Тест-система імуноферментна для виявлення антитіл класу igg проти цитомегаловірусу людини в сироватці крові (dia-cmv-igg)

Винахід належить до біотехнології, імунохімії та медицини і може бути застосований у клініці для постановки та підтвердження діагнозу первинної або рецидивної цитомегаловірусної інфекції, а також для проведення сероепідемічних досліджень. В Україні тест-системи для виявлення зараженості людей цитомегаловірусною інфекцією не виробляється. В Росії випускається тест-система "BeктоUMB-IgG-стрип" (ЗАО "Вектор-Бест", Новосибірськ), в складі якої на твердій фазі використовується рекомбінантний поліпептид-аналог цитомегаловірусного білку; сироватки досліджуються після попереднього розведення 1:100, а як кон'югат беруть антивидов! антитіла проти імуноглобулінів класу G людини, мічені пероксидазою [1]. В основу винаходу покладено завдання створити імуноферментну тест-систему на основі імуносорбенту з очищеними рекомбінантними полипептидами р28 та р150 аналогами мембранних білків-антигенів цитомегаловірусу. С уміш антигенів сорбують на поверхні полістиролових планшетів. Досліджувані сироватки розводять 1:10. В складі кон'югатів використовують моноклональні антитіла проти імуноглобулінів людини класу G, мічені ферментом. Ферментативну реакцію визначають за допомогою субстратного розчину з хромогеном. За одну постановку (2 години) можна проаналізувати 88 сироваток. Приклад 1. Визначення антитіл проти цитомегаловірусу у сироватці крові хворої Л. 1977 року народження. Визначення проводять за відомою методикою [2] твердофазного імуноферментного аналізу. Для цього вносять у лунки планшета-імуносорбента з фіксованими на ньому рекомбінантними поліпептидами аналогами мембранних антигенів цитомегаловірусу по 90мкл розчину для розведення сироваток та по 10 мкл сироватки крові хворої для виявлення антитіл класу G (IgG) та контрольні зразки - в 2 лунки позитивний та в 3 лунки негативний контролі. Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та інкубують при температурі 37°С протягом 60хв. Після закінчення інкубації видаляють вміст лунок за допомогою промивача або 8-канальної піпетки та промивають лунки чотири рази розчином для промивання планшетів. В лунки планшету вносять по 100мкл розчину моноклонального кон'югату проти імуноглобулінів людини, мічених пероксидазою, та інкубують планшет при 37°С у термостаті 30хв. Після закінчення інкубації промивають лунки шість разів і вносять по100 мкл розчину проявника (субстратний розчин з хромогеном) та інкубують при 18-22°С у темряві 30хв. Зупиняють кольорову реакцію, вносячи до всіх проб по 100 мкл стоп-реагента. Не більш як через 1 хв. після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі за допомогою спектрофотометра. Значення ОГ зразка прямо пропорційне кількості антитіл у сироватці Наявність антитіл проти цитомегаловірусу у сироватці хворої, визначене при застосуванні нашої тестсистеми, порівнювали зі значеннями, отриманими при використанні тест-системи виробництва ЗАО "Вектор-Бест" (Росія). Досліджена сироватка хворої було ідентифіковано як позитивна на наявність антитіл проти антигенів цитомегаловірусу. Приклад 2. Визначення чутливості та специфічності пропонованої тест-системи. Використовуючи названі тест-системи, досліджували сироватки крові (по 20 достеменно позитивних та 100 достеменно негативних сироваток). Усі сироватки досліджували у дво х повторностях кожною тест-системою за описаною методикою. Усі 20 позитивних сироваток показали наявність антитіл проти цитомегаловірусу, що складає 100% чутливості. З 100 негативних сироваток виявилися справді негативними всі 100 (специфічність 100%) у пропонованій тест-системі. В порівнюваній тест-системі з Росії з 20 достеменно позитивних сироваток 19 були позитивними. Одну низькотитражну сироватку не виявлено. Чутли вість тест-системи становила 95%. З 100 негативних сироваток - 1 сироватка була виявлена як хибнопозитивна. Специфічність порівняльної тест-системи становила 99%. Таким чином, пропонована тест-система забезпечує виявлення антитіл класу IgG проти антигенів цитомегаловірусу в сироватках людей. Проста і надійна в роботі, проявляє високу чутливість та специфічність. Використана література 1. Инструкция по применению тест-системы "BeктоUMB-IgG-стрип" производства ЗАО "Вектор-Бест", п. Кольцове, Новосибирской обл., 2003,3 с. 2. А.Т. Ми хайлов, В.Н. Симирский "Методы иммунохимического анализа в биологии развития". М. "Наука", 1981.