Спосіб лікування хвороби паркінсона препаратами з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин

Реферат: Спосіб лікування хвороби Паркінсона включає приготування та введення препаратів з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин у вигляді суспензії, яка містить терапевтично ефективну кількість стовбурових клітин. Виготовляють та вводять принаймні три препарати у вигляді суспензії кріоконсервованих стовбурових клітин, виділених з матеріалу фетуса людини 5-12 тижня гестації. Одна з яких містить стовбурові клітини з фетальної печінки, друга суспензія містить стовбурові клітини з фетального головного мозку, а третя суспензія містить стовбурові клітини попередників сполучної тканини з фетальних м'яких тканин. Суспензію кріоконсервованих стовбурових клітин з фетальної печінки вводять внутрішньовенно в об'ємі не меншому за 0,1 мл з кількістю ядровмісних клітин не менше за 6 15,71х10 в 1 мл за одне введення. Суспензію кріоконсервованих стовбурових клітин з фетального головного мозку вводять підшкірно в об'ємі не меншому за 0,5 мл з кількістю 6 ядровмісних клітин не менше за 6,14 × 10 в 1 мл за одне введення. Суспензію кріоконсервованих стовбурових клітин попередників сполучної тканини з фетальних м'яких тканин вводять підшкірно в об'ємі не меншому за 0,5 мл з кількістю ядровмісних клітин не 6 менше за 4,81 × 10 в 1 мл за одне введення. Вказані суспензії кріоконсервованих стовбурових клітин вводять одночасно з проведенням стандартної медикаментозної терапії. Перед введенням суспензії кріоконсерваних стовбурових клітин з фетальної печінки додатково виконують премедикацію. UA 100952 U (12) UA 100952 U UA 100952 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме: до неврології та клітинної терапії, та може бути використана при лікуванні нейродегенеративних захворювань центральної нервової системи, зокрема для лікування хворих на хворобу Паркінсона (ХП) шляхом введення препаратів з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин у вигляді суспензій, що містять стовбурові клітини, зокрема стовбурові клітини з фетальної печінки, стовбурові клітини з фетального головного мозку та стовбурові клітини попередники сполучної тканини з фетальних м'яких тканин, на тлі стандартної медикаментозної терапії. Як відомо, ХП - хронічне повільно прогресуюче неврологічне захворювання, характерне для осіб старшої вікової групи, що характеризується поступовою дегенерацією нігростріарних нейронів та порушенням функції базальних гангліїв головного мозку. ХП проявляється у моторних (м'язова ригідність, брадикінезія, тремор, постуральна нестійкість) та численних немоторних порушеннях (дисомнія, психоемоційні порушення, вегетативні порушення та ін.). Без лікування стан хворого прогресивно погіршується і, починаючи з легких рухових порушень, через 10 років призводить до повної залежності від сторонньої допомоги та прикутості до ліжка. Лікування основним препаратом замісної терапії - леводопом - лише відстрочує фінал захворювання на 5-7 років. Поширеність ХП досить висока і коливається від 67 до 350 випадків на 100 тис. населення. Найвища розповсюдженість зареєстрована в США - 107-329 випадків на 100 тис. населення, найнижча з європейських країн - у Швеції - 76 випадків на 100. тис. населення. В Україні офіційні цифри поширеності становлять близько 133 випадки на 100 тис. населення. Структура захворюваності має чітку залежність від віку: чим старша вікова популяція населення, тим частіше зустрічається захворювання. Найбільш часто перші симптоми захворювання реєструються у віці 42-52 років [1]. У розвитку ХП вирішальну роль відіграє взаємодія генетичних факторів та факторів зовнішнього середовища. Це поєднання ініціюють процес дегенерації в нігростріарних нейронах, а згодом у нейронах стовбура головного мозку. Ініційований процес стає незворотнім з поступовим експансивним поширення по всьому мозку. Виявлено, що на молекулярному рівні в основі розвитку ХП лежить порушення системи контролю за метаболізмом та біодегенерацією нейропептидів, головну роль з яких відіграє альфа-синуклеїн. При цьому найбільшу нейротоксичність мають проміжні олігомерні форми альфа-синуклеїну. Індукція вільнорадикальних реакцій, активації стресових протеїнкіназ і процесів апоптозу, активації мікроглії, порушення взаємодії альфа-синуклеїну з його природними білками-партнерами - все це обумовлює складні механізми нейротоксичності, підсумком яких є розвиток і прогресування нейродегенеративних процесів зі зменшенням продукції дофаміну. Дисфункція нейронів базальних гангліїв, призводить до розгальмовування і надмірної активності нейронів внутрішнього сегмента блідої кулі, ретикулярної частини чорної субстанції та призводить до гальмування таламокортикальних нейронів і дефіциту активації нейронів додаткової моторної кори, що обумовлює розвиток основних моторних проявів ХП. Крім дофамінергічних нейронів чорної субстанції, при ХП дегенерації піддаються й інші групи нейронів, через що виникає дисфункція серотонінергічних, норадренергічних і холінергічних систем, що обумовлює великий перелік немоторних проявів захворювання. На сьогоднішній день ХП належить до невиліковних захворювань. Існують фармацевтичні і хірургічні методи лікування. Незважаючи на сучасні підходи та технології, тактика лікування залишається направленою лише на зменшення проявів хвороби. Основними препаратами для лікування ХП є: препарати леводопи, антагоністи дофамінових рецепторів (праміпексол, пирібедил, бромкріптин та ін.), інгібітори МАО (селегілін, разагілін), інгібітори катехол-0метилтрансферази (ентакапон), інгібітори зворотного захвату дофаміну (амантадін) та деякі інші. Схему стандартної медикаментозної терапії формують з урахування стадії, форми захворювання, віку пацієнта та супутньої патології, шляхом монотерапії чи комбінування препаратів з вищезазначених груп. Значним недоліком медикаментозного лікування є великий перелік побічних ефектів, який часто обмежує використання препаратів, та поступовий розвиток звикання до медикаментів з формуванням їх неефективності. Клітинна терапія може бути оптимальним методом лікування при даному захворюванні, так як вона сприяє відновленню продукції дофаміну та зменшенню проявів захворювання. Відомий спосіб лікування ХП, що включає введення диференційованих клітин людини, що походять із ембріональних стовбурових клітин чи клітин, які подібні до ембріональних стовбурових клітин, чи інших типів стовбурових клітин, які походять із ембріона, шляхом переносу ядер соматичних клітин (заявка Російської Федерації на винахід № 2004117092, дата публікації - 20.11.2005р., кл. МПК: C12N 5/00). 1 UA 100952 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Відомий спосіб дозволяє лікувати захворювання та стани, зокрема м'язової дистрофії, хвороби Альцгеймера, дефекти або пошкодження спинного мозку, розсіяний склероз, м'язову дистрофію, тощо. Недоліком відомого способу лікування ХП є його складність та недостатнє відновлення синтезу дофаміну, що не дозволяє зменшити прояви нейродегенеративного процесу. Найбільш близьким до способу лікування ХП, що заявляється, є спосіб лікування хворих на паркінсонізм, що включає стереотаксичну трансплантацію ембріональної нервової тканини, причому за добу до оперативного втручання припиняють прийом протипаркінсонічних засобів, визначають вміст дофаміну, білкової фракції, імуноглобулінів, реєструють проліферативну відповідь лімфоцитів на фітогемаглютинін, а суспензію кріоконсервованих ембріональних нервових клітин людини вводять супранігрально в субталамічну зону під контролем комп'ютерного томографа з наступною оцінкою точності введення трансплантата шляхом порівнювання щільності тканини з аналогічною ділянкою протилежної півкулі (деклараційний патент України на винахід № 39324, дата публікації - 15.06.2001р., МПК: А61В 17/00). Зазначений спосіб лікування дозволяє підвищити вірогідність диференціювання трансплантату в дофамінергічну структуру, в результаті чого продукція дофаміну підвищується. Недоліком зазначеного способу лікування хвороби Паркінсона є недостатнє зменшення нейродегенеративного процесу при зменшенні синтезу дофаміну, що призводить до подальшого збільшення м'язової ригідності, гіпокінезії, тремору, розладів сну та вегетативних проявів хвороби. Крім цього, недоліком зазначеного способу є складність трансплантації суспензії у супранігральну зону при високій ймовірності виникнення алергійних реакцій та відторгнення ембріональних нервових клітин людини, прогресування нейродегенеративних процесів зі зменшенням синтезу дофаміну. Задачею корисної моделі, що заявляється, є удосконалення способу лікування хвороби Паркінсона препаратами з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин, в якому за рахунок запропонованої послідовності проведення лікування з використанням запропонованих суспензій стовбурових клітин емпірично підібраного складу на тлі стандартної медикаментозної терапії забезпечується підвищення ефективності лікування ХП, зокрема зменшення м'язової ригідності, гіпокінезії, тремору, розладів сну та вегетативних проявів хвороби, при нормалізації синтезу дофаміну без необхідності підбору донора за антигенами гістосумісності. В результаті - покращуються моторні функції, денна активність та соціальна незалежність, хворих на ХП. Крім цього забезпечується запобігання виникнення алергійних реакцій та відторгнення стовбурових клітин з фетальної печінки, стовбурових клітин із головного мозку та клітин-попередників сполучної тканини з фетальних м'яких тканин організмом хворих на ХП при проведенні лікування. Поставлена задача вирішується запропонованим способом лікування хвороби Паркінсона, що включає приготування та введення препаратів з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин у вигляді суспензії, яка містить терапевтично ефективну кількість стовбурових клітин, в якому виготовляють та вводять принаймні три препарати у вигляді суспензії кріоконсервованих стовбурових клітин, виділених з матеріалу фетуса людини 5-12 тижня гестації, одна з яких містить стовбурові клітини з фетальної печінки, друга суспензія містить стовбурові клітини з фетального головного мозку, а третя суспензія містить стовбурові клітини попередники сполучної тканини з фетальних м'яких тканин, причому суспензію кріоконсервованих стовбурових клітин з фетальної печінки вводять внутрішньовенно в об'ємі не 6 меншому за 0,1 мл з кількістю ядровмісних клітин не менше за 15,71 × 10 в 1 мл за одне введення, суспензію кріоконсервованих стовбурових клітин з фетального головного мозку вводять підшкірно в об'ємі не меншому за 0,5 мл з кількістю ядровмісних клітин не менше за 6 6,14 × 10 в 1 мл за одне введення, а суспензію кріоконсервованих стовбурових клітин попередників сполучної тканини з фетальних м'яких тканин вводять підшкірно в об'ємі не 6 меншому за 0,5 мл з кількістю ядровмісних клітин не менше за 4,81 × 10 в 1 мл за одне введення, при цьому вказані суспензії кріоконсервованих стовбурових клітин вводять одночасно з проведенням стандартної медикаментозної терапії, а перед введенням суспензії кріоконсерваних стовбурових клітин з фетальної печінки додатково виконують премедикацію. При цьому як стандартну медикаментозну терапію призначають введення щонайменше одного препарату або комбінації препаратів, вибраних з групи: леводопи, антагоністи дофамінових рецепторів (праміпексол, пирібедил, бромкріптин), інгібітори МАО (селегілін, разагілін), інгібітори КОМТ (ентакапон), інгібітори зворотного захвату дофаміну (амантадін). Схему стандартної медикаментозної терапії формують з урахування стадії, форми захворювання, віку пацієнта та супутньої патології. 2 UA 100952 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Суспензію кріоконсервованих стовбурових клітин з фетальної печінки вводять разом із фізіологічним розчином натрію хлориду зі швидкістю 20-40 крапель за хвилину. При цьому премедикацію виконують шляхом внутрішньовенного введення 10 мг димедролу і 30 мг преднізолону. Перед введенням суспензії кріоконсервованих стовбурових клітин з фетальної печінки, суспензії кріоконсервованих стовбурових клітин з фетального головного мозку та суспензії кріоконсервованих клітин попередників сполучної тканини з фетальних м'яких тканин додатково виконують клініко-неврологічне, лабораторне та інструментальне обстеження стану хворого. Перед проведенням лікування та через 6 та 12 місяців після введення суспензії кріоконсервованих стовбурових клітин з фетальної печінки, суспензії кріоконсервованих нервових стовбурових з клітин фетального головного мозку та суспензії кріоконсервованих стовбурових клітин попередників сполучної тканини з фетальних м'яких тканин здійснюють контроль активності патологічного процесу за клінічними, лабораторними та інструментальними показниками. Шляхом довготривалого спостереження за пацієнтами з ХП, ми встановили, що за рахунок введення принаймні трьох суспензій емпірично підібраного складу, що містять кріоконсервовані стовбурові клітини ембріофетального походження, та з кількістю ядровмісних клітин в 1 мл зазначених суспензій, відповідно до корисної моделі, забезпечується нормалізація рівня метаболізму нейропептидів, передусім альфа-синуклеїну та асоційованих з ним білкових комплексів, що сприяє нормалізації синтезу дофаміну та відновленню інших нейромедіаторних (серотонінергічних, норадренергічних і холінергічних) систем організму. Клінічно це буде проявлятися зменшенням моторних та немоторних проявів хвороби. Відновлення структури колагену, еластину та синтезу глікопротеїдів, протеогліканів, глікозаміногліканів, в результаті чого зменшується прогресування артралгічних ускладнень при високій ефективності лікування ХП в цілому. В результаті - забезпечується покращення функціонального стану хворих на ХП, їх рухових можливостей, що обумовлює покращення денної активності. При цьому виключається необхідність підбору донора за антигенами гістосумісності та забезпечується можливість повторного введення суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки, суспензії стовбурових клітин з фетального головного мозку, суспензії стовбурових клітин попередників сполучної тканини з фетальних м'яких тканин. Крім цього, проведення премедикації перед введенням суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки дозволяє запобігти виникненню алергійних реакцій та відторгненню стовбурових клітин з фетальної печінки організмом хворих під час проведення лікування. При цьому використання саме фетальної печінки, фетальної тканини головного мозку та фетальних м'яких тканин для отримання стовбурових клітин з метою приготування лікувальних препаратів у вигляді суспензій обумовлено їх пластичністю, зокрема здатністю таких клітин зазнавати змін та диференціації у відповідь на навколишній вплив або відповідно до їх внутрішньої програми. Відомо, що клітини ембріофетального походження здатні до росту, розмноження, диференціації, міграції та встановлення зв'язків з іншими клітинами. Порівняно з клітинами зрілих тканин, вони мають кращу здатність до проліферації, їх введення є ефективнішим також з огляду на утворення великої кількості ростових факторів. Клітини з фетальної печінки можуть виробляти значну кількість стимулюючих речовин, таких як ангіогенний і нейротрофічний фактори, що сприяють виживанню та росту, проліферації, диференціації та можуть стимулювати регенерацію за рахунок оточуючих клітин господаря. Крім цього, клітини з фетальної печінки мають здатність виживати при нижчому рівні кисню, ніж їх повністю диференційовані аналоги, що робить їх стійкими до ішемічного ушкодження як під час маніпуляцій in vitro, так і після їх введення. Проліферуючі або незрілі клітини з фетальної печінки переважно не мають довгих відростків або сильної міжклітинної адгезії і, таким чином, зазнають менших пошкоджень під час приготування суспензії клітин. Ці властивості дозволяють вводити клітини з фетальної печінки шляхом внутрішньовенної ін'єкції суспензії [4, 5]. Дані характеристики можуть пояснити і підвищене виживання клітин і тканин фетальної печінки в порівнянні з дорослими після кріоконсервації. Спосіб лікування ХП препаратами з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин здійснюють наступним чином. Виготовляють три препарати у вигляді суспензії кріоконсервованих стовбурових клітин, одна з яких містить стовбурові клітини з фетальної печінки, друга суспензія містить стовбурові клітини з фетального головного мозку, а третя суспензія містить стовбурові клітини попередники сполучної тканини з фетальних м'яких тканин. Для цього в умовах операційної, з дотриманням правил асептики та антисептики, одержують ембріофетальний матеріал, а саме: тканину печінки, тканину головного мозку та м'які тканини фетусів людини від 5 до 12 тижнів гестації, які 3 UA 100952 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 загинули внаслідок медичного аборту в випадках, коли вагітність переривали за соціальними показниками при відсутності патології розвитку чи інфікованості фетусу та письмової інформованої згоди жінки-донора. Вилучені тканини ембріофетального походження поміщають в стерильне транспортне середовище розчину Хенкса з антибіотиком. В стерильних умовах тканини сепарують та гомогенізують в розчині Хенкса. Отримані суспензії піддають фільтрації та кріоконсервують. Як кріопротектор використовують диметилсульфоксид. Далі готові суспензії розливають в кріопробірки об'ємом 0,1-1,0 мл. Кріоконсервування суспензій стовбурових клітин проводять у камері програмного заморожувача за визначеною програмою. Таке кріоконсервування забезпечує практично необмежене довгострокове зберігання вказаних суспензій, дозволяє протягом необхідного часу дослідити препарати у вигляді суспензії на бактеріологічну та вірусологічну безпеку, визначити якісні та кількісні показники суспензії, сформувати банк суспензій стовбурових клітин відповідно до визначених вимог до препаратів. Суспензії з матеріалу ембріофетального походження зберігають в кріобанку в рідкому азоті при температурі -196 °C. При формуванні банку суспензій з матеріалу ембріофетального походження для лікування хвороби Паркінсона суспензія стовбурових клітин з фетальної печінки, суспензія стовбурових клітин з головного мозку та суспензія клітин попередників сполучної тканини з фетальних м'яких тканин повинні мати такі параметри: вміст ядровмісних клітин (підраховують загальну кількість ядровмісних клітин, в одиниці об'єму за допомогою клітинного аналізатора чи візуально під 6 мікроскопом в лічильній камері) повинен становити не менше ніж 15,71 × 10 в 1 мл суспензії 6 для клітин з фетальної печінки, не менше за 6,14 × 10 в 1 мл суспензії для клітин з головного 6 мозку та не менше за 4,81 × 10 в 1 мл суспензії для клітин попередників сполучної тканини з фетальних м'яких тканин; вміст живих клітин після кріоконсервування - 70 %. Пробірки, що містять суспензію кріоконсервованих стовбурових клітин з фетальної печінки, суспензію кріоконсервованих стовбурових клітин з фетального головного мозку, суспензію кріоконсервованих клітин попередників сполучної тканини з фетальних м'яких тканин, безпосередньо перед введенням виймають з рідкого азоту, занурюють у водяну баню при температурі +37 °C та витримують до появи рідкої фази. Подальші маніпуляції проводять при кімнатній температурі з суворим дотриманням правил асептики. Час перебування розмороженої суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки, суспензії стовбурових клітин з фетального головного мозку та суспензію клітин попередників сполучної тканини з фетальних м'яких тканин при кімнатній температурі не повинен перевищувати 10 хвилин. При цьому перед введенням вибраних суспензій здійснюють додатковий контроль якості, зокрема проводять мікроскопію та здійснюють підрахунок кількості життєздатних клітин за допомогою автоматичного клітинного аналізатора. Перед початком проведення лікування хворих на ХП шляхом введення суспензії кріоконсервованих стовбурових клітин з фетальної печінки, суспензії кріоконсервованих стовбурових клітин з фетального головного мозку та суспензії клітин попередників сполучної тканини з фетальних м'яких тканин виконують клініко-неврологічне, лабораторне та інструментальне обстеження стану хворого та здійснюють контроль активності патологічного процесу за клінічними, лабораторними та інструментальними показниками. Далі, перед введенням суспензії кріоконсервованих стовбурових клітин з фетальної печінки, з метою запобігання виникненню алергійних реакцій під час лікування виконують премедикацію шляхом внутрішньовенного введення 10 мг димедролу і 30 мг преднізолону. Після цього через систему для переливання крові на фоні фізіологічного розчину натрію хлориду вводять суспензію кріоконсервованих стовбурових клітин з фетальної печінки шляхом внутрішньовенного введення зі швидкістю 20-40 крапель за хвилину. При цьому об'єм лікувальної дози суспензії для одного введення підбирають індивідуально, але не менше за 0,1 мл з кількістю ядровмісних 6 клітин не меншою за 15,71 × 10 в 1 мл. Введення суспензії кріоконсервованих стовбурових клітин з фетального головного мозку здійснюють підшкірно в об'ємі не меншому за 0,5 мл з 6 кількістю клітин не менше за 6,14 × 10 в 1 мл за одне введення. Введення суспензії кріоконсервованих стовбурових клітин-попередників сполучної тканини з фетальних м'яких тканин людського фетусу здійснюють підшкірно в об'ємі не меншому за 0,5 мл з кількістю клітин 6 не менше за 4,81 × 10 в 1 мл за одне введення. Така кількість клітин забезпечує необхідну якість суспензій та достатня для отримання високої ефективності лікування хворих на хворобу Паркінсона. Одночасно з введенням суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки, суспензії стовбурових клітин з фетального головного мозку та суспензії стовбурових клітин з фетальних м'яких тканин проводять стандартну медикаментозну терапію, що включає введення щонайменше одного препарату або комбінації препаратів, вибраних з групи: леводопи, 4 UA 100952 U 5 10 15 20 антагоністи дофамінових рецепторів (праміпексол, пирібедил, бромкріптин), інгібітори МАО (селегілін, разагілін), інгібітори КОМТ (ентакапон), інгібітори зворотного захвату дофаміну (амантадін). При цьому схему стандартної медикаментозної терапії формують з урахування стадії, форми захворювання, віку пацієнта та супутньої патології. Після введення вказаних вище кріоконсервованих суспензій, що містять стовбурові клітини, хворий знаходиться під спостереженням. При цьому після проведення лікування через 6 та 12 місяців здійснюють контроль активності патологічного процесу за клінічними, лабораторними та інструментальними показниками. При цьому точки спостереження вибирають, згідно з протоколом клінічного застосування препарату ембріофетального походження, розробленим на основі клінічного досвіду. Ефективність лікування ХП оцінюють за зменшенням патологічного процесу та м'язової ригідності, брадікінезії, тремору та немоторних проявів хвороби, покращенням денної активності та соціальної адаптації пацієнта. Так, з 2004 по 2013 рік у клініці клітинної терапії було проліковано 96 хворих на ХП, відповідно до способу лікування ХП, що заявляється. У всіх хворих спостерігався синдром раннього післятрансплантаційного покращення: відбувалося поліпшення сну, зменшення м'язової ригідності, у деяких хворих зменшився тремор у руках. Після введення суспензії кріоконсервованих стовбурових клітин з фетальної печінки в жодному випадку не спостерігались ускладнення чи побічні явища, в тому числі реакція "трансплантат проти господаря" (РТПГ). Після проведеного лікування спостерігалось покращення денної активності хворих, зменшились прояви моторних та немоторних порушень ХП (див. табл.). Таблиця UPDRS NMSPD (шкала з Шкала денної PDSS-2 (модифікована (універсальна оцінки немоторних активності версія оригінальної шкала оцінки ХП), симптомів при ХП), Швабе та шкали оцінки сну при балів балів Інгланда, % ХП), балів Перед лікуванням Через 6 місяців Через 12 місяців 49,24±2,41 104,984,12 70,253,33 23,660,44 41,42±1,67* 90,23,01* 79,182,15* 23,130,42 41,23±1,31** 89,133,32** 80,213,12** 21,880,41** *-р