Спосіб ідентифікації сортів конюшини лучної (trifolium pratense l.) методом електрофорезу запасних білків насіння

Спосіб ідентифікації сортів конюшини лучної (Trifolium pratense L.) методом електрофорезу запасних білків насіння, що включає подрібнення насіння до стану борошна, розмішування його з екстрагуючим розчином та центрифугування, змішування прозорого надосадового розчину (супернатанту) з відтяжним розчином, приготування гелю, нанесення на нього білкових екстрактів, проведення електрофорезу, фарбування гелевих пластин, відмивання їх від надлишків фарби та 3 лучної (Т. pretense L.) з достатньо високою точністю. Запропонований нами спосіб ідентифікації сортів конюшини лучної методом електрофорезу запасних білків насіння складається із наступних етапів: екстракція (виділення) білків, що включає в себе подрібнення насіння до стану борошна, розмішування його з екстрагуючим розчином та центрифугування, змішування прозорого надосадового розчину (супернатанту) з відтяжуючим розчином, приготування гелю, нанесення на нього білкових екстрактів, проведення електрофорезу, фарбування гелевих пластин, відмивання їх від надлишків фарби та фотографування, ідентифікація сортів. У запропонованому способі для екстракції білків використовується екстрагуючий розчин, до складу якого входить оцтова кислота і сечовина та відтяжуючий розчин, до складу якого входить оцтова кислота, сечовина і піронін G. Для приготування гелю використовуються наступні реактиви: метиленбісакриламід, акриламід, оцтова кислота, сечовина, гліцин, аскорбінова кислота, семиводне сірчанокисле закисне залізо, ТЕМЕД, персульфат калію. Гліциново-кислий електрофоретичний буфер. Запропоновані вищезазначені розчини для екстракції білків, а також склад гелю дозволяють за менш тривалий час ідентифікувати сорти та роблять спосіб більш економічно ефективний. Фарба для гелю містить ацетон або спирт, трихлороцтову кислоту 60%-ну, оцтову кислоту, барвник (Brilliant Blue R - 250). Гель полімеризується за кімнатної температури за 1 хвилину, що прискорює весь процес ідентифікації запропонованим способом. Приклад В лабораторних умовах було проведено ряд досліджень: Метою досліджень було розроблення способу екстракції, префоретичного поділу та електрофоретичного фракціонування запасних білків насіння різних сортів конюшини лучної (T. pratense L.) з метою їх сортової ідентифікації. В процесі розроблення методики були використані різні варіанти префоретичної підготовки і фракціонування запасних білків насіння різних сортів конюшини лучної (T. pratense L.). Білкові спектри насіння досліджуваних сортів конюшини лучної за різних варіантів відрізнялися не лише за кількістю фракцій, але й за інтенсивністю їх прояву та рухливістю. За умов нижче наведеного варіанту спостерігалася відмінність між сортами, тобто найбільш повно виявився поліморфізм запасних білків насіння різних сортів T. pratense L. Що дає підстави говорити про можливість використання даного методу для ідентифікації сортів конюшини лучної {T. pratense L.). Наведений нижче спосіб є експрес-методом електрофоретичного поділу запасних білків насіння різних сортів T. pratense L. Він дозволяє фракціонувати запасні білки насіння різних сортів конюшини лучної в поліакриламідному гелі (ПААГ) по заряду та масі для одержання електрофоретичних білкових спектрів. 47205 4 Екстракція білків Приблизно 100 насінин (окремо для кожного сорту) механічно подрібнюємо у фарфоровій ступці до стану борошна. В окремі пробірки беремо наважки по 0,002г і заливаємо 0,2мл екстрагуючого розчину, в 1л якого міститься 0,5М оцтової кислоти і 2М сечовини. Вмістиме пробірок розмішуємо за допомогою електричної мішалки 2 хвилини, після чого залишаємо відстоюватись не менше двох годин. Суспензію центрифугуємо 5 хвилин при 6000 обертів за хвилину. З кожної пробірки відбираємо 0,1мл супернатанту, переносимо в іншу пробірку і додаємо 0,1мл відтяжуючого розчину, в 1л якого міститься 0,5М оцтової кислоти, 9,5М сечовини і 0,005% піроніну G. Одержані білкові екстракти відстоюємо протягом 12 годин. Електрофорез білків 1. Готуємо електрофоретичний буфер: оцтова кислота - 10мл, гліцин - 1г, вода - до 5л. 2. Готуємо гель: метиленбісакриламід - 0,237г, акриламід - 5,7г, оцтова кислота - 1,68мл, сечовина - 40,32г, дистильована вода - до кінцевого об'єму - 70мл. У чітко зазначеній послідовності додаємо каталізатори: гліцин (500мг на 50мл води) 8,4мл розчину, аскорбіова кислота (200мг на 20мл води) - 2,8мл розчину, семиводне сірчанокисле закисне залізо (500мг на 71,4мл води) - 1,2мл розчину, ТЕМЕД - 0,12мл, персульфат калію (525мг на 25мл води) - 1,2мл розчину. 3. Заливаємо гель між двома пластинами скла приладу. Гель полімеризується за 1 хвилину. 4. Білкові екстракти прогріваємо на водяній бані протягом 5 хвилин при t=100°С та наносимо їх на гель дозатором на 5 мікро-літрів. Підключаємо прилад та встановлюємо напругу 400В. Форез знімаємо через 1 годину після виходу мітки. Гелі занурюємо на 24 години у попередньо підігріту до температури 50°-60°С фарбу, 5л водного розчину якої містить ацетон або спирт - 750мл, трихлороцтову кислоту 60%-ну - 500мл, оцтову кислоту 250мл, барвник (Brilliant Blue R - 250) - 1г. Надлишки якої відмиваємо водопровідною водою в присутності невеликої кількості ацетону. Відмиті гелеві пластини фотографуємо. Як приклад наводено електорофореграму запасних білків насіння декількох з досліджуваних сортів конюшини лучної (Т. pratense L.). Для аналізу використовували результати електрофорезу насіння того чи іншого сорту конюшини лучної (Т. pratense L.). Повторність дослідів п'ятикратна. Як стандартні, по шостій і дванадцятій доріжці пропускалися білки сорту Дарунок. На Фіг. зображена Електрофореграма запасних білків насіння сортів конюшини лучної (T. pratense L.): 1-а, 2-а, 3-я, 4-а, 5-а доріжки - сорт Агрос 12; 6-а і 12-а доріжки - сорт Дарунок; 7-а, 8-а, 9-а, 10-а, 11-а доріжки - сорт Передкарпатська 6; 13-а, 14-а, 15-а, 16-а, 17-а доріжки - сорт Білоцерківська 3306. За допомогою методу електрофорезу в поліакриламідному гелі нами встановлено широкий 5 47205 поліморфізм спектру запасних білків насіння досліджуваних сортів конюшини лучної (Т. pratense L.). Білкові спектри досліджуваних зразків відрізнялися за кількістю фракцій, інтенсивністю їх прояву, рухливістю. На електрофореграмі як еталонні для зіставлення результатів використовували білкові спектри сорту Дарунок на 6-й та 12-й доріжці. Рухливість певної фракції визначали відносно значення рухливості 14-ї фракції сорту Дарунок на кожній з електрофореграм. Одержані спектри досліджуваних сортів згори до низу ми умовно розділили на три частини, де, відповідно, відкладались високо-, середньо- і низькомолекулярні фракції запасних білків. Значильником при цьому слугувало розміщення білкових фракцій спектра сорту Дарунок, який використовувався як стандарт. Вище зазначений поділ здійснювали за такою схемою: І група -(високомолекулярні) - до 14-ї фракції; II група - (середньомолекулярні) - від 14-ї до 19-ї і III група - (легкомолекулярні) - від 19-ї фракції сорту Дарунок (див. табл.). Комп’ютерна верстка А. Рябко 6 Таблиця Кількість білкових фракцій досліджуваних сортів конюшини лучної (Т. pratense L.). № п/п Сорт 1. Дарунок 2. Агрос 12 3. Передкарпатська 6 4. Білоцерківська 3306 Група І II III 14 14 11 10 5 5 7 5 10 5 18 12 Загальна кількість фракцій 29 24 36 27 Отже, проведені дослідження вказують на перспективність застосування вище наведеної експрес-методики фракціонування запасних білків насіння сортів конюшини лучної за допомогою методу електрофорезу для використання в селекції, насінництві, насіннєвому контролі, для визначення сортової чистоти партій насіння. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601