Спосіб отримання цитробактерного аглютинуючого антигену

Винахід відноситься до біології, медичної та ветеринарної мікробіології, біотехнології та може бути використаний при виробництві біологічно активних препаратів, діагностичних цитробактерних антигенів для серологічної діагностики цитробактерної інфекції у пта хів. Має загально теоретичне і практичне значення. Для бактерій роду Сіtrоbасtеr характерна наявність 44 серологічних 0-груп, 88 антигенів і більше 200 серологічних типів. Окрім того є міжродові зв'язки по 0-антигену із бактеріями роду Sаlmonellа, Eshcerichia, Morganella та Haftiia. Прототип - відомий спосіб отримання аглютинуючих цитробактерних антигенів шляхом вирощування 18-24 годиною агарової культури бактерій роду Сіtrоbасtеr із наступним застосуванням його в реакції аглютинації на склі загальноприйнятим методом (1). Недоліком відомого способу являється те, що при виборі бактерій для отримання антигену не враховується видова специфічність бактерій за джерелом походження, що являється важливим для проведення правильної лабораторної діагностики. Окрім того, застосування антигену в реакції аглютинації на склі дає можливість оцінювати результати за якісним показникам - інтенсивність аглютинації, ступінь її прояви. Отримані дані дозволяють робити тільки загальний висновок про антигенні зв'язки, а в деяких випадках лише узагальнено (2). Метою передбачуваного винаходу являється розробка способу отримання аглютинуючого антигену для серологічної діагностики цитробактерної інфекції у к урей. Поставлена мета досягається тим, що як антиген використовують виділений від курей штам Сіtrоbасtеr freundii, видоспецифічний за джерелом походження. Антиген використовують у пластинчатій реакції аглютинації (мікротитратор Такачі) з кількісним визначенням титру антитіл. Приклад виконання способу: 1. Штам Сіtrоbасtеr freundii, ізольований із жовткових фолікулів курей, позитивнореагуючи х із еритроцитарним пулорним антигеном, виготовленим зі штаму S.pullorum-gallinarum. 2. Культур у Сіtrоbасtеr freundii, висівають на МПБ у пробірки по 10см 3 у кожній. Інкубують при 37°С протягом 24 годин. 3. Кожна культура містить 3x109 колонієутворюючих одиниць при підрахуванні колоній на агаровій поверхні у чашках Петрі. Культур у перевіряють на чистоту шляхом фарбування по Граму, та мікроскопією на рухливість. 4. Потім розплодку бактерій реінкубують на м'ясо-пептонному агарі (МПА) в матрацах об'ємом 1,5л; інкубують в термостаті при температурі 37°С протягом 18-24 годин. Добову агарову культур у змивають забуференим (рН7,2) 0,85% розчином МаСІ. 5. В отриманій суспензії визначають концентрацію мікробних клітин за стандартом каламутності. Фізіологічним розчином (рН7,2) доводять концентрацію бактерій до 20млрд./см 3. 6. Суспензію Сіtrоbасtеr freundii інактивують 0,4% розчином формаліну при 37°С протягом48 годин. Визначення активності і специфічності антигену. Антиген для діагностики цитробактерної інфекції у курей являє собою завись бактеріальної культури штаму Сіtrоbасtеr freundii (був отриманий виконавцями із жовткових фолікулів курей, № деклараційного патенту 61253, 2003р.), інактивованої розчином формаліну. Концентрація бактерій згідно стандарту каламутності складає 20млрд./см 3. Випробування проводять у тест-системі, яка містить специфічну імунну сироватку, нормальну негативну сироватку курей, фізіологічний розчин NаСІ з рН7,2. Антиген застосовують у кількісній, пробірочній та пластинчатій реакції аглютинації (РА) за допомогою мікротитратора Такачі. Порядок випробування в пластинчатій (РА). Готують послідовні двократні розведення імунної специфічної сироватки від курей фізіологічним розчином NаСІ, в об'ємі 0,05см 3. У всі розведення сироватки додають по 0,05см 3 робочого розчину антигену (для отримання робочого розчину нативний антиген розводять фізіологічним розчином 1:10). В контролі досліджуються нормальна негативна сироватка у двократних розведеннях. Контроль антигену на спонтанну аглютинацію проводять шляхом внесення у 5 лунок плексигласової панелі фізіологічного розчину NаСІ в об’ємі 0,05см 3, потім додають 0,05см 3 робочого розчину антигену у кожну лунку. Панелі струшують та ставлять на 2 години до термостата при 37°С. Потім реакцію залишають при кімнатній температурі 23-25°С на 20-22 години. Облік реакції. Позитивна реакція характеризується появою на дні лунки осаду у ви гляді парасольки із рівними або зубчастими краями. Негативна реакція характеризується появою на дні лунки осаду у вигляді маленького ґудзика. Реакція на спонтанну аглютинацію повинна бути негативною. Результати досліджень представлені у таблиці. Таблиця Назва компонента 1.Імунна сироватка 2.Нормальна сироватка 3.Фізіологічний розчин 1:2 + + 1:4 + + 1:8 + Розведення сироватки 1:16 1:32 1:64 + + + 1:128 + 1:256 1:512 Найбільше розведення імунної сироватки, при якому спостерігається чітка аглютинація вважають титром антигену. Реакцію аглютинації з імунною сироваткою оцінюють позитивно при титрі 1:16 і вище. Реакцію аглютинації з негативною сироваткою повинна бути негативною або не вище 1:4.