Виділений поліпептид, здатний зв’язувати flt3, виділений полінуклеотид, який кодує поліпептид, здатний зв’язувати flt3 (варіанти),виділений полінуклеотид, здатний гібридизуватися з ним (варіанти), вектор експре

1. Выделенный полипептид, способный связывать flt3, выбранный из группы, состоящей из полипептида, содержащего аминокислоты 28-160 последовательности SEQ ID NО:6: C2 (54) ВИДІЛЕНИЙ ПОЛІПЕПТИД, ЗДАТНИЙ ЗВ'ЯЗУВАТИ FLT3, ВИДІЛЕНИЙ ПОЛІНУКЛЕОТИД, ЯКИЙ КОДУЄ ПОЛІПЕПТИД, ЗДАТНИЙ ЗВ'ЯЗУВАТИ FLT3 (ВАРІАНТИ), ВИДІЛЕНИЙ ПОЛІНУКЛЕОТИД, ЗДАТНИЙ ГІБРИДИЗУВАТИСЯ З НИМ (ВАРІАНТИ), ВЕКТОР ЕКСПРЕСІЇ (ВАРІАНТИ), ЛІНІЯ КЛІТИН-ХАЗЯЇВ (ВАРІАНТИ), СПОСІБ ОД ЕРЖАННЯ ПОЛІП ЕПТИДУ, ЗДАТНОГО ЗВ'ЯЗУВАТИ FLT3 (ВАРІАНТИ), ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, СПОСІБ ПРОВЕД ЕННЯ АУТОЛОГІЧНОЇ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ ХВОРОМУ, ЯКИЙ ОТРИМУЄ ЦИТОВІД НОВЛЮВАЛЬНУ ТЕРАПІЮ, СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ РОЗМНОЖЕННЯ ГЕМОПОЕТИЧНИХ КЛІТИН, СПОСІБ ТРАНСФЕКЦ ІЇ ЕКЗОГЕННОГО ГЕНА В НЕД ИФЕРЕНЦІЙОВАНУ "РАННЮ" ГЕМОПОЕТИЧНУ КЛІТИНУ, СПОСІБ П ЕРЕНОСУ ЕКЗОГЕННОГО ГЕНА ССАВЦЮ, СПОСІБ СТИМУЛЯЦІЇ ПРОЛІФЕРАЦІЇ Т-КЛІТИН У ССАВЦ Я, СПОСІБ СТИМУЛЯЦІЇ ПРОЛІФЕРАЦІЇ КЛІТИН ЕРИТРОЇДНОГО НАПРАВЛЕННЯ ДИФ ЕРЕНЦІЮВАННЯ В СЕЛЕЗІНЦІ ССАВЦ Я, СПОСІБ ЛІКУВАННЯ ХВОРОГО, ЯКИЙ МАЄ СИМПТОМИ МІЄЛОДИСПЛАСТИЧНОГО СИНДРОМУ, СПОСІБ ЛІКУВАННЯ ХВОРОГО, ЯКИЙ МАЄ СИМПТОМИ АНЕМІЇ, СПОСІБ ЛІКУВАННЯ ХВОРОГО, ЯКИЙ МАЄ СИМПТОМИ СИНДРОМУ НАБУТОГО ІМУНОДЕФІЦИТУ, СПОСІБ ВІДОКРЕМЛЕННЯ КЛІТИН, ЯКІ МАЮТЬ РЕЦ ЕПТОР FLT3 НА ЇХ ПОВЕРХНІ, ВІД СУМІШІ КЛІТИН В СУСП ЕНЗІЇ, АНТИТІЛО, ІМУНОРЕАКТИВНЕ З ПОЛІПЕПТИДОМ, ЗДАТНИМ ЗВ'ЯЗУВАТИ FLT3 42726 14. Выделенный полинуклеотид по пункту 13, отличающийся тем, что последовательность ДНК кодирует аминокислотную последовательность 28-182 последовательности SEQ ID NО:6. 15. Выделенный полинуклеотид по п. 13, отличающийся тем, что имеет последовательность SEQ ID NО:5: и полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична аминокислотам 28-163 последовательности SEQ ID NO:2. 2. Полипептид по пункту 1, отличающийся тем, что выбран из группы, состоящей из полипептида, содержащего аминокислоты 28-182 последовательности SEQ ID NO:6, и полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична аминокислотам 28-182 последовательности SEQ ID NO:6. 3. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что выбран из группы, состоящей из полипептида, содержащего аминокислоты 28-235 последовательности SEQ ID NO:6, и полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична аминокислотам 28-235 последовательности SEQ ID NO:6. 4. Полипептид по пункту 3, отличающийся тем, что, по меньшей мере, на 80% идентичен аминокислотам 1-235 последовательности SEQ ID NO:6. 5. Полипептид по пункту 1, отличающийся тем, что содержит аминокислоты 28-160 последовательности SEQ ID NO:6. 6. Полипептид по п. 2, отличающийся тем, что содержит аминокислоты 28-182 последовательности SEQ ID NO:6. 7. Полипептид по пункту 3, отличающийся тем, что содержит аминокислоты 28-235 последовательности SEQ ID NO:6. 8. Полипептид по пункту 4, отличающийся тем, что содержит аминокислоты 1-235 последовательности SEQ ID NO:6. 9. Полипептид по пункту 1, отличающийся тем, что представляет собoй слитый белок, ковалентно связанный со вторым полипептидом. 10. Полипептид по пункту 2, отличающийся тем, что представляет собой слитый белок, ковалентно связанный со вторым полипептидом. 11. Полипептид по пункту 3, отличающийся тем, что представляет собой слитый белок, ковалентно связанный со вторым полипептидом. 12. Полипептид, способный связывать flt3, кодируемый кДНК, встроенной в рекомбинантный вектор, в клетках E. coli DH10B, с депозитным номером АТСС 69382. 13. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, способный связывать flt3, имеющий аминокислотную последовательность 28-160 последовательности SEQ ID NО:6 или аминокислотную последовательность последовательности, которая, по меньшей мере, на 80% идентична аминокислотам 28-160 последовательности SEQ ID NО:6. 16. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, способный связывать flt3, имеющий аминокислотную последовательность 28-163 последовательности SEQ ID NО:2 или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична аминокислотной последовательности 28-163 последовательности SEQ ID NО:2. 17. Выделенный полинуклеотид по п. 16, отличающийся тем, что имеет последовательность SEQ ID NО:1: 2 42726 32. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество полипептида flt3-L по любому из пп. 1-11 и фармацевтически приемлемые носитель, наполнитель или разбавитель. 33. Способ проведения аутологической трансплантации больному, получающему цитовосстановительную терапию, предусматривающий: (a) сбор гемопоэтических клеток-предшественников или стволовых клеток больного перед цитовосстановительной терапией; и (b) введение собранных клеток больному после цитовосстановительной терапии; причем способ дополнительно включает по меньшей мере одну из следующих стадий: (і) введение эффективного количества полипептида по любому из пп. 1-11 больному для увеличения количества циркулирующи х клетокпредшественников или стволовых клеток перед их сбором; (ii) размножение клеток-предшественников или стволовых клеток ex vi vo путем контактирования их с эффективным количеством полипептида по любому из пп. 1-11; и (iii) введение эффективного количества полипептида по любому из пп. 1-11 больному для облегчения приживления трансплантированных клеток-предшественников или стволовых клеток больному. 34. Способ по п. 33, отличающийся тем, что полипептид по любому из пп. 1-11 применяют в комбинации с цитокином, выбранным из группы, состоящей из CSF-1, GM-CSF, SF, G-CSF, ЕРО, IL-1, IL-IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, GM-CSF/IL-3-слитых белков, LIF и FGF и и х последовательных или совместных комбинаций. 35. Способ по п. 34, отличающийся тем, что полипептид по любому из пп. 1-11 применяют в комбинации с цитокином, выбранным из группы, состоящей из GM-CSF, SF, G-CSF, ЕРО, IL-3 и слитых белков GM-CSF/IL-3. 36. Среда для размножения гемопоэтических клеток, содержащая среду для выращивания клеток и эффективное количество полипептида по п. 1. 37. Способ трансфекции экзогенного гена в недифференцированную "раннюю" гемопоэтическую клетку, предусматривающий стадии: (a) культивирование недифференцированных клеток в средах, содержащих эффективное количество полипептида по любому из пп. 1-11; и (b) трансфекцию культивируемых клеток из стадии (а) экзогенным геном. 38. Способ переноса экзогенного гена млекопитающему, предусматривающий стадии: (a) культивирование недифференцированных гемопоэтических клеток в средах, содержащих эффективное количество полипептида по любому из пп. 1-11; (b) трансфекцию культивируемых клеток из стадии (а) этим геном; и (c) введение трансфицированных клеток млекопитающему. 39. Способ стимуляции пролиферации Т-клеток у млекопитающего, предусматривающий введение этому млекопитающему эффективного количества полипептида по любому из пп. 1-11. 18. Выделенный полинуклеотид, способный гибридизоваться в умеренно жестких условиях с выделенным полинуклеотидом по п. 13. 19. Выделенный полинуклеотид, способный гибридизоваться в умеренно жестких условиях с выделенным полинуклеотидом по п.16. 20. Вектор экспрессии, содержащий выделенный полинуклеотид по п. 13. 21. Вектор экспрессии, содержащий выделенный полинуклеотид по п.16. 22. Вектор экспрессии, содержащий выделенный полинуклеотид по п. 18. 23. Вектор экспрессии, содержащий выделенный полинуклеотид по п. 19. 24. Линия клеток-хозяев, трансфицированная или трансформированная вектором экспрессии по п. 20. 25. Линия клеток-хозяев трансфицированная или трансформированная вектором экспрессии по п. 21. 26. Линия клеток-хозяев, трансфицированная или трансформированная вектором экспрессии по п. 22. 27. Линия клеток-хозяев, трансфицированная или трансформированная вектором экспрессии по п. 23. 28. Способ получения полипептида, способного связывать flt3, предусматривающий культивирование линии клеток-хозяев по п. 24. 29. Способ получения полипептида, способного связывать flt3, предусматривающий культивирование линии клеток-хозяев по п. 25. 30. Способ получения полипептида, способного связывать flt3, предусматривающий культивирование линии клеток-хозяев по п. 26. 31. Способ получения полипептида, способного связывать flt3, предусматривающий культивирование линии клеток-хозяев по п. 27. 3 42726 40. Способ стимуляции пролиферации клеток эритроидного направления дифференцировки в селезенке млекопитающего, предусматривающий введение млекопитающему эффективного количества полипептида по любому из пп. 1-11. 41. Способ по п. 40, отличающийся тем, что он дополнительно предусматривает введение эффективного количества эритропоэтина. 42. Способ лечения больного, имеющего симптомы миелодиспластического синдрома, предусматривающий введение больному эффективного количества полипептида по любому из пп. 1-11. 43. Способ лечения больного по п. 42, отличающийся тем, что больному вводят эффективное количество одного или более факторов роста, выбранных из группы, состоящей из CSF-1, GM-CSF, SF, G-CSF, ЕРО, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, 1L-12, IL-13, IL-14, IL-15, GMCSF/IL-3-слитых белков, LIF и FGF. 44. Способ лечения больного, имеющего симптомы анемии, предусматривающий введение больному эффективного количества полипептида по любому из пп. 1-11. 45. Способ лечения больного по п. 43, отличающийся тем, что больному вводят эффективное количество одного или более факторов роста, выбранных из группы, состоящей из CSF-1, GM-CSF, SF, G-CSF, ЕРО, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, GMCSF/IL-3-слитых белков, LIF и FGF. 46. Способ лечения больного, имеющего симптомы синдрома приобретенного иммунодефицита, предусматривающий введение больному эффективного количества полипептида по любому из пп. 1-11. 47. Способ лечения больного по любому из пп. 4245, отличающийся тем, что больному вводят эффективное количество одного или более факторов роста, выбранных из группы, состоящей из CSF-1, GM-CSF, SF, G-CSF, ЕРО, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, GM-CSF/IL-3-слитых белков, LIF и FGF. 48. Способ по п. 46, отличающийся тем, что больной получает AZT-терапию. 49. Способ отделения клеток, имеющих рецептор flt3 на их поверхности, от смеси клеток в суспензии, предусматривающий контактирование клеток в смеси с контактирующей поверхностью, имеющей на ней полипептид по любому из пп. 1-11, и разделение контактирующей поверхности и суспензии. 50. Антитело, иммунореактивное с выделенным полипептидом по любому из пунктов 1-11. Это - частично продолжающаяся заявка U.S. Application 08-209502, поданнaя 7 марта 1994, которая является частично продолжающейся заявкой U.S. Application 08/162407, поданной 3 декабря 1993, которая является частично продолжающейся заявкой U.S. Application 08/111758, поданной 25 августа 1993, которая является частично продолжающейся заявкой U.S. Application 08/106463, поданной 12 августа 1993, которая, в свою очередь, является частично продолжающейся заявкой U.S. Application 08/068394, поданной 24 мая 1993, рассмотрение которой прекращено. Данное изобретение относится к flt 3-лигандам млекопитающих, н уклеиновым кислотам, кодирующим такие лиганды, способам получения рекомбинатных flt 3-лигандов, фармацевтическим композициям, содержащим такие лиганды, и их применению в различных терапиях. Клетки крови, гемоциты, происходят из гемопоэтических стволовы х клеток, дифференцирующи хся в определенных направлениях дифференцировки, т. е. в эритроидном, мегакариоцитарном, гранулоцитарном, моноцитарном и лимфоцитарном направлениях дифференцировки. Цитокины, стимулирующие пролиферацию и созревание клеток-предшественников, называют колониестимулирующими факторами ("CSF"). Некоторые CSF продуцируются Т-лимфоцитами, в том числе интерлейкин-3 ("IL-З"), гранулоцитарно-моноцитарный CSF (CM-CSF), гранулоцитарный CSF (GCSF) и моноцитарный CSF (М-CSF). Эти CSF воздействуют как на зрелые клетки, так и на стволовые клетки. До сих пор не были обнаружены факторы, способные действовать преимущественно на стволовые клетки. Тирозинкиназные рецепторы ("ТКR") представляют собой рецепторы факторов роста, которые регулируют пролиферацию и дифференциро вку многих клеток (Jarden, Y. & Ulrich, A. Annu. Rev. Biochem 57, 443-478, 1988; и Сadena, D.L. & Gill, G.N. FASEB J., 6, 2332-2337, 1992). Некоторые ТКR действуют внутри гемопоэтической (кроветворной) системы. Например, передача сигнала через колониестимулирующий фактор I ("CSF-I"), рецептор c-fms регулирует выживание, рост и дифференцировку моноцитов (Stanley et. al., J. Cell. Biochem., 21, 151-159, 1983). Фактор стила SF, также известный как фактор роста мастоцитов, фактор самоподдержания стволовых клеток или kitлиганд, действующий через-kit, стимулирует пролиферацию клеток как в миелоидном, так и в лимфоидном компартментах. Flt-3 (Rosnet et. al. Oncogene, 6, 1641-1650, 1991) и fl-2 (Mathhews et. al., Cell, 65, 1143-1152, 1991) являются разновидностями ТКR, который относится к с-fms и c-kit рецепторам. Продукт гена flk-2 экспрессируется на гемопоэтических и недифференцированных клетках (клетках-предшественниках), тогда как продукт гена flt-3 имеет более общее тканевое распространение. Белки рецепторов flt-3 и flk-2 сходны по аминокислотной последовательности и отличаются по двум аминокислотным остаткам во внеклеточном домене и различаются в сегменте из 31 аминокислоты, расположенном вблизи С-концов (Lyman et al., Oncogene, 8, 815-822, 1993). Было обнаружено, что flt-3-лиганд ("flt 3-L") регулир ует рост и дифференцировку клеток-предшественников и стволовых клеток и, по-видимому, полезен в клинике при лечении нарушений кроветворения, в частности, гипопластической (апластической) анемии и миелодиспластических синдромов. Кроме того, flt 3-L должен быть полезным в аллогенных, сингенных или аутогенных трансплантантах костного мозга у больных, подвергаю 4 42726 щи хся цитовосстановительной терапии, а также в развитии клеток. Flt 3-L будет также полезным в генной терапии и в системах мобилизации клеток-предшественников и стволовых клеток. Рак лечат при помощи цитовосстановительной терапии, предусматривающей применение ионизирующей радиации или введение химических токсинов, убивающих быстро делящиеся клетки. Побочные действия обычно возникают вследствие цитотоксического действия на нормальные клетки, и они могут ограничивать применение цитовосстановительных терапий. Частым побочным эффектом является миелосупрессия или повреждение клеток костного мозга, увеличивающи х количество лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов. В результате миелосупрессии больные развивают цитопению или недостаток клеток крови, что увеличивает опасность инфекции и нарушения, связанные с кровотечением. Цитопении увеличивают болезненность, смертность и ведут к заниженным дозам в лечении рака. Многие клинические исследователи манипулировали цитовосстановительной терапией, дозируя лекарственные средства и изменяя схемы применения лекарственных средств для увеличения дозирования для раковой терапии при одновременном ограничении повреждения костного мозга. Один из подходов использует трансплантанты костного мозга или клеток периферической крови, при которых костный мозг или циркулирующие гемопоэтические клетки-предшественники или стволовые клетки удаляют перед цитовосстановительной терапией и затем повторно вводят инфузией после терапии для восстановления гемопоэтической функции (U. S.Раtеnt № 5199942, включенный здесь в виде ссылки, описывает способ применения GM-CSF, IL-3, SF, GМ-СSF/IL-3-слитых белков, эритропоэтина ("ЕРО") и их комбинаций в аутогенных трансплантационных программах лечения). Химиотерапия с высокими дозами терапевтически выгодна, поскольку она дает увеличенную частоту целевой ответной реакции у больных с метастатическим раком, в частности, с раком грудной железы, по сравнению с терапией со стандартными дозами. Это может приводить к более продолжительной ремиссии с отсутствием признаков болезни для некоторых больных, даже с плохим прогнозом. Тем не менее, химиотерапия высоких доз токсична и может приводить ко многим клиническим осложнениям, таким как инфекции, нарушения с кровотечением и другие эффекты, связанные с пролонгированными периодами миелосупрессии. Миелодиспластические синдромы представляют собой нарушения стволовых клеток, характеризующиеся нарушенным созреванием клеток, прогрессивной панцитопенией и функциональными отклонениями от нормы зрелых клеток. Они также характеризуются вариабельными степенями цитопении, неэффективным эритропоэзом и миелопоэзом с клетками костного мозга, которые являются нормальными или увеличенными в числе и имеют необычную морфологию. Bennet et al. (Br. J. Haematol., 1982; 51: 180-199) разделили эти нарушения на 5 подтипов: рефракторная (стойкая) анемия, рефракторная анемия с кольцеобразными сидеробластами, рефракторная анемия с избытком бластных клеток, рефракторная анемия с избытком бластных клеток в процессе перерождения и хронический миеломоноцитарный лейкоз. Хотя значительный процент этих больных развивает острый лейкоз, большинство из них умирают от инфекционных или геморрагических осложнений. Лечение этих синдромов ретиноидами, витамином и цитарабином не было успешным. Большинство больных, страдающи х от эти х синдромов, являются пожилыми и не являются возможными кандидатами для пересадки костного мозга или агрессивной противолейкозной химиотерапии. Апластическая анемия представляет собой другую форму заболевания, характеризующегося нарушением костного мозга и тяжелой панцитопенией. В отличие от миелодиспластического синдрома, при этом нарушении костный мозг не содержит клеток или содержит мало клеток. Существующие способы лечения предусматривают пересадку костного мозга из тканесовместимого донора или иммуносупрессивное лечение противотимоцитным глобулином (АТG). Так же, как и в случае миелодиспластического синдрома, большинство больных, страдающи х от этого синдрома, являются пожилыми и для них неприемлемы пересадка костного мозга или агрессивная противолейкозная химиотерапия. У этих больных чрезвычайно высока смертность от инфекционных и геморрагических осложнений. Анемия обычно бывает у больных с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИДом). Эта анемия обычно является более тяжелой у больных, подвергающихся лечению зидовудином. Многие важные ретровирусные агенты, противоинфекционные и противоопухолевые средства подавляют эритропоэз. Было показано, что рекомбинантный ЕРО нормализует гематокритное число и уровни гемоглобина, однако обычно для этого требуются очень высокие дозы. Фактор роста, стимулирующий пролиферацию при эритроидном направлении дифференцировки, мог бы быть использован один или в комбинации с ЕРО, илидругими факторами роста для лечения таких больных и снижения количества требуемых переливаний крови. Фактор роста, который мог бы также увеличивать количество Т-клеток, нашел бы конкретное применение в лечении больных СПИДом. Данное изобретение относится к биологически активному flt З-лиганду (flt-3-L) в виде выделенного или гомогенного белка. Кроме того, изобретение относится к выделенным ДНК, кодирующим flt -3-L и к экспрессирующим векторам, содержащим кДНК, кодирующую flt 3-L. Внутри сферы этого изобретения находятся клетки-хозяева, которые были трансфицированы или трансформированы экспрессирующими векторами, содержащими кДНК, кодирующую fl t 3-L, и способы получения flt 3-L путем культивирования таких клеток-хозяев при условиях, способствующих экспрессии flt 3-L. Flt 3-L можно применять для приготовления фармацевтических композиций для применения в способах аллогенной, сингенной и аутогенной трансплантации. Фармацевтические композиции могут содержать только flt 3-L или flt 3-L в комбинации с другими факторами роста, такими как ин 5 42726 терлейкины, колониестимулирующие факторы, протеинтирозинкиназы и цитокины. Это изобретение включает в себя способы применения композиций flt 3-L в генной терапии и в лечении больных, страдающих от миелодиспластического синдрома, апластической анемии, инфекции ВИЧ (СПИДа) и раковых заболеваний, таких как рак молочной железы, лимфома, мелкоклеточный рак легкого, множественная миелома (болезнь Калера), нейробластома, острый лейкоз, тестикулярные опухоли и рак яичников. Данное изобретение относится также к антителам и, в частности, моноклональным антителам, иммунореактивным с flt 3-L. Слитые белки, содержащие растворимую часть flt 3-L и константный домен иммуноглобулина, также включены в это изобретение. Данное изобретение также направлено на применение flt 3-L в способах трансплантации клеток-предшественников периферической крови или стволовых клеток. В типичном случае клетки-предшественники периферической крови или стволовые клетки удаляют из больного перед миелосупрессивной цитовосстановительной терапией и затем вновь вводят больному совместно с цитовосстановительной терапией или после нее для нейтрализации миелосупрессивных эффектов такой терапии. Данное изобретение обеспечивает применение эффективного количества flt 3-L по меньшей мере одним из следующих способов: (i) flt 3-L вводят больному перед сбором клеток-предшественников или стволовых клеток для увеличения или мобилизации количества таких циркулирующих в кровотоке клеток; (ii) после сбора клеток-предшественников или стволовых клеток больного flt 3-L используют для увеличения в объеме таких клеток ex vivo; и (iii) flt 3-L вводят больному после трансплантации собранных клеток-предшественников или стволовых клеток для облегчения и приживления. Способ трансплантации этого изобретения может дополнительно предусматривать применение эффективного количества цитокина в последовательной или конкуретной комбинации с flt 3-L. Такие цитокины включают, но не ограничены ими, интерлейкины ("IL") IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 или IL-15, CSF, выбранный из группы, состоящей из G-CSF, GM-CSF, M-CSF или GK-CSF/IL-3-слитые белки, или другие факторы роста, такие как СSF-I, SF, ЕРО, ингибирующий лейкоз фактор ("LIF") или фактор роста фибробластов ("FGF"). Flt 3-L также применим таким же образом для сингенной или аллогенной трансплантации. Изобретение включает в себя далее среды для роста клеток-предшественников и стволовых клеток, содержащие среды для роста клеток, аутологичную сыворотку и flt 3-L, один или в комбинации с цитокином из перечисленной выше группы. Кроме того, изобретение предусматривает применением flt 3-L для увеличения в объеме клеток-предшественников или стволовых клеток, собранных из крови пупочной вены. Это растяжение клеток можно проводить с одним flt 3-L или в по следовательной или конкурентной комбинации его с цитокином из описанной выше группы. Кроме того, изобретение предусматривает применение flt 3-L в генной терапии. Flt 3-L, делает возможными пролиферацию и культивирование ранних (недифференцированных) гемопоэтических клеток-предшественников или стволовых клеток, которые должны быть трансфицированы экзогенной ДНК для использования в генной терапии. Альтернативно, кДНК, кодирующая flt 3-L, может быть трансфицирована в клетки, чтобы в конечном счете доставить продукт ее гена в клетке- или ткани-мишени. Кроме того, изобретение предусматривает применение flt 3-L для стимуляции образования эритроидных клеток in vivo для лечения анемии. Такое применение предусматривает введение flt 3-L больному, нуждающемуся в таком стимулировании эритроидных клеток, в сочетании с цитовосстановительной терапией или после нее. Это лечение может предусматривать одновременное введение другого фактора роста, выбранного из цитокинов из перечисленной выше группы. Предпочтительными цитокинами для применения в этом лечении являются ЕРО, IL-3, G-СSF и GM-CSF. Такое лечение, в частности, применимо для больных СПИДом и, в частности, для больных СПИДом, получающи х лечение АZТ (азидодезокситимидином). Поскольку flt 3-L стимулирует образование стволовых клеток, flt 3-L данного изобретения может влиять на другие негемопоэтические стволовые клетки, несущие рецепторы flt-3. Flt 3-L применим в способах оплодотворения in vitro и может быть применен in vivo в лечении бесплодия. В кишечнике flt 3-лиганд применим в лечении повреждения кишечника, вызываемого облучением или химиотерапией. Flt 3-L можно также применять для лечения больных, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (НIV, ВИЧ). Такое лечение предусматривает введение flt 3-L для стимуляции in vivo образования, а также увеличения в объеме ex vivo Т-клеток и эритроидных клеток. Такое лечение может предотвратить недостаточность Т-клеток и, в частности, СD 4-положительных Т-клеток, и может повышать иммунный ответ больного против этого вируса, улучшая тем самым качество жизни больного. Flt 3-L можно применять для стимуляции стволовых клеток, что приводит к развитию волосяных фолликулов, усиливая рост волос. Кроме того, flt 3-L может быть связан с твердофазным матриксом и использован для аффинной очистки или отделения клеток, экспрессирующи х flt 3 на их поверхности. Изобретение предусматривает отделение клеток, имеющих flt 3-рецептор на их поверхности, от смеси клеток в растворе, посредством контактирования этих клеток в смеси с поверхностью для контакта, имеющей на ней flt 3-связывающие молекулы, и отделения этой поверхности и раствора. После отделения эти клетки могут выращиваться ex vi vo c применением flt 3-L и вводиться больному. Кодирующая мышиный flt 3-L кДНК была выделена и описана в SEQ ID NO:1. Кодирующая человеческий flt 3-L кЦНК была выделена и описана в SEQ ID NO:5. Э то раскрытие кДНК, кодирующих 6 42726 мышиный и человеческий flt 3-L, делает возможным конструирование экспрессирующих векторов, содержащих кДНК, кодирующи х flt 3-L; клеток-хозяев, трансфицированных или трансформированных этими экспрессирующими векторами; получение биологически активных мышиных и человеческих flt 3-L в виде гомогенных белков; и антител, иммунореактивных с мышиным и человеческим flt 3-L. Flt 3-L применим в усилении, стимуляции пролиферации или роста клеток, экспрессирующих flt 3-рецептор, в том числе клеток, не являющихся гомопоэтическими. Поскольку flt 3-рецептор обнаружен в мозгу, плаценте и тканях, происходящих из нервной системы, или тканях гемопоэтического происхождения, и распределен в яичниках, лимфатических узлах, селезенке, вилочковой железе и печени эмбриона, возможно лечение множества состояний, ассоциированных с повреждениями их тканей. Конкретные применения flt 3-L описаны ниже, хотя изобретение и не ограничивается только ими. В применении здесь, термин " flt 3-L" относится к роду полипептидов, которые связываются и образуют комплекс независимо с рецептором flt 3, обнаруженным на клетках-предшественниках (недифференцированных клетках) и стволовых клетках. Термин " flt 3-L" включает в себя белки, имеющие аминокислотную последовательность 1-231 SEQ ID NO:2 или аминокислотную последовательность 1-235 SEQ ID NО:6, а также те белки, которые имеют высокую степень сходства или высокую степень идентичности с аминокислотной последовательностью 1-231 SEQ ID NО:2 или с аминокислотной последовательностью 1-235 SEQ ID NО:6 и являются биологически активными, и связывают рецептор flt 3. Кроме того, этот термин относится к биологически активным генным продуктам ДНК SЕQ ID NО:1 или SЕQ ID NO:5. Кроме того, термин "flt 3-L" относится к мембрано-связанным белкам (которые включают в себя внеклеточный район, мембранный район и внутриклеточный район) и растворимым или укороченным белкам, которые содержат исходно внеклеточную часть такого белка, сохраняют биологическую активность и способны секретироваться. Характерными примерами таких растворимых белков являются белки, содержащие последовательность аминокислот 28-163 SEQ ID NО:2 и последовательность аминокислот 28-160 SEQ ID NO:6. Термин "биологически активный" по отношению к flt 3-L означает, что flt 3-L способен связываться с flt 3. Альтернативно, термин "биологически активный" означает flt 3-L, который способен к трансдукции стимулирующего сигнала к клетке через мембрано-связанный flt 3. "Выделенный" означает, что flt З-L не связан с другими белками или полипептидами, например, в виде очищенного продукта культуры рекомбинантной клетки-хозяина или в виде очищенного экстракта. В применении здесь "flt 3-L-разновидность" означает полипептид, по существу, гомологичный нативному flt 3-L, но имеющий аминокислотную последовательность, отличающуюся от последовательности нативного flt 3-L (человека, мыши или други х видов млекопитающих), вследствие одной или нескольких делений, инсерций или замещений. Такая вариантная аминокислотная последовательность, предпочтительно, по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности нативного flt 3-L, наиболее предпочтительно - идентична по меньшей мере на 90%. Процент идентичности может быть, например, определен путем сравнения информации последовательности c применением компьютерной программы GAP, версия 6,0, описанной Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) и доступна из University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Программа GАР использует способ сравнительного анализа первичной структуры Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443. 1970), переработанный Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981). Предпочтительными параметрами "по умолчанию" для программы GАР являются: (1) унарная матрица сравнения (содержащая величину 1 для идентичностей и О - для отрицания идентичности) для нуклеотидов и матрица сравнения веса Grilskov and Burgess, Nucl. Acids. Res. 14:6745, 1986, как описано Schartz and Dayhoff, eds, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353358, 1979; (2) наказание 3,0 для каждого пропуска и дополнительное наказание 0,10 - за каждый символ в каждом пропуске; и (3) отсутствие наказания за концевые пропуски. Разновидности могут содержать консервативно замещенные последовательности, т. е. данный аминокислотный остаток заменен остатком, имеющим сходные физико-химические свойства. Примерами консервативных замещений являются: замена одного алифатического остатка на другой, например, замены Ile, Val, Leu или Аlа друг на друга или замены одного полярного остатка другим, например, замены между Lys и Аrg; Glu и ASp или Gln и Аsn. Другие такие консервативные замещения, например, замены целых районов, имеющих сходные характеристики гидрофобности, хорошо известны. Природно встречающиеся pазновидности flt 3-L также включены в это изобретение. Примерами таких разновидностей являются белки, происходящие из событий перемещающегося сплайсинга мРНК или из протеолитического расщепления белка flt 3-L, при которых сохраняется связывающая способность flt 3-L. Перемежающийся сплайсинг мРНК может давать укороченный, но биологически активный белок flt 3-L, такой как природно встречающаяся растворимая форма этого белка, например. Вариации, приписываемые протеолизу, включают, например, различия в N- или С-концах при экспрессии в разных типах клетокхозяев, вызываемые протеолитическим удалением одной или нескольких концевых аминокислот из белка flt 3-L (в основном, из 1-5 концевых аминокислот). Термин "аутологичная или аутогенная трансплантация" описан в U.S. Раtent № 5199242, включенном здесь в виде ссылки. Вкратце, термин означает способ проведения трансплантации гемопоэтических а утогенных клеток-предшественников или стволовых клеток, предусматривающий: 7 42726 (1) сбор гемопоэтических клеток-предшественников или стволовых клеток из больного перед цитовосстановительной терапией; (2) увеличение в объеме (развитие) этих недифференцированных гемопоэтических клеток или стволовых клеток ex vi vo с flt 3-L для обеспечения клеточного препарата, содержащего увеличенные количества гемопоэтических клеток-предшественников или стволовых клеток; и (3) введение этого клеточного препарата больному вместе с цитовосстановительной терапией или после нее. Клетки-предшественники и стволовые клетки могут быть получены из собранной периферической крови или эксплантатов костного мозга. Иногда один или более цитокинов, выбранных из описанной выше группы, могут комбинироваться с flt 3-L для содействия пролиферации определенных типов гемопоэтических клеток или для воздействия на клеточную функцию полученной размноженной популяции гемопоэтических клеток. Из описанных выше предпочтительны SF, IL-1, IL-3, ЕРО, G-CSF, GM-CSF и GM-CSF/IL-3-слитые белки, а особенно предпочтительны G-СSF, GМ-CSF и GM-CSF/IL-3-слитые белки. Термин "аллогенная трансплантация" означает способ, в котором клетки костного мозга или клетки-предшественники периферической крови, или стволовые клетки удаляют из млекопитающего и вводят другому млекопитающему того же самого вида. Термин "сингенная трансплантация" означает трансплантацию костного мозга генетически идентичными млекопитающими. Описанный выше способ трансплантации данного изобретения предусматривает предварительную процедуру in vivo включающую введение flt 3-L, одного или в последовательной или в совместной комбинации с пополняющим фактором роста, больному для пополнения гемопоэтических клеток в периферической крови перед их сбором. Пригодные, пополняющие количество гемопоэтических клеток, факторы перечислены выше, и предпочтительными из них являются flt 3-L, SF, IL-1 и IL-3. Описанный выше способ данного изобретения иногда включает в себя процедуру, предусматривающую введение flt 3-L, одного или в последовательной или совместной комбинации с приживляющим фактором роста, больному после трансплантации клеточного препарата для облегчения приживлення и усиления пролиферации приживленных гемопоэтических клеток-предшественников или стволовых клеток из клеточного препарата. Пригодные, способствующие приживлению, факторы перечислены выше, и предпочтительными из них являются GM-CSF, G-CSF, IL-3, IL-1, ЕРО и слитые GM-CSF/IL-З. Изобретение включает в себя далее среды для выращивания клеток-предшественников или стволовых клеток, содержащие среды для выращивания клеток, аутологичную сыворотку и flt 3-L, один или в комбинации с цитокиновым фактором роста, из перечисленных выше цитокинов. Предпочтительными факторами роста являются SF, GM-CSF, IL-3, IL-1, G-CSP, ЕРО и слитые белки GM-CSF/IL-3. В частности, flt 3-L можно применять для стимуляции пролиферации гемопоэтических и негемопоэтических стволовых клеток. Такая стимуляция выгодна, когда происходит повреждение специфической ткани. Как таковой flt 3-L можно применять в лечении нейрологического повреждения, и он может быть фактором роста для нервных клеток. Вероятно, flt 3-L можно было бы применять в способах оплодотворения in vitro и в лечении in vivo состояний бесплодия. Flt 3-L мог бы быть полезным в лечении кишечного повреждения, вызываемого облучением или химиотерапией. Поскольку рецептор flt 3 присутствует на стволовых клетках, ведущи х к развитию волосяных фолликулов, flt 3-L, вероятно, можно было бы применять для усиления роста волос. Поскольку показано, что flt 3-L стимулир ует пролиферацию Т-клеток, а также эритроцитов (см.: Примеры, infra), flt 3-L находит применение в лечении больных, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (HIV, ВИЧ). Такое лечение должно включать введение flt 3-L для стимуляции образования in vivo, а также ex vivo размножения Т-клеток. Кроме того, flt 3-L может предотвращать недостаточность СD4+Т-клеток. Такое лечение может увеличивать или поддерживать иммунную ответную реакцию больного против этого вируса, улучшая тем самым или поддерживая качество жизни больного. Кроме того, такое лечение in vivo стимулировало бы клетки эритроидного направления дифференцировки, улучшая гематокритное число и уровни гемоглобина. Flt 3-L можно вводить в этом случае один или в последовательной или одновременной комбинации с цитокинами, выбранными из описанной группы. Flt 3-L применим в генной терапии, благодаря его специфичности для клеток-предшественников и стволовых клеток. Генная терапия предусматривает введение трансфицированных экзогенной ДНК клеток хозяину, которым дают прижиться в нем (см., например, Boggs, International J. Cell Cloning 8:80-96 (1990); Kohn et al.; Cancer Invest., 7(2):179-192 ; Lehn, Bone Marrow Transpl., 5:287293 (1990) и Verma, Scientific Americаn, pp.68-84 (1990). С применением способов генной терапии, известных в этой области, способ переноса гена млекопитающему предусматривает стадии: (a) культивирования ранних гемопоэтических клеток в средах, содержащих один flt 3-L или в последовательной или одновременной комбинации с цитокином, выбранным из описанной выше группы; (b) трансфекции культивируемых клеток стадии (а) экзогенным геном; и (c) введение трансфицированных клеток млекопитающему. В рамках этого способа находится новый способ трансфекции клеток-предшественников или стволовых клеток геном, предусматривающий описанные стадии (а) и (b). Кроме того, при помощи тех же или сходных способов кДНК, кодирующая flt 3-L может быть трансфицирована в такие доставляющие клетки для доставки продукта гена flt 3-L к тканям-мишеням. Пример 1 описывает конструирование нового слитого белка flt 3:Fc, применимого в скрининге на flt 3-L. Другие Fc районы антитела могут быть за 8 42726 менены на Fc район человеческого lgGl, описанный в Примере 1. Другими подходящими Fc районами являются те, которые могут связываться с высокой аффинностью с белком А или белком G и включают в себя Fc район человеческого lgGl или фрагменты Fc района человеческого или мышиного lgGl, например, фрагменты, содержащие по меньшей мере шарнирную область, так что будут образовываться межцепочечные дисульфидные связи. Слитый белок flt 3:Fc имеет преимущество, заключающееся в том, что его легко очистить. Кроме того, дисульфидные связи образуются между Fc районами двух отдельных цепей слитого белка, создавая димеры. Димерный рецептор flt 3:Fc был выбран для потенциального преимущества высокоаффинного связывания flt 3-L ввиду возможности того, что этот лиганд мог бы быть мультимерным. Как описано supra аспектом этого изобретения являются растворимые полипептиды flt 3-L. Растворимые полипептиды flt 3-L содержат весь внеклеточный домен или его часть нативного flt 3-L, но не содержат трансмембранного района, который удерживал бы этот полипептид на клеточной мембране. Преимуществом растворимых полипептидов flt 3-L является то, что они содержат нативный (или гетерологичный) сигнальный пептид, который синтезируется первоначально для усиления секреции, но этот сигнальный пептид отщепляется при секреции flt 3-L из клетки. Растворимые полипептиды flt 3-L, включенные в это изобретение, сохраняют способность связывать рецептор flt 3. В самом деле растворимый flt 3-L может содержать также часть трансмембранного района или часть цитоплазметического домена, или другие последовательности при условии, что растворимый белок flt 3-L может секретироваться. Растворимый flt 3-L может быть идентифицирован (и его можно отличить от его мембраносвязанных копий) путем определения интактных клеток, экспрессирующи х этот целевой белок, от культуральной среды, например, центрифугированием, и анализом этой среды (супернатанта) на присутствие целевого белка. Присутствие flt 3-L в среде свидетельствует о том, что этот белок секретировался из клеток и, следовательно, представляет собой растворимую форму целевого белка. Растворимые формы flt 3-L обладают многими преимуществами по сравнению с нативным связанным белком flt 3-L. Возможна очистка таких белков из рекомбинантных клеток-хозяев, т. к. растворимые белки секретируются из этих клеток. Кроме того, растворимые белки обычно более пригодны для внутривенного введения. Примерами растворимых полипептидов flt 3-L являются полипептиды, содержащие значительную часть внеклеточного домена нативного белка flt 3-L. Такие растворимые белки flt 3-L млекопитающи х содержат аминокислоты 28-188 SEQ ID №:2 или аминокислоты 28-182 SЕQ ID №: 6. Кроме того, в изобретение также включены укороченные растворимые белки flt 3-L, содержащие неполный внеклеточный домен. Такие укороченные раcтворимые белки последовательностью аминокислот 28-163 SEQ ID №:2 и аминокислотами 28160 SEQ ID №:6. При первоначальной экспрессии внутри клетки-хозяина растворимый flt 3-L может дополнительно содержать один из гетерологичных сигнальных пептидов, описанных ниже, который функционален в клетках-хозяевах. Альтернативно, белок может содержать нативный сигнальный пептид, так что flt 3-L млекопитающего содержит аминокислоты 1-188 SEQ ID №:2 или аминокислоты 1-182 SEQ ID №:6. В одном варианте изобретения растворимый flt 3-L экспрессировался в виде слитого белка, содержащего (от N- к С-концу) сигнальный пептид a-фактора дрожжей, FL AGÒ пептид, описанный ниже и в U.S. Patent № 5011912, и растворимый flt 3-L, состоящий из аминокислот 28-188 SЕQ ID №:2. Этот рекомбинатный слитый белок экспрессируется в дрожжевых клетках и секретируется на них. FL AGÒ пептид облегчает очистку этого белка и затем может быть отщеплен от растворимого flt 3L при помощи энтерокиназы бычьей слизистой оболочки. Выделенные последовательности ДНК, кодирующие растворимые белки flt 3-L, включены в данное изобретение. Укoроченный flt 3-L, в том числе растворимые полипептиды, могут быть получены любым из многих стандартных способов. Целевая последовательность ДНК может быть химически синтезирована при помощи известных реr se способов. Фрагменты ДНК также могут быть получены расщеплением peстриктазами полноразмерной последовательности клонированной ДНК и выделены электрофорезом на агарозных гелях. Могут быть применены линкеры, содержащие сайт (сайты) расщепления рестриктаз, для инсерции целевого фрагмента ДНК в экспрессирующий вектор или фрагмент может быть расщеплен в сайтах расщепления, природно присутствующи х в нем. Для амплификации последовательности ДНК, кодирующей целевой белковый фрагмент, может быть также применена хорошо известная процедура полимеразной цепной реакции. В качестве дальнейшей альтернативы известные способы мутагенеза могут быть также использованы для инсерции стоп-кодона в желаемой точке, например, непосредственно справа (в направлении 5'-3') от кодона для последней аминокислоты внеклеточного домена. В другом подходе может быть применена ферментативная обработка (например, экзонуклеазой Ваl31) для делении концевых нуклеотидов из фрагмента ДНК для получения фрагмента, имеющего определенный целевой конец. Среди коммерчески доступных линкеров находятся линкеры, которые могут быть лигированы с тупыми концами, образуемыми при расщеплеии Ваl31, и которые содержат сайт (сайты) расщепления рестриктазами. Альтернативно, олигонуклеотиды, реконструир ующие N- или С-конец фрагмента ДНК до желаемой точки, могут быть синтезированы и лигированы с этим фрагментом ДНК. Синтезированный олигонуклеотид может содержать сайт расщепления рестриктазой слева (в направлении 3'-5') от желаемой кодирующей последовательности и положения инициирующего кодона (ATG) при N-конце кодирующей последовательности. Как утверждалось выше, это изобретение обеспечивает выделенные или гомогенные полипептиды flt 3-L, как рекомбинантные, так и нере 9 42726 комбинантные. Разновидности и производные нативных flt 3-L белков, сохраняющие желаемую биологическую активность (например, способность связывать flt-3), могут быть получены при помощи мутаций нуклеотидных последовательностей, кодирующи х нативные flt 3-L-полипептиды. Изменения нативной аминокислотной последовательности могут быть достигнуты любым из ряда стандартных способов. Мутации могут быть введены при определенных локусах п утем синтеза олигонуклеотидов, содержащих мутантн ую последовательность, фланкированную сайтами рестрикции, позволяющими лигирование с фрагментами нативной последовательности. После лигирования полученная реконструированная последовательность кодирует аналог, имеющий целевые инсерцию аминокислот, замену или делецию. Альтернативно, способы олигонуклеотид-направленного сайт-специфического мутагенеза могут быть использованы для обеспечения измененного гена, в котором заданные кодоны могут быть изменены посредством замены, делеции или инсерции. Примеры способов обеспечения таких изменений, изложенных выше, описаны Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al, (Gene 37:73,1985); Сraik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol, 154:367, 1987); и U.S. Patent №№ 4518584 и 4737462, включенных здесь в виде ссылок. Flt 3-L может быть модифицирован для получения производных flt 3-L путем образования ковалентных или агрегатных конъюгатов с другими химическими частями молекул, такими как гликозильные группы, липиды, фосфатные, ацетильные группы и т. п. Ковалентные производные flt 3-L могут быть получены соединением этих химических частей молекул с функциональными группами на боковых аминокислотных цепях flt 3-L или при N-конце или С-конце полипептида flt 3-L или его внеклеточного домена. Другие производные flt 3-L в сфере действия этого изобретения включают ковалентные или агрегатные конъюгаты flt 3-L или eго фрагментов с другими белками или полипептидами, например, при помощи синтеза в рекомбинантной культуре в виде N-концевых или С-концевых слитых белков. Например, такой конъюгат может содержать последовательность сигнального или лидерного полипептида (например, лидерную последовательность a-фактора Saccharomyces) при N-конце полипептида flt 3-L. Сигнальный или лидерный пептид ко-трансляционно или посттрансляционно направляет транспорт конъюгата из места его синтеза к месту внутри или снаружи клеточной мембраны или клеточной стенки. Слитые flt 3-L полипептиды могут содержать пептиды, добавленные для облегчения очистки и идентификации flt 3-L. Такие пептиды включают, например, поли-HiS или антигенные идентификационные пептиды, описанные в U.S. Раtеnt № 5011912 и в Норр еt al., Biol. Technology 6:1204, 1988. Кроме того, изобретение включает в cебя flt 3-L полипептиды с ассоциированным природным распределением гликозилирования или без него. Flt 3-L, экспрессируемый в дрожжевых сис темах экспрессии или в системах экспрессии млекопитающих (например, в COS-7 клетках), могут быть подобными нативному полипептиду flt 3-L или значительно отличаться от него по мол. массе и распределению гликозилирования в зависимости от выбора системы экспрессии. Экспрессия flt 3-L полипептидов в бактериальных системах экспрессии, таких как Е. соli, обеспечивает негликозилированные молекулы. В это изобретение включены эквивалентные конструкции ДНК, кодирующие различные добавления или замещения аминокислотных остатков или последовательностей, или делеции концевых или внутренних остатков, или последовательностей, не требующи хся для биологической активности или связывания. Например, сайты N-гликозилирования во внеклеточном домене flt 3-L могут быть модифицированы для предотвращения гликозилирования, что делает возможной экспрессию восстановленного углеводного аналога в системах экспрессии млекопитающих и дрожжей. Сайты N-гликозилирования в полипептидах эукариот характеризуются аминокислотым триплетом Asn-X-Y, где X обозначает любую аминокислоту, кроме Pro, а Y обозначает Ser или Тhr. Мы шиный и человеческий flt 3-L-белки содержат (каждый) два таких триплета при положениях аминокислот 126-128 и 150-152 SЕQ ID №:6, соотве тственно. Подходящие замены, добавления или делеции в нуклеотидной последовательности, кодирующей эти триплеты, будут приводить к предотвращению присоединения углеводных остатков при Asn боковой цепи. Изменения в единственном нуклеотиде, выбранном таким образом, что Asn заменяется другой аминокислотой, например, достаточно для инактивации сайта N-гликозилирования. Известные способы для инактивации сайтов N-гликозилирования в белках включают способы, описанные в U.S. Раtепt 5071972 и ЕР 276846, включенных здесь в виде ссылки. В другом примере последовательности, кодирующие Cys остатки, которые несущественны для биологической активности, могут быть изменены таким образом, чтобы Cys остатки были делетированы или заменены другими аминокислотами, что препятствует образованию неправильных дисульфадных мостиков внутри молекул при ренатурации. Другие эквиваленты получают модификацией смежных двух основных аминокислотных остатков для усиления экспрессии в дрожжевых системах, в которых присутствует КЕХ2-протеазная активность. ЕР 212914 описывает применение сайт-специфического мутагенеза для инактивации сайтов действия КЕХ2-протеаз в белке. Эти сайты инактивируются делецией, добавлением или заменой остатков для изменения пар Агg-Аrg, Arg-Lys и L ys-Arg для исключения присутствия этих смежных основных остатков. Пары Lys-Lys значительно меньше восприимчивы к расщеплению KEX2, и превращение пар Аrg-Lys или Lуs-Аrg в пару L уs-Lys является консервативным и предпочтительным подходом для инактивации сайтов KEX2. Как мышиный, так и человеческий flt 3-L содержат два сайта действия КЕХ2-протеазы при аминокислотах 216-217 и 217-218 SEQ ID №:2 и при аминокислотах 211-212 и 212-213 SEQ ID №:6, соответственно. Последовательности нуклеино 10 42726 вых кислот в сфере действия данного изобретения включают выделенные последовательности ДНК и РНК, гибридизующиеся с описанными здесь нуклеотидными последовательностями нативного flt 3-L при условиях умеренной или высокой строгости и кодирующие биологически активный flt 3-L. Условия умеренной строгости, описанные Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Man yal, 2 ed. Vol. 1, pp. 1. 101-104, Соld Spring Harbor Laboratory Press, (1989), предусматривают применение предпромывного раствора 5´SSc, 0,5% SDS 1,0 мМ ЕDТА (рН 8,0) и гибридизационных условий приблизительно 55°С, 5´SSc, в течение ночи. Условия высокой строгости предусматривают более высокие температуры гибридизации и промывания. Квалифицированный специалист в этой области должен понимать, что температура и концентрация соли в промывном растворе могут быть корректированы, если необходимо, в соответствии с такими факторами, как длина зонда. Вследствие известной вырожденности генетического кода, в котором более, чем один кодон, может кодировать одну и ту же аминокислоту, последовательность ДНК может отличаться от представленной в SEQ ID №:1 и SEQ ID №:5 и все-таки кодировать белок flt 3-L, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID №:6, соответственно. Такие вариантные последовательности ДНК могут происходить из молчащих мутаций (например, встречающи хся во время PCR, амплификации) или могут быть продуктом неспецифического мутагенеза нативной последовательности. Данное изобретение обеспечивает равноценные выделенные последовательности ДНК, кодирующие биологически активный flt 3-L, выбранные из: (а) ДНК, полученной из кодирующего района нативного гeнa flt 3-L млекопитающего; (b) кДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID №:1 или SEQ ID №:5; (с) ДНК, способной гибридизоваться с ДНК (а) при умеренно строгих условиях и кодирующей биологически активный flt 3-L; и (d) ДНК, вырожденной как результат генетического кода относительно ДНК, определенной в (а), (b) или (с), и кодирующей биологически активный flt 3-L. Белки flt 3-L, кодируемые такими эквивалентными последовательностями ДНК, включены в данное изобретение. ДНК, являющиеся эквивалентами последовательности ДНК SEQ ID №:1 или SEQ ID №:5, будут гибридизоваться при умеренно строгих условия х с нативной последовательностью ДНК, кодирующей полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности 28-163 SEQ ID №:2 или 28-160 SЕQ ID N°:6. Примеры flt 3-L белков, кодируемых такой ДНК, включают (но не ограничиваются ими) фрагменты 3-I (растворимые или мембрано-связанные) и flt 3-L белки, содержащие инактивированные сайт (сайты) N-гликозилирования, инактивированные сайты действия КЕХ2-протеазы или консервативные aминокислотые замены, описанные выше. В изобретение включены также белки flt 3-L, кодируемые ДНК, полученной из других видов млекопитающих, которые будут гибридизоваться с ДНК SEQ ID №:1 или SEQ ID №:5. Разновидности, обладающие требуемой способностью связывать рецептор flt 3, могут быть идентифицированы любым, пригодным для этого, тестом. Биологическую активность flt 3-L можно, например, определить конкуренцией за связывание с лиганд-связывающим доменом рецептора flt 3, (т. е. тестами конкуретного связывания). Один тип теста конкурентного связывания для полипептида flt 3-L использует радиоактивно меченый человеческий flt 3-L и интактные клетки, экспрессирующие рецепторы flt 3 клеточной поверхности. Вместо интактных клеток можно было бы применять растворимые рецепторы flt 3 (такие как слитый белок flt 3:Fс), связанные с твердой фазой через взаимодействие Протеина А, Протеина G или антител к flt 3- или Fc-частям этой молекулы с Fc районом слитого белка. Другой тип теста конкурентного связывания использует радиоактивно меченые растворимые рецепторы flt З, такие как слитый белок flt 3:Fc, и инактные клетки, экспрессирующие flt 3-L. Альтернативно, растворимый flt 3-L может быть связан с твердой фазой для положительного отбора экспрессирующих flt 3 клеток. Тесты конкурентного связывания можно проводить согласно общепринятой методологии. Например, можно использовать радиоактивно меченый flt 3-L для конкуренции с предполагаемым гомологом flt 3-L для оценки связывающей активности в отношении связанных с поверхностью рецепторов flt-3. Количественные результаты могут быть получены при помощи тестов конкурентного связывания с применением пластинки для авторадиографии или при помощи кривых Скетчарда, применяемых для получения количественных результатов. Альтернативно, flt 3-связывающие белки, такие как flt 3-L и антитела против flt 3 могут быть связаны с твердой фазой, такой как матрикс для колоночной хроматографии или подобный субстрат, пригодный для идентификации, отделения или очистки клеток, экспрессирующих рецептор flt 3 на их поверхности. Связывание flt 3-связывающи х белков с контактирующей с твердой фазой поверхностью может быть выполнено любым способом, например, конструированием слитого белка flt 3:Fc и связыванием его с твердой фазой через взаимодействие Протеина А или Протеина G. Многочисленные другие способы фиксации белков с твердой фазой хорошо известны в данной области и пригодны для применения в данном изобретении. Например, магнитные микросферы могут быть покрыты flt 3-связывающими белками и удерживаться в инкубационном сосуде при помощи магнитного поля. Суспензии клеточных смесей, содержащих гемопоэтические клетки-предшественники или стволовые клетки, приводят в контакт с твердой фазой, имеющей на ее поверхности flt 3-связывающие белки. Клетки, имеющие рецептор flt 3 на их поверхности, связываются с фиксированным flt 3-связывающим белком, а несвязавшиеся клетки вымываются. Этот способ аффинного связывания применим для очистки, скрининга или отделения таких экспрессирующих flt 3 клеток из раствора. Способы высвобождения положительно отобранных клеток из твердой фазы известны в данной области и предусматрива 11 42726 ют, например, применение ферментов. Такие ферменты, предпочтительно, являются нетоксичными и безвредными для клеток и, предпочтительно, направлены на отщепление связывающего партнера клеточной поверхности. В случае взаимодействий flt 3, flt 3-L фермент, предпочтительно, должен отщеплять рецептор flt 3, освобождая вследствие этого полученную клеточную суспензию от "чужеродного" flt 3-L материала. Очищенная клеточная популяция затем может быть размножена ex vivo перед трансплантацией больному в количестве, достаточном для восстановления гемопоэтической и иммунной системы больного. Альтернативно, смеси клеток, в которых предполагают присутствие flt З+клеток, сначала можно инкубировать с биотинилированным flt 3-связывающим белком. Периоды инкубирования составляют обычно не менее часа для гарантии достаточного связывания с flt 3. Затем полученную смесь пропускают через колонку, упакованную покрытыми авидином гранулами, в результате чего высокая аффинность биотина в отношении авидина обеспечивает связывание клетки с гранулами. Применение покрытых авидином гранул известно в данной области (см.: Berenson, et al. J. Cell. Biochem., 10:239 (1986). Промывание несвязавшегося материала и высвобождение связанных клеток выполняют при помощи общепринятых способов. В описанных выше способах подходящими flt 3-связывающими белками являются flt 3-L, антитела против flt 3 и другие белки, способные связываться с flt 3 с высокой аффинностью. Предпочтительным flt З-связывающим белком является flt 3-L. Как описано выше, flt 3-L этого изобретения можно применять для отделения клеток, экспрессирующи х рецепторы flt 3. В альтернативном способе flt 3-L или его внеклеточный домен, или его фрагмент могут быть конъюгированы с детектируемой частью молекулы, такой как 125I для обнаружения экспрессирующих fl t 3 клеток. Радиоактивное мечение при помощи 125I можно проводить любой из нескольких стандартных методологий, которые дают функциональную молекулу 125 I-flt 3-L, меченую до высокой удельной активности. Можно было бы использовать иодинированное или биотинилированное антитело против flt 3-района или Fс района этой молекулы. Можно использовать другую детектируемую часть молекулы, такую как фермент, способный катализировать колориметрическую или флуорометрическую реакцию, авидин или биотин. Клетки, тестируемые на экспрессию рецептора flt 3, можно привести в контакт с меченым flt 3-L. После инкубирования несвязавшийся flt 3-L удаляют, и связывание измеряют при помощи детектируемой части. Характеристики связывания flt 3-L (в том числе вариантов) можно также определить с применением конъюгированных рецепторов растворимого flt 3 (например, 125I-flt 3:Fc) в конкурентных тестах, подобных описанным выше. В этом случае, однако, применяют инактные клетки, экспрессирующие рецепторы flt-3, или рецепторы растворимого flt-3, связанные с твердым субстратом, для измерения степени, до которой проба, содержащая предполагаемую flt-3-L разновидность, конку рирует за связывание с растворимым flt-3, конъюгированным с flt-3-L. Другие способы определения flt 3-L включают применение антител против flt 3-L, клеточных линий, размножающихся в ответ на flt 3-L, или рекомбинантных клеточных линий, экспрессирующих рецептор flt 3 и размножающихся в присутствии flt 3-L. Например, клеточная линия BAF/BО3 не содержит рецептора flt 3 и является IL-3-зависимой (см.: Hatakeyama, et al., Cell, 59:837-845 (1989)). Клетки BAF/BО3, трансфицированные экспрессирующим вектором, содержащим ген рецептора flt 3, размножаются в ответ либо на IL-3, либо на flt 3-L. Примером подходящего экспрессирующего вектора для трансфекции flt 3 является плазмида pCAV/NОТ (см.: Mosley et al., Cell, 59:335-348 (1989). Полипептиды flt 3-L могут существова ть в виде с олигомеров, таких как ковалентнo соединенные или нековалентно соединенные димеры или тримеры. Олигомеры могут быть соединены дисульфидными связями, образуемыми между цистеиновыми остатками на различных полипептидах flt 3-L. В одном варианте изобретения димер flt 3-L образуют слиянием flt 3-L с Fc районом антитела (например, IgGl) таким образом, что это не мешает связыванию flt 3-L c flt 3-L-связывающим доменом. Полипептид Fc, предпочтительно, сливают с С-концом растворимого flt 3-L (содержащим только внеклеточный домен). Общее получение слитых белков, содержащих гетерологичные полипептиды, слитые с различными частями произведенных из антител полипептидов (в том числе с Fc доменом) было описано, например, Ashkenazi et al. (PNAS USA 88:10535, 1991) и Byrn et al. (Nature 344:677, 1990), включенными здесь в виде ссылки. Генное слияние, кодирующее слитый белок flt 3-L:Fc, встраивают в подходящий экспрессирующий вектор. Слитые белки flt 3-L:Fc могут собираться подобно молекулам антител, после чего образуются межцепочечные дисульфидные связи между Fc полипептидами, образуя двухвалентный flt 3-L. Если слитые белки сделаны как из тяжелых, так из легких цепей антитела, можно образовать олигомер flt 3-L c четырьмя flt 3-L внеклеточными районами. Альтернативно можно соединить два растворимых домена flt 3-L пептидным линкером. Рекомбинантные экспрессирующие векторы, содержащие ДНК, кодирующую flt 3-L, могут быть приготовлены при помощи хорошо известных способов. Эти экспрессирующие векторы включают в себя последовательность ДНК flt 3-L, оперативно соединенную с подходящими транскрипционными или транскрипционными регуляторными нуклеотидными последовательностями, полученными, например, из гена млекопитающего, микроорганизма, вируса или насекомого. Примерами регуляторных последовательностей являются транскрипционные промоторы, операторы или энхансеры, сайт связывания рибосом мРНК и подходящие последовательности, регулирующие инициацию и терминацию транскрипции и трансляции. Нуклеотидные последовательности "оперативно соединены", если данная регуляторная последовательность функционально имеет отношение к последовательности ДНК flt 3-L. Так, промоторная нуклеотидная последовательность оперативно со 12 42726 единена с последовательностью ДНК flt 3-L, если эта промоторная нуклеотидная последовательность контролирует транскрипцию этой последовательности ДНК flt 3-L. Способность к репликации в желаемых клетках-хозяевах, обычно придаваемая началом репликации, и селектируемый ген, при помощи которого идентифицируют трансформанты, могут быть дополнительно встроены в экспрессирующий вектор. Кроме того, последовательности, кодирующие подходящие сигнальные пептиды, которые в природе не связаны с flt 3-L, могут быть включены в экспрессирующие векторы. Например, последовательность ДНК для сигнального пептида (секреторного лидера) может быть слита в рамке считывания с последовательностью flt 3-L таким образом, что flt 3-L первоначально транслируется в виде слитого белка, содержащего сигнальный пептид. Сигнальный пептид, функциональный в предназначенных клетках-хозяевах, усиливает секрецию полипептида flt 3-L из клетки. Этот сигнальный пептид может отщепляться от полипептида flt 3-L после секреции flt 3-L из клетки. Подходящими клетками-хозяевами для экспрессии полипептидов flt 3-L являются прокариоты, дрожжевые клетки или летки высших эукариот. Пригодные клонирующие и экспрессирующие векторы для использования с бактериальными, грибковыми, дрожжевыми и млекопитающими клеточными хозяевами описаны, например, в Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985). Бесклеточные системы трансляции могли бы также применяться для продуцирования полипептидов flt 3-L с применением РНК, произведенных из конструкций ДНК, описанных здесь. Прокариоты включают в себя грамм-отрицательные или грамм-положительные организмы, например, E. coli или Васilli. Пригодные для трансформации прокариотные клетки-хозяева включают в себя, например, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и многочисленные другие виды внутри родов Pseudomonаs, Streptomyces и Staphylococcus, в прокариотной клетке-хозяине, такой как E. coli, полипептид flt 3-L может содержать N-концевой остаток метионина для облегчения экспрессии рекомбинантного полипептида в клетке прокариотного хозяина. N-концевой Met может быть отщеплен от экспрессируемого рекомбинантного flt 3-L полипептида. Экспрессирующие векторы для применения в прокаритных клетках-хозяевах содержат один или более фенотипических селектируемых маркерных генов. Фенотипическим селектируемым маркерным геном является, например, ген, кодирующий белок, который придает резистентность к антибиотику или который удовлетворяет требование автотрофии. Примерами применимых экспрессирующих векторов для прокариотных клеток-хозяев являются векторы, произведенные из коммерчески доступных плазмид, таких как клонирующий вектор рВR322 (АТСС 37017), рВR322 содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину и, следовательно, обеспечивает простое средство для идентификации трансформированных клеток. Для конструирования экспрессирующего вектора с применением рВR322 подходящий промотор и по следовательность ДНК flt З-L встраивают в вектор рВR322. Другие коммерчески доступные векторы включают, например, рКК223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uррsala, Sweden) и pGEM1 (Promega Bioteс, Madison, W1, USA). Промоторные последовательности, обычно применяемые для рекомбинантных экспрессирующих векторов прокариотных клеток-хозяев, включают b-лактамазную (пенициллиназную), лактозную промоторную систему (Сhang et al., Nature 275:615, 1978 и Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), систему промотора триптофана (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980 и ЕР-А-36776) и tас промотор (Maniatis, Molecblar Cloning: A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Ladoratory 412, 1982). Особенно ценная система экспрессии прокариотной клеткихозяина применяет промотор фага l РL ; и термолабильную репрессорную последовательность c1857ts. Плазмидные векторы, доступные из АТСС, содержащие производные РL промотора фага l, включают плазмиду pHU В2 (резидент в штамме E. colL JMB9 (АТСС 37092)) и pPL с28 (резидент в E. coli RR1 (ATCC 53082)). Полипептиды flt 3-L альтернативно могут экспрессироваться в дрожжевых клетках-хазяевах, предпочтительно, из рода Saccharomyces (например, S. cerevisiae). Можно применять также другие роды дрожжей, такие как Pichia, K. lactis или Kluyveromyces. Дрожжевые векторы будут часто содержать последовательность начала (ориджина) репликации из дрожжевой плазмиды 2m, автономно реплицирующуюся последовательность (ARS), промоторный район, последовательности полиаденилирования, последовательности терминации транскрипции и селектируемой маркерный ген. Пригодные промоторные последовательности для дрожжевых векторов включают, среди прочих, промоторы для металлотионеина, 3-фосфоглицераткиназы (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073, 1980) или других гликолитических ферментов (Hess et al., J. Adv. En zyme Reg. 7:149, 1968 и Hollard et al., Biochem., 17:4900, 1978), таких как энолаза глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа. гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофр уктокиназа, глюко-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. Другие пригодные векторы и промоторы для применения в дрожжевой экспрессии описаны далее в Hitzeman, EP-A-73657 или в Fleer et al., Gene, 10:285:195 (1991) и van Berg et al., BioTechnology, 8:135-139 (1990). Другой альтернативой является репрессируемый глюкозой промотор АDН2, описанный Russel et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) и Beier et al. (Nature 300:724, 1982). Челночные векторы, реплицируемые как в дрожжах, так и в E. colt., могут быть сконструированы путем встраивания последовательностей ДНК из рВR322 для отбора и репликации в E. colL (гена резистентности к ампициллину и начала репликации) в описанные выше дрожжевые векторы. Дрожжевая лидерная последовательность a-фактора может быть использована для направления секреции полипептида flt 3-L. Лидерную последовательность a-фактора часто встраивают между промоторной последовательностью и по 13 42726 следовательностью структурного гена (см., например, Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984; U.S. Patent 4546082 и ЕР 324274. Другие лидерные последовательности, пригодные для облегчения секреции рекомбинантных полипептидов из дрож жевых хозяев, известны специалистам в данной области. Лидерная последовательность может быть модифицирована вблизи ее 3'-конца таким образом, чтобы она содержала один или более сайтов рестрикции. Это будет облегча ть слияние лидерной последовательности со структурным геном. Протоколы трансформации дрожжей известны специалистам в этой области. Один из таких протоколов описан Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978. Протокол Hinnen et al. отбирает Trp+ трансформанты в селективной среде, состоящей из 0,67% дрожжевого азотистого основания, 0,5% аминокислот казеина, 2% глюкозы, 10 мкг/мл аденина и 20 мкг/мл урацила. Дрожжевые клетки-хозяева, трансформированные векторами, содержащими промоторную последовательность АDН2, могут выращиваться для индуцирования экспрессии в "богатой" среде. Примером богатой среды является среда, состоящая из 1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 1% глюкозы, дополненными 80 мкг/мл аденина и 60 мкг/мл урацила. Дерепрессия промотора АDН2 происходит, когда глюкоза истощается из среды. Системы культур клеток-хозяев млекопитающи х или насекомых также могли бы использоваться для экспрессии рекомбинантных полипептидов flt 3-L. Обзор бакуловирусных систем для получения гетерологичных белков в клетках насекомых дан Luckow и Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Могут также применяться установленные клеточные линии, происходящие из млекопитающих. Примерами подходящих линий клеток-хозяев млекопитающих являются линии COS-7 клеток почек обезьян (АТСС CRL 1651) (Gluzman et al., 23:175, 1981), L клетки, С127 клетки, ЗТЗ клетки (АТСС CCL 163), клетки яичника китайского хомячка (СНО), HeLa клетки и ВНК (АТСС CRL 10) клеточные линии и клеточная линия CV-1/ЕВN А-1, полученная из линии клеток почек Африканской зеленой мартышки CV1 (АТСС CCL 70), описанной McMahan аt al. (ЕМВО J. 10:2821, 1991). Tранскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности для экспрессирующи х векторов клеток-хозяев млекопитающих могут быть вырезаны из вирусных геномов. Обычно применяемые промоторные последовательности и эхансерные последовательности произведены из вируса полиомы, аденовируса 2, вируса обезьян 40 (SV 40) и человеческого цитомегаловируса. Последовательности ДНК, произведенные из вирусного генома SV 40, например, ориджин SV-40, ранний и поздний промотор, энхансер, сайты сплайсинга и полиаденилирования могут быть использованы для обеспечения други х генетических элементов для экспрессии последовательности структурного гена в клетке-хозяине млекопитающего. Вирусные, ранний и поздний, промоторы особенно применимы, поскольку их легко получить из вирусного генома в виде фрагмента, который содержит также вирусную точку инициации репли кации (ориджин) (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Можно применять большие или меньшие фрагменты SV-40 при условии, что включена последовательность приблизительно из 250 п.н., простирающаяся от сайта Нind III по направлению к сайту Bgl I, локализованному в сайте начала репликации вируса SV-40. Примеры экспрессирующи х векторов для применения в клетках-хозяевах млекопитающих могут быть сконструированы, как описано Okayama и Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Ценная система для стабильной экспрессии высокого уровня кДНК млекопитающих в С127 мышиных эпителиальных клетках молочной железы может быть сконструирована, по существу, как описано Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Ценный высокоэкспрессирующий вектор, PMLSV N1/N4, описанный Cosman et al., Nature 312:768, 1984, был депонирован как АТСС 39890. Дополнительные ценные экспрессирующие векторы млекопитающих описаны в ЕР-А-0367566 и в U.S. Patent Application Serial № 07/701415, поданной 16 мая 1991 года, включенных здесь в виде ссылок. Эти векторы могут быть произведены из ретровирусов. Вместо нативной сигнальной последовательности может быть добавлена гетерологичная сигнальная последовательность, например, сигнальная последовательность для IL-7, описанная в U.S. Patent 4965195; сигнальная последовательность для рецептора IL-2, описанная в Cosman et al., Nature 312:768 (1984); сигнальный пептид IL-4, описанный в ЕР 367566; сигнальный пептид рецептора IL-1 типа I, описанный в U.S. Patent 4968607, и сигнальный пептид рецептора IL-1 типа II, описанный в ЕР 460846. Flt 3-L в виде выделенного или гомогенного белка, согласно изобретению, может быть получен при помощи рекомбинантных систем экспрессии, описанных выше, или очищен из природно встречающи хся клеток. Flt 3-L может быть очищен, по существу, до гомогенности, о чем свидетельствуе т одна полоса белка после анализа электрофорезом в полиакриламидном геле с ДСН (SDS) (SDS-PAGE). Один способ получения flt 3-L предусматривает культивирование клетки-хозяина, трансформированной экспрессирующим вектором, содержащим последовательность ДНК, кодирующую flt 3-L, при условиях, достаточны х для усиления экспрессии flt 3-L. Затем flt 3-L извлекают из культуральной среды или клеточных экстрактов, в зависимости от примененной системы экспрессии. Как это известно квалифицированным специалистам, процедуры очистки рекомбинантного белка будут варьировать в соответствии с такими факторами, как тип примененных клеток-хозяев или в зависимости от того, секретируется или нет рекомбинантный белок в культуральную среду. Например, если применяют системы экспрессии, которые секретируют рекомбинантный белок, культуральную среду сначала можно концентрировать с применением коммерчески доступного фильтра для концентрирования белка, например, ультрафильтрационной единицы Amicon или Millipore Pellicon. После стадии концентрирования концентрат может быть нанесен на очищающий матрикс, такой как гель-фильтрационная среда. Аль 14 42726 тернативно, можно применять анионообменную смолу, например, матрикс или субстрат, имеющий боковые диэтиламиноэтильные (DЕАЕ) группы. Такими матриксами могут быть акриламид, агароза, декстран, целлюлоза или другие типы, обычно применяемые в очистке белков. Пригодные катионообменники включают различные нерастворимые матриксы, содержащие сульфопропильные или карбоксиметильные группы. Предпочтительны сульфопропильные группы. Наконец, могут быть применены одна или более стадий жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой (RP-HPLС, ЖХВР), применяющие гидрофобные среды RР-HPLС (например, силикагель с боковыми метильными или иными алифатическими группами), для дальнейшей очистки flt 3-L. Некоторые или все из предшествующих стадий очистки в различных комбинациях хорошо известны и могут применяться для обеспечения практически гомогенного рекомбинантного белка. Можно использовать аффинную колонку, содержащую лиганд-связывающий домен рецепторов flt 3, для аффинной очистки экспрессируемых полипептидов flt 3-L. Полипептиды flt 3-L могут быть удалены из аффинной колонки при помощи общепринятых способов, например, в высокосолевом буфере для элюции, и затем диализованы в низкосолевой буфер применения или путем изменения рН или других компонентов в зависимости от примененного аффинного матрикса. Альтернативно, аффинная колонка может содержать антитело, связывающее flt 3-L. Пример 6 описывает процедуру для применения flt 3-L данного изобретения для генерирования моноклональных антител против flt З-L. Рекомбинантный белок, продуцируемый в бактериальной культуре, обычно выделяют первоначальным разрушением клеток-хозяев, центрифугированием, экстракцией из осадков клеток в случае нерастворимого полипептида или из жидкости супернатанта - в случае растворимого полипептида, с последующим одним или более концентрированиями, высаливанием, ионообменом, аффинной очисткой или стадиями гель-фильтрационной хроматографии. Наконец, для конечных стадий очистки можно применять RР-HPLC. Микробные клетки можно разрушать любым стандартным способом, в том числе при помощи циклов замораживания-оттаивания, разрушением ультразвуком, механическим разрушением или при помощи лизирующих клетки агентов. Трансформированные дрожжевые клетки-хозяева применяют, предпочтительно, для экспрессии flt 3-L виде секретируемого полипептида для упрощения очистки. Секретируемый рекомбинантный полипептид, полученный при ферментации дрожжевых клеток-хозяев, может быть очищен согласно способам, описанным Urdal et al. (J. Chromatog 296:171, 1984). Urdal et al. описывают две последовательные стадии РР-НРIС для очистки рекомбинантного человеческого IL-2 на препаративной колонке HPLC. Согласно этому изобретению могут быть приготовлены смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие одноцепочечную последовательность нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), способную связываться с целевой последо вательностью мРНК flt 3-L (с образованием дуплекса) или с последовательностью flt 3-L в двухцепочечной спирали ДНК (с образованием тройной спирали). Антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды, согласно изобретению, содержат фрагмент кодирующего района кДНК flt 3-L. Такой фрагмент обычно содержит не менее 14 нуклеотидов, предпочтительно, от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов. Способность создавать антисмысловой или смысловой олигонуклеотид на основе последовательности кДНК для данного белка описана, например, Stein и Cohen, Cancer Res., 48:2659, 1988 и van der Klor et al., BioTechniques 6:958, 1988. Связывание антисмыслового или смыслового олигонуклеотидов с целевыми последовательностями нуклеиновых кислот приводит к образованию комплексов, блокирующи х трансляцию (РНК) или транскрипцию (ДНК) одним из нескольких способов, включающих в себя повышенную деградацию дуплексов, преждевременную терминацию транскрипции или трансляции, или другими способами. Таким образом, антисмысловые олигонуклеотиды могут быть использованы для блокирования экспрессии flt 3-L белков. Кроме того, антисмысловые и смысловые олигонуклеотиды включают олигонуклеотиды, имеющие модифицированные сахар-фосфодиэфирные структуры (или другие сахарные связи, такие, которые описаны в WО 91/06629), причем такие сахарные связи устойчивы к эндогенным нуклеазам. Такие олигонуклеотиды с устойчивыми сахарными связями стабильны in vivo (т. е. способны противостоять разрушению ферментами), но сохраняют специфичность последовательности, позволяющую связываться с целевыми нуклеотидными последовательностями. Другие примеры смысловых и антисмысловых олигонуклеотидов включают такие олигонуклеотиды, которые ковалентно соединены с органическими частями молекул, как описано в W/0 90/10448, и другими составляющими, которые увеличивают а ффинность такого олигонуклеотида в отношении целевой последовательности нуклеиновой кислоты, таким как поли-(L-лизин). Кроме того, интеркалирующие агенты, такие как эллиптицин, и алкилирующие агенты и комплексы металлов могут быть присоединены к смысловым или антисмысловым олигонуклеотидам для модификации специфичности связывания антисмыслового или смыслового олигонуклеотида в отношении целевой нуклеотидной последовательности. Антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды могут быть введены в клетку, содержащую целевую последовательность нуклеиновой кислоты, любым способов переноса генов, в том числе, например, СаРО4-опосредованной трансфекцией ДНК, электропорацией или путем применения векторов переноса генов, таких как вирус ЭпштейнаБарра. Антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды предпочтительно вводят в клетку, содержащую целевую последовательность нуклеиновой кислоты, встраиванием антисмыслового или смыслового олигонуклеотида в подходящий ретровирусный вектор с последующим контактированием этой клетки с ретровирусным вектором, содержащим встроенную последовательность, in vivo или 15 42726 ех vi vo. Подходящие ретровирусные векторы включают (но не ограничены ими) мышиный ретровирус M-MuLV, N2 (ретровирус, произведенный из M-MuLV) или двухкопийные векторы, обозначенные DСТ5А, DСТ5В и DСТ5С (см.: РСТ Application US 90/02656). Смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды могут быть также введены в клетку, содержащую целевую н уклеотидную последовательность, путем образования конъюгата с лигандсвязывающей молекулой, как описано в WО 91/04753. Подходящие лигандсвязывающие молекулы включают (но не ограничены ими) рецепторы клеточной поверхности, факторы роста, другие цитокины или другие лиганды, связывающиеся с рецепторами клеточной поверхности. Предпочтительно, конъюгирование лигандсвязывающей молекулы, по существу, не мешает способности этой молекулы связываться с соответствующей ей молекулой или рецептором или не блокирует вхождение смыслового или антисмыслового олигонуклеотида или его конъюгированной версии в клетку. Альтернативно, смысловой или антисмысловой олигонуклеотид может быть введен в клетку, содержащую целевую последовательность нуклеиновой кислоты, путем образования олигонуклеотид-липидного комплекса, как описано в WO 90/10448. Этот комплекс смыслового или антисмыслового олигонуклеотида с липидом, предпочтительно, диссоциируется внутри клетки эндогенной липазой. Flt 3-L полипептиды изобретения могут быть приготовлены в соответствии с известными технологическими способами, применяемыми для получения фармацевтически применимых композиций. Flf 3-L может быть объединен в смеси либо в виде единственного активного материала, либо с другими известными активными материалами с фармацевтически приемлемыми разбавителями (например, с Трис-НСІ, ацетатом, фосфатом), консервантами (например, Тимерозалом, бензиловым спиртом, парабенами), эмульгаторами, растворителями, адъювантами и/или носителями. Подходящие носители и их готoвые формы описаны в Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980, Маck Publishing Co. Кроме того, такие композиции могут содержать flt 3-L в комплексе с полиэтиленгликолем (PEG), ионами металла или flt 3-L может быть включен в полимерные соединения, такие как полиуксусная кислота, полигликолевая кислота, гидрогели и т. д., или в липосомы, микроэмульсии, мицеллы, однослойные или многослойные везикулы, гемолизированные эритроциты ("тени" эритроцитов) или сферобласты. Такие композиции будут влиять на физическое состояние, растворимость, стабильность, скорость выделения in vivo и на скорость клиренса in vivo flt 3-L. Flt 3-L может быть также конъюгирован с антителами против тканеспецифических рецепторов, лигандов или антигенов или соединен с лигандами тканеспецифических рецепторов. В случаях, когда рецептор flt 3 обнаружен на неопластических клетках, flt 3-L может быть конъюгирован с токсином для применения его для доставки этого токсина к специфическому сайту или он может быть использован для сенсибилизации таких неопластических клеток к вводимым затем противоопухолевым агентам. Flt 3-L можно вводить топически, парентерально или ингаляцией. Термин "парентерально" включает в себя подкожные инъекции, внутривенную, внутримышечную, внутриполостную инъекцию или инфузионные способы. Эти композиции обычно содержат эффективное количество flt 3-L, одного или в комбинации с эффективным количеством любого другого активного материала. Дозы и желаемые концентрации лекарственного средства, содержащиеся в композиции, могут варьировать с зависимости от многих факторов, в том числе от предназначаемого применения, массы тела больного и его возраста и от пути введения. Предварительные дозы могут быть определены в тестах на животных, а определение дозировок для введения человеку выполняют в соответствии с принятыми в данной области способами. С учетом описанного выше типичные дозы flt 3-L могут быть в пределах от приблизительно 10 мкг/кв.м до приблизительно 1000 мкг/кв.м. Предпочтительный диапазон доз имеет порядок приблизительно 100 мкг/кв.м - 300 мкг/кв.м. В дополнение к вышеописанному следующие примеры иллюстрируют конкретные варианты, но не ограничивают сферу действия этого изобретения. Пример 1 Получение слитого белка flt 3-рецептор:Fс. Этот пример описывает клонирование мышиной кДНК flt 3 и конструирование экспрессирующего вектора, кодирующего слитый белок мышиного flt З-рецептора с Fc, для применения в детектировании клонов кДНК, кодирующих flt 3-L. Полимеразную цепную реакцию (РСR), клонирующую кДНК flt 3 из мышиной Т-клетки, проводили с применением олигонуклеотидных праймеров и способов, описанных Lyman et al., Oncogene 8:815-822, (1993), включенных здесь в виде ссыки. Последовательность кДНК и кодируемая ею аминокислотная последовательность мышиного рецептора flt 3 представлены Rosnet et al., Oncogene 6:1641-1650, (1991) (включ. здесь ссылкой). Мышиный белок flt 3 имеет внеклеточный домен из 542 аминокислот, трансмембранный домен из 21 аминокислоты и цитоплазматический домен из 437 аминокислот. Перед слиянием кДНК мышиного flt З с N-концом кДНК, кодирующей Fc часть молекулы человеческого lgGl, амплифицированный фрагмент кДНК мышиного flt 3 был встроен в Asp718-Not I сайт pCAV/NОТ, описанный в РСТ Application 90/05183. ДНК, кодирующая одноцепочечный полипептид WО, содержащий Fc район человеческого lgGl антитела, была клонирована в сайт Spel вектора pBLUESCRIPT SKÒ , коммерчески доступного из Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California. Этот плазмидный вектор может реплицироваться в E. colL и содержит полилинкерный сегмент, содержащий 21 уникальный сайт рестрикции. Уникальный сайт Вgl II вводили вблизи 5'-конца встроенной кодирующей Fc последовательности, так что сайт Вgl II включает кодоны для аминокислот три и четыре Fc полипептида. Кодируемый Fc полипептид простирается от N-концевой шарнирной области до нативного С-конца, т. е. является, по существу, полнораз 16 42726 мерным Fc районом антитела. Фрагменты Fc районов, например, укороченные при С-конце, также можно использовать. Эти фрагменты, предпочтительно, содержат множественные остатки цистеина (по меньшей мере, остатки цистеина в шарнирном районе), что делает возможным образование межцепочечных дисульфидных связей между частями Fc полипептидов двух отдельных слитых белков 3:Fc с образованием обсуждаемых выше димеров. Сайт расщепления Аsр718 рестриктазой вводили слева от кодирующего flt 3 района. Выделили фрагмент Аsр718-Nоt I кДНК мышиного flt 3 (содержащий весь внеклеточный район, трансмембранный район и небольшую часть цитоплазматического домена). Описанную выше частичную кДНК Asp718-Not I flt 3 клонировали в вектор рBLUESCRIPT SK®, содержащий кДНК Fc, таким образом, что кДНК flt 3 расположена слева (в направлении 3'-5') от кДНК Fc. Одноцепочечную ДНК, произведенную из полученного слитого генного продукта, подвергали мутагенезу по способу, описанному в Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985) и Kunkel et al. (Methods in Enzymol 154:367, 1987), для точного слияния всего внеклеточного домена flt 3 с Fc последовательностью. Мутированную ДНК секвенировали для подтверждения, что надлежащие нуклеотиды были удалены (т. е. трансмембранный район и частичный цитоплазматический домен ДНК были детектированы) и что flt 3 и Fс последовательности были в одной и той же рамке считывания. Затем слитую кДНК вырезали и встраивали в экспрессирующий вектор млекопитающих, обозначенный sf HAV-EO 409, который был разрезан Sal1-Not1 и Sal1 и ASp718 концы затупляли. Вектор sf HAV-EO (также известный как рDС406) описан МсМаhan et al. (ЕМВО J., 10; № 10:2821-2832 (1991)). Слитые белки flt 3:Fc, предпочтительно, синтезировали в культуре рекомбинантных клеток млекопитающего. Содержащий продукт слияния flt 3:Fc экспрессирующий вектор трансфицировали в С\/-I клетки (АТСС ССL 70) и COS-7 клетки (АТСС СRL 1651), полученные из почек обезьян. Уровень экспрессии flt 3:Fс был oтносительно низко как в С\/-I, так и в COS-7 клетках. Поэтому была сделанa попытка экспрессии в клетках 293 (трансформированных первичных человеческих эмбриональных почечных клетках, АТСС CRL 1573). Клетки 293, трансфицированные вектором sf HAV-EO/flt 3:Fc, культивировали в роллерных флаконах для нестационарной экспрессии слитого белка, который секретируется в культуральную среду через сигнальный пептид flt 3. Слитый белок очищали на Сефарозных колонках с Протеином А, элюировали и использовали для скрининга клеток на способность связывать flt 3:Fc, как описано в Примерах 2 и 3. Пример 2 Скрининг клеток на связывание flt-3:Fc Приблизительно 100 различных эмбриональных клеток и клеточных линий, подразделяющихся на следующие основные категории: эмбриональные мышиные клетки мозга зародыша, линии клеток печени мышиного зародыша, линии клеток мозга крысиного эмбриона, линии клеток (фибробластоидных) рака легкого человека, человече ские и мышиные линии лимфоидных и миелоидных клеток, тестировали на связывание flt 3:Fc. Клеточные линии инкубировали с flt 3:Fc, затем с биотинилированным антителом против человеческого Fс, затем с комплексом стрептавидин-фикоэритрин (Весton Dickinson). Биотинилированные антитела покупали из Jackson Immunoresearch Laboratories. Стрептавидин связывается с молекулой биотина, соединенной с антителом против человеческого Fc, которое в свою очередь связывается с Fc частью слитого белка flt 3:Fc. Фикоэритрин, представляющий собой флуоресцентный фикобилирубин, служит в качестве детектируемой метки. Уровень сигнала флуоресценции измеряли для каждого клеточного типа с применением проточного цитометра FАСScanÒ (Becton Dickinson). Были идентифицированы клеточные типы, которые считали положительными в отношении связывания flt 3:Fc. Пример 3 Выделение и клонирование кДНК flt 3-L из библиотеки кДНК мышиных Т-клеток Библиотека кДНК мышиных Т-клеток клеточной линии Р7В-0,ЗА4 была выбрана в качестве возможного источника кДНК flt 3-L. Р7В-0,ЗА4 является клоном мышиных Т-клеток, который является Thy1,2+, СD4-, СD8-, ТСRаb±, СD44+. Эта линия первоначально клонирована при плотности клеток 0,33 клеток на лунку в присутствии rHu1L-7 и иммобилизованных анти-СD3 МАb и ее выращивали в непрерывной культуре в течение более 1 года с пассажем один раз в неделю в среде, содержащей 15 нг/мл rHu1L-7. Родительскую клеточную линию получали из клеток лимфатического узла SJL/J мышей, иммунизированных 50 нмолями РLР139-151-пеп- тида и 100 мкг Mycobacterium tuberculosis Н37Rа в неполном адъюванте Фрейнда. PLP является протеолипидным белковым компонентом миелиновой оболочки центральной нервной системы. Этот пептид, состоящий из аминокислот 139151, как было ранее показано, является энцефалогенным пептидом в экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (ЕАЕ), мышиной модели для рассеянного склероза в SJL/J мышax (Touhy, V.K., Z. Lu, R.A. Sobel, R.A. Laursen and M.B. Lees; 1989, Identification for SJL mice. J.Immunol. 142: 1523). После исходной культуры в присутствии антигена родительская клеточная линия, обозначенная PLP7, находилась в непрерывной культуре с rHu1L-7 (и без антигена) в течении более 6 месяцев перед клонированием. Р7В-0,ЗА4 размножается только в ответ на очень высокие концентрации пептида PLP139-151 в присутствии облученных сингенных клеток селезенки и не является энцефалогенной и аллореактивной. Этот клон размножается в ответ на иммобилизованные анти-СDЗ МАb, IL-2 и IL-7, но не IL-4. Связывание flt 3:Fc наблюдали на мышиных Т-клетках и человеческих Т-клетках и были выбраны мышиные Т-клетки (линия 0,3А4), благодаря легкости их выращивания. Библиотеку кДНК мышиной 0,3А4 клеточной линии в sf HAV-ЕО готовили, как описано в McMahan et al. (EMBO J., 10: № 10; 2821-2832, 1991). Sf HAV-EO является экс 17 42726 прессирующим вектором млекопитающих, который также реплицируется в Е. coli. Sf HAV-HO содержит начала репликации, произведенные из SV 40, вируса Эпштейна-Барра и рВR322, и является производным HAV-ЕО, описанным Dower et al., J. Immunol 142:4314 (1989). Sf HAV-ЕО отличается от HAV-ЕО делецией интрона, присутствующего в тре хчастной лидерной последовательности аденовируса 2 в H AV-ЕО. Вкратце, кДНК мышиных Т-клеток клонировали в Sal 1 сайт sf HAV-ЕО адаптерным способом, подобным описанному Наymerle et al. (Nucl. Acids Res. 14:8615, 1986), с применением следующей олигонуклеотидной адаптерной пары: 5' TCGACTGGAACGAGACGACCTGCT 3' SEQ ID) №:3 3' GACCTTGCTCTGCTGGACGA 5' SEQ ID №:4 Двухцепочечную кДНК с тупыми концами и произвольными праймерами получали из 0,3А4 поли(А)+РНК, в основном, как описано Gubler и Hoffman, Gene, 25:263-269 (1983), с применением набора ДНК Pharmacia. Указанные выше адаптеры добавляли к этой кДНК, как описано Haymerle et al. Низкомолекулярный материал удаляли пропусканием через Sephacryl S-1000 при 65°С и кДНК лигировали в sf HAV-ЕО 410, расщепленную предварительно Sal 1, и лигировали с той же самой парой олигонуклеотидов. Этот вектор обозначали как sf HAV-ЕО 410. ДНК вводили электропорацией (Dower et al., Nucleic Acids. Res., 16:6127-6145, (1988) в Е. соli DН10В и после 1 часа роста при 37°С трансформированные клетки замораживали в виде аликвот по 1 мл в среде SOC (Hanahan et al., J. Mol. Biol. 166:557-580 (1983), содержащей 20% глицерин. Одну аликвоту титровали для определения числа устойчивых к ампициллину колоний. Полученная 0,ЗА4 библиотека имела 1,84 миллиона клонов. Клетки штамма E. coli DH10B, трансфицированные библиотекой кДНК в sf HAV-Е0 410, высевали для обеспечения приблизительно 1600 колоний на чашку. Колонии выскребали из каждой чашки, объединяли и из каждого пула получали плазмидную ДНК. Эти объединенные ДНК, представляющие приблизительно 1600 колоний, применяли затем для трансфекции суб-конфлюентного (сливающегося) слоя СV-I/ЕВN А-I клеток с применением ДЭАЭ-декстрана с последующей обработкой хлорохином, подобно способу, описанному Luthman et al., Nucl. Acids. Res. 11:1295, (1983) и McCutchan et al., J. Natl. Cancer. Inst. 41:351 (1986). Клеточная линия CV-I/ЕВNА-I (АТСС CRL 10478) конститутивно экспрессирует EBV ядерный антиген-I, запускаемый самым ранним энхансером/промотором СМV. С VI-ЕВN А-I получали из линии клеток СV-I почек Африканских зеленых мартышек (АТСС CCL 70), как описано McMahan et al. (ЕМВО J., 10:2821, 1991). Для трансфекции СV-I/ЕВN А-I клеток библиотекой кДНК эти клетки выдерживали в полной среде (модифицированной Дульбекко среде Игла (DМЕМ), содержащей 10% (об./об.) фетальную плодную) телячью сыворотку (FCS), 50 Е/мл пенициллина, 50 Е/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамин), и высевали при плотности 2´105 клеток/лунку на однокамерные предметные стекла (Lab-Тек). Стекла предобрабатывали 1 мл человеческого фибронектина (10 мкг/мл в PBS ) в течение 30 минут и затем промывали 1 раз PBS. Среду удаляли из прикрепленного клеточного слоя и заменяли 1,5 мл полной среды, содержащей 66,6 мкМ сульфата хлорохина. 2/10 мл раствора ДНК (2 мкг ДНК, 0,5 мг/мл ДЭАЭ-декстрана в полной среде, содержащей хлорохин) добавляли затем к этим клеткам и инкубировали в течение 5 часов. После инкубации среду удаляли, и клетки обрабатывали шоком путем добавления полной среды, содержащей 10% DМSO в течение 2,5-20 минут, и затем заменяли этот раствор свежей полной средой. Клетки культивировали в течение 2-3 дней для экспрессии встроенных последовательностей. Трансфицированные монослои СV-IЕВNА-I клеток анализировали на экспрессию flt 3-L при помощи радиоавтографии на предметных стеклах, описанной Gearing et al. (ЕМВО J. 8:3667, 1989). Трансфицированные СV-I/ЕВN А-I клетки (прикрепленные к имеющим камеру предметным стеклам) промывали 1 раз средой для связывания с обезжиренным сухим молоком (BM-NFDМ) (RРМI среда 1640, содержащая 25 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (ВSА), 2 мг/мл азида натрия, 20 мМ HEPES , рН 7,2 и 50 мг/мл обезжиренного сухого молока). Затем клетки инкубировали с flt 3:Fс в BM-NFD M (1 мкг/мл) в течение 1 часа при комнатной температуре. После инкубации монослои клеток в предметных стеклах с камерами промывали 3 раза при помощи ВМ-NFDM для удаления несвязавшегося слитого белка flt 3:Fс и затем инкубировали с 40 нг/мл 125I-мышиными антителами против Fс человека (описанными ниже) (разведение 1:50) в течение 1 часа при комнатной температуре. Клетки промывали 3 раза ВМ-NFDМ, затем 2 раза солевым раствором с фосфатным буфером (РВS) для удаления несвязавшихся 125 I-мышиных антител против Fс человека. Клетки фиксировали инкубированием в течение 30 минут при комнатной температуре в 2,5% глутаровом альдегиде в PBS, рН 7,3, промывали дважды в PBS и сушили на воздухе. Предметные стекла с камерами, содержащими клетки, выдерживали на Phophorimager (Molecular Dynamics) в течение ночи, затем погружали в фотографическую эмульсию Кodak GTNB-2 (6x разведение в воде) и выдерживали в темноте в течение 3-5 дней при 4°С в светонепроницаемом боксе. Предметные стекла затем проявляли приблизительно в течение 4 минут в проявителе Kodak D19 (40 г/500 мл воды), промывали водой и фиксировали в фиксаже Agfa 433C. Эти предметные стекла по отдельности исследовали в микроскопе при увеличении 25-40х, и положительные клетки, экспрессирующие flt 3-L, идентифицировали по присутствию радиоавтографических гранул серебра против светлого фона. Мышиные антитела против Fc человека получали из Jackson Laboratories. Эти антитела обнаруживали минимальное связывание с Fc, связанными с Fcg-рецептором. Антитела метили при помощи способа с Хлорамином Т. Вкратце, готовили колонку Сефадекса G-25, согласно изготовителю. Колонку предобрабатывали 10 объемами колонки РВS, содержащего 1% бычий сывороточный альбумин, для снижения неспецифической адсорбции антител с колонкой и смолой. Затем несвязавший 18 42726 ся бычий сывороточный альбумин из колонки 5 объемами PBS без бычьего сывороточного альбумина. В микрофужную пробирку добавляли 10 мкг антител (растворенных в 10 мкл PBS ) к 50 мкл 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,2), добавляли 2,0 кКи Nа125I без носителя, и раствор хорошо перемешивали. 15 мкл свежеприготовленного раствора хлорамина Т (2 мг/мл в 0,1 М натрийфосфатном буфере, рН 7,2) добавляли, и смесь инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем эту смесь сразу же наносили на колонку Сефадекса G-25. После этого радиоактивно меченые антитела элюировали из колонки, собирая фракции элюата по 100150 мкл. Бычий сывороточный альбумин добавляли к элюированным фракциям, содержащим радиоактивно меченые антитела, до конечной концентрации 1%. Радиоиодинирование дало удельные активности в пределах 5-10´1015 имп/нмоль белка. При помощи подхода с применением радиоавтографии предметных стекол приблизительно 1840000 кДНК подвергли скринингу в п улах из, приблизительно, 1600 кДНК, пока анализ одного пута трансфектантов не обнаружил множество клеток, явно положительных в отношении связывания flt 3:Fc. Этот пул затем делили на 500 пулов и снова скринировали при помощи радиоавтографии на предметных стеклах и идентифицировали положительный пул. Этот пул делили на 100 пулов и снова скринировали. Отдельные колонии из этого пула скринировали, пока не был идентифицирован клон (клон № 6С), который направлял синтез поверхностного белка с детектируемой связывающей flt 3:Fc активностью. Этот клон выделяли и секвенировали его кДНК-инсерцию 0,88 т. п. н. Нуклеотидная и кодируемая аминокислотная последовательность кодирующего района кДНК мышиного flt 3-L клона № 6С представлены в SEQ ID № 1 и № 2. Инсерция кДНК имеет длину 0,88 т. п. н. Открытая рамка считывания внутри этой последовательности могла бы кодировать белок из 231 аминокислот. Таким образом, ДНК и кодируемые аминокислотные последовательности для открытой рамки считывания из 231 аминокислот представлены в SEQ ID №:1 и №:2. Белок SEQ ID № 2 является белком трансмембранного типа с N-концевым сигнальным пептидом (аминокислоты 1-27), внеклеточным доменом (аминокислоты 28-188), трансмембранным доменом (аминокислоты 189-211) и цитоплазматическим доменом (аминокислоты 212-231). Предсказанная мол. масса нативного белка после отщепления сигнальной последовательности равна 23164 дальтон. Зрелый белок имеет оцененную рI 9,372. Имеются 56 п. н. 5'-некодирующей последовательности и 126 п. н. 3'-некодирующей последовательности, которые фланкируют кодирующий район, в том числе добавленные адаптеры кДНК. Описанная выше процедура клонирования дала также клон № 5Н мышиного flt 3-лиганда, который идентичен клону № 6С, начиная при нуклеотиде 49, и по нуклеотид 545 (соответствующий аминокислоте 163) SEQ ID №:1. Клон № 5Н полностью отличается от этой точки дальше и представляет собой другую, полученную при участии сплайсинга, конструкцию. Вектор sf HAV-ЕО 410, содержащий кДНК flt 3-L в клетках E. coli DH10B, был депонирован с АТСС, Rockville, MD USA 20 апреля 1993 г. и получил ассеssion number АТСС 69286. Депонирование было выполнено по условиям Budapest Treaty. Пример 4 Клонирование кДНК, кодирующей человеческий flt 3-L кДНК, кодирующую человеческий flt 3-L, клонировали из библиотеки кДНК человеческого клона 22 Т-клеток lgt10 с произвольными праймерами, как описано Sims et al., PNAS, 86:8946-8950 (1989). Библиотеку скринировали Рlе I фрагментом 413 п. н., соответствующим внеклеточному домену мышиного flt 3-L (нуклеотиды 103-516 SEQ ID №:1). Фрагмент произвольного примировали, гибридизовали в течение ночи с фильтрами библиотеки при 55°С, в олиго-предгибридизационном буфере. Затем фрагмент промывали при 55°С при 2´SSC/0,1% SDS в течение 1 часа, затем 1´SSC/0,1% SDS в течение 1 часа и затем 0,5´SSC/1% SDS в течение 1 часа. ДНК из положительных фаго вых бляшек экстрагировали, и инсерции амплифицировали при помощи РСР с применением олигонуклеотидов, специфических для фаговых отростков. Затем эту ДНК секвенировали, и последовательность клона № 9 показана в SEQ ID №:5. Дополнительную кДНК человеческого flt 3-L выделяли из той же самой библиотеки кДНК lgt10 с произвольными праймерами, как описано выше, путем скрининга этой библиотеки фрагментом внеклеточного домена мышиного клона № 5 кДНК, содержащего последовательность кДНК, в основном, соответствующую нуклеотидам 128-541 SEQ ID №:1. Секвенирование клона № 9 кДНК из 988 п. н. обнаружило открытую рамку считывания из 705 п. н., окрузенную 29 п. н. 5'-некодирующей последовательности и 250 п. н. 3'-некодирующей последовательности. 3'-некодирующий район не содержит поли-А-хвост. Не было в рамке считывания стоп-кодонов слева от инициирующего метионина. Открытая рамка считывания кодирует трансмембранный белок типа I из 235 аминокислот, как показано аминокислотами 1-235 SEQ ID №:6. Этот белок имеет N-концевой сигнальный пептид из 26 или 27 аминокислот. Существует несколько большая вероятность, что N-концевой сигнальный пептид имеет длину 26 аминокислот, чем 27 аминокислот. За сигнальным пептидом следует внеклеточный домен из 156 или 155 аминокислот (для сигнальных пептидов из 26 и 27 аминокислот, соответственно); далее следуют трансмембранный домен из 23 аминокислот и цитоплазматический домен из 30 аминокислот. Человеческий flt 3-L имеет всего 72% идентичных аминокислот и 78% сходных аминокислот по сравнению с мышиным flt 3-L. Вектор pВLUESCRIPT SK(-), содержащий кДНК человеческого flt 3-L клона № 9, был депонирован с АТСС, Rockville, Maryland, USA 6 а вгуста 1993 г., и получил accession № АТСС 69382. Депонирование было выполнено по условиям Budapest Treaty. 19 42726 Пример 5 (Mullis and Faloona, Meth. En zymol. 155:335-350, Экспрессия flt 3-L в дрожжах 1987) всего внеклеточного кодирующего домена Для экспрессии растворимого flt 3-L в дрожжах flt 3-L между концом сигнального пептида и начаиспользовали синтетические олигонуклеотидные лом трансмембранного сегмента. 5'-праймер праймеры для амплификации при помощи РСR ( 5'-AATTGGTACCTTTGGATAAAAGAGACTAC AAGGACGACGATGAC AAGAC ACCTGACTGTTACTTC AGCC-3' ) flt 3-L с применением адаптированных способов, SEQ ID №:7 кодировал часть лидера a-фактора и описанных в Engval et al. Immunochem 8:871, 1971 антигенный октапептид, последовательность и в U.S. Раtent 4703004. Предпочтительным споFLАG, слитую в рамке с предсказанным зресобом скрининга является способ захвата антилым N-концом flt З-L. 3'-олигонуклеотид (5'AT AT GGAT C C CT AC T GC CT GG GC C GAG GC T CT GG GAGтел, описанный в Beckmann et al., (J. Immunol. 144:4212, 1990). Положительные гибридомные 3') SEQ ID №:8 создал кодон терминации после клетки можно ввести вн утрибрюшинной инъекцией Gln-189, как раз при предполагаемом трансмемв сингенных BALB/c мышей для образования асбранном районе. Этот генерированный полимецитов, содержащих высокие концентрации моноразной цепной реакцией фрагмент ДНК лигировали в дрожжевой экспрессирующий вектор (для клональных антител против flt 3-L. Альтернативно, гибридомные клетки можно выращивать in vitro в экспрессии в К. lactis), который направляет секреколбах или роллерных флаконах различными споцию рекомбинантного продукта в среду дрожжей собами. Моноклональные антитела, образованные (Fleer et al. 107:285-195 (1991) и van den Berg et al., в мышиных асцитах, можно очистить осаждением Bio/Technology,8:135-139 (1990)). Слитый белок FLAG:flt 3-L очи щали из дрожжевого бульона афсульфатом аммония, а затем гель-фильтрационной хроматографией. Альтернативно, можно такфинной хроматографией, как описано ранее (Норр же использовать аффинную хроматографию, осеt al., Biotechnjlogy 6:1204-1210, 1988). нованную на связывании антител с Протеином А Пример 6 или Протеином G, а также аффинную хроматоМоноклональные антитела к flt 3-L Этот пример иллюстрирует способ получения графию на основе связывания с flt 3-L. Пример 7 моноклональных антител к flt 3-L. Flt 3-L экспресПрименение flt 3-L отдельно и в комбинации с сируется в клетках-хозяевах млекопитающих, таIL-7 или IL-3 ких как С0S-7 или CV-I/EBN A-I клетки и его очиЭтот пример демонстрирует стимуляцию и щают при помощи аффинной хроматографии с пролиферацию АА4.I+ эмбриональных печеночных flt 3:Fc. Очищенный flt 3-L, его фрагмент, такой как клеток под влиянием композиций, содержащиx внеклеточный домен, синтетические пептиды или flt 3-L и IL-7, а также стимуляцию и пролиферацию клетки, экспрессирующие flt 3-L могут быть исс-kit-положительных (с-kit+) клеток под влиянием пользованы для получения моноклональных антикомпозиций, содержащих flt 3-L и IL-3. тел против flt 3-L при помощи общепринятых споАА4.I-положительные (АА4.I+) экспрессируюсобов, например, способов, описанных в U.S. Paщие клетки выделяли из печеней 14-дневных эмtent 4411993. Вкратце, мышей иммунизировали брионов С57ВL/6 мышей пэннингом клеток в плаflt 3-L в качестве иммуногена, эмульгированным в стиковых чашках Петри (Optilux 100 мм) (Folcon полном адъюванте Фрейнда, и инъецировали в № 1001, Oxrard CA). Чашки были покрыты в течеколичествах от 10 до 100 мкг подкожно или внутрибрюшинно. Спустя 10-12 дней иммунизированние ночи при 4°С в PBS плюс 0,1% фетальная быных животных повторно иммунизировали дополчья сыворотка (FBS), содержащая 10 мкг/мл АА4.I нительным количеством flt-3-L, эмульгированным антител (МсКеагn et al., J. Immunol 132:232-339, в неполном адъюванте Фрейнда. Мышей перио1984) и затем промыты интенсивно РВS плюс дически иммунизировали повторно после этого по 1% FВS перед применением. Суспензию отдельсхеме иммунизации 1 раз в неделю или 1 раз в ных печеночных клеток добавляли при концентрадве недели. Пробы сыворотки периодически брации 107 клеток на чашку в PBS с 1% FBS и давали ли ретроглазничным кровопусканием или отрезаклеткам прикрепиться к чашкам в течение 2 часов нием кончика хвоста для анализа на антитела пропри 4°С. Затем чашки интенсивно промывали, и тив flt 3-L при помощи дот-блот-анализа, ЕL ISA прикрепившиеся клетки собирали соскабливанием (твердофазного иммуноферментного анализа) или для анализа или дальнейшего использования в ингибирования связывания flt 3. описанных ниже тестах на гемопоэз. FACS анализ После обнаружения достаточного титра антис применением АА4.I антител показал более 95% тел положительным животным давали одну поАА4.I+ клеточной популяции. следнюю внутривенную инъекцию flt 3-L в солевом С-kit+ плюрипотентные стволовые клетки очирастворе. Спустя 3-4 дня животных убивали, выщали из костного мозга взрослых мышей (de Vries резали клетки селезенки и их сливали с клетками et al., J. Exp. Med., 176:1503-1509, 1992 и Visser мышиной миеломы, например, NS I или предпочand de Vries, Methods in Cell Biol., Submitted). Клеттительно P3´63Ag8.653 (ATCC СRL 1580). Слияки низкой плотности (£1,078 г/см 3), положительные ние дает гибридомные клетки, которые высевают в отношении лектина агглютинина зародышей на множество микротитрационных планшетов в пшеницы и отрицательные в отношении антигеHAT (гипоксантин, аминоптерин и тимидин) селекнов, узнаваемых В220 и 15-1. 4.1 (Visser et al., тивной среде для ингибирования пролиферации Meth. In Cell. Biol., 33:451-468, 1990) моноклональнеслитых клеток, миеломных гибридов и гибридов ными антителами, можно было разделить на субклеток селезенки. популяции клеток, экспрессирующи х и не экспресГибридомные клетки скринировали при помосирующи х c-kit, при помощи биотинилированного щи ЕL ISА на реактивность против очищенного фактора Стила. Было показано, что с-kit+ фракция 20 42726 содержит плюрипотентные гемопоэтические стволовые клетки (de Vries et al., Science 255:989-991; Visser and de Vries, Methods in Cell. Biol., 1993, submitted и Ware et al., 1993, submitted). AA4.I+ эмбриональные печеночные клетки культивировали в рекомбинантном IL-7 (U.S. Patent № 4965195) при 100 нг/мл и рекомбинантном flt 3-L при 250 нг/мл. Flt 3-L применяли в трех различных формах в эти х экспериментах: (1) в виде присутствующего на фиксированных трансфицированных flt 3-L CVI/ЕВN А клетках; (2) в виде концентрированных культуральных супернатантов из тех же трансфицированных flt 3-L CVI/EBNA клеток; и (3) в виде препарата очищенного и выделенного полипептида из дрожжевого супернатанта, описанного в Примере 5. Тесты на гемопоэз Пролиферацию с-kit+ стволовых клеток, эмбриональных печеночных АА4.I+ клеток анализировали в тестах включения [3H]-тимидина, описанных, в общем, de Vries et al., J. Exp. Med., 173:1205-1211, 1991. Очищенные с-kit+ стволовые клетки культивировали при 37°С в полностью увлажненной атмосфере 6,5% СО2 и 7% О2 в воздухе в течение 96 часов. Мышиный рекомбинантный IL-3 применяли при конечной концентрации 100 нг/мл. Затем эти клетки импульсно-метили с применением 2 мкКи на лунку [3H]-тимидином (81 Ки/ммоль; Amersham Corp., Arlington Heightss, 1L) и инкубировали еще в течение 24 часов. АА4.I+ клетки (приблизительно 20000 клеток на лунку) инкубировали в IL-7, flt 3-L и flt 3-L+IL-7 в течение 48 часов и затем импульсно-метили [3Н]тимидином в течение 6 часов. Результаты flt 3-L и IL-7 показаны в табл. I и результаты flt 3-L и IL-3 показаны в табл. II. Культуральный супернатант от CVI/EBNA клеток, трансфицированных кДНК flt 3-L, стимулировал c-kit+ стволовые клетки приблизительно в 18 раз больше, чем культуральный супернатант CVl/ЕВNА клеток, трансфицированных одним экспрессирующим вектором. Добаление IL-3 к flt З-L, содержащему супернатант, дало синергическое действие, при котором наблюдали приблизительно вдвое более высокую пролиферацию, чем можно было бы ожидать, если бы действия были аддитивными. Пример 8 Конструирование слитого белка flt 3-L:Fc Этот пример описывает способ конструирования слитого белка, содержащего внеклеточный район flt 3-L и Fc-домен человеческого иммуноглобулина. Эти способы, в основном, те же самые, которые описны в Примере 1 для конструирования слитого белка flt 3:Fc. Перед слиянием кДНК flt 3-L с N-концом кДНК, кодирующей Fc-часть молекулы человеческого ІgGl, фрагмент кДНК flt 3-L встраивали в сайт Asp718-Not1 вектора pCAV/NOT, описанного в РСТ Aррlication WO 90/05183. ДНК, кодирующую одноцепочечный полипептид, содержащий Fc район человеческого lgGl антитела, клонировали в Spe1 сайт вектора pBLUESCRIPT SKÒ , который коммерчески доступен из Stratagene Cloning Systems, La Jolla California. Этот плазмидный вектор может реплицироваться в E. coli и содержит полилинкерный сегмент, содержащий 21 уникальный сайт рестрикции. Затем уникальный Bgl11 сайт встраивали вблизи 5'-конца встроенной кодирующей Fc последовательности таким образом, что сайт Bgl11 включает в себя кодоны для аминокислот 3 и 4 Fc полипептида. Кодируемый Fc полипептид простирается от N-терминальной шарнирной области от нативного С-конца, т. е. представляет, по существу, полноразмерный Fc район антитела. Можно также использовать фрагменты Fc районов, например, укороченные при С-конце. Эти фрагменты, предпочтительно, содержат множество остатков цистеина (по меньшей мере в шарнирном районе), что делает возможным образование межцепочечных дисульфидных связей между частями Fc полипептидов двух отдельных слитых белков flt 3-L:Fc с образованием димеров. Аsр718-Stu1 частичная кДНК flt 3-L в pCAV/NOT может быть клонирована в Asp718Spe1 сайт вектора рBLUESCRIPT SKÒ , содержащего кДНК Fc, таким образом, что кДНК flt 3-L расположена в направлении 3'-5' от кДНК Fc. Последовательность одноцепочечной ДНК, полученной из образованного слитого гена, может быть подвергнута направленному на определенную матрицу мутагенезу, описанному Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985) и Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987), для точного слияния всего внеклеточного домена flt 3-L с Fc последовательностью. Полученную ДНК можно затем секвенировать для подтверждения того, что удалены надлежащие нуклеотиды (т. е. делетированы трансмембранный район и частичный цитоплазматический район) и что последовательности flt 3-L и Fc находятся в одной рамке считывания. Затем слитую кДНК вырезают и встраивают об Таблица I Действие flt 3-L и IL-7 на пролиферацию АА4.I+ эмбриональных печеночных клеток Фактор Контроль flt 3-L IL-7 100 1000 100 Включение [3H]-тимидина (имп/мин) 4200 Комбинация flt 3-L и IL-7 дала ответную реакцию, которая была приблизительно в 4 раза выше, чем при одном flt 3-L и приблизительно в 40 раз выше , чем при одном IL-7. Таблица II Действие flt 3-L и IL-3 на пролиферацию с-kit+ клеток Фактор Контроль flt 3-L (только вектор) Включение [3H]тимидина (имп/мин) 100 1800 1L-3 3000 9100 21 42726 щепринятыми способами в экспрессирующий вектор млекопитающих рСАV/NОТ, который расщеплен ASp718-Not 1. Слитые белки flt 3-L:Fc предпочтительно синтезируют в культуре рекомбинантных клеток млекопитающего. Затем содержащий слитый продукт flt 3-L:Fc экспрессирующий вектор трансфицируют в CV-I клетки (АТСС ССL 70) или COS-7 клетки (АТСС СRL 1651). Возможна также экспрессия в клетках 293 (трансформированных эмбриональных почечных клетках человека, АТСС СRL 1573). 293 клетки, трансфицированные вектором pCAV/NOT/flt 3-L:Fc культивируют в роллерных флаконах для кратковременной экспрессии слитого белка, который секретируется в культуральную среду через сигнальный пептид flt 3-L. Слитый белок можно очистить на колонках с Протеин А-се фарозой. Пример 9 Получение трансгенных мышей, сверхпродуцирующи х flt 3-L. Этот пример описывает процедуру, применяемую для получения трансгенных мышей, сверхпродуцирующи х flt 3-L. Свер хпродуцирующих flt 3-L трансгенных мышей исследовали для определения биологических эффектов избыточной экспрессии. Пронуклеусы мыши (В16/J) микроинъецировали дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) flt 3-L согласно способу, описанному Gоrdоn et al., Science 214:1244-1246, (1981). В общих чертах, оплодотворенные мышиные яйцеклетки, имеющие видимые пронуклеусы, сначала помещали на камеру для инъекции и удерживали на месте небольшой пипеткой. Затем использовали инъекционную пипетку для инъекции гена, кодирующего flt 3-L (клона № 6С), в пронуклеусы яйцеклетки. Затем инъекцированные яйцеклетки или (i) переносили в яйцевод 0,5 дня р. с. ложнобеременной самки; (ii) культивировали in vitro до стадии двух клеток (в течение ночи) и переносили в яйцевод 0,5 дня р. с. псевдобеременной самки; или (iii) культивировали in vitro до стадии бластоцисты и переносили в матку 2,5 дня р. с. псевдобеременной самки. Предпочтительно, можно применять два первых варианта, т. к. они позволяют избежать культивирования, и, предпочтительно, следует применять приблизительно 20-30 микроинъецированных яйцеклеток для переноса в самок во избежании малого приплода. Пример 10 Flt 3-L стимулирует пролиферацию эритроидных клеток в селезенке Этот пример описывает действие flt 3-L на образование эритроидных клеток в селезенке трансгенных мышей. Трансгенных мышей получали в соответствии с процедурами Примера 9. Мышей убивали и из каждой инактной селезенки готовили cуспензию отдельных клеток. Суспендированные клетки откручивали и затем ресуспендировали в 10 мл среды, содержащей РВS и 1% фетальную бычью сыворотку. Подсчет клеток проводили с применением гемоцитометра. Каждый клеточный образец считали с красителем Trypcin Blue для получения общего числа жизнеспособных клеток на мл среды в соответствии со следующей фор мулой: (RВС+WВС)/мл, где RBC обозначает число эритроцитов, a WBC обозначает число лейкоцитов. Затем каждый образец считали с красителем Тuгк для получения общего числа лейкоцитов на мл среды. Общее число эритроцитов на мл рассчитывали для каждого образца вычитанием общего числа лейкоцитов на мл из общего числа жизнеспособных клеток на мл. Эти результаты показаны в следующей далее табл. III. Таблица III Пролиферация эритроидных клеток в сверхпродуцир ующей flt 3-L селезенке трансгенных мышей Мышь Контроль 1 Контроль 2 Трансгенная 1 Трансгенная 2 Общее число жизнеспособных клеток (млн.клеток/мл) 29,7 31 44,7 37,3 Общее число лейкоцитов (млн клеток/мл) Общее число эритроцитов (млн клеток/мл) 27 24,6 35,6 28,4 2,7 6,4 19,1 8,9 Как видно из данных табл. III, числа лейкоцитов на мл были приблизительно такими же, что и в контрольных мышах. Однако числа эритроцитов из селезенок двух трансгенных мышей были приблизительно в 2-3 раза выше, чем наблюдаемые в контрольных мышах. Flt 3-L стимулирует увеличение в клетках эритроидного направления дифференцировки, возможно, через стимуляцию эритроидных клеток-предшественников, через стимуляцию клеток, продуцирующих эритропоэтин или путем блокирования механизма, ингибирующего эритропоэз. Пример 11 Flt 3-L стимулирует пролиферацию Т-клеток и ранних В-клеток Костный мозг из 9-недельных трансгенных мышей, полученных согласно Примеру 9, подвергали скринингу на присутствие различных маркеров фенотипов Т- и В клеток с применением антител, иммунорегирующих с такими маркерами. Исследовали следующие маркеры: маркер В220, специфичный к линии дифференцировки В-клеток; маркер поверхностного IgМ (sigM), специфичный для зрелых В-клеток; маркер S7 (СD43), являющийся маркером ранних В-клеток; маркер антиген-I стволовы х клеток (SСА-I), являющийся маркером активированных Т-клеток и В-клеток; СD4, являющийся маркером хелперных Т-клеток и некоторых стволовых клеток; и маркер Мас-I, специфичный для макрофагов. Костный мозг скринировали с применением хорошо известных антител против таких маркеров. Следующая далее табл. IV показывает данные, полученные из скрининга костного мозга. Двух трансгенных мышей из одного и того же приплода анализировали по сравнению с нормальной мышью из того же приплода (контроль) и с неродственной нормальной мышью (контроль). 22 42726 Таблица IV ход клеток тимуса от стадии 2 к стадии 3 их развития, что свидетельствует о том, что flt 3-L активен на ранних Т-клетках. Пример 13 Применение flt 3-L в трансплантации периферических стволовы х клеток Этот пример описывает способ применения flt 3-L в аутологической (аутогенной) трансплантации периферических стволовых клеток (РSС) или клеток-предшественников периферической крови (РВРС). Обычно трансплантацию РВРС и РSС проводят на больных, костный мозг которых непригоден для взятия вследствие, например, патологии или злокачественного поражения. Перед сбором клеток может быть желательным мобилизовать или увеличить количества циркулирующих РВРС и РSС. Мобилизация может улучшить сбор РВРС и РСS, и она достигается внутривенным введением flt 3-L больным перед сбором таких клеток. Другие факторы роста, такие как CSF-I, GM-MSF, SF, G-CSF, ЕРО, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, GM-CS F/IL-3-слитые белки, LIF, FGF и их комбинации, могут быть также введены в последовательной или одновременной комбинации с flt 3-L. Мобилизованные или немобилизованные РВРС и PSС собирают при помощи процедур афераза, известных в этой области (cм., например, Bishop et al., Blood, vol. 83, № 2, pp. 610616 (1994)). Вкратце, РВРС и РSС собирают при помощи стандартных устройств, например, при помощи устройства для афереза Haemonetics Model V50 (Haemonetics, Braintree, MA). Четырехчасовое взятие клеток проводят обычно не более, чем 5 раз в неделю до тех пор, пока не будет собрано приблизительно 6,5´108 одноядерных клеток (МNС) на кг массы больного. Аликвоты собранных РВРС и PSС анализируют на содержание гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразующи х единиц (CFU-GM) путем разведения приблизительно 1:6 сбалансированным солевым раствором Хенка без кальция или магния (НВSS) и наслаивания на среду для отделения лимфоцитов (Organon Teknika, Durham, North, Carolina). После центрифугирования МNС в интерфазе собирают, промывают и ресуспендируют в HBSS. Аликвоты по 1 мл, содержащие приблизительно 300000 МNС, модифицированную среду McCoy 5 A, 0,3% агар, 200 Е/мл рекомбинантного человеческого GM-CSF, 200 Е/мл рекомбинантного человеческого IL-3 и 200 Е/мл рекомбинатного человеческого G-СSF, культивировали при 37°С в 5% СО2 в полностью увлажненном воздухе в течение 14 дней. Иногда к этим культурам можно добавить flt 3-L или слитые молекулы GM-C SF/IL-3 (РIХV 321). Эти к ультуры окрашивали красителем Райта и колонии CFu -GM оценивали при помощи препаровальной лупы (Ward et. al., Exp. Hematol., 16:358 (1988). Альтернативно, CFu-GM колонии можно оценивать при помощи способа СD34/СD33 проточной цитометрии Siena et. al., Blood, Vol. 77, № 2, pp. 400-409 (1991) или любого иного способа, известного в данной области. CFu-GМ содержащие культуры замораживали в морозильном аппарате с контролируемой скоростью замораживания (например, Сryo. Меd, Mt. Clemens, M1), затем хранили в фазе паров жидко Действие сверхпродуцирования flt 3-L в трансгенных мышах Процент положительных клеток КонНеродтроль Маркер ствен. того же контроль приплода В220 30,64 27,17 slgM 3,54 2,41 S7(CD43) 54,43 45,44 SCA-I 10,92 11,74 CD4 6,94 8,72 Мас-I 36,80 27,15 Трансгенная мышь №1 Трансгенная мышь №2 45,84 1,94 46,11 19,45 12,21 21,39 48,78 1,14 50,59 27,37 14,05 18,63 Представленные выше данные показывают, что свер хпродуцирование flt 3-L в мышах приводит к увеличению в числе В-клеток, как видно из увеличения В220+ клеток и SCA-I+ клеток. Анализ В220+ клеток при помощи FACS (клеточного сортера с возбуждением флуоресценции) показал увеличение в числе проВ-клеток (HSA-, S7+). Увеличение в СВ4+ клетках показало приблизительно 2-кратное повышение в числе Т-клеток и стволовых клеток. Уменьшение в клетках, имеющих sIgM маркер, свидетельствует о том, что flt 3-L не стимулирует пролиферацию зрелых В-клеток. Эти данные свидетельствуют о том, что flt 3-L увеличивает число клеток с фенотипом стволовых клеток, Т-клеток или ранних В-клеток и не стимулирует пролиферацию зрелых В-клеток или макрофагов. Пример 12 Анализ тимуса (вилочковой железы из сверхпродуцирующи х flt 3-L мышей Этот пример описывает анализ тимуса из трансгенных мышей, полученных согласно продедуре Примера 9. Убивали 6 взрослых мышей приблизительно 3-месячного возраста. Из каждой мыши удаляли тимус и готовили суспензию отдельных клеток. FACS анализ показал, что не происходило общего изменения в числе клеток и что мыши не обнаружили изменения в соотношениях созревающи х тимоцитов при применении маркеров: СD4vs CD8; CD3vs, abTCR (рецептор Т-клеток); и СDЗvs gdTCR (рецептор Т-клеток). Однако изменение в соотношениях определенных типов клеток внутри СD4- и СD8- компартмента (т. е. самых ранних клеток в отношении развития; каждые из указанных представляют приблизительно 2%-3% от всех клеток тимуса) происходило. В частности, СD4- и СD8- клетки в тимусе развиваются в трех стадиях. Стадия 1 представляет собой клетки, имеющие Рgр-1++, HSA+ и IL-2-рецептор-отрицательные ("IL2R-") маркеры. После стадии 1 клетки тимуса развиваются до стадии 2, состоящей из клеток, имеющи х Рgр-1+, HSА++ и IL-2R++ маркеры, и затем до стадии 3, характеризующейся клетками, имеющими Рgр-1+/-, HSА++ и IL-2R - маркеры. Клетки тимуса в стадии 2 уменьшались в числе приблизительно на 50%, в то время как популяция клеток в стадии 3 пропорционально увеличивалась. Эти данные предполагают, что flt 3-L действует на пере 23 42726 го азота. В качестве криопротектора можно применять 10% диметилсульфоксид. После завершения всех сборов из больного CFu-GM содержащие культуры оттаивали и объединяли. Оттаянные собранные клетки либо повторно вливали внутривенно больному или размножали ex vi vo перед повторной инфузией. Ех vi vo увеличение объединенных клеток можно выполнять с применением flt 3-L в качестве фактора роста либо одного, либо в одновременной комбинации с другими цитокинами, указанными выше. Способы такого увеличения в объеме ех vivo хорошо известны в данной области. Клетки, увеличенные или неувеличенные, повторно вливают больному внутривенно. Для облегчения приживлення трансплантированных клеток flt 3-L вводили одновременно с повторной инфузией или после нее. Flt 3-L при этом вводили один или последовательно, или в совместной комбинации с другими цитокинами, выбранными из приведенного выше перечня. Пример 14 Очистка гемопоэтических клеток-предшественников или стволовых клеток при помощи flt 3-L Этот Пример описывает способ очистки клеток-предшественников и стволовых клеток из сус пензии, содержащей смесь клеток. Клетки из костного мозга и периферической крови собирают при помощи общепринятых процедур. Эти клетки суспендируют в стандартных средах и затем центрифугир уют для удаления эритроцитов и нейтрофилов. Клетки, расположенные при интерфазе между двумя фазами (также известной как лейкоцитарная пленка), извлекают и ресуспендируют. Эти клетки преимущественно одноядерные и представляют основную часть ранних гемопоэтических клеток-предшественников и стволовых клеток. Затем полученную клеточную суспензию инкубируют с биотинилированным flt 3-L в течение времени, достаточного для взаимодействия flt 3-L:flt 3-L. Обычно достаточны периоды инкубации не менее 1 часа. После инкубирования клеточную суспензию пропускают под действием силы тяжести через колонку, упакованную покрытыми авидином гранулами. Такие колонки хорошо известны в данной области (см.: Berenson, et al., J. Cell. Biochem., 10: 239 (1986). Колонку промывали раствором РВS для удаления несвязавшегося материала. Целевые клетки высвобождали из гранул и освобождали от flt 3-L при помощи общепринятых способов. Cписок последовательностей Информация для SEQ ID №1: Характеристики последовательности: Длина: Тип: Количество цепей: Топология: Тип молекулы: Гипотетическая: Антисмысловая: Признак: Имя/код: Местоположение: Признак: Имя/код: Местоположение: Признак: Имя/код: Местоположение: 879 п. н. нуклеиновая кислота oдна линейная кДНК-мРНК нет нет misc-feature 1…25 misc-feature 855…879 CDS 57…752 Описание последовательности: 24 42726 Информация для SEQ ID № 2 Характеристики последовательности: Длина: Тип: Топология: Тип молекулы: 231 аминокислота аминокислота линейная белок Описание последовательности: 25 42726 Информация для SEQ ID №3: Характеристики последовательности Длина:. Тип: Количество цепей: Топология: Гипоетическая : Антисмысловая: : 24 п. н нуклеиновая кислота одна линейная нет Нет Описание последовательности: 26 42726 Информация для SEQ ID № 4 Характеристики последовательности Длина Тип Количество цепей Топология Гипотическая Антисмысловая 20 п. н. нуклеиновая кислота одна линейная нет нет Описание последовательности: Информация для SEQ ID № 5: Характеристики последовательности: Длина: Тип: Количество цепей: Топология: Тип молекулы: Гипотетическая: Антисмысловая: Признак: Имя/код: Местоположение: 988 п. н. нуклеиновая кислота одна линейная кДНК-мРНК нет нет CDS 30…7344 Описание последовательности: 27 42726 Информация для SEQ 1D № 6 Характеристики последовательности Длина Тип Топология Тип молекулы 235аминокислот аминокислота линейная белок Описание последовательности 28 42726 Информация для SEQ 1D № 7 Характеристики последовательности Длина: Тип: Количество цепей: Топология: Тип молекулы: Гипотетическая: Антисмысловая: 71 п. н. нуклеиновая кислота одна линейная кДНК-мРНК нет нет Описание последовательности: 29 42726 Информация для SEQ 1D № 8: Характеристики последовательности: Длина: Тип: Количество цепей: Топология: Тип молекулы: Гипотетическая: Антисмысловая: 37 п. н. нуклеиновая кислота одна линейная кДНК-мРНК нет нет Описание последовательности: __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 30