Спосіб виготовлення мікробного препарату поліміксобактерину – стимулятора росту рослин

Реферат: Спосіб виготовлення мікробного препарату Поліміксобактерину - стимулятора росту рослин шляхом приготування живильних середовищ для розмноження маточної культури бактерій Paenibacillus polymyxa KB 1-ї генерації на мікробіологічних коливалках з частотою обертання 200-220 об./хв. при t=(28-30) °С, =(24-36) годин, 2-ї генерації - з частотою обертання 200-220 об./хв. при t=(28-30) °С, =(36-48) годин та вирощування суспензії Поліміксобактерину у 2 ферментері при t=(28-30) °С, Р=(0,3-0,4) кгс/см , =(36-48) годин, рН=7,2-8,4. UA 99009 U (54) СПОСІБ ВИГОТОВЛЕННЯ МІКРОБНОГО ПРЕПАРАТУ ПОЛІМІКСОБАКТЕРИНУ - СТИМУЛЯТОРА РОСТУ РОСЛИН UA 99009 U UA 99009 U 5 10 15 20 25 30 35 Корисна модель належить до галузі сільськогосподарської мікробіології, а саме до біотехнології, і може бути використана на підприємствах, які виробляють мікробні препарати стимулятори росту рослин. Відомі регулятори росту рослин [Пат. 25141 Україна, МПК (2006)А01N65/00, C12N1/00, А01P21/00. Спосіб одержання фітогормонів / Антонюк В.П., Башмакова С.В., Кошель М.І., Яворська В.К., Драговоз І.В.; заявник і патентовласник: Український науково-дослідний інститут спирту і біотехнології продовольчих продуктів. - № 96062344; заявл. 13.06.96; опубл. 16.10.00, бюл. № 5; Пат. 54965 Україна, МПК (2006) МПК (2006) A01N65/00, А01Р21/00. Регулятор росту рослин мікробного походження / Кошель М.I., Заболотна Г.М., Яворська В.К., Драговоз І.В., Пономаренко С.П., Герасименко С.М.; заявник і патентовласник: Український науково-дослідний інститут спирту і біотехнології продовольчих продуктів. - № 2002064534; заявл. 04.06.02; опубл. 15.02.05, бюл. № 2]. Найбільш близьким по суті до заявленого технічного рішення є спосіб отримання біопрепарату [Пат. 22797 А Україна. Спосіб отримання біопрепарату / Козировська И.О., Громозова О.М.; заявник і патентовласник: Науково-виробничий центр "Енергія". - № 96062197; заявл. 05.06.96; опубл. 21.04.98], який включає культивування мікроорганізмів у стерильному живильному середовищі з наступним їх висушуванням. Корисна модель стосується способу виготовлення мікробного препарату Поліміксобактерину (ТУ У 24.1-00497360-004). Технічним результатом корисної моделі є підвищення продуктивності і якості сільськогосподарських культур за рахунок застосування Поліміксобактерину з метою покращення фосфорного живлення та стимуляції росту і розвитку рослин. Біоагентом Поліміксобактерину є культура фосфатмобілізовної бактерії Paenibacillus 6 polymyxa KB [Пат. 20206 А Україна, МПК C12N1/20, C05F11/08. Штам бактерій Bacillus роlумуха ВНДІСГМ В-324 Д для виробництва стимулятора росту цукрового буряка / Канівець В.I., Токмакова Л.М., Мелимука Ю.М.; заявник і патентовласник: Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН. - № 94076423; заявл. 27.07.94; опубл. 15.07.97]. Клітини бактерій - великі, грампозитивні, рухомі палички 1,1-1,3×3,0-5,0 мкм; поодинокі, в парах і коротких ланцюжках. При спороутворенні клітини роздуваються веретеноподібно. Спори великі, овальні (еліпсовидні). Факультативний анаероб. Клітини P. polymyxa KB авірулентні для теплокровних організмів. Механізм дії Поліміксобактерину на продукційний процес сільськогосподарських культур пов'язаний із властивостями P. polymyxa KB продукувати органічні кислоти, що сприяє розчиненню важкорозчинних мінеральних фосфатів ґрунту та добрив, а також синтезувати фермент фосфатазу, що забезпечує гідроліз органічних ґрунтових фосфатів, внаслідок чого активізується процес засвоєння фосфору рослинами (табл. 1). Таблиця 1 Вміст органічних кислот та фосфатази у культуральній рідині Paenibacillus polymyxa KB Вміст органічних кислот загальна кількість кислот, мг-екв/ 3 дм 0,680 40 45 ацетатна кислота, 3 ммоль/дм 0,261 Фосфатазна активність масляна кислота, Решта кислот, 3 3 ммоль/дм мг-екв/дм 0,111 0,308 Р2О5, кмоль/мл/год. 1,00 При визначенні за методом Ердеї здатності P. polymyxa KB розчиняти фосфати у рідкому середовищі Муромцева встановлено, що при внесенні у поживне середовище 5 г/л Са3(РО4)2 (Р2О5 229 мг/100 мл) бактерія здатна переводити з мінерального фосфату у розчин 52,0 мг Р2О5/100 мл, тобто до 22,7 %. Бактерії P. polymyxa KB продукують фітогормональні речовини ауксинової, гіберелінової і цитокінінової природи, вітаміни групи В, які здатні підвищувати імунітет рослин, активно впливають на формування і розвиток кореневої системи, її абсорбуючої здатності (табл. 2). 1 UA 99009 U Таблиця 2 Вміст фітогормональних речовин в культуральній рідині P. polymyxa KB ІОК, нг/мл ГібеЦіанкоЦитокініни нг/мл Тіамін релінова баламін (В1), (В12), вільна зв'язана кислота, Зеатин- Зеатин- Ізопентеніл- Ізопентеніл- Всього мкг/мл Зеатин мкг/ мкг/л рибозид глюкозид аденін аденозин цитокінінів 15,0±0,7 сліди 80,0±0,1 9,5±0,5 14,7±0,7 9,6±0,5 сліди сліди 33,8 0,020 0,0025 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Клітини P. polymyxa KB проявляють резистентність до дії низки фунгіцидів та інсектицидів у концентрації, яка застосовується в технологічній робочій суміші для протруєння насіння сільськогосподарських культур. Токсикологічна оцінка показала екологічну та біологічну безпечність P. polymyxa KB при виробництві та застосуванні як біодобрива. В основу корисної моделі поставлена задача розробки спрощеного способу виготовлення мікробного препарату Поліміксобактерину рідкої форми, що включає отримання інокуляційної культури, яку вирощують у живильному середовищі, поступово збільшуючи об'єм ємностей, у колбах та бутлях на мікробіологічних коливалках і у ферментері. Суть корисної моделі розкриває стадії основних технологічних процесів виготовлення мікробного препарату Поліміксобактерину: - одержання робочої культури P. polymyxa KB в пробірках на картопляному живильному середовищі. Склад живильного середовища: 200 г гарячої картоплі розчиняють у водному розчині солей, г: КН2РО4-0,05; К2НРО4-0,05; MgSO4-0,5; NaCl-0,5; FeSO4-0,01; MnSO4-0,01, агар 20,0 та 1 мл розчину мікроелементів за Федоровим. У приготовлену картопляну суміш вносять 10 г СаСО3 і доводять водою водогінною до 1000 мл. Стерилізацію живильного середовища в 2 автоклаві проводять при t=(126-128)°С, Р=1,5 кгс/см , =30 хвилин, рН=7,4-7,5; - приготування живильного середовища для вирощування маточної культури 1-ї і 2-ї генерації та мікробного препарату на мікробіологічних коливалках та ферментері. Склад живильного середовища, %: меляса - 4,00; кукурудзяний екстракт - 2,00; K2НРО4-0,05; KН2РО40,05; MgSO4-0,05; NaCl-0,05; СаСО3-1,05; вермикуліт - 0,40; вода водогінна - 92,35. Стерилізацію живильного середовища в автоклаві проводять при t=(123-124)°С, Р=1,2 кгс/см, =40 хвилин, 2 рН=6,4-6,5 та у ферментері при t=(126-128)°С, Р - 1,5 кгс/см , =60 хвилин, рН=6,8-7,2; 3 3 - розмноження маточної культури 1-ї генерації по 100 см в колбах, місткістю 0,5 дм (проводять водний змив біомаси робочої культури P. polymyxa KB зі скошеного агару) та 3 вирощування маточної культури 2-ї генерації по 1 дм проводять в скляних банках місткістю 3 3 дм (засівають 10 % посівного матеріалу - маточної культури 1-ї генерації від об'єму живильного середовища). Культивування бактерій проводять на мікробіологічних коливалках з частотою обертання 200-220 об./хв. при t=(28-30)°С, =(24-36) годин; - вирощування суспензії мікробного препарату Поліміксобактерину в скляних банках 3 місткістю 3 дм (засівають 10 % посівного матеріалу маточної культури 2-ї генерації від об'єму живильного середовища). Культивування бактерій проводять на мікробіологічних коливалках з частотою обертання 200-220 об./хв. при t=(28-30)°С, =(36-48) годин. Суспензія препарату 9 3 містить не менше 5×10 клітин бактерій P. polymyxa KB в 1 см ; - вирощування суспензії Поліміксобактерину у ферментері (засівають 10 % посівного матеріалу - маточної культури 2-ї генерації від об'єму живильного середовища) проводять при 2 9 t=(28-30)°С, Р=(0,3-0,4) кгс/см , =(36-48) годин, рН=7,2-8,4. Препарат містить не менше 5×10 3 клітин бактерій P. polymyxa KB в 1 см . Отриману культуральну рідину мікробний препарат Поліміксобактерин використовують для бактеризації насіння та поверхневої обробки вегетуючих рослин зернових культур, кукурудзи, соняшнику, цукрових буряків, льону-довгунця та інших сільськогосподарських культур з метою покращення кореневого фосфорного живлення (за рахунок його мобілізації в ризосфері рослин із важкорозчинних неорганічних і органічних сполук ґрунту та добрив) та росту і розвитку культурних рослин (за рахунок фітогормональної дії Поліміксобактерину), підвищення урожайності та поліпшення якості сільськогосподарської продукції. Суть корисної моделі розкривають наступні приклади конкретного застосування Поліміксобактерину у технологіях вирощування сільськогосподарських культур. Ефективність мікробного препарату Поліміксобактерину, одержаного вищеописаним способом виготовлення, 2 UA 99009 U 5 10 визначали в умовах польових дослідів. У контрольному варіанті вирощували рослини, де використовували насіння без бактеризації. Приклад 1. В умовах Полісся у польовому стаціонарному досліді на лучно-чорноземному ґрунті вивчали дію Поліміксобактерину на ступінь рухомості фосфатів у ризосферному ґрунті рослин пшениці озимої. Встановлено, що у фазі трубкування вміст Р2О5 у кореневій зоні бактеризованих рослин 3 3 становив 0,33 мг Р2О5/дм ґрунтового розчину при 0,55 мг Р2О5/дм у контрольному варіанті, а у 3 3 фазу цвітіння - від 0,28 мг Р2О5/дм до 0,48 мг Р2О5/дм , відповідно (табл. 3). Це вказує на активніше поглинання сполук фосфору з ґрунту кореневою системою бактеризованих рослин, порівняно з контрольними, завдяки підвищенню ступеня рухомості фосфатів під впливом інтродукованих в агроценоз мікроорганізмів. Таблиця 3 Дія бактеризації на ступінь рухомості фосфатів у ризосферному ґрунті рослин пшениці озимої Варіанти досліду Вміст Р2О5, мг/дм фаза трубкування фаза цвітіння фаза молочно-воскової стиглості 0,55±0,2 0,48±0,1 0,29±0,2 0,66±0,1 0,33±0,1 0,58±0,2 0,28±0,1 0,57±0,3 0,24±0,1 Без бактеризації (контроль) Р30 (суперфосфат) Поліміксобактерин 15 За дії Поліміксобактерину вміст Р2О5 у листо-стебловій масі рослин становив 0,26 %, 0,22 % та 0,19 % залежно від фази розвитку рослин при контрольних показниках на рівні 0,22 %, 0,19 %, 0,17 % відповідно (табл. 4). Таблиця 4 Загальний вміст сполук фосфору у рослинах пшениці озимої Варіанти досліду Без бактеризації (контроль) Р30 (суперфосфат) Поліміксобактерин 20 25 Вміст Р2О5, % у стеблі та листках рослин фаза молочнофаза трубкування фаза цвітіння воскової стиглості 0,22±0,02 0,19±0,01 0,17±0,02 0,27±0,02 0,23±0,01 0,20±0,01 0,26±0,01 0,22±0,01 0,19±0,01 у зерні 0,78±0,01 0,81±0,01 0,90±0,01 Підвищення ступеня рухомості фосфатів у кореневій зоні бактеризованих рослин сприяло надходженню додаткового фосфору в зерно пшениці. Так, вміст фосфору у зерні становив від 0,78 % у контролі до 0,90 % при бактеризації. Слід відмітити, що варіанти з бактеризацією за цим показником не поступалися дії суперфосфату в дозі Р30 (0,81 % Р2О5 у зерні). За розрахунками виносу фосфору зерном та соломою пшениці озимої бактеризація сприяє значному його збільшенню, що не поступається дії від застосування мінерального фосфорного добрива (табл. 5). 3 UA 99009 U Таблиця 5 Винос фосфору з урожаєм пшениці озимої за дії Поліміксобактерину Винос фосфору з урожаєм, кг/га Варіанти досліду Ефективність фосфорного * живлення зерно Без бактеризації (контроль) Р30 (суперфосфат) Поліміксобактерин солома загальний винос кг/га % 28,4 10,8 39,2 34,9 38,1 13,1 14,1 48,0 52,2 8,8 13,0 22,4 33,2 Примітка. * - різниця між показниками загального виносу фосфору з урожаєм досліджуваного і контрольного варіанту. 5 10 Так, винос фосфору зерном збільшувався від 28,4 кг/га (у контролі) до 38,1 кг/га за дії бактеризації, соломою - від 10,8 кг/га до 14,1 кг/га, відповідно. Загальний винос фосфору рослинами становив від 39,2 кг/га (у контролі) до 52,2 кг/га (при бактеризації), що на 13,0 % більше контрольних показників, тоді як при застосуванні 30 кг/га д.р. суперфосфату винос фосфору рослинами зростав лише на 4,2 %. Винос фосфору з урожаєм за використання Поліміксобактерину збільшувався порівняно з контролем на 13,0 кг/га або 33,2 %, що свідчить про підвищення ефективності фосфорного живлення рослин пшениці озимої. Приріст урожаю від бактеризації насіння склав 0,88 т/га або 22,2 % до контролю, що прирівнюється до варіанту з внесенням суперфосфату у дозі Р 30 (табл. 6). Таблиця 6 Урожайність пшениці озимої під впливом Поліміксобактерину Варіанти досліду Урожайність зерна, т/га Без бактеризації (контроль) Р30 (суперфосфат) Поліміксобактерин НІР05, т/га 15 3,96 4,89 4,84 0,07 Приріст т/га 0,93 0,88 % 23,5 22,2 Поліміксобактерин є ефективним за його використання по різних агрофонах при вирощуванні пшениці озимої. Так, зокрема, прирости урожаю від бактеризації при внесенні різних доз мінеральних добрив знаходилися в межах 0,42-0,65 т/га (табл. 7). 4 UA 99009 U Таблиця 7 Вплив мінеральних добрив та Поліміксобактерину на урожайність пшениці озимої Без інокуляції Поліміксобактерин Урожайність, т/га (середнє за три роки) 2 Без добрив 3,54 3,96 Без інокуляції Поліміксобактерин 4,03 4,53 Без інокуляції Поліміксобактерин 4,56 5,17 Варіанти досліду 1 Приріст від бактеризації т/га % 3 4 0,42 11,9 0,50 12,4 0,61 13,4 0,65 13,0 0,60 11,5 N30K20 N60K40 Без інокуляції Поліміксобактерин Без інокуляції Поліміксобактерин по досліду для добрив НІР05 для інокуляції і взаємодії 5 N90K60 5,00 5,65 N120K80 5,22 5,82 0,26 0,15 0,14 Примітно, що віддача добрив урожаєм при зростанні їх дози за використання Поліміксобактерину не зменшується. Ця обставина свідчить про можливість застосування біопрепарату за різних умов - як при екстенсивному, так і інтенсивному веденні землеробства. Приклад 2. В умовах Лівобережного Лісостепу України у польовому стаціонарному досліді на чорноземі типовому за бактеризації насіння кукурудзи Поліміксобактерином урожайність зеленої маси кукурудзи підвищувалася до 9,3 т/га або 32,4 % (табл. 8). Таблиця 8 Вплив Поліміксобактерину на урожайність зеленої маси кукурудзи Варіанти досліду Урожайність, т/га 1 Контроль - без бактеризації Поліміксобактерин Р30 Р30 + Поліміксобактерин N30 N30 + Поліміксобактерин N30P30K30 N30P30K30 + Поліміксобактерин HIP05, т/га 2 28,7 38,0 31,0 38,5 32,6 37,4 32,5 39,0 1,0 Приріст дo контролю т/га % 3 4 9,3 32,4 7,5 34,2 4,8 14,7 6,5 20,0 10 15 Поєднане застосування Поліміксобактерину та мінеральногодобрива забезпечує зростання урожайності зеленої маси кукурудзи: у дозі Р 30 на 7,5 т/га або 34,2 %, у дозі N30-4,8 т/га або 14,7 %, у дозі N30P30K30-6,5 т/га або 20,0 %. Приклад 3. В умовах Полісся України у польовому стаціонарному досліді на дерновопідзолистому ґрунті за дії Поліміксобактерину приріст зерна кукурудзи становив 1,5 т/га або 26,8 %, та вміст білка у зерні збільшувався до 2,5 % (табл. 9). 5 UA 99009 U Таблиця 9 Вплив Поліміксобактерину на урожайність зерна кукурудзи Варіанти досліду Без бактеризації Поліміксобактерин НІР05 по досліду 5 10 Урожайність зерна, т/га 5,6 7,1 0,05 Приріст Вміст протеїну, % т/га % 1,5 26,8 10,6 13,1 Приклад 4. В умовах Полісся у польовому стаціонарному досліді на чорноземі вилугуваному бактеризація насіння та поверхнева обробка вегетуючих рослин кукурудзи (у фазі до 8 листків) Поліміксобактерином сприяє підвищенню урожаю зерна на 4,0 т/га, або 56,3 % (при контролі 7,1 т/га). Приклад 5. В умовах Лівобережного Лісостепу України у польовому стаціонарному досліді на чорноземі типовому на неудобреному фоні приріст урожаю насіння соняшнику під впливом Поліміксобактерину склав 0,3 т/га або 13,0 % (табл. 10). При сумісному застосуванні з мінеральними добривами ефективність мікробного препарату становила 8,0 % на фоні внесення N30, - 8,3 % - на фоні Р30 та 7,7 % - на фоні N30Р30К30. Таблиця 10 Дія Поліміксобактерину на урожайність насіння соняшнику Варіанти досліду Урожайність, т/га Контроль - без бактеризації Поліміксобактерин Р30 Р30 + Поліміксобактерин N30 N30 + Поліміксобактерин N30P30K30 N30P30K30 + Поліміксобактерин НІР05, т/га 15 2,3 2,6 2,4 2,6 2,5 2,7 2,6 2,8 0,09 Приріст до контролю т/га % 0,3 13,0 0,2 8,3 0,2 8,0 0,2 7,7 Приклад 6. В умовах Степу на чорноземі південному при вирощуванні соняшнику по різних фонах удобрення використання Поліміксобактерину сприяє підвищенню урожайності насіння у варіанті без добрив на 0,49 т/га (на 15,8 %), при внесенні N60P40K40 на 0,75 т/га (на 22,6 %), при внесенні 40 т/га гною + N60Р30К30 - на 0,43 т/га (на 35,6 %) (табл. 11). Таблиця 11 Урожайність насіння соняшнику за дії Поліміксобактерину Варіанти досліду 2 3,11 3,60 3,32 4,07 3,54 Приріст дo контролю т/га % 3 4 0,49 15,8 0,75 22,6 4,8 0,43 Урожайність, т/га 1 Контроль - без бактеризації Поліміксобактерин N60P40K40 N60P40K40 + Поліміксобактерин 40 т/га гною + N60Р30К30 40 т/га гною + N60Р30К30 + Поліміксобактерин HIP05, т/га 0,3 6 35,6 UA 99009 U Приклад 7. В умовах Лісостепу України на чорноземі вилугуваному при вирощуванні цукрових буряків урожайність коренеплодів підвищується під впливом Поліміксобактерину на 12,8 т/га або 53,3 %, збір цукру на 2,2 т/га або 56,4 % (табл. 12). Таблиця 12 Вплив Поліміксобактерину на продуктивність цукрових буряків Варіанти досліду Контроль - без бактеризації Поліміксобактерин НІР05, т/га Приріст т/га % 12,8 53,3 Урожайність, т/га 24,0 36,8 1,9 Збір цукру, т/га 3,9 6,1 0,1 Приріст т/га % 2,2 56,4 5 Приклад 8. В умовах Західного Полісся України на дерново-підзолистому ґрунті застосування Поліміксобактерину при вирощуванні льону-довгунця сприяє збільшенню урожайності соломки до 8,6 %, насіння до 16,7 %, по фону внесення N30P60K90 приріст урожайності соломи складав 1,4 т/га та насіння - 0,2 т/га (табл. 13). 10 Таблиця 13 Урожайність соломи та насіння льону-довгунця за різних фонів удобрення Урожайність соломи, т/га Варіанти досліду Контроль бактеризації Поліміксобактерин N20P40K60 N20P40K60 + Поліміксобактерин N30P60K90 N30P60K90 Поліміксобактерин НІР05, т/га 15 без Приріст до контролю т/га % Урожайність насіння, т/га Приріст до контролю т/га % 0,6 3,8 4,3 0,3 0,8 8,6 22,9 0,7 0,7 0,1 0,1 16,7 16,7 4,6 1,1 31,4 0,8 0,2 33,3 4,5 + 3,5 1,0 28,6 0,8 0,2 33,3 4,9 1,4 40,0 0,8 0,2 33,3 0,3 0,05 Наведені результати дослідів по застосуванню Поліміксобактерину для обробки насіння та посівів сільськогосподарських культур доводять ефективність дії мікробного препарату, виготовленого запропонованим способом, та підтверджують технічний результат від використання корисної моделі. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 Спосіб виготовлення мікробного препарату Поліміксобактерину - стимулятора росту рослин, який включає приготування живильних середовищ для розмноження маточної культури бактерій Paenibacillus polymyxa KB 1-ї генерації на мікробіологічних коливалках з частотою обертання 200-220 об./хв. при t=(28-30) °С, =(24-36) годин, 2-ї генерації - з частотою обертання 200-220 об./хв. при t=(28-30) °С, =(36-48) годин та вирощування суспензії Поліміксобактерину у 2 ферментері при t=(28-30) °С, Р=(0,3-0,4) кгс/см , =(36-48) годин, рН=7,2-8,4. 25 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7