули імуноглобуліну, які містять паратоп, включаючи ті ділянки, які відомі з рівня техніки як Fab, Fab', F(ab') 2 та F(v), причому дані ділянки є переважними для використання у терапевтичних способах, описаних у цьому документі. Ділянки Fab та F(ab')2 молекул антитіла приготовляються в результаті протеолітичної реакції папаїну та пепсину, відповідно, на суттєво інтактних молекулах антитіла з використанням способів, які добре відомі з рівня техніки. Див. наприклад, патент U.S. № 4,342,566 Theofilopolous та ін. Ділянки Fab' молекули антитіла також відомі та утворені з ділянок F(ab') 2, з подальшим відновленням меркаптоетанолм дисульфідних містків, що зв'язують дві ділянки важкого ланцюга, яке супроводжується алкілуванням одержаного протеїнового меркаптану реактивом, наприклад, йодоацетамідом. Переважним є антитіло, що містить інтактні молекули антитіла. 13 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фраза "моноклональне антитіло" в її різних граматичних формах стосується антитіла, що має лише один вид антигенозв'язувального активного центру антитіла, здатний до здійснення імунної реакції із специфічним антигеном. Моноклональне антитіло, таким чином, зазвичай виявляє єдину зв'язувальну афінність до будь-якого антигена, з яким вступає в імунну реакцію. Тому моноклональне антитіло може містити молекулу антитіла, що має безліч антигенозв'язувальних активних центрів антитіла, кожен з яких є імуноспецифічним для окремого антигена; наприклад, біспецифічне (химерне) моноклональне антитіло. Термін "допоміжний фактор (ад'ювант)" стосується сполуки або суміші, які підсилюють імунну реакцію на антиген. Ад'ювант може служити депо для тканини, яке поволі вивільняє антиген, а також як активатор лімфосистеми, який неспецифічно підсилює імунну відповідь [Hood et al., in Immunology, р. 384, Second Ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, California (1984)]. Часто первинне зараження лише одним антигеном, за відсутності допоміжного фактора, виявляється не здатним виявити гуморальну або клітинну імунну відповідь. Допоміжні фактори включають, але не обмежені, повний ад'ювант Freund, неповний ад'ювант Freund, сапонін, мінеральні гелі, наприклад, такі як гідроокис алюмінію, поверхнево активні речовини, такі як лізолецитин, плуронієві поліоли (pluronic polyols), поліаніони, пептиди, нафту або вуглеводневі емульсії, гемоціанін лімфи слимака, динітрофенол і потенційно корисні людські ад'юванти, наприклад, такі як BCG (bacille Calmette-Guerin (Кальмет-герен бацили) та Corynebacterium parvum. Переважно допоміжний фактор є фармацевтично прийнятним. Різні методи, відомі з рівня техніки, можуть бути використані для одержання поліклональних антитіл до поліпептидів за винаходом. Для одержання антитіла організми різних тварин можуть бути імунізовані ін'єкцією з поліпептидом за винаходом, включаючи, але не обмежуючись, кроликів, мишей, щурів, овець, кіз тощо. В одному з прикладів здійснення поліпептид за винаходом може поєднуватися з імуногенним носієм, наприклад, бичачим сироватковим альбуміном (BSA) або гемоціаніном лімфи слимака (KLH). Різні допоміжні фактори можуть бути використані для посилення імунологічної реакції, залежно від виду організму-господаря, включаючи, але не обмежуючись, повний та неповний ад'ювант Freund, мінеральні гелі, такі як гідроокис алюмінію, поверхнево-активні речовини, такі як лізолецитин, плуронієві поліоли (pluronic polyols), поліаніони, пептиди, масляні емульсії, гемоціанін лімфи слимака, динітрофенол і потенційно корисні людські ад'юванти, наприклад, такі як BCG (bacille CalmetteGuerin (Кальмет-герен бацили) та Corynebacterium parvum. Для приготування моноклональних антитіл, призначених для поліпептиду за винаходом, може бути використана будь-яка технологія, яка забезпечує виробництво молекул антитіла методом безперервних клональних клітинних ліній. Вони включають, але не обмежені ними, технологію гібридоми, первинно розроблену Kohler et al., (1975) Nature, 256:495-497, технологію тріоми, технологію гібридоми людської B-клітини [Kozbor et al., (1983) Immunology Today, 4:72] і технологію EBV-гібридоми для виробництва людських моноклональних антитіл [Cole et al., (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Моноклональні антитіла та терапія раку) pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc.]. "Безсмертні" клітинні лінії, що утворюють антитіла, можуть бути вироблені з використанням технологій, відмінних від технології злиття, наприклад, із застосуванням технології прямої трансформації B лімфоцитів онкогенної ДНК або трансфекції вірусом Epstein-Barr. Див., наприклад, патенти U.S. №№ 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,451,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; і 4,493,890. У додатковому прикладі здійснення винаходу моноклональні антитіла можуть бути утворені у неінфікованих тварин з використанням недавно розробленої технології. Згідно з винаходом, можуть бути використані антитіла свині або курчати, причому вони можуть бути одержані при використанні гібридом курчати чи свині або шляхом трансформування В-клітин вірусом EBV in vitro. Фактично, згідно з винаходом, можуть бути використані методики, розроблені для створення "химерних антитіл" [Morrison et al., (1984) J. Bacteriol., 159-870; Neuberger et al., (1984) Nature, 312:604-608; Takeda et al., (1985) Nature, 314:452-454] шляхом з'єднання генів із молекули антитіла миші, визначеної для поліпептиду за винаходом, разом з генами із молекули антитіла адекватної біологічної активності; такі антитіла входять в обсяг захисту даного винаходу. Такі химерні антитіла переважні для використання у терапії кишкових хвороб або порушень (описано інфра), оскільки самі по собі антитіла набагато менш імовірні порівняно з екзогенними антитілами для індукції імунної відповіді, особливо алергічної реакції. Відповідно до винаходу, технології, описані для виробництва одноланцюжкових антитіл (патент U.S. 4,946,778), можуть бути пристосовані для виробництва одноланцюжкових антитіл, специфічних для поліпептиду за винаходом. Додатковий приклад здійснення винаходу використовує технологію, описану для конструкції бібліотек експресії Fab [Huse et al., (1989) Science, 246:1275-1281], щоб дати можливість забезпечити швидку та просту у виконання 14 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ідентифікацію моноклональних Fab-фрагментів із заданою специфічністю для поліпептиду за винаходом. Фрагменти антитіла, які містять ідіотип молекули антитіла, можуть бути утворені методами, відомими з рівня техніки. Наприклад, такі фрагменти включають, але не обмежені ними: F(ab') 2фрагмент, який може бути утворений переварюванням пепсину молекули антитіла; Fab'фрагменти, які можуть бути утворені, відновлюючи дисульфідні містки F(ab') 2-фрагмента, і Fab'фрагменти, які можуть бути одержані шляхом обробки молекули антитіла папаїном та відновником. При виготовленні антитіл скринінг заданого антитіла може бути забезпечений з використанням методик, проб та досліджень, відомих з рівня техніки, таких, наприклад, як радіоімуноаналіз, ELISA, імунологічні аналізи, виконані за допомогою детекторного імунокомплексу "сендвіч", імунорадіометричні дослідження, гелеві дифузійні преципітинові реакції, імунодифузійні дослідження, імунологічні дослідження in situ (що використовують, наприклад, колоїдне золото, фермент або радіоізотопні лейбли), вестерн-блотінги, реакції осадження, проби аглютинації (наприклад, проби аглютинації гелю, проби гемаглютинації), проби реакції зв'язування комплементу, проби імунофлуоресценції, проби А протеїну, проби імуноелектрофорезу тощо. В одному з прикладів здійснення зв'язування антитіла виявлено шляхом виявлення лейбла (мітки) на первинному антитілі. В іншому прикладі здійснення первинне антитіло виявлено шляхом зв'язування вторинного антитіла або реактиву з первинним антитілом. Ще в одному прикладі здійснення марковано вторинне антитіло. З рівня техніки відома велика кількість засобів виявлення зв'язування у процесі імунологічного аналізу, які підпадають під обсяг захисту даного винаходу. Наприклад, щоб обрати антитіла, які розпізнають специфічний епітоп поліпептиду за винаходом, можна досліджувати вироблені гібридоми для продукту, який зв'язується з фрагментом поліпептиду за винаходом, що містить такий епітоп. Даний винахід поширюється на способи діагностики та профілактики, що визначають присутність B. hyodysenteriae, використовуючи поліпептид за винаходом і/або антитіла, які зв'язуються з поліпептидом за винаходом, а також на набори, використовувані для діагностики та прогнозування інфекцій B. hyodysenteriae. Діагностичні та прогностичні методи повинні проводитися, використовуючи біологічний зразок, одержаний від тварини, наприклад, курчати або свині. Термін "зразок" стосується тканини тварини або плинного середовища, що підозрююються в наявності у них різновидів Brachyspira, наприклад, B. hyodysenteriae, або її багатонуклеотидів, або його поліпептидів. Приклади такої тканини або плинного середовища включають, але не обмежені ними, плазму, сироватку, фекальний матеріал, сечу, легені, серце, скелетний м'яз, шлунок, кишки, а також in vitro елементи клітинної культури. Винахід забезпечує методи виявлення наявності поліпептиду за винаходом у зразку, що включають наступні операції: (a) забезпечення контакту із зразком підозрюваного у вмісті у ньому поліпептиду за винаходом з антитілом (переважно зв'язаним з твердою опорою), яке специфічно зв'язується з поліпептидом за винаходом за умов, які враховують формування реактивних комплексів, що включають антитіло та поліпептид за винаходом; і (b) виявлення формування реактивних комплексів, що включають антитіло та поліпептид за винаходом у зразку, при цьому виявлення формування реактивних комплексів вказує на наявність у зразку поліпептиду за винаходом. Переважно антитіло, використовуване у даному способі, є похідним від одержаного методом афінної очистки поліклонального антитіла, більш прийнятно – моноклонального антитіла. Крім того, переважно, якщо молекули антитіла, використовувані у даному винаході, присутні у вигляді Fab, Fab', F(ab')2 або F(v)-ділянок чи цілих молекул антитіл. Особливо переважні способи виявлення B. hyodysenteriae, засновані на вищезазначеному методі, включають твердофазовий імуноферментний аналіз, радіоімуноаналізи, імунорадіометричні проби та імуноензиматичні проби, включаючи проби типу сендвіча, що використовують моноклональні і/або поліклональні антитіла. Три такі методики, які є особливо корисними, у процесі застосування використовують або поліпептид за винаходом (або його фрагмент) з міткою виявлення, антитіло Ab 1 з міткою виявлення або антитіло Ab2 з міткою виявлення. В цілому методики можуть бути узагальнені наступними рівняннями, в яких наявність зірочки вказує на те, що частка маркована, а "AA" означає поліпептид за винаходом: A. AA* + Ab1=AA*Ab1 B. AA+Ab1* = AA Ab1* C. AA+Ab1+Ab2* = Ab1 AA Ab2*. 15 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вказані методики та їх використання відомі кваліфікованим фахівцям з рівня техніки і, відповідно, можуть бути використані в обсязі даного винаходу. "Конкурентоздатна" методика, методика A, описана у патентах U.S. №№ 3 654 090 та 3 850 752. Методика B являє собою добре відомі конкурентоздатні методи досліджень. Методика C, методика "сендвіча", описана у патентах U.S. №№ RE 31,006 та 4,016,043. Крім того, можуть використовуватися інші відомі методики, наприклад, методика "подвійного антитіла" або "DASP". У кожному випадку поліпептид за винаходом формує комплекси з одним або більше антитілом(ами) чи зв'язувальними компонентами-партнерами, при цьому один компонент комплексу маркований лейблом (міткою), що піддається виявленню. Існує неспростовний факт, що комплекс вже сформований, і, якщо потрібно, його кількісний склад може бути визначений відомими методами, застосовуваними для виявлення міток. Із сказаного вище випливає, що характерна властивість Ab 2 полягає в реакції з Ab1. Ця реакція можлива тому, що Ab1, сформований в одному із видів ссавця, використовувався в іншому виді як антиген для генерування антитіла Ab2. Наприклад, Ab2 може бути сформований у кіз в результаті використання антитіл кролика як антигенів. Тому Ab 2 міг би бути антитілом антикролика, сформованим у кіз. З метою кращого розуміння викладу даного опису та формули винаходу Ab1 далі згадуватиметься як первинне антитіло, а Ab2 буде згадуватися як вторинне або анти-Ab1 антитіло. Мітками, найчастіше використовуваними для подібних досліджень, є радіоактивні елементи, ензими, хімічні речовини, що флуоресціюють під впливом ультрафіолетового випромінювання, та інші. Прикладами флуоресціюючих матеріалів, придатних для використання як мітки, є флуоресцеїн, родамін та аурамін. Специфічним матеріалом виявлення є антитіло анти-кролика, препароване у козах та поєднане з флуоресцеїном за допомогою ізотіоціанату. Прикладами 3 14 32 35 36 51 57 58 59 90 125 131 186 переважних ізотопів є H, C, P, S, Cl, Cr, Co, Co, Fe, Y, I, I та Re. Радіоактивна мітка може бути виявлена з використанням будь-якої доступної методики підрахунку. Незважаючи на те, що з цією метою може бути використано безліч ферментів, прикладами переважних ферментів є: пероксидаза, ß-глюкуронідаза, ß-d-глюкозидаза, ß-d-галактозидаза, уреаза, оксидаза глюкози плюс пероксидаза та лужна фосфатаза. Фермент сполучається з обраною часткою в результаті реакції з "місточковими" молекулами, наприклад, карбодіімідами, діізоціанатами, глютаральдегідом і тому подібними. Ферментні мітки можуть бути виявлені будь-яким з використовуваних способів, наприклад, колориметричним, спектрофотометричним, флуороспектрофотометричним, амперометричним або газометричним способами. Патенти U.S №№ 3 654 090; 3 850 752 та 4 016 043 згадані у цьому документі як приклади, що розкривають додаткові матеріали для міток та способи здійснення маркування. Винахід також забезпечує метод виявлення антитіл для поліпептиду за винаходом у біологічних зразках, застосовуючи наступні операції: (a) забезпечення наявності поліпептиду за винаходом або його фрагмента; (b) інкубацію біологічного зразка з названим поліпептидом за винаходом в умовах, які враховують формування комплексу антигена-антитіла; і (c) визначення, чи сформований комплекс антигена-антитіла з поліпептидом за винаходом. В іншому прикладі здійснення винаходу представлені in vitro способи оцінки рівня антитіл для поліпептиду за винаходом у біологічному зразку, використовуючи наступні операції: (a) виявлення формування реактивних комплексів у біологічному зразку згідно з методом, зазначеним вище; і (b) оцінку кількості сформованих реакційних комплексів, яка кількість реакційних комплексів відповідає рівню поліпептиду за винаходом у біологічному зразку. Крім того, представлені in vitro способи моніторингу терапевтичного лікування хвороби, що асоціюється з B. hyodysenteriae в організмі тварин, шляхом оцінки, як описано вище, рівнів антитіл для поліпептиду за винаходом у низці біологічних зразків, одержаних в різні моменти часу від організму тварин, що піддаються такому терапевтичному лікуванню. Даний винахід розкриває способи виявлення наявності або відсутності B. hyodysenteriae у біологічному зразку шляхом виконання операцій: (a) забезпечення контакту біологічного зразка з пробою полінуклеотиду або затравкою полінуклеотиду за винаходом за відповідних умов гібридизації; і (b) виявлення будь-якого дуплекса, сформованого між пробою або затравкою та нуклеїновою кислотою у зразку. Згідно з одним із прикладів здійснення винаходу, виявлення B. hyodysenteriae може бути досягнуте при безпосередньому посиленні послідовностей полінуклеотиду з біологічного зразка, використовуючи відомі методи, з подальшим виявленням наявності послідовностей полінуклеотиду за винаходом. В одному із варіантів винаходу цільова послідовність нуклеїнової кислоти посилюється PCR і потім виявляється шляхом використання будь-якого із специфічних способів, згаданих вище. Перелік інших відповідних для використання діагностичних методів виявлення наявності 16 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностей полінуклеотиду включає, не обмежуючись ними: 1) алель-специфічну PCR (полімеразно-ланцюгову реакцію); 2) одноланцюжковий підтверджуючий аналіз; 3) електрофорез у градієнті денатуруючого гелю; 4) проби захисту від Рнкази; 5) використання протеїнів, які розпізнають нуклеотидну невідповідність, таких як E. coli mutS протеїн; 6) алельспецифічні олігонуклеотиди; і 7) флуоресцентна in situ гібридизація. На додаток до вищезазначених методів полінуклеотидні послідовності можуть бути виявлені, використовуючи технологію звичайного дослідження. Коли проби використовуються для виявлення наявності заданих полінуклеотидних послідовностей, підлягаючий дослідженню біологічний зразок, наприклад, кров або сироватка, за бажанням, може бути оброблений з метою екстракції нуклеїнових кислот. Для полегшення виявлення цільової послідовності полінуклеотидні послідовності зразка можуть бути оброблені різними способами, наприклад, денатуруванням, рестрикційним переварюванням (гідроліз), електрофорезом або точковим блотінгом. Націлена ділянка нуклеотидної послідовності зразка зазвичай повинна бути, щонайменше частково, одноланцюжковою, щоб сформувати гібриди з цільовою послідовністю проби. Якщо послідовність є природно одноланцюжковою, денатурація не потрібна. Однак якщо послідовність виявиться дволанцюжковою, то послідовність, імовірно, повинна бути денатурована. Денатурування може бути виконане різними методами, відомими з рівня техніки. Полінуклеотидні послідовності зразка та проби інкубують в умовах, які сприяють формуванню стійкого гібрида цільової послідовності у пробі з передбачуваною заданою полінуклеотидною послідовністю у зразку. Переважно для запобігання хибним позитивним результатам дослідження проводять у суворих умовах. Виявлення одержаного гібрида (якщо такий є) зазвичай досягається за допомогою маркованих проб. Як альтернатива, проба може бути немаркована, але піддаватися виявленню завдяки специфічному зв'язуванню з лігандом, який маркований, або прямо чи опосередковано. Підхожі мітки та способи маркування проб і ліганд відомі з рівня техніки і включають, наприклад, радіоактивні мітки, які можуть бути інкорпоровані відомими методами (наприклад, ніктрансляцією (зміщенням розриву), довільним примируванням або kinasing), біотин, флуоресцентні групи, хемілюмінесцентні групи (наприклад, діоксетани, особливо цільові діоксетани), ферменти, антитіла тощо. Варіанти основної схеми відомі з рівня техніки і їх перелік включає такі варіанти, які полегшують відокремлення виявлених гібридів від сторонніх матеріалів і/або які підсилюють сигнал від маркованої частки. В обсяг захисту винаходу входить також те, що дослідження проби нуклеїнової кислоти за винаходом можуть використовувати коктейль проб нуклеїнової кислоти, здатних виявити задані полінуклеотидні послідовності за винаходом. Так, в одному з прикладів здійснення, щоб виявити наявність полінуклеотидної послідовності за винаходом у клітинному зразку, використовують більше однієї проби додатково до полінуклеотидних послідовностей, зокрема, число різних проб альтернативне 2, 3 або 5 різним послідовностям проб нуклеїнової кислоти. Полінуклеотидні послідовності, описані у цьому документі (переважно у вигляді проб), можуть бути іммобілізовані на твердофазовій опорі для виявлення видів Brachyspira species, включаючи, але не обмежуючись ними, B. hyodysenteriae, B. intermedia, B. alvinipulli, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii і B. pilosicoli. Як альтернатива, полінуклеотидні послідовності, описані у цьому документі, формують частину бібліотеки ДНК-молекул, які можуть бути використані для одночасного виявлення числа різних генів із Brachyspira-виду, наприклад, B. hyodysenteriae. Як ще одна альтернативна форма за винаходом, полінуклеотидні послідовності, описані у даному документі, разом з іншими полінуклеотидними послідовностями (від інших бактерій або вірусів) можуть бути іммобілізовані на твердій опорі таким чином, щоб дати можливість ідентифікувати наявність різновиду Brachyspira, такого як B. hyodysenteriae, і/або будь-яку іншу із полінуклеотидних послідовностей, зв'язаних на твердій опорі. Технічні засоби створення іммобілізованих бібліотек молекул ДНК були описані у рівні техніки. В принципі, більшість способів із попереднього рівня техніки розкривають синтез бібліотек одноланцюжкових молекул нуклеїнової кислоти, використовуючи, наприклад, "запасаючі" методи створення різних перестановок (пермутацій) послідовностей у різних дискретних положеннях на твердому субстраті. Патент U.S. № 5 837 832 описує вдосконалений метод одержання безлічі ДНК, іммобілізованих на силіконових субстратах, заснований на великомасштабній технології інтеграції. Зокрема, патент U.S. № 5 837 832 описує так звану стратегію "tiling" ("настил черепичної покрівлі") для синтезування специфічних наборів проб у певних просторових місцеположеннях на субстраті, які можуть бути використані для одержаних іммобілізованих бібліотек ДНК за даним винаходом. Патент U.S. № 5 837 832 також пропонує посилання на більш ранні методи, які також можуть бути використані. Таким чином, проби полінуклеотидних послідовностей можуть бути синтезовані in situ на поверхні субстрату. 17 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як альтернатива, одноланцюжкові молекули можуть бути синтезовані поза твердим субстратом, і кожна передсформована послідовність застосована для дискретного положення на твердому субстраті. Наприклад, полінуклеотидні послідовності можуть бути надруковані безпосередньо на субстраті, використовуючи автоматизовані пристрої, обладнані або штифтами або п'єзоелектричними пристроями. Послідовності бібліотеки зазвичай іммобілізують на або у дискретних ділянках твердого субстрату. Субстрат може бути пористим, щоб забезпечити іммобілізацію в межах субстрату, або, суттєво, позбавленим пор, коли послідовності бібліотеки звичайно іммобілізуються на поверхні субстрату. Твердий субстрат може бути виготовлений з будь-якого матеріалу, з яким поліпептиди можуть зв'язуватися прямо або побічно. Перелік прикладів підхожих твердих субстратів включає плоске скло, силіконові пластинки, слюду, кераміку та органічні полімери, наприклад, пластмаси, включаючи полістирол і поліметакрулат. Можливе також використання напівпроникних мембран, наприклад, широко доступних мембран із нітроцелюлози або нейлону. Напівпроникні мембрани можуть бути встановлені на більш жорсткій твердій поверхні, прикладом якої є скло. У разі потреби, поверхні можуть бути покриті шаром металу, наприклад, золотом, платиною або іншим перехідним металом. Переважно твердим субстратом є матеріал, що має тверду або напівтверду поверхню. У переважних прикладах здійснення, щонайменше, одна поверхня субстрату повинна бути суттєво плоскою, хоча в окремих прикладах здійснення може виникнути потреба у фізично окремих одна від одної областях синтезу для різних полімерів, наприклад, з підвищеними ділянками або з протравленими канавками. Переважно, щоб твердий субстрат був придатний для високої щільності нанесення послідовностей ДНК у дискретних ділянках, зазвичай, від 50 до -2 100 μm, забезпечуючи щільність 10000-40000 dots/cm (плям на кв. см). Твердий субстрат, за необхідності, розділений у секції. Це досягається такими методами, як фототравлення, або застосуванням гідрофобних чорнил, наприклад, чорнил на основі тефлону (Cel-line, USA). Дискретні положення, в яких розташовується кожен окремий елемент бібліотеки, можуть бути будь-якої зручної форми, наприклад, круглими, прямокутними, еліптичними, у формі клина тощо. Накладення полінуклеотидних послідовностей на субстрат може бути виконане ковалентними або нековалентними засобами. Полінуклеотидні послідовності можуть бути приєднані до субстрату через шар молекул, з якими зв'язуються послідовності бібліотеки. Наприклад, полінуклеотидні послідовності можуть бути марковані біотином, при цьому субстрат покритий авідином і/або стрептавідином. Зручність використання біотинільованої полінуклеотидної послідовності полягає у тому, що у цьому випадку може бути легко визначена ефективність зчеплення з твердим субстратом. Оскільки полінуклеотидні послідовності можуть погано зв'язуватися з окремими твердими субстратами, часто виникає потреба у забезпеченні хімічного інтерфейсу між твердим субстратом (наприклад, склом) і послідовностями нуклеїнової кислоти. Приклади підхожих хімічних інтерфейсів включають гексаетиленгліколь. Іншим прикладом є використання скла, покритого полілізином, причому потім полілізин хімічно модифікується з використанням стандартних методик введення афінного ліганду. З рівня техніка відомі й інші методи приєднання молекул до поверхонь твердого субстрату шляхом використання зчеплювальних агентів, див., наприклад, WO98/49557. Зв'язування комплементарних полінуклеотидних послідовностей з іммобілізованою нуклеїнокислотною бібліотекою може бути виявлено безліччю засобів та ознак, наприклад, змінами в оптичних характеристиках зв'язаної полінуклеотидної послідовності (тобто за допомогою етидіумсброміду) або з використанням маркованих нуклеїнових кислот, йдеться про поліпептиди, марковані фторофорами. Існують інші способи виявлення, що не потребують використання міток, які засновані на таких оптичних методах, як, наприклад, оптоакустика, рефлектометрія, еліпсометрія і резонансний метод поверхневих плазмонів (див. WO97/49989). Таким чином, існуючий винахід забезпечує твердий субстрат, що іммобілізував на собі, щонайменше, один полінуклеотид за даним винаходом, переважно дві або більше різних полінуклеотидних послідовності за даним винаходом. Даний винахід також може бути використаний як профілактичний чи терапевтичний засіб, який може бути застосований з метою стимулювання гуморальних відповідей та відповідей, забезпечених через клітини, в організмі таких тварин, як курча та свиня, створюючи, таким чином, захист проти колонізації різновидами Brachyspira, включаючи, але не обмежуючись ними, B. hyodysenteriae, B. suanatina, засоби передачі B., B. alvinipulli, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii і B. pilosicoli. Природна інфекція, привнесена різновидом Brachyspira, наприклад, B. hyodysenteriae, генерує циркулюючі титри антитіла проти протеїнів, описаних у даному 18 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 документі. Тому розкриті амінокислотні послідовності або їхні частини здатні сформувати основу для профілактичного або терапевтичного засобу, що вводиться системно або перорально, для забезпечення захисту проти кишкового спірохетозу. Відповідно, в одному із прикладів здійснення даного винаходу розкриті описані тут амінокислотні послідовності або їхні фрагменти, або антитіла, які зв'язують розкриті у даному документі амінокислотні послідовності чи полінуклеотидні послідовності у терапевтично ефективній кількості, з доданням фармацевтично прийнятного носія, розчинника або наповнювача. У контексті даного винаходу фраза "терапевтично ефективна кількість" використовується для позначення кількості, достатньої для зниження, щонайменше, приблизно на 15 %, переважно, щонайменше, на 50 %, більш прийнятно, щонайменше, на 90 %, і найбільш прийнятно, для запобігання клінічно значущого дефіциту в активності, функціонуванні та реактивності організму тварин. Як альтернатива, терапевтично ефективної кількості достатньо, щоб викликати поліпшення клінічно значущого стану організму тварини (організму-господаря). Фраза "фармацевтично прийнятний" стосується молекулярних частинок та композицій, які при введенні в організм тварини є фізіологічно толерантними і зазвичай не викликають ані алергічної, ані будь-якої побічної несприятливої реакції, такої, наприклад, як шлунковий розлад. Термін "носій" стосується розчинника, допоміжного фактора, наповнювача або переносника, з яким вводиться сполука. Такі фармацевтичні носії можуть бути представлені стерильними рідинами, наприклад, вода та олії, включаючи вироблені із нафти, а також тваринного, рослинного або синтетичного походження, наприклад, арахісова олія, соєва олія, мінеральне масло, олія кунжуту тощо. Водні або фізіологічні розчини, водна декстроза та гліцеринові розчини переважно використовуються як носії, особливо розчини для ін'єкцій. Підхожі фармацевтичні носії описані у роботі Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). У розділі опису винаходу, присвяченому детальному розкриттю прикладів здійснення об'єктів, представлені фармацевтичні композиції, що включають терапевтично ефективні кількості описаних амінокислотних послідовностей або їх аналогів, їх фрагментів або похідних продуктів, або антитіла спільно з фармацевтично прийнятними розріджувачами, консервантами, розчинниками, емульгаторами, ад'ювантами і/або носіями. Такі композиції включають розріджувачі різного буферного вмісту (наприклад, Tris-HCl, ацетат, фосфат), з різними значеннями рН фактора та іонної сили і добавки, такі як детергенти та розчинні засоби (наприклад, Tween 80, Polysorbate 80), антиоксиданти (наприклад, аскорбінова кислота, метабісульфіт натрію), консерванти (наприклад, Thimersol, бензиловий спирт) і речовини збільшення об'єму (наприклад, лактоза, манітол). Матеріал може бути включений у корпускулярні препарати полімерних сполук, наприклад, полімолочної кислоти, полігліколевої кислоти тощо, або у ліпосоми. Може також використовуватися гіалуронова кислота. Такі композиції можуть впливати на фізичний стан, стабільність, інтенсивність випускання in vivo, а також на ступінь чистоти in vivo існуючих протеїнів та їхніх похідних. Див., наприклад, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) стор. 1435-1712, які включені у даний документ методом посилання. Композиції можуть бути приготовлені у рідкій формі або у формі висушеного порошку, так званій ліофілізованій формі. Як альтернатива, полінуклеотиди за винаходом можуть бути оптимізовані для експресії у рослинах (наприклад, зернових). Рослина може бути трансформована плазмідами, що містять оптимізовані полінуклеотиди. Потім рослину вирощують, і в рослині експресують протеїни за винаходом, або експресує рослина-оптимізована версія. Пізніше урожай рослини збирають, а ділянки рослини, що містять протеїн за винаходом, обробляють на корм тварині. Разом із з'їденим кормом тварині передається імунітет проти B. hyodysenteriae. Приклади із попереднього рівня техніки, що детально описують вказані методики, можуть бути знайдені у патенті U.S № 5 914 123(Arntzen, et al.); патенті U.S. № 6,034,298 (Lam, et al.); і патенті U.S. № 6,136,320 (Arntzen, et al.). Слід завважити, що фармацевтичні композиції, одержані відповідно до винаходу, можуть вводитися будь-яким способом, відомим з рівня техніки. Переважно фармацевтичні композиції, що призначаються хворим, вводяться у вигляді ін'єкцій перорально, легеневим або носовим шляхом. Амінокислотні послідовності, описані у даному документі, або їхні похідні антитіла більш прийнятно вводяться внутрішньовенно, внутрішньоартеріально, інтраперитонеально, внутрішньом'язово або підшкірно. Як альтернатива, амінокислотна послідовність, описана у даному документі, або її похідні антитіла після відповідного оформлення можуть призначатися для носового або парорального введення. 19 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід поширюється на застосування полінуклеотидних послідовностей за винаходом, так само як антисенсорних та рибозимних полінуклеотидних послідовностей, що піддаються гібридизації відносно полінуклеотидної послідовності, яка кодує амінокислотну послідовність, відповідну винаходу, для приготування медикаменту для модуляції хвороби, що асоціюється з B. hyodysenteriae. Полінуклеотидні послідовності, що кодують антисенсорні конструкції або рибозими для використання у терапевтичних методах, за бажанням, вводяться безпосередньо як елементарна конструкція нуклеїнової кислоти. Поглинання елементарних конструкцій нуклеїнової кислоти бактерійними клітинами посилюється деякими відомими методами трансфекції, наприклад, такими, які включають використання агентів трансфекції. Прикладами таких агентів є катіонні агенти (наприклад, фосфат кальцію та DEAE-декстран) і ліпофектанти. Як правило, конструкції нуклеїнової кислоти змішуються з агентом трансфекції для виробництва композиції. Як альтернатива, антисенсорна конструкція або рибозими можуть бути об'єднані з фармацевтично прийнятним носієм або розріджувачем для приготування фармацевтичної композиції. Підхожі носії та розріджувачі включають ізотонічні фізіологічні розчини, наприклад, буферизований фосфатом сольовий розчин. Композиція може бути приготовлена для парентерального, внутрішньом'язового, внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньоочного, орального або трансдермального призначення. Шляхи описаного призначення розраховані тільки для орієнтовної рекомендації, оскільки кваліфікований фахівець у змозі визначити оптимальний шлях введення та дозування для будь-якої специфічної тварини та захворювання. Даний винахід також включає набір для скринінгу тварин, стосовно яких існує припущення в інфікуванні різновидом Brachyspira, наприклад, B. hyodysenteriae, або з метою підтвердження того, що тварина інфікована різновидом Brachyspira, наприклад, B. hyodysenteriae. В інших прикладах здійснення винаходу набори, придатні для використання фахівцем, можуть бути приготовлені для виявлення наявності чи відсутності різновидів Brachyspira, включаючи, але не обмежуючись ними, B. hyodysenteriae, B. suanatina, B. intermedia, B. alvinipulli, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii та B. pilosicoli у здогадно інфікованих тварин або для кількісного визначення різновидів Brachyspira, включаючи, але не обмежуючись ними, B. hyodysenteriae, B. suanatina, B. intermedia, B. alvinipulli, B. aalborgi і B. pilosicoli інфекцією. Відповідно до описаних вище методів тестування такі набори можуть містити, щонайменше, маркований варіант однієї з амінокислотних послідовностей, описаних у цьому документі, або зв'язаний з нею партнер, наприклад, специфічне відносно неї антитіло, і рекомендації залежно від обраного методу, наприклад, "конкурентоздатного", "сендвіча", "DASP" тощо. Як альтернатива, такі набори можуть містити, щонайменше, полінуклеотидну послідовність, комплементарну до ділянки однієї з полінуклеотидних послідовностей, описаних у даному документі, разом з інструкціями щодо використання. Набори можуть також містити другорядні реагенти, такі як буфери, стабілізатори тощо. Відповідно, випробувальний набір для демонстрації наявності різновиду Brachyspira, включаючи, але не обмежуючись ними, B. hyodysenteriae, B. suanatina, B. intermedia, B. alvinipulli, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii і B. pilosicoli, може містити наступне: (а) задану кількість, щонайменше, одного маркованого імунохімічного реактивного компонента, одержаного шляхом безпосереднього або опосередкованого приєднання однієї з амінокислотних послідовностей, описаних у даному документі, або специфічно приєднаного до неї партнера до мітки, що піддається виявленню; (b) інші реагенти; і (с) рекомендації з використання вказаного набору. Більш специфічно, діагностичний тестовий набір може містити: (а) відому кількість однієї з амінокислотних послідовностей, описаних у даному документі, як вказано вище, (або зв'язувального партнера), в основному, зв'язаної з твердою фазою для формування імуносорбенту, або, як альтернатива, зв'язаної з відповідним ярликом; або є безліч таких кінцевих продуктів тощо; (b) якщо необхідно, інші реагенти; і (с) рекомендації з використання вказаного тестового набору. В інших комплектаціях тестовий набір може містити: (а) маркований компонент, який був одержаний шляхом зчеплення однієї із амінокислотних послідовностей, описаних у даному документі, з міткою, що піддається виявленню; (b) один або декілька додаткових імунохімічних реагентів, з яких, щонайменше, один реагент є лігандом або іммобілізованим лігандом, причому даний ліганд обраний із групи, що включає: (i) ліганд, здатний зв'язуватися з маркованим компонентом (a); 20 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (ii) ліганд, здатний зв'язуватися із зв'язувальним партнером маркованого компонента (a); (iii) ліганд, здатний зв'язуватися, щонайменше, з одним із компонентів (s) з метою визначення; або (iv) ліганд, здатний зв'язуватися, щонайменше, з одним із зв'язувальних партнерів, щонайменше, одного із компонентів (s) з метою визначення; і (c) рекомендації (інструкції) для складання протоколу для виявлення і/або визначення одного чи кількох компонентів імунохімічної реакції між однією із амінокислотних послідовностей, описаних у цьому документі, і специфічним відносно до неї зв'язувальним партнером. Приготування геномної бібліотеки Геномну бібліотеку приготовляють, використовуючи ізолят B. hyodysenteriae ділянки австралійської свині (штам WA1). Даний штам був ретельно досліджений. Дослідження показали його вірулентність після експериментального контрольного зараження свиней. Метод цетилтриметиламонію (CTAB) використовується для приготування високоякісної хромосомної ДНК, придатної для підготовки бібліотек геномної ДНК. B. hyodysenteriae вирощують у 100 мл 9 анаеробної бульйонної культури сої (Trypticase Soy Broth) до клітинної щільності 10 клітин/мл. Клітини збирають при 4.000 x g протягом 10 хвилин, а клітинну масу (осад у пробірці) повторно суспендують у 9,5 мл TE-буфера. SDS додають до одержання остаточної концентрації 0,5 % (вага/об'єм (w/v)) і клітини лізують при 37C протягом 1 години з 100 µг протеїнази K. NaCl додають до остаточної концентрації 0,7 M і 1,5 мл CTAB/NaCl розчину (10 % w/v CTAB, 0,7 M NaCl) додають перед інкубуванням розчину при 65C протягом 20 хв. Лізат екстрагують з рівним обсягом хлороформу/ізоамілового спирту і трубку центрифугують при 6.000 x g протягом 10 хвилин для відокремлення фаз. Рідку фазу переносять у чисту трубку і додають 0,6 обсягу ізопропанолу для вивільнення високомолекулярної ДНК. Осаджену ДНК збирають, використовуючи зігнуту скляну паличку, і переносять у трубку, що містить 1 мл 70 % (об'єм/об'єм (v/v) етанолу. Трубку центрифугують у 10. 000 x g і осаджену (гранульовану) ДНК повторно розчиняють у 4 мл буфера TE протягом 12 годин. Градієнт хлориду цезію, що містить 1,05 г/мл CsCl і 0,5 мг/мл етидіумброміду, приготовляють, використовуючи розчин повторно розчиненої ДНК. Градієнт переносять у 4 мл герметизовані трубки центрифуги і центрифугують при 70 000 x g протягом 12 годин при 15C. Виділену ДНК візуалізують при ультрафіолетовому освітленні і високомолекулярну ДНК дістають з градієнта, використовуючи 15-г голку. Етидіумбромід вилучають з ДНК шляхом послідовної екстракції CsCl-насиченим ізопропанолом. Очищена хромосомна ДНК діалізується 2-літровим TE буфером і осаджується ізопропанолом. Повторно суспендована геномна ДНК фрагментується, використовуючи генний фрагментатор GeneMachines Hydroshear (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI), і фрагментована ДНК наповнюється, використовуючи Klenow ДНК полімеразу для генерування фрагментів з тупим кінцем. Одна сотня нг (ng) фрагментів ДНК з тупим кінцем лігується з 25 нг (ng) вектора pSMART VC (Lucigen, Meddleton, WI), використовуючи лігазу CloneSmart DNA. Потім лігована ДНК піддається електропорації у E. coli електрокомпетентних клітинах. Невеличка вбудована бібліотека (2-3 КБ) та вбудована бібліотека живильного середовища (3-10 kb) вставляються у слабо репліковану версію pSMART VC-вектора. Геномне секвенування Після одержання геномної бібліотеки обирають індивідуальні клони E. coli, що містять pSMART VC-вектор. Очищають та упорядковують ДНК плазміди. Очищені плазміди піддають автоматизованому прямому секвенуванню pSMART VC-вектора, використовуючи прямі та зворотні затравки, специфічні відносно pSMART VC-вектора. Кожна реакція секвенування виконується у 10 μл обсязі, що складається з 200 нг ДНК плазміди, 2 пмол (pмол) затравки і 4 μл ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Mix (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Коловий процес включає 2-хвилинну операцію денатурування при 96C з подальшими 25 циклами денатурації при 96C протягом 10 секунд і об'єднану операцію відпалу (ренатурування) затравки та подовження при 60C протягом 4 хвилин. Залишки фарбника видаляють від продуктів секвенування шляхом осадження 95 % (v/v (об'єм/об'єм) етанолом, що містить 85 мМ ацетат натрію (pH 5,2), 3 mM EDTA (pH 8), і піддають вакуумному сушінню. Плазміди секвеновані у двох примірниках з використанням кожної затравки. Продукти секвенування піддають аналізу із застосуванням секвенатора ДНК ABI 373A (PE Applied Biosystems). Анотація Часткові геномні послідовності для B. hyodysenteriae збирають та анотують, використовуючи увесь діапазон інструментарію біоінформатики для дослідження та повторного дослідження послідовностей як частини методики забезпечення якісного проведення аналізу даних. Відкриті 21 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 рамки зчитування (ORFs) зумовлені використанням цілого набору програм, включаючи GeneMark, GLIMMER, ORPHEUS, SELFID і GETORF. Передбачувані ORFs досліджені відносно гомології (ДНК та протеїну) з існуючими міжнародними базами даних, що використовують джерела, включаючи BLAST і FASTA. Все прогнозовані ORFs досліджені на предмет визначення їх клітинної локалізації, використовуючи програми, що включають PSI-BLAST, FASTA, MOTIFS, FINDPATTERNS, PHD, SIGNALP і PSORT. Бази даних, що включають Interpro, Prosite, ProDom, Pfam і Blocks, використовуються для підтвердження прогнозу про існування поверхнево асоційованих протеїнів, наприклад, таких як трансмембранні домени, лідерні пептиди, гомологи до відомих поверхневих протеїнів, сигнатури ліпопротеїнів, зовнішня мембрана, що фіксує мотиви, і клітини-господарі, що зв'язують домени. Філогенетичний та інший аналіз еволюції молекули проводиться з ідентифікованими генами та іншими різновидами, сприяючими призначенню функції. Аналіз in silico обох частково секвенованих геномів забезпечує вичерпний список всіх прогнозованих ORFs, присутніх у доступних даних послідовності. Кожен ORF опитаний для надання інформації, наприклад, щодо прогнозованої молекулярної ваги, ізоелектричної точки, гідрофобності та субклітинної локалізації, для забезпечення кореляції з in vitro властивостями природного генного продукту. Прогнозовані гени, що кодують протеїни, подібні до поверхнево локалізованих компонентів і/або факторів вірулентності в інших патогенних бактеріях, відібрані як потенційні цілі вакцини. Результати біоінформатики "Шотган"-секвенування геному B. hyodysenteriae приводить до 94,6 % (3028.6 КБ з передбачуваних 3200 КБ) секвенованого геному. B. hyodysenteriae послідовність складається із 294 контигів з середнім розміром контига 10,3 КБ. Для B. hyodysenteriae прогнозують 2 593 відкритих рамок зчитування (ORFs) від 294 контигів. Порівняння прогнозованих ORFs з генами, присутніми у базах даних нуклеїнової кислоти та протеїнів, вказує, що приблизно у 70 % ORFs існує гомологія з генами, що містилися у публічно доступних базах даних. У 30 % прогнозованих ORFs, що залишилися, відсутня будь-яка відома ідентичність. Кандидати вакцини Щоб допомогти скоротити кількість ORF, які треба тестувати як вакцини-"кандидати", ORF, які демонструють обгрунтовану гомологію (E-значення менше, ніж -15 e ) з протеїнами зовнішньої поверхні, секретованими протеїнами і можливими вірулентними факторами, присутніми у доступних базах даних, відбираються як потенційні вакцини-"кандидати". З 2 593 ORF, одержаних при геномному "шатган»-секвенуванні, багато пройшли цей тест, але результати лише тридцяти трьох генів представлені у цьому документі. Таблиця 1 демонструє тридцять три гени, відібрані як потенційні цілі для вакцини, та їх схожість з іншими відомими амінокислотними послідовностями, одержаними із бази даних SWISS-PROT. Відмічено, що процент ідентичності амінокислот не піднімається вище 58 %, тоді як процент схожості або гомологія амінокислот залишається менше 71 %, вказуючи, таким чином, на те, що дані ORF єдині у своєму роді. Таблиця 1 Ген NAV-H54 NAV-H55 NAV-H56 NAV-H57 NAV-H58 NAV-H59 Ідентичність протеїну з найвищою гомологією Brachyspira hyodysenteriae Мінливий поверхневий протеїн (VSPD) Leptospira interrogans Flagellar протеїн B Подібний до міозину головний антиген Літичний муреїновий трансглікосилат (можливо, зв'язаний із зовнішньою мембраною) Treponema pallidum протеїн зовнішньої мембрани Подібний до міозину головний антиген Ідентичність (амінокислоти) Схожість (амінокислоти) Інвентарний номер 106/223 (47 %) 136/223 (60 %) O68157 58/213 (27 %) 108/213 (50 %) Q72SJ3 288/1509 (19 %) 609/1509 (40 %) P21249 97/318 (25 %) 158/318 (41 %) Q6F7W9 57/175 (32 %) 90/175 (51 %) P96127 204/1012 (20 %) 432/1012 (42 %) P21249 40 22 UA 104714 C2 Протеїн зовнішньої мембрани і NAV-H60 споріднений пептидогліканасоційований ліпопротеїн Treponema denticola NAV-H61 передбачуваний ліпопротеїн Streptococcus suis NLPA NAV-H62 ліпопротеїн Streptococcus suis NLPA NAV-H63 ліпопротеїн Streptococcus suis NLPA NAV-H64 ліпопротеїн Streptomyces violaceoruber NAV-H65 передбачуваний секретований протеїн Escherichia coli NAV-H66 тoксин (YоеB) Протеїн зовнішньої мембрани NAV-H67 (TolC) Dehalococcoides sp, NAV-H68 можливо, гемолізину-споріднений протеїн Bacillus cereus NAV-H69 протеїн зовнішньої поверхні Vibrio vulnificus мембранаNAV-H70 асоційований ліпопротеїн Methanosarcina barkeri NAV-H71 протеїн поверхневого шару Літичний муреїновий трансNAV-H72 глікосилат (можливо, зв'язаний із зовнішньою мембраною) Escherichia coli NAV-H73 тoксин (YоеB) Протеїн/захисний антиген NAV-H74 зовнішньої мембрани Brachyspira hyodysenteriae NAV-H22 Мінливий поверхневий протеїн (VSPH) Mycoplasma mycoides мембранаNAV-H23 асоційований ліпопротеїн Ліпопротеїн зовнішньої мембрани NAV-H24 Geobacter metallireducens Bacteroides forsythus поверхневий NAV-H30 антиген (BspA) Nostoc sp NAV-H32 гемолітичний протеїн (HlpA). Prevotella intermedia гемолітичний NAV-H33 протеїн Vibrio parahaemolyticus мірулентноNAV-H37 медіативний протеїн (VirC) Літична муреїнова трансглікосилаза NAV-H40 (містить LysM/інвазійні домени) Bacteroides forsythus поверхневий NAV-H41 антиген BspA Anabaena variabilis гемолізини та NAV-H43 споріднені протеїни Leptospira interrogans порин NAV-H44 зовнішньої мембрани Geobacter sulfurreducens протеїн NAV-H45 вірулентного фактора (MviN) 46/139 (33 %) 68/139 (48 %) COG2885 336/805 (41 %) 483/805 (60 %) Q73NT0 92/269 (34 %) 151/269 (56 %) Q303L3 106/312 (33 %) 167/312 (53 %) Q303L3 112/337 (33 %) 198/337 (58 %) Q303L3 50/127 (39 %) 68/127 (53 %) Q849M9 42/85 (58 %) 60/85 (76 %) P69349 80/350 (20 %) 171/350 (39 %) Q2Z054 121/415 (29 %) 204/415 (49 %) Q3ZYX1 193/357 (54 %) 256/357 (71 %) Q4MWS0 146/417 (35 %) 203/417 (48 %) Q2SRL9 72/201 (36 %) 112/201 (49 %) Q8TJE3 51/141 (36 %) 6/141 (53 %) P44049 42/84 (50 %) 62/84 (73 %) P69349 210/833 (25 %) 339/833 (40 %) COG4775 29 % (133/454) 43 % (199/454) AAK14803.1 43 % (114/263) 60 % (159/263) AAF27178.1 32 % (46/142) 53 % (76/142) ZP00300921.1 38 % (83/216) 55 % (120/216) AAC82625.1 35 % (49/137) 56 % (77/137) NP488469.1 54 % (64/117) 70 % (83/117) AAC05836.1 36 % (58/159) 63 % (101/159) NP800579.1 26 % (120/449) 41 % (185/449) ZP00146104.1 41 % (84/201) 57 % (115/201) AAC82625.1 35 % (150/425) 56 % (242/425) ZP00162711.2 20 % (79/393) 41 % (163/393) YP001419.1 32 % (153/469) 49 % (231/469) NP952225.1 23 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ДНК і NAV-H54 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 1 і 2, відповідно. ДНК і NAV-H55 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 3 і 4, відповідно. ДНК і NAV-H56 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 5 і 6, відповідно. ДНК і NAV-H57 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 7 і 8, відповідно. ДНК і NAV-H58 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 9 і 10, відповідно. ДНК і NAV-H59 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 11 і 12, відповідно. ДНК і NAV-H60 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 13 і 14, відповідно. ДНК і NAV-H61 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 15 і 16, відповідно. ДНК і NAV-H62 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 17 і 18 відповідно. ДНК і NAV-H63 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 19 і 20, відповідно. ДНК і NAV-H64 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 21 і 22, відповідно. ДНК і NAV-H65 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 23 і 24, відповідно. ДНК і NAV-H66 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 25 і 26, відповідно. ДНК і NAV-H67 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 27 і 28, відповідно. ДНК і NAV-H68 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 29 і 30, відповідно. ДНК і NAV-H69 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 31 і 32, відповідно. ДНК і NAV-H70 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 33 і 34, відповідно. ДНК і NAV-H71 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 35 і 36, відповідно. ДНК і NAV-H72 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 37 і 38, відповідно. ДНК і NAV-H73 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 39 і 40, відповідно. ДНК і NAV-H74 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 41 і 42, відповідно. ДНК і NAV-H22 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 43 і 44, відповідно. ДНК і NAV-H23 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 45 і 46, відповідно. ДНК і NAVH24 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 47 і 48, відповідно. ДНК і NAV-H30 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 49 і 50, відповідно. ДНК і NAV-H32 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 51 і 52, відповідно. ДНК і NAV-H33 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 53 і 54, відповідно. ДНК і NAV-H37 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 55 і 56, відповідно. ДНК і NAV-H40 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 57 і 58, відповідно. ДНК і NAV-H41 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 59 і 60, відповідно. ДНК і NAV-H43 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 61 і 62, відповідно. ДНК і NAV-H44 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 63 і 64, відповідно. ДНК і NAV-H45 амінокислотні послідовності знайдені у SEQ ID №№: 65 і 66, відповідно. Щоб далі скоротити кількість ORF, які повинні бути перевірені як вакцин-"кандидати", були виключені генні продукти, що прогнозуються за допомогою силікоаналізу як локалізовані у цитоплазмі або внутрішній мембрані спірохети. В результаті подальшому дослідженню були піддані двадцять один із тридцяти трьох генів, представлених у Таблиці 1. Їх перелік включає NAV-H58, NAV-H60, NAV-H62, NAV-H64, NAV-H66, NAV-H67, NAV-H69, NAV-H71, NAV-H73, NAV-H22, NAV-H23, NAV-H24, NAV-H30, NAV-H32, NAV-H33, NAV-H37, NAV-H40, NAV-H41, NAV-H43, NAV-H44 і NAV-H45. Аналіз генного розподілу з використанням ланцюгової реакції полімерази (PCR) Для виявлення PCR розроблені та оптимізовані одна або дві пари затравок, які ренатурують (відпалюють) до різних зон кодуючої ділянки цільового гена. Індивідуальні затравки розроблені, використовуючи зонд Oligo Explorer 1.2, і обрані набори затравок з розрахунковими температурами плавлення приблизно 55-60C. Такі набори затравок відібрані для одержання продуктів PCR більше ніж 200 bp. Температура відпалу затравки середньої строгості 50C обрана для аналізу розподілу PCR. Умови середньої строгості забезпечили б ситуацію, при якій потенційно нижчі (слабкі), несумісні послідовності (із-за відмінності в ланцюгах), які можуть виникнути на зв'язувальних сайтах затравки, не перешкоджали зв'язуванню затравки. Аналізи розподілу двадцяти одного із цільових генів B. hyodysenteriae виконуються на 23 ланцюгах B. hyodysenteriae, включаючи два ланцюги, які виявили свою авірулентність. PCR-аналіз проводять у 25 μл загального обсягу, використовуючи Taq ДНК-полімеразу (Biotech International, Thurmont, MD). Суміш ампліфікації складається з 1x PCR буфера (що містить 1,5 мМ MgCl 2), 1 U (а.е.м.) Taq ДНК-полімерази, 0,2 мМ кожної dNTP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 0,5 μM пари затравки і 1 л очищеної хромосомної темплати ДНК. Умови циклічності включають операцію денатурування первинної темплати, яка триває 5 хвилин при 94C, після чого йдуть 35 циклів денатурування при 94C протягом 30 секунд, відпал при 50C протягом 15 секунд і розтягування затравки при 68C протягом 4 хвилин. Продукти PCR піддають електрофорезу у 1 % (вага/об'єм (w/v)) арагоза-гелях у 1x TAE буфері (40 мМ Тріс-ацетата, 1 мМ EDTA), 24 UA 104714 C2 5 10 забарвленню у 1 μг/мл розчину етидіумброміду і проглядають при електрофіолетовому освітленні. Затравки, використовувані для вісімнадцяти генів (з двадцяти одного), вказані у Таблиці 2. З цих вісімнадцяти генів три гени (NAV-H23, NAV-H41 і NAV-H71) присутні у 83 % тестованих ланцюгів B. hyodysenteriae; три з них (NAV-H24, NAV-H30 і NAV-H73) присутні у 87 % тестованих ланцюгів, сім з них (NAV-H22, NAV-H32, NAV-H33, NAV-H37, NAV-H43, NAV-H64 і NAV-H69) присутні у 91 % тестованих ланцюгів і три з них (NAV-H40, NAV-H44, і NAV-H45) присутні у 100 % тестованих ланцюгів. Три гена, що залишилися, присутні менше, ніж у 80 % тестованих ланцюгів B. hyodysenteriae. Незадовільний розподіл цих генів робить їх менш корисними з погляду підодиниці (компонента) вакцини. З цієї причини вказані гени були виключені із подальших досліджень. Таблиця 2 Ген NAV-H22 NAV-H23 NAV-H24 NAV-H30 NAV-H32 NAV-H33 NAV-H37 NAV-H40 NAV-H41 NAV-H43 NAV-H44 NAV-H45 NAV-H62 NAV-H64 NAV-H66 NAV-H69 NAV-H71 NAV-H73 Найменування затравки H22-F4 H22-R1308 H23-F4 H23-R2366 H24-F19 H24-R729 H30-F4 H30-R969 H32-F4 H32-R564 H33-F4 H33-R396 H37-F4 H37-R825 H40-F16 H40-R1815 H41-F19 H41-R1067 H43-F46 H43-R1236 H44-F43 H44-R2931 H44-F80 H44-R929 H45-F52 H45-R1595 H62-F69 H62-R866 H64-F69 H64-R253 H66-F114 H66-R200 H69-F546 H69-R662 H71-F568 H71-R773 H71-F37 H71-R1241 H73-F37 H73-R254 Послідовність затравки (5’-3") AAACGTTTATATTTTATTTTATC (SEQ ID №: 67) AAACTTCCAAGTGATACC (SEQ ID №: 68) AAATATAAACCTACAAGCAG (SEQ ID №: 69) AATATTTCAGTTAATCTAAAATC (SEQ ID №: 70) ACTTTAATCTTTGTATTAATTTTG (SEQ ID №: 71) TTGTTTTAATTTGATAATATCAG (SEQ ID №: 72) AAAAAAATTATTTTATTAATATTTATATT (SEQ ID №: 73) TTCTCTTATAATCTTTACAGTTG (SEQ ID №: 74) CATATTTCTGGTGATTCTC (SEQ ID №: 75) TTTTTTGATAAATAAGTTTTTTATTTG (SEQ ID №: 76) TTTAATACTCCTATATTATTAATTATTT (SEQ ID №: 77) AAGGAGAATCACCAGAAA (SEQ ID №: 78) AATGATATTATTAAAGTGATAAA (SEQ ID №: 79) AAAATCTAATATAACGGATT (SEQ ID №: 80) AAATATGCTTCCATTATAGG (SEQ ID №: 81) ACTTTTAGGAAGAAGTTTAAC (SEQ ID №: 82) TATATTTTCATTATATATTTATTAG (SEQ ID №: 83) CTAGGCATAGATTTTCCA (SEQ ID №: 84) TTTGCCATGTCGGAAATTGCAG (SEQ ID №: 85) TATTCTAGCACCGTCCATATC (SEQ ID №: 86) GTATGTTTATATGCTCAGGATAC (SEQ ID №: 87) AACAGCAGCACTATCTTGTAA (SEQ ID №: 88) CAGCAGCAACAAATAATACTACTG (SEQ ID №: 89) TGAATATAAACACCTTCTCTCAAAG (SEQ ID №: 90) AAAATGTCATTGGTAACTACTGTAAG (SEQ ID №: 91) CTTGATAATCTGCCTTTAAACATAC (SEQ ID №: 92) ATGTGAGGAAAAAACAGAAAG (SEQ ID №: 93) TCATTACCAGAAAACCATACTC (SEQ ID №: 94) AGGAAATAAAGCTCCTGCTGCTTCAGC (SEQ ID №: 95) GCATAGCAGCAACTTCAGAAGGTCCA (SEQ ID №: 96) CTTATTAATTGGTATAGGAAAACC (SEQ ID №: 97) AATCTATGTTCTTGATTTATTAGCC (SEQ ID №: 98) AGAAGCTACTTTTGGACCTTGGCCTGT (SEQ ID №: 99) ACACAGTCAACACCAAGAGC (SEQ ID №: 100) AAACAGCAGACTAGCTGGTG (SEQ ID №: 101) TGACCATTACTTACACCGGATACCCCA (SEQ ID №: 102) TTAATGACTATATCGCTTTCATACACTTTC (SEQ ID №: 103) TCAATTCTTCCAGACATAAAATCAGTAAG (SEQ ID №: 104) TATATAGAGTGGGTATCAGAAG (SEQ ID №: 105) TCATAATGGTATTTACAAGATG (SEQ ID №: 106) Екстракція плазміди pTrcHis 25 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Клони JM109 Escherichia coli, що включають плазміду pTrcHis (Invitrogen, Carlsbad, CA), переносяться із сховища запасів гліцерину на агарові пластинки Luria-Bertani (LB) з додаванням ампіциліну 100 мг/л та інкубуються при температурі 37 °C протягом 16 годин. Одна єдина колонія використовується для інкубації 10 мл бульйону з додаванням 100 мг/л ампіциліну, при цьому бульйонна культура інкубується при 37 °C з перемішуванням протягом 12 годин. Вся нічна культура центрифугується при 5000 x г протягом 10 хвилин і плазміда, що міститься у клітинах, екстрагується із застосуванням набору QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Doncaster VIC). Гранульовані клітини повторно суспендуються з 250 µл буфера Р1 повторної клітинної суспензії, після чого клітини лізуються при додаванні 250 µл буфера Р2 клітинного лізису. Лізовані клітини нейтралізуються за допомогою 350 µл буфера нейтралізації N3 і осаджений клітинний детрит гранулюється методом центрифугування при 20 000 x г протягом 10 хвилин. Супернатант передається у веретеноподібну хроматографічну колонку і центрифугується при 10 000 x г протягом 1 хвилини. Після скидання потоку у колонку додають 500 µл промивного буфера PE і центрифугують за методом, описаним вище. Потік скидають, а колонку висушують центрифугуванням при 20 000 x г протягом 3 хвилин. ДНК плазміди елююють з колонки із застосуванням 100 µл буфера елюції EB. Визначають кількісний склад очищеної плазміди, використовуючи флюорометр ДНК Dynaquant (Hoefer, San Francisco, CA), при цьому концентрацію ДНК доводять до 100 μг/мл шляхом розчинення буфером TE. Очищену плазміду зберігають при –20C. Приготування вектора Два μg очищеної плазміди pTrcHis переварюють при 37C протягом 1-4 годин у повному обсязі 50 μл, що містять 5 U двох ферментів обмеження у 100 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ DTT і 100 μг/μл BSA. Специфічна пара ферментів обмеження використовується залежно від послідовності затравок та послідовності ORF; мета процедури полягає у використанні затравок, які не повинні відсікати ORF. Рестриктований вектор перевіряють у процесі електрофорезу 1 μл реакції переварювання через 1 % (w/v (вага/об'єм) агарозний гель у буфері 1X TAE при 90 V протягом 1 години. Оброблена у процесі електрофорезу ДНК забарвлена 1 г/мл eтидіумброміду і проглядається при ультрафіолетовому (UV) освітленні. Лінеаризований вектор pTrcHis очищають, використовуючи набір для ультра-очищення PCR (UltraClean PCR Clean-up Kit) (Мо Bio Laboratories, Carlsbad, CA). Коротко, реакція рестрикції (50 µл) змішується з 250 µл SpinBind буфера В1 і увесь обсяг додають у веретеноподібну хроматографічну колонку. Після центрифугування при 8 000 x г протягом 1 хвилини потік скидають і 300 µл SpinClean буфера B2 додають у колонку. Колонку центрифугують за попередньою методикою і потік скидають перш, ніж її висушують при 20 000 x г протягом 3 хвилин. Очищений вектор елююють із колонки з 50 µл буфера TE. Очищений лінійний вектор піддають кількісному аналізу, використовуючи флюорометр, і концентрацію ДНК доводять до 50 μг/мл шляхом розбавлення буфером TE. Очищений обмежений вектор зберігають при –20C. Затравка для приготування вставки Розроблені пари затравок для якомога більшого підсилення кодуючої ділянки цільового гена з використанням геномної ДНК як стартового сайту. Всі послідовності затравок включають кінцеві рестрикційні сайти ферменту для забезпечення вшивання здатного до зчеплення кінця одержаного амплікону у лінеаризований вектор pTrcHis. Затравки тестують, використовуючи Amplify 1.2 (University of Wisconsin, Madison, WI), і теоретичну послідовність амплікону вставляють у відповідне положення у векторній послідовності pTrcHis. Розшифрована трансляція касети химерної експресії pTrcHis виконана, використовуючи версію 6 вектора NTI (InforMax), щоб підтвердити, що генні вставки будуть знаходитися у коректній рамці зчитування. Таблиця 3 також забезпечує розмір гена, розмір протеїну, прогнозовану молекулярну вагу природного протеїну у дальтонах та прогнозований pI протеїну. Відмічено, що гістидин-злиття рекомбінантного білка додає приблизно 4 kDa (кДа) до прогнозованої молекулярної ваги природного протеїну. 26 UA 104714 C2 Таблиця 3 Ген NAV-H40 NAV-H41 NAV-H44 NAV-H62 NAV-H64 NAV-H66 NAV-H69 NAV-H73 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Розмір гена, (bp) Розмір протеїну, (aa) 1815 1068 2940 1014 1011 264 1080 258 605 356 980 338 337 88 360 86 Прогнозований показник MW природного протеїну, Прогнозований pI (Da) 97,733 9.4853 39,870 5.2168 113,722 5.1864 37642 4.3944 36468 4.4953 10629 9.3027 41525 5.7123 10527 9.5920 Ампліфікація генних вставок При використанні геномної ДНК всі цільові генні вставки ампліфікуються PCR у загальному обсязі 100 μл, використовуючи Taq ДНК полімеразу (Biotech International) і Pfu ДНК полімеразу (Promega, Madison, WI). Підсилювальна суміш складається з 1x PCR буфера (що містить 1,5 мM MgCl2), 1 U (а.е.м.) Taq ДНК полімерази, 0,01 U Pfu ДНК полімерази, 0,2 мM кожного з dNTP (Amersham Pharmacia Biotech), 0,5 μM відповідної затравочної пари і 1 л очищеної хромосомної ДНК. Хромосомна ДНК готується з того ж самого ланцюга B. hyodysenteriae, який використовується для геномного секвенування. Умови циклічності процесу включають початковий крок денатурування шаблону (зразка) протягом 5 хвилин при 94C, за яким йдуть 35 циклів денатурування при 94C протягом 30 секунд, відпал (ренатурування) при 50C протягом 15 секунд і розтягування затравки при 68C протягом 4 хвилин. Продукти PCR, оброблені електрофорезом в 1 % (вага/об'єм) w/v)) арагозному гелі у 1x TAE буфері, забарвлюються в 1 μг/мл етидіумбромідному розчині і проглядаються при ультрафіолетовому освітленні. Після підтверджуючого виявлення наявності продукту PCR коректного розміру реакція PCR піддається очищенню, використовуючи набір UltraClean PCR Clean-up Kit (Мо Bio Laboratories, Carlsbad, CA). Реакція PCR (100 µл) змішується з 500 µл SpinBind буфера B1 і в хроматографічну колонку веретенного типу додається повний обсяг згаданого вище компонента. Після центрифугування при 8 000 x г протягом 1 хвилини потік скидається і в колонку додається 300 µл SpinClean буфера B2. Колонку центрифугують відповідно до раніше згаданої методики і потік скидають перед висушуванням колонки при 20 000 x г протягом 3 хвилин. Очищений вектор елююють із колонки з використанням 100 µл TE буфера. Рестрикційне ферментне переварювання генних вставок Тридцять μл очищеного продукту PCR переварюють у 50 μл повного обсягу з 1 U (а.е.м.) кожного ферменту рестрикції, сумісного з кінцевим рестрикційним сайтом розпізнавання ендонуклеази, визначеним клонуючою олігонуклеотидною затравкою. Реакція рестрикції (обмеження) складається з 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 мM NaCl, 10 мM MgCl2, 1 мM DTT і 100 μг/μл BSA з 1 U (а.е.м.) кожного ферменту рестрикції при 37C протягом 1-4 годин. Переварена ДНК вставки очищена з використанням набору надвисокої очистки UltraClean PCR Clean-up Kit (див. вище). Очищена переварена ДНК вставки визначена кількісно, використовуючи флюорометр, при цьому концентрація ДНК приведена до 20 μг/μл шляхом розбавлення буфером TE. Очищені обмежені ДНК вставки (інсерційні ДНК) відразу ж використовуються для векторного лігування. Лігування генних вставок у вектор pTrcHis Реакції лігування виконані у повному обсязі 20 μл. 100 нг лінеаризованого pTrcHis інкубуються з 20 нг обмеженої вставки при 16C протягом 16 годин у 30 мМ Tris-HCl (pH 7,8), 10 мM MgCl2, 10 мM DTT та 1 мM ATP, що містить 1 U (а.е.м.) T4 ДНК лігази (Promega). Ідентична реакція лігування, що не містить вставки ДНК, також включена як векторний рециркуляційний негативний контроль. Для кожної реакції використовується відповідний рестрикційний фермент. Трансформування лігувань pTrcHis у клітини E. coli Забезпечують танення компетентних клітин E. coli JM109 (Promega) від –80C, при яких відбувалося їх зберігання на льоду, після чого 50 μл цих клітин було перенесено у крижані 1,5 мл трубки мікроцентрифуги, що містять 5 μл матеріалу нічних реакцій лігування (еквівалентно 25 нг вектора pTrcHis). Трубки акуратно перемішують, легко ударяючи дном кожної із трубок об опорну поверхню, і залишають на льоду протягом 30 хвилин. Після цього для клітин створюють 27 UA 104714 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 шокову обстановку, поміщаючи трубки у водяну баню з температурою 42C на 45 секунд до повернення трубки на лід протягом 2 хвилин. Трансформовані клітини відновлюються у бульйоні 1 мл LB протягом 1 години при 37C з легким перемішуванням. Відновлені клітини збирають при 2500 x г протягом 5 хвилин, а потім ці клітини повторно суспендують у 50 μл свіжого бульйону LB. Усі 50 μл повторно суспендованих клітин розподілені рівномірно на LB агаровій пластинці, що містить 100 мг/л ампіциліну, використовуючи стерильну скляну паличку. Пластинки інкубують при 37C протягом 16 годин. Виявлення рекомбінантних конструкцій pTrcHis у E. coli за допомогою PCR Дванадцять окремих колоній трансформанта для кожної конструкції перенесено на нові LB агарові пластинки, що містять 100 мг/л ампіциліну, і інкубовані при 37C протягом 16 годин. Одна єдина колонія від кожного випадку трансформації повторно суспендується у 50 μл буфера TE і кип'ятиться протягом 1 хвилини. Два μл кип'ячених клітин як шаблон (зразок) для PCR. Суміш ампліфікації складається з 1x PCR буфера (що містить 1,5 мM MgCl 2), 1 U (а.е.м.) Taq ДНК полімерази, 0,2 мM кожного dNTP, 0,5 M pTrcHis-F затравки (5’CAATTTATCAGACAATCTGTGTG-3" SEQ ID №: 107) і 0,5 M pTrcHis-R затравки (5’TGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCG-3" SEQ ID №: 108). Умови циклічності процесу включають початковий крок денатурування шаблону (зразка) протягом 5 хвилин при 94C, за яким йдуть 35 циклів денатурування при 94C протягом 30 секунд, відпал (ренатурування) при 60C протягом 15 секунд і розтягування затравки при 72C протягом 1 хвилини. Продукти PCR, оброблені електрофорезом у 1 % (вага/об'єм)w/v)) арагозному гелі у 1x TAE буфері, забарвлюються у 1 μг/μл етидіум-бромідному розчині і проглядаються при ультрафіолетовому освітленні. Клонування різних вставок у векторі експресії pTrcHis забезпечує одержання рекомбінантних конструкцій різних розмірів. Експериментальна експресія рекомбінантних His-маркованих протеїнів П'ять-десять виділених колоній рекомбінантної конструкції pTrcHis у E. coli JM109 інкубовані в бульйоні 3 мл LB у трубці розміром 5 мл, що містить 100 мг/л ампіциліну та 1мМ IPTG, причому інкубування проводиться при 37C протягом 16 годин з перемішуванням. Клітини збирають центрифугуванням у 5 000 x г протягом 10 хвилин при 4C. Супернатант видаляють, а кожну гранулу повторно суспендують 10 µл Ni-NTA денатуруючим лізисним буфером (100 мM NaH2PO4, 10 мM Tris-HCl, 8 M urea, pH 8,0). Після інтенсивного перемішування трубки протягом 1 хвилини клітинний детрит гранулюють методом центрифугування у 10 000 x г протягом 10 хвилин при 4C. Супернатант передають в нову трубку і зберігають при –20C до наступного дослідження. Натрію додецилсульфату поліакліламіду гелевий електрофорез (SDS-PAGE) SDS-PAGE-аналіз протеїну виконується з використанням безперервної Tris-гліцинової буферної системи. Тридцять μл протеїнового зразка змішують з 10 μл буфера обробки 4 зразків (250 мM Tris-HCl (pH 6,0), 8 % (w/v) SDS, 200 мM DTT, 40 % (v/v) гліцерину і 0,04 % (w/v) бромофенолу-блу (блакитного)). Зразки кип'ятять протягом 5 хвилин відразу перед завантаженням у 10 µл зразка в лунки у гелі. Гель представлений концентруючим гелем (125 мM Tris-HCl, ph 6,8, 4 % w/v ациламід, 0,15 % w/v біс-акриламід і 0,1 % w/v SDS) та відокремлювальним гелем (375 мM Tris-HCl, ph 8,8, 12 % w/v ациламід, 0,31 % w/v біс-акриламід і 0,1 % w/v SDS). Вказані гелі полімеризуються з додаванням 0,1 % (v/v) TEMED та 0,05 % (w/v) свіжоприготовленого розчину сульфату амонію і заливаються у гелеву систему "mini-Protean dual slab cell" (Bio-Rad, Hercules, California). Зразки працюють при 150V при кімнатній температурі (RT) до тих пір, поки фарбник бромофенол-блу не досягне дна гелевого шару. Попередньо забарвлені стандарти молекулярної ваги піддаються обробці методом електрофорезу паралельно із зразками забезпечення можливості визначення молекулярної ваги. Після електрофорезу гель відразу ж забарвлюють, використовуючи Coomassie Brilliant Blue G250 (Bio-Rad), або піддають операції електроперенесення (передачі гальваностереотипу) на нітроклітковинну мембрану для вестерн-блотінга. Вестерн-блотінг Електрофоретичне перенесення відокремлених протеїнів від SDS-PAGE гелю до нітроклітковинної мембрани виконується, використовуючи буферну систему перенесення Towbin. Після електрофорезу гель зрівноважується у буфері передачі (25 мM Tris, 192 мM гліцин, 20 % v/v метанол, pH 8,3) протягом 15 хвилин. Протеїни у гелі передаються гальваностереотипу нітроклітковинної мембрани (Protran, Schleicher and Schuell BioScience, Inc., Keene, NH), використовуючи систему "mini-Protean transblot apparatus" (Bio-Rad) при 30 V протягом 12 годин при 4 °C. Щойно передана нітроклітковинна мембрана, що містить відокремлені протеїни, блокується 10 мл tris-буферизованого сольового розчину (TBS), що містить 5 % (w/v) порошку збираного молока, протягом 1 години при кімнатній температурі. 28