Ізольований фрагмент днк промотору гена синтази ацетооксикислот (ahas) для експресії генів в рослинах, вектор для трансформації рослин, спосіб високорівневого експресування гетерологічного гена в рослині та в

1. Изолированный фрагмент ДНК промотора гена синтазы ацетооксикислот (AHAS) для экспрессии генов в растениях, выбранный из группы, состоящей из SEQ Ю №1 '- I' ! SEQ ID № 2 О SEQ Ю № 3 2. Изолированный фрагмент ДНК по п. 1, отличающийся тем, что растение является однодольным. ю 00 48951 3 Изолированный фрагмент ДНК по п 2, отличающийся тем, что растение представляет собой кукурузу 4 Вектор для трансформации растений, включающий фрагмент ДНК по п 1 5 Способ высокоуровневого экспрессирования гетерологического гена в растении и в различных тканях этого растения, включающий трансформирование упомянутого растения вектором, включающим фрагмент ДНК по п 1, и последующее экспрессирование гетерологического гена в указанном растении под контролем упомянутого фрагмента ДНК 6 Конструкция нуклеиновой кислоты, включающая фрагмент ДНК по п 1, соединенный с гетерологическим геном 7 Конструкция нуклеиновой кислоты по п 6, отличающаяся тем, что гетерологический ген является мутантным геном, способным придавать устойчивость к гербицидам селектируемому трансгенному материалу 8 Конструкция нуклеиновой кислоты по п 6, отличающаяся тем, что гетерологический ген является геном синтазы ацетооксикислот (AHAS) 9 Способ селекции трансгенного растительного материала, устойчивого к гербицидам, включающий стадии (а) рекомбинантное трансформирование растительного материала путем вставки конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей фрагмент ДНК промотора гена синтазы ацетооксикислот (AHAS) по п 1, присоединенный к мутантному гену, придающему устойчивость к гербицидам, (б) помещение трансформированного растительного материала на питательную среду, включающую соединение, являющееся гербицидом, (в) идентификация растительного материала, способного расти в присутствии упомянутого соединения 10 Способ по п 9, отличающийся тем, что мутантный ген является геном синтазы ацетооксикислот (AHAS) 11 Способ по п 9, отличающийся тем, что соединение относится к имидазолинонам Настоящее изобретение относится к изолированным некодирующим нуклеотидным последовательностям, используемым в качестве промоторов для экспрессии гетерологичных генов у растений Настоящее изобретение также относится к векторам и клеткам растений, включающим эти изолированные нуклеотидные последовательности Уровень техники Царство растений подразделяется на два типа, моховидные Bryophyta и сосудистые растения Tracheophyta Тип Tracheophyta включает свыше 266 000 видов, сгруппированных в четыре подтипа Подтип Pterepsida включает класс покрытосеменные Angiospermae Этот класс делится на два подкласса, двудольные и однодольные Поскольку однодольные включают многие важные пищевые и фуражные культуры, генетики растений остро заинтересованы в том, чтобы иметь возможность создавать трансгенные однодольные Известно около 50 000 видов однодольных Они включают лилии, пальмы, орхидей, ирисы, тюльпаны, осоки и злаки Злаки включают кукурузу, пшеницу, рис и все прочие злаковые зерновые К сожалению, однодольные чрезвычайно тяжело поддаются генноинженерным манипуляциям, так что большинство работ с растениями проводится с двудольными Двудольные больше по числу видов из этих двух групп, приблизительно известно 200 000 их видов Лютик, львиный зев, гвоздика, магнолия, мак, капуста, роза, горох, пуансеттия, хлопчатник, кактус, морковь, черника, мята, томат, подсолнечник, вяз, дуб и клен представляют 19 из 250 семейств двудольных Генетическая информация, заключенная в молекуле ДНК, обычно служит матрицей для синтеза большого количества более коротких молекул РНК, большинство которых в свою очередь служат матрицами для синтеза специфических цепей полипептидов Особые сегменты нуклеотидов, называемые часто промоторами, распознаются молекулами РНК-полимеразы как сигнал к синтезу РНК По окончании транскрипции функциональной цепи РНК второй класс сигналов приводит к прекращению синтеза РНК и к отделению молекул РНК-полимеразы от соответствующих им матриц ДНК В настоящее время имеется ряд общих промоторов, которые используются для управления экспрессией гетерологичных генов у однодольных растений David McEIRoy и др (1990) отмечали, что испытания временной экспрессии в конструкции, где промотор гена актина 1 риса (Actl) был присоединен к бактериальному гену р-глюкуронидазы (GUS) в трансформированных протопластах риса, показали, что промотор актина управляет высокими уровнями генной экспрессии Эта экспрессия 6кратно превосходила таковую с геном-промотором алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы (Adhl) и зависела от присутствия интактного интрона Actl David McEIRoy и др (1991) отмечали, что оптимизированные векторы для трансформации однодольных были сконструированы при использовании либо промотора 35S вируса мозаичности цветной капусты /Cauliflower Mosaic Virus/ (CaMV), либо промотора Actl Испытания временной экспрессии были выполнены на трансформированных протопластах как риса, так и кукурузы Добавление интрона Actl и оптимизированного сайта инициализации трансляции GUS к любой промоторной последовательности значительно увеличивало генную экспрессию Так же, как неопубликованный результат, отмечалось, что промотор актина обнаруживает способность к управлению 48951 экспрессией GUS в кратковременных испытаниях на протопластах пшеницы, овса, ячменя и сорго Wanggen Zhang и др (1991) отмечали, что исследования по гибридизации in situ растений трансгенного риса, выполненные с Actl-GUS слиянием, показали что, промотор Actl имеет базовый тип экспрессии как в вегетативной, так и репродуктивной ткани Jun Cao и др (1992) отмечали, что растения трансгенного риса были отобраны на устойчивость к биалофосу после трансформации bar-гена, экспрессируемого под контролем либо CaMV 35S промотора, либо промотора Actl риса Alan H Chnstensen и др (1992) отмечали, что протопласты кукурузы, трансформированные слиянием гена Ubi-1-CAT кукурузы, в испытаниях временной экспрессии обнаружили приблизительно 10-кратно повышенные уровни CAT активности, по сравнению с клетками кукурузы, трансформированными путем слияния гена CaMV-35S-GUS Нозерн-блот анализ уровней Ubi-1 и Ubi-1 транскриптов, проводимый вслед за тепловым шоком сеянцев кукурузы, продемонстрировал, что оба гена достаточно хорошо экспрессируются при 25°С, но индуцируются вслед за тепловым шоком Seiichi Toki и др (1992) отмечали, что стабильно трансформированные трансгенные растения риса были получены после электро по рати чески опосредованной трансформации bar-гена, экспрессируемого под контролем промотора Ubi-1 кукурузы и селекции на биалофос Этот результат демонстрирует, что промотор Ubi-1 может быть использован для достаточно эффективного управления высокими уровнями генной экспрессии у риса, позволяя проводить селекцию и регенерацию фертильных трансгенных растений риса J Troy и др (1993) отмечали, что стабильно трансформированные растения пшеницы были получены после бомбардировки каллусов, выращенных из незрелых эмбрионов, как с bar-геном, так и с GUS, каждый при этом экспрессировался под контролем промотора Ubi-1 кукурузы, за этим следовала селекция на биалофос Этот результат демонстрирует, что промотор Ubi-1 может быть использован для достаточно эффективного управления высокими уровнями генной экспрессии у пшеницы, позволяя проводить селекцию и регенерацию фертильных трансгенных растений Yuechun Wan и Peggy G Lemaux (1994) отмечали, что стабильно трансформированные фертильные растения ячменя были получены после микропроекционной бомбардировки двумя генами bar-геном и GUS, тканей эмбрионов ячменя под контролем промотора Ubi-1 кукурузы, за которой следовала селекция на биалофос Этот результат демонстрирует, что промотор Ubi-1 может быть использован для достаточно эффективного управления высокими уровнями генной экспрессии у ячменя, позволяя проводить селекцию и регенерацию фертильних трансгенных растений Эксперимент, включающий бомбардировку небольшого количества растений либо с Ubiполосой, либо с CaMV 353-полосой показали, что нет существенного различия в полученном количестве трансформантов слияние промотор Adh1 кукурузы - GUS было введено в протопласты риса с целью получения трансгенных растений риса Активность GUS У трансгенных растений определяли для выяснения способа экспрессии, GUS Было обнаружено, что промотор Adhl кукурузы способен промотировать базовую экспрессию во всех частях исследованных растений Как было предварительно продемонстрировано для экспрессии Adh1 у кукурузы, управляемая Adh1 экспрессия GUS индуцировалась в корнях в анаэробных условиях D I Last и др (1991) отмечали, что промотор Adh1 кукурузы был модифицирован добавлением мультиплетных копий анаэробного элемента гена ADH1 кукурузы и элементов ocs гена октопин синтазы Agrobastenum tumefacience (pEmu) В тестах по временной экспрессии в протопластах различных видов однодольных, трансформированных pEmu-GUS, он был лучшим составляющим, дающим 1 0 - 1 5 кратное увеличение уровней экспрессии по сравнению с промотором CaMV 35S у пшеницы, кукурузы, риса, пшеницы-однозернянки Tnticum monococcum и плевела многоцветкового Lohum multiflorum Junkon Kyozuka и др (1991) отмечали, что Для управления экспрессией гетерологичных Robert Bower и Robert G Birch (1992) отмечали, что стабильные трансформанты были получены при трансформации эмбриогенного каллуса сахарного тростника геном неомицин фосфотрансферазы под контролем Emu промотора D A Chamberlain и др (1994) отмечали, что промотор Emu-использовался для управления экспрессией четырех различных выбираемых маркерных генов (неомицин фосфотрансферазы, гидромицин фосфотрансферазы, фофинотриицин N-ацетилтрансферазы и мутантной ацетолактат синтазы, дающей сопротивляемость гербицидам), которые были трансформированы как в пшеницу, так и в рис Каллус пшеницы и трансформированные растения риса были получены после селекции трансформантов, демонстрируя, что этот промотор может быть использован для управления экспрессией выбираемых маркерных генов при получении трансформированных злаков Обзор промоторных элементов, используемых для контроля экспрессии чужеродного гена у трансгенных злаков, был недавно опубликован, и здесь мы на него ссылаемся (McElroy and Brettel, 1994) Ряд промоторов в настоящее время используется для трансформации двудольных растений Эти промоторы происходят из различных источников Одна группа широко используемых промоторов была выделена из Agrobactenum tumefaciens, где их функция состоит в управлении экспрессией генов опин синтазы, переносящих сегмент Т-ДНК, который интегрируется в геном растения во время инфекции Эти промоторы включают промотор октопин синтазы (ocs)(L Comai et al , 1985, CWaldron et al , 1985), промотор маннопин синтазы (mas)(LComai et al , 1985, К Е McBnde and К R Summerfelt, 1990) и промотор нопалин синтазы (nos) (M W Bevan et al , 1983, Herrera-Estrella et al , 1983, RTFraley et al , 1983, M De Block et al , 1984, R Ham et al , 1985) Эти промоторы активны в разнообразных растительных тканях 48951 генов двудольных используется также несколько вирусных промоторов (J С Kndl and R M Goodman, 1986) Промотор 35S вируса мозаичности цветной капусты - один из промоторов, которые чаще других используются для трансформации двудольных, потому что он дает высокие уровни генной экспрессии почти во всех тканях (J Odell et al , 1985, D W O w et al , 1985, D W O w et al , 1986, D M Shah et al , 1986) Используются также и модификации этого промотора, включая конфигурацию с двумя тандемными 35S промоторами (R Кау et al , 1987) и mas-35S промотор (L Cornai et al , 1990), который состоит из промотора маннопин синтазы в тандеме с 35S промотором Оба эти промотора управляют даже более высокими уровнями генной экспрессии по сравнению с единичной копией 35S промотора Другие вирусные промоторы, которые использовались, включают промотор 19S вируса мозаичности цветной капусты (J Paszkowski et al , 1984, Е Balazs et al , 1985) и 34S промотор вируса мозаичности норичника Scrophulana (M Sanger et al , 1990) Изучение экспрессии AHAS (синтаза ацетооксикислот) у ряда растений показывает, что AHAS экспрессируется во всех растительных тканях Gail Schmitt и BiJay К Singh (1990) отмечали, что энзиматические тесты, выполненные на различных тканях лимской фасоли Phaseolus hmensis, продемонстрировали, что активность AHAS проявлялась во всех тестируемых тканях, включая листья, стебли, корни, цветки, стручки и меристемы Активность AHAS обнаруживалась фактически постоянной в стеблях, но уменьшалась в листьях, корнях и меристемах с увеличением возраста тканей Sharon J Kheeler и др (1993) отмечали, что табак содержит два гена, кодирующие синтазу ацето-оксикислот, SurA и SurB Повидимому, оба гена экспрессируются во всех типах тканей с приблизительно 4-кратным варьированием уровня экспрессии в различных тканях Развивающиеся органы имеют наивысшие уровни экспрессии Исследования гибридизации in situ продемонстрировали, что наивысшие уровни экспрессии наблюдались в метаболически активных или интенсивно делящихся клетках Уровни экспрессии SurB были выше, чем у SurA для всех исследованных тканей Therese Ouellet и др (1992) отмечали, что виды Brassica содержат мультигенные семейства, кодирующую синтазу ацето-оксикислот В Brassica napus были идентифицированы четыре из пяти генов AHAS Тесты с РНКазной защитой с использованием геноспецифических зондов проводились для определения типов экспрессии различных членов семейства генов у различных видов Brassica Обнаружено, что два из этих генов, AHAS1 и AHAS3 хорошо экспрессируются во всех исследованных тканях Транскрипты AHAS2 обнаруживались только в репродуктивных органах и экстраэмбриональной ткани семян Транскрипты, кодируемые четвертым геном, AHAS4, не были обнаружены, и поэтому предположили, что он представляет собой псевдоген Dale LShaner и N Moorthy Malhpudi (1991) отмечали, что сравнение активности AHAS в молодых листьях и клетках кукурузы BMS, выращивае 8 мых в суспензионной культуре, показало, что активность клеток BMS на грамм сырого веса была приблизительно в 5 - 8 раз выше по сравнению с образцами листьев Поскольку клетки BMS являются активно делящимися, этот результат согласуется с результатами предыдущих исследований табака и лимской фасоли Phaseolus hmensis, которые продемонстрировали, что более молодые активно делящиеся ткани обладают большей активностью AHAS по сравнению со старыми Сущность изобретения Промоторы AHAS из кукурузы используются для экспрессии интродуцированных генов на высоком уровне и в различных тканях растений Промоторы из генов als1 и als2 клонируются и секвенируются (фиг1, фиг 2, фигЗ), и промоторные регионы из этих генов затем интродуцируются в плазмиду 5' к гену-репортеру р-глюкуронидазы (GUS) Оба проматорных фрагмента происходят от линии кукурузы Х112 Промоторный фрагмент als1 приблизительно длиной 1400 пар оснований, в то время как промоторный фрагмент als2 содержит 819 пар оснований Чтобы определить активность промоторов AHAS, для анализа уровней кратковременной экспрессии химерные плазмиды были затем перенесены в протопласты кукурузы "Black Mexican Sweet" /черная мексиканская сладкая/ и протопласты риса Для сравнения протопласты были также трансформированы плазмидой с промотором CaMV 35S, управляющим геном-репортером GUS Экспрессия химерных плазмид в клетках кукурузы определялась путем анализа ферментативной активности GUS Активность промотора als2 была равной или превосходила активность промотора CaMV 35S в обоих типах клеток (фиг 4) Фиг 5 показывает результаты Р-глюкуронидазных тестов, выполненных на клеточных линиях BMS кукурузы, стабильно трансформированных либо pCD221B (als2-GUS-ocs терминаторная плазмида), либо рАС400 (CaMV 35S-GUS-ocs терминаторная плазмида) Анализ распределения AHAS мРНК путем гибридизации in situ радиоактивномеченных РНК-зондов в растительную ткань показывает, что промоторы AHAS кукурузы активны в большинстве частей растения (фиг 6, фиг 7, Фиг 8) Активность промотора AHAS анализировалась у растений арабидопсиса Arabidopsis, которые были стабильно трансформированы с использованием Agrobactenum tumefaciens Входной промоторный регион гена AHAS арабидопсиса присоединяли к гену-репортеру GUS, вставленному в бинарный вектор pBIN19 и далее использовали для трансформации арабидопсиса Анализы трансформированных растений показывают, что при этом происходит экспрессия GUS (судя по активности промотора) в большинстве частей растения Краткое описание схем Фигура 1 раскрывает последовательность als1 промотора AHAS кукурузы ХА17 Фигура 2 раскрывает последовательность als2 промотора AHAS кукурузы ХА17 Фигура 3 раскрывает последовательность als2 промотора AHAS курузы XI12 48951 Фигура 4 является столбчатой диаграммой, представляющей р- глкжуронидазную аісгивность во временных тестах на протопластах клеток кукурузы "Black Mexican Sweet" или клетках риса в суспензионной культуре после трансформации pCD221B (als2-npoMOTop-GUS-ocs терминаторная плазмида) или рАС400 (CaMV 35S-GUS-ocs терминаторная плазмида Активность GUS расчитывали как пмоль/мин/мГ протеина представлены результаты трех независимых экспериментов Фигура 5 является столбчатой диаграммой, представляющей р-глюкуронидазную активность в стабильно трансформированных клеточных линиях кукурузы "Black Mexican Sweet" после трансформации pCD221B (als2-npoMOTop-GUS-ocs терминатор) или рАС400 (CaMV 35S-GUS-ocs терминатор) "СК" обозначает нетрансформированную контрольную ткань Активность GUS рассчитывалась в пмоль/мин/мг протеина Фигура 6 - исследования по гибридизации in situ в листовой мутовке двухнедельных сеянцев кукурузы с использованием радиоактивно помеченных РНК- зондов Срезы тканей были препарированы и гибридизированы с РНК-зондами, кодирующими либо AHAS смысловую полосу (AHAS-), либо AHAS антисмысловую полосу (AHAS+) Для сравнения, в качестве зондов использовали SSU (малая субъединица RUBISCO) смысловая полоса (SSU-) или SSU антисмысловая полоса (SSU+) В каждом случае ожидалось, что только антисмысловая полоса (+) будет вступать в гибридизацию с мРНК, присутствующей в ткани а) SSU+зонд, Ь) SSU-зонд, с) AHAS+зонд, d) AHAS-зонд Фигура 7 - исследования по гибридизации in situ в сердцевине зародыша кукурузы спустя 12 суток после опыления Образцы подготовлены так же как и на фиг 6 a) эмбрион и суспензорий, AHAS+зонд, b) эмбрион и суспензорий, AHAS-зонд, c) перикарп, алейроновый слой и эндосперм, AHAS-зонд, d) перикарп, алейроновый слой и эндосперм, AHAS+зонд Фигура 8 - исследования по гибридизации in situ в апикальк меристеме молодых растений кукурузы Образцы подготовлены так же, как и на фиг 6 а) и Ь) AHAS+зонд, с) и d) AHAS-зонд Характеристики изолированных нуклеотидных последовательностей, включающих промотор синтазы ацетооксикислот для экспрессии генов у растений, представлены на страницах -18-19 SEQ I D N o i , -19-20 SEQ ID No 2, -20-21 SEQ ID No 3 Подробное описание изобретения Ученные исследуя способы применения генетической модификации для придания растениям желательных свойств Методики генной инженерии, используемые для улучшения характеристик, таких как вкус, структура, размер, устойчивость к вредителям и сопротивление воздействию гербицидов, цвет, кислотность или сахаристность растений употребляемых в пищу, развиваются как более быстрая стратегия, 20 чем традиционные методы скрещивания-селекции 10 Настоящее изобретение относится к промоторам AHAS кукурузы и арабидопсиса, и к векторам, и к растительным клеткам, включающим эти промоторы Применительно к данной заявке, промотор определяв как нуклекотидная последовательность, находящаяся в начале гена, которая действует как сигнал для связывания с РНКполимеразой Гены als1 и als2 кукурузы клонируются и секвенируются, и промоторные регионы из этих генов затем интродуцируются в плазмиду 5' к генурепортеру GUS Применительно к данной заявке, ген-репортер определяется как нуклеотидная последовательность, которая присоединена в конец интересующего промотора, так что транскрипты, инициализирующиеся с этим промотором, затрагивают ген-репортер Гены-репортеры обычно кодируют ряд легко определяемых по своей активности ферментов, например в настоящем изобретении экспрессия химерных плазмид в клетках кукурузы определяется анализом активности фермента р-глюкуронидазы (GUS) Работающий в данной области должен знать, что промоторы AHAS обладают высокой активностью во многих растительных тканях различного происхождения, и их можно использовать для экспрессии новых генов у разнообразных растений Новые гены включают, но не сводятся к ним, гены устойчивости к гербицидам, детоксикации и сопротивляемости растительным патогенам Заявляемые промоторы могут использоваться для экспрессии гете-рологичных генов у однодольных, включая, но не ограничиваясь такими видами, кукурузу, рис, пшеницу, ячмень, сорго, овес, рожь и просо Работающий в данной области также должен знать, что заявляемые промоторы будут также управлять экспрессией у двудольных, хотя экспрессия промоторов однодольных у двудольных, по-видимому, характеризуется более низкими уровнями, по сравнению с ее протеканием у однодольных Работающий в данной области должен знать, что промотор als2 кукурузы можно использовать для управления генной экспрессией у других видов однодольных Например, промотор Act1 риса управляет генной экспрессией в протопластах кукурузы, промотор Emu кукурузы использовался для селекции трансгенных пшеницы, ячменя и риса, а промотор AHAS арабидопсиса, промотор двудольного, использовали для управления экспрессией гена AHAS у трансгенных табака и картофеля Упомянутый als2 кукурузы лучше всего функционирует в кукурузе, но также управляет экспрессией генов у другого однодольного На основе исследований, выполненных на кукурузе и других видах, следует заключить, что этот промотор будет управлять базовой экспрессией гена у растения везде Наиболее высокие уровни экспрессии наблюдаются либо в активно делящихся, либо в метаболически активных тканях Для трансформации однодольных культур использовались разнообразные методики, хорошо известные работающим в данной области, которые, однако, не ограничиваются микропроективной бомбардировкой, ПЭГ-опосредованной трансформацией, электропорацией и силиконо 48951 12 11 выми волокнами Все эти методики включают искотрансформированы pFF19K (содержащей выбипользование векторов ДНК для доставки нуклеораемый маркерный ген, кодирующий неомицин тидных последовательностей, подлежащих фосфотрансферазу) и pCD221B или рАС400 Потрансформации Векторы, пригодные для испольсле трансформации протопласты культивировазования в настоящем изобретении, включают, но лись на миллипоровских фильтрах, помещенных не ограничиваются ими, векторы, переносящие поверх среды, содержащей фидерные клетки маркерные гены, используемые для селекции Спустя неделю протопласты переносили на среду, трансгенного материала, включая гены, придаюсодержащую фидерные клетки и 100мг/л канамищие устойчивость к гигромицину, канамицину, цина Культуры протопластов переносили на свебиалофосу и гербицидам, производным имидазожую среду Мурасиге-Скуга с 100мг/л канамицина линона и сульфонил-мочевины до тех пор, пока резистентные каллусы не стали видимыми Каллусы, резистентные к канамицину, Следующий пример служит только для иллюсобирали и выращивали отдельно в течение двухстрации данного изобретения и не может быть трех недель в присутствии канамицина Каллус, истолкован как любым образом ограничивающий резистентный к канамицину, окрашивали X-Gluc это изобретение или тестировали MUG по протоколу R A Jefferson Пример (1987) с целью скрининга GUS-позитивного каллуЭффективность промоторов als1 и als2 оцениса Каллус, идентифицированный как экспрессивается путем измерения активности GUS в проторующий GUS, измельчали в экстракционном бупластах кукурузы и риса или клеточных линиях фере и тестировали, активность GUS измеряли кукурузы с конструкциями, в которых эти последофлюориметрически вательности промотора присоединены к гену GUS Приготовление векторов и протокол трансформации описаны ниже Конструкции, содержащие химерные гены CaMV 35S-GUS, als1-GUS и als2-GUS Плазмида рАС400 является pUC19-основной плазмидой, образованной слиянием 418 пар оснований фрагмента EcoRI-Xbal промотора CaMV 35S, клонированного у головы 1 7-kb фрагмента Xbal-Pstl, содержащего ген GUS, и 700 пар оснований фрагмента Pstl-BamHI, содержащего терминатор октопин синтазы Гены als1 и als2 получены путем скрининга библиотеки генома, приготовленной из кукурузы линии Х112 Фрагмент EcoRI-Ncol, содержащий 1400 пар оснований последовательности у головы кодона ATG инициализации гена als1, субклонирован в рАС400 на место CaMV 35S промотора для образования pCD223B Фрагмент Pstl-Ncol, содержащий 819 пар оснований у головы ATG гена als2, был субклонирован спереди того же самого GUS-ocs терминатора связывания в pBluescnpt® KS(Stratagene) для образования pCD221B 15 Последовательность промотора als2 кукурузы Х112 представлена на фиг 3 Трансформация и оценка протопластов риса и кукурузы Протопласты были выделены из клеток в суспензионной культуре риса (Nortai) или кукурузы (Black Mexican Sweet, BMS) в суспензионной культуре и трансформированы плазмидами рАС221В или рАС400 в соответствии с протоколами ПЭГопосредованной трансформации по L A Lyzmk et al (1989) и JYPeng et al (1990) Во временных тестах трансформированные протопласты риса распределялись по поверхности миллипоровских фильтров, помещенных поверх среды, содержащей фидерные клетки, и трансформированные протопласты BMS культивировались в Змл жидкой среды Спустя двое суток после трансформации культуры протопластов были собраны и экстрагированы буфером для извлечения GUS Активность GUS измерялась флюориметрически в соответствии с протоколом R A Jefferson (1987) Для обнаружения стабильных трансформантов в культуре кукурузы BMS, протопласты были Данные этих экспериментов представлены на фиг 4 и фиг 5 Мутантный ген AHAS кукурузы, ответственный за резистентность к гербицидам группы имидазолинона, и управляемый промотором als2 кукурузы, использовался в качестве выбираемого маркера для получения трансгенного каллуса после трансформации как BMS, так и А188хВ73 клеток и клеток риса Этот результат подтверждает идею, что промотор als2 эффективно управляет высокими уровнями экспрессии, что дает ему возможность управлять экспрессией маркерного гена Гибридизация in situ Препараты на предметных стеклах готовились в основном по J A Langdale et al (1988) Ткань фиксировали в 4% формалине, обезвоживали в этиловом спирте, очищали в ксилоле и заключали в парафиновую пленку Из ткани готовили срезы 8 - 10|ім и помещали на предметные стекла, покрытые поли-1_-лизином Парафин удаляли ксилолом и ткань повторно регидратировали (обратная проводка) промыванием этанолом и ополаскиванием в воде РНК-зонды готовили из обеих лент (+ и -) 172-х нуклеотидного фрагмента региона, кодирующего als2, и 392-х нуклеотидного фрагмента региона, кодирующего SSU, используя набор Атbion Maxiscnpt® Препараты на предметных стеклах подвергали гибридизации согласно протоколу Meyerowitz et al (1988) при 50°С на ночь в разбавлении 1 4 SPB [100 шп 10 кратных солей (З М NaCI, ЮмМ Tns pH 6 8, 50мМ DTA), 400шп формамида, 200шп 50% сульфата декстрана, 40шп Юмг/мл тРНК, Юшп 1 MDTT, 50шп Юмг/мл poly A /полиаденилат/] с зондом, денатурированном в 50% формалине и ЮмМ DTT при 80°С в течение 30 секунд Препараты на предметных стеклах промывали дважды по 15мин в промывном буфере (однократные соли, 50% формамид, ЮмМ Tns рН 8, 1мМ EDTA, ЮмМ DTT) при 50°С, обрабатывали РНКазой А (20цг/мл в NTE_) в течение 30 мин при 37°С, промывали пятикратно в NTE буфере при 37°С за 1 час, дважды промывали по 30 мин в промывном буфере при 50°С, обезвоживали в этаноле и высушивали на воздухе Препараты на предметных стеклах авторадиографировали 48951 14 13 путем погружения в эмульсию, предварительно (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ нагретую до 37°С в темноте, высушивали в тече(і) APPLICANT ДИТРИХ, Габриэл ние 30 мин-1 часа и хранили в темноте при 4°С до (м) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Непроявления Препараты проявляли в течение 2 кодирующая DNA 5' к структуральному гену (промин, ополаскивали в воде, фиксировали в течемотору) для синтазы ацето-оксикислот (АНAS) ние, по крайней мере, 5мин и снова ополаскивали используемая для экспрессии в интродуцированв воде Ткань окрашивали с помощью Alcien Blue ных генах растений (синий краситель) и обесцвечивали в этаноле и (їм) ЧИСЛО СИКВЕНСОВ (ПОСЛЕДОВАТЕЛЬксилоле После установки в предметный столик НОСТЕЙ) 3 Permount ткань просматривали с использованием (iv) АДРЕС ДЛЯ ПЕРЕПИСКИ микроскопа темного поля (A) АДРЕСАНТ Америкой Цианамид Компани Данные экспериментов по гибридизации in situ (B) УЛИЦА Уан Цианамид Плаза на фиг 6 - 8 показывают, что ген в эмбрионе куку(C) ГОРОД Вейн рузы экспрессируется везде (D) ШТАТ Нью Джерси Оказывается возможным оценить экспрессию (E) СТРАНА Соединенные Штаты промотора AHAS путем (F) ИНДЕКС 07470-8426 1) конструирования гена связывания als2 (v) ДАННЫЕ О КОМПЬЮТЕРЕ GUS и определения структуры активности GUS у (A) МЕДИУМ ТИП Флоппи диск трансгенных растений кукурузы или риса Преды(B) КОМПЬЮТЕР IBM PC совместимый дущие исследования с использованием промото(C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА PC-DOS/MSра кукурузы продемонстрировали пригодность DOS оценки экспрессии промотора кукурузы у риса (D) СОФТВЕЙР Патентные документы < 1 0, (Junko Kyozuka et al , 1991) После селекции Версия < 1 25 трансгенных растений с целью определения как (vi) СВЕДЕНИЯ О ЗАЯВКЕ специфичности по ткани, так и по типу клеток бы(A) ЗАЯВКА № США ли выполнены гистохимические анализы расти(B) ДАТА ПОДАЧИ тельных тканей на различных стадиях развития (C) КЛАССИФИКАЦИЯ Этот способ обычно используется для оценки ак(VIM) ИНФОРМАЦИЯ О ПОВЕРЕНтивности промотора как у однодольных, так и у НОМ/АГЕНТЕ двудольных ( А ) Ф И О ГАРИНГТОН, Джеймс Дж 2) тесты по временной экспрессии проведены (B) РЕГИСТРАЦИОННЫЙ НОМЕР Р38 711 на протопластах, полученных от различных видов (C) №ДЕЛА 32,348 растений после трансформации конструкций als2 (їх) ИНФОРМАЦИЯ О ТЕЛЕКОММУНИКАЦИИ GUS Этот подход используется для оценки спо(А) ТЕЛЕФОН, 201-831-3246 собности различных промоторов функциониро(В)ТЕЛЕФАХ 201-831-330$ вать у гетерологич-ных видов Протопласты (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ SEQ Ю № 1 трансформировали с помощью соответствующей (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ СИКВЕНСА конструкции и выдерживали для того, чтобы ин(A) ДЛИНА 413 спаренных оснований тродуцированный ген экспрессировался и нако(B) ТИП нуклеиновая кислота пился соответствующий протеин После такой вы(C) СКРУЧЕННОСТЬ НИТИ одиночная держки клетки тестировались на присутствие (D) ТОПОЛОГИЯ линейная протеина, кодируемого трансгеном для определе(м) ТИП МОЛЕКУЛЫ ДНК (геномная) ния эффективности управляемой промотором (ш) ГИПОТЕТИЧЕСКИЙ НЕТ трансгенной экспрессии (iv) АНТИ-ЧУВСТВИТЕЛЫЮСТЬ НЕТ (XI) ОПИСАНИЕ СИКВЕНСА SEQ ID № 1 ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ TCTAGAGAAA СТАААСТАСТ ААТАААААТТ ATFTTTAGCA ТАГПТАаГА СПЗТМЭТТТА 60 TATITNNAAA TGATAAAGTT TAACTAAAAG TGCACCGCTA AACCACCGTA ААТССАААОА 120 -GACCGTAAAT CTCTTCCACG CACTGTGTCG TGTACCAACG TGCTGTGGAA ACGCTCACGT 180 ACCTTTGTGT ATTATGTACG GATTCGGGCA ACGGACATTT CGACGTCGGTT TTGCCAGTCC 240 NATTCCCATC TGAACCACAC ATCTCTGMC AAAAGTAGGG GAGGCGCCCG CGTAGGCCCC 300 ТГТСССАСАА TCCCACTCCG TGCCAGGTGC САСССГССОС AAGCCCTCGC GCCGCTCCGA GACAGCCGCC CGCAACGATG GCCACCGCCG CCACCGCGGC CGCCGCGCTC АСС 413 15 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ SEQ ID № 2 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ СИКВЕНСА (A) ДЛИНА 509 спаренных оснований (B) ТИП нуклеиновая кислота 48951 16 (C) СКРУЧЕННОСТЬ НИТИ одиночная (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ТИП МОЛЕКУЛЫ ДНК (геномная) (XI) ОПИСАНИЕ СИКВЕНСА SEQ ID № 2 CCGGATTTCC CTGTTGCGGA TTGCGGGTGG CAGCCTGGCA GGTGGGTGCG ACCCCGTTTQ 60 QATTCCCTTG TCTGGGCCCCTTGTGTCAGT ACCGTCTGTA CTCCGATGAC ATGCACCGTC 120 GTCCACAGTC AAGTCCAAM ТСТССССТСТ ТГТТПТМС GGAACAGTTC ААААССТССТ 180 TGACGCACGC TGTCGTGTAC CAGCACTD3G TGGACACCAC GTTTGTAATC CAGGCCGACA 240 CGTCGGTCCC ACGTCGACAG GCCCCACCGT CCGGTCTGTA GCGTGTACGT ATTCGGGCGA 300 CGGACGTGTC GTCGTCGTCT TGCGAGTCCC ATTCCCATCA CCATGTGAGC CAGACATCCT CTGAACAAAA GCAGGGAGGC CTCCACGCAC АТСССССТТГ CTCCACTCCG GTCCGTGGCA 420 CCCACCCCAA ACCCTCGCGC CGCCTCGGAG ACAGCCGCCG CAACCATGGC CACCGCCGCC GCCGCOTCTA CCGCGCTCAC TG0CGCGAC 509 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ SEQ ID № 3 (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ СИКВЕНСА (A) ДЛИНА 829 спаренных оснований (B) ТИП нуклеиновая кислота (C) СКРУЧЕННОСТЬ НИТИ одиночная (D) ТОПОЛОГИЯ линейная (м) ТИП МОЛЕКУЛЫ ДНК (геномная) (XI) ОПИСАНИЕ СИКВЕНСА SEQ Ю № 3 CTGCAGGTCA ACGGATCACC TATCAACATC CGAGCTAAAA ACA.GTAAAAA GGGGGAAAAC 60 GTGGGTGAGT TGAGTCTGTC TTGTGGAAAA AACGTTTTAG TTTCTCCTGG ААТТААСААТ 120 AAAAACAGTT GAACAAGATT GACTGTTCCT CX^GGGAGGGT TTGGAACATC GTTACAGATG 180 TGAGCGAAAG GTGAGGAAAC AG.AGCGGAGG GCTTGGAGGT GACCTCGGTA GTCAGACGCC 240 GGAGTTGAGC TTGATGACGA CACCGTACTG GCGTACCAGG CCTAGTAGTG AACACCCGGC 300 CTGAAGCTGT CGCCGCCGCT GCTCATCTTG TNGGCTGTGC NCGGTGTCCC TGTTGCGGAT 360 TGCGGGTGGC AGCCTGGCAG GTGGGTGCGA CCCGnTGGA CTCCCTGATC TGGGCCCTTT 420 GTGTCAGTAC CGTCTGTACT CCGATGACAT GCACANCGTC GTCCACAGTC AAGTCCACAA 480 ТСТССССТСТ 1111 IIAACG GAATAGTTNC AAAATCTCCT TGACGCACGC TATCGTGTAC 540 17 48951 18 CAGCGCTCAC TGGACACCAC GTTTGTAATC CACGCCGACA CGTCGNTCCC ACGTCGACAG 600 GCCCCACCGT CCGGTCTQTA GCGTGTACGT ATTCGGGCAA CGGACGTGTT; GTCQTCGTCT 660 TGCNNNNGTC CCANNNCCGA TGACCATCTG AGCCATCACA TCTCATGCGT GAANAAAAGC 720 AGGGAAGGCC TCTACGCACA TGCCCCTTTC TNNCTNNNNT CCGTGTGCGT GGCACCCAGG 780 GGAAACCCXC QCGCCGGCTC CGA0ACAGCC GCCGCMGCA TGGCCACOG 829 БИБЛИОГРАФИЯ 1 David McElroy et al , (1990) Изоляция эффеїсгивного аісгин промотора для использования в трансформации риса The Plant Cell 2, 163 -171 2 David McElroy et al ,(1991) Конструкция векторов экспрессии основанных на региональном актин 1 (Actl) риса для использования в трансформации однодольных растений Мої Gen Genet 231 150-160 3 Wanggen Zhang et al , (1991) Анализ активности Act 5' региона в трансгенезе растений риса TheplantCell3 1155-1165 4 Jun Cao et al , (1992) Регенерация гербицидной резиетентности трансгенеза растений риса в связи с промежуточной трансформацией суспензионной культуры клетов Plant Cell Reports II 586 - 591 5 Alan H Chnstensen et al , (1992) Полиубиквитин гены кукурузы структура, термальная пертурбация экспрессии и транскрипция сплайсинга, и активность промотора, следующая за передачей к протопластам путем электропорации Plant Molecular Biology 18 675-689 6 Seiichi Toki et al , (1992) Экспрессия убиквитин генетического промотора кукурузы - бар химерного гена в трансгенезе растений риса Plant Physiol 100 1503-1507 7 J Troy et al , (1993) Ускоренное продуцирование со сложней структурой, независимых линий фертильной трансгенной пшеницы (Tnticum aestivum) Plant Physiol 102 1077-1084 8 Yucchun Wan and Peggy G Lemaux, (1994) Генерация большого числа независимо трансформированных растений ячменя Plant Physiol 104 37-48 9 Junko Kyozuka et al , (1991) Анаэробная индукция и тканеспецифичная эксперессия Adhi промотора кукурузы в трансгенные растения риса и их потомство Мої Gen Genet 228,40 - 48 10 D 1 Last et al , (1991) pEmu улучшенный промотор для экспрессии гена в клетках злаковых Theor Appl Genet 81 581 - 588 11 Robert Bower and Robert G Birch (1992) Трансгенные растения сахарного тростника, полученные путем микропроекционной бомбардировки The Plant Journal 2(3) 409-416 12 D A Chamberlain et al , (1994) Использование Emu промотора с антибиотической и гербицидной резистентностью генов для селекции кал луса растений трансгенной пшеницы и риса Aust J Plat Physiol ,21 95-112 13 L Cornai et al (1985) Экспрессия в растениях мутанта агоА гена из Salvonella typhimunum сравнивается с толерантностью к глифосфату Nature 317 741 -744 14 С Waldron et al (1985) Резистентность к гидромицину В новый маркер для изучения трансформации растений Plant Мої Biol 5 103 108 15 Kevin E McBnde, Kristin R Summerfelt (1990) Улучшенные бинарные векторы для трансформации Ag ro bacterium-mediated растений Plant Мої Biol 14 269-276 16 Michael Bevan et al (1983) Химерный ген с антибиотической резистентностью в качестве пригодного для селекции маркера для трансформации растительной клетки Nature 304 184-187 17 Luis Herrera-Estrella et al (1983) Экспрессия химерных генов, трансформированных в клетки растений путем использования Ті-плазмидразветвленного вектора Nature 304 209-213 18 Robert T Fraley et al (1983) Экспрессия бактериальных генов в клетках растений Р N A S 80 4803-4807 19 Marc De Block et al (1984) Экспрессия инородных генов в регенерированных растениях и их потомстве EMBOJ3 1681 -1689 20 R Ham et al (1985) Ввод, интеграция, экспрессия и генетическая трансмиссия пригодных для отбора химерных генов протопластов растений Мої Gen Genet 199 161 -168 21 J С Kndi and Robert M Goodman (1986) Транскрипциональные регуляторные последовательности, полученные из вирусов растений Вю Essays 4 4 - 8 22 Joan T Odell et al (1985) Идентификация ДНК последовательностей, необходимых для активации 35S промотора вируса мозаики цветной капусты Nature 313 810-812 23 David W Ow et al (1986) Временная и устойчивая экспрессия гена люциферазы светляков в клетках растений и трансгенных растений Science 234 856 - 959 24 D М Shah et al (1896) Инжененрия гербицидной толерантности в трансгенных растениях Science 233 478-481 25 Robert Kay et al (1987) Дупликация CaMV последовательностей 35S промотора создает 48951 20 19 сильный энхансер для растительных генов Sciтазы ацето-оксикислот мультигенного семейства ence 236 1299-1302 Brassica napus имеют различные паттерны экспрессии The Plant Journal 2 321 - 330 26 L Cornai et al (1990) Новые и полезные свойства химерного растительного промотора в 33 Dale L Shaner and N Moorthy Malhpudi комбинации CaMV 35S и MAS элементов Plant (1991) Взаимодействия синтазы имадозолинонМої biol 15 373-381 ацето-оксикислот Imidazolmone Herbicides ed Dale L Shaner and Susan L 0' Connor CRC Press (Boca 27 J Pazskowski et al (1984) Прямая передаRaton, FL) ча гена в растения, plants EMBOJ 3 2717 - 2722 28 Ervm Balazs et al (1985) Конструкция хи34 R A Jefferson (1987) Анализ химерных гемерного вектора для трансформации высших раснов в растениях система слияния GUS генов тений Gene 40 343 - 348 Plant Mol Biol Rept5 387-405 29 Margaret Sanger et al (1990) Характери35 LA Lyzmk et al (1989) Стабильная стики сильного промотора для вируса мозаичнотрансформация протопластов кукурузы с gusA и сти норичника шишковатого Сравнение с аналопео генами Plant Mol biol 13 151-161 гами 35S промотора для вируса мозаичности 36 J Y Peng et al (1990) Ко-трансформация цветной капусты и промотора ман-нопин синтазы протопластов риса mdica с пео и gusA генами Plant Mol Biol 14 433-443 Plant Cell Kept 9 168-172 30 Gail Schmidt and Bijay К Singh (1990) Ак37 J A Langdale et al , (1988) Экспрессия клетивность тканевого распределения синтазы ацетоточных паттернов фотосинтетического гена в разоксикислот на различных стадиях развития фасовивающихся листьях кукурузы Gene Dev 2 106 ли лима Pesticide Sci 30(4) 418-419 115 31 Sharon J Kheeler et al , (1993) Экспрессия 38 Е Meyerowitz et al , (1988), Гибридизация регуляции гена актиолактат синтазы табака Plant "на месте" в раститетльных клетках РНК Plant Physiol 102 1009-1018 Мої Bio Kept ,5 242 - 250 32 Therese Ouellet et al , (1992) Органы синSEQUENCE LISTING TCTAGAGAAACTAAACTACTAATAAAAAnATTTTTAGCATAn AGTGCACCGCTAAACCACCGTAAATCCAAAGAGACCGTAAATCT CTTCCACGCACTCTGTCGTGTACCAACGTGCTGTGGAAACGCTC ACGTACCTTTGTGTAnATGTACGGAnCGGGCAACGGACATTT CGACGTCGGTTTGCCAGTCCNAnCCCATCTGAACCACACATCT CTGAACAAAAGTAGGGGAGGCGCCCGCGTAGCCCCCTTTCCCAC AATCCCACTCCGTGCCAGGTGCCACCCTCCCCAAGCCCTCGCGC CGCTCCGAGACAGCCGCCCGCAACCATGGCCACCGCCGCCACCG CGGCCGCCGCGCTCACC Фиг. 1 21 48951 22 CCGGATTTCCCTGTTGCGGATTGCGGGTGGCAGCCTGGCAGGTG GGTGCGACCCCGTTTGGAnCCCTTGTCTGGGCCCCnGTGTCA GTACCGTCTGTACTCCGATGACATGCACCGTCGTCCACAGTCAA GTCCAAAATCTCCCCTCI11111FIAACGGAACAGTTCAAAACC TCCTTGACGCACGCTGTCGTGTACCAGCACTCGGTGGACACCAC GTnGTAATCCAGGCCGACACGTCGGTCCCACGTCGACAGGCCC CACCGTCCGGTCTGTAGCGTGTACGTAnCGGGCGACGGACGTG TCGTCGTCGTCTTGCGAGTCCCAnCCCATCACCATCTGAGCCA CACATCCTCTGAACAAAAGCAGGGAGGCCTCCACGCACATCCCC CTTTCTCCACTCCGGTCCGTGGCACCCACCCCAAACCCTCGCGC CGCCTCCGAGACAGCCGCCGCAACCATGGCCACCGCCGCCGCCG CGTCTACCGCGCTCACTGGCGCCAC . 2 CTGCAGGTCA GGGGGAAAAC TTTCTCCTGG CCGGGAGGGT AGAGCGGAGG TGATGACGAC TGAAGCTGTC GTTGCGGATT TCCCTGATCT CACACCGTCG AATAGTTCAA GACACCACGT CCCACCGTCC CGTCGTCTTG GAACAAAAGC GTCCGTGGCA CAACCATGGC ACGGATCACC GTGGGTGAGT AATTAACMT TTGGAACATC GCTTGGAGGT ACCGTACTGG GCCGCCGCTG GCGGGTGGCA GGGCCCTTTG TCCACAGTCA AATCTCCTTG TTGTAATCCA GGTCTGTAGC CGAGTCCCAT AGGGAGGCCT CCCACCCCM CACCG TATCAACATC TGAGTCTGTC AAAAACAGTT GTTACAGATG GACCTCGGTA CGTACCAGGC CTCATCTTGT GCCTGGCAGG TGTCAGTACC AGTCCACMT ACGCACGCTA CGCCGACACG GTGTACGTAT TCCCATCACC CTACGCACAT ACCCTCGCGC Фиг. з CCAGCTAAAA TTGTGGAAAA GMCAAGATT TGAGCGAAAG GTCGACGCCG CTAGTAGTGA GGGCTGTGCC TGGGTGCGAC GTCTGTACTC CTCCCCTCTT TCGTGTACCA TCGGTCCCAC TCGGGCGACG ATCTGAGCCA CCCCCTTTCT CGCCTCCGAG ACAGTAAAAA AACGTTTT&G GACTGTTCCT GTGAGGAAAC GAGTTGAGCT ACACCGGGCC CGGTGTCCCT CCGTTTGGAC CGATGACATG TTTTTAACGG GCGCTCACTG GTCGACAGGC GACGTGTCGT CACATCCTCT CCCACTCCGT ACAGCCGCCG 23 24 48951 ЭКСПРЕССИЯ ПРОМОТОРА СИНТАЗЫ АЦЕТО-ОКСИКИСЛОТ В ИНТРОДУЦИРОВАННЫХ ГЕНАХ РАСТЕНИЙ РИС Э К С П Е Р И М Е Н Т Ы І II III СРЕДНЕЕ ТАНДАРТШВ ОТНОШЕНИЕ 3040 2413 2847 2767 321 8337 5110 8024 7157 1780 Э К С П Е Р ЙНЕ и т Ы II III Ї 2275 6117 3234 2060 3174 1269 7295 4018 4145 9419 3369 2863 8357 3149 1463 997 1129 1033 1187 1999 133? 446 35S-GUS СРЕДНЕЕ СТАНДАРТНОЕ ОТНОШЕНИЕ 970 1175 1732 1292 394 AXB/35S 2430 3435 2933 1882 . 1097 1235 731 1236 480 348 540 292 393 130 Фаг. 4 а Фиг. 4Ъ 1021 1228 1125 334 624 1032 341 384 359 529 336 25 26 48951 2 Фиг.4с II 2500 и я 2000 161 198 300 315 339 420 540 784 833 841 1084 1367 2104 g 15001000 Бі В 5001 69 13 62 53 16 74 28 60 35 Клеточная линия Фиг, 5 31 73 15 1 76 27 48951 Фиг* Єа Фиг. бъ ФИГ, 6 с 28 29 48951 Фиг, 6d Фиг. 7а , 7Ъ ЗО 31 48951 Фиг. 7с Фиг. 7й 32 33 48951 ФИГ, 8а Фиг. 8Ъ 34 35 48951 ФИГ. 8 с * 3d ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 36