Виявлення та підрахунок мікроорганізмів

Реферат: Спосіб виявлення та підрахунку життєздатних мікроорганізмів у зразку, що, як підозрюють, містить зазначені мікроорганізми, що включає (1) контактування зазначених мікроорганізмів зазначеного зразка з репаративними сполуками та поживним середовищем, та (2) інкубування продукту стадій (1), та (3) виявлення та підрахунок зазначених життєздатних мікроорганізмів, у якому мікроорганізми являють собою вид Legionella pneumophila, та у якому репаративні сполуки включають UA 105296 C2 (12) UA 105296 C2 (a) серин; (b) треонін; -6 -2 (c) сполуку, що містить іони кальцію у дозі від 10 до 10 мМ; -6 -2 (d) сполуку, що містить іони магнію у дозі від 10 до 10 мМ; (e) сполуку, що містить іони калію; (f) глутамінову кислоту або її сіль, та (g) піровиноградну кислоту або її сіль. Даний винахід також включає набір для більш точного виявлення та підрахунку життєздатних мікроорганізмів виду Legionella pneumophila у зразку, що, як підозрюють, містить зазначені мікроорганізми. UA 105296 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід відноситься до способу виявлення та підрахунку життєздатних мікроорганізмів виду Legionella pneumophila у зразку. Даний винахід також включає набір, що підходить для застосування у такому способі. Зазначений спосіб та набір дає можливість більш швидко кількісно визначити життєздатні мікроорганізми. Legionella бактерії повсюдно розповсюджені у вологих або мокрих середовищах, таких як ґрунтові та неморські водні середовища. Вони також можуть бути знайдені у водогонах гарячої та холодної води, градирнях систем кондиціонування повітря та зволожувачах повітря. Legionella, особливо Legionella pneumophila, є патогенами, які можуть викликати гостру бактеріальну пневмонію, в основному відому як "хвороба легіонерів", яка часто є смертельною для інфікованих індивідуумів. Традиційно виявлення та підрахунок Legionella pneumophila проводять культивуванням клітин. Цей спосіб може бути здійснений шляхом визначення придатних для культивування бактерій, використовуючи визначення кількості бактерій посівом або визначаючи кількість мікроколоній, використовуючи спосіб мембранних фільтрів. Ці технології оцінюють життєздатні бактерії за їх здатністю утворювати колонію або мікро-колонію. Нажаль, такі способи зазвичай потребують від 3 до 10 днів для того, щоб дати можливість сформуватися колоніям або мікроколоніям. Коли системи водопостачання знаходяться у процесі роботи, існує неприпустимий ризик інфікування людей протягом цього часу. Інші способи визначення загальної кількості Legionella мікроорганізмів включають технології ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція). ПЛР використовує ДНК-полімеразу для ампліфікації фрагменту ДНК шляхом in vitro ферментативної реплікації. У процесі цієї технології генеровану ДНК використовують як матрицю для реплікації, яка викликає ланцюгову реакцію, у якій ДНК матриця експоненціально ампліфікується. ПЛР дозволяє ампліфікувати одну або декілька копій фрагменту ДНК шляхом створення мільйонів або більше копій фрагменту ДНК. Звичайно такий спосіб описаний Diederen et al., J Med Microbiol. 2007 Jan; 56 (Pt 1):94-101. Однак, недоліком ПЛР є те, що зразки, як правило, містять інгібітори реакції полімеризації та тому не забезпечуються стабільні кількісні результати. Більше того, ця технологія залежить від попередньої стадії очищення ДНК, яка може приводити до втрати ДНК з наступною недооцінкою присутніх Legionella. До деякої міри ці недоліки долаються шляхом ПЛР у режимі реального часу, яка є кількісною. Однак, ця технологія не може проводити різницю між життєздатними клітинами та нежиттєздатними клітинами. Іншою технологією є флуоресцентна in situ гібридизація (FISH), у якій олігонуклеотидний зонд, мічений флуоресцентною речовиною, проникає у клітини бактерій. Коли рибосомні нуклеїнові кислоти (рРНК) мають правильну послідовність із зондом, відомим як ціль, цей зонд буде сам прикріплюватися до своєї цілі та не буде видалятися за допомогою будь-якої наступної стадії промивання. Бактерія, у якій цей зонд прикріпився, далі буде випромінювати флуоресцентний сигнал. Цей флуоресцентний сигнал далі може бути кількісно визначений шляхом технологій, таких як цитометрія у потоці, твердофазна цитометрія або епіфлуоресцентна мікроскопія. Типова FISH технологія описана Dutil S. et al. J Appl Microbiol. 2006 May; 100(5):955-63. Однак, використання FISH технології дає можливість визначити тільки загальну кількість життєздатних Legionella pneumophila, але нажаль цей спосіб не може визначити винятково тільки ті бактерії Legionella pneumophila, які здатні ділитися та, як наслідок, створювати колонію. Додатковий спосіб підрахунку життєздатних Legionella pneumophila включає ChemChrome V6 та описаний Delgado-Viscogliosi et al. Appl Environ Microbiol. 2005 JuI; 71(7):4086-96. Цей спосіб дозволяє кількісно визначити Legionella pneumophila, а також розрізнити життєздатні та нежиттєздатні бактерії. Він поєднує специфічне виявлення клітин Legionella, використовуючи антитіла та маркер життєздатності бактерій (ChemChrome V6), та застосування епіфлуоресцентної мікроскопії для підрахунку. Однак, хоча ця технологія розрізняє життєздатні та нежиттєздатні клітини, вона не здатна окремо ідентифікувати ці колоніє-утворюючі бактерії. US 20070218522 описує способи та композиції для виявлення та кількісної оцінки життєздатних Legionella та інших гетеротрофних аеробних бактерій, де спосіб включає застосування пластинок для мікробіологічного аналізу, які включають абсорбуюче середовище, промотуючі ріст та культуро-селективні речовини для швидкого виявлення та кількісної оцінки мікро-колоній Legionella. Ця технологія не буде рахувати уражені бактерії. EP 1329515 відноситься до способу тестування присутності мікроорганізмів у газоподібному середовищі, що містить пероксид водню, шляхом приведення цього газоподібного середовища у контакт з агаровим поживним середовищем, що містить сіль піровиноградної кислоти, та забезпечення росту колоній мікроорганізмів. Технології, які включають ріст колоній на поживному середовищі, такому як пластина з поживним агаром, в основному вважаються більш надійними. Отже, чашковий спосіб підрахунку залишається переважним вибором способу для одержання 1 UA 105296 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 загального підрахунку життєздатних клітин. Це в основному означає нанесення зразку, що, як підозрюють, містить мікроорганізм, на пластину, що містить тверде джерело поживних речовин або поживне середовище. Така технологія як посів є в основному кращою. Під загальною кількістю життєздатних клітин автори мають на увазі загальну кількість бактерій, здатних створити популяцію, яка помітна для спостерігача. Як правило, це буде означати видиму колонію на поверхні поживного середовища, такого як пластина з поживним агаром. Однак, мікроорганізми, такі як Legionella pneumophila, у навколишньому середовищі можуть бути піддані одному або більшій кількості стресів, які запобігають росту та розмноженню мікроорганізмів у оточуючій їх обстановці. Такі піддані стресу мікроорганізми не будуть ділитися взагалі або утворювати видимі колонії у нормальних умовах культивування. У навколишньому середовищі частина клітин мікроорганізмів буде в основному піддаватися стресу через умови навколишнього середовища, такі як недостатність поживних речовин, присутність біоциду, тепловий шок та зневоднення. Більше того, ці клітини могли б бути у вразливому фізіологічному стані, у якому технологія посіву мікроорганізмів може посилювати стрес цих, вже підданих стресу клітин мікроорганізмів завдяки присутності атмосферного кисню. Крім того, це могло б привести до артефактної смерті підданих стресу бактерій, що приводить до недооцінки загальної кількості життєздатних клітин. Крім того, недооцінка життєздатних Legionella pneumophila із способом посіву могла б стати небезпечною через їх патогенність. У 1970-их роках було повідомлено, що слід використовувати поглиначі активних форм кисню (ROS) для обмеження ефекту окисного стресу у процесі посіву. Це було повідомлено Speck et al, Repair and enumeration of injured conforms by a plating procedure, Appl Microbiol 29, 549-50 (1975); Martin et al Catalase: its effect on microbial enumeration. Appl Environ Microbiol 32, 731-4 (1976); Brewer et al. Beneficial effects of catalase or pyruvate in a most-probable-number technique for the detection of Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol 34, 797-800 (1977); McDonald et al, Enhanced recovery of injured Escherichia coli by compounds that degrade hydrogen peroxide or block its formation. Appl Environ Microbiol 45, 360-5 (1983); Marthi et al) Resuscitation effects of catalase on airborne bacteria. Appl Environ Microbiol 57, 2775-6 (1991); Busch та Donnelly Development of a repair-enrichment broth for resuscitation of heat-injured Listeria monocytogenes and Listeria innocua. Appl Environ Microbiol 58, 14-20 (1992); та Dukan et al, Oxidative stress defense and deterioration of growth-arrested Escherichia соli cells. J Biol Chem 274, 26027-32 (1999). Однак, винахідники даного винаходу вважають, що у всіх зазначених вище випадках ROS можуть бути зменшені прямим шляхом, у якому сполука вступає у хімічну реакцію з ROS. Berube et al, "Rapid detection and identification of Legionella pneumophila by membrane immunoassay", Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55, 1640-1641 описує виявлення та ідентифікацію Legionella pneumophila способом імуноблоттингу, використовуючи моноклональне антитіло. Не забезпечено ніяких засобів для вирішення проблеми уражених бактерій. Стаття Pine et al. (Role of keto acids and reduced-oxygen-scavenging enzymes in the growth of Legionella species. J Clin Microbiol 23, 33-42 (1986)) описує необхідність додавання кето кислот та антиоксидантного ферменту відновленого кисню для оптимізації росту Legionella pneumophila та пропонує використовувати ці матеріали у середовищі, що використовується для стандартного підрахунку цих мікроорганізмів. Однак використання тільки кето кислот та антиоксидантного ферменту відновленого кисню є недостатнім для регенерації підданих стресу клітин Legionella pneumophila, які необхідно відновити, та забезпечення точного підрахунку. Це особливо так, коли використовують специфічне поживне середовище для Legionella pneumophila, таке як буферне вугільнодріжджове (BCYE) агарозне середовище. По суті, немає ніяких доступних даних, що стосуються оптимізації стандартного середовища, корисного для точного підрахунку Legionella pneumophila. WO 2009 121726 описує спосіб виявлення та підрахунку життєздатних Legionella pneumophila мікроорганізмів у зразку шляхом контактування цих мікроорганізмів з щонайменше однією репаративною сполукою та поживним середовищем після стадій інкубування та виявлення та кількісного вимірювання життєздатних мікроорганізмів. Репаративна сполука безпосередньо або опосередковано робить вплив на метаболізм для зниження окисного стресу мікроорганізмів. Запропоновані репаративні сполуки включають піруват та гліколеву кислоту. Цей спосіб забезпечує неперевершений засіб для більш точного підрахунку життєздатних Legionella pneumophila протягом коротшого проміжку часу, ніж попередні способи. Однак, було б бажано забезпечити покращений спосіб для навіть більш точного підрахунку життєздатних Legionella pneumophila та навіть більш швидко. Більше того, також було б бажано досягнути цього разом з більш широким спектром штамів Legionella pneumophila. 2 UA 105296 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Таким чином, відповідно до даного винаходу автори забезпечують спосіб виявлення та підрахунку життєздатних мікроорганізмів у зразку, у якому, як вважають, містяться зазначені мікроорганізми (1) Контактування зазначених мікроорганізмів зазначеного зразку із репаративними сполуками та поживним середовищем, та (2) інкубування продукту стадій (1), та (3) виявлення та кількісний підрахунок зазначених життєздатних мікроорганізмів, у якому мікроорганізми являють собою мікроорганізми виду Legionella pneumophila, та у якому репаративні сполуки включають (a) серин; (b) треонін; -6 -2 (c) сполуку, що містить іони кальцію у дозі від 10 до 10 мМ; -6 -2 (d) сполуку, що містить іони магнію у дозі від 10 до 110 мМ; (e) сполуку, що містить іони калію, (f) глутамінову кислоту або її сіль, та (g) піровиноградну кислоту або її сіль. Автори виявили, що при застосуванні цих сполук у поєднанні як репаративні сполуки у даному способі, тривалість інкубаційного періоду Legionella pneumophila мікроорганізмів значно знижується. По суті, автори виявили, що це досягається разом із більш широким спектром Legionella pneumophila штамів. Не обмежуючись теорією, вважають, що комбінація пірувату, глутамату та специфічних концентрацій іонів кальцію та магнію приводить до цього позитивного ефекту через безпосереднє або опосередковане усунення або зниження окисного стресу, та розуміють, що іони калію зменшують осмотичний шок, у той час як серин та треонін посилюють метаболізм. Вважають, що ця спеціальна комбінація репаративних сполук забезпечує синергетичне покращення в усуненні або зниженні окисного стресу, зменшуючи осмотичний шок та посилюючи метаболізм, таким чином, досягаючи цілей даного винаходу. У даному винаході бажана доза серину або треоніну може становити від 0,01 до 5 %, базуючись на співвідношенні маси репаративної сполуки до об'єму зразку. Бажано, це звичайно буде у інтервалі від 0,05 до 2,5 %, наприклад, від 0,1 до 2 %, часто від 0,5 до 1 %. Глутамінову кислоту (або її сіль) та/або піровиноградну кислоту (або її сіль) використовують у бажаній дозі від 0,01 до 5 %, базуючись на співвідношенні маси репаративної сполуки до об'єму зразку. Бажано, це часто буде у інтервалі від 0,05 до 2,5 %, наприклад, від 0,1 та 2 %, часто у інтервалі від 0,5 до 1 %. Кожна зі сполук, що містять іони кальцію, іони магнію або іони калію, може являти собою будь-яку прийнятну сіль. Бажано, вони мають бути водорозчинними принаймні достатньо для забезпечення необхідної дози. Ці солі можуть мати будь-які прийнятні протиіони. Кваліфіковані спеціалісти у будь-якому випадку зрозуміють, що протиіони не мають бути відомими токсинами для мікроорганізмів, таких як Legionella pneumophila. Як правило, протиіони будуть включати, не обмежуючись наведеними, хлорид, сульфат, нітрат тощо. Як показано вище, коли сполука -6 -2 містить іони кальцію, її слід використовувати у дозі від 10 до 10 мМ, переважно вона буде у -5 -3 -4 -3 -4 інтервалі від 10 до 10 мМ, більш переважно від 5×10 до 5×10 , особливо близько 10 . У -6 відношенні сполуки, що містить іони магнію, як показано вище, доза має становити від 10 до -2 -5 -3 -4 10 мМ, переважно вона буде у інтервалі від 10 до 10 мМ, більш переважно від 5×10 до -3 -4 5×10 мМ, особливо близько 10 мМ. Репаративна сполука, що містить іони калію, бажано має -4 -1 -3 використовуватися у дозі, яка може становити від 1 до 10 мМ, наприклад, від 10 до 10 мМ, -1 -2 -2 більш переважно від 5×10 до 5×10 мМ, особливо близько 10 мМ. Репаративні сполуки використовують у поєднанні, що означає, що вони можуть бути використані одночасно або послідовно. Під послідовним автори мають на увазі додавання кожної сполуки послідовно однієї за одною. Під одночасним автори мають на увазі додавання двох або більшої кількості репаративних сполук до зразку у один і той самий час. Також може бути бажано об'єднувати дві або більшу кількість репаративних сполук у композицію та, таким чином, виключити окремі додавання репаративних сполук. Автори вважають, що репаративні сполуки, що містять піруват, глутамат, кальцій та магній, діють безпосередньо або опосередковано на метаболізм мікроорганізму шляхом, який знижує окисний стрес мікроорганізму. Таким чином, автори вважають, що репаративні сполуки, що містять піруват, глутамат, кальцій та магній, діють ендогенно на мікроорганізми. Під окисним стресом автори мають на увазі дисбаланс між концентрацією ROS (ендогенне вироблення або екзогенне додавання) та здатністю мікроорганізмів легко нейтралізувати 3 UA 105296 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 реакційно-здатні проміжні продукти або ефективно усунути отримане порушення. Такий збій нормальних метаболічних процесів мікроорганізму може спричинити токсичні ефекти через утворення вільних радикалів та окисників, таких як пероксиди, які можуть привести до ушкодження компонентів клітин мікроорганізмів, наприклад, ДНК, білків або ліпідів. Спричинення ефекту на метаболізм мікроорганізму означає здійснення змін у природніх внутрішніх хімічних процесах у клітині мікроорганізму. Що стосується ендогенного способу, зміни здійснюють у клітині мікроорганізму для зниження окисного стресу. Наприклад, це могли б бути зміни у метаболічних процесах у мікроорганізмі. Це також може включати видалення ROS у клітині мікроорганізму. Більше того, мається на увазі, що піруват, глутамат, іони кальцію та іони магнію можуть безпосередньо або опосередковано інгібувати утворення та/або розкладати ROS. Така сполука, яка викликає непрямий ефект на ROS, може робити це шляхом перешкоджання метаболізму мікроорганізму. Така комбінація репаративних сполук може вважатися опосередковано знижуючою ROS ендогенно, наприклад, у процесі клітинного дихання. Сполуки калію допомагають знижувати осмотичний шок. Під осмотичним шоком мається на увазі дисбаланс концентрації розчинених речовин між навколишнім середовищем, що оточує клітину, та всередині клітини. Цей дисбаланс викликає швидку зміну у русі води через мембрану клітини та може привести до ушкодження клітини. Ушкоджені клітини або змінена клітина є значно більш чутливими до осмотичного стресу та можуть втратити життєздатність через цей тип стресу. Вважається, що серин та треонін модифікують метаболізм мікроорганізму. Під цим автори мають на увазі, що серин та треонін залучаються у метаболічний шлях, що, як вважають, безпосередньо або опосередковано викликає збільшення метаболічної швидкості у клітинах, які мають обмежений або знижений метаболізм. Використовуючи ці дві молекули, клітини здатні показувати покращений ріст. Переважно зазначена вище комбінація репаративних сполук відповідно до даного винаходу синергетично покращує комбінацію зменшення або видалення ROS, знижуючи осмотичний шок та покращуючи метаболізм. Це є особливо правильним для більш широкого спектру штамів Legionella pneumophila, ніж було можливо раніше. Автори виявили, що даний спосіб викликає регенерацію підданих стресу Legionella pneumophila клітин разом з більш широким спектром штамів Legionella pneumophila, і, таким чином, забезпечує більш точний підрахунок загальної кількості життєздатних клітин. Неочікувано, автори також виявили, що цей спосіб додатково зменшує необхідний час інкубування. Загалом автори виявили, що цей спосіб може зменшувати час інкубування на багато годин та у деяких випадках щонайменше на один або два дні. Неочікувано, автори також виявили, що спосіб даного винаходу може приводити до зниження заважаючого впливу мікроорганізмів, тобто тих мікроорганізмів, які відмінні від Legionella pneumophila. Спосіб даного винаходу, який відповідно включає контактування підданих стресу клітин мікроорганізму Legionella pneumophila з комбінацією репаративних сполук відповідно до даного винаходу, бажано інгібує утворення та/або знижує та/або усуває ROS, знижує осмотичний шок та покращує метаболізм та це приводить до спричинення регенерації підданих стресу клітин. Мікроорганізм Legionella pneumophila може бути безпосередньо приведений у контакт з репаративною сполукою після збирання зразку. Таким чином, контейнер, у який збирають зразок води, що, як вважають, містить мікроорганізм, може уже містити репаративні сполуки. Альтернативно, як тільки зібрали зразок води, що містить Legionella pneumophila, для аналізу він може бути розведений водою для розведення, що містить репаративні сполуки. У додатковому альтернативному варіанті, зразок, що є необов'язково розведеним, може бути приведений у контакт із середовищем для вирощування, що містить репаративні сполуки, або репаративні сполуки можуть бути застосовані після контактування мікроорганізму із поживним середовищем. Після того як зразок зібрали, може бути бажано покласти його у пристрій для зберігання до того часу, коли буде зручно виконувати спосіб відповідно до даного винаходу. Може бути бажано вводити всі з репаративних сполук протягом зберігання. Переважно, всі з репаративних сполук, що використовують у поєднанні відповідно до даного винаходу, слід приводити у контакт з мікроорганізмами протягом стадії розведення або протягом зберігання зразку. Одна форма даного винаходу бажано включає контактування зазначеного зразку з репаративним середовищем, переважно неселективним репаративним середовищем, що містить зазначену репаративну сполуку та потім приведення її у контакт із поживним середовищем, переважно селективним поживним середовищем. Переважно поживне середовище являє собою рідину та більш переважно бульйон. Коли репаративне середовище являє собою рідину, його відповідно називають рідким репаративним способом. Як правило, у 4 UA 105296 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рідкому репаративному способі зразок спочатку вводять у рідке середовище, що містить комбінацію відповідно до даного винаходу. У ідеалі, рідкий репаративний спосіб дозволяє підданим стресу бактеріям відновитися у неселективному репаративному середовищі. Переважно рідкий репаративний спосіб буде використовувати бульйон як рідке середовище. Загалом рідке середовище, що містить мікроорганізми Legionella pneumophila, потім буде перенесене у поживне середовище. Піддані стресу мікроорганізми мали б бути регенеровані або до переносу у поживне середовище або після контактування із поживним середовищем. Більш переважно поживне середовище являє собою селективне поживне середовище. Як правило, рідке середовище, що містить мікроорганізми, буде нанесене на пластину із селективним поживним середовищем, таку як пластина з селективним поживним агаром. У альтернативному кращому варіанті стадія (1) включає контактування зазначеного зразку із поживним середовищем, переважно неселективним поживним середовищем, що містить зазначену комбінацію репаративних сполук, та потім приведення його у контакт із репаративним середовищем, що також містить зазначену репаративну сполуку. Переважно репаративне середовище являє собою неселективне репаративне середовище, більш переважно тверду речовину, та особливо переважно селективне поживне агарозне середовище. Коли репаративне середовище являє собою тверду речовину, це буде називатися твердим репаративним способом. Як правило, твердий репаративний спосіб буде включати контактування зразку із неселективним поживним середовищем, що містить комбінацію репаративних сполук відповідно до даного винаходу. Потім він може бути приведений у контакт із селективним поживним середовищем, що містить репаративну сполуку або комбінацію репаративних сполук. У цьому варіанті селективні інгредієнти та сполука або сполуки, які запобігають утворенню, знижують кількість або видаляють ROS, будуть дифундувати у неселективне середовище. Переважно неселективне поживне середовище може являти собою неселективне поживне агарозне середовище. Таким чином, у цьому варіанті зразок може бути посіяний на будь-який неселективний агар та потім селективне поживне агарозне середовище, що містить сполуку або сполуки, які запобігають утворенню, знижують кількість або видаляють ROS, наносять шаром на неселективне поживне агарозне середовище. У додатковому альтернативному варіанті, зразок може бути нанесений на селективне поживне середовище, яке вже містить комбінацію репаративних сполук. Таке селективне поживне середовище може являти собою селективне поживне агарозне середовище. Посів зразку може бути виконаний як описано вище. У додатковому альтернативному варіанті, зразок може бути зібраний з води у формі аерозолю. Як правило, аерозоль може бути розташований у градирні або кондиціонері повітря. Краще конденсувати воду з аерозолю перед тестуванням відповідно до способу даного винаходу. У альтернативному переважному варіанті стадія (1) включає контактування зазначеного зразку з аерозолю з водою для розведення, що містить репаративне середовище, переважно неселективне репаративне середовище, що містить зазначену комбінацію репаративних сполук, та потім приведення його у контакт із поживним середовищем, що також містить зазначену комбінацію репаративних сполук. У всіх з описаних вище варіантів даного винаходу поживне середовище має бути підходящим для росту Legionella pneumophila. Підходящі типи поживних середовищ описані у літературі та добре відомі кваліфікованому спеціалісту. Як правило, поживне середовище має містити активоване вугілля та цистеїн. Краще, коли селективне поживне середовище являє собою селективне поживне агарозне середовище та більш переважно являє собою буферне вугільно-дріжджове (BCYE) агарозне середовище. BCYE поживне середовище стане селективним шляхом додавання добавки антибіотику. Дуже підходяще BCYE поживне середовище з антибіотиком відоме як GVPC (Гліцин, Валкоміцин, Поліміксин В, Цеклогексимід). Спосіб посіву описаний у літературі та добре відомий кваліфікованому спеціалісту. Як правило, цей спосіб буде включати нанесення деякої кількості цих зразків води на агаровий гель, який поміщають у чашку Петрі. Це може називатися метод чашок Петрі або метод посіву на агарі. Метою посіву на агарі є нанесення аліквоти, як правило, 100 мкл води, що, як підозрюють, містить цей мікроорганізм, що називають бактеріальною суспензією, на тверде середовище у чашці Петрі. Скляні гранули або клітинний скрепер можуть бути використані для нанесення бактеріальної суспензії на агарову платину. Після нанесення, більшість рідини абсорбується агаром та тонкий шар з бактеріями залишається на агаровій поверхні. При інкубуванні на агаровій поверхні відбувається ріст бактерій у формі колоній. Інкубування буде відбуватися при температурі, що найкраще підходить для цього мікроорганізму, що добре задокументовано у літературі та відомо кваліфікованому спеціалісту. Як правило, температура буде становити від 30°C до 50°C, наприклад, приблизно 37 °C. 5 UA 105296 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Комбінацію репаративних сполук слід додавати у кількості, ефективній для зниження окисного стресу мікроорганізму. Переважно, це буде кількість, ефективна для зниження або по суті видалення ROS у клітині мікроорганізму. Фактично, автори виявили, що використання комбінації репаративних сполук приводить до значного зменшення інкубаційної фази росту у процесі розвитку Legionella pneumophila, зокрема, у рідкому середовищі. Таке зменшення інкубаційної фази росту у рідкому середовищі приводить до скорочення часу, необхідного для одержання видимої колонії на агаровій пластині. Також може бути бажано включити кето кислоту та/або антиоксидантний фермент відновленого кисню у репаративне середовище та/або поживне середовище. Кето кислота та/або антиоксидантний фермент відновленого кисню не вважаються репаративною сполукою відповідно до даного винаходу. Тим не менше, може бути корисно включити одну або обидві з цих сполук у будь-яку з описаних вище комбінації репаративних сполук. Виявлення та підрахунок життєздатних мікроорганізмів можуть бути виконані за будь-яким з відомих способів, який описаний у літературі. Як правило, це буде означати підрахунок видимих колоній на поверхні поживного середовища, наприклад, поживної агарової пластини. Спосіб відповідно до даного винаходу полегшує точне кількісне визначення існування Legionella pneumophila. Більше того, час інкубування може бути значно скорочений. Цей спосіб підходить для виявлення Legionella pneumophila у зразках, отриманих з будь-якої групи, вибраної з промислового охолодження води, питних вод та природних вод. Даний винахід також включає набір для більш точного виявлення та підрахунку життєздатних мікроорганізмів виду Legionella pneumophila у зразку, що, як підозрюють, містить зазначені мікроорганізми, який включає: (1) репаративні сполуки, (2) поживне середовище, (3) засіб для інкубування, (4) засіб для виявлення та підрахунку мікроорганізмів, у якому мікроорганізмами є вид Legionella pneumophila, та у якому репаративні сполуки включають (a) серин; (b) треонін; (c) сполуку,що містить іони кальцію; (d) сполуку, що містить іони магнію; (e) сполуку, що містить іони калію; (f) глутамінову кислоту або її сіль, та (g) піровиноградну кислоту або її сіль. Цей набір також може включати будь-який з варіантів втілення, описаних у відношенні першого аспекту даного винаходу. Цей набір підходить для застосування із способом даного винаходу та дозволяє більш точно підрахувати Legionella pneumophila, особливо з урахуванням більш широкого спектру штамів Legionella pneumophila. Наступні приклади ілюструють даний винахід. Приклади Вибір сполук та визначення їх оптимальних концентрацій Для того щоб оцінити ефекти різних сполук, порівнюють 2 критерії: інкубаційний період та швидкість росту спостерігають із культуральним середовищем та доповненим середовищем з культурою без добавок. Для спрощення, інкубаційний період оцінюють за часом, необхідним для одержання оптичної густини 0,1 при 600 нм. Для всіх сполук, які тестують, виграш у інкубаційному періоді (позначений GT) отримують за різницею між інкубаційними періодами, отриманими на стандартному середовищі (YEC) та на середовищі з добавками. У однакових умовах, співвідношення швидкості росту (позначеної RVC) визначають як співвідношення між швидкістю росту, отриманою на стандартному середовищі, та швидкістю росту, отриманою на середовищі з добавками (YEC+X). У стандартному середовищі (YEC), штами L. pneumophila мають інтервал часу від 5 годин до 15 годин та потребують приблизно 10 годин для того, щоб досягнути оптичної густини (позначеної як OD) від 0,1 до 0,3. Коли застосовують серин або треонін як репаративні сполуки у кожному випадку покращення у інкубаційному періоді та/або швидкості росту спостерігаються для цілого ряду штамів Legionella pneumophila. Покращення спостерігаються у інтервалі доз, наприклад, від 0,01 6 UA 105296 C2 5 10 15 20 до 5 % у перерахунку маси сполуки до об'єму зразку з оптимальною дозою приблизно 1 г на літр. Покращення у інкубаційному періоді та/або швидкості росту спостерігаються для численних штамів Legionella pneumophila, коли застосовують хлорид кальцію або хлорид магнію у дозах -6 -2 -4 від 10 до 10 мМ, особливо 10 мМ. Покращення у інкубаційному періоді та/або швидкості росту спостерігаються для певної кількості штамів Legionella pneumophila, коли застосовують хлорид калію у дозах від 1 до 10 4 -2 мМ, особливо приблизно 10 мМ. Особливо ефективні комбінації репаративних сполук включають: Комбінація А 1 г на літр пірувату, 1 г на літр серину, 1 г на літр треоніну, 1 г на літр глутамінової кислоти, -4 -4 10 мМ хлориду кальцію, 10 мМ хлориду магнію. Комбінація В 1,5 г на літр пірувату, 1,5 г на літр серину, 1,5 г на літр треоніну, 1 г на літр глутамінової -4 -4 кислоти, 10 мМ хлориду кальцію та 10 мМ хлориду магнію. Комбінація C 2 г на літр пірувату, 2,5 г на літр серину, 1 г на літр треоніну, 1 г на літр глутамінової кислоти, -4 -4 -2 10 мМ хлориду кальцію, 10 мМ хлориду магнію та 1,16×10 мМ хлориду калію. Результати покажуть, що деякі комбінації є корисними для росту, особливо у рідкому середовищі, що містить різні штами. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 25 30 35 40 45 50 55 60 1. Спосіб виявлення та підрахунку життєздатних мікроорганізмів у зразку, що, як підозрюють, містить зазначені мікроорганізми (1) контактування зазначених мікроорганізмів зазначеного зразка з репаративними сполуками та поживним середовищем, та (2) інкубування продукту стадій (1), та (3) виявлення та підрахунок зазначених життєздатних мікроорганізмів, у якому мікроорганізми являють собою вид Legionella pneumophila, та у якому репаративні сполуки включають (a) серин; (b) треонін; -6 -2 (c) сполуку, що містить іони кальцію у дозі від 10 до 10 мМ; -6 -2 (d) сполуку, що містить іони магнію у дозі від 10 до 10 мМ; (e) сполуку, що містить іони калію; (f) глутамінову кислоту або її сіль, та (g) піровиноградну кислоту або її сіль. 2. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, у якому стадія (1) включає контактування зазначеного зразка з репаративним середовищем, переважно неселективним репаративним середовищем, що містить зазначену репаративну сполуку, та потім приведення його у контакт із поживним середовищем, переважно селективним поживним середовищем. 3. Спосіб за п. 2, у якому репаративне середовище являє собою рідину, переважно бульйон. 4. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, у якому стадія (1) включає контактування зазначеного зразка з поживним середовищем, переважно неселективним поживним середовищем, та потім приведення його у контакт з репаративним середовищем, що містить зазначену репаративну сполуку. 5. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, у якому репаративне середовище являє собою селективне репаративне середовище, переважно тверду речовину та більш переважно селективне агарозне поживне середовище. 6. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, у якому стадія (1) включає контактування зазначеного зразка з поживним середовищем, що містить зазначену репаративну сполуку. 7. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, у якому поживне середовище являє собою буферний вугільно-дріжджовий екстракт (BCYE) або GVPC агарозне поживне середовище. 8. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, у якому репаративне середовище та/або поживне середовище включає кетокислоту та/або антиоксидантний фермент відновленого кисню. 9. Набір для більш точного виявлення та підрахунку життєздатних мікроорганізмів виду Legionella pneumophila у зразку, що, як підозрюють, містить зазначені мікроорганізми, що включає: (1) репаративні сполуки, 7 UA 105296 C2 5 10 (2) поживне середовище, (3) засіб для інкубування, (4) засіб для виявлення та підрахунку мікроорганізмів, у якому мікроорганізми являють собою вид Legionella pneumophila, та у якому репаративні сполуки включають (a) серин; (b) треонін; (c) сполуку, що містить іони кальцію; (d) сполуку, що містить іони магнію; (e) сполуку, що містить іони калію; (f) глутамінову кислоту або її сіль, та (g) піровиноградну кислоту або її сіль. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8