Поживне середовище для одночасного виявлення гемолітичної та лецитиназної активностей мікроорганізмів

Поживне середовище для одночасного виявлення гемолітичної та лецитиназної активностей мікроорганізмів, що містить панкреатичний гідролізат рибної муки 24,0 г/л, натрію хлорид 4,0 г/л, агар 12,0+2,0 г/л, дефібриновану кров 5%, яке відрізняється тим, що додатково містить 5-10% суспензії курячого жовтка в ізотонічному розчині хлориду натрію. (19) (21) u200711212 (22) 10.10.2007 (24) 27.10.2008 (46) 27.10.2008, Бюл.№ 20, 2008 р. (72) РИЖКОВА ТЕТЯНА АН АТОЛІЇВН А, U A, СКЛЯР НАДІЯ ІВАНІВН А, UA, БАБИЧ ЄВГЕНІЙ МИ ХАЙЛОВИЧ, UA, ВОЛЯНСЬКИЙ ЮРІЙ ЛЕОНІДОВИЧ, UA, КАЛІНІЧЕНКО СВІТЛАН А ВІКТОРІВНА, U A, ХВОРОСТЯНА ВІРА ОЛЕКСІЇВН А, U A, МІЗІН ВАСИЛЬ ВАСИЛЬОВИЧ, UA, КРЕСТЕЦЬКА СВІТЛАН А ЛЕОНІДІВН А, U A (73) РИЖКОВА ТЕТЯНА АН АТОЛІЇВН А, U A, СКЛЯР НАДІЯ ІВАНІВН А, UA, БАБИЧ ЄВГЕНІЙ МИ ХАЙЛОВИЧ, UA, ВОЛЯНСЬКИЙ ЮРІЙ ЛЕОНІ 3 36224 Для визначення лецитиназної активності інших мікроорганізмів користуються наступним рецептом [5]: Панкреалізат казеїну 40,0г Na2HPО4 5,0г K2НРO4 1,0г NaCl 2,0г 0,1г MgSO4×7H2 O Глюкоза 2,0г Агар-агар 25,0г Жовток курячого яйця (1 жовток на 500,0мл середовища). Спільною ознакою з запропонованим середовищем є використання жовтка курячого яйця під час приготування середовища. Також широко застосовується комерційне середовище для визначення лецитиназної активності лістерій [5]: Панкреатичний гідролізат рибної му15,0г ки Панкреатичний гідролізат казеїну 10,0г Дріжджовий екстракт 2,0г Натрій хлорид 3,5г Глюкоза 1,0г Агар 10,0г Суспензія курячого жовтка в ізотонічному розчині хлориду натрія до 5%. Спільним із заявленим середовищем є використання суспензії курячого жовтка для визначення лецитиназної активності. Для вивчення гемолітичної активності бактерій, як правило, використовують наступні середовища: Кров 'яний агар на основі агау з сердцевою витяжкою [Каталог фірми HiMedia, Heart Infusion Agar, Cat. Ml 69], що містить: Витяжка з телячого сердця 500,0г Триптоза 10,0г Натрій хлорид 5,0г Агар 15,0г Дефібринована кров кроля, коня, барану чи людини до 5%. Ознакою, спільною з заявленим рішенням, є наявність у середовищі 5% дефібринованої крові Найбільш близьким до запропонованого середовища та обраним за прототип є 5% кров'яний агар на основі комерційного поживноо агару для культивування мікроорганізмів (ГРМ-АГ АР), до складу якого входять: Панкреатичний гідролізат рибної 24,0г муки Натрій хлорид 4,0г Агар 12,0±2,0г Дефібринована кров кроля, коня, барану чи людини до 5%. Спільним із запропонованим середовищем є наявність у складі середовища панкреатичного гідролізату рибної муки (24,0г/л), натрію хлориду (4,0г/л), агару (12,0±2,0г/л) та 5% дефібринованої крові для виявлення гемолітичної активності. Істотним недоліком наведених середовищ, що широко використовуються в мікробіологічний практиці є те, що для визначення гемолітичної та лецитиназної активностей необхідно готувати окремі середовища і жодне з них не розраховане на од 4 ночасне визначення вищевказаних факторів агресії. У основу корисної моделі поставлено задачу розробки середовища для одночасного виявлення лецитиназної та гемолітичної активностей бактерій, у якому за рахунок додавання окремих компонентів досягається отримання оптимального за складом середовища, зручного і простого у використанні. Суть корисної моделі полягає в поєднаному додаванні дефібринованої крові та жовточної зависі до готового середовища, що дозволяє виявляти як лецитиназну так і гемолітичну активності бактерій, використовуючи тільки запропоноване середовище. До складу запропонованого середовища входять: Панкреатичний гідролізат рибної 24,0г муки Натрію хлорид 4,0г Агар мікробіологічний 12,0±2,0г Дефібринована кров кроля, коня, до 5% барану чи людини Суспензії курячого жовтка у ізото5-10% нічному розчині хлориду натрія Вміст 5-10% жовточної зависі у запропонованому середовищі обумовлен тим, що при її вмісті менш ніж 5% слабо виявляється лецитиназна активність, а при її вмісті більш ніж 10% середовище стає занадто мутним та погано виявляється гемолітична активність мікроорганізмів. У залежності від вмісту суспензії курячого жовтка в середовищі ми назвали запропоноване середовище 5% жовточно-кров'яний агар (ЖКА), та 10% ЖКА (5% жовткової завісі та 10% жовткової зависі відповідно). При необхідності визначення гемолітичної та лецитиназної активностей у вибагливи х до поживних речовин мікроорганізмів можливо додавання стерильного розчину 40% глюкози до кінцевого вмісту у середовищі - 1%. Можливість здійснення винаходу ілюстр уємо на нижченаведених прикладах. Приклад 1 Готували середовище, що містить 5% жовткової зависі та 5% дефібринованої крові людини- 5% жовточно-кров'яний агар (5% ЖКА). Для порівняння кількості мікроорганізмів, що виросли на поверхні агарового середовища, культурально-морфологічних властивостей штамів, гемолітичної та лецитиназної активностей паралельно використовували 5% кров'яний агар (5% КА) та жовточно-сольовий агар (ЖСА). У дослід було взято 5 вилучених від хворих штамів S. aureus, S. aureus АТСС №25923; 5 штамів S. epidermidis із гемолітичними властивостями; S. saprophyticus АТСС №1535; Bacillus cereus АТСС №10702; штам Pseudomomas aeruginosa, вилучений від хворої; Pseudomomas aeruginosa АТСС №27853; циркулюючий штам С. diphtheriae gravis tox+; 5 клінічних ізолятів Е. соlі з гемолітичними властивостями; Е. соlі АТСС №25922. Для постановки досліду використовували 1824 годинні культури вказаних мікроорганізмів. Готували суспензію відповідних мікроорганізмів у 5 36224 стерильному фізіологічному розчині, що відповідала 1,0 одиниці мутності за McFarland, робили послідовні десятикратні розведення та висів із розведень 10-6, 10-7 та 10-8 по 0,1мл на запропоноване середовище для одночасного визначення гемолітичної та лецитиназної активностей, на 5% кров'яний агар (5% КА) та на жовточно-сольовий агар (ЖСА). Для визначення стабільності основних біологічних властивостей мікроорганізмів проводили десять пасажів вищезазначених штамів через запропоноване середовище (5% ЖКА), 5% КА та ЖС А й вивчали наступні ознаки: - для штамів S. aureus, S.epidermidis та S. saprophyticus -плазмокоагулазну активність, оксидазну та каталазну активності, ферментацію глюкози в анаеробних умовах та маніту в аеробних умовах; - для штамів Ps. aeruginosa - оксидазну та каталазну активності, O/F тест, р ухливість , здатність 6 до росту на середовищі Єндо та МПА, здатність утворювати пігмент та утилізувати цитрат; - для штаму С. diphtheriae gravis tox+ - здатність до токсиноутворення, цистиназну активність, ферментацію глюкози, крахмала, сахарози, уреази; - для штамів E.coli - рухливість, здатність до утилізації цитрату та ацетату, здатність до ферментації мочевини та лізину. Усі досліди проводили в чотирьох повтореннях, результати були оброблені статистичне компьютерною програмою Biostat. Приклад 2 Готували середовище зі вмістом 10% жовткової зависі та 5% дефібринованої крові людини 10% жовточно-кров'яний агар (10% ЖКА). Постановка досліду аналогічна попередньому Результати дво х дослідів наведено в таблицях 1-3. Таблиця 1 Порівняльна характеристика кількості мікроорганізмів, що виросли на запропонованому середовищі, 5% кров'яному агарі та жовточно-сольовому агарі. Вид мікрооорганізму № штаму S. aureus 1 S. aureus 2 S. aureus 3 S. aureus 4 S. aureus 5 S. aureus S.epidermidis АТСС№ 25923 6 S.epidermidis 7 S.epidermidis 8 S.epidermidis 9 S.epidermidis 10 S. saprophyticus Bacillus cereus Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa C. diphtheriae gravis tox+ E.coli АТСС№ 1535 АТСС№ 10702 11 АТСС№ 27853 12 13 Розведення 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 5% ЖКА 53,5±0,6 5±0,4 55±1,2 5,3±0,5 55±1 5,5±0,3 53,8±1,5 5,5±0,6 55±1,3 5,8±0,6 54,8±1,3 5,8±1,1 54,8±1,7 6,3±0,5 54,5±2 6±0,4 56,5±1 5,8±0,9 56±1,5 6±0,4 56,8±1,9 5,8±0,6 56,3±1 5,8±0,5 6,5±0,6 0 32,5±1 3,3±0,3 32,8±1,4 3,5±0,3 55,3±1,3 5,5±0,6 31,5±1,6 3±0,4 Кількість колоній (M±m) на: 10% ЖКА 5% КА 54,3±1,3 54,8±0,9 5±0,4 4.5±0,3 53,8±1,3 54±2,1 5,8±0,6 5,5±0,6 55±1,9 54,8±1,5 5±0,4 5±0,7 54,8±1 53,3±1,4 5,5±0,3 5,8±0,6 53,8±1,5 54,3±1,6 5,3±0,6 5±0,4 54,8±0,9 54,8±1,1 5,8±1,5 5,3±0,8 55±0,7 54,5±1 6±0,4 5,5±0,6 55,5±1,3 55,8±0,9 5,5±0,6 5,3±0,5 55,8±1,5 56±1 5,8±0,6 5±0,4 56,3±1,1 54,8±1,3 5,8±0,8 5,3±0,5 57,8±1,1 56±1,5 5,3±0,5 5,5±0,6 56±1,3 55,3±0,9 5,5±0,6 5,3±0,5 7±0,4 6,3±0,5 0 0 32,8±1,3 33,5±1,4 3,5±0,3 3,3±0,5 31,5±1,2 33,3±0,9 3,8±0,3 3,5±0,6 54±1,5 53,8±1,1 4,8±0,5 4,8±0,9 31±1 31±1 3,3±0,5 3,3±0,5 ЖСА 52,8±1,1 4,8±0,5 52,8±1,3 5±0,4 53,8±1,5 5,3±0,5 53,3±1,1 5±0,4 54,3±1,3 4,8±0,5 53,8±1,5 5,3±0,8 54,8±1,1 5,3±0,4 55,3±1,1 54±0,4 54±1,3 5±0,6 55±1,8 5±0,4 55,5±1,6 5±0,7 55,5±1,6 5,54±0,6 6±0,4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 36224 8 Продовження таблиці 1 E.coli 14 E.coli 15 E.coli 16 E.coli 17 E.coli АТСС№ 25922 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 32,3±1,1 3±0,4 30,8±1,9 3±0,4 32±0,9 3,5±0,3 30±0,9 3,3±0,3 30,3±0,9 3,5±0,3 Культурально-морфологічні ознаки були типовими, а окремі біологічні властивості, що вивчали 32,3±0,9 2,8±0,5 30,5±1 3,2±0,5 31,3±1Д 3,3±0,5 30±1,8 3±0,4 29,8±1,5 3,3±0,3 32,3±1,3 2,5±0,3 32±1,2 2,8±0,3 32,3±1,1 3±0,4 31±0,9 3,3±0,3 30,8±1,5 3,3±0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ся, залишалися стабільними протягом десяти пасажів при чотирикратному проведенні дослідів. Таблиця 2 Порівняльна характеристика прояву гемолітичних властивостей на запропонованому середовищі, 5% кров'яному агарі та жовточно-сольовому агарі. Вид мікрооорганізму № штаму S. aureus 1 S. aureus 2 S. aureus 3 S. aureus 4 S. aureus 5 S. aureus АТСС № 25923 S.epidermidis 6 S.epidermidis 7 S.epidermidis 8 S.epidermidis 9 S.epidermidis 10 S. saprophyticus АТСС № 1535 Bacillus cereus АТСС№10702 Ps. aeruginosa 11 Ps. aeruginosa АТСС №27853 C. diphtheriae gravis 12 tox+ E.coli 13 E.coli 14 E.coli 15 E.coli 16 E.coli 17 E.coli АТСС №25922 Примітка: "+" - наявність ознаки; "-" - відсутність ознаки. Гемолітична активність мікроорганізмів на: 5% ЖКА 10% ЖКА 5% КА ЖСА + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 9 36224 10 Таблиця 3 Порівняльна характеристика прояву лецитиназної активності на запропонованому середовищі, 5% кров'яному агарі та жовточно-сольовому агарі. Вид мікрооорганізму № штаму S. aureus S. aureus S. aureus S. aureus S. aureus S. aureus S.epidermidis S.epidermidis S.epidermidis S.epidermidis S.epidermidis S. saprophyticus Bacillus cereus Ps. aeruginosa Ps. aeruginosa C. diphtheriae gravis tox+ E.coli E.coli E.coli E.coli E.coli E.coli Примітка: "+" - наявність "-" - відсутність ознаки. 1 2 3 4 5 АТСС №25923 6 7 8 9 10 АТСС № 1535 АТСС№10702 11 АТСС №27853 12 13 14 15 16 17 АТСС №25922 ознаки; Лецитиназна активність мікроорганізмів на: 5% ЖКА 10% ЖКА 5% КА ЖСА + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Приведені дані вказують не тільки на придатність використання запропонованого середовища для одночасного виявлення гемолітичної та лецитиназної активностей, а й на його більшу чутливість (в порівнянні з ЖСА) при виявленні лецитиназної активності деяких штамів S.epidermidis. Перевагою даного середовища є можливість визначення лецитиназної активності не тільки стафілококів (як на середовищі ЖСА), а й широкого спектру більш вибагливих до поживних речовин мікроорганізмів. При цьому, під час порівняння ростових якостей, стабільності біологічних властивостей, можливості виявлення гемолітичної та лецитиназної активностей на запропонованому середовищі з додаванням 5% чи 10% жовтка не було виявлено статистичне достовірних відмінностей, від експериментальних даних при застосуванні відповідних рецептурних середовищ. Використання запропонованого середовища в мікробіологічній практиці замість кров'яного та жовточно-сольового агарів не тільки дозволить підвищити якість дослідження за рахунок більш точного виявлення лецитиназної активності, а й сприятиме зниженню собівартості мікробіологічних досліджень, тобто є економічно обгрунтованим. Література 1. Медициская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник / Под ред. А.А. Воробьева. + ~ М.: Медицинское информационное агентство, 2004. - 691 с. 2. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие / Под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. - М.: Медицина, 2004. - 576 с. 3. Мельников Н.И., Мельников В.Н., Гимранов М.Г. «Ферменты патогенности» и токсины бактерий. М.: Медицина. - 1969. - 252 с. 4. Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. - М.: Медицина, 1978. - 394 с. 5. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие / Под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. - М.: Медицина, 2005. - 600 с. 6. Патент RU №95112633 Питательная среда для выявления стафилококков с персистентными характеристиками. C12Q1/04 Изобретатели: Бухарин О.В., Матюшина С.Б., Чернова О.Л. Номер заявки: 95112633/13. Дата подачи заявки: 1995.07.20. Дата публикации: 1996.04.27. 11 Комп’ютерна в ерстка І.Скворцов а 36224 Підписне 12 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601