Штам вірусу ядерного поліедрозу diprion pini для виробництва інсектицидного препарату

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству биологических инсектицидов для лесного хозяйства. Известен штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда S-13-p, который используется при производстве вирусного инсектицида Вирин-ЭНШ и получен путем адаптации вируса ядерного полиэдроза ивовой волянки к непарному шелкопряду (Итоги и перспективы производства и применения вирусных препаратов в сельском и лесном хозяйстве: Сб. - М, 1984. - С.3 - 14). Недостатком данного штамма является то, что он имеет низкую биологическую активность. Кроме того, штамм имеет узкую видоспецифичность и препарат на его основе неэффективен, в частности, для обыкновенного соснового пилильщика. Известен штамм вируса ядерного полиэдроза Pd-1 - 5 для производства инсектицидного препарата, полученный путем отбора из природного изолятора вируса, выделенного обычными методами из больной гусеницы непарного шелкопряда (Авторское свидетельство СССР №1638161, кл. C12N7/00). Данный штамм наиболее близко к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату. Штамм-прототип устраняет недостаток аналога, связанный с низкой биологической активностью. Однако, как и аналог, штамм-прототип имеет узкую видоспецифичнрсть, поэтому инсектицидный препарат на его основе мало эффективен для борьбы, в частности, с обыкновенным сосновым пилильщиком. В основу изобретения поставлена задача получения штамма вируса ядерного полиэдроза для производства инсектицидного препарата, который имел бы более высокую вирулентность по отношению к обыкновенному сосновому пилильщику. Новый штамм Ba-1 получен путем отбора из природного изолята вируса, выделенного традиционными методами из больных личинок обыкновенного соснового пилильщика, которые были обнаружены заявителем в Васищевском лесничестве Октябрьского гослесхоза Харьковской области. Способ выделения нового штамма включает в себя следующие этапы: 1. Личинки обыкновенного соснового пилильщика, которые погибли от вироза, растирают в фарфоровой ступке с дистиллированной водой, а затем размешивают на магнитной мешалке в течении 2 х суток с целью вымывания вирусных полиэдров из тканей погибших личинок. 2. Полученную суспензию фильтруют; первый раз через ватномарлевый фильтр, потом дважды через капроновый фильтр с отверстиями диаметром 0,1мм. 3. Полученный фильтрат центрифугируют в течение двух часов при нагрузке 9000g. Супернатант сливают, осадок собирают, тщательно гомогенизируют до получения однородной массы. 4. Наличие полиэдров, а также их концентрацию определяют с помощью способа Гимзе - окрашивания нативных мазков бриллиантовой зеленью и просмотра мазков при увеличении в 1350 раз в поле зрения объектива с масляной имерсией. Отбор материала проходил в пяти повторностях с разных участков лесонасаждения. После выделения штамма, полученный изолят вируса испытывался на различных популяциях (по местонахождению) обыкновенного соснового пилильщика - Херсонской, Волчанской, Николаевской, Очаковской для определения вирулентности данного штамма. Штамм вируса Ba-1 был передан на хранение и проведение медико-токсикологического анализа в УкрНИИ эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л.В. Громашевского. Полученный штамм вируса ядерного полиэдроза имеет следующие морфологическую и физиологическую характеристики. Морфологическая характеристика: штамм Ba-1 относится, согласно классификации вирусов принятой в 1966г. в Москве на IX международном микробиологическом конгрессе Международным комитетом таксономии вирусов, к семейству бакуловирусов (Baculoviridae), группа (или род) Baculovirus, подгруппа A; вирусы, вызывающие ядерный полиэдроз у насекомых (Polyhedrovirus), видовое название Nucleopolyhedrosis virus Diprion pini L. Палочковидные вирионы размером до 50 ´ 250нм расположены в полиморфных белковых матриксах полиэдрах поодиночке и беспорядочно. Размер полиэдров 0,3 - 0,9мкм. Полиэдры не имеют четких границ и близки к шарообразной форме (гексатетраэдрический класс изометрической сингонии). В среднем в каждом полиэдре содержится до 11шт. вирусных частиц. Вирион окружен двумя мембранами, внешняя мембрана толщиной около 75Ǻ, внутренняя - около 60Ǻ. Расстояние между мембранами составляет около 40Ǻ. Внутренняя мембрана тождественная капсиду, составляющему внешний белковый слой вириона. Сердцевина вирусной частицы состоит из электронно-плотной зоны шириной около 60Ǻ содержащей ДНК, которая имеет спиральную структур у. Криптограмма вируса ядерного полиэдроза обыкновенного соснового пилильщика: D/2 : 80/8 - 15 : 0/E : 1/0, где D/2 - вир ус содержит ДНК и она двунитчата; 80млн - молекулярный вес ДНК; 8 - 15% - содержание ДНК; 0 - вирион округлой формы, палочковидный; E - нуклеокапсид продолговатый с параллельными сторонами и незакругленными углами; 1 - систематическая принадлежность инфицируемого хозяина - /Invertebrate/ беспозвоночное/; 0 - переносчик неизвестен. Физиологические признаки: Штамм Ba-1 культивируется в личинках обыкновенного соснового пилильщика, зараженных путем скармливания естественного корма хвои сосны, инфицированного вирусом. При заражении личинок по достижении ими 3-возрастной стадии хвойную лапку опрыскивают водной суспензией полиэдров с титром 1 ´ 106. Инкубационный период заболевания составляет 8 - 10 дней. Вирус репродуцируется в тканях кишечника. Оптимальная температура для репродукции вируса 25° ± 2°C. Рекомендуется хранить штамм при температуре от -12° до -70°C. Выход вирусны х полиэдров из одной личинки IV возраста составляет 7,7 ´ 108 полиэдров. Устойчивость к воздействию внешних факторов: вирус ядерного полиэдроза устойчив к экстремальным факторам при сохранении элементарных вирусных частиц в белковом матриксе, то есть в полиэдре, который надежно защищает вирус от инактивации. Вирусные включения теряют биологическую активность под воздействием ультрафиолетовых лучей (вир ус полностью инактивируется за 5,5 часов). Если с помощью химических веществ разрушать белковый матрикс (полиэдр), то освобожденные вирусные частицы быстро теряют активность. Также инактивация вируса происходит при температуре выше 55°C. Сохраняемые при комнатной температуре на протяжении 4 - х лет полиэдры сохраняли высокие показатели вирулентности, которая существенно снижается к 9 - 10 году хранения. После внесения вируса в сосновые насаждения, он сохраняет активность на протяжении 25 - 30 дней, а потом вирулентность начинает постепенно снижаться под влиянием инсоляции. Характеристики штамма Ba-1 и известного штамма Pd-1 - 5 приведены в таблице. Как видно из таблицы, биологическая активность предлагаемого штамма выше, чем биологическая активность прототипа. При заражении гусениц непарного шелкопряда штаммом Ba-1 вируса обыкновенного соснового пилильщика инфицирования не наблюдалось и наоборот, Po-1 - 5 не инфицирует личинок обыкновенного соснового пилильщика. Норма расхода препарата на основе предлагаемого штамма в два раза ниже. Сущность изобретения поясняется следующим конкретным примером использования штамма Ba-1. Пример. Партию личинок обыкновенного соснового пилильщика по достижении ими 3-возрастной стадии инфицировали штаммом Ba-1 вируса ядерного полиэдроза. Корм опрыскивали вирусной суспензией с титром 1 ´ 106 полиэдров в 1мл. Через 10 дней проводили сбор инфицированных личинок. Погибших личинок собирали и гомогенизировали до получения однородного гомогената, который затем мацерировали в течение 2 - х дней. После этого жидкость фильтровали, фильтрат центрифугировали и полученный осадок после определения титра разводили глицерином и водой. Полученный инсектицид (Вирин-ОСП) представляет собой суспензию полиэдров вируса ядерного полиэдроза с 50% - ным глицерином. Препарат легко и равномерно ресуспендируется в воде. С тойкость при хранении обеспечивается в течение трех лет. Препарат Вирин-ОСП на основе штамма Ba-1 является экологически чистым, обладает избирательным действием только к целевому насекомому - обыкновенному сосновому пилильщику. Препарат безопасен для теплокровных животных и человека. Таким образом, штамм Ba-1 позволяет получить инсектицид, который патогенен для личинок Diprion pini L и обладает высоким избирательным действием, инфицируя только личинки обыкновенного соснового пилильщика.