Спосіб культивування хрящових фрагментів

Корисна модель відноситься до клітинної біології і може бути використана у медичній та ветеринарній практиці. Відомі способи культивування хрящових тканин [пат. США №5206023, ИСМ, 1994, 22-24, С.105. А61F2/02, А61L37/22, С07L15/6, С09H3/02, опубл. 27.04.93. Т1149 №4] з застосуванням ксеногенного матеріалу, недостатком якого є відторгнення організмом тварин. Також відомий спосіб культивування експлантантів [Silbermnn М. et al. In vitro transformation of chondropgenitor cells into osteobllasts and the formation of new membrane bone. - J. Anatomie Rekord.1983.206 №4 p.373 383]. При культивуванні експлантантів мищелків нижньої щелепи 19-20 добових зародків мишей, які містять чистий хрящ, на міліпорових фільтрах у модифіційованому середовищі Ігла, протягом 10 діб ефективність культивування по відомому способу досить низька. Так на протязі перших 2-х діб тканина хряща зберігає свою первинну структур у. Через 5 діб культивування хондробластичні клітини зникають, а увесь хрящ заповнюють гіпертрофовані хондроцити, а мезенхімальні клітини диференціюються в остеобласти, котрі утворюють остеоід. Недостатком вказаного способу є те, що при культивуванні експлантантів хряща на міліпорових фільтрах хондробластичні клітини через 5 діб зникають, а увесь хрящ заповнюється гіпертрофованими хондроцитами. Задача корисної моделі - підвищення проліферативної активності та покращання диференціації клітин. Поставлена задача вирішується тим, що в способі культивування хрящови х фрагментів, який включає вирощування їх на підложках у живильному середовищі, згідно корисної моделі, в якості підложки використовують демініралізовану кісткову тканину тварин. Використання демініралізованої кісткової тканини в якості підложки для культивування хрящових фрагментів дає змогу підвищити їх проліферативну активність та покращати диференціювання клітин. Приклад конкретного виконання. Приклад 1. Підложку з кісткової тканини тварин готують наступним чином. Відбирають стегнові кістки у 10-ти добових курчат і у 4-6 місячних щурів, поміщають їх у декальцинатор, який складається із 20%-ного нітрату натрію та мурав'їної кислоти в рівних частинах. Після демініралізації стегнових кісток у них відрізують епіфізи, вимивають кістковий мозок, очищують від м'язових волокон, після чого тричі промивають дистильованою водою (по 20хв.) і переносять у 96-градусний спирт на 5 годин для знежирення. Після цього тричі промивають у дистильованій воді (по 30хв.), двічі у розчині Хенкса з антибіотиками (по 20хв.), після чого переносять у живильне середовище 199, яке містить 10% глюкози. В цьому живильному середовищі і зберігаються кісткові підложки при -4°С. Приклад 2. Хрящову тканину, одержану у 10-ти добових щурів з головок стегнових кісток, колінних суглобів, міжхребцевих дисків ретельно відмивають у дво х порціях середовища 199 з антибіотиками. Обережно відтинають лезом бритви близькі м'язові волокна, зв'язки. Хрящ, взятий з головок стегнової кістки, розрізують лезом на чотири частини. Міжхребцеві хрящові диски та хря щова тканина колінного суглоба не розрізається і висаджується у кісткове ложе підложок, (одержаних від 4-х місячних щурів), таким чином, що б хрящова тканина щільно прилягала до кісткової основи, тобто підложки. Підложки з хрящовими фрагментами укладають у чашки Петрі, де знаходиться живильне середовище 199 з додаванням 20%-ної нормальної інактивованої сироватки великої рогатої худоби. Культивування відбувається за умов 36°С у атмосфері повітря з доданням 5 % СО2 на протязі 15 діб зі зміною живильного середовища кожні 2 доби. Протягом перших двох днів хрящова тканина зберігала свою первинну стр уктур у. Але через 5 діб культивування спостерігається збільшення чисельності хондробластичних клітин. Через десять діб культивування спостерігається апозиційний ріст хряща, недиференційовані клітини на поверхні хряща проліферують та ди ференціюються у молоді хрящові клітини. Через 15 діб культивування спостерігається інтерстиційний ріст хряща, молоді хрящові клітини діляться, утворюючи клітинне гніздо, яке складається з двох або чотирьох клітин, тобто хрящо ві клітини клітинних гнізд утворюють клони, котрі і є нащадками однієї первинної хрящової клітини. Приклад 3. Стегнові кістки з хрящовими епіфізами виділяють у 18 добових курячих ембріонів, відрізують лезом бритви м'язові волокна, прилеглі до кістки, зв'язки, відмивають у 2-х порціях живильного середовища 199, яке містить антибіотики, потім укладають у декальциновані кісточки-підложки 10-добових курчат. Культивування проводили як описано у прикладі 1 протягом 15 діб. Морфологічні особливості культивованої кісткової тканини визначали на зрізах, пофарбованих гематоксилинеозином. Кісткова тканина після культивування зберігає свою цитоморфологічну характеристику. Остеобласти розташовані на поверхні кістки і являють собою великі клітини з одним ядром, цитоплазма різко базофільна. На кінці епіфізарних пластинок спостерігається інтерстиціальний ріст хряща. Додатковий вплив на індукцію хондрогенезу в культурі клітин може відігравати морфогенетичний білок, а також остеоіндуктивний фактор, який міститься у демініралізованій кістці, яка відіграє роль в остеоутворюанні In vitro. По запропонованому способу, починаючи з 5 доби культивування, спостерігається збільшення чисельності хондробластичних клітин і до 10-ї доби спостерігається інтерстиціальний ріст хряща з проліферацією та диференціюванням недиференційованих клітин, а на 15 день культивування спостерігається інтерстиціальний ріст хряща. Застосування способу дозволяє з більшою ефективністю одержати ріст клітин у хрящови х експлантантах, котрі можуть бути використані в гуманній та ветеринарній медицинах для регенерації суглобових хрящів.