Способи підвищення врожайності резистентних до 2,4-d сільськогосподарських культур

Реферат: Даний винахід стосується способів підвищення висоти рослин і/або врожайності сільськогосподарських культур, резистентних до гербіциду 2,4-D, за допомогою обробки 2,4-D при нормах внесення, що не є шкідливими для рослин. Зокрема, винахід стосується способу з використанням нанесення 2,4-D для підвищення врожайності сільськогосподарських культур, які експресують ген AAD-12 для резистентності до 2,4-D. Спосіб, що надається, представляє конкретний інтерес для обробки сільськогосподарських рослин, включаючи кукурудзу, сою, ріпак, з якого отримують олію, що використовується у весняний і зимовий сезон (канолу), цукровий буряк, пшеницю, соняшник, ячмінь і рис. UA 113882 C2 (12) UA 113882 C2 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ По даній заявці заявляється пріоритет по попередній заявці США № 61/656546, зареєстрованій 7 червня 2012 року, опис якої, таким чином, явно включений як посилання в повному об'ємі. ВКЛЮЧЕННЯ МАТЕРІАЛУ, ПОДАНОГО В ЕЛЕКТРОННОМУ ВИГЛЯДІ, ЯК ПОСИЛАННЯ Включеним в повному об'ємі як посилання є машиночитаний список послідовностей, який поданий одночасно із заявкою і визначений таким чином: один файл розміром 11342 байт ASCII (текстовий) під назвою "72747_ST25.txt", створений 13 травня 2013 року. ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Бур'яни можуть швидко виснажувати вміст в ґрунті корисних поживних речовин, необхідних для сільськогосподарських культур і інших бажаних рослин. Існує велика кількість типів гербіцидів, що використовуються в цей час для контролю бур'янів. Одним з дуже популярних гербіцидів є гліфосат. Розроблені сільськогосподарські культури, такі як кукурудза, соя, канола, бавовна, цукровий буряк, пшениця, газонна трава і рис, резистентні до гліфосату. Таким чином, поля з активно зростаючою кукурудзою, резистентною до гліфосату, наприклад, можна обприскувати для контролю бур'янів без значного пошкодження рослин кукурудзи. З впровадженням генетично сконструйованих, стійких до гліфосату сільськогосподарських культур (GTC) в середині 1990-х років сільгоспвиробники отримали простий, зручний, гнучкий і недорогий інструмент для контролю широкого спектра широколистяних і трав'янистих бур'янів, що не має аналогів в сільському господарстві. Таким чином, виробники швидко прийняли GTC і в багатьох випадках відмовилися від багатьох з кращих загальноприйнятих агрономічних прийомів, таких як сівозміна, сівозміна в комбінації з дією гербіцидів, використання бакової суміші, впровадження механічного контролю разом з хімічним і культуральним контролем бур'янів. У цей час толерантні до гліфосату соя, бавовна, кукурудза і канола є комерційно доступними в США і в інших областях Західної півкулі. Все більше GTC (наприклад, пшениця, рис, цукровий буряк, газонна трава, і т. д.) готові для впровадження, очікуючи прийняття на глобальному ринку. Багато інших резистентних до гліфосату видів знаходяться в стадії від експерименту до розробки (наприклад, люцерна, цукрова тростина, соняшник, буряк, горох, морква, огірок, латук, цибуля, полуниці, помідор і тютюн; лісогосподарські види, такі як тополя і лівідамбар; і садівничі види, такі як чорнобривці, петунія і бегонія; див. "веб-сайт isb.vt.edu/cfdocs/fieldtestsl.cfm, 2005"). Крім того, вартість гліфосату за останні роки значно знизилася до такої точки, що декілька програм загальноприйнятого контролю бур'янів можуть ефективно конкурувати по ціні і дії з системами гліфосат-GTC. Гліфосат успішно використовують для знищення бур'янів і в інших несільськогосподарських галузях для тотальної боротьби з бур'янами протягом більше 15 років. У багатьох випадках, як і з GTC, гліфосат використовують 1-3 разів на рік протягом 3, 5, 10, до 15 років підряд. Ці обставини привели до надмірного довір'я до гліфосату і технології GTC і важкого тиску відбору відносно місцевих видів бур'янів на користь рослин, які є від природи більш стійкими до гліфосату або у яких розвинувся механізм резистентності до гербіцидної активності гліфосату. Широке використання програм контролю бур'янів тільки за допомогою гліфосату приводить до селекції резистентних до гліфосату бур'янів і є селективним для розмноження видів бур'янів, від природи більш стійких до гліфосату, ніж більшість видів-мішеней (тобто зсуви в популяціях бур'янів). (Ng et al., 2003; Simarmata et al, 2003; Lorraine-Colwill et al, 2003; Sfiligoj, 2004; Miller et al, 2003; Heap, 2005; Murphy et al., 2002; Martin et al., 2002). Хоча гліфосат широко використовують по всьому світу протягом більше 15 років, повідомляють, що тільки у невеликої кількості бур'янів розвинулася резистентність до гліфосату (Heap, 2005); однак, більшість з них ідентифікували в останні 3-5 років. Резистентні бур'яни включають трав'янисті і широколистяні види - Lolium rigidum, Lolium multiflorum, Eleusine indica, Ambrosia artemisiifolia, Conyza canadensis, Conyza bonariensis і Plantago lanceolata. Крім того, бур'яни, що раніше не являли собою агрономічну проблему до широкого використання GTC, тепер стають все більш поширеними і важкоконтрольованими у випадку GTC, що займають >80 % акрів бавовни і сої в США і >20 % акрів кукурудзи в США (Gianessi, 2005). Ці зсуви в популяціях бур'янів переважно (але не виключно) відбуваються у важкоконтрольованих широколистяних бур'янів. Деякі приклади включають види Ipomoea, Amaranthus, Chenopodium, Taraxacum і Commelina. У областях, де сільгоспвиробники стикаються з резистентними до гліфосату бур'янами або зсувами в сторону більш важкоконтрольованих видів бур'янів, сільгоспвиробники можуть компенсувати недостатність дії гліфосату використанням його в баковій суміші або заміною іншими гербіцидами, за допомогою яких будуть контролювати упущені бур'яни. Одним з популярних і ефективних засобів для використання в баковій суміші для контролю 1 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 широколистяних диких рослин в багатьох випадках є 2,4-дихлорфеноксіоцтова кислота (2,4-D). 2,4-D використовують в агрономії і в несільськогосподарських умовах широкого спектра для контролю широколистяних бур'янів протягом більше 60 років. Повідомляють про окремі випадки стійких видів, але 2,4-D залишається одним з гербіцидів, що найбільш широко використовується по всьому світу. Обмеженням для подальшого використання 2,4-D є те, що його селективність у випадку дводольних сільськогосподарських культур, таких як соя або бавовна, дуже погана, і, таким чином, 2,4-D, як правило, не використовують на (і, як правило, не поблизу) чутливих дводольних сільськогосподарських культур. Крім того, використання 2,4-D у випадку трав'янистих сільськогосподарських культур в деякій мірі обмежене природою пошкодження сільськогосподарських культур, яке може відбуватися. 2,4-D в комбінації з гліфосатом використовують для забезпечення більш надійної burndown обробки перед посадкою сої і бавовни з нульовою обробкою ґрунту; однак, внаслідок чутливості цих дводольних видів до 2,4D, цю burndown обробку необхідно провести щонайменше за 14-30 днів до посадки (Agriliance, 2003). 2,4-D належить до феноксикислотного класу гербіцидів, як і MCPA. 2,4-D використовують у випадку багатьох однодольних сільськогосподарських культур (таких як кукурудза, пшениця і рис) для селективного контролю широколистяних бур'янів без істотного пошкодження бажаних сільськогосподарських культур. 2,4-D є синтетичним похідним ауксину, діючим, порушуючи регуляцію нормального клітинно-гормонального гомеостазу і перешкоджаючи збалансованому, контрольованому росту; однак, точний механізм дії все ще невідомий. Триклопір і флуроксипір є гербіцидами на основі піридилоксіоцтової кислоти, механізм дії яких також є таким, як у синтетичного ауксину. Ці гербіциди мають різні рівні селективності відносно конкретних рослин (наприклад, дводольні рослини є більш чутливими, ніж трав'янисті рослини). Відмінності метаболізму у різних рослин є одним з пояснень різних рівнів селективності. У основному, рослини повільно метаболізують 2,4-D, таким чином, різну відповідь рослин на 2,4-D, більш ймовірно, можна пояснити різною активністю в сайтах-мішенях (WSSA, 2002). Метаболізм 2,4-D у рослин, як правило, відбувається за допомогою двофазного механізму, як правило, гідроксилування з подальшою кон'югацією з амінокислотами або глюкозою (WSSA, 2002). З плином часу в популяціях мікроорганізмів з'явився альтернативний і ефективний шлях деградації цього конкретного ксенобіотику, що приводить до повної мінералізації 2,4-D. Подальше нанесення гербіциду приводить до селекції мікроорганізмів, які можуть використовувати гербіцид як джерело вуглецю для росту, забезпечуючи їм конкурентну перевагу в ґрунті. З цієї причини 2,4-D, який складається в цей час має, відносно короткий час напівжиття в ґрунті, і не виявляє значних перехідних ефектів відносно подальших сільськогосподарських культур. Це підвищує застосовність 2,4-D як гербіциду. Одним з організмів, що піддається широким дослідженням на предмет його здатності деградувати 2,4-D, є Ralstonia eutropha (Streber et al., 1987). Кодуючим геном на першому ферментативному етапі циклу мінералізації, є tfdA. Див. патент США № 6153401 і GENBANK реєстр. № M16730. TfdA каталізує перетворення кислоти 2,4-D в дихлорфенол (DCP) через реакцію α-кетоглутарат-залежної діоксигенази (Smejkal et al., 2001). DCP має невисоку гербіцидну активність в порівнянні з 2,4-D. TfdA використовують в трансгенних рослинах для надання резистентності до 2,4-D дводольних рослин (наприклад, бавовни і тютюну), в нормі чутливим до 2,4-D (Streber et al. (1989), Lyon et al. (1989), Lyon (1993) і патент США № 5608147). Велика кількість генів tfdA-типу, що кодують білки, здатні деградувати 2,4-D, ідентифіковані в навколишньому середовищі і депоновані в базі даних Genbank. Багато гомологів схожі з tfdA (>85 % ідентичності амінокислот) і мають схожі з tfdA ферментативні властивості. Однак, існує ряд гомологів, що мають значно меншу ідентичність відносно tfdA (25-50 %), але мають +2 характерні залишки, асоційовані з α-кетоглутарат-залежними Fe -діоксигеназами. Таким чином, не зрозумілі субстратні специфічності цих дивергентних діоксигеназ. Одним унікальним прикладом низької гомології відносно tfdA (31 % ідентичності амінокислот) є sdpA з Delftia acidovorans (Kohler et al., 1999, Westendorf et al., 2002, Westendorf et al., 2003). Показано, що цей фермент каталізує перший етап в мінералізації (S)-дихлорпропу (і інших (S)-феноксипропіонових кислот), а також 2,4-D (феноксіоцтової кислоти) (Westendorf et al., 2003). До цього часу не повідомляли про використання цього гена в трансформації рослин. Розробка нових технологій стійких до гербіцидів сільськогосподарських культур (HTC) має обмежений успіх, головним чином, внаслідок ефективності, низької вартості і зручності GTC. Таким чином, серед виробників має місце дуже високий рівень впровадження GTC. Це приводить до низької мотивації для розробки нових технологій HTC. 2 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Арилоксіалканоатні хімічні субструктури є поширеними речовинами в багатьох комерційних гербіцидах, включаючи феноксіацетатауксини (такі як 2,4-D і дихлорпроп), піридилоксіацетатауксини (такі як флуроксипір і триклопір), арилоксифеноксипропіонатні (AOPP) інгібітори ацетил-кофермент А карбоксилази (ACCase) (такі як галоксифоп, квізалофоп, і диклофоп) і 5-заміщені феноксіацетатні інгібітори протопорфіриногеноксидази IX (такі як пірафлуфен і флуміклорак). Однак ці класи гербіцидів є абсолютно різними, і в сучасній літературі немає доказів загальних шляхів деградації серед цих класів хімічних речовин. Нещодавно описаний мультифункціональний фермент для деградації гербіцидів, які охоплюють множину типів дії (PCT US/2005/014737; зареєстрованої 2 травня 2005 року). СУТЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується способів підвищення висоти рослин і/або врожайності сільськогосподарських культур, резистентних до гербіциду 2,4-D, за допомогою обробки рослин 2,4-D при нормах внесення, що не є шкідливими для рослин. Зокрема, винахід стосується способу з використанням обробки 2,4-D для підвищення врожайності сільськогосподарських культур, які експресують ген AAD-12 для резистентності до 2,4-D. Цей винахід додатково стосується застосування 2,4-D для поліпшення врожайності сільськогосподарських культур, що є резистентними до 2,4-D. Спосіб, що надається, представляє конкретний інтерес для обробки сільськогосподарських рослин, включаючи кукурудзу, сою, озимий і яровий ріпак, (канолу), цукровий буряк, пшеницю, соняшник, ячмінь і рис. У деяких варіантах здійснення резистентні до 2,4-D сільськогосподарські культури є трансгенними сільськогосподарськими культурами, трансформованими арилоксіалканоатдіоксигеназою (AAD). У додатковому варіанті здійснення арилоксіалканоатдіоксигеназа (AAD) є AAD-1 або AAD-12. AAD-1 раніше описана в патенті США 2009/0093366, а AAD-12 раніше описана в WO 2007/053482, повний зміст яких включений в даний опис як посилання. Підвищуючий врожайність ефект обробки 2,4-D можна спостерігати при нормах внесення від 25 г ке/га до 5000 г ке/га, або від 100 г ке/га до 2500 г ке/га, або, зокрема, від 1000 г ке/га до 2000 г ке/га. У одному з варіантів здійснення використовують від 1000 г ке/га до 1500 г ке/га 2,4D. У іншому варіанті здійснення використовують від 2000 г ке/га до 2500 г ке/га. Крім того, цей підвищуючий врожайність ефект обробки 2,4-D є особливо вираженим при нанесенні 2,4-D в фазу від 2 до 8 листків сільськогосподарських культур до цвітіння. Однак необхідна норма внесення і/або фаза зростання сільськогосподарської культури варіюється залежно від рослин, їх росту і кліматичних умов. Термін "підвищення" врожайності означає, що врожайність рослини підвищується на 50 % або більше. У одному з варіантів здійснення підвищення врожайності становить щонайменше 10 %. У іншому варіанті здійснення підвищення врожайності становить щонайменше 20 %. У іншому варіанті здійснення підвищення врожайності становить від 10 % до 60 %. У іншому варіанті здійснення підвищення врожайності становить від 20 % до 50 %. У іншому варіанті здійснення підвищення врожайності є статистично значущим. Активність 2,4-D, що посилює зростання, відносно резистентних до 2,4-D сільськогосподарських культур можна вимірювати в польових випробуваннях або вегетаційних дослідах. Про гербіцид, що має різний механізм дії, як правило, відомо, чи надає він несприятливий вплив на врожайність, або чи не впливає на врожайність. Один з аспектів стосується способу підвищення врожайності резистентних до 2,4-D сільськогосподарських культур, що включає обробку рослин стимулюючою кількістю гербіциду, що містить залишок арилоксіалканоату. У одному з варіантів здійснення резистентні до 2,4-D сільськогосподарські культури є трансгенними рослинами, трансформованими з використанням арилоксіалканоатдіоксигенази (AAD). У додатковому варіанті здійснення арилоксіалканоатдіоксигеназа (AAD) є AAD-1 або AAD-12. У іншому варіанті здійснення гербіцид, що містить залишок арилоксіалканоату, є фенокси-гербіцидом або феноксіоцтовим гербіцидом. У додатковому варіанті здійснення гербіцид, що містить залишок арилоксіалканоату, є 2,4-D. У додатковому варіанті здійснення 2,4-D містить 2,4-D-холін або 2,4-D-диметиламін (DMA). У одному з варіантів здійснення трансгенні рослини, трансформовані з використанням арилоксіалканоатдіоксигенази, (AAD) вибрані з бавовни, сої і каноли. У іншому варіанті здійснення обробку здійснюють щонайменше один раз при нормі внесення 2,4-D, що використовується також для контролю бур'янів. У іншому варіанті здійснення обробку здійснюють два рази при нормі внесення 2,4-D, що використовується також для контролю бур'янів. У додатковому варіанті здійснення 2,4-D наносять в фази росту V3 і R2 сої зі стійкістю до 2,4-D. У іншому варіанті здійснення обробку здійснюють щонайменше три рази при нормі 3 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 внесення 2,4-D, що використовується також для контролю бур'янів. У іншому варіанті здійснення гербіцид, що містить залишок арилоксіалканоату, досягає резистентних до 2,4-D сільськогосподарських культур за допомогою поглинання корінням. У іншому варіанті здійснення для контролю бур'янів резистентні до 2,4-D сільськогосподарські культури також обробляють гербіцидом, іншим, ніж 2,4-D. У додатковому варіанті здійснення гербіцид, інший, ніж 2,4-D, є фосфорним гербіцидом або арилоксифеноксипропіоновим гербіцидом. У додатковому варіанті здійснення фосфорний гербіцид включає гліфосат, глуфосинат, їх похідні або їх комбінації. У додатковому варіанті здійснення фосфорний гербіцид знаходиться в формі солі амонію, солі ізопропіламонію, солі ізопропіламіну або солей калію. У іншому варіанті здійснення фосфорний гербіцид досягає резистентних до 2,4-D сільськогосподарських культур за допомогою поглинання корінням. У іншому варіанті здійснення арилоксифеноксипропіоновий гербіцид включає хлоразифоп, феноксапроп, флуазифоп, галоксифоп, квізалофоп, їх похідні або їх комбінації. У додатковому варіанті здійснення арилоксифеноксипропіоновий гербіцид досягає резистентних до 2,4-D сільськогосподарських культур за допомогою поглинання корінням. У одному з варіантів здійснення резистентні до 2,4-D сільськогосподарські культури обробляють щонайменше один раз при дозі від 25 г ке/га до 5000 г ке/га 2,4-D. У іншому варіанті здійснення резистентні до 2,4-D сільськогосподарські культури обробляють щонайменше один раз при дозі від 100 г ке/га до 2000 г ке/га 2,4-D. У іншому варіанті здійснення резистентні до 2,4-D сільськогосподарські культури обробляють щонайменше один раз при дозі від 100 г ке/га до 2500 г ке/га 2,4-D. У іншому варіанті здійснення резистентні до 2,4-D сільськогосподарські культури обробляють щонайменше один раз при дозі від 1000 г ке/га до 2000 г ке/га 2,4-D. У додатковому варіанті здійснення 2,4-D включає 2,4-D-холін або 2,4-D-диметиламін (DMA). Один з варіантів здійснення стосується способу підвищення врожайності резистентних до 2,4-D сільськогосподарських культур. Спосіб включає (a) трансформацію рослинних клітин з використанням молекули нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує арилоксіалканоатдіоксигеназу (AAD); (b) селекцію трансформованих клітин; (с) регенерацію рослин з трансформованих клітин; і (d) обробку рослин стимулюючою кількістю гербіциду, що містить залишок арилоксіалканоату. У одному з варіантів здійснення арилоксіалканоатдіоксигеназа (AAD) є AAD-1 або AAD-12. У іншому варіанті здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить селективний маркер, що не є арилоксіалканоатдіоксигеназою (AAD). У додатковому варіанті здійснення або альтернативному варіанті здійснення селективний маркер є геном фосфінотрицинацетилтрансферази (pat) або геном резистентності до біалафосу (bar). У іншому варіанті здійснення молекула нуклеїнової кислоти оптимізована для рослин. Інший аспект стосується застосування гербіциду, що містить залишок арилоксіалканоату, у виробництві трансгенних рослин з резистентністю до 2,4-D з підвищеною врожайністю в порівнянні з їх нетрансгенними батьківськими рослинами. У одному з варіантів здійснення гербіцид, що містить залишок арилоксіалканоату, є 2,4-D. У додатковому варіанті здійснення 2,4-D наносять щонайменше один раз при дозі від 25 г ке/га до 5000 г ке/га 2,4-D. У іншому варіанті здійснення 2,4-D наносять щонайменше один раз при дозі від 100 г ке/га до 2000 г ке/га 2,4-D. У іншому варіанті здійснення 2,4-D наносять щонайменше один раз при дозі від 100 г ке/га до 2500 г ке/га 2,4-D. У іншому варіанті здійснення 2,4-D наносять щонайменше один раз при дозі від 1000 г ке/га до 2000 г ке/га 2,4-D. У додатковому варіанті здійснення 2,4-D включає 2,4-D-холін або 2,4-D-диметиламін (DMA). У додатковому варіанті здійснення резистентні до 2,4-D сільськогосподарські культури обробляють 2,4-D щонайменше два рази перед цвітінням. У іншому варіанті здійснення резистентні до 2,4-D сільськогосподарські культури є трансгенними рослинами, трансформованими з використанням арилоксіалканоатдіоксигенази (AAD). У додатковому варіанті здійснення арилоксіалканоатдіоксигеназа (AAD) є AAD-1 або AAD-12. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ І ПОСЛІДОВНОСТЕЙ На фіг. 1 представлена загальна хімічна реакція, яка каталізується ферментами AAD-12 за даним винаходом. На фіг. 2 представлена типова карта плазміди pDAB4468. На фіг. 3 представлена типова карта плазміди pDAS1740. SEQ ID NO: 1 являє собою нуклеотидну послідовність AAD-12 з Delftia acidovorans. SEQ ID NO: 2 являє собою трансльовану білкову послідовність, що кодується SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 3 являє собою оптимізовану для рослин нуклеотидну послідовність AAD-12 (v1). SEQ ID NO: 4 являє собою трансльовану білкову послідовність, що кодується SEQ ID NO: 3. 4 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO: 5 являє собою оптимізовану для Е. coli нуклеотидну послідовність AAD-12 (v2). SEQ ID NO: 6 являє собою послідовність прямого праймера M13. SEQ ID NO: 7 являє собою послідовність зворотного праймера M13. SEQ ID NO: 8 являє собою послідовність прямого праймера PTU AAD-12 (v1). SEQ ID NO: 9 являє собою послідовність зворотного праймера PTU AAD-12 (v1). SEQ ID NO: 10 являє собою послідовність прямого праймера для ПЛР кодуючої області AAD-12 (v1). SEQ ID NO: 11 являє собою послідовність зворотного праймера для ПЛР кодуючої області AAD-12 (v1). SEQ ID NO: 12 являє собою послідовність "праймера sdpacodF" AAD-12 (v1). SEQ ID NO: 13 являє собою послідовність "праймера sdpacodR" AAD-12 (v1). SEQ ID NO: 14 являє собою послідовність "праймера Nco1 °F Brady". SEQ ID NO: 15 являє собою послідовність "праймера Sac1 °F Brady". ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Як застосовують в даному описі, фраза "трансформований" або "трансформація" стосується вбудовування ДНК в клітину. Фрази "трансформант" або "трансгенний" стосуються рослинних клітин, рослин і т. п., трансформованих або підданих трансформації. Вбудовувана ДНК, як правило, знаходиться в формі вектора, що містить вставку ДНК. Як застосовують в даному описі, фраза "селективний маркер" або "ген селективного маркера" стосується гена, необов'язково, що використовується в трансформації рослин, наприклад, для захисту рослинних клітин від селективного засобу або забезпечення резистентності/стійкості до селективного засобу. Тільки ті клітини або рослини, які отримували функціональний селективний маркер, здатні ділитися або рости в умовах наявності селективного засобу. Приклади селективних засобів можуть включати, наприклад, антибіотики, включаючи спектиноміцин, неоміцин, канаміцин, паромоміцин, гентаміцин і гігроміцин. Ці селективні маркери включають ген неоміцинфосфотрансферази (npt II), експресуючий фермент, що додає резистентності до антибіотика канаміцину, і гени для споріднених антибіотиків неоміцину, паромоміцину, гентаміцину і G418, або гена гігроміцинфосфотрансфераза (hpt), експресуючий фермент, що додає резистентності до гігроміцину. Інші гени селективних маркерів можуть включати гени, що кодують резистентність до гербіциду, включаючи Bar (резистентності до BASTA® (глуфосинат амонію) або фосфінотрицину (PPT)), ацетолактатсинтазу (ALS, резистентність до інгібіторів, таких як сульфонілкарбаміди (SU), імідазолінони (IMI), триазолопіримідини (TP), піримідинілоксибензоати (POB) і сульфоніламінокарбонілтриазолінони, що запобігають першому етапу синтезу амінокислот з розгалуженим ланцюгом, гліфосату, 2,4-D і резистентності або чутливості до металів. Фраза "маркер-позитивний" стосується рослин, трансформованих з включенням гена селективного маркера. У вибраний експресуючий вектор можна вбудовувати різні селективні або детектовані маркери, роблячи можливою ідентифікацію і селекцію трансформованих рослин, або трансформантів. Доступна множина способів підтвердження експресії селективних маркерів в трансформованих рослинах, включаючи, наприклад, секвенування ДНК і ПЛР (полімеразну ланцюгову реакцію), Саузерн-блотинг, РНК-блотинг, імунологічні способи визначення білка, що експресується з вектора, наприклад, преципітованого білка, білків репортерних генів - до фосфінотрицину, або інших білків, таких як β-глюкуронідаза (GUS), люцифераза, зелений флуоресцентний білок (GFP), DsRed, β-галактозидаза, хлорамфеніколацетилтрансфераза (CAT), лужна фосфатаза і т. п. (див. Sambrook, et al., Molecular Cloning: А Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001, зміст якого включений в даний опис як посилання в повному об'ємі). Гени селективних маркерів використовують для селекції трансформованих клітин або тканин. Гени селективних маркерів включають гени, що кодують резистентність до антибіотиків, такі як гени, що кодують неоміцинфосфотрансферазу II (NEO) і гігроміцинфосфотрансферазу (HPT), а також гени, що додають резистентності до гербіцидних сполук. Гени резистентності до гербіцидів, як правило, кодують модифікований білок-мішень, нечутливий до гербіциду, або деградуючий фермент, або детоксифікуючий гербіцид в рослині до того, як він може подіяти. Див. DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513-2518; DeBlock et al. (1989) Plant Physiol., 91:691-704; Fromm et al. (1990) 8:833-839; Gordon-Kamm et al. (1990) 2:603-618). Наприклад, резистентності до гліфосату або сульфонілкарбамідних гербіцидів досягали з використанням генів, що кодують мутантні ферменти-мішені 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтетазу (EPSPS) і ацетолактатсинтазу (ALS). Резистентності до глуфосинату амонію, бромоксинілу і 2,4дихлорфеноксіацетату (2,4-D) досягали з використанням бактеріальних генів, що кодують 5 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фосфінотрицинацетилтрансферазу, нітрилазу або 2,4-дихлорфеноксіацетатмонооксигеназу, детоксифікуючі відповідні гербіциди. Ферменти/ген резистентності до 2,4-D раніше описані в патенті США № 2009/0093366 і WO 2007/053482, зміст яких, таким чином, включений в даний опис як посилання в повному об'ємі. Інші гербіциди можуть інгібувати конус наростання або меристему, включаючи імідазолінон або сульфонілкарбамід. Приклади генів цієї категорії кодують мутантні ферменти ALS і AHAS, як описано, наприклад, в Lee et al., EMBO J. 7: 1241 (1988); і Miki et al., Theon. Appl. Genet. 80:449 (1990), відповідно. Гени резистентності до гліфосату включають мутантні гени 5-енолпірувілшикімат-3фосфатсинтетази (EPSP) (за допомогою вбудовування рекомбінантних нуклеїнових кислот і/або різних форм мутагенезу in vivo нативних генів EPSP), гени aroA і гени гліфосатацетилтрансферази (GAT), відповідно. Гени резистентності до інших фосфонових сполук включають гени глуфосинат (гени фосфінотрицинацетилтрансферази (PAT) з видів Streptomyces, включаючи Streptomyces hygroscopicus і Streptomyces viridichromogenes) і піридинокси- або феноксипропіонові кислоти і циклогексони (гени, що кодують інгібітор ACCase). Див., наприклад, патент США № 4940835 Shah, et al. і патент США № 6248876 Barry et al., в яких описують нуклеотидні послідовності форм EPSP, які можуть додавати рослині резистентності до гліфосату. Молекулу ДНК, що кодує мутантний ген aroA, можна отримувати в ATCC під реєстраційним номером 39256, і нуклеотидна послідовність мутантного гена описана в патенті США № 4769061 Comai, європейській патентній заявці № 0 333 033 Kumada et al. і патенті США № 4975374 Goodman et al., в яких описують нуклеотидні послідовності генів глутамінсинтетази, що додають резистентності до гербіцидів, таких як L-фосфінотрицин. Нуклеотидна послідовність гена PAT представлена в європейській патентній заявці № 0 242 246 Leemans et al. Крім того, в DeGreef et al., Bio/Technology 7:61 (1989) описують отримання трансгенних рослин, експресуючих химерні гени bar, що кодують активність PAT. Прикладами генів, що додають резистентності до феноксипропіонових кислот і циклогексонів, включаючи сетоксидим і галоксифоп, є гени Acc1-S1, Acc1-S2 і Acc1-S3, що описуються в Marshall et al., Theon. Appl. Genet. 83:435 (1992). Гени GAT, здатні додавати резистентності до гліфосату, описують в WO 2005012515 Castle et al. Гени, що додають резистентності до гербіцидів 2,4-D, фоп і піридилоксіауксину, описують в WO 2005107437 і патентній заявці США з серійним № 11/587893. Інші гербіциди можуть інгібувати фотосинтез, включаючи триазин (гени psbA і 1s+) або бензонітрил (ген нітрилази). У Przibila et al., Plant Cell 3: 169 (1991) описують трансформацію Chlamydomonas з використанням плазмід, що кодують мутантні гени psbA. Нуклеотидні послідовності генів нітрилази описують в патенті США № 4810648 Stalker, і молекули ДНК, що містять ці гени, доступні в ATCC під реєстраційними №№ 53435, 67441 і 67442. Клонування і експресію ДНК, що кодує глутатіон-S-трансферазу, описують в Hayes et al., Biochem. J. 285: 173 (1992). У цілях за даним винаходом, гени селективних маркерів включають, як необмежувальні приклади, гени, які кодують: неоміцинфосфотрансферазу II (Fraley et al. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science, 4: 1-25); ціанамідгідратазу (Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4250-4264); аспартаткіназу; дигідродипіколінатсинтетазу (Perl et al. (1993) Bio/Technology, 11:715-718); триптофандекарбоксилазу (Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Bio., 22:907-912); дигідродипіколінатсинтетазу і десенсибілізовану аспартаткіназу (Perl et al. (1993) Bio/Technology, 11:715-718); ген bar (Toki et al. (1992) Plant Physiol., 100: 1503-1507 і Meagher et al. (1996) and Crop Sci., 36: 1367); триптофандекарбоксилазу (Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol., 22:907-912); неоміцинфосфотрансферазу (NEO) (Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen., 1:327; гігроміцинфосфотрансферазу (HPT або HYG) (Shimizu et al. (1986) Mol. Cell Biol., 6: 1074); дигідрофолатредуктазу (DHFR) (Kwok et al. (1986) PNAS USA 4552); фосфінотрицинацетилтрансферазу (DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513); дегалогеназу 2,2дихлорпропіонової кислоти (Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330); синтетазу ацетогідроксикислот (Anderson et al., патент США № 4761373; Haughn et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266); 5-енолпірувілшикіматфосфатсинтетазу (aroA) (Comai et al. (1985) Nature 317:741); галоарилнітрилазу (Stalker et al., опублікована заявка PCT WO87/04181); ацетил-кофермент А карбоксилазу (Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92: 1220); дигідроптероатсинтетазу (sul I) (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15: 127); і поліпептид фотосистеми II масою 32 кДа (psbA) (Hirschberg et al. (1983) Science, 222: 1346). Також включені гени, що кодують резистентність до: хлорамфеніколу (Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J., 2:987-992); метотрексату (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature, 303:209-213; Meijer et al. (1991) Plant Mol Bio., 16:807-820 (1991); гігроміцину (Waldron et al. (1985) Plant Mol. 6 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Biol., 5: 103-108; Zhijian et al. (1995) Plant Science, 108:219-227 і Meijer et al. (1991) Plant Mol. Bio. 16:807-820); стрептоміцину (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet., 210:86-91); спектиноміцину (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res., 5: 131-137); блеоміцину (Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol., 7: 171-176); сульфонаміду (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Bio., 15: 127-136); бромоксинілу (Stalker et al. (1988) Science, 242:419-423); 2,4-D (Streber et al. (1989) Bio/Technology, 7:811-816); гліфосату (Shaw et al. (1986) Science, 233:478-481); і фосфінотрицину (DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513-2518). Всі посилання, процитовані в описі, таким чином, включені в даний опис як посилання в повному об'ємі, якщо не указано інакше. Представлений вище список генів селективних маркерів і репортерних генів не є обмежувальним. Будь-який репортерний або ген селективного маркера знаходяться в об'ємі даного винаходу. При необхідності, такі гени можна секвенувати відомими в цій галузі способами. Репортерні гени і гени селективних маркерів синтезують для оптимальної експресії в рослинах. Тобто кодуючу послідовність гена модифікують для підвищення експресії в рослинах. Синтетичний маркерний ген конструюють для експресії в рослинах на високому рівні, трансформації, що приводить до більш високої ефективності. У цій галузі доступні способи синтетичної оптимізації генів. Фактично, декілька генів оптимізують для підвищення експресії продукту гена в рослинах. Послідовність маркерного гена можна оптимізувати для експресії у конкретному виді рослин або, альтернативно, її можна модифікувати для оптимальної експресії в сімействах рослин. Переважні для рослини кодони можна визначати з кодонів, які зустрічаються з найбільшою частотою в білках, які експресуються в найбільших кількостях у конкретному виді рослин, який цікавить. Див., наприклад, EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3324-3328; і Murray et al. (1989) Nucleic Acids Research, 17: 477-498; патент США № 5380831; і патент США № 5436391, включені в даний опис як посилання. Таким чином, нуклеотидні послідовності можна оптимізувати для експресії в будь-якій рослині. Встановлено, що можна оптимізувати або синтезувати всю послідовність гена або будь-яку її частину. Тобто, також можна використовувати повністю оптимізовані або частково оптимізовані послідовності. Крім того, розроблено декілька стратегій трансформації з використанням системи опосередкованої Agrobacterium трансформації. Наприклад, бінарна векторна стратегія основана на двоплазмідній системі, де Т-ДНК знаходиться в інший плазміді, ніж плазміда Ti. У стратегії коінтеграції невелику частину Т-ДНК вміщують в той же вектор, що і чужорідний ген, який потім рекомбінує з плазмідою Ti. Як застосовують в даному описі, фраза "рослина" включає дводольні рослини і однодольні рослини. Приклади дводольних рослин включають тютюн, арабідопсис, сою, помідор, папайю, канолу, соняшник, бавовну, люцерну, картоплю, виноград, голубиний горох, горох, декоративну капусту, нут, цукровий буряк, ріпак, кавун, диню, перець, арахіс, гарбуз, редиску, шпинат, гігантський гарбуз, броколі, капусту, моркву, цвітну капусту, селеру, китайську капусту, огірок, баклажан і латук. Приклади однодольних рослин включають кукурудзу, рис, пшеницю, цукрову тростину, ячмінь, жито, сорго, орхідею, бамбук, банан, рогіз, лілію, овес, цибулю, просо і тритикале. Предметна розробка гена резистентності до 2,4-D і подальших резистентних сільськогосподарських культур забезпечує виняткові засоби контролю широколистяних, резистентних до гліфосату (або високостійких і підданих зсуву) видів бур'янів для використання в сільськогосподарських культурах. 2,4-D є відносно недорогим і надійним гербіцидом широкого спектра дії проти широколистяних рослин, який буде приносити виняткову користь сільгоспвиробникам, якщо можна забезпечувати більш високу стійкість сільськогосподарських культур в рівній мірі у випадку дводольних і однодольних сільськогосподарських культур. Стійкі до 2,4-D трансгенні дводольні сільськогосподарські культури також будуть мати велику гнучкість по термінах і нормі внесення. Додатковою користю вказаної ознаки стійкості до гербіциду 2,4-D є запобігання пошкодженню в нормі сприйнятливих сільськогосподарських культур при дрейфі 2,4-D, випаровуванні, перетворенні (або іншому явищі переміщення за межі території), неправильному застосуванні, вандалізмі і т. п. Додатковою перевагою гена AAD-12 є те, що, на відміну від всіх гомологів tfdA, охарактеризованих до теперішнього часу, AAD-12 здатна деградувати піридилоксіацетатні ауксини (наприклад, триклопір, флуроксипір) в доповнення до ахіральних феноксіауксинів (наприклад, 2,4-D, MCPA, 4-хлорфеноксіоцтової кислоти). Див. таблицю 1. Загальна картина хімічних реакцій, каталізованих вказаним ферментом AAD-12, представлена на фіг. 1. (Додавання O.sub.2 є стереоспецифічним; розпад проміжної сполуки на 7 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фенол і гліоксилат є спонтанним.) Потрібно розуміти, що за допомогою хімічних структур на фіг. 1 ілюструють молекулярні кістяки, і що різні R-групи і т. п. (такі як представлені в таблиці 1) включені, але не обов'язково конкретно проілюстровані на фіг. 1. Для впливу на конкретні спектри бур'янів і умови навколишнього середовища в різних областях у всьому світі використовують множину сумішей різних комбінацій феноксіауксинів. Використання гена AAD-12 в рослинах забезпечує захист проти набагато більш широкого спектра ауксинових гербіцидів, таким чином, збільшуючи гнучкість і спектри бур'янів, які можна контролювати. До теперішнього часу ідентифікований єдиний ген (AAD-12), який при генетичному конструюванні для експресії в рослинах має властивості, які дозволяють використовувати феноксіауксинові гербіциди на рослинах, у яких ніколи не було спадкової стійкості, або вона була недостатньо високою, щоб мати можливість використовувати ці гербіциди. Крім того, AAD12 може забезпечувати захист від піридилоксіацетатних гербіцидів в польових умовах, підвищуючи потенційну користь від цих гербіцидів, природної стійкості до яких також недостатньо, щоб зробити можливою селективність. Рослини, що містять AAD-12 нарізно, тепер можна обробляти послідовно або з використанням бакової суміші з одним, двома або комбінацією декількох феноксіауксинових гербіцидів. Норма внесення кожного феноксіауксинового гербіциду може знаходитися в діапазоні від 25 до 4000 г ке/га, і частіше - від 100 до 2000 г ке/га для контролю широкого спектра дводольних бур'янів. Аналогічно, одну, дві або суміш декількох піридилоксіацетатауксинових сполук можна наносити на рослини, які експресують AAD-12, зі зниженим ризиком пошкодження від вказаних гербіцидів. Норма внесення для піридилоксіацетатного гербіциду може знаходитися в діапазоні від 25 до 2000 г ке/га, і частіше - 35-840 г ке/га для додаткового контролю дводольних бур'янів. Гліфосат широко використовують, оскільки він допомагає контролювати дуже широкий спектр широколистяних і трав'янистих видів бур'янів. Однак повторне використання гліфосату в GTC і при несільськогосподарському застосуванні приводить і буде продовжувати приводити до селекції бур'янів зі зсувами в сторону природно більш стійких видів або резистентних до гліфосату біотипів. Використання бакових сумішей гербіцидів, які використовуються в ефективних нормах внесення, що забезпечують контроль одних і тих же видів, але мають різні механізми дії, призначають в більшості стратегій боротьби з резистентністю до гербіцидів, як спосіб затримки появи резистентних бур'янів. Стекінг AAD-12 з ознакою стійкості до гліфосату (і/або з ознаками стійкості до інших гербіцидів) може представляти механізм, що дозволяє контролювати резистентні до гліфосату види дводольних бур'янів в GTC, роблячи можливим використання гліфосату, феноксіауксинів (наприклад, 2,4-D) і піридилоксіацетатауксинових гербіцидів (наприклад, триклопіру) вибірково в одній сільськогосподарській культурі. Нанесення цих гербіцидів може бути одночасним нанесенням в баковій суміші, що містить два або більше гербіциди з різними механізмами дії; окремим нанесенням однієї композиції гербіцидів з послідовним нанесенням в передпосівному, передсходовому або післясходовому і окремому режимі нанесення в діапазоні від приблизно 2 годин до приблизно 3 місяців; або, альтернативно, будь-яку комбінацію будь-якої кількості гербіцидів, що представляють кожний хімічний клас, можна наносити в будь-якому режимі в межах від приблизно 7 місяців від посадки сільськогосподарської культури до збору урожаю сільськогосподарської культури (або передзбирального інтервалу для окремого гербіциду, залежно від того, який з них є найбільш коротким). Важливо мати гнучкість в контролі широкого спектра трав'янистих і широколистяних бур'янів відносно режиму нанесення, норми внесення окремих гербіцидів і здатності контролювати резистентні або які представляють ускладнення бур'яни. Норма внесення гліфосату на сільськогосподарську культуру зі стеком гена резистентності до гліфосату/AAD-12 може знаходитися в діапазоні приблизно 250-2500 г ке/га; феноксіауксинові гербіциди (один або декілька) можна наносити при нормі внесення приблизно 25-4000 г ке/га; і піридилоксіацетатауксинові гербіциди (один або декілька) можна наносити при нормі внесення 25-2000 г ке/га. Оптимальні комбінації і режим цього нанесення буде залежати від конкретної ситуації, виду і навколишнього середовища, і найкраще їх буде визначати фахівець в галузі контролю бур'янів, що отримує користь від даного винаходу. Проростки, як правило, резистентні протягом всьому циклу зростання. Трансформовані рослини, як правило, будуть резистентні до нанесення нового гербіциду в будь-який час експресії гена. У даному описі представлена стійкість до 2,4-D протягом всього життєвого циклу при використанні конститутивних промоторів, протестованих до теперішнього часу (головним чином, CsVMV і AtUbi10). Це, як правило, є очікуваним, але являє собою удосконалення в порівнянні з іншими неметаболізованими активними засобами, де на стійкість може значно впливати, наприклад, знижена експресія місця прикладення дії механізму резистентності. 8 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Одним з прикладів є Roundup Ready cotton, де рослини стійкі при ранньому обприскуванні, але якщо обприскати їх дуже пізно, гліфосат концентрується в меристемі (оскільки він не метаболізується і переміщується); використовувані вірусні промотори Monsanto погано експресуються в квітках. Відносно цього заявлений винахід являє собою удосконалення. Склади гербіцидів (наприклад, склад складних ефірів, кислот або солей; або розчинний концентрат, емульгований концентрат або розчинна рідина) і добавки для бакових сумішей (наприклад, допоміжні засоби, поверхнево-активні речовини, уповільнювачі дрейфу або засоби сумісності) можуть значно впливати на контроль бур'янів за допомогою вказаного гербіциду або комбінації одного або декількох гербіцидів. Будь-яка їх комбінація з будь-якою з вказаних вище гербіцидних хімічних речовин входить в об'єм даного винаходу. Фахівець в цій галузі також побачить користь комбінування двох або більше механізмів дії для збільшення спектра контрольованих бур'янів і/або для контролю природно більш стійких або резистентних видів бур'янів. Це також може поширюватися на хімічні речовини, у випадку яких стійкість до гербіцидів в сільськогосподарських культурах стала можливою під впливом людини (трансгенно або нетрансгенно), крім GTC. Насправді, ознаки резистентності до гліфосату (наприклад, EPSPS резистентної рослини або бактерії, гліфосатоксидоредуктазу (GOX), GAT), резистентності до глуфосинату (наприклад, Pat, bar), ацетолактатсинтаза (ALS)інгібіторної резистентності до гербіцидів (наприклад, імідазолінону, сульфонілкарбаміду, триазолопіримідин сульфонаніліду, піримідинілтіобензоатів і інших хімічних речовин - AHAS, Csrl, SurA і ін.), резистентності до бромоксинілу (наприклад, Bxn), резистентності до інгібіторів ферменту HPPD (4-гідроксифенілпіруватдіоксигенази), резистентності до інгібіторів фітоендесатурази (PDS), резистентності до гербіцидів, які інгібують фотосистему II (наприклад, psbA), резистентності до гербіцидів, які інгібують фотосистему I, резистентності до гербіцидів, які інгібують протопорфіриногеноксидазу IX (PPO) (наприклад, PPO-1), резистентності до гербіцидів на основі фенілсечовини (наприклад, CYP76B1), дикамба-деградуючі ферменти (див., наприклад, US 20030135879) і інші можуть бути відособлені або бути у множині комбінацій для забезпечення здатності ефективно контролювати або запобігати зсувам бур'янів і/або резистентності до будь-якого гербіциду з вказаних вище класів. У деяких переважних варіантах здійснення можна використовувати модифіковану in vivo EPSPS, а також гени резистентності до гліфосату класу I, класу II і класу III. Що стосується додаткових гербіцидів, деякі додаткові переважні інгібітори ALS включають, як необмежувальні приклади сульфонілкарбаміди (такі як хлорсульфурон, галосульфурон, нікосульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, трифлоксисульфурон), імідазолінони (такі як імазамокс, імазетапір, імазахін), триазолопіримідин сульфонаніліди (такі як клорансуламметил, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам і пеноксулам), піримідинилтіобензоати (такі як біспірибак і піритіобак) і флукарбазон. Деякі переважні інгібітори HPPD включають, як необмежувальні приклади, мезотрион, ізоксафлутол і сулкотрион. Деякі переважні інгібітори PPO включають, як необмежувальні приклади, флуміклорак, флуміоксазин, флуфенпір, пірафлуфен флутіацет, бутафенацил, карфентразон, сульфентразон і дифенілові прості ефіри (такі як ацифлуорфен, фомезафен, лактофен і оксифлуорфен). Крім того, AAD-12 окрему або піддану стекінгу з однією або декількома додатковими ознаками HTC можна піддавати стекінгу з однією або декількома додатковими вхідними (наприклад, резистентність до комах, резистентність до грибів або стресостійкість і ін.) або вихідними (наприклад, підвищена врожайність урожай, поліпшений профіль олій, поліпшена якість волокон і ін.) ознаками. Таким чином, даний винахід можна використовувати для забезпечення повного агрономічного пакету поліпшеної якості сільськогосподарської культури зі здатністю гнучко і економічно ефективно контролювати будь-яку кількість сільськогосподарських шкідників. Даний винахід частково стосується ідентифікації ферменту, який не тільки здатний деградувати 2,4-D, але також, несподівано, має нові властивості, що відрізняє фермент за даним винаходом, наприклад, від раніше відомих білків tfdA. Незважаючи на те, що цей фермент має дуже низьку гомологію з tfdA, гени за даним винаходом все одно, як правило, можна класифікувати в те ж загальне сімейство α-кетоглутарат-залежних діоксигеназ. Це сімейство білків відрізняється трьома консервативними залишками гістидину в мотиві "HX(D/Е)X23-26(Т/S)X114-183HX10-13R", що містить активний центр. Гістидини координують в 2+ активному центрі іон Fe , який важливий для каталітичної активності (Hogan et al., 2000). Попередні експерименти по експресії in vitro, що обговорюються в даному описі, адаптували для полегшення селекції нових властивостей. Ці експерименти також показують, що фермент AAD-12 унікальний відносно іншого, в корені відмінного ферменту того ж класу, що описується в зареєстрованій раніше патентній заявці (PCT US/2005/014737; зареєстрованій 2 травня 2005 9 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 року). Фермент AAD-1 по цій заявці має всього лише приблизно 25 % ідентичності послідовності відносно білка AAD-12 за даним винаходом. Більш конкретно, даний винахід частково стосується застосування ферменту, здатного деградувати не тільки 2,4-D, але також і піридилоксіацетатні гербіциди. Раніше не повідомляли про α-кетоглутарат-залежний фермент діоксигенази, який має здатність деградувати гербіциди різних хімічних класів і механізмів дії. Переважні ферменти і гени для застосування за даним винаходом означають в даному описі як гени і білки AAD-12 (арилоксіалканоатдіоксигенази). Білки за даним винаходом при аналізі були тест-позитивними на перетворення 2,4-D в 2,4дихлорфенол ("DCP"; гербіцидно неактивний). Частково очищені білки за даним винаходом можуть швидко перетворювати 2,4-D в DCP in vitro. Додатковою перевагою AAD-12трансформованих рослин, які надаються, є те, що батьківські гербіциди метаболізуються до неактивних форм, таким чином, знижуючи потенціал збору гербіцидних залишків разом із зерном або соломою. Даний винахід також включає способи контролю бур'янів, де вказані способи включають нанесення піридилоксіацетатного і/або феноксіауксинового гербіциду на рослини, що містять ген AAD-12. У світлі цих результатів, тепер надають нові рослини, що містять полінуклеотид, який кодує цей тип ферменту. До цього моменту не існувало мотивації отримувати такі рослини, і не очікували, що такі рослини зможуть ефективно продукувати цей фермент, що робить рослини резистентними не тільки до гербіцидів на основі феноксикислот (таким як 2,4-D), але також і до піридилоксіацетатних гербіцидів. Таким чином, даний винахід забезпечує велику кількість переваг, які до даного моменту в цій галузі не вважали можливими. Загальнодоступні штами (депоновані в колекціях культур, таких як ATCC або DSMZ) можна купувати і піддавати скринінгу на нові гени з використанням способів, представлених в даному описі. Послідовності, представлені в даному описі, можна використовувати для ампліфікації і клонування гомологічних генів в систему рекомбінантної експресії для додаткового скринінгу і тестування за даним винаходом. Як указано вище в розділі "Рівень техніки", одним з організмів, який інтенсивно досліджуються на здатність деградувати 2,4-D, була Ralstonia eutropha (Streber et al., 1987). Геном, що кодує перший фермент в шляху деградації, є tfdA. Див. патент США № 6153401 і GENBANK реєстр. № M16730. TfdA каталізує перетворення кислоти 2,4-D в гербіцидно неактивний DCP за допомогою реакції α-кетоглутарат-залежної діоксигенази (Smejkal et al., 2001). TfdA використовують в трансгенних рослинах для надання резистентності до 2,4-D дводольних рослин (наприклад, бавовни і тютюну), в нормі сприйнятливих до 2,4-D (Streber et al., 1989; Lyon et al., 1989; Lyon et al., 1993). Велика кількість генів tfdA-типу, що кодують білки, здатні деградувати 2,4-D, ідентифікували з навколишнього середовища і депонували в базі даних Genbank. Багато гомологів дуже схожі на tfdA (>85 % ідентичності амінокислот) і мають аналогічні tfdA ферментативні властивості. Однак, до теперішнього часу ідентифікували невелику колекцію гомологів α-кетоглутарат-залежної діоксигенази, що мають низький рівень гомології з tfdA. Даний винахід частково стосується несподіваних даних про нове використання і функції віддалено спорідненого ферменту sdpA з Delftia acidivorans (Westendorf et al., 2002, 2003) з низькою гомологією відносно tfdA (31 % ідентичності амінокислот). Раніше показано, що цей фермент α-кетоглутарат-залежна діоксигеназа, очищена в своїй нативній формі, деградує 2,4-D і S-дихлорпроп (Westendorf et al., 2002 і 2003). Однак раніше не повідомляли про фермент αкетоглутарат-залежної діоксигенази, що має здатність деградувати гербіциди хімічного класу піридилоксіацетатів. SdpA ніколи не експресували в рослинах, не було і мотивації для цього, частково тому, що розробка нових технологій HTC обмежена, головним чином, ефективністю, низькою вартістю і зручністю GTC (Devine, 2005). З урахуванням нової активності білки і гени за даним винаходом означають в даному описі як білки і гени AAD-12. До теперішнього часу підтверджено, що AAD-12 деградує різноманітні феноксіацетатауксинові гербіциди in vitro. Однак, як уперше повідомлено в даному описі, несподівано виявляли, що цей фермент також здатний деградувати додаткові субстрати класу арилоксіалканоатних молекул. Субстрати значної агрономічної важливості включають піридилоксіацетатауксинові гербіциди. Це нове відкриття є основою для значних можливостей для стійких до гербіцидів сільськогосподарських культур (HTC) і ознак селективних маркерів. Цей фермент унікальний по своїй здатності виявляти свою гербіцид-деструктивну активність відносно гербіцидів широколистяних рослин широкого спектра (феноксіацетат- і піридилоксіацетатауксинів). 10 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Таким чином, даний винахід частково стосується деградації 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти, інших феноксіацетатауксинових гербіцидів і піридилоксіацетатних гербіцидів за допомогою ферменту арилоксіалканоатдіоксигенази (AAD-12), який рекомбінантно експресується. Даний винахід також частково стосується ідентифікації і застосування генів, що кодують деградуючий фермент арилоксіалканоатдіоксигеназу (AAD-12), здатну деградувати фенокси- і/або піридилоксіауксинові гербіциди. Фермент за даним винаходом робить можливою трансгенну експресію, що приводить до стійкості до комбінацій гербіцидів, за допомогою яких будуть контролювати майже всі широколистяні бур'яни. AAD-12 може служити як виняткова ознака стійкої до гербіцидів сільськогосподарської культури (HTC) для стекінгу з іншими ознаками HTC [наприклад, резистентністю до гліфосату, резистентністю до глуфосинату, резистентністю до ALS-інгібіторів (наприклад, імідазолінону, сульфонілкарбаміду, триазолопіримідин сульфонаніліду), резистентністю до бромоксинілу, резистентністю до HPPD-інгібіторів, резистентністю до РРОінгібіторів і ін.] і, наприклад, ознаками резистентності до комах (Cry1F, Cry1Ab, Cry 34/45, інші білки Bt. або інсектицидні білки, що не походять з Bacillis, і ін.). Додатково, AAD-12 може служити як селективний маркер для полегшення селекції первинних трансформантів рослин, генетично сконструйованих з другим геном або групою генів. Крім того, ген мікроорганізму за даним винаходом переконструювали таким чином, що білок кодується кодонами, зміщеними у бік їх використання і однодольними, і дводольними рослинами (гемікот). Арабідопсис, кукурудзу, тютюн, бавовну, сою, канолу і рис трансформували з використанням конструкцій, що містять AAD-12, і вони демонстрували високі рівні резистентності до фенокси- і піридилоксіауксинових гербіцидів. Таким чином, даний винахід також стосується генів, "оптимізованих для рослин", що кодують білки за даним винаходом. Оксіалканоатні групи застосовні для включення в гербіциди стабільної кислотної функціональної групи. Кислотна група за допомогою "кислотної пастки" може додавати бажану характерну рису дії гербіциду - рухливість у флоемі, і, таким чином, її можна включати в нові гербіциди з метою підвищення рухливості. Аспекти даного винаходу також стосуються механізму отримання HTC. Існує велика кількість потенційних комерційних і експериментальних гербіцидів, які можуть служити як субстрати для AAD-12. Таким чином, застосування генів за даним винаходом також може приводити до стійкості до гербіциду також відносно інших гербіцидів. Ознаки HTC за даним винаходом можна використовувати в нових комбінаціях з іншими ознаками HTC (включаючи, як необмежувальні приклади, стійкість до гліфосату). Ці комбінації ознак дають початок новим способам контролю видів бур'янів (і т. п.) внаслідок новонабутої резистентності або спадкової стійкості до гербіцидів (наприклад, гліфосату). Таким чином, в доповнення до ознак HTC в об'єм винаходу входять нові способи контролю бур'янів з використанням гербіцидів, стійкість до яких в трансгенних сільськогосподарських культурах досягали за допомогою вказаного ферменту. Даний винахід можна застосовувати відносно отримання комерційної вигоди з ознаки резистентності до 2,4-D, підданої стекінгу, наприклад, з існуючими в цей час ознаками резистентності до гліфосату у сої. Таким чином, даний винахід стосується інструмента для боротьби зі зсувами в популяціях видів широколистяних бур'янів і/або селекції резистентних до гербіцидів широколистяних бур'янів, що досягли широкого поширення внаслідок надто високого довір'я сільгоспвиробників відносно гліфосату для контролю бур'янів в різних сільськогосподарських культурах. Трансгенна експресія генів AAD-12 за даним винаходом представлена як приклад в арабідопсисі, тютюні, сої, бавовні, рисі, кукурудзі і канолі. Соя є переважною сільськогосподарською культурою для трансформації за даним винаходом. Однак даний винахід можна використовувати у множині інших однодольних (таких як пасовищні злаки або газонна трава) і дводольних сільськогосподарських культур, таких люцерна, конюшина, види дерев і ін. Аналогічно, 2,4-D (або інші субстрати AAD-12) можна більш успішно використовувати у випадку трав'янистих сільськогосподарських культур, в яких стійкість є помірною, і стійкість, підвищена за допомогою цієї ознаки, буде надавати сільгоспвиробникам можливість використання цих гербіцидів в більш ефективних нормах внесення і з більш широким режимом нанесення без ризику пошкодження сільськогосподарських культур. Крім того, даний винахід стосується одного гена, який може забезпечувати резистентність до гербіцидів, за допомогою яких можна контролювати широколистяні бур'яни. Цей ген можна використовувати у множині сільськогосподарських культур, щоб зробити можливим використання комбінації гербіцидів широкого спектра. За допомогою даного винаходу також 11 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можна контролювати бур'яни, резистентні до існуючих в цей час хімічних речовин, і він може допомагати контролювати зсуви популяцій бур'янів, які виникають внаслідок існуючих в цей час агрономічних технологій. AAD-12 за даним винаходом також можна використовувати в спробах ефективно детоксифікувати додаткові гербіцидні субстрати в негербіцидні форми. Таким чином, даний винахід стосується розробки додаткових ознак HTC і/або технології селективних маркерів. Окремо або в доповнення до використання генів за даним винаходом для отримання HTC, гени за даним винаходом також можна використовувати як селективні маркери для успішної селекції трансформантів в культурах клітин, теплицях і в польових умовах. Гени за даним винаходом мають надто важливе значення просто як селективний маркер для біотехнологічних проектів. Недиференційована дія AAD-12 відносно інших арилоксіалканоатауксинових гербіцидів надає множину можливостей для використання цього гена з метою отримання HTC і/або селективного маркера. Не можна просто описати термін "резистентність" і не використати дієслово "мати стійкість" або прикметник "стійкий". У цій галузі витрачена незліченна кількість годин в дебатах про терміни "стійкі до гербіцидів сільськогосподарські культури" (HTC) і "резистентні до гербіцидів сільськогосподарські культури" (HRC). HTC є переважним терміном в цій галузі. Однак, офіційним визначенням "резистентності" згідно з Weed Science Society of America є "природжена здатність рослини виживати і розмножуватися після впливу дози гербіциду, в нормі летальній для рослини дикого типу. У рослин резистентність може бути природною або яка індукується за допомогою таких технологій, як генна інженерія або селекція варіантів, здійснювана за допомогою культури тканин або мутагенезу". Як застосовують в даному описі, якщо не указано інакше, "резистентність" до гербіциду є спадковою і дозволяє рослині рости і розмножуватися в присутності типової гербіцидно-ефективної обробки за допомогою гербіциду для вказаної рослини, як запропоновано в останньому, на момент подачі даної заявки, виданні Herbicide Handbook. Як вважають фахівці в цій галузі, рослину все одно можна вважати "резистентною", навіть якщо очевидна деяка міра пошкодження рослини внаслідок обробки гербіцидом. Як застосовують в даному описі, термін "стійкість" є більш широким, ніж термін "резистентність", і включає "резистентність", як визначено в даному описі, а також поліпшену здатність конкретної рослини чинити опір різним ступеням пошкодження, що індукується гербіцидами, яке, як правило, відбувається у рослин дикого типу того ж генотипу при тій же дозі гербіциду. Перенесення функціональної активності в рослинні або бактеріальні системи може включати послідовність нуклеїнової кислоти, кодуючу амінокислотну послідовність білка за даним винаходом, інтегровану у вектор, експресуючий білок, відповідний для хазяїна, в якому вектор буде знаходитися. Одним зі способів отримання послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує білок з функціональною активністю, є виділення нативного генетичного матеріалу з видів бактерій, які продукують білок, який цікавить, з використанням інформації, що прогнозується з амінокислотної послідовності білка, як представлено в даному описі. Нативні послідовності можна оптимізувати для експресії в рослинах, наприклад, як більш детально описано нижче. Оптимізований полінуклеотид також можна конструювати на основі послідовності білка. Існує ряд способів отримання білків для застосування за даним винаходом. Наприклад, можна використовувати антитіла проти білків, представлених в даному описі, для ідентифікації і виділення таких білків з суміші білків. Зокрема, можна індукувати антитіла проти частин білків, які є найбільш консервативними або які найбільш розрізнюються в порівнянні з іншими спорідненими білками. Потім ці антитіла можна використовувати для конкретної ідентифікації еквівалентних білків з характерною активністю за допомогою імунопреципітації, твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) або імуноблотингу. Антитіла проти білків, представлених в даному описі, або проти еквівалентних білків, або проти фрагментів цих білків можна легко отримувати з використанням стандартних способів. Такі антитіла є аспектом даного винаходу. Антитіла за даним винаходом включають моноклональні і поліклональні антитіла, переважно, продуковані у відповідь на той, який є прикладом або передбачуваний білок. Фахівцеві в цій галузі буде зрозуміло, що білки (і гени) за даним винаходом можна отримувати з різноманітних джерел. Оскільки відомо, що повні оперони деградації гербіцидів кодуються мобільними генетичними елементами, такими як плазміди, а також елементами, що інтегруються в геном, білки за даним винаходом можна отримувати з широкого спектра мікроорганізмів, наприклад, включаючи рекомбінантні бактерії і/або бактерії дикого типу. Мутантні форми ізолятів бактерій можна отримувати способами, добре відомими в цій галузі. Наприклад, аспорогенні мутанти можна отримувати, піддаючи ізолят мутагенезу з використанням етилметансульфонату (EMS). Мутантні штами також можна отримувати з 12 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використанням ультрафіолетового випромінювання і нітрозогуанідину добре відомими в цій галузі способами. Білок "з" або що "отримується з" будь-якого з ізолятів за даним винаходом, згаданий або запропонований в даному описі, означає, що білок (або аналогічний білок) можна отримувати з ізоляту або деякого іншого джерела, такого як інший штам бактерій або рослина. "Отриманий з" також має це значення і включає білки, що отримуються з вказаного типу бактерій, наприклад, модифіковані для експресії в рослині. Фахівцеві в цій галузі буде зрозуміло, що, беручи до уваги опис бактеріального гена і білка, можна конструювати рослину для отримання білка. Препарати антитіл, зонди нуклеїнових кислот (наприклад, ДНК, РНК або ПНК) і т. п. можна отримувати з використанням полінуклеотидних і/або амінокислотних послідовностей, представлених в даному описі, і використовувати їх для скринінгу і виділення інших споріднених генів з інших (природних) джерел. Для клонування і секвенування білків і генів, представлених в даному описі, можна використовувати стандартні способи молекулярної біології. Додаткову інформацію можна знайти в Sambrook et al., 1989, включеному в даний опис як посилання. Полінуклеотиди і зонди: Даний винахід додатково стосується послідовностей нуклеїнової кислоти, що кодують білки для застосування за даним винаходом. Даний винахід додатково стосується способів ідентифікації і визначення властивостей генів, які кодують білки, що мають бажану гербіцидну активність. У одному з варіантів здійснення даний винахід стосується унікальних нуклеотидних послідовностей, застосовних як зонди для гібридизації і/або праймерів для способів ПЛР. За допомогою праймерів отримують характерні фрагменти генів, які можна використовувати в ідентифікації, визначенні властивостей і/або виділенні конкретних генів, які цікавлять. Нуклеотидні послідовності за даним винаходом кодують білки, відмінні від раніше описаних білків. Полінуклеотиди за даним винаходом можна використовувати для отримання повних "генів", що кодують білки або пептиди в бажаній клітині-хазяїні. Наприклад, як буде зрозуміло фахівцям в цій галузі, полінуклеотиди за даним винаходом можна відповідним чином вміщувати під контроль промотору в хазяїні, який цікавить, як відомо в цій галузі. Рівень експресії гена і тимчасова/тканиноспецифічна експресія можуть значно впливати на застосовність винаходу. Як правило, більш високі рівні експресії білка деструктивного гена будуть приводити до більш швидкої і більш повної деградації субстрату (в цьому випадку - гербіциду-мішені). Бажано, щоб промотори контролювали експресію гена-мішені на високих рівнях, якщо висока експресія не має подальшого негативного впливу на здоров'я рослини. Як правило, бажано мати ген AAD-12, який конститутивно експресується у всіх тканинах для повного захисту рослини на всіх фазах росту. Однак, альтернативно, можна використовувати ген резистентності, який експресується залежно від фази вегетативного циклу; це дозволить використати гербіцид-мішень в фазу плодоносіння для контролю бур'янів і потім контролювати статеве розмноження цільової сільськогосподарської культури за допомогою нанесення протягом фази цвітіння. Крім того, бажані рівні і періоди експресії також можуть залежати від типу рослини і бажаного рівня стійкості. У деяких переважних варіантах здійснення використовують сильні конститутивні промотори в комбінації з енхансерами транскрипції і т. п. для підвищення рівнів експресія і стійкості до бажаних рівнів. Деякі такі варіанти здійснення більш детально описані нижче перед розділом "Приклади". Як відомо фахівцям в цій галузі, ДНК, як правило, існує в дволанцюжковій формі. У такій структурі один ланцюг комплементарний іншому ланцюгу, і навпаки. Оскільки ДНК реплікується (наприклад) в рослині, продукуються додаткові комплементарні ланцюги ДНК. Термін "кодуючий ланцюг" часто використовують в цій галузі для позначення ланцюга, що зв'язується з антисмисловим ланцюгом. мРНК транскрибується з "антисмислового" ланцюга ДНК. "Смисловий" або "кодуючий" ланцюг має серію кодонів (кодон являє собою три нуклеотиди, які можна читати як одиницю з трьох залишків для позначення конкретної амінокислоти), яка може бути прочитана як відкрита рамка зчитування (ORF) для утворення цікавлячого білка або пептиду. У випадку продукції білка in vivo ланцюг ДНК, як правило, транскрибується в комплементарний ланцюг мРНК, що використовується як матриця для білка. Таким чином, даний винахід включає застосування прикладів полінуклеотидів, представлених в прикладеному списку послідовностей, і/або еквівалентів, включаючи комплементарні ланцюги. Даний винахід включає РНК і ПНК (пептид-нуклеїнові кислоти), що є функціонально еквівалентними прикладам молекул ДНК. Білки і гени для застосування за даним винаходом можна ідентифікувати і отримувати, наприклад, з використанням олігонуклеотидних зондів. Ці зонди є детектованими нуклеотидними послідовностями, які можна визначати за допомогою відповідної мітки, або які 13 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 можна отримувати, по суті, флуоресцентними, як описано в міжнародній патентній заявці № WO 93/16094. Зонди (і полінуклеотиди за даним винаходом) можуть являти собою ДНК, РНК або ПНК. У доповнення до аденіну (А), цитозину (C), гуаніну (G), тиміну (Т) і урацилу (U); у випадку молекул РНК), синтетичні зонди (і полінуклеотиди) за даним винаходом також можуть містити інозин (нейтральна основа, здатна спарюватися зі всіма чотирма основами; іноді використовувана замість суміші всіх чотирьох основ в синтетичних зондах) і/або інші синтетичні (неприродні) основи. Таким чином, коли в даному описі згадують синтетичний, вироджений олігонуклеотид і, загалом, використовують "N" або "n", "N" або "n" може являти собою G, А, Т, С або інозин. Як застосовують в даному описі, невизначені коди відповідають стандартним угодам про номенклатуру IUPAC на момент подачі даної заявки (наприклад, R означає А або G, Y означає С або Т і т. д.). Як добре відомо в цій галузі, якщо молекулу зонда гібридизують із зразком нуклеїнової кислоти, можна розумно передбачити, що зонд і зразок мають істотну гомологію/схожість/ідентичність. Переважно, спочатку здійснюють гібридизацію полінуклеотиду з подальшими промиваннями в умовах зниженої суворості, помірної суворості або в суворих умовах способами, добре відомими в цій галузі, як описано, наприклад, в Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Наприклад, як там указано, умов зниженої суворості можна досягати спочатку промиванням 2-кратним SSC (стандартним цитратно-сольовим буфером)/0,1 % SDS (додецилсульфатом натрію) протягом 15 хвилин при кімнатній температурі. Як правило, здійснюють два промивання. Потім можна досягати більшої суворості, знижуючи концентрацію солі і/або підвищуючи температуру. Наприклад, після вказаного вище промивання можна здійснювати два промивання 0,1-кратним SSC/0,1 % SDS протягом 15 хвилин, кожне при кімнатній температурі, з подальшими промиваннями 0,1-кратним SSC/0,1 % SDS протягом 30 хвилин, кожне при 55 °C. Ці температури можна використовувати з іншими протоколами гібридизації і промивання, приведеними в даному описі і відомими фахівцеві в цій галузі (як сіль замість SSC можна використовувати, наприклад, SSPE). 2-кратний SSC/0,1 % SDS можна отримувати, додаючи 50 мл 20-кратного SSC і 5 мл 10 % SDS в 445 мл води. 20-кратний SSC можна отримувати, комбінуючи NaCl (175,3 г/0,150 M), цитрат натрію (88,2 г/0,015 M) і воду, доводячи pH до 7,0 за допомогою 10 Н NaOH, а потім доводячи об'єм до 1 літра. 10 % SDS можна отримувати, розчиняючи 10 г SDS в 50 мл автоклавованої води, а потім розбавляючи до 100 мл. Детекція зонда забезпечує засоби для визначення відомим способом того, чи підтримується гібридизація. Такий аналіз зонда представляє швидкий спосіб ідентифікації генів за даним винаходом. Сегменти нуклеотидів, що використовуються як зонди за винаходом, можна синтезувати з використанням ДНК-синтезатора і стандартних способів. Ці нуклеотидні послідовності також можна використовувати як праймери для ПЛР для ампліфікації генів за даним винаходом. Гібридизаційні характеристики молекули можна використовувати для визначення полінуклеотидів за даним винаходом. Таким чином, даний винахід включає полінуклеотиди (і/або комплементарні їм полінуклеотиди, переважно, повністю комплементарні їм полінуклеотиди), які гібридизуються з полінуклеотидом, приведеним як приклад в даному описі. Тобто, одним зі способів визначення гена (і білка, що кодується їм), наприклад, є визначення його здатності гібридизуватися (в будь-яких умовах, конкретно представлених в даному описі) з відомим або конкретно приведеним як приклад геном. Як застосовують в даному описі, термін "суворі" умови гібридизації стосується умов, за допомогою яких досягають того ж або приблизно того ж ступеня специфічності гібридизації, що і в умовах, які використовуються авторами даного винаходу. Зокрема, гібридизацію 32 іммобілізованої ДНК при Саузерн-блотингу з міченими P специфічними для гена зондами можна здійснювати стандартними способами (див., наприклад, Maniatis et al. 1982). У основному, гібридизацію і подальші промивання можна здійснювати в умовах, що дозволяють визначати послідовності-мішені. У випадку дволанцюжкових ДНК-зондів до гена гібридизацію можна здійснювати протягом ночі при температурі на 20-25 °C нижче за температуру плавлення (Tm) гібрида ДНК в 6-кратному SSPE, 5-кратному розчині Денхардта, 0,1 % SDS, 0,1 мг/мл денатурованої ДНК. Як правило, промивання можна здійснювати таким чином: (1) двічі при кімнатній температурі протягом 15 хвилин в 1-кратному SSPE, 0,1 % SDS (промивання в умовах зниженої суворості); і (2) один раз при Tm-20 °C протягом 15 хвилин в 0,2-кратному SSPE, 0,1 % SDS (промивання в умовах помірної суворості). 14 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У випадку олігонуклеотидних зондів гібридизацію можна здійснювати протягом ночі при температурі на 10-20 °C нижче температури плавлення (Tm) гібрида в 6-кратному SSPE, 5кратному розчин Денхардта, 0,1 % SDS, 0,1 мг/мл денатурованої ДНК. Як правило, промивання можна здійснювати таким чином: (1) двічі при кімнатній температурі протягом 15 хвилин в 1-кратному SSPE, 0,1 % SDS (промивання в умовах зниженої суворості); і (2) один раз при температурі гібридизації протягом 15 хвилин в 1-кратному SSPE, 0,1 % SDS (промивання в умовах помірної суворості). У основному, для зміни суворості можна змінювати сіль і/або температуру. У випадку міченого фрагмента ДНК довжиною >70 основ або близько того, можна використовувати наступні умови: (1) зниженої суворості: 1- або 2-кратний SSPE, кімнатна температура; (2) зниженої суворості: 1- або 2-кратний SSPE, 42 °C; (3) помірної суворості: 0,2- або 1-кратний SSPE, 65 °C, або (4) суворі умови: 0,1-кратний SSPE, 65 °C. Утворення і стабільність дуплекса залежать від фактичної комплементарності між двома ланцюгами гібрида і, як указано вище, можна допускати деякий ступінь неспівпадіння. Таким чином, послідовності зондів за даним винаходом включають мутації (одиночні і множинні), делеції, інсерції в послідовностях, що описуються, і їх комбінації, де вказані мутації, інсерції і делеції роблять можливим утворення стабільних гібридів з полінуклеотидом-мішенню, який цікавить. Мутації, інсерції і делеції можна отримувати у вказаній полінуклеотидній послідовності множиною способів, і ці способи, як правило, відомі фахівцям в цій галузі. Інші способи можуть стати відомими в майбутньому. Технологія ПЛР: Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) являє собою повторюваний, ферментативний, примований синтез послідовності нуклеїнової кислоти. Цей спосіб добре відомий і загальновикористовуваний серед фахівців в цій галузі (див. Mullis, патенти США №№ 4683195, 4683202, і 4800159; Saiki et al., 1985). ПЛР основана на ферментативній ампліфікації фрагмента ДНК, який цікавить, фланкованого двома олігонуклеотидними праймерами, які гібридизуються на протилежних ланцюгах послідовності-мішені. Переважно, праймери орієнтовані по 3'-кінцях, направлених один проти одного. Повторювані цикли термічної денатурації матриці, відпалу праймерів на комплементарних їм послідовностях і елонгації відпалених праймерів за допомогою ДНК-полімерази приводять до ампліфікації сегмента, що визначається по 5'-кінцях праймерів для ПЛР. Продукт елонгації кожного праймера може служити як матриця для інших праймерів, таким чином, в кожному циклі подвоюється кількість фрагмента ДНК, що утворилася в попередньому циклі. Це приводить до експонентного накопичення конкретного фрагменту-мішені в декілька мільйонів разів за декілька годин. Використовуючи термостабільну ДНК-полімеразу, таку як Taq-полімераза, виділена з термофільної бактерії Thermus aquaticus, можна повністю автоматизувати ампліфікацію. Інші ферменти, які можна використовувати, відомі фахівцям в цій галузі. Приклади послідовності ДНК або їх сегменти можна використовувати як праймери для ПЛРампліфікації. При здійсненні ПЛР-ампліфікації можна допускати певний ступінь неспівпадання між праймерами і матрицею. Таким чином, мутації, делеції, і інсерції (особливо додавання нуклеотидів на 5'-кінець) прикладів праймерів входять в об'єм даного винаходу. У вказаному праймері можна здійснювати мутації, інсерції і делеції способами, як правило, відомими фахівцям в цій галузі. Модифікація генів і білків: Гени і білки за даним винаходом можна піддавати злиттю з іншими генами і білками для отримання химерних або злитих білків. Гени і білки, застосовні за даним винаходом, включають не тільки конкретно приведені як приклади повнорозмірні послідовності, але також частини, сегменти і/або фрагменти (включаючи суміжні фрагменти і варіанти з внутрішніми і/або кінцевими делеціями в порівнянні з повнорозмірними молекулами) цих послідовностей, їх варіанти, мутантні, химерні і злиті форми. Білки за даним винаходом можуть містити заміни амінокислот за умови, що вони зберігають бажану функціональну активність. "Варіанти" генів мають нуклеотидні послідовності, які кодують ті ж білки або еквівалентні білки, що мають активність, еквівалентну або схожу з білком, приведеним як приклад. Два кращих результати пошуків за допомогою BLAST з використанням нативної нуклеотидної послідовності aad-12 демонструють достатній рівень гомології (приблизно 85 %) по 120 парах основ в послідовності. Можна очікувати, що гібридизація в конкретних умовах буде включати ці дві послідовності. Див. GENBANK реєстр. №№ DQ406818.1 (89329742; Rhodoferax) і AJ6288601.1 (44903451; Sphingomonas). Rhodoferax дуже схожа з Delftia, але Sphingomonas філогенетично представляє абсолютно інший клас. Терміни "варіанти білків" і "еквівалентні білки" стосуються білків, що мають ту ж або, по суті, ту ж біологічну/функціональну активність проти субстратів-мішеней і еквівалентні послідовності 15 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відносно білків, приведених як приклади. Як застосовують в даному описі, посилання на "еквівалентну" послідовність стосується послідовностей, що містять заміни амінокислот, делеції, додатки або інсерції, які поліпшують або не впливають на активність значною мірою несприятливо. Фрагменти, що зберігають активність також включені в це визначення. Фрагменти і інші еквіваленти, що зберігають ту ж або аналогічну функцію або активність, що і відповідний фрагмент білка, приведеного як приклад, входять в об'єм даного винаходу. Зміни, такі як заміни амінокислот або додавання, можна здійснювати в різних цілях, таких як підвищення (або зниження) протеазної стабільності білка (без значного/істотного зниження функціональної активності білка), видалення або додавання ділянки рестрикції і т. п. Варіанти генів можна легко конструювати, наприклад, з використанням стандартних способів отримання точкових мутацій. Крім того, наприклад, в патенті США № 5605793 описують способи отримання додаткової молекулярної різноманітності з використанням реасемблювання ДНК після випадкової або направленої фрагментації. Це можна позначати як "перетасовування" генів, як правило, що включає змішування фрагментів (бажаного розміру) двох або більше різних молекул ДНК з подальшими повторюваними раундами ренатурації. Це може поліпшувати активність білка, що кодується вихідним геном. Результатом є химерний білок, що має поліпшену активність, змінену субстратну специфічність, підвищену ферментативну стабільність, змінену стереоспецифічність або інші характеристики. "Перетасовування" можна планувати і направляти після отримання і дослідження атомних 3D (тривимірних) координат і кристалічної структури білка, який цікавить. Таким чином, "направлене перетасовування" можна направляти на конкретні сегменти білка, ідеальні для модифікації, такі як сегменти, що експонуються на поверхні, і, переважно, не внутрішні сегменти, що беруть участь у фолдингу білка і важливі для 3D структурної цілісності. Конкретні зміни в "активному центрі" ферменту можна здійснювати для впливу на властиву йому функціональність відносно активності або стереоспецифічності. Muller et. al. (2006). Відому кристалічну структуру tauD використовували як модель діоксигенази для визначення залишків активного центра, в той час як він був пов'язаний зі своїм характерним субстратом таурином. Elkins et al. (2002) "X-ray crystal structure of Escerichia coli taurine/alpha-ketoglutarate dioxygenase complexed to ferrous iron and substrates, " Biochemistry 41(16):5185-5192. Що стосується оптимізації послідовності і конструювання активних центрів ферменту, див. Chakrabarti et al., PNAS, (Aug. 23, 2005), 102(34): 12035-12040. Фрагменти повнорозмірних генів можна отримувати стандартними способами з використанням комерційно доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз. Наприклад, для систематичного відщеплення нуклеотидів з кінців цих генів можна використовувати ферменти, такі як Bal31, або сайт-специфічний мутагенез. Крім того, гени, що кодують активні фрагменти, можна отримувати з використанням різних ферментів рестрикції. Щоб напряму отримувати активні фрагменти цих білків, можна використовувати протеази. Як представлено в даному описі, в об'єм винаходу входить те, що білки можуть бути укороченими і все одно зберігати функціональну активність. Термін "укорочений білок" означає, що можна відщеплювати частину білка, в той час як інший укорочений білок після розщеплення зберігає і виявляє бажану активність. Розщеплення можна здійснювати з використанням різних протеаз. Крім того, ефективно розщеплені білки можна отримувати способами молекулярної біології, де основи ДНК, що кодує вказаний білок, видаляють за допомогою обробки рестрикційними ендонуклеазами, або іншими способами, доступними фахівцям в цій галузі. Після укорочення вказані білки можна експресувати в гетерологічних системах, таких як Е. coli, бакуловіруси, системи на основі вірусів рослин, дріжджі і т. п., а потім вміщувати в системи аналізу на основі клітин комах, як представлено в даному описі, для визначення активності. У цій галузі добре відомо, що можна успішно отримувати укорочені білки таким чином, що вони зберігають функціональну активність, маючи меншу послідовність, ніж повнорозмірна послідовність. Наприклад, білки B.t. можна використовувати в укороченій формі (коровий білок) (див., наприклад, Hofte et al. (1989), і Adang et al. (1985)). Як застосовують в даному описі, термін "білок" може включати функціонально активні укорочені форми. Як застосовують в даному описі, якщо не указано інакше, процент ідентичності і/або подібності послідовності двох нуклеїнових кислот визначають з використанням алгоритму Karlin and Altschul, 1990, модифікованого, як указано в Karlin and Altschul, 1993. Такий алгоритм включений в програми NBLAST і XBLAST Altschul et al., 1990. Нуклеотидні пошуки в BLAST здійснюють з використанням програми NBLAST, вага збігів=100, довжина "слова"=12. Можна використовувати Gapped BLAST, як описано в Altschul et al., 1997. При використанні програм BLAST і Gapped BLAST використовують параметри відповідних програм за умовчанням 16 UA 113882 C2 (NBLAST і XBLAST). Див. веб-сайт NCBI/NIH. З метою порівняння для отримання вирівнювання з пропусками використовували функцію AlignX Vector NTI Suite 8 (InforMax, Inc., North Bethesda, Md., U.S.A.) з параметрами за умовчанням. Вони були наступними: штраф за відкриття пропуску - 15, штраф за подовження пропуску - 6,66, і штраф за розділення пропуску - 8. 5 Таблиця 1 Клас амінокислот Неполярні Незаряджені полярні Кислі Основні 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Приклади амінокислот Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln Asp, Glu Lys, Arg, His Також можна змінювати різні властивості і тривимірні межі білка без несприятливого впливу на його активність/функціональність. Консервативні амінокислотні заміни можна допускати/включати таким чином, щоб не впливати несприятливо на активність і/або тривимірну конфігурацію молекули. Амінокислоти можна розділяти на наступні класи: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислі. Консервативні заміни, при яких амінокислоту одного класу замінюють іншою амінокислотою того ж типу, потрапляють в об'єм даного винаходу за умови, що заміна не впливає несприятливо на біологічну активність сполуки. У таблиці 1 представлений список прикладів амінокислот, що належать до кожного класу. У деяких випадках також можна здійснювати неконсервативні заміни. Однак переважні заміни не змінюють значно функціональну/біологічну активність білка. Як застосовують в даному описі, посилання на "виділені полінуклеотиди і/або "очищені" білки стосується цих молекул, коли вони не пов'язані з іншими молекулами, з якими їх виявляють в природі. Таким чином, посилання на "виділені" і/або "очищені" означає участь "рук людини", як представлено в даному описі. Наприклад, бактеріальний "ген" за даним винаходом, вміщений в рослину для експресії, є "виділеним полінуклеотидом". Аналогічно, білок, отриманий з бактеріального білка і продукований рослиною, є "виділеним білком". Внаслідок виродженості/надмірності генетичного коду амінокислотні послідовності, представлені в даному описі, можуть кодуватися множиною різних послідовностей ДНК. Фахівець в цій галузі може отримувати альтернативні послідовності ДНК, що кодують однакові або, по суті, однакові білки. Ці варіанти послідовностей ДНК входять в об'єм даного винаходу. Це більш детально описано нижче в розділі під назвою "Оптимізація послідовності для експресії в рослинах". Оптимізація послідовності для експресії в рослинах: Для досягнення високого рівня експресії гетерологічних генів в рослинах, як правило, переважно реконструювати гени таким чином, щоб вони більш ефективно експресувались в рослинних клітинах (цитоплазмі). Кукурудза є однією з таких рослин, в яких переважним може бути реконструювання гетерологічних генів перед трансформацією для підвищення рівня їх експресії у вказаній рослині. Таким чином, додатковим етапом в конструюванні генів, що кодують бактеріальний білок, є реконструювання гетерологічного гена для оптимальної експресії з використанням відхилення частоти використання кодонів, більш відповідного послідовності-мішені рослини, що належить до дводольних або однодольних видів. Послідовності також можна оптимізувати для експресії в будь-якому з більш конкретних типів рослин, що обговорюються де-небудь в даному описі. Трансгенні хазяїни: Гени за даним винаходом, кодуючі білки, можна вбудовувати в широкий спектр мікроорганізмів- або рослин-хазяїв. Даний винахід включає трансгенні рослинні клітини і трансгенні рослини. Переважними рослинами (і рослинними клітинами) є кукурудза, арабідопсис, тютюн, соя, бавовна, канола, рис, пшениця, газонна трава, бобово-злакові рослини (наприклад, люцерна і конюшина), пасовищні злаки і т. п. За даним винаходом також можна отримувати інші типи трансгенних рослин, такі як плодові рослини, овочеві культури, декоративні рослини і дерева. Загалом, в різних аспектах за даним винаходом можна використовувати дводольні і/або однодольні рослини. У переважних варіантах здійснення експресія гена, прямо або опосередковано, приводить до внутрішньоклітинної продукції (і збереження) білків, які цікавлять. Таким чином, рослини можна робити резистентними до гербіцидів. Таких хазяїв можна позначати як трансгенні, рекомбінантні, трансформовані і/або трансфіковані хазяїні і/або клітини. У деяких аспектах за даним винаходом (наприклад, при клонуванні і отриманні гена, який цікавить) клітини мікроорганізмів (переважно, бактерій) можна отримувати і використовувати стандартними способами з вигодою розкриття предмета винаходу. 17 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рослинні клітини, трансфіковані з використанням полінуклеотиду за даним винаходом, можна піддавати регенерації в цілі рослини. Даний винахід включає культури клітин, включаючи культури клітин тканин, рідкі культури і культури на твердому середовищі. Насіння, які продукуються і/або використовуються для отримання рослин за даним винаходом, також входять в об'єм даного винаходу. Інші рослинні тканини і частини також включені в даний винахід. Даний винахід аналогічно включає способи отримання рослин або клітин, що містять полінуклеотид за даним винаходом. Одним з переважних способів отримання таких рослин є посадка насіння за даним винаходом. Хоча рослини можуть бути переважними, даний винахід також включає продукцію високоактивної рекомбінантної AAD-12, наприклад, в штамі-акцепторі Pseudomonas fluorescens (Pf). Даний винахід включає переважні температури зростання для підтримки розчинної активної AAD-12 в цьому хазяїні; умови ферментації, в яких AAD-12 продукується як більше 40 % загального білка клітини або щонайменше 10 г/л; спосіб очищення, що приводить до ефективного виділення активної рекомбінантної AAD-12 з Pf-хазяїна; схему очищення, вихід якої становить щонайменше 10 г активної AAD-12 на кг клітин; схему очищення, вихід якої може становити 20 г активної AAD-12 на кг клітин; спосіб складання, при якому можна зберігати AAD12 і відновлювати її активність в розчині; і спосіб ліофілізації, при якому можна зберігати активність AAD-12 для тривалого зберігання і терміну придатності. Вбудовування генів для отримання трансгенних хазяїв: Одним з аспектів даного винаходу є трансформація/трансфекція рослин, рослинних клітин і інших клітин-хазяїв з використанням полінуклеотидів за даним винаходом, з яких експресуються білки за даним винаходом. Рослини, трансформовані таким чином, можна робити резистентними до різних гербіцидів з різними механізмами дії. Доступний широкий спектр способів вбудовування гена, що кодує бажаний білок, в хазяїнамішень в умовах, що роблять можливим стабільне збереження і експресію гена. Ці способи добре відомі фахівцям в цій галузі і описані, наприклад, в патенті США № 5135867. Вектори, що містять полінуклеотид AAD-12, включені в об'єм даного винаходу. Наприклад, для підготовки до вбудовування чужорідних генів у вищі рослини доступна велика кількість клонуючих векторів, що містять систему реплікації в Е. coli і маркер, що робить можливою селекцію трансформованих клітин. Вектори включають, наприклад, pBR322, серію pUC, серію M13 mp, pACYC184, і т. д. Таким чином, послідовність, яка кодує білок, можна вбудовувати у вектор у відповідну ділянку рестрикції. Отриману плазміду використовують для трансформації Е. coli. Клітини E. coli культивують у відповідному поживному середовищі, потім збирають і лізують. Плазміду виділяють за допомогою очищення від геномної ДНК. Як способи аналізу, як правило, здійснюють, аналіз послідовності, рестрикційний аналіз, електрофорез і інші способи біохімії і молекулярної біології. Після кожної маніпуляції використовувану послідовність ДНК можна рестрикувати і з'єднувати з наступною послідовністю ДНК. Послідовність кожної плазміди можна клонувати в однакові або різні плазміди. Залежно від способу вбудовування бажаних генів в рослину, необхідними можуть бути інші послідовності ДНК. Наприклад, якщо для трансформації рослинної клітини використовують плазміду Ti або Ri, то, щонайменше, правий край, але часто і правий край, і лівий край Т-ДНК плазміди Ti або Ri необхідно з'єднувати у вигляді фланкуючих областей генів, що підлягають вбудовуванню. Використання Т-ДНК для трансформації рослинних клітин активно досліджують і описують в EP 120 516; Hoekema (1985); Fraley et al. (1986); і An et al. (1985). Для вбудовування ДНК в рослинну клітину хазяїна доступна велика кількість способів. Ці способи включають трансформацію за допомогою Т-ДНК з використанням Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes як об'єктів трансформації, злиття, ін'єкцію, біолістику (бомбардування мікрочастинками), використання віскерів карбіду кремнію, обробку аерозольним шляхом, PEG або електропорацію, а також інші можливі способи. При використанні Agrobacteria для трансформації, ДНК, що підлягає вбудовуванню, необхідно клонувати в спеціальні плазміди, а саме в проміжний вектор або бінарний вектор. Проміжні вектори можна вбудовувати в плазміду Ti або Ri за допомогою гомологічної рекомбінації завдяки послідовностям, гомологічним послідовностям в Т-ДНК. Плазміда Ti або Ri також містить vir-область, необхідну для перенесення Т-ДНК. Проміжні вектори не можуть самостійно реплікуватися в Agrobacteria. Проміжний вектор можна перенести в Agrobacterium tumefaciens за допомогою плазміди-помічника (кон'югації). Бінарні вектори можуть самостійно реплікуватися і в Е. coli, і в Agrobacteria. Вони містять ген селективного маркера і лінкер або полілінкер, фланковані правою і лівою крайовими областями Т-ДНК. За допомогою них можна напряму трансформувати Agrobacteria (Holsters, 1978). Agrobacterium, що використовується як клітинахазяїн, повинна містити плазміду, яка несе vir-область. Vir-область необхідна для перенесення 18 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Т-ДНК в рослинну клітину. Можна включати додаткову Т-ДНК. Трансформовану таким чином бактерію використовують для трансформації рослинних клітин. Для перенесення ДНК в рослинну клітину рослинні експлантати можна культивувати переважно з Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes. Потім у відповідному середовищі, яке може містити антибіотики або біоциди для селекції, з інфікованого рослинного матеріалу (наприклад, шматочків листя, сегментів стебла, коріння, а також протопластів або клітин, що культивуються в суспензії) можна здійснювати регенерацію цілих рослин. Потім рослини можна тестувати на наявність вбудованої ДНК. У випадку ін'єкції і електропорації для плазмід немає спеціальних вимог. Можна використовувати загальноприйняті плазміди, такі як, наприклад, похідні pUC. Трансформовані клітини ростуть всередині рослин звичайним чином. Вони можуть утворювати статеві клітини і передавати трансформовані ознаки потомству рослин. Такі рослини можна вирощувати загальноприйнятим чином і схрещувати з рослинами, що мають ті ж трансформовані спадкові чинники або інші спадкові чинники. Отримані гібридні особні мають відповідні фенотипові властивості. У деяких переважних варіантах здійснення винаходу гени, що кодують бактеріальний білок, експресуються з транскрипційних одиниць, вбудованих в геном рослини. Переважно, вказаними транскрипційними одиницями є рекомбінантні вектори, які здатні до стабільної інтеграції в геном рослини і роблять можливою селекцію ліній трансформованих рослин, які експресують мРНК, що кодує білки. При вбудовуванні ДНК інтегрується в геном і є в ньому відносно стабільною (і не виходить назад). У нормі вона містить селективний маркер, що додає трансформованим рослинним клітинам резистентності до біоциду або антибіотику, такому як, крім іншого, канаміцин, G418, блеоміцин, гігроміцин або хлорамфеникол. Селективні маркери рослин, як правило, також можуть додавати резистентності до різних гербіцидів, таких як глуфосинат (наприклад, PAT/bar), гліфосат (EPSPS), інгібітори ALS (наприклад, імідазолінон, сульфонілкарбамід, триазолопіримідин сульфонанілід і ін.), бромоксиніл, резистентності до інгібіторів HPPD, інгібіторів PPO, інгібіторів ACC-ase і багатьох інших. Таким чином, використовуваний окремо маркер повинен робити можливим селекцію трансформованих клітин, а не клітин, що не містять вбудовану ДНК. Переважно, гени, які цікавлять, експресуються в рослинній клітині за допомогою конститутивних або індуцибельних промоторів. При експресії мРНК транслюється в білки, таким чином, амінокислоти, які цікавлять, вбудовуються в білок. Гени, що кодують білок, який експресується в рослинних клітинах, можуть знаходитися під контролем конститутивного промотору, тканиноспецифічного промотору або індуцибельного промотору. Існує декілька способів вбудовування чужорідних рекомбінантних векторів в рослинні клітини і отримання рослин, що стабільно зберігають і експресують вбудований ген. Такі способи включають вбудовування генетичного матеріалу, яким покривають мікрочастинки, безпосередньо в клітини (патенти США №№ 4945050 Cornell і 5141131 DowElanco, в цей час Dow AgroSciences, LLC). Крім того, рослини можна трансформувати за допомогою технології з використанням Agrobacterium, див. патенти США №№ 5177010 University of Toledo; 5104310 Texas А&M; європейську патентну заявку № 0131624B1; європейські патентні заявки №№ 120516, 159418B1 і 176112 Schilperoot; патенти США №№ 5149645, 5469976, 5464763, 4940838 і 4693976 Schilperoot; європейські патентні заявки №№ 116718, 290799, 320500 Max Planck; європейські патентні заявки №№ 604662 і 627752 і патент США № 5591616 Japan Tobacco; європейські патентні заявки №№ 0267159 і 0292435 і патент США № 5231019 Ciba Geigy, в цей час Syngenta; патенти США №№ 5463174 і 4762785 Calgene; і патенти США №№ 5004863 і 5159135 Agracetus. Інша технологія трансформації включає технологію з використанням віскерів. Див. патенти США №№ 5302523 і 5464765 Zeneca, в цей час Syngenta. Інша технологія трансформації з прямою доставкою ДНК включає технологію aerosol beam. Див. патент США № 6809232. Для трансформації рослин також використовують технологію електропорації. Див. WO 87/06614 Boyce Thompson Institute; патенти США №№ 5472869 і 5384253 Dekalb; і WO 92/09696 і WO 93/21335 Plant Genetic Systems. Крім того, для отримання трансгенних рослин, які експресують білок, який цікавить, також можна використовувати вірусні вектори. Наприклад, однодольні рослини можна трансформувати за допомогою вірусного вектора з використанням способів, що описуються в патенті США № 5569597 Mycogen Plant Science і Ciba-Geigy (в цей час Syngenta), а також патентах США №№ 5589367 і 5316931 Biosource, в цей час Large Scale Biology. Як указано вище, спосіб, яким конструкцію ДНК вбудовують в рослину-хазяїна, не є критичним для даного винаходу. Можна використовувати будь-який спосіб, що забезпечує ефективну трансформацію. Наприклад, різні способи трансформації рослинних клітин представлені в даному описі і включають використання плазмід Ti або Ri і т. п. для здійснення опосередкованої Agrobacterium трансформації. У багатьох випадках бажано мати конструкцію, 19 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що використовується для трансформації, яка фланкується з однієї або обох сторін крайовими областями Т-ДНК, більш конкретно - правою крайовою областю. Особливо корисно, коли для конструкції як спосіб трансформації використовують трансформацію, опосередковану Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes, хоча крайові області Т-ДНК можуть знайти застосування в інших способах трансформації. При використанні Agrobacterium для трансформації рослинних клітин можна використовувати вектор, який можна вбудовувати в хазяїна для гомологічної рекомбінації з Т-ДНК або плазмідою Ti або Ri, присутніх в хазяїні. Вбудовування вектора можна здійснювати за допомогою електропорації, трибатьківського схрещування і інших способів трансформації грамнегативних бактерій, відомих фахівцям в цій галузі. Спосіб трансформації Agrobacterium-хазяїна з використанням вектора не є критичним для даного винаходу. Плазміда Ti або Ri, що містить Т-ДНК для рекомбінації, може бути здатна або нездатна спричиняти утворення галів і не є критичною для вказаного винаходу за умови, що у вказаному хазяїні присутні vir-гени. У деяких випадках при використанні Agrobacterium для трансформації експресуючу конструкцію всередині крайових областей Т-ДНК будуть вбудовувати в широкий спектр векторів, таких як pRK2 або його похідні, як описано в Ditta et al. (1980) і EPO 0 120 515. У експресуючу конструкцію і Т-ДНК будуть включати один або декілька маркерів, як представлено в даному описі, що роблять можливою селекцію трансформованих Agrobacterium і трансформованих рослинних клітин. Конкретний використовуваний маркер не є суттєвим для даного винаходу, при цьому переважний маркер залежить від використовуваного хазяїна і конструкції. Для трансформації рослинних клітин з використанням Agrobacterium експлантати можна комбінувати і інкубувати з трансформованими Agrobacterium протягом періоду часу, достатнього, щоб зробити можливою їх трансформацію. Після трансформації Agrobacteria знищують за допомогою селекції з використанням відповідного антибіотика і культивують рослинні клітини з відповідним селективним середовищем. Після утворення калюсів можна стимулювати утворення пагонів, використовуючи відповідні рослинні гормони, способами, добре відомими в галузі культивування рослинних тканин і регенерації рослин. Однак проміжна стадія калюсу не завжди є обов'язковою. Після утворення пагонів вказані рослинні клітини можна перенести в середовище, яке стимулює утворення кореня, таким чином, завершуючи регенерацію рослини. Потім рослини можна вирощувати для отримання насіння і вказане насіння можна використовувати для отримання майбутніх поколінь. Незалежно від способу трансформації, ген, що кодує бактеріальний білок, переважно, вбудовують у вектор для перенесення гена, адаптований для експресії вказаного гена в рослинній клітині за допомогою включення у вектор промоторного регуляторного елемента рослин, а також 3'-нетрансльованих областей термінації транскрипції, такої як Nos і т. п. У доповнення до численних технологій трансформації рослин також можна варіювати тип тканини, що приводиться в контакт з чужорідними генами. Така тканина буде включати, як необмежувальні приклади, ембріогенну тканину, тканину калюсу типів I, II і III, гіпокотиль, меристему, тканину кореня, тканини для експресії у флоемі і т. п. Майже всі тканини рослин можна трансформувати при дедиференціюванні з використанням відповідних способів, представлених в даному описі. Як указано вище, при бажанні можна використовувати множину селективних маркерів. Перевага конкретного маркера залишається на розсуд фахівця в цій галузі, але можна використовувати будь-який з наступних селективних маркерів разом з будь-яким іншим геном, не вказаним в даному описі, який може функціонувати як селективний маркер. Такі селективні маркери включають, як необмежувальні приклади, ген аміноглікозидфосфотрансферази транспозону Tn5 (Aph II), що кодує резистентність до антибіотиків канаміцину, неоміцину і G41; резистентність до гігроміцину; резистентність до метотрексату, а також гени, що кодують резистентність або стійкість до гліфосату; фосфінотрицину (біалафосу або глуфосинату); ALSінгібуючих гербіцидів (імідазолінонів, сульфонілкарбамідів і триазолопіримідинових гербіцидів), інгібіторів ACC-ase (наприклад, арилоксипропіонатів або циклогександіонів) і ін., таких як бромоксиніл, і інгібіторів HPPD (наприклад, мезотриону) і т. п. У доповнення до селективного маркера бажаним може бути використання репортерного гена. У деяких випадках репортерний ген можна використовувати з селективним маркером або без нього. Репортерними генами є гени, як правило, не присутні в організмі- або тканиніреципієнті і, як правило, кодуючі білки, що приводять до деяких фенотипових змін або ферментативної властивості. Приклади таких генів представлені в Weising et al., 1988. Переважні репортерні гени включають ген бета-глюкуронідази (GUS) локусу uidA Е. coli, ген хлорамфеніколацетилтрансферази з Tn9 E. coli, ген зеленого флуоресцентного білка біолюмінесцентної медузи Aequorea victoria і гени люциферази світляка Photinus pyralis. Потім 20 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можна здійснювати аналіз для визначення експресії репортерного гена у відповідний час після вбудовування вказаного гена в реципієнтні клітини. Такий переважний аналіз включає використання гена, що кодує бета-глюкуронідазу (GUS), локусу uidA Е. coli, як описано в Jefferson et al., (1987), для ідентифікації трансформованих клітин. У доповнення до промоторних регуляторних елементів рослин в рослинних клітинах для експресії чужорідних генів можна ефективно використовувати промоторні регуляторні елементи з множини джерел. Наприклад, можна використовувати промоторні регуляторні елементи бактеріального походження, такі як промотор октопінсинтази, промотор нопалінсинтази, промотор манопінсинтази; промотори вірусного походження, такі як промотор вірусу мозаїки цвітної капусти (35S і 19S), 35T (що є реконструйованим промотором 35S, див. патент США № 6166302, особливо приклад 7E) і т. п. Промоторні регуляторні елементи рослин включають, як необмежувальні приклади, промотор малої субодиниці рибулозо-1,6-біфосфат (RUBP)карбоксилази (ssu), промотор бета-конгліциніну, промотор бета-фазеоліну, промотор ADH, промотори білків теплового шоку і тканиноспецифічні промотори. Можуть бути присутніми інші елементи, такі як послідовності прикріплення до матриксу, послідовності зв'язування з ядерним матриксом, інтрони, енхансери, послідовності поліаденілування і т. п., і, таким чином, можуть поліпшувати ефективність транскрипції або інтеграцію ДНК. Такі елементи можуть бути або не бути необхідними для функціонування ДНК, хоча вони можуть забезпечувати кращу експресію або функціонування ДНК, впливаючи на транскрипцію, стабільність мРНК і т. п. Такі елементи, при бажанні, можна включати в ДНК для досягнення оптимального функціонування трансформованої ДНК в рослині. Типові елементи включають, як необмежувальні приклади, Adh-інтрон 1, Adh-інтрон 6, лідерну послідовність білка оболонки вірусу мозаїки люцерни, послідовності UTR осмотину, лідерну послідовність білка оболонки вірусу смугастості кукурудзи, а також інші, доступні фахівцям в цій галузі. Також можна використовувати конститутивні промоторні регуляторні елементи, таким чином, регулюючи безперервну експресію гена у всіх типах клітин і в будь-який момент часу (наприклад, актин, убіквітин, CaMV 35S і т. п.). Тканиноспецифічні промоторні регуляторні елементи відповідають за експресію гена в конкретних типах клітин або тканин, таких як листя або насіння (наприклад, зеїн, олеозин, напін, ACP, глобулін і т. п.), і їх також можна використовувати. Промоторні регуляторні елементи також можуть бути активними (або неактивними) протягом конкретної фази росту рослини, а також активними в тканинах і органах рослини. Їх приклади включають, як необмежувальні приклади, специфічні для пилка, ембріоспецифічні, специфічні для кукурудзяних приймочок, специфічні для бавовняного волокна, специфічні для коріння, специфічні для ендосперму насіння і т. п. В конкретних обставинах бажаним може бути використання індуцибельного промоторного регуляторного елемента, що відповідає за експресію генів у відповідь на конкретний сигнал, такий як: фізичний стимул (гени білків теплового шоку), світло (RUBP-карбоксилаза), гормон (Em), метаболіти, хімічні речовини (чутливі до тетрацикліну) і стрес. Можна використовувати інші бажані транскрипційні і трансляційний елементи, що функціонують в рослинах. У цій галузі відома множина специфічних для рослин векторів для перенесення генів. Для експресії бактеріального білка також можна використовувати системи на основі РНКвірусів рослин. При цьому ген, що кодує білок, можна вбудовувати в промоторну область гена білка оболонки відповідного вірусу рослин, яким інфікують рослину-хазяїна, яка цікавить. Потім білок може експресуватися, таким чином, забезпечуючи захист рослини від пошкодження гербіцидів. Системи на основі РНК-вірусів рослин описують в патенті США № 5500360 Mycogen Plant Sciences, Inc. і патентах США №№ 5316931 і 5589367 Biosource, в цей час Large Scale Biology. Засоби додаткового підвищення рівнів стійкості або резистентності. У даному описі показано, що рослинам за даним винаходом можна додавати нових ознак резистентності до гербіцидів без несприятливих впливів на фенотип, , що спостерігаються, включаючи врожайність. Такі рослини входять в об'єм даного винаходу. Рослини, приведені як приклади і запропоновані в даному описі, можуть витримувати 2-, 3-, 4- і 5-кратні типові норми внесення, наприклад, щонайменше одного гербіциду за даним винаходом. Поліпшення цих рівнів стійкості входять в об'єм даного винаходу. Наприклад, в цій галузі відомі різні способи, і їх передбачувано можна оптимізувати і розробляти далі для підвищення експресії вказаного гена. Один з таких способів включає підвищення копійності генів AAD-12 за даним винаходом (в експресуючих касетах і т. п.). Трансформовані об'єкти також можна піддавати селекції на користь генів, які мають множину копій. Можна використовувати сильні промотори і енхансери для "форсування" експресії. Приклади таких промоторів включають переважний промотор 35T, в якому використовують 21 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 енхансери 35S. Для таких цілей включені промотори 35S, убіквітину кукурудзи, убіквітину арабідопсису, актину A.t. і CSMV. Також переважними є інші сильні вірусні промотори. Енхансери включають подвійний енхансер 4 OCS і 35S. Для підвищення ефективності трансформації і експресії трансгена також можна використовувати послідовності прикріплення до матриксу (MAR). Для варіантів здійснення даного винаходу також можна використовувати перетасовування (направлений розвиток) і чинники транскрипції. Також можна конструювати варіанти білків, відмінні на рівні послідовності, але що зберігають ту ж або схожу с необхідну трипільнувимірну структуру, поверхневий розподіл заряду і т. п. див., наприклад, патент США № 7058515; Larson et al., Protein Sci. 2002 11: 28042813, "Thoroughly sampling sequence space: Large-scale protein design of structural ensembles"; Crameri et al., Nature Biotechnology 15, 436-438 (1997), "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling"; Stemmer, W. P. C. 1994. "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; Stemmer, W. P. C. 1994. "Rapid evolution of а protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370: 389-391; Stemmer, W. P. C. 1995. Searching sequence space. Bio/Technology 13: 549-553; Crameri, А., et al. 1996. "Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling" Nature Medicine 2: 100-103; and Crameri, А., et al. 1996. "Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling" Nature Biotechnology 14: 315-319. Активність рекомбінантних полінуклеотидів, вбудованих в рослинні клітини, може залежати від впливу ендогенної ДНК рослин, суміжної з вставкою. Таким чином, іншим варіантом є використання переваги об'єктів, про які відомо, що вони є прекрасними ділянками для інсерцій в геномі рослин. Див. наприклад WO 2005/103266 A1, що стосується об'єктів бавовни crylF і crylAc; геном AAD-12 за даним винаходом можна заміняти в локусах генома вставки crylF і/або crylAc. Таким чином, за даним винаходом можна використовувати, наприклад, направлену гомологічну рекомбінацію. Цей тип технології є об'єктом, наприклад, WO 03/080809 A2 і відповідної опублікованої патентної заявки США № 20030232410, що стосується використання цинкових пальців для направленої рекомбінації. Також відоме використання рекомбінази (наприклад, cre-10 х і flp-frt). Вважають, що детоксифікація AAD-12 відбувається в цитоплазмі. Таким чином, аспекти даного винаходу включають засоби для додаткової стабілізації цього білка і мРНК (включаючи блокування деградації мРНК), і, таким чином, можна використовувати відомі в цій галузі способи. Можна конструювати білки, резистентні до деградації протеазами і т. п. (ділянки розщеплення протеазами можна ефективно видаляти, реконструюючи амінокислотну послідовність білка). Такі варіанти здійснення включають використання 5'- і 3'-структури типу "стебло-петля", таких як UTR з осмотину, і per5 (AU-багаті 5'-нетрансльовані послідовності). Також можна використовувати 5'-кепи, такі як 7-метил- або 2'-O-метильні групи, наприклад, залишок 7-метилгуанілової кислоти. Див., наприклад: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 74, No. 7, pp. 2734-2738 (July 1977) Importance of 5'-terminal blocking structure to stabilize mRNA in eucaryotic protein synthesis. Також можна використовувати білкові комплекси або ліганд-блокуючі групи. У об'ємі даного винаходу також можна здійснювати комп'ютерний дизайн 5'- або 3'-UTR, найбільш прийнятних для AAD-12 (синтетичні шпильки). Комп'ютерне моделювання загалом, а також перетасовування генів і направлений розвиток описують будь-де в даному описі. Більш конкретно, що стосується комп'ютерного моделювання і UTR, способи комп'ютерного моделювання для використання в прогнозуванні/оцінці похідних 5'- і 3'-UTR за даним винаходом включають, як необмежувальні приклади: MFold версії 3.1, доступний в Genetics Corporation Group, Madison, Wis. (див. Zucker et al., Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: А Practical Guide. In RNA Biochemistry and Biotechnology, 11-43, J. Barciszewski & B. F. C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, (1999); Zucker et al., Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure. J. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999); Zucker et al., RNA Secondary Structure Prediction. In Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry S. Beaucage, D. E. Bergstrom, G. D. Glick, and R. A. Jones eds., John Wiley & Sons, New York, 11.2.1-11.2.10, (2000)), COVE (аналіз структури РНК з використанням коваріаційних моделей (стохастичних безконтекстних граматичних способів)) v. 2.4.2 (Eddy & Durbin, Nucl. Acids Res. 1994, 22: 20792088) вільно поширюваний як початкова програма і який можна завантажувати за допомогою доступу до веб-сайту genetics.wustl.edu/eddy/software/, і FOLDALIGN, також вільно поширюваний і доступний для завантаження на веб-сайті bioinf.au.dk.FOLDALIGN/ (див. Finding the most significant common sequence and structure motifs in а set of RNA sequences. J. Gorodkin, L. J. Heyer and G. D. Stormo. Nucleic Acids Research, Vol. 25, no. 18 pp 3724-3732, 1997; Finding 22 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Common Sequence and Structure Motifs in а set of RNA Sequences. J. Gorodkin, L. J. Heyer, and G. D. Stormo. ISMB 5; 120-123, 1997). Варіанти здійснення за даним винаходом можна використовувати в комбінації з природно розвиненими або хімічно індукованими мутантами (мутантів можна піддавати селекції за допомогою способів скринінгу, а потім трансформувати з використанням AAD-12 і, можливо, інших генів). Можна комбінувати рослини за даним винаходом з резистентністю до ALS і/або розвиненою резистентністю до гліфосату. Резистентність до амінопіраліду, наприклад, також можна комбінувати або "піддавати стекінгу" з геном AAD-12. Загальноприйняті способи схрещування також можна комбінувати з даним винаходом для отримання сильної комбінації, інтрогресії і поліпшення бажаних ознак. Додаткові поліпшення також включають використання разом з відповідними антидотами для додаткового захисту рослин і/або для надання перехресної резистентності до більшої кількості гербіцидів. Антидоти, як правило, діють, посилюючи імунну систему рослин за допомогою активації/експресії cP450. Антидоти є хімічними засобами, що знижують фітотоксичність гербіцидів відносно сільськогосподарських культур за допомогою фізіологічного або молекулярного механізму, не порушуючи ефективність контролю бур'янів. Антидоти гербіцидів включають беноксакор, клоквінтоцет, ціометриніл, дихлормід, дициклонон, діетолят, фенхлоразол, фенклорим, флуразол, флуксофеним, фурилазол, ізоксадифен, мефенпір, мефенат, нафтойний ангідрид і оксабетриніл. У варіантах здійснення даного винаходу також можна використовувати рослинні активатори (новий клас сполук, що захищають рослини за допомогою активації їх механізмів захисту). Вони включають ацибензолар і пробеназол. Можна використовувати комерційно доступні антидоти для захисту великонасінних трав'янистих сільськогосподарських культур, таких як кукурудза, сорго звичайне і культура рису, що висівається у воду, при нанесенні передпосівних або передсходових гербіцидів з сімейств тіокарбамату і хлорацетаніліду. Також розробляють антидоти для захисту озимих зернових сільськогосподарських культур, таких як пшениця, при післясходовому нанесенні арилоксифеноксипропіонатних і сульфонілкарбамідних гербіцидів. Також добре відоме використання антидотів для захисту кукурудзи і рису від гербіцидів сульфонілкарбаміду, імідазолінону, циклогександіону, ізоксазолу і трикетону. Індуковане антидотом підвищення детоксифікації гербіциду в захищених рослинах широко визнають як основний механізм дії антидота. Антидоти індукують кофактори, такі як глутатіон і гербіцид-детоксифікуючі ферменти, такі як глутатіон-S-трансферази, цитохром-P450-монооксигенази і глюкозилтрансферази. Hatzios KK, "Burgos N (2004) Metabolism-based herbicide resistance: regulation by safeners, " Weed Science: Vol. 52, No. 3 pp. 454-467. Використання гена цитохром-p450-монооксигенази, підданого стекінгу з AAD-12, є одним з переважних варіантів здійснення. Існують P450, що беруть участь в метаболізмі гербіцидів; cP450 може мати, наприклад, походження з ссавця або рослинне походження. Відомо, що у вищих рослин цитохром-P450-монооксигеназа (P450) здійснює повторний метаболізм. Вона також відіграє важливу роль в окислювальному метаболізмі ксенобіотиків у взаємодії з NADPHцитохром-P450-оксидоредуктазою (редуктазою). Повідомляють, що резистентність до деяких гербіцидів є результатом метаболізму за допомогою P450, а також глутатіон-S-трансферази. За допомогою молекулярного клонування охарактеризували ряд мікросомальних видів P450, що беруть участь в метаболізмі ксенобіотиків у ссавців. Повідомляють, що деякі з них ефективно метаболізують декілька гербіцидів. Таким чином, трансгенні рослини з P450 рослин або ссавців можуть демонструвати резистентність до декількох гербіцидів. Одним з переважних варіантів здійснення викладеного вище є застосування cP450 для резистентності до ацетохлору (продукти на основі ацетохлору включають гербіциди Surpass®, Keystone®, Keystone LA, FulTime® і TopNotch®) і/або трифлураліну (такому як Treflan®). Деякі переважні варіанти здійснення включають таку резистентність у сої і/або кукурудзи. Додаткові інструкції, що стосуються таких варіантів здійснення, див., наприклад, в Inui et al., "А selectable marker using cytochrome P450 monooxygenases for Arabidopsis transformation, " Plant Biotechnology 22, 281-286 (2005) (селекції, що стосуються системи для трансформації Arabidopsis thaliana за допомогою Agrobacterium tumefaciens, в якій використовують цитохромP450-монооксигенази людини, метаболізуючі гербіциди; стійкі до гербіцидів саджанці трансформували і піддавали селекції з використанням гербіцидів ацетохлор, амипрофос-метил, хлорпрофам, хлорсульфурон, норфлуразон і пендиметалін); Siminszky et al., "Expression of а soybean cytochrome P450 monooxygenase cDNA in yeast and tobacco enhances the metabolism of phenylurea herbicides, " PNAS Vol. 96, Issue 4, 1750-1755, Feb. 16, 1999; Sheldon et al, Weed Science: Vol. 48, No. 3, pp. 291-295, "А cytochrome P450 monooxygenase cDNA (CYP71A10) 23 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 confers resistance to linuron in transgenic Nicotiana tabacum"; "and Phytoremediation of the herbicides atrazine and metolachlor by transgenic rice plants expressing human CYP1A1, CYP2B6, and CYP2C19," J Agric Food Chem. 2006 Apr. 19; 54(8):2985-91 (що стосуються тестування цитохром-p450-монооксигенази людини в рисі, де, як повідомляють, рослини рису демонстрували високу стійкість до хлорацетамідів (ацетохлору, алахлору, метоахлору, претилахлору і тенилхлору), оксіацетамідів (мефенацету), піридазинонів (норфлуразону), 2,6динітроаналінів (трифлураліну і пендиметаліну), фосфамідатів (аміпрофос-метилу, тіокарбаматів (пірибутикарбу) і сечовини (хлортолурону)). Також можна змінювати або використовувати різні хімічні склади 2,4-D, щоб зробити гени AAD-12 за даним винаходом більш ефективними. Такі можливі зміни включають отримання кращих субстратів і кращих відхідних груп (більшої електронегативності). Для підвищення гербіцидної активності разом з 2,4-D також можна використовувати інгібітори транспорту ауксинів (наприклад, дифлуфензопір). Якщо конкретно не указано або очевидно інше, терміни в однині означають "щонайменше один", як застосовують в даному описі. Всі патенти, патентні заявки, попередні заявки і публікації, вказані або процитовані в даному описі, включені в даний опис як посилання в повному об'ємі доти, поки вони не суперечать представленому в даному описі. Далі приведені приклади, в яких ілюструють способи практичного здійснення винаходу. Ці приклади не можна тлумачити як такі, обмежувальні. Всі процентні частки являють собою частки по масі, і всі пропорції в сумішах розчинників є пропорціями по об'єму, якщо не указано інакше. ПРИКЛАДИ ПРИКЛАД 1 Спосіб ідентифікації генів, що додають резистентності до 2,4-D в польових умовах Як спосіб ідентифікації генів, що мають властивості деградації гербіцидів в польових умовах, можна здійснювати пошук в існуючих на даний момент загальнодоступних базах даних, таких як NCBI (National Center for Biotechnology Information). Для початку необхідно мати вже ідентифіковану послідовність функціонального гена, що кодує білок з бажаними властивостями (тобто активність α-кетоглутаратдіоксигенази). Потім цю білкову послідовність використовують як ввідну інформацію для алгоритму BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1997) для порівняння з доступними білковими послідовностями, що зберігаються в NCBI. Використовуючи параметри за умовчанням, за допомогою цього пошуку отримують приблизно 100 гомологічних білкових послідовностей на різних рівнях. Вони знаходяться в діапазоні від високоідентичних (85-98 %) до малоідентичних (23-32 %) на рівні амінокислот. Як правило, очікують, що тільки послідовності з високою гомологією будуть зберігати властивості, схожі з властивостями ввідної послідовності. У цьому випадку будуть вибирати тільки послідовності з ≥50 % гомології. Як приведено в даному описі як приклад, можна використовувати клонування і гомологів, які рекомбінантно експресуються, всього з 31 % консервативних амінокислот (відносно tfdA з Ralstonia eutropha) для надання комерційних рівнів резистентності не тільки до передбачуваного гербіциду, але також і до субстратів, раніше ніколи не тестованими з цими ферментами. За допомогою бази даних NCBI (див. веб-сайт ncbi.nlm.nih.gov; обліковий № AF516752) як гомолога всього з 31 % ідентичності амінокислот відносно tfdA ідентифікували єдиний ген (sdpA). Процент ідентичності визначали, спочатку переводячи послідовності ДНК sdpA і tfdA, що зберігаються в базі даних, в білки, потім використовуючи ClustalW в пакеті програм VectorNTI для здійснення множинного вирівнювання послідовностей. ПРИКЛАД 2 Оптимізація послідовності для експресії в рослинах і бактеріях Для досягнення більш високих рівнів експресії гетерологічних генів в рослинах переважним може бути реконструювання кодуючої білок послідовності генів таким чином, щоб вони більш ефективно експресувались в рослинних клітинах. Кукурудза є однією з таких рослин, де переважним може бути реконструювання гетерологічної області, що кодує білок, перед трансформацією для підвищення рівня експресії гена і рівня білка, що кодується в рослині. Таким чином, додатковим етапом в конструюванні генів, що кодують бактеріальний білок, є реконструювання гетерологічного гена для оптимальної експресії. 24 UA 113882 C2 Таблиця 2 Узагальнення даних про вміст G+С в областях генів кукурудзи, що кодують білок Клас білка Метаболічні ферменти (76) Структурні білки (18) Регуляторні білки (5) Неохарактеризовані білки (9) Всі білки (108) Діапазон % G+С 44,4-75,3 48,6-70,5 57,2-68,8 41,5-70,3 44,4-75,3 Середній % G+Cb 59,0 (.+-.8,0) 63,6 (.+-.6,7) 62,0 (.+-.4,9) 64,3 (.+-.7,2) з 60,8 (.+-.5,2) а Кількість генів в класі приведена в дужках Стандартне відхилення приведене в дужках с Середнє для об'єднаних груп ігнорують в обчисленнях середнього b 5 10 15 20 25 30 35 Однією з причин реконструювання бактеріального білка для експресії в кукурудзі є неоптимальний вміст G+С в нативному гені. Наприклад, дуже низький вміст G+С в багатьох нативних бактеріальних генах (і подальше зміщення у бік високого вмісту А+Т) приводить до утворення послідовностей, що імітують або дублюють послідовності контролю гена рослини, які, як відомо, є, значною мірою багатими А+Т. Наявність деяких А+Т-багатих послідовностей в ДНК генів, що вбудовуються в рослини (наприклад, областей ТАТА-бокс, генів, що в нормі виявляються в промоторах), може приводити до аномальної транскрипції генів. З іншого боку, наявність інших регуляторних послідовностей в транскрибованій мРНК (наприклад, послідовностей сигналу поліаденілування (AAUAAA) або послідовностей, комплементарних малій ядерній РНК, що бере участь в сплайсингу пре-мРНК) може приводити до нестабільності РНК. Таким чином, однією з цілей при конструюванні генів, що кодують бактеріальний білок, для експресії в кукурудзі, більш переважно, що позначаються як гени, оптимізовані для рослин, є отримання послідовності ДНК, що має більш високий вміст G+С, і, переважно, близький до такого в генах кукурудзи, що кодують метаболічні ферменти. Іншою метою при конструюванні генів, які оптимізовані для рослин і кодують бактеріальний білок, є отримання послідовності ДНК, в якій модифікації послідовності не перешкоджають трансляції. У таблиці 2 показано, наскільки високим є вміст G+С в кукурудзі. Що стосується даних в таблиці 2, кодуючі області генів отримували із записів в GenBank (випуск 71), і композиції основ обчислювали з використанням програми MacVector™ (Accelerys, San Diego, Calif.). При обчисленнях ігнорували послідовності інтронів. Внаслідок пластичності, що забезпечується надмірністю/виродженістю генетичного коду (тобто деякі амінокислоти визначаються декількома кодонами), еволюція геномів в різних організмах або класах організмів привела до різного використання надмірних кодонів. Це "відхилення частоти використання кодонів" відображене в середній композиції основ в областях, що кодують білок. Наприклад, організми з відносно низьким вмістом G+С використовують кодони, що містять А або Т в третьому положенні надмірних кодонів, в той час як організми, що має високий вміст G+С, використовують кодони, що містять G або С в третьому положенні. Вважають, що наявність "мінорних" кодонів в мРНК може знижувати абсолютну швидкість трансляції цієї мРНК, особливо коли відносний надлишок навантаженої тРНК, відповідної мінорному кодону, є низьким. Продовженням цього є те, що зниження швидкості трансляції за допомогою окремих мінорних кодонів буде, щонайменше, адитивний для численних мінорних кодонів. Таким чином, мРНК, що має високий відносний вміст мінорних кодонів, буде мати, відповідно, низьку швидкість трансляції. Ця швидкість буде відбиватися в подальших низьких рівнях білка, що кодується. Таблиця 3 Переважні кодони для амінокислот в білках, які експресуються в кукурудзі Амінокислота Аланін Цистеїн Аспарагінова кислота Кодон * GCC/GCG TGC/TGT GAC/GAT 25 UA 113882 C2 Таблиця 3 Переважні кодони для амінокислот в білках, які експресуються в кукурудзі Амінокислота Глутамінова кислота Фенілаланін Гліцин Гістидин Ізолейцин Лізин Лейцин Метіонін Аспарагін Пролін Глутамін Аргінін Серин Треонін Валін Триптофан Тирозин Стоп-кодон 5 10 15 20 25 30 35 Кодон * GAG/GAA TTC/TTT GGC/GGG CAC/CAT ATC/ATT AAG/AAA CTG/CTC ATG AAC/AAT CCG/CCA CAG/CAA AGG/CGC AGC/TCC ACC/ACG GTG/GTC TGG TAC/TAT TGA/TAG При конструюванні генів, що кодують бактеріальний білок, для експресії в кукурудзі (або іншій рослині, такій як бавовна або соя) визначають відхилення частоти використання кодонів в рослині. Відхилення частоти використання кодонів в кукурудзі є статистичним розподілом кодонів, які рослина використовує для кодування своїх білків, і переважне використання кодонів представлене в таблиці 3. Після визначення відхилення визначають процентну частоту кодонів в генах, які цікавлять. Необхідно визначати переважні первинні кодони в рослині, а також переважні кодони другого, третього і четвертого вибору, якщо існує можливість множинного вибору. Потім можна конструювати нову послідовність ДНК, що кодує амінокислотну послідовність в бактеріальному білку, але нова послідовність ДНК відрізняється від нативної бактеріальної послідовності ДНК (що кодує білок) замінами на кодони рослини (перші переважні, другі переважні, треті переважні або четверті переважні) для визначення амінокислот в кожному положенні в амінокислотній послідовності білка. Потім нову послідовність аналізують на предмет ділянок розпізнавання рестрикційних ферментів, які можна отримувати за допомогою модифікації. Ідентифіковані ділянки додатково модифікують, замінюючи кодони переважними кодонами першого, другого, третього або четвертого вибору. Іншими ділянками в послідовності, які можуть впливати на транскрипцію або трансляцію гена, який цікавить, є екзон-інтронні зчленування (5' або 3'), сигнали поліаденілування або сигнали термінації для РНК-полімерази. Послідовність додатково аналізують і модифікують для зниження частоти TA- або GC-дуплетів. У доповнення до дуплетів, блоки G або С в послідовності, що містять приблизно більше чотирьох однакових залишків, можуть впливати на транскрипцію послідовності. Таким чином, ці блоки також модифікують, замінюючи кодони першого або другого вибору і т. д. переважними кодонами наступного вибору. Переважно, гени, які оптимізовані для рослин і кодують бактеріальний білок, містять приблизно 63 % кодонів першого вибору, від приблизно 22 % до приблизно 37 % кодонів другого вибору і від приблизно 15 % до приблизно 0 % кодонів третього або четвертого вибору, де загальна процентна частка становить 100 %. Найбільш переважно, гени, оптимізовані для рослин, містять приблизно 63 % кодонів першого вибору, щонайменше приблизно 22 % кодонів другого вибору, приблизно 7,5 % кодонів третього вибору і приблизно 7,5 % кодонів четвертого вибору, де загальна процентна частка становить 100 %. Спосіб, що описується вище, дозволяє фахівцеві в цій галузі модифікувати гени, які є чужорідними для конкретної рослини, таким чином, що гени оптимально експресуються в рослинах. Спосіб додатково проілюстрований в заявці PCT WO 97/13402. Таким чином, для конструювання генів, які оптимізовані для рослин і кодують бактеріальний білок, послідовність ДНК конструюють кодуючою амінокислотну послідовність вказаного білка з використанням надмірного генетичного коду, встановленого по таблиці відхилень частот 26 UA 113882 C2 5 10 15 20 25 30 використання кодонів, складеній з послідовностей генів конкретної рослини або рослин. Послідовність ДНК, що отримується, має більш високий ступінь різноманітності кодонів, бажану композицію основ, може містити стратегічно розташовані ділянки розпізнавання рестрикційних ферментів і не містить послідовності, які можуть перешкоджати транскрипції гена або трансляціям продукту мРНК. Таким чином, для трансформації хазяїв, включаючи рослини, можна використовувати синтетичні гени, функціонально еквівалентні білкам/гену за даним винаходом. Додаткові інструкції, що стосуються отримання синтетичних генів можна знайти, наприклад, в патенті США № 5380831. Аналіз перебудов в AAD-12 рослин: При широкому аналізі 876 пар основ (п.н.) послідовності ДНК, що кодує області нативного AAD-12 (SEQ ID NO: 1), виявляли наявність декількох мотивів послідовності, які, як вважають, є несприятливими для оптимальної експресії в рослині, а також неоптимальну композицію кодонів. Білок, що кодується SEQ ID NO: 1 (AAD-12), представлений як SEQ ID NO: 2. Для поліпшення продукції рекомбінантного білка в однодольних, а також дводольних рослинах, розробляли "оптимізовану для рослин" послідовність ДНК AAD-12 (v1) (SEQ ID NO: 3), що кодує білок (SEQ ID NO: 4), що є тим же, що і нативний SEQ ID NO: 2, за винятком додавання залишку аланіну у другому положенні (підкреслено в SEQ ID NO: 4). Додатковий кодон для аланіну (GCT; підкреслений в SEQ ID NO: 3) кодує частину ділянки розпізнавання рестрикційного ферменту NcoI (CCATGG), що перекривається з ініціюючим трансляцію кодоном ATG. Таким чином, він служить подвійній меті полегшення подальших дій по клонуванню одночасно з поліпшенням контексту послідовності, що оточує ініціаторний кодон ATG, для оптимізації ініціації трансляції. Білки, що кодуються нативною і оптимізованою для рослин (v1) кодуючими областями, є на 99,3 % ідентичними, відрізняючись тільки по амінокислоті в положенні 2. На відміну від цього, нативні і оптимізовані для рослин (v1) послідовності ДНК кодуючих областей є тільки на 79,7 % ідентичними. У таблиці 4 показані відмінності композицій кодонів нативної (колонки А і D) і оптимізованої для рослин (колонки В і Е) послідовностей, і приведене порівняння з теоретичною оптимізованою для рослин послідовністю (колонки С і F). При розгляді таблиці 4 видно, що нативна і оптимізована для рослин кодуючі області, хоч і кодують приблизно ідентичні білки, істотно відрізняються одна від одної. Версія, оптимізована для рослин, (v1) точно імітує композицію кодонів в теоретичній оптимізованій для рослин кодуючій області, що кодує білок AAD-12. "Amino acid" - "Амінокислота", "Native #" - "Кількість в нативній послідовності", "Plant Opt v1 #" - "Кількість в оптимізованій для рослин версії (v1)", "Theor. Plant Opt. #" - "Кількість в теоретичній оптимізованій для рослин версії", "Totals" - "Всього". 35 Таблиця 4 Порівняння композиції кодонів кодуючих областей нативної AAD-12, оптимізованої для рослин версії (v1) і теоретичної оптимізованої для рослин версії А АміноКодон кислота ALA (А) GCA GCC GCG GCT ARG (R) AGA AGG CGA CGC CGG CGT ASN (N) AAC AAT ASP (D) GAC GAT CYS (C) TGC TGT Кількість в нативній послідовності 1 35 7 0 0 0 0 15 3 0 3 1 15 2 3 0 В С Кількість в Кількість в теоретичній оптимізооптимізованій для ваній для рослин рослин версії (v1) версії 10 11 16 15 0 0 18 17 4 5 4 6 0 0 6 4 0 0 4 3 2 2 2 2 9 9 8 8 2 2 1 1 D АміноКодон кислота LEU (L) LYS (K) MET (M) PHE (F) PRO (Р) SER (S) 27 CTA CTC CTG CTT TTA TTG AAA AAG ATG TTC TTT CCA CCC CCG CCT AGC Е F Кількість в Кількість в Кількість в теоретичній оптимізованій нативній оптимізованій для рослин послідовності для рослин версії (v1) версії 0 1 23 0 0 0 1 5 10 7 1 0 9 5 0 5 0 8 0 8 0 8 1 5 10 5 3 5 4 0 5 4 0 8 0 8 0 8 2 4 10 5 3 6 4 0 5 3 UA 113882 C2 Таблиця 4 Порівняння композиції кодонів кодуючих областей нативної AAD-12, оптимізованої для рослин версії (v1) і теоретичної оптимізованої для рослин версії А АміноКодон кислота END TAA TAG TGA GLN (Q) CAA CAG GLU (Е) GAA GAG GLY (G) GGA GGC GGG GGT HIS (Н) CAC CAT ILE (I) ATA ATC ATT Усього 5 10 15 20 25 30 35 Кількість в нативній послідовності 1 0 0 1 13 3 8 0 24 1 0 8 8 0 10 1 163 В С Кількість в Кількість в теоретичній оптимізооптимізоАмінованій для ваній для кислота рослин рослин версії (v1) версії 0 1 0 1 8 7 6 7 4 4 THR (Т) 7 7 8 7 7 7 3 4 TRP (W) 7 7 TYR (Y) 9 9 7 7 VAL (V) 2 2 4 5 5 4 164 163 D Кодон AGT TCA TCC TCG TCT ACA ACC ACG ACT TGG TAC TAT GTA GTC GTG GTT Усього Е F Кількість в Кількість в Кількість в теоретичній оптимізованій нативній оптимізованій для рослин послідовності для рослин версії (v1) версії 0 0 2 6 0 1 11 5 1 8 4 1 0 6 18 0 130 0 3 3 0 3 4 7 0 7 8 3 2 0 8 8 8 130 0 3 3 0 3 5 7 0 6 8 3 2 0 7 9 8 130 Перебудова для експресії в Е. coli: Спеціально сконструйовані штами Escherichia coli і відповідні векторні системи часто використовують для отримання відносно великих кількостей білків для біохімічних і аналітичних досліджень. Іноді виявляють, що нативний ген, який кодує бажаний білок, погано підходить для високорівневої експресії в Е. coli, навіть якщо організмомджерелом гена може бути інший рід бактерій. У таких випадках можна і бажано реконструювати кодуючу білок область гена, щоб зробити його більш відповідним для експресії в Е. coli. Гени E. coli класу II визначають як ті, які на високому рівні і безперервно експресуються протягом експонентної фази росту клітин Е. coli. (Henaut, А. and Danchin, А. (1996) in Escherichia coli and Salmonella typhimurium cellular and molecular biology, vol. 2, pp. 2047-2066. Neidhardt, F., Curtiss III, R., Ingraham, J., Lin, Е., Low, В., Magasanik, В., Reznikoff, W., Riley, M., Schaechter, M. and Umbarger, Н. (eds.) American Society for Microbiology, Washington, D.C.). Досліджуючи композиції кодонів кодуючих областей генів Е. coli класу II, можна розробляти середню композицію кодонів для цих кодуючих областей генів Е. coli класу II. Вважають, що кодуюча білок область, яка має середню композицію кодонів, що імітує таку в генах класу II, буде підходити для експресії протягом експонентної фази росту Е. coli. Використовуючи ці посібники, нову послідовність ДНК, яка кодує білок AAD-12 (SEQ ID NO: 4), що включає додатковий аланін у другому положенні, як указано вище, конструювали відповідно до середньої композиції кодонів кодуючих областей генів класу II E. coli. Вихідну послідовність, конструювання якої основувалося тільки на композиції кодонів, додатково реконструювали для включення конкретних послідовностей ділянок розпізнавання рестрикційних ферментів, відповідних для клонування у вектори, які експресуються в Е. coli. Уникали несприятливих меж послідовності, таких як структури "стебло-петля" з високою стабільністю, а також внутрішньогенні послідовності, гомологічні 3'-кінцю рибосомальної РНК 16S (тобто послідовності Шайна-Дальгарно). Е. coli-оптимізовану послідовність (v2) описують як SEQ ID NO: 5, і вона кодує білок, що описується як SEQ ID NO: 4. Нативна і Е. coli-оптимізована (v2) послідовності ДНК є на 84,0 % ідентичними, в той час як оптимізована для рослин (v1) і Е. coli-оптимізована (v2) послідовності ДНК є на 76,0 % ідентичними. У таблиці 5 представлені композиції кодонів нативної кодуючої області AAD-12 (колонки А і D), що кодує області AAD-12, оптимізованої для експресії в Е. coli (v2; колонки В і Е), і композиція кодонів теоретичної кодуючої області для білка AAD-12, що має оптимальну композицію кодонів генів класу II E. coli (колонки С і F). При розгляді таблиці 6 видно, що нативна і Е. coli-оптимізована кодуючі області, хоча і кодують приблизно ідентичні білки, істотно відрізняються одна від одної. Е. coli-оптимізована 28