Спосіб культивування амніоцитів

Спосіб культивування амнюцитів, який включає вирощування клітин амнютичної рідини в середовищі AmnioMax-C100 Basal Medium в СО2шкубаторі до формування 4-6 колоній амнюцитів, який відрізняється тим, що після формування колоній амнюцитів культуральне середовище з культур зливають у новий флакон, в якому знову вирощують культуру амнюцитів, повторюючи цей цикл 2-3 рази Винахід відноситься до галузі медицини, зокрема - медичної генетики і може бути застосований для вирощування культури амнюцитів, яка використовується при діагностиці хромосомної патології плоду ВІДОМІ способи культивування амнюцитів ґрунтуються на центрифугуванні амнютичної рідини, посадці осаджених амнюцитів на покривні скла у чашки Петрі з комплексним середовищем Ігna+RPMI-1640+Ham's FIO+пуповинна та ембріональна теляча сироватка, культивуванні амнюцитів напротязі 10-15 діб у СОг-інкубаторі [1] Недоліками цього способу є трудомісткість, методична складність, тривалість виконання та низький вихід культур Найближчим аналогом є спосіб культивування амнюцитів, який включає посадку нативної (невідцентрифугованої) амнютичної рідини у комплексному середовищі росту Ham's F-10 + Ham's F-12 + RPMI-1640+20% ембріональної телячої сироватки на слайд-флакони, культивування 7-9 діб при 37°С [2] Недоліком аналогу є низький вихід культур, методична складність та трудомісткість Задачею винаходу є розробка такого способу культивування амнюцитів, який би за рахунок повторного використання середовища росту забезпечував би підвищення КІЛЬКОСТІ кінцевого клітинного продукту при зменшенні вихідного біологічного матеріалу Поставлена задача вирішується тим, що в способі культивування амнюцитів, який включає вирощування нативної амнютичної рідини в сере довищі АтпюМах-С100 Basal Medium в СО2шкубаторі до формування 4-6 колоній клітин, згідно з винаходом, після формування колоній клітин культуральне середовище з культур зливають у новий флакон, в якому знову вирощують культуру амнюцитів, повторюючи цей цикл 2-3 рази Зливання середовища і повторне вирощування культур амнюцитів забезпечує підвищення виходу готового продукту, оскільки в злитому середовищі є живі клітини, здатні до росту в культурі При цьому, відпадає необхідність у повторних заборах вихідного біологічного матеріалу Вказані у формулі винаходу КІЛЬКОСТІ ЦИКЛІВ обґрунтовані на 17 дослідженнях При цьому встановлено, що після 3-го циклу, як правило, культура себе не відтворює Спосіб виконують наступним чином у пластиковий разовий флакон для культури клітин вносять амнютичну рідину, добавляють середовище AmnioMax-C100 Basal Medium у співвідношенні 2 1 культивують у СОг-інкубаторі 5-9 діб до утворення 4-6 колоній амнюцитів на дні флакона Після цього середовище росту з культур зливають у новий пластиковий разовий флакон, в якому знову вирощують культуру амнюцитів Цей цикл при необхідності повторюють 2-3 рази Приклад 1 Тетяна О , 22 роки Вагітна, 23-24 тижні вагітності Скерована на дородову діагностику з приводу підозри на хромосомну патологію плоду на підставі підвищеного у 2,5 рази рівня альфафетопротешу у крові, відносного багатовіддя та двобічних пієлоектазій плоду CO о ^0 0 ю 58403 Під час амнюцентезу отримано 20мл амнютичної рідини Амнютичну рідину в стерильних умовах розлили утри пластикові разові флакони для культури клітин по 8 мл в один флакон, додали 4мл середовища AmnioMax-C100 Basal Medium фірми "Gibco BRL" КЛІТИНИ культивували в термостаті при 37°Ста вмістом 5% ССЬ Для більш зрозумілого пояснення подальших маніпуляцій ці перші (ВИХІДНІ) культури умовно позначаємо культурами серії №1 Мікроскопування культур серії №1 на 6-ту добу культивування засвідчило наявність по 4-6 колоній амнюцитів діаметром 4-6 мм в усіх трьох флаконах "Старе" середовище, у якому, як показали дослідження в інвертованому мікроскопі, плавали живі неприкріплені клітини, злили у нові флакони для культури клітин, ставили в термостат на 37°С з СОг-продувкою Ці культури умовно назвали культурами серії №2 Мікроскопування культур серії №2 засвідчило наявність 4-6 колоній клітин через 5 діб після початку культивування На 6-у добу середовище росту з культур серії №2 злили в нові культуральні флакони (культури серії №3) і поміщали у термостат для подальшого культивування Те ж проробляли з культурами серії №3 з метою приготувати культур серії №4 Оцінка культур серії №4 засвідчила присутність клітинного росту у флаконах з дещо нижчою проліферативною активністю, а спроба ще раз повторити цикл не увінчалася успіхом Отже, з 3-х вихідних культур амнюцитів отримано додатково 9 нових культурамнюцитів без внесення нових порцій біологічного матеріалу Приклад 2 Валентина Б, 36 років, вагітність 17-18 тиж Скерована на швазивну пренатальну діагностику з приводу вікового цензу, заниженого рівня альфафетопротешу, підвищеного рівня хорюгонічного гонадотропіну в крові та обтяженого родинного анамнезу (у сина рідного брата вагітної - синдром Дауна) Під час амнюцентезу отримано 15мл амнютичної рідини Комп'ютерна верстка Т Чепелсва Амонютичну рідину в стерильних умовах розлили у два пластикові разові флакони для культури клітин по 8мл в один флакон, додали 4мл середовища АтпюМах-С100 Basal Medium фірми "Gibco BRL" Клітини культивували в термостаті при 37°С з вмістом 5% СОг Позначаємо ці культури умовно культурами серії №1 Мікроскопування культур серії №1 засвідчило наявність по 4-6 колоній амнюцитів діаметром біля 5мм в усіх флаконах на 9-у добу культивування На 9-у добу "старе" середовище з цих культур зливали в нові флакони під умовною назвою флакони з культурами серії №2 Через 5 діб у флаконах серії №2 констатована наявність 4-5 колоній амнюцитів На 6-ту добу середовище росту з цих культур зливали у нові флакони (культури серії №3) Мікроскопування культур серії №3 засвідчило достатній колоніальний ріст на 6-у добу, середовище росту з цих культур на 6-ту добу злили у нові флакони (культури серії №4) Мікроскопування культур серії №4 засвідчило поодинокі прикріплені амнюцити через 6-ть діб культивування, а ще через 3-й доби констатовано загибель клітин Таким чином, з 2-х вихідних культур амнюцитів отримано додатково 4-ри культури амнюцитів без внесення нових порцій біологічного матеріалу Запропонований спосіб застосований при 17 дослідженнях При цьому, в 11 випадках вдалося провести відтворення культур у 3-х циклах, а у 6-й випадках - у 2-х циклах В той час як при використанні способу найближчого аналога в усіх 17 випадках був тільки 1-ин цикл Таким чином, використання запропонованого способу дозволяє збільшити вихід готового продукту при зниженні КІЛЬКОСТІ вихідного біологічного матеріалу Джерела інформації 1 Гринберг К Н , Кухаренко В И , Золотухина Т В / / Методические рекомендации по культивированию клеток для диагностики наследственных болезней человека - М -1990 -С 19-22 2 Арбузова С Б , Хлевная Л А , Малова С А Усовершенствованная методика культивирования и фиксации амниоцитов человека // Биополимеры и клетка,- 1998 - Т 14, №6 - С 559-560 - найближчий аналог Підписано до друку 05 08 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна