Спосіб виготовлення мікробного препарату

Реферат: Спосіб виготовлення мікробного препарату передбачає приготування окремо посівної культури бактерій роду Azotobacter та порошкоподібного субстрату, інокуляцію субстрату суспензією бактерій та висушування отриманого препарату. Використовують стерильний субстрат, який містить торф, біогумус, 50 % розчин меляси та кальцій карбонат. Висушування відбувається у паперових пакетах за температури 40-45 °C до вологості 1-10 %. UA 98869 U (12) UA 98869 U UA 98869 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Корисна модель належить до галузі сільськогосподарської мікробіології і біотехнології, а саме до виготовлення мікробних препаратів на основі бактерій роду Azotobacter та може бути використаний у технологіях вирощування овочів. Відомі способи одержання рідких біопрепаратів, що включають культивування бактерій за контрольованих умов у спеціально підготовленому поживному серeдовищі. Отримані препарати використовують для передпосівної інокуляції насіння сільськогосподарських культур із метою збільшення їх урожайності в результаті формування активної асоціації [4, 5, 6, 7]. Недоліками відомих біопрепаратів, отриманих даним способом, є нетривалий термін їх зберігання та не достатній рівень приживаності бактерій у ризосфері рослин. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб виготовлення мікробного препарату на основі бактерій роду Azotobacter із подовженим терміном зберігання та підвищеним рівнем приживаності бактерій у ризосфері рослин для підвищення урожайності овочевих культур. Поставлена задача вирішується шляхом виготовлення бактеріального препарату, що включає індукування цистоутворення мікроорганізмів-біоагентів даного препарату в результаті його висушування при температурі 40-45 °C до вологості 1-10 %. Спосіб виготовлення нового бактеріального препарату передбачає виконання наступних етапів: 1. Приготування посівної культури бактерій роду Azotobacter [1, 2, 3] шляхом вирощування в умовах періодичного культивування на мікробіологічній качалці. 2. Приготування субстрату з горфу та біогумусу з додаванням стерильного 50 % розчину меляси з кількості 6 % та кальцію карбонат (СаСО3) у кількості 3-5 % від загальної маси субстрату. Вологість наповнювача становить 25 %. Після цього субстрат фасують у термостійкі пакети і стерилізують їх в автоклаві при 1 атм. впродовж 120 хв. 3. Інокуляція субстрату суспензією бактерій роду Azotobacter та інкубування його у термостаті за температури 28±2 °C упродовж 3 діб. Вихідний титр клітин азотобактера в 1 г препарату повинен становити не менше 0,5 млрд. 4. Висушування отриманого мікробного препарату в стерильних паперових пакетах при температурі 40-45 °C до вологості 1-10 % та фасування в поліетиленові пакети. Титр препарату повинен бути не меншим за 100 млн клітин на грам субстрату. Отриманий мікробний препарат зберігається за температури 22±2 °C упродовж року. При використанні даного біопрепарату у технологіях вирощування овочевих культур приживаність бактерій роду Azotobacter зростає на 20 %, а врожайність рослин - від 10 % до 27 %. Суть корисної моделі пояснюється наступними прикладами. Приклад 1. Згідно запропонованого способу виготовлено субстрат, який інокульований різними біоагентами: A. vinelandii М-Х і консорціумом A chroococcum і A. vinelandii. Після інкубації в термостаті препарат розфасували в спеціальні пакети і висушували за температури 40-45 °C. Титр консорціуму штамів A. chroococcum і A. vinelandii та A. vinelandii М-Х у 1 г субстрату на четверту добу висушування становив 2763 млн. кл. та 2168 млн. кл. при вологості 3,2 та 4,1 % відповідно (табл. 1). Методом Віса встановлено [8], що вегетативні клітини в результаті висушування утворили цисти. Таблиця 1 Динаміка чисельності клітин бактерій роду азотобактер за висушування субстрату Тривалість висушування, діб Досліджувані показники 0 1 2 3 4 5 Субстрат, інокульований А. сhroococcum і A. vinelandii Вологість, % 37,4±0,7 26,1±0,4 18,1±0,2 9,2±0,4 3,2±0,3 2,8±0,1 Кількість життєздатних клітин в 1 г, 5864±86,6 5236±92,3 4122±72,0 3628±80,5 2763±36,8 1972±76,2 млн. Субстрат, інокульований A. vinelandii M-X Вологість, % 37,1±0,6 23,3±0,2 19,4±0,4 10,3±0,4 4,1±0,4 3,7±0,7 Кількість життєздатних клітин в 1 г, 5225±85,6 4642±87,6 3526±67,1 2968±48,3 2168±64,8 1635±46,4 млн. 45 1 UA 98869 U 5 10 15 20 Приклад 2. Подовження терміну збереженості мікроорганізмів у препаратах, інокульованих A. vinelandii М-Х та консорціумом A. chroococcum і A. vinelandii, а також із цими ж штамами бактерій, клітини яких переведені у форму цист підтверджується даними Фіг. 1. Препарати було розфасовано в спеціальні пакети і закладено на зберігання за температури 22 °C. Встановлено, що упродовж першого місяця зберігання титр всіх досліджуваних мікроорганізмів був відносно сталим (Фіг. 1), а протягом наступних трьох місяців кількість життєздатних клітин азотобактера знизилася вдвічі. Проте титр бактерій, клітини яких переведені у форму цист був вищим: у 6 разів для консорціуму A. chroococcum і A. vinelandii та у 4,5 рази для A. vinelandii M-X. Подальше зберігання цих варіантів призвело до поступового зменшення титру бактерій до рівня 133,2 млн. кл/г для консорціуму A. chroococcum і A. vinelandii, а для A. vinelandii M-X-126,8 млн. кл./г на дванадцятому місяці, що є достатнім для використання препарату у виробничих умовах. Приклад 3. Приживаність мікроорганізмів-біоагентів препарату, отриманого запропонованим способом, перевіряли в умовах вегетаційного досліду при вирощуванні цибулі ріпчастої. При бактеризації насіння препаратом на основі A. vinelandii М-Х (корисна модель) (табл. 2) чисельність мікроорганізмів у ризосфері рослин цибулі ріпчастої становила 165,2 тис. клітин/г сухого ґрунту, що на 20 % вище, ніж у варіанті із застосуванням вегетативних клітин цього ж штаму. Таблиця 2 Чисельність бактерій роду Azotobacter у ризосфері цибулі ріпчастої сорту Стригунівська носівська, вегетаційний дослід Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Препарат на основі консорціуму A. chroococcum і A. vinelandii Препарат на основі консорціуму A. chroococcum і A. vinelandii (корисна модель) Препарат на основі A. vіnelandii M-X Препарат на основі A. vinelandii M-X (корисна модель) 25 30 35 Чисельність мікроорганізмів, тис./г сухого ґрунту 0±0 104,2±2,5 121,6±3,8 138,7±1,9 165,2±3,6 Приклад 4. Вплив бактеризації на врожайність сільськогосподарських культур вивчали в польовому досліді. У результаті обліку врожайності в умовах ґрунтово-кліматичної зони Полісся було встановлено, що за обробки насіння цибулі ріпчастої сорту Стригунівська носівська препаратом на основі консорціуму A. chroococcum і A. vinelandii у стані цист приріст врожаю становив 2,7 т/га (табл. 3). Найвища врожайність цибулі ріпчастої була за обробки препаратом на основі A. vinelandii М-Х в стані цист і становила 18,6 т/га, що на 23 % вище контролю. Подібну закономірність отримано і для цибулі ріпчастої сорту Веселка в умовах ґрунтовокліматичної зони Полісся. Так, за обробки препаратом на основі консорціуму A. chroococcum і A. vinelandii урожайність становила 22,8 т/га, що на 19 % вище контролю. Використання препарату на основі A. vinelandii М-Х у стані цист забезпечило приріст врожаю 5,2 т/га (на 27 % вище контролю). 2 UA 98869 U Таблиця 3 Вплив бактеризації на врожайність цибулі ріпчастої в умовах Полісся, польовий дослід Варіанти досліду Контроль (без бактеризації) Препарат на основі консорціуму A. chroococcum і A. vinelandii у стані цист (корисна модель) Препарат на основі A. vinelandii М-Х у стані цист (корисна модель) 5 Сорт Стригунівська носівська Урожайність Приріст т/га т/га % 15,1 Сорт Веселка Урожайність т/га 19,1 Приріст т/га % 17,8 2,7 18 22,8 3,7 19 18,6 3,5 23 24,3 5,2 27 Вплив бактеризації на врожайність капусти білоголової сорту Леся вивчали в умовах ґрунтово-кліматичної зони Лісостепу (табл. 4). У результаті обліку врожайності було встановлено, що за обробки насіння препаратом на основі A. vinelandii M-X у стані цист приріст врожаю становив 5,9 т/га (на 10 % вище контролю). Таблиця 4 Вплив бактеризації на врожайність капусти білоголової сорту Леся в умовах Лісостепу, польовий дослід Варіанти досліду Контроль (без бактеризації) Препарат на основі A. chroococcum і A. vinelandii у стані цист (корисна модель) 10 Урожайність, т/га Приріст 51,9 т/га % 57,8 5,9 10 У результаті обліку врожайності моркви сорту Нантська харківська було встановлено (табл. 5), що за обробки насіння препаратом на основі A. vinelandii M-X у стані цист приріст врожаю становив 2,5 т/га, що на 12 % вище контролю. Таблиця 5 Вплив бактеризації на врожайність моркви сорту Нантська харківська в умовах Лісостепу, польовий дослід Варіанти досліду Контроль (без бактеризації) Препарат на основі A. chroococcum і A. vinelandii у стані цист (корисна модель) 15 20 25 Урожайність, т/га Приріст 21,8 т/га % 24,3 2,5 12 Джерела інформації: 4 1. АC CРСР №1459183, МПК С05F 11/08, С12N 1/20, С12R 1:065). Штамм бактерий Azotobacter vinelandii для производства бактериального удобрения под кормовую свеклу / Ю.М. Мочалов, В.И. Канивец. - № 4133167/31-13; заявл. 08.10.86; опубл. 03.01.1989. 4 2. АC CРСР №1476831, МПК С05F 11/08. Консорциум штаммов бактерий Azotobacter chroococcum и Azotobacter vinelandii для производства бактериальных удобрений под кормовую свеклу и капусту / Ю.М. Мочалов, В.И. Канивец. - № 4086625/30-13; заявл. 02.07.86; опубл. 03.01.1989. 4 3. АC CРСР №1459184, МПК С05F 11/08, С12N 1/20 // (С12N 1/20, С12R 1:065). Штамм бактерий Azotobacter chroococcum для производства удобрения азотобактерина под кормовую свеклу и овощные культуры / Ю.М. Мочалов. - № 4085950/22-13; заявл. 02.07.86; опубл. 03.01.1989. 4. Біологічний азот / [В.П. Патика, С.Я. Коць, В.В. Волкогон та ін.]. - К.: Світ, 2003. - 422 с. 3 UA 98869 U 5 10 5. Методологія і практика використання мікробних препаратів у технологіях вирощування сільськогосподарських культур / [В.В. Волкогон, A.С. Заришняк, І.В. Гринник та ін.]; за ред. В.В. Волкогона. - К.: Аграрна наука, 2011. - 155 с. 6. Мікробні препарати у землеробстві. Теорія і практика: [монографія] / [Волкогон В.В., Надкернична О.В., Ковалевська Т.М. та ін.]; за ред B.В. Волкогона. - К.: Аграрна наука, 2006. 311 с 7. Рекомендації з ефективного застосування мікробних препаратів у технологіях вирощування сільськогосподарських культур. - К., 2007. - 52 с. 8. Wyss О. Development and germination of the Azotobacter cyst / Wyss O., Neumann M.G., Socolofsky M.D. // Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. - 1961. - № 10. – С. 555-565. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 Спосіб виготовлення мікробного препарату, що передбачає приготування окремо посівної культури бактерій роду Azotobacter та порошкоподібного субстрату, інокуляцію субстрату суспензією бактерій та висушування отриманого препарату, який відрізняється тим, що використовують стерильний субстрат, який містить торф, біогумус, 50 % розчин меляси та кальцій карбонат, а висушування відбувається у паперових пакетах за температури 40-45 °C до вологості 1-10 %. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4