Кодуюча послідовність днк гена гідроксифенілпіруватдіоксигенази, химерний ген, вектор, рослинна клітина, рослина, які містять таку послідовність, спосіб трансформації рослин, спосіб селективної гербіцидної обро

Даний винахід стосується гечу гідроксилфенілпіруватдіоксигенази (ГФПД), химерному гену, що містить цей ген як кодуючу послідовність, і його застосування для одержання рослин, стійких до деяких гербіцидів. Відомі деякі гербіциди, такі, як ізоксазоли, що описуються, зокрема, в заявках на французькі патенти 95 06800 і 95 13570, ізоксафлутол, гербіцид вибіркової дії по відношенню до кукурудзи, дикетонітрили, такі, що описуються в європейських заявках 0496630, 0496631, зокрема, 2-ціано-3-ціклопропіл-1-(2-SО2 СН3 -4CF3 феніл) пропан-1,3-діон та 2-ціано-3-циклопропіл-1-(2-SО2 СН3 -2,ЗСІ 2 -феніл) пропан-1,3-діон, трикетони, що описуються в європейських заявках 0 625 505 та 0 625 508, зокрема, сулькотріон. Однак, жодного гена, толерантного до таких гербіцидів, описано не було. Пдроксилфенілпіруватдіоксигеназа є фрагментом, який каталізує реакцію трансформації парагідроксифенілпірувата в гомогентизат. В той же час, одержаної із Pseudomonas sp. P. J. 874, була, хоча й не було повідомлень про (Ruetschi et col:Eur.J. Biochem. 205, 459-466, 1922). В цьому документі немає опису гена, що кодує цей білок. Тепер відкрили послідовність гену цього типу і те, що така послідовність після введення в рослинні клітини може викликати надекспресію або активацію ГФПД в рослинах, що надають цим останнім значну толерантність до деяких гербіцидів, що з'явилися нещодавно, таких, як гербіциди родини ізоксазолів або родини трикетонів. Об'єктом даного винаходу є послідовність ДНК, виділена із гена нелюдського походження та бактеріального неморського походження або ще із рослинного гена, або послідовність, яка може гібридизуватися з цією виділеною послідовністю, яка відрізняється тим, що вона експресує гідроксилфенілпіруватдіокси-геназу (ГФПД). Зокрема, ця послідовність може бути бактеріального походження, особливо з бактерій, що належать до родини Pseudomonas, або ж рослинного походження, будучи виділеною із однодольної або дводольної рослини, особливо Arabidopsis, або зонтичних, як наприклад, моркви {Daucus carotta). Вона може бути природною або дикою, або, можливо, мутованою із збереженням суттєвої властивості гербіцидної толерантності проти інгібіторів ГФПД, таких, як гербіциди родини ізоксазолів або родини трикетонів. Винахід включає також спосіб виділення вищеназваного гена, в якому: - декілька олігонуклеотидів, що походять із послідовності амінокислот ГФПД, вибирають праймерами - виходячи з цих праймерів, синтезують фрагменти ампліфікації шляхом ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція); - виділяють ген шляхом створення та скринінгу банка генів і - клонують ген. Переважно використовують праймери, що походять із послідовності ГФПД бактерії роду Pseudomonas. Особливо переважно вони походять із Pseudomonas fluorescens. Об'єктом винаходу є також застосування гена, що кодує ГФПД, для трансформації рослин, таким може бути ген-маркер або кодуюча послідовність, що дозволяє надати рослині толерантність до деяких гербіцидів. Його можна також використати разом з іншими генами - маркерами та/або кодуючою послідовністю, якщо це необхідно. Кодуючий ген може бути нативним, диким, або, можливо, мутованим, при збереженні суттєвої властивості гербіцидної толерантності проти інгібіторів ГФПД, таких як гербіциди родини ізоксазолів або родини трикетонів. Як кодуючу послідовність можна, зокрема, використати послідовність відповідно до винаходу, як описано вище. Трансформація рослинних клітин може бути здійснена за допомогою відомого методу. Ряд методів полягає в бомбардуванні клітин або протопластів частками, до яких прикріплені послідовності ДНК. Інша серія методів полягає в використанні як засобу переносу в рослину химерного гена, включеного в плазміду Ті Agrobacterium tumefaciens або Ri Agrobacterium rhizogenes. Об'єктом даного винаходу є також химерний ген, що включає по ходу транскрипції, принаймні, одну промоторну регулюючу послідовність, одну гетерологіч-ну кодуючу послідовність, яка експресує гідроксилфенілпіруватдіоксигеназу, і принаймні, одну термінуючу регулюючу або поліаденілуючу послідовність. Як промоторну регулюючу послідовність можна використати будь-яку промоторну послідовність гена, яка природно експресується в рослинах, зокрема, промотор бактеріального, вірусного або рослинного.походження, такий, як, наприклад, промотор гена малої субодиниці рибулози-бікарбоксилази (RuBisCO) або промотор гена альфа-трибулину (Європейська заявка на патент N 0 652 286), або ще гена рослинного вірусу, як наприклад, вірус мозаїки цвітної капусти (CAMV 19S або 25S), а також можна використати будь-який відомий підходящий промотор. Переважно використовують регулюючу промоторну послідовність, яка сприяє надекспресії кодуючої послідовності, як, наприклад, послідовність, яка містить, принаймні, один гістонний промотр, що описаний в європейській заявці на патент 0 507 698. В даному винаході можна також використати разом з промоторною регулюючою послідовністю інші регулюючі послідовності, що знаходяться між промотором та кодуючою послідовністю, такі, як активатори транскрипції "енхансер", як, наприклад, активатор трансляції вірусу мозаїки тютюну (TEV), описаний в Міжнародній заявці 87/07644, або перехідні пептиди, прості чи подвійні, причому в цьому випадку вони можуть бути розділені проміжною послідовністю, тобто, включають по ходу транскрипції послідовність, що кодує перехідний пептид рослинного гена, який кодує фермент з локалізацією в пластидах, частину послідовності Nкінцевої зрілої ділянки рослинного гена, що кодує фермент з локалізацією в пластидах, потім послідовність, що кодує другий перехідний пептид рослинного гена, кодуючого фермент з локалізацією в пластидах, утвореного частиною послідовності N-кінцевої зрілої ділянки рослинного гена, кодуючого фермент з локалізацією в пластидах, описаних в європейській заявці N 0 508 909. Як термінуючу і поліаденілуючу регулюючу послідовність можна використати будь-яку відповідну послідовність бактеріального походження, як, наприклад, термінатор Agrobacterium tumefciens, або ж рослинного походження, як, наприклад, гістонний термінатор, що описаний у європейській заявці N 0 633 317. Об'єктом даного винаходу є також рослинні клітини однодольних або дводольних рослин, особливо культур, трансформованих по одному із описаних вище способів і які містять в своєму геномі ефективну кількість гена, дякуючи якому проходить експресія гідроксифенілпіруватдіоксигенази (ГФПД). Було помічено, що трансформовані таким чином рослини мають значну стійкість до деяких гербіцидів, що з'явилися нещодавно, таким, як ізоксазоли, описані, зокрема, в заявках на французькі патенти 9506800 та 95 13570, і, особливо 4-[4-CF3 -2-(метилсульфоіл) бензоіл}-5-циклопропілізоксазол, і особливо ізоксафлутол, гербіцид селективної дії по відношенню до кукурудзи, дікетонітрили, описані в європейських заявках 0 496 630, 0 496 631, зокрема, 2-ціано-3-циклопропіл-1-(2-SO2 CH3-4-CF3-феніл) пропан-1,3-діон та 2-ціано-3-циклопропіл-1-(2SО2 СН3-4-2-, 3Сl2 -феніл) пропан - 1,3-діон, трикетони, описані в європейських заявках и 625 505 та 0 625 508, зокрема, сулькотріон. Нарешті, об'єктом винаходу є спосіб прополювання рослин, особливо культурних рослин, за допомогою гербіцида цього типу, в якому цим гербіцидом обробляють трансформовані відповідно до винаходу рослини перед посівом, до проростання і після проростання культури. Об'єктом винаходу є застосування гена ГФПД, як гена-маркера під час циклу "трансформація-регенерація" рослинного виду та селекції на вказаному вище гербіциді. Наведені нижче приклади ілюструють даний винахід, не обмежуючи його об'єм. ПРИКЛАД 1 Виділення гену ГФПД із P.fluorescens A32 Виходячи із послідовності амінокислот ГФПД Pseudomonas sp.P.J.874 (опубліковано Ruetschi U. et al. 1992. Eur. J. Biochem. 205:459-466) виділяють послідовність різноманітних олігонуклеотидів для ампліфікації шляхом ПЛР частини послідовності, що кодує ГФПД P.fluorescens A32 (виділеної Мак Келларом Р.К., 1982J.Appl Bacteriol. 53:305-316). Ампліфікуючий фрагмент гена цього ГФПД використовують для скринінга неповного банка генів P.fluorescens A32 та виділення таким чином гена, що кодує цей фермент. А) Одержання геномної ДНК із P.fluorescens A32. Бактерію культивують в 40 мл мінімального середовища М63 (КН2 РО4 13,6 г/л (NH 4)2 SO4 2 г/л, MgS04 0,2 г/л, FeSO4 0,005 г/л, рН=7 плюс L-тирозин 10 мМ як єдиного джерела вуглецю) при 28° С протягом 48 годин. Після промивання, клітини оброблюють 1 мл лізуючого буфера (tris HCL 100 мМ, рН=8,3; NaCI 1,4 Μ та ЕДТА 10 мМ) та інкубують 10 хв. при 65°С. Після обробки сумішшю фенол/хлороформ (24/1) і обробки хлороформом, нуклеїнові кислоти осаджують шляхом додавання певного об'єму ізопропанолу, потім обробляють 300 мкл стерильної води, потім 10 мкг/мл РНКазою. ДНК знову обробляють сумішшю фенолу з хлороформом, хлороформом і знову осаджують додаванням 1/10 об'єму ЗМ ацетату натрію, рН=5 і 2 об'ємів етанолу. Потім ДНК обробляють стерильною водою і аналізують. Б) Вибір олігонуклеотидів та синтезів Виходячи з послідовності амінокислот ГФПД, що виділяються із Pseudomonas sp.P.J. 874, вибирають п'ять олігонуклеотидів, із яких два орієнтовані в напрямку від NH2 - кінця білка до СООН - кінця, а три орієнтовані в зворотному напрямі (див. фіг. 1). Вибір олігонуклеотидів грунтується на двох наступних правилах: - 3'-кінець олігонуклеотида є незмінним, принаймні, дві його основи; -найбільш слабке переродження. Вибрані олігонуклотиди мають такі послідовності: Їх синтезують на синтезаторі "Cyclone plus DNA Synthesizer" марки "MILUPORE". Фрагменти ампліфікації, що утворюються з цими п'ятьма олігонуклиотидами шляхом ПЛР, які теоретично повинні бути отримані за прикладом послідовності N1, мають наступні розміри: з праймерами Р1 та Р2 близько 690 п.о., з праймерами Р1 та Р4 близько 720 п.о. з праймерами Р1 та Р5 близько 1000 п.о. з праймерами Р2 та РЗ близько 390 п.о. з праймерами Р2 та Р4 близько 420 п.о. з праймерами Р2 та Р5 близько 700 п.о. В) Ампліфікація кодуючої частини ГФПД із P.fluorescens A32 Ампліфікації здійснюють на установці ПЛР PERKIN ELMER 9600, шляхом Taq полімерази PERKIN ELMER з її буфером в стандартних умовах, тобто для 50 мкл реакційної суміші беруть 200 мкМ dNTR, 20 мкМ праймерів, 2,5 одиниць Taq полімерази та 2,5 мкг ДНК із P.fluorescens A32. Використовують програму ампліфікації: 5 хв. при 95°С, потім 35 циклів (45 сек. при 95°С, 45 сек. при 49°С, 1 хв. при 72° С), далі, 5 хв. при 72°С. В цих умовах всі одержані фрагменти ампліфікації мають розміри, порівняні з наведеними вище теоретичними розмірами, що є чіткою вказівкою на специфічність ампліфікацій. Фрагменти ампліфікації, одержані за участю праймерів Р1/Р4, Р1/Р6 та Р2/Р4 .лігують з pBSII SK(-) після розщеплення цієї плазміди за допомогою Есо RV та обробки термінальною трансферазою в присутності ddTTP, як описано HOLTON ТА та GRAHAM V.W. 1991.N.A.R. vol.19, Ν 5 р1156. Клон кожного із трьох типів частково секвенують, це дозволяє підтвердити, що в трьох випадках дійсно ампліфікували частину, кодуючу ГФПД P.fiuorescens A32. Фрагмент Р1/Р4 використовують як зонд для скринінга неповного оанку генів P.fluorescens А32 й виділяють повний ген ГФПД. За допомогою саузерн-блоттінга визначають, що фрагмент із 7 т.п.о. після перетравлення ДНК P.fluorescens A32 рестрикційним ферментом ВатНІ гібридизується із зондом ГФПД Р1/Р4. Розщеплюють 400 мкг ДНК P.fluorescens A32 рестрикційним ферментом ВатНІ і очищують на гелі агарози фрагменти ДНК, ве личиною близько 7 т.п.о. Ці фрагменти лігують з pBSII SK(-), яка розщеплюється шляхом ВатНІ і де-фосфорилюється шляхом обробки лужною фосфатазою. Після трансформації в Е.соїі DHlOb, неповний банк генів піддають скринінгу зондом ГФПД Р1/Р4. Позитивний клон виділяють і називають pRPA. Його спрощена карта приведена на фіг. 2. На цій карті вказано положення кодуючої частини гена ГФПД. Вона складається із 1077 нуклеотидів, які кодують 358 амінокислот (див. послідовність N1). ГФПД P.fluorescens A32 мають високу гомологію по амінокислотному складу зі штамом Pseudomonas sp. Ρ.ϋ.874, яка складає 92% між цими двома білками (див. фіг. 3). ПРИКЛАД 2 Побудова двох химерних генів Для надання рослинам стійкості до гербіцидів, інгібуючим ГФПД, конструюють два химерних гена: Перший включає кодуючу частину гена ГФПД P.fluorescens A32. Під контролем подвійного гістонного промотора (Європейська заявка на патент N 0 507 698), за яким слідує енхансер, що посилює трансляцію вірусу тютюнової мозаїки (TEV) (pRTL-GUS (Carrington and Freed, 1990; J.Virol. 64: 1590-1597)) з термі-натором гена нопалінсинтази. ГФПД при цьому буде локалізуватися в цитоплазмі. Другий подібний до першого, з тією різницею, що між активатором трансляції TEV та кодуючою частиною ГФПД вмонтовують пептид для оптимізації переноса (ОТР) (Європейська заявка N 0 508 909). При цьому ГФПД буде локалізуватися в хлоропласті. А) Побудова вектора pRPA-RD-153: - pRPA-RD-11: похідна pRBS-11 SK(-) (Stratagene catalog N 212206), що містить сайт поліаденілювання нопалинсинтази (NOS poly А) (Європейська заявка на патент N 0652 286) , клонують між сайтами Kpnl та Sail. Сайт Kpnl трансформують в сайт Notl шляхом обробки за допомогою Т4 ДНК полімерази І в присутності 150 мкМ дезоксинуклеотидтрифосфатів, потім лігують з лінкером Notl (Stratagene catalog Ν 1029). Таким чином, одержують касету клонування NOS poly А. - pRPA-RD-127: похідна pRPA-BL-466 (Європейська заявка на патент N 0 337 899) клонують в pRPA-RD-11 з одержанням касети експресії гена оху та вмістом промотору малої субодиниці рибулози-бікарбоксилази: "промотор (SSU) - оху ген - NOS poly А". Для створення цієї плазміди, pPRA-BL-488 обробляють Xbal та Hindlll для виділення фрагмента 1,9 т.п.о., що містить промотор SSU та ген оху, який лігуе з плазмідою pRPA-RD-11, обробленої відповідними ферментами. - pRPA-RD-132: її одержують із pRPA-BL-488 (Європейська заявка на патент N 0 507 698) клонуванням в pRPA-RD-127 із створенням касети експресії гена оху з подвійним гістонним промотором: "подвійний гестонний промотор - оху ген NOS poly А" Для одержання цієї плазміди, pRPA-BL-466 розщеплюють Hindlll, обробляють фрагментом Кленова, потім знову розрізають за допомогою Ncol. Очищений фрагмент довжиною 1,35 т.п.о., що вміщує подвійний гістонний промотор НЗА748, лігують з плазмідою pRPA-RD-127, яка була оброблена Xbal, фрагментом Кленовай піддана вдруге розщепленню за допомогою Ncol. - pRPA-RD-153: одержують із pRPA-RD-132, яка містить активатор трансляції вірусу гравіровки тютюну (TEV). pRTL-GUS (Carrington and Freed, 1990; J.Virol. 64: 1590-1597) обробляють Ncol та EcoRI, фрагмент 150 п.о. лігують із pRPA-RD-132, розщепленої тими ж самими ферментами. Таким чином одержують касету експресії, яка містить промотор: "подвійний гістонний промотор - ТЕ/ - оху ген NOS poly А". Б) Побудова вектора pRPA-RD-185 pUC19/GECA: виділяють із pUC-19 (Gibco catalog N 15364011), яка містить велику кількість сайтів клонування. pUC-19 обробляють EcoRI й лігують із олігонуклеотидним лінкером 1: Відібраний клон містить сайт EcoRI, за яким йде полілінкер, що містить такіч сайти: EcoRI, Apal, Avrll, Pmel, Sfil, Sad, Kpnl, Smal, BamHI, Xbal, Sail, Pstl, Sphl та Hidlll. pRPA-RD-185: одержують із pUC19/GECA, що містить модифікований полілінкер. pRPA-RD-185: розрізають з Hindlll та лігують із олігонуклеотидним лінкером 2. Відібраний клон містить сайт Hindlll, розміщений в центрі полілінкера, що містить такі сайти: EcoRI, Apal, Avrll, Pmel, Stii, Sad, Kpnl, Smai, BamHI, Xbal, Sail, Pstl, Sphl, Hindlll, Pad, AscI Xhol та ExoNI. В) Побудова вектора pRP Τ: -pRR О: похідна pRPA-RD-153, що містить касету експресії ГФПД, подвійний гістонний промотор - TEV ген ГФПД - термінатор Nos. Для одержання pRP О, pRPA-RD-153 розрізають Hindlll, обробляють фрагментом Кленова, потім знову обробляють Ncol для вирізання гена оху та його заміни геном ГФПД, що виділений із плазміди PRP шляхом переварювання BstEII, обробки фрагментом Кленова та Ned І. - pRPA R: для його одержання, плазміду pRP О обробляють Pvull та Sacl, химерний ген очищають, потім лігують з - pRPA RD-185, яка була розрізана за допомогою Pvull та Sacl. - pRP Τ: його одержують лігуванням химерного гена, виділеного із pRP R після його обробки Sacl та Hindlll в плазміді - pRPA-BL 150 альфа 2, розщепленій тими ж ферментами (Європейська заявка на патент ЕР N 0 508 909). Химерний ген вектора pRP T має, таким чином, таку структуру: Подвійний Кодуюча Термінатор гістнонний TEV область ГФПД nos промотор Γ) Побудова вектора pRP V - pRP P: одержують із -pRPA-RD-7 (Європейська заявка на патент N 0652 286), що містить пептид оптимізованого переносу, за яким йде ген ГФПД. Його одержують лігуванням кодуючої частини ГФПД, вилученої із pRP А розрізанням за допомогою BstEll та Ncol, обробкою фрагментом Кленова та плазміди pRPA-RD-7, розщепленої за допомогою Sphl та АссІ й обробленої ДНК-азою полімера-зи Т4. - pRP Q: одержують із -pRP A-RD-153, що містить касету експресії ГФПД, подвійний гістонний промотор TEV - ОТР - ген ГФПД - термінатор Nos. Для його побудови плазміду -pRPA-RD-153 обробляють Sail, фрагментом Кленова, потім знову розрізають Ncol для видалення гена оху та його заміни геном ГФПД, виділеним із плазміди -pRP Ρ шляхом обробки BstEll, фрагментом Кленова та повторною обробкою Ncol. - pRP S: одержують тим, що плазміду - pRP Q розщеплюють за допомогою Pvull та Sacl для вилучення химерного гена, який лігує з pRPA-RD-185, який сам розщеплений за допомогою Pvull та Sacl. - pRP V: його одержують шляхом лігування химерного гена, вилученого із pRP S після розщеплення за допомогою Sacl та Hindlll, із плазмідою pRPA^BL 150 альфа 2 (Європейська заявка на патент N 0 508 90). Химерний ген вектора pRP Q має, таким чином, таку структуру: Кодуюча Подвійний Термінатор гістноннийTEVОТР: область промотор nos ГФПД ПРИКЛАД 3 Трансформація промислового тютюну PBD6 Для визначення ефективності цих двох химерних генів їх переносять до промислового тютюну PBD6 у відповідності з методами трансформації й регенерації, вже описаними в європейській заявці на патент N 0508 909. 1) Трансформаціямація: Вектор вводять в неонкогенний штам Agrobacterium EHA 101 (Hood et al, 1987), що несе косміду pTVK291 (Komari та ін., 1986). Спосіб трансформації заснований на методі Horsh R. та ін. (1985), Science, 227, 12291231. 2) Регенерація: Регенерація тютюну PBD6 (походження; SEITA,. Франція) із листкових експлантатів здійснюється на основному середовищі Murashige та Skoog (MS), що включає ЗО мг/л сахарози, а також 200 мкг/мл канаміцину. Листкові експлантати відбирають у тепличних рослин або рослин in vitro й трансформують за методом листкових дисків (Science 1985, т. 227, с. 1229-1231) в три послідовні стадії: перша включає індукцію проростання на основному середовищі MS, в яку добавлено ЗО г/л сахарози, яка містить 0,05 мг/л нафтилоцтової кислоти (НУК) та 2 мг/л бензиламінопурина (БАП), протягом 15 днів. Паростки, що з'явилися в процесі цієї стадії, потім культивують на середовищі MS, в яке добавлено ЗО г/л сахарози і яке не містить гормону, протягом 10 днів. Потім відбирають паростки, що розвинулися, і культивують їх на середовищі укорінення MS, яке складається наполовину із солей, вітамінів та сахарів і не містить гормону. Через приблизно 15 днів паростки, що вкоренилися, пересаджують у землю. ПРИКЛАД 4 Вимірювання толерантності тютюну до 4-[4-СF3-2(метилсульфоніл)бензоіл]-5-циклопропілізоксазолу: обробка після проростання Одержані in vitro трансформовані проростки тютюну акліматизують в теплиці (відносна вологість: 60%, температура: 20°С вночі та 23°С вдень) протягом п'яти тижнів, потім обробляють за допомогою 4-[4-СF3-2{метилсульфонілу)бензоілу]-5-циклопропілізоксазолом. У випадку контрольних, нетрансформованих, тютюнових рослин, і оброблених 4-[4-СF3-2(метилсульфоніл) бензоіл]-5-циклопропілізоксазола в кількості від 50 до 400 г/га, приблизно за 72 години розвиваються хлорози, які посилюються з еволюційним розвитком до дуже різко виражених некрозів за тиждень (що захоплює близько 80% кінцевих листків). Після трансформації ті ж самі тютюнові рослини, які надекспресують ГФПД P. fluorescens, дуже добре захищені проти обробки 4-[4-CF3-2-(метилсульфоніл) бензоіл]-5-циклопропілілзоксазолом в кількості 400 г/га. Якщо надекспресований фермент знаходиться в цитоплазмі, тобто, якщо трансформацію здійснюють за допомогою гена, який переноситься вектором ч. pRP, тоді рослина має дуже невеликі хлорози, локалізовані на проміжних листках. Якщо надекспресований фермент знаходиться в хлоропласті, тобто якщо трансформацію здійснюють за допомогою гена, який переноситься вектором pRP V, то в цьому випадку рослина чудово захищена і не має ніяких симптомів. ПРИКЛАД 5 Визначення толерантності тютюну до 4-[4-СF3-2-(метил-сульфоніл) бензоіл]-5-циклопропілизоксазолу: обробка перед проростанням a) тест in vitro: Використовують насіння тютюну, зібраного з рослин, що походять із циклу "трансформація-регенерація", стійких до обробки листків ізоксафлутолом в кількості 400 г/га, описаних в прикладах 1-3. Це насіння висівають в ящики, які містять фітагар в кількості 10 г/л й ізокса-флутол у різній концентрації від 0 до 1 мг/л. Пророщування проводять потім при температурі 25°С з фотоперіодом 12 годин - світло/12 годин - темнота. У відповідності до цього протоколу, пророщують насіння дикого тютюну, а також насіння обох типів трансгенного тютюну, тобто тютюну CY з локалізацією ГФПД в цитоплазмі і тютюну із локалізацією ГФПД в хлоропласті. Визначення стійкості проводять візуально між 2 та 3 тижнями після висівання. Результати наводяться в наступній таблиці. Концентрація ізоксафлутолу Дикий тютюн Тютюн CY Тютюн СО 0 мг/л 0,05 мг/л 0,1 мг/л 0,5 мг/л 1 мг/л 100% 100% 100% насіння насіння насіння проростає проростає проростає без без без симптомів симптомів* симптомів 20% насіння 75% насіння 75% насіння проростає проростає** проростає** і має без без симптоми* симптомів симптомів* 75% насіння 75% насіння сходи проростає** проростає** відсутні без без симптомів* симптомів* 75% насіння 75% насіння сходи проростає** проростає** відсутні без без симптомів* симптомів* 75% насіння 75% насіння проростає** проростає** сходи з з відсутні невеликими невеликими симптомами* симптомами* *симптоми, які мають паростки в ході проростання, являють собою деформацію більш-менш великих сім'ядолей і особливо знебарвлення, звичайно фотосинтетичних і, отже, зелених тканин. ** 75% насіння проростає, оскільки висівають насіння, що проходить від самозапилення монолокусних рослин, одержаних із циклу "трансформація-регенерація", отже, таких, що не несуть ген толерантності на хромосомі. Діючи таким же чином, при використанні продукту №51 із патенту США 4 780 127 одержують такі ж результати при концентрації 0 мг/л та 0,1 мг/л у випадку дикого тютюну та тютюну CO. Діють так само, як у прикладі 4, лише здійснюють обробку перед сходами за 24 години до посіву. Дикий посів здійснюють звичайним способом. В цих умовах спостерігають, що у випадку необроблених контрольних посівів немає проростання при будь-якій дозі гербіциду, що принаймні дорівнює 10 г/га. Навпаки, тютюнові рослини CY не мають ніяких симптомів, як визначено в параграфі а), до 100 г/га включно. Також тютюнові рослини СО не мають ніяких симптомів, як визначено в параграфі а), до 200 г/га включно. Ці результати ясно свідчать, що ген ГФПД P. fluorescens надає тютюну толерантність проти попередніх обробок перед сходами ізоксафлуктолом. Ця толерантність вища, якщо протеїн локалізується в хлоропласті, а не в цитоплазмі. Приклад 6 З метою дослідження того, чи може ген ГФПД із P. fluorescens бути використаний як ген-маркер під час циклу "трансформація-регенерація" рослинного виду, тютюн трансформують за допомогою гена ГФПД і трансформовані рослини одержують після селекції при використанні ізоксафлутола. Матеріали, методи та результати Описаний нижче химерний ген - pRP V переносять в промисловий тютюн PBD6 у відповідності з уже описаним в європейській заявці на патент 0 508 909 методами трансформації та регенерації. Химерний ген вектора pRP V має таку структуру: Кодуюча Подвійний Термінатор гістоннийTEVOTR область промотор nos ГФПД 1) Трансформація; Вектор вводять в неонкогенний штам Agrobacterium ΕΝΑ 101 (Hood та ін., 1987), що несе косміду pTVK 291 (Komari та ін., 1986). Спосіб трансформації заснований на методиці Horsh та ін. (1985). 2) Регенерация: Регенерацію тютюну PBD6 (походження СЕНА, Франція) із листкових експлантатів здійснюють на основному середовищі Murasnige та Scoog (MS), що включає ЗО г/л сахарози, а також 350 мг/л цефотаксину і 1 мг/л ізоксафлутолу. Листкові експлантанти відбирають у тепличних рослин або рослин in vitro й трансформують способом листкових дисків (Science 1985, т. 227, с. 1229-1231) у три послідовних стадії: перша включає індукцію проростання на середовищі MS з добавкою 30г/л сахарози, яка містить 0,05 мг/л нафтилоцтової кислоти (НОК), 2 мг/л бензиламінопурину (БАП) та 1 мг/л ізоксафлутолу протягом 15 днів. Зелені паростки, що з'явилися по ходу цієї стадії, потім культивують на середовищі MS з добавкою 30 г/л сахарози та 1 мг/л ізоксафлутола, але яке не містить гормону, протягом 10 днів. Потім відбирають паростки, що розвилися, й культивують їх на середовищі укорінення MS, яке складається наполовину із солей, вітамінів та сахарів й 1 мг/л ізоксафлутолу, яке не містить гормону. Через приблизно 15 днів паростки, що вкоренилися, пересаджують у землю. Всі одержані відповідно до цього протоколу паростки аналізують шляхом ПЛР при використанні специфічних праймерів ГФПД P. fluorescens. Цей аналіз шляхом ПЛР дозволяє підтвердити, що в усіх одержаних таким чином паростках добре інтегрований ген ГФПД. І нарешті, цей іспит підтверджує, що ген ГФПД можна використати як ген-маркер і що разом з цим геном ізоксафлутол може служити гарним агентом селекції. Приклади 7 та 8 Виділення гена ГФПД Arabidopsis thaliana й гена ГФПД моркви (Daucus carotta) Матричні РНК, що екстраговані із молодих паростків Arabidopsis thaliana та матричні РНК, що екстраговані Із клітин культурної моркви, використовують для побудови двох банків кДНК у векторі Uni Zap TM XR, .що випускається в продаж фірмою Стратаген, у відповідності з протоколом, що пропонує ця фірма. Обидва ці банки піддають скринінгу за допомогою зонда, який відповідає кНДК Arabidopsis thaliana неповної довжини, одержаної із Arabidopsis Biological Ressource Centre (Огайо, США) і яка має позначення: EST клон Ν 91Β13Τ7. Цей клон складається приблизно із 500 пар основ, із яких лише 228 секвеновані в лабораторії дослідження рослин MSO-DOE у рамках секвенування у випадку компліментарних ДНК Arabidopsis thaliana. У відповідності до винаходу, секвено-вано повністю 500 пар основ до застосування цього клону для скринінга запропонованих у відповідності до винаходу банків кДНК Arabidopsis thaliana та моркви за допомогою звичайного способу гібридизації міст лізису (посилання?). в) Одержана кД НК Arabidopsis thaliana (послідовність N 2), що відповідає 1338 парам основ. Ця кДНК включає ініціюючий початок трансляції кодон в положенні 25 та кодон кінця трансляції в положенні 1336. Ця кДНК є таким чином повною й кодує протеїн із 445 амінокислот. г) Одержана кДНК моркви (Daucus carotta) (послідовність N 3), що відповідає 1329 парам основ. Ця кДНК включає ініціюючий початок трансляції кодон в положенні 1 та кодон кінця трансляції в положенні 1329. Ця кДНК є таким чином повною й кодує протеїн із 442 амінокислот. Проілюстровані такі послідовності: Послідовність N 1: послідовність гена ГФПД Pseudomonas fluorescens A 32; Послідовність N 2: Послідовність кДНК ГФПД із Arabidopsis thaliana; Послідовність N 3: Послідовність кДНК із Daucas carotta. Нижче наводяться фігури з метою ілюстрації винаходу. На фіг. 1 представлена білкова послідовність ГФПД із Pseudomonas sp. штаму P. J. 874 та теоретична нуклеотидна послідовність відповідної кодуючої частини; п'ять олігонуклеотидів, вибраних для здійснення ампліфікації частини цієї кодуючої області, зображені п'ятьма стрілками. На фіг. 2 представлена картографія плазміди з геномним фрагментом ДНК довжиною 7 т. н., яка містить ген ГФПД із P. fluorescens A32. На фіг. З приведено порівняння амінокислотних послідовностей ГФПД із Р. fluorescens A32 та ГФПД із Pseudomonas sp штаму P. J. 874 (вказані лише амінокислоти з відмінностями між обома послідовностями), а також консенсусна послідовність. Перелік послідовностей (1) Загальні відомості (I) Заявник: Sailland Alain, Rolland Anne, Matringe, Michel, Pallett Kenneth E. (II) Назва винаходу: Послідовність ДНК гена гідроксифенілпіруватдіоксигенази та одержання рослин, які містять цей ген гідроксифенілпіруватдіоксигенази, стійких до деяких гербіцидів. (III) Кількість послідовностей: З (IV) Адреса для кореспонденції, (а) адресат: Francois Chretien (б) вулиця: 14-20 rue Pierre BAIZET (в) місто: Lyon Cedex 09 (д) країна: Франція (France) (є) поштовий індекс: 69263 (V) Редактор на комп'ютері: (а) носій даних: дискета (б) комп'ютер: персональний комп'ютер, сумісний з машинами фірми ІБМ (в) операційна система: ПК-ДОС/МС-ДОС (г) програмне забезпечення: патентна редакція # 1,0; версія # 1,25 (VI) Відомості про подачу заявки: (а) номер заявки: FR РН 95033 (б) дата подання: 2 червня 1995 р. (в) класифікація: (VIII) Патентний повірений: (а) Ім'я: Francois Chretien (IX) Інформація про зв'язки: (а) Телефон: 72-29-26-42 (б) Телефакс: 72-29-28-43 (2) Відомості про послідовність N 1: (1) Характеристики послідовності: (а) довжина: 1077 пар основ (б) тип: нуклеїнова кислота (в) число ниток: двониткова (г) топологія: лінійна (II) Тип молекули: ДНК (геномна) (III) Гіпотетична: ні (IV) Антисмислова: ні (VI) Першоджерело: (а) організм: Pseudomonas fluorescens (XI) Опис послідовності N 1: (2) Відомості про послідовність N 2: (1) Характеристики послідовності: (а) довжина: 1338 пар основ (б) тип: нуклеїнова кислота (в) число ниток: двониткова (г) топологія: лінійна (II) Тип молекули: кДНК (III) Гіпотетична: ні (IV) Антисмислова: ні (VI) Першоджерело: (а) організм: Arabodopsis thaliana (б) штам: Columbia (г) стадія розвитку: молода зелена рослина (VII) Безпосереднє джерело: (а) бібліотека: Unizap XP STRATAGENE (XI) Опис послідовності N 2: (2) Відомості про послідовність N 3: (1) Характеристики послідовності: (а) довжина: 1329 пар основ (б) тип: нуклеїнова кислота (в) число ниток: двониткова (г) топологія: лінійна (II) Тип молекули: кДНК (III) Гіпотетична: ні (IV) Антисмислова: ні (VI) Першоджерело: (а) організм: Daucus carota (г) стадія розвитку: суспензія клітин (VII) Безпосереднє джерело: (а) бібліотека: Uni zap XP STRATAGENE (XI) Опис послідовності Ν 3: