Спосіб визначення плодів, листя та квіток глоду і суцвіття конюшини лучної у фітопрепараті

Реферат: UA 79928 U UA 79928 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі фармації, а саме до фітохімії, та може бути використана для стандартизації комплексних фітопрепаратів, що містять плоди, листя та квітки глоду і суцвіття конюшини лучної. Відомо, що плоди, листя та квітки глоду і суцвіття конюшини лучної широко застосовуються в фітотерапії як у вигляді монокомпонентних, так і у вигляді комбінованих препаратів [3]. Квітки глоду містять гіперозид, кверцетин, вітексин, сапонаретин, орієнтин, гомоорієнтин, рамнозиди вітексину, фенолокислоти, аміни. У плодах знайдено органічні кислоти, цукри, сорбіт, пектинові речовини, аскорбінову кислоту, -каротин, вітамін К, фенольні сполуки, кумарини, стерини, тритерпенові кислоти. Препарати глоду виявляють кардіотонічну, спазмолітичну, гіпотензивну, седативну та десенсибілізуючу дію [4]. Суцвіття конюшини лучної містять ізофлавоноїди, глікозиди трифолін та ізотрифолін, дубильні речовини, ефірну і жирну олії, саліцилову та інші органічні кислоти, каротин, вітаміни С, Е, В1, В2, К та інші корисні речовини [4, 9]. Суцвіття конюшини лучної мають відхаркувальну, сечогінну, потогінну, протизапальну та бактерицидну властивість, а також володіють антиатеросклеротичною та антитромботичною дією [5]. З огляду на належну фармакологічну дію плодів, листя та квіток глоду і суцвіття конюшини лучної поєднання даної сировини у фітопрепаратах для терапії серцево-судинних захворювань, таких як ішемічна хвороба серця, атеросклероз, гіпертонічна та інші хвороби є доцільним та знаходить використання на практиці [6, 7]. Тому створення ефективного способу визначення плодів, листя та квіток глоду і суцвіття конюшини лучної, який би забезпечував необхідну специфічність визначення при їх сумісній присутності у фітопрепараті і можливість його стандартизації, а також оптимізацію роботи аналітиків - є досить важливим і необхідним завданням. Відомий фармакопейний спосіб [1, 2] визначення плодів, листя та квіток глоду методом тонкошарової хроматографії, який проводиться за речовинами флавоноїдної природи. Як розчин порівняння для плодів глоду використовують суміш хлорогенової кислоти Р, кавової кислоти Р, гіперозиду Р та рутину Р, для квіток глоду - суміш хлорогенової кислоти Р та гіперозиду Р. Відомий фармакопейний спосіб визначення [8, 9] суцвіття конюшини методом тонкошарової хроматографії, який також проводиться за речовинами флавоноїдної природи, у якості розчинів порівняння використовують рутин Р та стандартизований сухий екстракт конюшини. До недоліків цих способів можна віднести те, що їх застосування при аналізі комбінованого фітопрепарату, що містить плоди, листя та квітки глоду та суцвіття конюшини лучної, не дає можливості їх однозначного визначення та належної специфічності. За прототип вибраний спосіб визначення суцвіть конюшини лучної методом високоефективної тонкошарової хроматографії (ВЕТШХ) за ізофлавоноїдами. Спосіб за прототипом здійснюється наступним чином. 1,0 г суцвіть конюшини лучної чи екстракту конюшини лучної розчиняють у 10 мл 60 % метанолу Р протягом 10 хв. на ультразвуковій бані. Як випробовуваний розчин використовують надосадову рідину, розчину порівняння - формононетин Р (1 мг/10 мл). Наносять 2 мкл випробовуваного розчину та 5 мкл розчину порівняння смужками довжиною 8 мм на ВЕТШХ пластинку виробництва Silica gel 60 F254 (Merck) розміром 10×10 чи 20×10. Пластинку поміщають у хроматографічну камеру з сумішшю розчинників: толуол Р - етилацетат Р - мурашина кислота Р (70:30:1) попередньо насичену з фільтрувальним папером протягом 20 хв. Після проходження рухомої фази близько 7 см від краю пластинки, її виймають з камери, сушать на повітрі у витяжній шафі протягом 5 хв. і переглядають в УФ-світлі за довжини хвилі 254 нм та 365 нм [10]. Недоліком даного способу є те, що для його виконання необхідно використовувати ВЕТШХпластинки, які є дорожчими за пластинки для тонкошарової хроматографії (ТШХ). При використанні для даного способу пластинок для ТШХ необхідно експериментально визначати умови хроматографування. Суттєвим недоліком даної методики є те, що при її використанні для стандартизації комбінованого фітопрепарату визначаються лише суцвіття конюшини лучної. Задачею корисної моделі є використання тонкошарової хроматографії, розробити методику визначення, яка б забезпечувала необхідну специфічність визначення для плодів, листя та квіток глоду і суцвіть конюшини лучної при їх сумісній присутності у фітопрепараті, можливість стандартизації комплексного фітопрепарату, а також оптимізувати роботу аналітиків, використовуючи замість двох окремих рухомих систем на різні класи біологічно активних сполук одну, але з різними умовами виявлення. 1 UA 79928 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Поставлена задача вирішується тим, що спосіб визначення плодів, листя та квіток глоду і суцвіття конюшини лучної у фітопрепараті, який включає використання методу тонкошарової хроматографії, визначення ізофлавоноїдів, що наявні в суцвітті конюшини, з використанням як розчину порівняння формононетину Р, а як рухомої фази суміші розчинників: толуол Р етилацетат Р - мурашина кислота Р (70:30:1) та переглядання пластини в УФ-світлі за довжини хвилі 254 нм після висушування на повітрі протягом 10 хв, згідно з корисною моделлю, хроматографічну пластинку додатково обприскують розчином анісового альдегіду Р чи 10 % розчином сірчаної кислоти Р в метанолі Р, після чого витримують у сушильній шафі, та визначають тритерпенові сполуки, що наявні в плодах, листі та квітках глоду, з використанням як розчину порівняння олеанолевої кислоти Р. У відповідності з корисної моделлю хроматографічну пластинку витримують в сушильній шафі протягом 5-10 хв. при температурі 100-105 °C. Усі параметри заявленого засобу визначені експериментальним шляхом. Заявлений спосіб здійснюється наступним чином: Випробовуваний розчин. Фітопрепарат у формі настойки, що містить у складі плоди, листя та квітки глоду і суцвіття конюшини, приготовану з використанням спирто-водного розчину (4070 %). Розчин порівняння. Формононетин Р, що розчиняють в метанолі Р (1 мг/10 мл) та олеанолова кислота Р, що розчиняють в метанолі Р (1 мг/мл). На хроматографічну пластинку Silica gel 60 F254 (Merck) чи "Alugram" Sil G/UV254 (MachereyNagel) розміром 10×10 см чи 6×10 см наносять смугами 20-25 мкл випробовуваного розчину та паралельно по 15 мкл розчинів порівняння формононетину Р та олеанолової кислоти Р. Пластинку висушують на повітрі протягом 10 хв, поміщають в попередньо насичену фільтрувальним папером протягом 1 год. хроматографічну камеру з сумішшю розчинників: толуол Р - етилацетат Р - мурашина кислота Р (70:30:1) і хроматографують висхідним способом. Коли фронт розчинників пройде 8-8,5 см від лінії старту, пластинку виймають з камери, висушують на повітрі протягом 10 хв., переглядають в УФ-світлі за довжини хвилі 254 нм та документують за допомогою фотоапарата. На хроматограмі розчину порівняння у нижній частині пластинки має виявлятися темна зона (формононетин). На хроматограмі випробовуваного розчину має виявлятися темна зона на рівні зони формононетину на хроматограмі розчину порівняння (формононетин). Допускається наявність інших зон різної величини і забарвлення. Наступним етапом обприскують хроматографічну пластинку розчином анісового альдегіду Р чи 10 % розчином сірчаної кислоти Р в метанолі Р. Витримують пластинку у сушильній шафі протягом 5-10 хв. при температурі 100-105 °C, переглядають при денному світлі та документують за допомогою фотоапарата. На хроматограмі розчину порівняння у середній половині пластинки має виявлятися зона синьо-фіолетового кольору (олеанолова кислота). На хроматограмі випробовуваного розчину має виявлятися зона синьо-фіолетового кольору на рівні зони олеанолової кислоти на хроматограмі розчину порівняння (олеанолова кислота). Допускається наявність інших зон різної величини і забарвлення. Одержані результати достовірно свідчать про наявність ізофлавоноїдів (суцвіття конюшини лучної) та тритерпенових кислот (плоди, листя та квітки глоду) у комплексному фітопрепараті. Дослідником знайдена можливість одночасного визначення плодів, квіток та листя глоду у суміші з суцвіттями конюшини лучної у тій самій рухомій фазі, після проявлення пластинки розчином анісового альдегіду Р чи 10 % розчином сірчаної кислоти Р в метанолі Р та витримування пластинки в сушильній шафі при температурі 100-105 °C протягом 5-10 хв., за тритерпеновими кислотами, використовуючи як розчин порівняння олеанолову кислоту Р, що сприяє удосконаленню методик контролю якості комплексних фітопрепаратів та оптимізації роботи аналітиків (за рахунок скорочення часу проведення аналізу з використанням однієї рухомої фази замість двох). Корисна модель ілюструється прикладами. Приклади ілюструються рисунками, де: 1 - настойка складна, що містить плоди, листя та квітки глоду, суцвіття конюшини та траву сухоцвіту, приготовану з використанням 50 % спиртоводного розчину за методом перколяції; 2 - формононетин Р в метанолі Р (1 мг/10 мл); 3 - олеанолова кислотуа Р в метанолі Р (1 мг/мл); 2 UA 79928 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 4 - настойка конюшини лучної, приготована з використанням 50 % спирто-водного розчину за методом перколяції; 5 - настойка плодів глоду, приготована з використанням 50 % спиртоводного розчину за методом перколяції; 6 - настойка листя та квіток глоду, приготована з використанням 50 % спирто-водного розчину за методом перколяції. Приклад 1 Як випробовуваний розчин використовували настойку складну - 1, що містить плоди, листя та квітки глоду, суцвіття конюшини та траву сухоцвіту, приготовану з використанням 50 % спирто-водного розчину за методом перколяції. Як розчин порівняння використовували формононетин Р - 2, що розчиняли в метанолі Р (1 мг/10 мл) та олеанолову кислоту Р - 3, що розчиняли в метанолі Р (1 мг/мл), настойку конюшини лучної - 4, настойку плодів глоду - 5 та настойку листя та квіток глоду - 6, приготовані з використанням 50 % спирто-водного розчину за методом перколяції. На хроматографічну пластинку "Alugram" Sil G/UV254 (Macherey-Nagel) розміром 10×10 см наносили смугами 25 мкл випробовуваного розчину, паралельно по 15 мкл розчинів порівняння формононетину Р та олеанолової кислоти Р, та по 25 мкл настойки конюшини лучної, настойки плодів глоду та настойки листя та квіток глоду. Пластинку висушували на повітрі протягом 10 хв., поміщали в попередньо насичену фільтрувальним папером протягом 1 год. хроматографічну камеру з сумішшю розчинників: толуол Р - етилацетат Р - мурашина кислота Р (70:30:1) і хроматографували висхідним способом. Коли фронт розчинників проходив 8,5 см від лінії старту, пластинку виймали з камери, висушували на повітрі протягом 10 хв., переглядали в УФ-світлі за довжини хвилі 254 нм та документували за допомогою фотоапарата. На хроматограмі розчинів порівняння формононетину та настойки конюшини лучної у нижній частині пластинки виявлялася темна зона (формононетин). На хроматограмі випробовуваного розчину виявлялася темна зона на рівні зони формононетину на хроматограмі розчинів порівняння (формононетин). Вище неї виявлялася ще одна темна зона (фіг. 1). Обприскували хроматографічну пластинку розчином анісового альдегіду Р. Витримували пластинку у сушильній шафі протягом 10 хв. при температурі 105 °C, переглядали при денному світлі та документували за допомогою фотоапарата. На хроматограмі розчинів порівняння олеанолової кислоти, настойки плодів глоду і настойки листя та квіток глоду у середній половині пластинки виявлялася зона синьо-фіолетового кольору (олеанолова кислота). На хроматограмі випробовуваного розчину виявлялася зона синьо-фіолетового кольору на рівні зони олеанолової кислоти на хроматограмі розчинів порівняння (олеанолова кислота). Вище неї виявилася слабко-виражена зона синьо-фіолетового кольору (фіг. 2). Приклад 2 Як випробовуваний розчин використовували настойку складну, що містить плоди, листя та квітки глоду, суцвіття конюшини та траву сухоцвіту, приготовану з використанням 50 % спиртоводного розчину за методом перколяції. Як розчин порівняння використовували формононетин Р, що розчиняли в метанолі Р (1 мг/10 мл) та олеанолову кислоту Р, що розчиняли в метанолі Р (1 мг/мл). На хроматографічну пластинку "Alugram" Sil G/UV254 (Macherey-Nagel) розміром 6×10 см наносили смугами 25 мкл випробовуваного розчину та паралельно по 15 мкл розчинів порівняння формононетину Р та олеанолової кислоти Р. Пластинку висушували на повітрі протягом 10 хв., поміщали в попередньо насичену фільтрувальним папером протягом 1 год. хроматографічну камеру з сумішшю розчинників: толуол Р - етилацетат Р - мурашина кислота Р (70:30:1) і хроматографували висхідним способом. Коли фронт розчинників проходив 8,5 см від лінії старту, пластинку виймали з камери, висушували на повітрі протягом 10 хв., переглядали в УФ-світлі за довжини хвилі 254 нм та документували за допомогою фотоапарата. На хроматограмі розчину порівняння у нижній частині пластинки виявлялася темна зона (формононетин). На хроматограмі випробовуваного розчину виявлялася темна зона на рівні зони формононетину на хроматограмі розчину порівняння (формононетин). Вище неї виявлялася ще одна темна зона (фіг. 3). 3 UA 79928 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Обприскували хроматографічну пластинку розчином анісового альдегіду Р. Витримували пластинку у сушильній шафі протягом 10 хв. при температурі 105 °C, переглядали при денному світлі та документували за допомогою фотоапарата. На хроматограмі розчину порівняння у середній половині пластинки виявлялася зона синьофіолетового кольору (олеанолова кислота). На хроматограмі випробовуваного розчину виявлялася зона синьо-фіолетового кольору на рівні зони олеанолової кислоти на хроматограмі розчину порівняння (олеанолова кислота). Вище неї виявилася слабко-виражена зона синьо-фіолетового кольору (фіг. 4). Приклад 3 Як випробовуваний розчин використовували настойку складну, що містить плоди, листя та квітки глоду, суцвіття конюшини та траву сухоцвіту, приготовану з використанням 50 % спиртоводного розчину за методом перколяції. Як розчин порівняння використовують формононетин Р, що розчиняли в метанолі Р (1 мг/10 мл) та олеанолову кислоту Р, що розчиняли в метанолі Р (1 мг/мл). На хроматографічну пластинку Silica gel 60 F254 (Merck) розміром 6×10 см наносили смугами 20 мкл випробовуваного розчину та паралельно по 15 мкл розчинів порівняння формононетину Р та олеанолової кислоти Р. Пластинку висушували на повітрі протягом 10 хв., поміщали в попередньо насичену фільтрувальним папером протягом 1 год. хроматографічну камеру з сумішшю розчинників: толуол Р - етилацетат Р - мурашина кислота Р (70:30:1) і хроматографували висхідним способом. Коли фронт розчинників проходив 8 см від лінії старту, пластинку виймали з камери, висушували на повітрі протягом 10 хв., переглядали в УФ-світлі за довжини хвилі 254 нм та документували за допомогою фотоапарата. На хроматограмі розчину порівняння у нижній частині пластинки виявлялася темна зона (формононетин). На хроматограмі випробовуваного розчину виявлялася темна зона на рівні зони формононетину на хроматограмі розчину порівняння (формононетин). Вище неї виявлялася ще одна темна зона (фіг. 5). Наступним етапом обприскували хроматографічну пластинку розчином анісового альдегіду Р. Витримували пластинку у сушильній шафі протягом 5 хв. при температурі 105 °C, переглядали при денному світлі та документували за допомогою фотоапарата. На хроматограмі розчину порівняння у середній половині пластинки виявлялася зона синьофіолетового кольору (олеанолова кислота). На хроматограмі випробовуваного розчину виявлялася зона синьо-фіолетового кольору на рівні зони олеанолової кислоти на хроматограмі розчину порівняння (олеанолова кислота). Вище неї виявилася слабко-виражена зона синьо-фіолетового кольору (фіг. 6). Приклад 4 Як випробовуваний розчин використовували настойку складну, що містить плоди, листя та квітки глоду, суцвіття конюшини та траву сухоцвіту, приготовану з використанням 50 % спиртоводного розчину за методом перколяції. Як розчин порівняння використовували формононетин Р, що розчиняли в метанолі Р (1 мг/10 мл) та олеанолову кислоту Р, що розчиняли в метанолі Р (1 мг/мл). На хроматографічну пластинку Silica gel 60 F254 (Merck) розміром 6×10 см наносили смугами 20 мкл випробовуваного розчину та паралельно по 15 мкл розчинів порівняння формононетину Р та олеанолової кислоти Р. Пластинку висушували на повітрі протягом 10 хв., поміщали в попередньо насичену фільтрувальним папером протягом 1 год. хроматографічну камеру з сумішшю розчинників: толуол Р - етилацетат Р - мурашина кислота Р (70:30:1) і хроматографували висхідним способом. Коли фронт розчинників проходив 8 см від лінії старту, пластинку виймали з камери, висушували на повітрі протягом 10 хв., переглядали в УФ-світлі за довжини хвилі 254 нм та документували за допомогою фотоапарата. На хроматограмі розчину порівняння у нижній частині пластинки виявлялася темна зона (формононетин). На хроматограмі випробовуваного розчину виявлялася темна зона на рівні зони формононетину на хроматограмі розчину порівняння (формононетин). Вище неї виявлялася ще одна темна зона (фіг. 7). Наступним етапом обприскували хроматографічну пластинку 10 % розчином сірчаної кислоти Р в метанолі Р. Витримували пластинку у сушильній шафі протягом 5 хв. при температурі 100 °C, переглядали при денному світлі та документували за допомогою фотоапарата. 4 UA 79928 U 5 10 15 20 25 30 35 На хроматограмі розчину порівняння у середній половині пластинки виявлялася зона синьофіолетового кольору (олеанолова кислота). На хроматограмі випробовуваного розчину виявлялася зона синьо-фіолетового кольору на рівні зони олеанолової кислоти на хроматограмі розчину порівняння (олеанолова кислота) (фіг. 8). Висновок Запропонований спосіб забезпечує необхідну специфічність визначення для плодів, квіток та листя глоду та суцвіття конюшини лучної при їх сумісній присутності у фітокомпозиції та можливість стандартизації комплексного фітопрепарату, а також забезпечує скорочення часу проведення аналізу, витрат матеріалів та реактивів на хроматографування. Джерела інформації: 1. Державна Фармакопея України / Дії "Науково-експертний фармакопейний центр". - 1-е вид. - Доп. 2. - X.: ДП "Науково-експертний фармакопейний центр", 2008. - 620 с. 2. Державна Фармакопея України / ДП "Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів". - 1-е вид. - Доп. 3. - X.: ДП "Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів", 2009. - 280 с. 3. Компендиум 2009 - лекарственные препараты; под ред. В.Н. Коваленко, А.П. Викторова. К.: МОРИОН, 2009. - 2270 с. 4. Лікарські рослини: енциклопедичний довідник / за ред. А.М. Гродзинського. - К.: Голов, ред. УРЕ, 1990. - 544 с. 5. Пат. 68651 U, UA, МПК (2012.01) А61К31/00. Застосування сухого екстракту конюшини лучної як засобу, що проявляє антиатеросклеротичну та антитромботичну дію / Ярош О.К., Козир В.А., Солеймані М.В.; заяви, і власн. Державна установа "Інститут фармакології та токсикології АМН України". - u201108792; заявл. 12.07.2011; опубл. 10.04.2012, Бюл. № 7. 6. Пат. 14791 U, UA, МПК (2006) А61Р9/00, А61Р9/12. Застосування Равісолу як препарату з гіпотензивною та кардіотонічною дією / Звягінцева Т.В, Киричок Л.Т., Трутаєв І.В.; заяви, і власн. Харківський державний медичний університет. - u200600168; заявл. 06.01.2006; опубл. 15.05.2006, Бюл. № 5. 7. ТУ 9197-145-21428156-06 "Биологически активная добавка к пище "Атероклефит"; ном. свид. и дата 77.99.23.3.У.7501.7.06 от 26.07.2006. Реестр продукции, прошедшей государственную регистрацию. Режим доступу: (http://fp.crc.ru). 8. British Herbal Pharmacopoeia. - British Herbal Medicine Association, 1996. - P. 160. 9. USP Dietary Supplement Compendium. - 1-st ed. - Rockville, MD, 2009. - 1577 p. 10. HPTLC identification of Red Clover (Trifolium pratense L.) F-22B. Режим доступу: (http://www. camag.com/en/tlc_hptlc/camag_laboratory/methods.cfm). ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 1. Спосіб визначення плодів, листя та квіток глоду і суцвіття конюшини лучної у фітопрепараті, який включає використання методу тонкошарової хроматографії, визначення ізофлавоноїдів, що наявні в суцвітті конюшини лучної, з використанням як розчину порівняння формононетину Р, а як рухомої фази суміші розчинників: толуол Р - етилацетат Р - мурашина кислота Р (70:30:1), та переглядання пластини в УФ-світлі за довжини хвилі 254 нм після висушування на повітрі протягом 10 хв., який відрізняється тим, що хроматографічну пластинку додатково обприскують розчином анісового альдегіду Р чи 10 % розчином сірчаної кислоти Р в метанолі Р, після чого витримують у сушильній шафі та визначають тритерпенові сполуки, що наявні в плодах, листі та квітках глоду, з використанням як розчину порівняння олеанолову кислоту Р. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що хроматографічну пластинку витримують в сушильній шафі протягом 5-10 хв. при температурі 100-105 °C. 5 UA 79928 U 6 UA 79928 U Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7