Спосіб активації латентного вірусу ядерного поліедрозу у лускокрилих

Корисна модель стосується області сільського господарства. Відомий спосіб використання стильбенового з'єднання як активатор схованої вірусної інфекції в комах при захисті сільськогосподарських і лісових культур [Black B.C. Potentiation of epizootic viral infections // Patent USA №5879674.- 1999.-P. 1-6]. Спосіб включає введення 4, 4' - диаміно-2, 2' - стильбен дисульфонової кислоти й солей кислоти в якості активізатора вірусу, у їжу для лускокрилих, двокрилих, прямокрилих або розпилення активізатора з додаванням зволожників, емульсіфікаторів і адгезірів. Недоліком способу є повільне нагромадження вірусних поліедров у гусениць і відсутність вибірковості в дії для інших живих організмів. В основу корисної моделі поставлене завдання вдосконалити спосіб активізації латентного вірусу ядерного поліедроза у лускокрилих шляхом впливу продуктами ампліфікації ДНК вірусних поліедрів, що забезпечує активізацію латентного вірусу в гусеницях 1-го личинного віку й стрімке його нагромадження. Поставлене завдання вирішується тим, що в способі активізації латентного вірусу ядерного поліедроза у лускокрилих , що включає вплив активізатором на організм гусениць, відповідно до корисної моделі, наносять біологічну речовину, що містить фрагменти ДНК вірусу ядерного поліедроза хазяїна на поверхню тіла гусениць у кількості не менш 106 фрагментів ДНК в обсязі 0,04-0,06мкл речовини, що забезпечує збільшення швидкості нагромадження вірусних поліедров, вибірковість дії вірусу. Спосіб реалізується таким чином. Біологічна речовина, що містить не менш 106 фрагментів ДНК в обсязі 0,040,06мкл, наносять на тіло гусениці, заражаючи її вірусом. Після закінчення часу через 18-22 годин заражені гусениці гинуть, їх розтирають і мікро скопіюють. Дослідження показали значне нагромадження вірусних поліедров (див. таблиця). Приклад. Для активізації латентного вірусу використали яйця непарного шовкопряда. Через 11-13 годин після виходу з яєць личинок 1-го віку на поверхню тіла 14 гусениць нанесли по 0,04-0,06мкл розчину продуктів ампліфікації ДНК вірусних поліедров. Розчин одержують таким чином. Екстракцію тотальної ДНК проводили з використанням комплекту «Днк-сорб-А» варіант 100 фірми АмплиСенс (по інструкції). Активізацію латентного вірусу ядерного поліедроза непарного шовкопряда проводять за допомогою продуктів ампліфікації ДНК вірусних поліедров, отриманих методом RAPD-PCR с використанням праймера ОРА-08. RAPD-PCR проводили в реакційній суміші обсягом 29мкл на термоциклері «Терцик» (Днктехнологія, Росія) з використанням реактивів для полімеразної ланцюгової реакції «АмплиСенс-200-1» (АмплиСенс, Москва). Реакційна суміш обсягом 29мкл містила: 5-х PCR-буфер - 5мкл; MgSO4, 50Mm - 1.5мкл; Н2O Milli - 3мкл; dNTP-mix - 2.5мкл, 2 Mm; Taq-полімераза, 5од/мкл - 0.5мкл; мінеральне масло - 10.5мкл; праймер, А260 10 ОЕ/мол - 1мкл; Т-буфер з дослідженою ДНК - 5мкл. RAPD-PCR проводили в режимі: денатурація 93°С 1хв, відпал 35°С - 1хв, синтез 72°С - 1хв - 5 циклів; денатурація 93°С - 0.5хв, відпал 35°С - 0.5хв, синтез 72°С 0.5хв - 40 циклів. Термінальну стадію синтезу проводили при 72°С - 3хв. Продукти ампліфікації розділяли методом електрофореза в 1,8 %-ном агарозном гелі. Для проведення RAPD-PCR використали праймер ОРА-08 (GTGACGTAGG). Розчин містив 7 фрагментів ДНК різної довжини в сумі складових приблизно 1200 п. н. Концентрація кожного з 7 фрагментів ДНК становила 106 фрагментів на 0.05мкл розчину. Після зараження кожну гусеницю помістили в окрему пробірку. Як контроль використали 6 гусениць, заражених описаним вище способом із застосуванням того ж розчину, але не утримуючих фрагментів ДНК (II група). Через 18-22 години гусениць із І і II груп розтирали й мікроскопіювали. Виявлено достовірну відмінність між І і II групами в нагромадженні вірусних поліедров (F>F0.001). В І групі нагромадження вірусних поліедров ішло в середньому в 9.7 рази швидше, ніж в II групі. Отже, саме ампліфіцірованні фрагменти ДНК вірусу викликають стрімке нагромадження вірусних поліедров, вірогідність розходжень вибіркових середніх за критерієм Фишера в порівнянні з контролем (F>F0.001; F=80.01); зазначений 99.9 % довірчий інтервал. Запропонований спосіб активізації латентного вірусу має вибірковість у дії, безпечний для інших живих організмів. Активізує латентний вірус у гусеницях 1-го личиночного віку. Спосіб активізації латентного вірусу ядерного поліедроза у лускокрилих Таблиця I група II група (контроль) Кількість поліедров, 0.00025 мкл 19.85±10.6* 2.04±1.6 Розмір поліедров, мкм 0.168±0.049 0.242±0.048