Пристрій для реєстрації біохемілюмінесценції

Винахід відноситься до технічних засобів для проведення люмінесцентного аналізу і може бути використане з метою діагностики (біологічні рідини - кров, сироватка, плазма крові, слина, сеча), а також вивчення структурнофункціональної організації біологічних мембран, функціональної активності клітинних популяцій, для рішення науково-практичних і фундаментальних задач медицини, біології (біохімії, біофізики, імунології, мікробіології), фармакології, токсикології, екології, сільського господарства (тваринництво, селекція) і т.д. Одним з найважливіших напрямків у біології і медицині є вивчення біологічних мембран - багатокомпонентних надмолекулярних систем, що забезпечують структурну відособленість і цілісність кліток і їх внутрішньоклітинних органелл. Практично усі функціональні, життєво важливі процеси - такі як біоенергетика, розподіл кліток, транспорт речовин, збудливість і проведення нервового імпульсу, імунна відповідь, рухова активність і т.д. здійснюється з прямою чи непрямою участю біологічних мембран. Ці різноманітні аспекти їхньої функції визначаються, насамперед, структурно-динамічним станом основних компонентів мембран - білків і ліпідів. Для вивчення біологічних мембран широко використовуються біофізичні методи дослідження. До них відносяться і люмінесцентні методи, зокрема хемілюмінесцентний. Встановлено, що біологічні мембрани хемілюмінесцирують. Світіння зв'язують з перекісним окислюванням ліпідів і вважають, що воно містить інформацію про рівень радикально-ланцюгових реакцій, що протікають у мембранах, про ступінь насиченості жирних кислот, що входять до складу ліпідів, про рівень антиокислюваної активності антиоксидантів, що контролюють інтенсивність радикально-ланцюгових реакцій. Основу хемілюмінесценції складають хімічні реакції, у ході яких виникають короткоіснуючі збуджені молекули радикали, що швидко переходять в основний (незбуджений) стан, а енергію порушення виділяють у вигляді фотонів світла. Відомий вітчизняний прилад - Хемілюмінометр медичний ХЛМ1Ц-01 (Сидорик Е.П., Карнаух И.М., Баглей Е.А. і ін. Хемілюмінометр медичний ХЛМ1Ц-01 // Засоби виміру, допущені до випуску в обігу в СРСР. Опис затверджених зразків М: Вид-во стандартів, 1979. Вип. 54. С.21-27.), що дозволяє реєструвати інтенсивність зверхслабкого світіння в діапазоні 200-600нм, що працює в режимі рахунка фотонів. Недоліком цього приладу є надмірно великі габарити, велика маса (360кг), споживає велику кількість електроенергії (2кВ), що економічно невигідно. При експлуатації часто виходить з ладу. У силу цього в даний час прилад не випускається промисловістю. Відомий також прилад (Ципін А.Б., Рогатський Г.Г., Журавльов А.І. і ін. «Пристрій для виміру зверхслабкого світіння біологічних субстратів», А.З № 457892 СРСР // Б. І. 1975. № 3. С.94), призначений для виміру надслабкого світіння біологічних рідин у режимі рахунка фотонів. Містить світлонепроникну камеру з вікном для фотокатода фотоумножника, затвор, виконаний у виді сектора зі світлонепроникного нелюмінесцируючого матеріалу, світодіод, установлений на внутрішній поверхні затвора, сальник, виконаний зі світлонепроникного матеріалу, усередині якого проходить вісь рукоятки повороту затвора, оксамитні щічки ущільнення, розташовані паралельно в корпусі камери, а також термостатуючу кювету для досліджуваного зразка. Недоліком пристрою є вертикальне розташування блоку, що містить ФЕУ, що розташований зверху над кюветою і практично не дозволяє вводити в кювету в момент реєстрації хемілюмінесценції різні дозуючі добавки. Крім того, від частого руху пластини затвора, оксамитні щітки швидко виходять з ладу, що може привести до засвітки ФЕУ. Найбільш близьким, узятим як прототип є Біолюмінометр БЛМ-8703М, (Академія наук СРСР, ордена Леніна Сибірське відділення спеціальне конструкторсько-технологічне бюро «Наука», 1990р.), призначений для реєстрації біохемілюмінесцентних реакцій. Прилад працює в аналоговому режимі. Результати виміру виводяться на 12-ти розрядний цифровий індикатор, а також на самописний прилад і цифродрукуючий пристрій. Наявність інтерфейсу RS-232 у приладі забезпечує роботу з мікро-ЕОМ, типу ДВК, IBM і іншими обчислювальними комплексами. Основними недоліками цього приладу є низька чутливість, оскільки прилад працює в аналоговому режимі, а незадовільний світлозахист не дозволяє використовувати ФЕУ типу 130, 140 і ін., що призначаються для зверхслабих світінь. У силу цей прилад не уловлює настільки слабке світіння, що характерно для сироватки, сечі й інших біологічних рідин. Призначений тільки для виміру люмінолзалежної хемілюмінесценції і при використанні системи люциферин-люцифераза. Метою дійсного винаходу є створення приладу настільного типу, що працює в режимі рахунка фотонів, що володіє високою чутливістю завдяки застосуванню ФЕУ-130, ФЕУ-140 і інших високочутливих фотоумножників. Ціль досягається тим, що в пристрої замість заслінки-діафрагми вводиться спеціальна заслінка з двох, розділених між собою металевих пластин, що приводяться в рух за допомогою стрижня, що виходить протилежним кінцем назовні через отвір у бічній стінці кюветного блоку, що дозволяє оператору «відкривати і закривати» ФЕУ в потрібний момент. З метою виключення влучення зовнішнього світла усередину кюветного блоку через зазор між стрижнем і отвором, була використана система з двох мідних трубок, одна з яких щільно впресована в отвір бічної стінки кюветного блоку, а друга, рухлива, розташована зовні першої, зв'язана з кінцем стрижня за допомогою круглої гайки і приводиться в рух разом із заслінкою при роботі оператора. Така конструкція заслінки разом із системою трубок виключає дифракцію зовнішнього світла, і тим самим забезпечує надійний світлозахист ФЕУ від паразитних, зовнішніх світлових потоків, робить можливим використання ФЕУ, призначених для реєстрації сверхслабих світлових потоків (ФЕУ-130,ФЕУ-140 та ін.). Крім цього в хемілюмінометре додатково введений захист від грубої ненавмисний засвітки ФЕУ в ситуації, коли знімається кришка люка і ФЕУ відкритий (що може негайно вивести з ладу ФЕУ). Основу цього захисту складає кулісний механізм, що приводить у дію спеціальний фіксатор, притискаючи кришку люка кюветного блоку при відкритому і звільняючи її при закритому ФЕУ. Новим також є те, що з метою вивчення впливу на параметри хемілюмінесценції досліджуваного зразка різних речовин-добавок у кришці люка кюветного блоку вмонтована мідна трубка для введення голки дозатора. При цьому конструкція кришки виконана так, щоб цілком виключити влучення зовнішнього світла усередину кюветного блоку. Новим є те, що кювета постачена пристроєм перемішування і забезпечує відтворюваність результатів, тому що процес перемішування виключає осадження кліток і внутрішньоклітинних структур у суспензії. В основі перемішування застосований спосіб барботування рідини повітрям. Однак, у даному випадку барботування цілком виключається завдяки використанню тонкого поліетиленового капіляра, зануреного в розчин кювети, у капілярі стовпчик рідини цілком не витісняється повітрям, що надходить імпульсами по гумовому шлангу від сифона з приводом для формування імпульсів тиску, у результаті чого стовпчик рідини поводиться як поршеньок, повідомляючи навколишньої капіляри рідині імпульс. Оскільки капіляр малих розмірів він не робить істотного впливу на сигнал хемілюмінесценції. Новизна також полягає в тому, що для градуіровки в абсолютних одиницях інтенсивності світіння ми застосували як еталон сіль - уранілацетат. З погляду метрологічної служби вирішена важлива проблема контроль чутливості і працездатності приладів - хемілюмінометрів, а також порівняння результатів виміру, отриманих на різних приладах. На відміну від аналога, у якому висновок у мікро-ЕОМ результатів вимірів хемілюмінесценції здійснюється за схемою: аналоговий підсилювач >аналогово-цифровий перетворювач (АЦП)>КР580ВВ55>пам'ять з відповідним драйвером, у нашому варіанті ця схема змінена: семирозрядний нагромаджувач імпульсів лічильника V > дешифратор 155 ИД3 > ключі (КТ801, КТ315) > КР580ВВ79 (програмувальний контролер дисплею і клавіатури) у режимі набору датчиків > пам'ять. Драйвер, природно, відрізняється. Перевага цієї схеми полягає в тому, що вона дозволяє візуально контролювати по цифровому дисплею введення даних у мікро-ЕОМ VI, простіше в реалізації. Розроблено програмне забезпечення для обробки даних, їхнього аналізу і висновок на цифровий дисплей. Убудована мікро-ЕОМ значно дешевше і менше по габаритах персонального комп'ютера. У той же час вона дозволяє не тільки зберігати в пам'яті результати вимірів, але і здійснювати відповідну математичну обробку й аналіз матеріалів. Таким чином, у пропонованому технічному рішенні всі перераховані ознаки відрізняються як від відомого устрою-прототипу, так і від аналога. Тому в пропонованому пристрої завдяки новим ознакам забезпечуються критерії «Істотні відмінності», «Новизна», «Позитивний ефект». На фіг.1 приведена структурно-функціональна схема пристрою для реєстрації хемілюмінесценції, де: І. Кюветний блок, у якому розташовується заслінка і кварцова кювета зі зразком; II. Фотоелектроний умножитель (ФЕУ типу 130 чи 140); III. Широкополосний підсилювач імпульсів, що надходять з ФЕУ; IV. Аналізатор імпульсів; V. Семірозрядний лічильник імпульсів; VI. Високовольтне джерело постачання ФЕУ; VII. Мікро ЕОМ. Подальший опис буде стосуватися структури кюветного блоку І, у якому і представлена новизна пропонованих рішень. Усі приведені в тексті малюнки і їхній опис представлені в додатку. На фіг.1.1 (а і б) і 1.2 представлені схематичні зображення деталей заслінки. На фіг.1.1 представлено заслінку (а), що складається з двох металевих пластин 9 (в) і між ними 2-х металевих прокладок 8 (б), розмірами, зазначеними на фіг. Заслінка жорстко за допомогою гвинтів кріпиться до металевої стінки 4 кюветного блоку (фіг.3А і Б), що розділяє ФЕУ і кварцову кювету 20 (фіг.3А). Перегородка 4 і пластини 9 мають оптичне вікно 5, що розташовується перед фотокатодом ФЕУ II. Пластини 9 і прокладки 8 спільно утворять пази 10, у які вдвигаються рухливі пластини 11 заслінки, закриваючи, і висуваються, відкриваючи, відповідно оптичне вікно 5, дві (фіги. 1.2а). Пластини 11 заслінки і між ними металева прокладка 12, за допомогою гвинтів кріпляться до металевої планки 13 (б), до якої у свою чергу одним кінцем угвинчується металевий стрижень 14, а інший кінець стрижня 14 виходить назовні кюветного блоку усередині мідної трубки 16 (фіг.3А і Б). Трубка 16 жорстко зв'язана зі стінкою 15. Зовнішній кінець стрижня 14 за допомогою круглої гайки 18 кріпиться до мідної трубки 17, що спільно зі стрижнем 14 вільно рухається поверх трубки 16 і в такий спосіб надає руху пластини 11 заслінки. На фіг.1.3А (вид зверху) і Б (вид збоку) зображений кюветний блок у зібраному стані. Розміри блоку і його частин, зображених на фіг. відповідає масштабу 1:1: 1. Світлонепроникний сталевий кожух, усередині якого розташований ФЕУ (2). 3. Металева гайка, що кріпить кожух 1 до пластини 4, що розділяє ФЕУ 2 і кварцову кювету 20. 5. Оптичне вікно. 6. Кварцова короткофокусна лінза. 7.15 і 12 - бічні металеві стінки кюветного блоку. 8. Металева прокладка. 9. Металева пластина, що разом із прокладкою 8 утворить нерухому, жорстко фіксовану частину заслінки (фіг.1.1А, Б). 10. Пази, утворені прокладкою 8 і пластиною 9 (фіг.1.1А). 11. Рухлива пластина заслінки (дві) (фіг.1.2А). 13. Металева планка, до якої кріпляться пластини 11 і стрижень 14. (фіг.1.2А, Б). 16. Внутрішня мідна трубка діаметром 5 мм, жорстко зв'язана зі стінкою 15. 17. Зовнішня мідна трубка діаметром 6 мм, що вільно рухається по поверхні трубки 16. 18. Кругла гайка, за допомогою якої стрижень 14 жорстко, кріпиться до трубки 17, і в такий спосіб надає руху рухливим пластинам 11 заслінки (фіг. 1.2А). Наявність мідних трубок 16 і 17, а також гайки 18 виключає доступ зовнішнього світла до фотокатода ФЕУ в момент реєстрації хемілюмінесценції досліджуваного зразка, тобто коли оптичне вікно 5 відкрите для ФЕУ. 19. Мідна труба, що виконує функцію люка, завдяки якому вводиться усередину кюветного блоку і витягається назовні кварцова кювету 20 з досліджуваним зразком. 21. Фіксатор положення кварцової кювети 20 усередині кюветного блоку. 22. Металева пластина, що служить підставою для кварцової кювети 20. На фіг.1.4А (вид з боку) і фіг.1.4Б (вид зверху) зображений механізм захисту ФЕУ від ненавмисної грубої засвітки. Основу цього захисту складає кулісний механізм, що приводить у дію фіксатор 30, притискаючи кришку 19 при відкритому (фіг.1.4Б) і звільняючи її при закритому ФЕУ (фіг.1.4А). На фіг.1.4А зображені: 1. Кожух для ФЕМ; 3. Гайка, що закріплює кожух 1 до пластини 4; 5. Оптичне вікно; 17. Зовнішня трубка, на яку надіто і закріплене бронзове кільце 26, що у свою чергу зв'язано з важелем 27. 28. Г-образний важіль, що об обертається навколо осі 29 і один кінець його рухливо з важелем 27, а на протилежному кінці жорстко закріплена пластина-фіксатор 30. При відкритому ФЕУ (фіг.1.4Б) фіксатор 30 притискає кришку 19 і не дозволяє її знімати. При закритому ФЕУ фіксатор 30 займає положення, що зображено на фіг.1.4 А. У цьому положенні кришку люку 19 можна знімати, чи уводити витягати назовні кварцову кювету 20 зі зразком. На фіг.1.5 зображено дозатор з голкою і кришка люку кюветного блоку. На шток 37 комерційного дозатора ємністю 0,05мл на клеї надіта з нержавіючої сталі трубка 38, у протилежному кінці якої впресована голівка медичної голки діаметром 1,6мм. Між голівкою голки 39 і внутрішньою стінкою трубки утворений паз 40, у який входить трубка кришки 33 люка й таким чином зовнішнє світло не попадає усередину кюветного блоку і, отже, на фотокатод ФЕУ в момент реєстрації хемілюмінесценції. Кінець голки 39 з добавкою розташовується на висоті 10 мм від поверхні досліджуваного розчину, добавка вводиться в будь-який момент по розсуду оператора. Оскільки стінки штока 37 дозатора прозорі для зовнішнього світла шток 37 покритий пековим лаком. У кришку люка кюветного блоку умонтована світлонепроникна трубка 41, на яку надівається гумовий шланг (фіг.1.6) для подачі до капіляра пульсуючого тиску повітря від гумової груші з клапаном (від пульвілізатора) і відповідним приводом (електродвигун 45 і шатун 46). У тонкому капілярі 44, зануреному в розчин кювети стовпчик рідини цілком не витісняється повітрям, що надходить імпульсом по гумовому шлангу 42, у результаті чого стовпчик рідини в капілярі 44 поводиться як поршеньок, повідомляючи навколишньої капіляр рідини імпульс і, таким способом, здійснюючи необхідне перемішування розчину, при цьому капіляр 44 у силу малих розмірів не робить істотного впливу на хемілюмінесценцію. Для градуіровки в абсолютних одиницях інтенсивності світіння ми застосували як еталон сіль уранілацетату. На фіг.1.7А представлена пробірка 47 діаметром 12мм і висотою 40мм, у якій знаходиться сіль уранілацетату 48. Висота наповнення солі 48 у пробірці 10мм, а вага 340мг. На фіг.1.7Б пробірка 1.7А поміщена у світлонепроникний циліндр 49 з чорного паперу з бічним отвором 50 діаметром 0,8мм і площею 0,5мм2 на рівні оптичної осі; цей варіант дає можливість вимірювати граничне світіння еталона і прийняти це світіння як вихідний стандарт. У таблиці 1 представлені результати вимірів світіння уранілацетату в пробірці а) і б) при напрузі 1300В, що подається на ФЕУ (6 послідовних вимірів по 10 секунд кожне) при температурі 20°С, а також уранілацетату у повному обсязі й обмеженому отворі. Таблиця 1 Показники хемілюмінесценції еталону (уранілацетату) і сироватки крові людини темн. струм 4655 4606 4601 4585 4535 4649 S =27671 461імп/с Еталон Пробірка а/ Пробірка б/ 143457 5623 144115 5619 143779 5516 144036 5639 145315 5559 144621 5601 S =865323 S =33557 14422імп/с 559імп/с 13961фотон/с 98фотон/с темн. струм 4053 3999 4099 4053 4041 4032 S =24277 405імп/с ХЛ сироватки крові людини Спонтанна ХЛ ХЛ інд.Fe2+ 4624 5283 4571 4749 4341 4893 4323 4793 4329 4981 4429 5053 S =26617 S =29692 444імп/с 4949імп/10с 39фотон/с 90фотон/с ХЛ інд.Н2О2 24975 20035 17691 18757 17929 18576 S =117963 19660імп/10с 1561фотон/с Ці показники при експлуатації приладу повинні бути порівнянні з хемілюмінесценцією (ХЛ) зразків сироватки чи крові інших біологічних субстратів. Як видно з таблиці, погрішність вимірювань не перебільшує 2%. В другій частині таблиці 1 представлений зразок результатів вимірів ХЛ сироватки крові людини (1мл трисбуфера + 0,3мл сироватки людини, як добавку використовували 0,05мол 1мг % розчину FeSО4 і 0,05мл 3% розчину H2О2). Таким чином, вирішена важлива проблема метрологічної служби: контроль чутливості і працездатності хемілюмінометрів, а також можливості порівнювати між собою результати вимірів, отриманих на різних приладах. Показники хемілюмінесценції, тобто рівень інтенсивності світіння ХЛ, індукованої Fe2+ і Н2O2 апробовані на групі контрольних осіб, що зіставлені з працюючими що піддавалися впливу електромагнітних випромінювань СВЧдіпазону і хворими хронічним пиловим бронхітом (ХПБ). Дані представлені в таблиці 2. Таблиця 2 Показники хемілюмінесценції сироватки крові у осіб контрольної групи, хворих ХПБ і працюючих на СВЧустановках (імп/с) Групи обстежених n Спонтанна ХЛ Інтенсивність хемілюмінесценції Індуційована Fе2+ Індуційована Н2О2 «Швидкий» спалах Светосума «Швидкий» спалах Светосума Практич. 44 52,6±4,3 161,1±7,8 122,2±7,5 2710±241 2018±111 здорові Працюючі з 34р 89,8±27,8>0,05 239,4±12,6