Антитіло, направлене проти ангіопоетину-1 й ангіопоетину-2, та його застосування

Реферат: Винахід належить до ізольованого антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, що специфічно зв'язується з лігандами Ang1 і Ang2 рецептора Tiе 2, а також до способів одержання й застосування зазначеного антитіла. UA 102683 C2 (12) UA 102683 C2 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ Дана заявка претендує на пріоритет відповідно до попередньої заявки на патент США, серійний номер 61/139,361, поданої 19 грудня, 2008, і попередньої заявки на патент США, серійний номер 61/061,943, поданої 16 червня, 2008, і попередньої заявки на патент США, серійний номер 61/066,632 поданої 20 лютого, 2008, включених у даний документ за допомогою посилання. ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Даний винахід відноситься до специфічних єднальних агентів, що розпізнають і зв'язують ангіопоетини-1 (Ang-1) і/або ангіопоетин-2 (Ang-2). Зокрема, винахід відноситься до одержання, застосування в діагностиці й терапевтичного застосуванні моноклональних і поліклональних антитіл, а також антигензв'язувальних фрагментів таких антитіл, що специфічно зв'язують Ang-1 й/або Ang-2. Також, аспекти винаходу відносяться до гібридом або інших ліній клітин, що експресують зазначені антитіла. Описані антитіла придатні для застосування в діагностиці й лікуванні захворювань, пов'язаних з активністю й підвищеною продукцією Ang-1 або Ang-2. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Ангіонез, утворення нових кровоносних судин із уже існуючих, має істотне значення для багатьох фізіологічних і патологічних процесів. У нормі, ангіонез строго регулюється про- і антиангіогенними факторами, але у випадку таких захворювань, як рак, неоваскулярні захворювання очей, артрит і псоріаз, у даному процесі можуть з'являтися відхилення. Folkman, J., Nat. Med., 1:27-31 (1995). Існує ряд захворювань, пов'язаних з порушенням регуляції або небажаним ангіонезом. Такі захворювання включають, але не обмежуються наступними: неоваскуляризація ока, наприклад, ретинопатії, включаючи діабетичну ретинопатію, вікова дегенерація жовтої плями, псоріаз, гемангіобластома, гемангіома, артеріосклероз, захворювання запального характеру, наприклад, ревматоїдні або ревматичні запальні захворювання, зокрема, артрит (включаючи ревматоїдний артрит), або інші хронічні захворювання запального характеру, наприклад, хронічна астма, артеріальний або пост-трансплантаційний атеросклероз, ендоматріоз, і неопластичні захворювання, наприклад, так називані солідні (тверді) пухлини й рідинні (або гематопоетичні) пухлини (наприклад, лейкемія й лімфоми). Фахівцям у даній галузі також відомі інші захворювання, пов'язані з небажаним ангіонезом. Хоча в процес регуляції ангіонезу залучені багато систем трансдукції, однією з найбільш вивчених є система, селективна відносно клітин ендотелію, що включає рецепторну тирозинкіназу Tie-2 (також називану "Tie-2" або "Tie-2R" (також іменований "ORK"); рецептор Tie-2 миші також іменується "tek") та її ліганди, ангіопоетини (Gale, N. W. and Yancopoulos, G. D., Genes Dev. 13:1055-1066 [1999]). У цей час відомі 4 типи ангіопоетинів: від ангіопоетину-1 ("Ang1") до ангіопоетину-4 ("Ang-4"). Зазначені ангіопоетини також називають "лігандами Tie-2". (Davis, S., et al., Cell, 87:1161-1169 [1996]; Grosios, K., et al., Cytogenet Cell Genet, 84:118-120 [1999]; Holash, J., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1617-1625 [1999]; Koblizek, T. I., et al., Current Biology, 8:529-532 [1998]; Lin, P., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 95:8829-8834 [1998]; Maisonpierre, P. C., et al., Science, 277:55-60 [1997]; Papapetropoulos, A., et al., Lab Invest, 79:213-223 [1999]; Sato, T. N., et al., Nature, 375:70-74 [1998]; Shyu, K. G., et al., Circulation, 98:2081-2087 [1998]; Suri, C., et al., Cell, 87:1171-1180 [1996]; Suri, C., et al., Science, 282:468-471 [1998]; Valenzuela, D. M., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 96:1904-1909 [1999]; Witzenbichler, B., et al., J Biol Chem, 273:18514-18521 [1998]). У той час як зв'язування Ang-1 з Tie-2 стимулює фосфорилювання рецептора в культурі клітин ендотелію, для Ang-2 проявляє як агоністичні, так і антагоністичні властивості у відношенні фосфорилювання рецептора Tie-2 (Davis, S., et al., [1996], supra; Maisonpierre, P.C., et al., [1997], supra; Kim, I., J.H. Kim, et al., Oncogene 19(39): 4549-4552 (2000); Teichert-Kuliszewska, K., P.C. Maisonpierre, et al., Cardiovascular Research 49(3): 659-70 (2001)). Фенотипи мишей з нокаутом по Tie-2 й Ang-1 подібні, що дозволяє припустити, що процес фосфорилювання Tie-2, який стимулює Ang-1, опосредковує ремоделювання (перебудову) і стабілізацію судин, що утворюються, in utero шляхом забезпечення адгезії до ендотеліальних підтримуючих клітин (Dumont, D. J., et al., Genes & Development, 8:1897-1909 [1994]; Sato, T. N., et al., Nature, 376:70-74 [1995]; Suri, C., et al., [1996], supra). Вважається, що роль Ang-1 у стабілізації судин зберігається й у дорослому стані, коли він експресується на значному рівні й конститутивно (Hanahan, D., Science, 277:48-50 [1997]; Zagzag, D., et al., Experimental Neurology, 159:391-400 [1999]). Навпроти, експресія Ang-2, в основному, обмежена областями перебудови судин, у яких він, як вважають, блокує функцію Ang-1, і, таким чином, індукує стан пластичності 1 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 судин, сприятливий для процесів ангіонезу (Hanahan, D., [1997], supra; Holash, J., et al., Science, 284:1994-1998 [1999]; Maisonpierre, P. C., et al., [1997], supra). Численні опубліковані результати досліджень, указують на судиноселективну експресію Ang-2 при хворобливих станах, пов'язаних з ангіонезом. Такі патологічні стани включають, наприклад, псоріаз дегенерацію жовтої плями й рак (Bunone, G., et al., American Journal of Pathology, 155:1967-1976 [1999]; Etoh, T., et al., Cancer Research, 61:2145-2153 [2001]; Hangai, M., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1617-1625 [2001]; Holash, J., et al., [1999] див. вище; Kuroda, K., et al., Journal of Investigative Dermatology, 116:713-720 [2001]; Otani, A., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40:1912-1920 [1999]; Stratmann, A., et al., American Journal of Pathology, 153:1459-1466 [1998]; Tanaka, S., et al., J Clin Invest, 103:34-345 [1999]; Yoshida, Y., et al., International Journal of Oncology, 15:1221-1225 [1999]; Yuan, K., et al., Journal of Periodontal Research, 35:165-171 [2000]; Zagzag, D., et al., [1999] supra). Більшість згаданих досліджень сфокусовані на раку, в якого багато типів пухлин демонструють експресію Ang-2 у судинах. На противагу експресії при патологічному ангіонезі, експресія Ang-2 у нормальних тканинах надзвичайно обмежена (Maisonpierre, P. C., et al., [1997], выше; Mezquita, J., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 260:492-498 [1999]). У нормально функціонуючому дорослому організмі, трьома основними областями ангіонезу є яєчники, плацента й матка; перераховані тканини в нормі є первинними (тобто, не-раковими) тканинами, у яких виявляється мРНК Ang-2. Деякі функціональні дослідження вказують на те, що Ang-2 може бути залучений в ангіонез пухлин. Ahmad et al. (Cancer Res., 61:1255-1259 [2001]) описують понадекспресію Ang-2 і показують її можливий зв'язок з посиленням росту пухлини в моделі з мишами із ксенотрансплантатами. Див. також джерела Etoh et al., вище, і Tanaka et al., вище, у яких представлені дані, що припускають зв'язок понадекспресії Ang-2 з гіперваскуляризацією пухлини. Проте, на противагу цьому, Yu et al. (Am. J. Path., 158:563-570 [2001]) приводять дані, які показують, що понадекспресія Ang-2 у легеневій карциномі Льюиса й клітках TA3 карциноми молочної залози, можливо, збільшували час життя миші, якій ін'єктували відповідні транфектанти. В останні кілька років, у різних публікаціях Ang-1, Ang-2 й Tie-2 розглядалися як можливі мішені для протиракової терапії. Наприклад, у патентах США № 6,166,185, 5,650,490, і 5,814,464 розкриті антитіла до лігандів Tie-2 і тіл рецепторів. Патент США № 2003/0124129A1 описує окремі антитіла до Ang 2 й їхнє застосування в лікуванні раку. Lin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95:8829-8834 [1998]) ін'єктували мишам аденовірус, що експресує розчинний рецептор Tie-2; розчинний Tie-2, припустимо, знижував кількість і розміри пухлин, що розвивалися в мишей. У пов'язаному дослідженні Lin et al. (J. Clin. Invest.,100:2072-2078 [1997]) уводили розчинну форму Tie-2 пацюкам; дана речовина, припустимо, знижувала розмір пухлини в пацюка. Siemeister et al. (Cancer Res., 59:3185-3189 [1999]) одержали лінії клітин меланоми людини, що експресують позаклітинний домен Tie-2, клітини таких ліній вводили бестимусним ("nude") мишам, і прийшли до висновку, що присутність розчинного Tie-2, припустимо, вела до "значного інгібування" росту пухлини, а також ангіонезу пухлини. Отже, ефективна терапія, спрямована проти Ang-2, може бути корисною для великої кількості пацієнтів, хворих раковими захворюваннями, тому що більшості солідних пухлин для досягнення розмірів більше 1-2 міліметрів у діаметрі потрібен процес неоваскуляризації. Така терапія може знайти широке застосування при лікуванні інших захворювань, пов'язаних з ангіонезом, таких як ретинопатії, артрит і псоріаз. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Незважаючи на те, що численні дані вказують на придатність інгібування рівнів Ang 2 у лікуванні небажаного ангіонезу (або будь-якої групи станів, що включають небажане утворення кровоносних судин, таких як артеріогенез), при існуючому рівні техніки не ясно, чи буде придатним у терапії одночасне інгібування Ang 1, і, якщо це так, яка ступінь інгібування Ang 1, на додаток до інгібування Ang 2, може знадобитися для забезпечення, щонайменше, аддитивного терапевтичного ефекту. Відповідно, даний винахід спрямований на задоволення невизнаної потреби у визначенні нових агентів, які специфічно розпізнають і зв'язують як ліганди Ang-1, так і ліганди Ang-2. Зв'язувальні агенти, такі як антитіла згідно із даним винаходом, мають необхідні рівні активності інгібування як Ang-2, так й Ang-1, що робить їх особливо корисними в багатьох областях застосування, таких як діагностичний скринінг, біологічні дослідження, і терапевтичне втручання при захворюваннях, пов'язаних з активністю Ang-1 й/або Ang-2, таких як рак, запалення, та інші захворювання, пов'язані з небажаним ангіонезом. 2 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Різні варіанти реалізації даного винаходу відносяться до зв'язувальних агентів напраленої дії, які специфічно зв'язують Ang-1 й/або Ang-2, і, відповідно, інгібують фізіологічний або патологічний ангіонез. Механізми досягнення зазначеного результату включають, але не обмежуються наступними: інгібування зв'язування Ang-1 й/або Ang-2 з рецепторами Tie1 й/або Tie2, інгібування передачі сигналу Tie1 й/або Tie2, індукованого Ang-1 й/або Ang-2, або підвищений кліренс Ang1 й/або Ang-2 з організму пацієнта, і, відповідно, зниження ефективної концентрації Ang-1 й/або Ang-2. Відповідно до одного варіанта реалізації винаходу, специфічний зв'язувальний агент являє собою повнорозмірне антитіло людини, що специфічно зв'язує Ang-1 й/або Ang-2 і перешкоджає зв'язуванню Ang-1 й/або Ang-2 з рецепторами Tie1 й/або Tie2. У ще одному варіанті реалізації винаходу, запропоноване повнорозмірне моноклональне антитіло людини, що зв'язує Ang-1 й/або Ang-2, і додатково інгібує фосфорилювання Tie1 й/або Tie2, яке индукує Ang-1 й/або Ang2. Антитіло припустимо зв'язує Ang-1 й/або Ang-2 з Kd, меншої, чим, приблизно, 100 пм, 30 пм, 20 пм, 10 пм, 5 пм або 1пм. Відповідно до окремих варіантів реалізації даного винаходу, антитіла відносяться до класу IgG, наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, і IgG4. В іншому варіанті реалізації даного винаходу запропонований зв'язувальний агент, наприклад, антитіло, що містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, у якому важкий ланцюг містить варіабельну область важкого ланцюга, обрану із групи, що складається з H2 (SEQ ID NO: 1); H3 (SEQ ID NO: 2); H4 (SEQ ID NO: 3); H6 (SEQ ID NO: 4); H10 (SEQ ID NO: 5); H11 (SEQ ID NO: 6); H5P (SEQ ID NO: 7); і антигензв'язувальні фрагменти таких агентів; і зазначений легкий ланцюг містить варіабельну область легкого ланцюга, обрану із групи, що складається з: L1 (SEQ ID NO: 8); L2 (SEQ ID NO: 9); L4 (SEQ ID NO: 10); L6 (SEQ ID NO: 11); L7 (SEQ ID NO: 12); L8 (SEQ ID NO: 13); L9 (SEQ ID NO: 14); L11 (SEQ ID NO: 15); L12 (SEQ ID NO: 16); L13 (SEQ ID NO: 17); і антигензв'язувальних фрагментів таких агентів. Відповідно до винаходу також запропонований специфічний зв'язувальний агент, що містить щонайменше один пептид, обраний із групи, що складається з: H2 (SEQ ID NO: 1); H3 (SEQ ID NO: 2); H4 (SEQ ID NO: 3); H6 (SEQ ID NO: 4); H10 (SEQ ID NO: 5); H11 (SEQ ID NO: 6); H5P (SEQ ID NO: 7); L1 (SEQ ID NO: 8); L2 (SEQ ID NO: 9); L4 (SEQ ID NO: 10); L6 (SEQ ID NO: 11); L7 (SEQ ID NO: 12); L8 (SEQ ID NO: 13); L9 (SEQ ID NO: 14); L11 (SEQ ID NO: 15); L12 (SEQ ID NO: 16); L13 (SEQ ID NO: 17); і антигензв'язувальних фрагментів таких агентів. Зрозуміло, що специфічний зв'язувальний агент може являти собою, наприклад, антитіло, наприклад, поліклональне, моноклональне, химерне, гуманізоване або повнорозмірне антитіло людини. Антитіло також може представляти собою одноланцюгове антитіло. Інші приклади специфічних зв'язувальних агентів включають пептидні антитіла, наприклад, пептидне антитіло mL4-3, авімери (avimer), інші форми пептидних молекул (наприклад, Fc-злиті молекули й Abзлиті молекули (див. технологію CovX-Pfizer)), які містять послідовності пептидів, які розпізнають і зв'язуються з білком-мішенню (у контексті даного документа, ліганди Ang2 й/або Ang1), і т.д. В одному з варіантів реалізації, даний винахід відноситься до пептидних антитіл (peptibodies), наприклад, до mL4-3, які зв'язують Ang1. В інших варіантах реалізації, даний винахід відноситься до пептидної ділянки mL4-3, а також до подібних пептидів, що зв'язують Ang1, які можуть бути отримані шляхом приєднання, делецій, і/або вставок амінокислот у складі зазначеного пептиду. Аналогічні приєднання, делеції або вставки можна робити в складі Fcфрагмента пептидного антитіла mL4-3. Подальші перетворення mL4-3 і пептидних антитіл, у цілому, добре відомі в даній галузі, і описані, наприклад, в WO 00/24782 й WO03/057134, включених у даний документ за допомогою посилання на розділи, що описують і розкривають створення зв'язувальних агентів, що містять випадковим чином отриманий пептид, що зв'язує бажану мішень. Далі, винахід відноситься до гібридоми, що продукує моноклональне антитіло відповідно до винаходу, а також до лінії клітин, що містить (за допомогою різних способів, таких як трансфекція, трансформація, электропорація) послідовності нуклеїнових кислот, необхідні для експресії специфічних зв'язувальних агентів відповідно до винаходу, таких як антитіла, описані в даному документі. Також варто розуміти, що винахід відноситься до кон'югатів, описаних у даному документі. Наприклад, кон'югат може являти собою специфічний зв'язувальний агент (такий як антитіло) відповідно до винаходу, кон'югований з іншою молекулою (іншими молекулами) білка, вуглеводню, ліпіду, або зі складеною молекулою. Далі, винахід відноситься до молекул нуклеїнових кислот, що кодують специфічні зв'язувальні агенти (такі як антитіло) відповідно до винаходу, а також до вектора, що містить 3 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зазначену молекулу нуклеїнової кислоти, а також до клітини-хазяїна, що містить зазначений вектор. Також, відповідно до винаходу запропонований спосіб одержання специфічного зв'язувального агента, що включає (a) трансформацію клітини-хазяїна, щонайменше, одною молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує специфічний зв'язувальний агент; (b) експресію зазначеної молекули нуклеїнової кислоти в зазначеній клітині-хазяїні; і (c) виділення специфічного зв'язувального агента. Далі, відповідно до винаходу запропонований спосіб одержання антитіла, що включає: (a) трансформацію клітини-хазяїна щонайменше однією молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло відповідно до винаходу; (b) експресію зазначеної молекули нуклеїнової кислоти в зазначеній клітині-хазяїні; і (c) виділення специфічного антитіла. Далі, винахід відноситься до способу інгібування небажаного ангіонезу в ссавця, що включає введення терапевтично ефективної кількості специфічного зв'язувального агента відповідно до винаходу. Також, відповідно до винаходу запропонований спосіб лікування рака в ссавця, шляхом введення терапевтично ефективної кількості специфічного зв'язувального агента відповідно до винаходу. Також винахід відноситься до способу інгібування небажаного ангіонезу в ссавця, що полягає у введенні терапевтично ефективної кількості антитіла відповідно до винаходу. Також, відповідно до винаходу запропонований спосіб лікування рака в ссавця, що включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла відповідно до винаходу. Варто розуміти, що винахід також відноситься до фармацевтичних композицій, що містять специфічний зв'язувальний агент відповідно до винаходу й фармацевтично прийнятний допоміжний агент. Фармацевтична композиція може містити антитіло відповідно до винаходу й фармацевтично прийнятний допоміжний агент. Відповідно до винаходу запропонований спосіб модулювання або інгібування активності ангіопоетину-2 шляхом введення одного або більше специфічних зв'язувальних агентів відповідно до винаходу. Також, відповідно до винаходу запропонований спосіб модулювання або інгібування активності ангіопоетину-2 шляхом введення одного або більше антитіл відповідно до винаходу. Далі, винахід відноситься до способу модулювання щонайменше одного з наступних процесів: проникність судин або просочування плазми в ссавця шляхом введення терапевтично ефективної кількості специфічного зв'язувального агента відповідно до винаходу. Також винахід відноситься до способу лікування щонайменше одного з перерахованих нижче захворювань: неоваскулярне захворювання ока, ожиріння, гемангіобластома, гемангіома, артеріосклероз, запальне захворювання, порушення запального характеру, атеросклероз, ендоматріоз, неопластичне захворювання, захворювання, пов'язане з костями або псоріаз, у ссавця, що включає введення терапевтично ефективної кількості специфічного зв'язувального агента відповідно до винаходу. Далі, відповідно до винаходу запропонований спосіб модулювання щонайменше одного з наступних процесів: проникність судин або просочування плазми в ссавця, що включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла відповідно до винаходу. Також винахід відноситься до способу лікування, щонайменше, одного з перерахованих нижче захворювань: неоваскулярне захворювання ока, ожиріння, гемангіобластома, гемангіома, артеріосклероз, запальне захворювання, порушення запального характеру, атеросклероз, ендоматріоз, неопластичне захворювання, захворювання, пов'язане з костями, або псоріаз, у ссавця, що включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла відповідно до винаходу. Далі, винахід відноситься до способу лікування рака в ссавця, що включає введення терапевтично ефективної кількості специфічного зв'язувального агента відповідно до винаходу й хемотерапевтичного агента. Фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що специфічний зв'язувальний агент і хемотерапевтичний агент не обов'язково вводять одночасно. Далі, відповідно до винаходу запропонований специфічний зв'язувальний агент, що містить гіперваріабельну ділянку 1 (CDR 1) важкого ланцюга, що має будь-яку послідовність із: SEQ ID NO: 18. Далі, відповідно до винаходу запропонований специфічний зв'язувальний агент, що містить гіперваріабельну ділянку 2 (CDR 2) важкого ланцюга, що має будь-яку послідовність із: SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; і антигензв'язувальні фрагменти таких агентів. Також винахід відноситься до специфічного зв'язувального агента, що містить гіперваріабельну ділянку 3 (CDR 3) у складі важкого ланцюга,що має будь-яку послідовність із: SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39); і антигензв'язувальні фрагменти таких агентів. 4 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Також відповідно до винаходу запропонований специфічний зв'язувальний агент, що містить гіперваріабельну ділянку 1 (CDR 1) у складі легкого ланцюга, що має будь-яку послідовність із: SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; і антигензв'язувальні фрагменти таких агентів. Також відповідно до винаходу запропонований специфічний зв'язувальний агент, що містить гіперваріабельну ділянку 2 (CDR 2) легкого ланцюга, що має будь-яку послідовність із: SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; і антигензв'язувальні фрагменти таких агентів. Також винахід відноситься до специфічного зв'язувального агента, що містить гіперваріабельну ділянку 3 (CDR 3) легкого ланцюга, що має кожну з наступних послідовностей: SEQ ID NO:33; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 40; і антигензв'язувальні фрагменти таких агентів. Інші варіанти реалізації винаходу включають ізольовані молекули нуклеїнової кислоти, що кодують кожне з антитіл, описаних у даній заявці, вектори, що містять ізольовані молекули нуклеїнової кислоти, що кодують антитіла до Ang-1 й/або антитіла до Ang-2, або клітини-хазяї, трансформовані будь-якою із зазначених молекул нуклеїнової кислоти. Також, один варіант реалізації даного винаходу відноситься до способу одержання антитіла до Ang-1 й/або до Ang-2 шляхом культивування клітин-хазяїв в умовах, у яких відбувається експресія молекули нуклеїнової кислоти, з одержанням антитіла, і наступного виділення антитіла. Варто розуміти, що обсяг винаходу також включає будь-яку молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло або фрагмент антитіла відповідно до винаходу, включаючи послідовності нуклеїнових кислот, оптимизовані з метою збільшення виходу антитіл або фрагментів антитіл при трансфекції їх у клітини-хазяї для одержання антитіл. Відповідно до подальших варіантів реалізації запропонований спосіб одержання высокоафінних антитіл до Ang-1 й/або Ang-2 шляхом імунізації ссавця Ang-1 або 2 чоловік, або його фрагментом, і однією або більше ортологічними послідовностями або їхніми фрагментами. Далі, винахід відноситься до способу визначення рівня Ang-1 або Ang-2 у біологічному зразку шляхом (a) приведення специфічного зв'язувального агента відповідно до винаходу в контакт зі зразком; і (b) визначення ступеня зв'язування специфічного зв'язувального агента зі зразком. Винахід також відноситься до способу визначення рівня Ang-2 у біологічному зразку шляхом (a) приведення антитіла відповідно до винаходу в контакт зі зразком; і (b) визначення ступеня зв'язування антитіла зі зразком. Винахід також відноситься до способу інгібування небажаного ангіонезу в ссавця, що включає введення терапевтично ефективної кількості поліпептиду або композиції згідно із даним описом. Винахід також відноситься до способу модулювання ангіонезу в ссавця, що включає введення терапевтично ефективної кількості поліпептиду або композиції відповідно до описаного в даній заявці. Далі, винахід відноситься до інгібування росту пухлини, що характеризується небажаним ангіонезом, у ссавця, що включає введення терапевтично ефективної кількості поліпептиду або композиції, відповідно до описаного в даній заявці. Також, винахід відноситься до способу лікування рака в ссавця, що включає введення терапевтично ефективної кількості поліпептиду або композиції відповідно до описаного в даній заявці, і хемотерапевтичного агента. Специфічний поліпептид або композиція згідно із даним винаходом й хіміотерапевтичний агент не обов'язково вводити одночасно. У переважному варіанті реалізації, хемотерапевтичний агент являє собою принаймні один з перерахованих: 5-FU, CPT11 і Таксотер. Проте, варто розуміти, що можливо застосування інших хемотерапевтичних агентів й інших засобів протиракової терапії. Далі, винахід відноситься до способу лікування рака в ссавця, що включає введення терапевтично ефективної кількості поліпептиду або композиції згідно із даним винаходом й агента, спрямованого проти VEGF, або інгібітора мультикінази (MKI). У переважному варіанті реалізації, агент, спрямований проти VEGF або інгібітор мультикінази (MKI) обрані з наступних: Avastin® (бевацизумаб), Lucentis® (ранибізумаб), Macugen® (пегаптаніб), Sutent® (сунитиніб), Nexavar® (сорафеніб), дифосфат мотесанібу, Zactima® (вандетаніб), Recentin (AZD 2171), AG013736 (акситиніб). Проте, варто розуміти, що можливо застосування інших підходящих антиангіогенних агентів й інших засобів протиракової терапії. Варто розуміти, що специфічні зв'язувальні агенти відповідно до винаходу застосовні для лікування ряду захворювань, пов'язаних з небажаним ангіонезом або порушенням його регуляції. Такі захворювання включають, але не обмежуються наступними: неоваскуляризація ока, наприклад, ретинопатії (включаючи ретинопатію діабетичного походження й вікову дегенерацію жовтої плями) псоріаз, гемангіобластома, гемангіома, артеріосклероз, захворювання запального характеру, наприклад, ревматоїдні або ревматичні запальні захворювання, зокрема, артрит (включаючи ревматоїдний артрит), або інші хронічні захворювання запального характеру, наприклад, хронічна астма, артеріальний або пост 5 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 трансплантаційний атеросклероз, ендоматріоз, і неопластичні захворювання, наприклад, так називані, тверді (солідні) пухлини й рідинні (або гематопоетичні) пухлини (такі як лейкемія). Інші захворювання, лікування яких можна здійснювати шляхом введення специфічних зв'язувальних агентів, відомі фахівцям у даній галузі. Такі захворювання включають, але не обмежуються наступними: ожиріння, проникність судин, просочування плазми, і захворювання, пов'язані з костями, включаючи остеопороз. Таким чином, винахід додатково відноситься до способів лікування зазначених захворювань, пов'язаних з небажаним ангіонезом або порушенням його регуляції. Також, варіанти реалізації винаходу включають специфічний зв'язувальний агент, що містить, щонайменше, один пептид, обраний із групи, що складається з: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17 важкого ланцюга; і антигензв'язувальних фрагментів таких агентів. Також, відповідно до винаходу передбачені антитіла, що містять зазначені вище поліпептидні послідовності. Зазначені антитіла можуть являти собою поліклональні, моноклональні, химерні, гуманізовані або повнорозмірні антитіла людини. Зазначені антитіла можуть мати як одноланцюгову, так і многоланцюгову структуру. Також передбачені гібридоми, що продукують моноклональні антитіла, а також молекули нуклеїнових кислот, що кодують поліпептиди й антитіла, вектори, що містять зазначені молекули нуклеїнових кислот, і клітини-хазяї, наприклад, клітини CHO, що містять й експресують зазначені вектори. Спосіб створення зв'язувального агента або антитіла згідно із даним винаходом включає трансформацію клітини-хазяїна принаймні однією молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує зв'язувальний агент або антитіло; експресію зазначеної молекули нуклеїнової кислоти в зазначеної клітині-хазяїні; і виділення зазначеного специфічного зв'язаного агента або антитіла. Застосування винаходу в діагностиці включає спосіб визначення рівня ангіопоетину-1 й/або ангіопоетину-2 у біологічному зразку, що включає приведення антитіла або зв'язувального агента, описаного в даній заявці, із зазначеним біологічним зразком; і визначення ступеня зв'язування антитіла або зв'язувального агента із зазначеним зразком. Конкретні способи застосування даного винаходу в терапії включають способи інгібування небажаного ангіонезу (або будь-якої групи станів, що включають небажане утворення кровоносних судин, таких як артеріогенез) у ссавця, що включають введення терапевтично ефективної кількості ізольованих поліпептидів або зв'язувальних агентів, наприклад, антитіл, отриманих з поліпептидів. До випадків зазначеного небажаного ангіонезу (або будь-якої групи станів, що включають небажане утворення кровоносних судин, таких як артеріогенез), відносяться рак і запальні захворювання в ссавця. Таким чином, передбачена фармацевтична композиція, що містить ізольований поліпептид, що зв'язує агент або антитіло відповідно до винаходу, у суміші з фармацевтичним носієм. Очевидно, що для створення зазначених фармацевтичних композицій для введення суб'єктові, що потребує цього, часто використтовують фармацевтично прийнятні допоміжні. Інші способи застосування композицій відповідно до винаходу включають спосіб модулювання або інгібування активності ангіопоетину1 й/або ангіопоетину-2, що включає введення пацієнтові ізольованого поліпептиду, що зв'язує агент або антитіла, описаного в даній заявці. Такі способи модулювання або інгібування активності ангіопоетину-1 й/або ангіопоетину2 включають введення пацієнтові ізольованого поліпептиду, що зв'язує агент або антитіла, описаного в даній заявці. Такі способи включають модулювання, принаймні, одного з наступних процесів: проникність судинабо просочування плазми, у ссавця, що включає введення ссавцеві терапевтично ефективної кількості ізольованого поліпептиду, що зв'язує агент або антитіла, у даній заявці. Також передбачені способи лікування, принаймні, одного з перерахованих нижче захворювань: неоваскулярне захворювання очей, ожиріння, гемангіобластома, гемангіома, артеріосклероз, запальне захворювання, запальні порушення, атеросклероз, ендоматріоз, неопластичне захворювання, захворювання, пов'язані з порушеннями в кістках, або псоріаз. Також передбачений спосіб комбінованої терапії, такий як спосіб лікування рака в ссавця, що включає введення ссавцеві терапевтично ефективної кількості ізольованого поліпептиду, що зв'язує агента або антитіла, описаного в даній заявці, і хемотерапевтичного агента. При застосуванні таких способів, у деяких випадках, ізольований поліпептид, що зв'язує агент або антитіло й хемотерапевтичний агент вводять одночасно, в інших випадках - роздільно в часі, залежно від конкретного стану, дозволу регуляторного органа, і рішення медичних фахівців. Інші види комбінованої терапії включають спосіб лікування рака в ссавця, що включає введення ссавцеві терапевтично ефективної кількості ізольованого поліпептиду, що зв'язує 6 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 агента або антитіла, описаного в даній заявці, і другої молекули, що зв'язується з лігандом будьякого з 1-3 рецепторів VEGF. Приклади зазначених других молекул, що зв'язуються з лігандом будь-якого з 1-3 рецепторів VEGF, включають Авастин®, Люцентис®, і Макуген®. Також передбачене застосування поліпептидів, що зв'язують агентів або антитіла, описані у даній заявці, у сполученні з низькомолекулярними агентами для введення в терапевтичних цілях пацієнтам, що потребують цього. Такі низькомолекулярні агенти включають агенти, що модулюють передачу сигналу кожного з 1-3 рецепторів VEGF, а також агентів, що є інгібіторами мультикінази. Наприклад, передбачене застосування Сутента®, Нексавара®, Дифосфата Мотесаниба, Акситиниба, Зактима, AZD 2171, Рецентина, і AG-013736 у комбінованій терапії з поліпептидами, зв'язуючими агентами або антитілами, описаними в даній заявці передбачене застосування. Окремі варіанти реалізації винаходу відносяться до специфічних зв'язувальних агентів, що містять CDR 1, що має кожну з наведених нижче послідовностей: SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; специфічних зв'язувальних агентів, що містять CDR 2, що має кожну з наведених нижче послідовностей SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; і до специфічних зв'язувальних агентів, що містять CDR 3, що має кожну з наведених нижче послідовностей SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40. Специфічний зв'язувальний агент може містити 1, 2, 3, 4, 5, або 6 гіперваріабельних ділянок. Аналогічним чином, передбачені молекули нуклеїнової кислоти, що кодують зазначені вище специфічні зв'язувальні агенти. Також запропонований спосіб визначення рівня ангіопоетина-1 й/або ангіопоетина-2 у біологічному зразку, що включає приведення специфічного зв'язувального агента, описаного в даній заявці, у контакт із зазначеним біологічним зразком; і у визначенні ступеня зв'язування специфічного зв'язувального агента із зазначеним біологічним зразком. Також, запропонований спосіб визначення рівня ангіопоетина-1 й/або ангіопоетина-2 у біологічному зразку, що включає приведення кожного з антитіл, описаних у даній заявці, у контакт із зазначеним біологічним зразком; і у визначенні ступеня зв'язування антитіла із зазначеним зразком. Згідно ще одному варіанту реалізації даного винаходу, запропоноване антитіло, що містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, причому важкий ланцюг включає гіперваріабельну ділянку, обрану із групи, що складається з: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6 й, SEQ ID NO: 7; і легкий ланцюг включає гіперваріабельну ділянку, обрану із групи, що складається з: SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16 й, SEQ ID NO: 17; а також антигензв'язувальні фрагменти таких агентів. Природно, також передбачені молекули нуклеїнової кислоти, що кодують антитіла, описані вище, і антигензв'язувальні фрагменти таких антитіл. В іншому варіанті реалізації, даний винахід відноситься до ізольованого антитіла, що містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, причому легкий ланцюг включає гіперваріабельну ділянку, і важкий ланцюг включає гіперваріабельну ділянку, і послідовність гіперваріабельної ділянки ланцюга обрана із групи, що складається з: SEQ ID NO: 1,SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, і SEQ ID NO: 7; і при цьому зазначене антитіло специфічно зв'язується принаймні з одним з лігандів, Ang1 й Ang2, рецептора Tie 2. Відповідно до подальшого варіанта реалізації даного винаходу, запропоноване ізольоване антитіло, що містить у складі важкий ланцюг і легкий ланцюг, де легкий ланцюг включає гіперваріабельну ділянку, і важкий ланцюг включає гіперваріабельну ділянку, послідовність гиперваріабельного ділянки в складі легкого ланцюга обрана із групи, що складається з: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, і SEQ ID NO: 17; де зазначене антитіло специфічно зв'язується, щонайменше, з одним з лігандов, Ang1 й Ang2, рецептора Tie 2. У ще одному варіанті реалізації, винахід відноситься до ізольованого антитіла, що містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, причому легкий ланцюг включає гіперваріабельну ділянку, і важкий ланцюг включає гіперваріабельну ділянку, при цьому варіабельна ділянка в складі важкого ланцюга містить 1, 2, або 3 гіперваріабельних ділянок важкого ланцюга (HC CDR), обраних із групи, що складається з гіперваріабельних ділянок важкого ланцюга, що мають послідовності SEQ ID NO: 18, 26, 28, 32, 34, 35, 37, 38 й, 39, і при цьому антитіло специфічно зв'язується щонайменше з одним з лігандов, Ang1 й Ang2, рецептора Tie 2. В іншому варіанті реалізації, винахід спрямований на ізольоване антитіло, що містить у складі важкий ланцюг і легкий ланцюг, де легкий ланцюг включає гіперваріабельну ділянку, і 7 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 важкий ланцюг включає гіперваріабельну ділянку, де варіабельна ділянка в складі важкого ланцюга містить 1, 2, або 3 гіперваріабельних ділянки легкого ланцюга, обраних із групи, що складається з гіперваріабельних ділянок легкого ланцюга, що мають послідовності SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 27, 33, 36, 40, і при цьому антитіло специфічно зв'язується щонайменше з одним з лігандов, Ang1 й Ang2, рецептора Tie 2. Згідно ще одному варіанту реалізації винаходу запропоноване ізольоване антитіло, що містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, причому важкий ланцюг включає варіабельну область важкого ланцюга, і легкий ланцюг включає гіперваріабельну ділянку, де в складі важкого ланцюга перебувають 3 гіперваріабельних ділянки важкого ланцюга (HC CDR), і зазначена варіабельна область у складі легкого ланцюга містить 3 гіперваріабельних ділянки легкого ланцюга (LC CDR), при цьому послідовності зазначених гіперваріабельних ділянок важкого ланцюга й легкого ланцюга антитіла із групи, що складається з: (a) SEQ ID NO: 18, 26, 32 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 19, 27, 33 легкого ланцюга, (b) SEQ ID NO: 18, 26, 34 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 19, 27, 33 легкого ланцюга, (c) SEQ ID NO: 18, 26, 35 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 20, 27, 36 легкого ланцюга, (d) SEQ ID NO: 18, 26, 37 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 19, 27, 33 легкого ланцюга, (e) SEQ ID NO: 18, 26, 38 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 19, 27, 33 легкого ланцюга, (f) SEQ ID NO: 18, 26, 35 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 19, 27, 33 легкого ланцюга, (g) SEQ ID NO: 18, 26, 34 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 21, 27, 33 легкого ланцюга, (h) SEQ ID NO: 18, 28, 39 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 19, 27, 33 легкого ланцюга, (i) SEQ ID NO: 18, 26, 34 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 22, 27, 33 легкого ланцюга, (j) SEQ ID NO: 18, 26, 32 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 22, 27, 33 легкого ланцюга, (k) SEQ ID NO: 18, 29, 39 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 19, 27, 33 легкого ланцюга, (l) SEQ ID NO: 18, 26, 34 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 23, 27, 33 легкого ланцюга, (m) SEQ ID NO: 18, 26, 35 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 20, 27, 40 легкого ланцюга, (n) SEQ ID NO: 18, 26, 32 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 21, 27, 33 легкого ланцюга, (o) SEQ ID NO: 18, 26, 35 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 24, 27, 33 легкого ланцюга, (p) SEQ ID NO: 18, 26, 35 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 21, 27, 33 легкого ланцюга, (q) SEQ ID NO: 18, 26, 35 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 23, 27, 33 легкого ланцюга, (r) SEQ ID NO: 18, 26, 34 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 20, 30, 33 легкого ланцюга, (s) SEQ ID NO: 18, 26, 34 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 25, 27, 33 легкого ланцюга, (t) SEQ ID NO: 18, 26, 35 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 20, 30, 33 легкого ланцюга, (u) SEQ ID NO: 18, 26, 34 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 20, 27, 40 легкого ланцюга, і (v) SEQ ID NO: 18, 26, 34 важкого ланцюга а також SEQ ID NO: 20, 31, 33 легкого ланцюга; при цьому антитіло специфічно зв'язується принаймні з одним з лігандов, Ang1 й Ang2, рецептора Tie 2. Даний винахід також відноситься до антитіла, що містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, причому легкий ланцюг містить варіабельну область легкого ланцюга, що включає три фрагменти LC CDR, обрані з будь-яких, наведених вище, від (a) до (v), і при цьому антитіло специфічно зв'язується принаймні з одним з лігандів, Ang1 й Ang2, рецептора Tie 2. Також, даний винахід відноситься до антитіла, що містить важкий ланцюг і легкий ланцюг, при цьому важкий ланцюг містить варіабельну область важкого ланцюга, що включає три фрагменти НC CDR, обрані з будь-яких, наведених вище, від (a) до (v), і при цьому антитіло специфічно зв'язується щонайменше з одним з лігандов, Ang1 й Ang2, рецептора Tie 2. Також запропоновані молекули нуклеїнової кислоти, що кодують будь-яке зі згаданих вище антитіл й антиген-зв'язувальних фрагментів таких антитіл. Інші варіанти реалізації даного винаходу будуть очевидні з розкриття сутності, наведеного в даній заявці. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР На Фігурі 1 зображений графік зміни розміру пухлини (вісь y) залежно від часу (вісь x) в організмі миші-носія пухлини, яку піддавали впливу або антитіла, спрямованого проти Ang1/2 (H4L4, H4L11, або H6L7) відповідно до винаходу, або високоактивного пептидного антитіла, застосовуваного як контроль (AMG 386), або антитіла 536, у порівнянні з лікуванням з використанням антитіла-контролю ізотипу. Подробиці описані в Прикладах. На Фігурі 2 зображена маса пухлини (% життєздатної пухлини [серединний зріз] x масу пухлини) в організмі миші-носія пухлини, яку піддавали впливу або антитіла, спрямованого проти Ang1/2 (H4L4, H4L11, або H6L7), відповідно до винаходу, або високоактивного пептидного антитіла, застосовуваного як контроль (AMG 386), або антитіла 536, у порівнянні з лікуванням з використанням ізотипічного контролю. Подробиці описані в Прикладах. 8 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На Фігурі 3 зображений вплив H4L4, H4L11 й H6L7 відповідно до винаходу, високоактивного пептидного антитіла, застосовуваного як контроль (AMG 386) і антитіла 536 на проліферацію клітин ендотелію в організмі миші-носія пухлини Colo205. Подробиці описані в Прикладах. На Фігурі 4 зображена залежність відповіді від дози в мишей-носіїв пухлини Colo205 від дози антитіла H4L4. Подробиці описані в Прикладах. На Фігурі 5 показаний вплив антитіла H4L4 на масу пухлини Colo205 in vivo. Подробиці описані в Прикладах. На Фігурі 6 показаний вплив антитіла H4L4 на проліферацію клітин ендотелію в організмі миші-носія пухлини Colo205. Подробиці описані в Прикладах. На Фігурі 7 відображена нейтралізація індукованого Ang1 фосфорилювання Tie2 у легенях миші за допомогою системного введення mL4-3. Мишей (n=3 у групі) піддавали впливу L1-7(N) (2 мг/кг), mL4-3 (20 мг/кг) або контролю Fc (20 мг/кг) щодня протягом 23 днів перед внутрішньовенним введенням Ang1 або БСА. На наступному етапі робили забір легенів миші, і за допомогою аналізу методом Вестерн - блот визначали рівні фосфорилювання Tie2. Наведені дані є середніми значеннями ± SE (стандартна помилка). *P=0.0005 vs Ang1 плюс Fc, ANOVA (дисперсійний аналіз) при використанні апостеріорного критерію Фішера. На Фігурі 8 показано, що фармакологічне інгібування Ang1 у ході раннього органогенезу веде до змін у розвитку серця. A) В ембріонів миші, яких піддали впливу 300 мг/кг mL4-3 (праворуч) були серця менших розмірів, з більш нечисленними, більш вузькими й рідше розташованими трабекулами, у порівнянні із серцями більших розмірів, з великими, часто розташованими трабекулами, що спостерігалися на відповідній стадії експерименту в ембріонів, підданих впливу 300 мг/кг контролю Fc (ліворуч). Наведено показові зображення. B) Частота виникнення аномалій серця в ембріонів, підданих впливу Fc й mL4-3. *P < 0.0001 vs Fc, аналіз по хі-квадрат. На Фігурі 9 показане спільне інгібування Ang1 й Ang2 росту ксенотрансплантатів пухлини Colo205. Мишам (n=10 у групі) імплантували клітини Colo205, і коли пухлини досягали 3 приблизно 500 мм , починали лікування з використанням контролю Fc (5.2 мг/кг QD), mL4-3 (3.2 мг/кг QD), L1-7(N) (2.0 мг/кг QD), L1-7(N) у комбінації з mL4-3 (у тих же режимах дозування, що й у групах, для яких застосовували лікування з використанням одного агента), або AMG 386 (5.6 мг/кг двічі в тиждень). Наведено один із чотирьох показових експериментів. Дані являють собою середні значення ± SE. *P < 0.0001 vs L1-7(N), RMANOVA (дисперсійний аналіз повторних вимірів), оцінка за критерієм Шеффе в повторі. На Фігурі 10 показаний антагоністичний вплив Ang1 й Ang2 на проліферацію пухлинних клітин ендотелію, ангіонез роговиці, і ангіонез сітківки. A) Вплив інгібування Ang1 й Ang2 на поглинання Brd (5-бромдезоксиуридина) у клітках ендотелію миші, отриманих із ксенотрансплантатів пухлини Colo205. Мишей-носіїв пухлини обробляли Fc протягом 3 днів (5.7 мг/кг QD), AMG 386 (в однократній дозі 6 мг/кг), L1-7(N) (2.2 мг/кг QD), mL4-3 (3.5 мг/кг QD), або L1-7(N) у комбінації з mL4-3 (у тих же дозуваннях і за тими самими схемами, які використали в групах з використанням одного агента). Кожна смуга представляє рівні Brd у клітинах ендотелію: загальна кількість клітин миші (n=3). Дані являють собою середні значення ± SE. *P < 0.05 vs. Fc, по однобічному t-критерію Стьюдента. B й C) Вплив інгібування Ang1 й Ang2 на ангіонез роговиці, індукований (B) VEGF й (C) bFGF. Ангіонез індукували шляхом імплантації нейлонових дисків, просочених VEGF або bFGF, у строму роговиці пацюків (n=8 у групі). Лікування починали за один день до корнеальної імплантації й проводили кожні 3 дні із застосуванням: Fc (60 мг/кг), L1-7(N) (5 мг/кг), mL4-3 (60 мг/кг) і L1-7(N) у комбінації з mL4-3 (у тих же дозуваннях і за тими самими схемам, які використали в групах із застосуванням одного † # агента). Дані являють собою середні значення ± SE. P < 0.0001 vs Fc+VEGF (B); P < 0.002 vs Fc+bFGF (C), ANOVA при використанні тесту Фішера в повторі. D) Інгібування Ang2 запобігає неоваскуляції, індукованої киснем, у сітківці миші. Починаючи з P8 дня постнатального періоду, дитинчатам (n=5 у групі) щодня протягом 9 днів підшкірно вводили Fc (200 мг/кг) L1-7(N) (100 мг/кг) mL4-3 (100 мг/кг) або L1-7(N) у сполученні з mL4-3 (у тих же дозуваннях і за тими самими схемами, які використали в групах з використанням одного агента). Дані являють собою середні § значення ± SE. P < 0.0001 vs Fc, ANOVA при використанні тесту Фішера в повторі. На Фігурі 11 показане спільне придушення інгібіторами Ang1 й Ang2 ангіогенезу оваріальних фолікулів. Для індукування суперовуляції в мишей застосовували ХГЧ людини. Fc (300 мг/кг), mL4-3 (150 мг/кг), L1-7(N) (150 мг/kg), або сполучення mL4-3/L1-7(N) (150 мг/кг кожної речовини), що вводять підшкірно (n=7-10 мишей у групі), оцінювали за здатностю запобігати неоваскуляції у фолікулах, що утворюються. Площа кровоносних судин обчислювали по областях окремих фолікулів, пофарбованих за допомогою імунної мітки, напраленої на CD31. Дані являють собою середні значення ± SE. наведено два незалежних експерименти. *P=0.005 у порівнянні з 9 UA 102683 C2 # комбінацією mL4-3/L1-7(N) vs будь-який з агентів, застосований окремо; P < 0.05 vs Fc, ANOVA з апостеріорним критерієм тесту Дуннетта. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Заголовки розділів використані в даній заявці винятково в організаційних цілях, і не мають на увазі під собою яких-небудь обмежень описаного об'єкта винаходу. Для одержання молекул рекомбінантних ДНК, білків й антитіл, а також для культур клітин і трансформації клітин, можна застосовувати стандартні методики. Ферментативні реакції й процедури очищення зазвичай здійснюють відповідно до технічних умов виробника, або відповідно до звичайних методик, що існують у даній галузі, при застосуванні таких стандартних способів, як описані в Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]), або способів, описаних у даній заявці. За винятком випадків, коли наведені особливі визначення, номенклатура, використовувана в даному зв'язку, а також описані в даній заявці методики лабораторних досліджень і методики органічної хімії, синтетичної органічної хімії, і медичної й фармацевтичної хімії, широко відомі й загальноприйняті в даній області. Для хімічного синтезу, хімічного аналізу, готування препаратів і лікарських форм, а також їхньої доставки в організм і лікування пацієнтів застосовуються загальноприйняті способи. Терміни, використовувані для опису винаходу, за винятком випадків, певних особливо в даному тексті, будуть мати значення, що зазвичай розуміється й застосовується в даній області. Варто згадати, що терміни H5 й H5P використовуються взаємозамінно, і відносяться до важкого ланцюга, використовуваного в різних варіантах здійснення винаходу, наприклад, у МАТ, позначуваних як H5L7, H5L6, H5L8, H5L4, H5L11, H5L1, H5L12, і H5L9. Термін "Ang-2" відноситься до поліпептиду, зображеному на Фігурі 6 патенту США № 6,166,185 ("ліганд-2 Tie-2"), включеному в текст даної заявки за допомогою посилання, або до фрагментів такого поліпептиду, до родинних йому поліпептидів, які включають алельні варіанти, варіанти сплайсування, похідні, варіанти, отримані в результаті внесення замін, делеций, і/або вставок, злиті пептиди й поліпептиди, і міжвидові гомологи. Поліпептид Ang-2 може включати або не включати додаткові кінцеві залишки, наприклад, лідерні послідовності, націлювальні послідовності, аміно-кінцевий залишок метіоніну, аміно-кінцеві залишки метіоніну й лізину, і/або послідовності-мітки або послідовності злитих білків, залежно від способу створення. Термін "специфічний зв'язувальний агент" відноситься до молекули, переважно, до білкової молекули, що зв'язує Ang-2, а також Ang-1 (і їхні варіанти й похідні, даного опису) з більшої афінністю, чим інші ангіопоетини. Специфічний зв'язувальний агент може являти собою білок, пептид, нуклеїнову кислоту, вуглеводень, ліпід, або низькомолекулярну речовину, що переважно зв'язується з Ang-2 й Ang-1. У переважному варіанті реалізації, специфічний зв'язувальний агент згідно із даним винаходу являє собою антитіло, наприклад, поліклональне антитіло, моноклональне антитіло (mAb), химерне антитіло, антитіло із щепленими гіперваріабельними ділянками, мультиспецифічне антитіло, біоспецифичне антитіло, каталітичне антитіло, гуманізоване антитіло, антитіло людини, анти-ідиотипичне (anti-Id) антитіло й антитіла, у які може бути внесена мітка в розчинній або зв'язаній формі, а також антиген-зв'язувальні фрагменти таких антитіл, їхні варіанти й похідні, як окремо, так й у сполученні з іншими амінокислотними послідовностями, отримані за допомогою відомих технік. Такі методики включають, але не обмежуються наступними: ферментативне розщеплення, хімічне розщеплення, синтез пептидів і рекомбінантні технології. Специфічні зв'язувальні агенти згідно із даним винаходом, спрямовані проти Ang-2 й Ang-1, здатні зв'язувати області Ang-2 й Ang-1, які модулюють, наприклад, інгібують або сприяють біологічній активності Ang-2 й Ang-1 й/або інші типи активності, пов'язані з Ang-2 й Ang-1. Термін "поліклональне антитіло" відноситься до гетерогенної суміші антитіл, що розпізнають і зв'язують різні епітопи того самого антигену. Поліклональні антитіла можна одержувати з неочищених препаратів сироватки, або вони можуть бути очищені шляхом, наприклад, антигенної афінної хроматографії, або афінної хроматографії з Білком A/Білком G. Термін "моноклональні антитіла" відноситься до ряду антитіл, що кодує одна й та сама молекула нуклеїнової кислоти, припустимо, одержуваних за допомогою однієї гібридоми (або клону гібридоми) або іншої лінії клітин, або за допомогою трансгенного ссавця, таким чином, що кожне моноклональне антитіло зазвичай розпізнавало той самий епітоп у складі антигену. Термін "моноклональне" не обмежений певним способом одержання антитіла, а також не обмежений одержанням у яких-небудь певних видах організмів, наприклад, в організмі миші, пацюка, і т.д. 10 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "химерні антитіла" відноситься до антитіл, у складі яких частина важкого й/або легкого ланцюга є ідентичною або гомологічною до відповідної послідовності в складі антитіла, отриманого в певному виді організмів, або що стосується певного класу або підкласу антитіл, у той час як інша частина ланцюга (ланцюгів) є ідентичною або гомологічною відповідній послідовності в складі антитіла, отриманого в іншому виді організмів, або що стосується іншого класу або підкласу антитіл. Даний термін також включає антигензв'язувальні фрагменти зазначених антитіл, що проявляють бажану біологічну активність (наприклад, здатність специфічно зв'язувати Ang-2). Див. патент США № 4,816,567 й Morrison et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 81:6851-6855 [1985]. Термін "антитіло із щепленою гіперваріабельною ділянкою" відноситься до антитіла, у складі якого гіперваріабельна ділянка (CDR) одного антитіла певного виду організму або ізотипу рекомбінантным шляхом поміщена у каркас іншого антитіла того ж або іншого виду або ізотипу. Термін "мультиспецифічне антитіло" відноситься до антитіла, що містить варіабельні ділянки, що розпізнають більше одного епітопа одного або більше антигенів. Підкласом такого типу є "біспецифічне антитіло", що розпізнає два різних епітопи одного або різних антигенів. "Каталітичні" антитіла означають антитіла, у складі яких одна або більше цитотоксичних, або, у більш загальному випадку, біологічно активних груп приєднані до агента, що зв'язується з мішенню. Термін "гуманізоване антитіло" відноситься до окремого типу антитіла із щепленою гіперваріабельною ділянкою, у складі якої каркасна область антитіла є похідною каркасної області антитіла людини, але кожна гіперваріабельна ділянка заміщена на відповідну ділянку, отриману з організму іншого виду, наприклад, гіперваріабельної ділянки миші. Термін "гіперваріабельна ділянка (CDR)" визначений вище. Термін "повністю людське антитіло" відноситься до антитіла, у складі якого як гіперваріабельна ділянка, так і каркасна ділянка отримані з однієї або більше молекул ДНК людини. Термін "анти-ідиотипове" антитіло відноситься до антитіла, що специфічно зв'язується з іншим антитілом, яке розпізнає антиген. Анти-ідиотипові антитіла можуть бути отримані будьяким зі способів, описаних у даній заявці, які призначені для одержання антитіл, специфічних до Ang-2, за винятком того, що описані антитіла продукуються, наприклад, у відповідь, на імунізацію тварини антитілом, специфічним до Ang-2 або фрагментом такого антитіла, що зв'язує Ang-2, а не самим поліпептидом Ang-2 або його фрагментом. Термін "варіанти" у даному описі включає поліпептиди, амінокислотнийсклад яких відповідає амінокислотній послідовності зв'язувального агента, що зустрічається в природі (або, принаймні, відомого), у яку внесені вставки, делеції, або заміни залишків амінокислот. Варіанти відповідно до винаходу включають білки злиття, описані вище. "Похідні" включають зв'язувальні агенти, піддані хімічній модифікації способом, відмінним від варіантів із внесенням вставок, делецій або замін. "Специфічно зв'язує" відноситься до здатності специфічного зв'язувального агента (такого як антитіло або фрагмент антитіла) згідно із даним винаходом, розпізнавати й зв'язувати зрілий, повнорозмірний поліпептид-мішень або його частину (Ang-2 й Ang-1 згідно із даним винаходом), або ортолог такого поліпептиду, причому афінність (визначена, наприклад, методом ІФА на афінність або в аналізі BIAcore, як описано в даній заявці) або його нейтралізуюча здатність (визначена, наприклад, методом ІФА на нейтралізацію, або подібними методами аналізу) принаймні в 10 разів вище, але, можливо, в 50 разів вище, в 100, 250 або 500 разів вище, або навіть принаймні в 1000 разів вище, ніж афінність або нейтралізуюча здатність зазначеного агента стосовно іншого ангіопоетину або іншого пептиду або поліпептиду. Термін "антигензв'язувальна область (домен)" або "антигензв'язувальна ділянка" відноситься до частини специфічного агента (наприклад, молекули антитіла), що містить амінокислотні залишки специфічного зв'язувального агента (або інші групи), які взаємодіють із антигеном і забезпечують специфічність й афінність зв'язувального агента відносно антигену. У складі антитіла антигензв'язувальну область зазвичай називають гіперваріабельною ділянкою або ділянкою, що визначає комплементарність (CDR). Термін "епітоп" відноситься до частини будь-якої молекули, що може бути розпізнана й зв'язана будь-яким специфічним агентом, наприклад, антитілом, в одній або більше антигензв'язувальних ділянках зв'язувального агента. Епітопи зазвичай складаються з поверхневих груп на молекулі, що мають хімічну активність, таких як, наприклад, бічні ланцюги амінокислот або вуглеводнів, і мають особливі характеристики тривимірної структури, а також особливі характеристики заряду. Термін епітопи в даному описі може відноситься як до епітопів що перекриваються, так і до епітопів, що не перекриваються. Більше того, епітопи можуть 11 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 являти собою "миметики", у випадку, коли вони мають тривимірну структуру, ідентичну структурі епітопа, який використали для створення антитіла, і при цьому не містять, або містять тільки деякі амінокислотні залишки, які виявляють у складі Ang-2, що застосовували для стимуляції імунної відповіді. Термін "інгібуючий й/або нейтралізуючий епітоп "позначає епітоп, дія якого при зв'язуванні специфічним агентом, таким як антитіло, проявляється у втраті (або, щонайменше, зниженні) біологічної активності молекули, клітини, або організму, що несе зазначений епітоп, in vivo, in vitro, або in situ. У контексті даного винаходу, нейтралізуючий епітоп локалізований у біологічно активній ділянці Ang-2 або пов'язаний із зазначеною ділянкою. На противагу цьому, термін "що активує епітоп" відноситься до епітопу, дія якого при зв'язуванні специфічним агентом відповідно до винаходу, таким як антитіло, проявляється в активації Ang-2, або, щонайменше, прийнятті ним біологічно активної конформації. Термін "фрагмент антитіла" відноситься до пептиду або поліпептиду, що менше, ніж повнорозмірне, інтактне антитіло. Повнорозмірні антитіла містять дві функціонально незалежні складові або два фрагменти: антигензв'язувальний фрагмент, називаний "Fab" і карбоксикінцевий фрагмент, що кристалізується, називаний фрагмент "Fc". Фрагмент Fab включає перший константний домен як важкого, так і легкого ланцюга (CH1 й CL1) разом з варіабельними ділянками важкого й легкого ланцюга, що зв'язують специфічний антиген. Кожна варіабельна ділянка в складі як важкого, так і легкого ланцюга, містить три гіперваріабельних і залишки амінокислот каркасної ділянки, що перебувають між окремими гіперваріабельними ділянками. Фрагмент Fc містить другий і третій константні домени важкого ланцюга (CH2 й CH3), і бере участь в ефекторних функціях, наприклад, в активації комплементу й атаці фагоцитів. У деяких варіантах реалізації, фрагменти Fc й Fab розділені "шарнірною областю" антитіла, і, залежно від того, яким чином відбудеться протеолітичне розщеплення, шарнірна область може бути зв'язана або із фрагментом Fab або з Fc. Наприклад, при розщепленні антитіла протеазою папаїном утворюється шарнірна область, пов'язана із фрагментом Fc, тоді як при розщепленні протеазою пепсином утворюється фрагмент, у складі якого шарнірна область одночасно пов'язана з обома фрагментами Fab. Оскільки два фрагменти Fab виявляються, власне кажучи, ковалентно зв'язаними в результаті розщеплення пепсином, одержуваний фрагмент називається фрагмент F(ab')2. Фрагмент Fc може мати відносно тривалий період напівжиття в сироватці, тоді як період напівжиття фрагмента Fab нетривалий. [Capon et al., Nature, 337: 525-31 (1989)] При експресії фрагмента Fc у виді частини злитого білка, його період напівжиття може подовжуватися, або фрагмент може здобувати такі функції, як зв'язування Fc рецептора, зв'язування білка A, фіксація комплементу, і, можливо, навіть плацентарне перенесення у білок, з яким проводили злиття. Фрагмент Fc відповідно до винаходу може являти собою фрагмент Fc, що зустрічається в природі, або модифікований з поліпшенням певних властивостей, наприклад, терапевтичних властивостей, або збільшенням часу циркуляції. Термін "варіабельна область" або "варіабельний домен" відноситься до області легкого й/або важкого ланцюга антитіла, що зазвичай включає, приблизно, від 120 до 130 амінокінцевих амінокислот у складі важкого ланцюга, і, приблизно, 100 до 110 аміно-кінцевих амінокислот у складі легкого ланцюга. Варіабельні області зазвичай сильно розрізняються за амінокислотною послідовностю навіть у межах антитіл одного виду. Варіабельна ділянка антитіла зазвичайно визначає властивості зв'язування й специфічність кожного конкретного антитіла відносно конкретного антигену. Варіабельність послідовності сконцентрована в областях, називаних гіперваріабельними ділянками (CDR), а більш консервативні ділянки в складі варіабельной області називаються каркасними ділянками (FR). Гіперваріабельні ділянки легких і важких ланцюгів містять амінокислоти, які в значній мірі відповідальні за безпосередню взаємодію між антигеном й антитілом, хоча, амінокислоти в складі каркасних ділянок можуть значно впливати на зв'язування/розпізнавання антигену, як обговорюється нижче в даній заявці. Термін "легкий ланцюг" стосовно до антитіла, є збірним терміном, що відноситься до двох різних типів, називаних каппа (k) і лямбда (l), залежно від амінокислотних послідовностей константних областей. Термін "важкий ланцюг" стосовно до антитіла є збірним терміном, що відноситься до п'яти різних типів, називаним альфа, дельта, епсилон, гама й мю, залежно від амінокислотної послідовності константної області важкого ланцюга. П'ять відомих класів антитіл виділені за принципом сполучення важкого й легкого ланцюгів: IgA, IgD, IgE, IgG і IgM, відповідно, включаючи чотири відомих підкласи IgG, позначуваних як IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4. 12 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "зустрічається в природі" (природний) стосовно до біологічних речовин, таким як молекули нуклеїнової кислоти, поліпептиди, до клітин-хазяїв, і т.д., відноситься до речовин, клітин, і т.д., що виявляються у природі й не модифікованій людині. Термін "ізольований" стосовно до Ang-2 або специфічного агента, що зв'язує Ang-2, відноситься до речовини, вільної, принаймні, від одного контамінируючого поліпептиду, або до речовини, що виявляється переважно в природних умовах, по суті вільній від будь-яких контамінируючих поліпептидів ссавців, які можуть перешкоджати терапевтичному або діагностичному застосуванню. Термін "зрілий" стосовно до Ang-2, антитілу до Ang-2 або будь-якого білкового специфічного агента, що зв'язує Ang-2, відноситься до пептиду або поліпептиду, у складі якого відсутня лідерна або сигнальна послідовність. При експресії зв'язувального агента відповідно до винаходу, наприклад, у прокариотичній клітині, "зрілий" пептид або поліпептид також може включати додаткові залишки амінокислот (але не включати при цьому лідерну послідовність) таких, як аміно-кінцевий залишок метіоніну, або один або більше залишків метіоніну або лізину. Пептид або поліпептид, отриманий таким способом, можна застосовувати як без видалення з нього додаткових залишків амінокислот, так і після їхнього видалення. Специфічні зв'язувальні агенти й антитіла Термін "специфічний зв'язувальний агент" у даному описі відноситься до молекули, що має специфічність у розпізнаванні й зв'язуванні з Ang-2 й Ang-1, як описано в даній заявці. Підходящі специфічні зв'язувальні агенти включають, але не обмежуються перерахованими: антитіла й похідні антитіл, поліпептиди й низькомолекулярні речовини. Підходящі специфічні зв'язувальні агенти можуть бути отримані способами, відомими в даній області. Типовий поліпептидний агент згідно із даним винаходом зв'язувальний Ang-2 й Ang-1, здатний до зв'язування певної ділянки поліпептидів Ang-2 й Ang-1, і переважно - до модулювання активності або функцій поліпептидів Ang-2 й Ang-1. Специфічні зв'язувальні агенти, такі як антитіла й фрагменти антитіл, специфічно зв'язувальні поліпептиди Ang-2 й Ang-1, включені в обсяг даного винаходу. Антитіла можуть являти собою поліклональні антитіла, включаючи моноспецифічні поліклональні, моноклональні (mAb, МАТ), рекомбінантні, химерні, гуманізовані, такі як антитіла із щепленими гіперваріабельними ділянками, антитіла людини, одноланцюгові, каталітичні, мультиспецифічні й/або біспецифічні, а також передбачені антигензв'язувальні фрагменти, варіанти, і/або похідні описаних антитіл. Поліклональні антитіла, спрямовані проти поліпептидів Ang2 й Ang1, у загальному випадку одержують в організмі тварин (наприклад, кроликів, хом'яків, кіз, овець, коней, свиней, пацюків, піщанок, морських свинок, мишей, або будь-якого іншого підходящого ссавця, а також в організмі інших видів, що не відносяться до ссавців) шляхом багаторазових підшкірних або внутрішньочеревинних ін'єкцій поліпептиду Ang-2 й/або Ang-1 або його фрагмента, з ад'ювантом або без нього. Такі ад'юванти включають, без обмежень наступні: повний і неповний ад'ювант Фрейнда, мінеральні гелі, такі як гідроксид алюмінію, і поверхнево-активні речовини, такі як лізолецитин, плюронилові багатоатомні спирти, поліаніони, пептиди, масляні емульсії, гемоцианін лімфи равлика, і динитрофенол. Потенційно придатні для людини ад'юванти являють собою БЦЖ (бацила Кальметта-Герина) і Corynebacterium parvum. Також можна застосовувати сполучення поліпептидного антигену з білком-переносником, що є імуногенним для видів, які піддають імунізації, наприклад, гемоцианіном лімфи равлика, сироваткою, альбуміном, бичачим тироглобуліном або інгібітором трипсину з бобів сої. Також для посилення імунної відповіді можна застосовувати агенти, що викликають агрегацію, наприклад, квасці. Після імунізації, тварин знекровлюють, і сироватку досліджують на титр антитіл до поліпептиду Ang-2, який можна визначити за допомогою аналізів, описаних у даній заявці в розділі "Приклади". Поліклональні антитіла можна застосовувати в сироватці, де вони детектовані, або вони можуть бути виділені із сироватки, шляхом, наприклад, афінної хроматографії з антигеном, або афінної хроматографії з білком А або білком G. Моноклональні антитіла до поліпептидів Ang-2 можуть бути отримані, наприклад, традиційним методом "гібридом" або більш нової техніки "фагового відображення", але не обмежуючись зазначеними методами. Наприклад, моноклональні антитіла згідно із даним винаходом можуть бути отримані методом гібридом, описаного в Kohler et al., Nature 256:495 [1975]; the human B-cell hybridoma technique [Kosbor et al., Immunol Today 4:72 (1983); Cote et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 80: 2026-2030 (1983); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987)] і технології гібридом, трансформованих EBV [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R 13 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Liss Inc, New York N.Y., pp 77-96, (1985)]. Також, згідно із даним винаходом, запропоновані лінії клітин гібридоми, продукуючих моноклональні антитіла, реакційно-здатні відносно поліпептидів Ang-2. При використанні технології гібридом, можна застосовувати лінії клітин міеломи. Такі лінії клітин, що підходять для застосування в процедурах злиття з утворенням гібридом, переважно є не-антитілоутворюючими, мають високу ефективність злиття, і є дефіцитними по ферментах, що забезпечує нездатність до росту на певних селективних середовищах, що підтримують ріст тільки необхідних злитих клітин (гібридом). Прикладами ліній клітин, застосовуваних для процедур злиття в організмі миші, є Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 й S194/5XX0 Bul; до ліній клітин, застосовуваним для процедур злиття в організмі миші, відносяться R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F й 4B210. Іншими лініями клітин, що підходять для процедур злиття, є U-266, GM1500GRG2, LICR-LON-HMy2 й UC729-6. Гібридоми й інші лінії клітин, які продукують моноклональні антитіла, розглядаються як нові композиції згідно із даним винаходом. Технологію фагового дисплея також можна застосовувати для одержання моноклональних антитіл в організмі будь-якого виду. Переважно, зазначену технологію застосовують для одержання повнорозмірних моноклональних антитіл людини, у складі яких поліуклеотид, що кодує один фрагмент антитіла, Fab або Fv, експресується на поверхні частки фага. [Hoogenboom et al., J Mol Biol 227: 381 (1991); Marks et al., J Mol Biol 222: 581 (1991); див. також патент США №. 5,885,793)]. Можна провести "скринінг" кожного фага з використанням методів аналізу, описаних у даній заявці, для визначення фрагментів антитіл, що мають афінність до Ang-2. Отже, зазначені процедури імітують імунну селекцію за допомогою подання набору фрагментів антитіла на поверхні нитковидного бактеріофага, і наступній селекції фага за ознакою зв'язування з Ang-2. Один подібний алгоритм із застосуванням зазначеного підходу описаний у попередній заявці на патент № PCT/US98/17364, поданої від імені Adams et al., у якій описане виділення фрагментів високоафінного й функціонально агоністичного антитіла до рецепторів MPL- і msk. Із застосуванням цього підходу, можна створити повний набір генів антитіл людини шляхом клонування перебудованих природним шляхом генів V людини з лімфоцитів периферичної крові, як було описано раніше [Mullinax et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 87: 8095-8099 (1990)]. Після визначення полінуклеотидних послідовностей, що кодують кожен ланцюг повнорозмірного моноклонального антитіла, або фрагмента (фрагментів) Fab або Fv відповідно до винаходу, клітини-хазяї, як еукаріотичні, так і прокаріотичні, можна використати для експресії полінуклеотидів моноклонального антитіла, з використанням рекомбінантних технологій, широко відомих і рутинно застосовуваних у даній області. Також як варіант, одержують трансгенних тварин шляхом введення полінуклеотиду, що кодує специфічний зв'язувальний агент відповідно до винаходу, у геном тварини-реципієнта, наприклад, у геном миші, кролика, козла, або корови, способом, що забезпечує можливість експресії полінуклеотидних молекул, що кодують моноклональне антитіло або інший специфічний зв'язувальний агент. Відповідно до одного аспекту винаходу, полінуклеотиди, що кодують моноклональне антитіло або інший специфічний зв'язувальний агент, можна з'єднати з регуляторними послідовностями, специфічними для молочної залози, і химерні полінуклеотиди можна ввести в зародкову клітину тварини-мішені. Отримана трансгенна тварина буде продукувати необхідне антитіло в складі молока [Pollock et al., J Immunol Meth 231:147-157 (1999); Little et al., Immunol Today 8:364-370 (2000)]. Також, на додаток, для експресії й одержання специфічних агентів, що зв'язують Ang-2, наприклад, моноклональних антитіл, можна застосовувати рослини; із цією метою підходящі рослини трансфікують полінуклеотидами, які кодують моноклональні антитіла або інші специфічні зв'язувальні агенти. В іншому варіанті реалізації даного винаходу, моноклональне або поліклональне антитіло, або його фрагмент, отриманий в організмі виду, що не відноситься до виду людин, можна "гуманізувати" або "химеризувати". Способи гуманізації антитіл, що не є антитілами людини, добре відомі в даній області. (див. патент США №. 5,859,205, 5,585,089, і 5,693,762). Гуманізацію здійснюють, наприклад, способами, відомими в даній області [Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)] шляхом заміни, щонайменше, частини, гіперваріабельних ділянок (CDR), наприклад, антитіла гризуна, на відповідні ділянки антитіла людини. Також, відповідно до винаходу запропоновані варіанти й похідні зазначених антитіл людини, обговорюваних у даній заявці добре відомих у даній області. Також винахід включає повністю людські антитіла, що зв'язують поліпептиди Ang-2, а також антигензв'язувальні ділянки, варіанти й/або похідні зазначених поліпептидів. Такі антитіла 14 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можуть бути отримані з використанням методики фагового дисплея, описаної вище. Також, як варіант, для створення таких антитіл можна використати трансгенних тварин (наприклад, мишей), здатних продукувати репертуар антитіл людини під час відсутності ендогенного вироблення імуноглобулінів. Цього можна досягти шляхом імунізації тварини антигеном Ang-2 або його фрагментами, за умови, що такі фрагменти мають унікальну для Ang-2 амінокислотну послідовність. Такі імуногени при необхідності можна кон'югувати із носієм. Див., наприклад, Jakobovits et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 90: 2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno, 7:33 (1993). Відповідно до одного способу, таких трансгенних тварин одержують шляхом вимикання ендогенних локусів, які кодують важкі й легкі ланцюги імуноглобуліну тварини, і введення в геном тварини локусів, що кодують білки важкого й легкого ланцюга людини. Після цього схрещують частково модифікованих тварин, які несуть менш, ніж повний набір зазначених модифікацій, з одержанням тварини, що має всі необхідні модифікації імунної системи. При введенні імуногена, такі трансгенні тварини здатні виробляти антитіла з варіабельними областями людини, включаючи амінокислотні послідовності людини (а не, наприклад, миші), які є імуноспецифічними відносно необхідних антигенів. Див. попередню заявку на патент США № PCT/US96/05928 й PCT/US93/06926. Додаткові способи описані в патенті США № 5,545,807, попередній заявці № PCT/US91/245, PCT/GB89/01207 й в EP 546073B1 й EP 546073A1. Антитіла людини також можна одержувати шляхом експресії рекомбінантної ДНК у клітинах-хазяїнах або шляхом експресії в клітинах гібридоми, як описано в тексті даної заявки. Трансгенез здійснюють декількома різними шляхами. Див., наприклад, Bruggeman et al., Immunol Today 17:391-7 (1996). Відповідно до одного підходу, конструюють мінілокус, у якому сегменти гена в конфігурації зародкової лінії штучно розташовують близько один до одного. Через обмеження в розмірі (наприклад, маса, зазвичай, менш 30 кб), підсумковий мінілокус містить обмежену кількість різних сегментів гена, але зберігає здатність до продукування великого набору антитіл. Мінілокуси, що містять тільки послідовності ДНК людини, включаючи промотори й енхансери, повноцінно функціонують у геномі трансгенної миші. Якщо потрібна трансгенна тварина з більшою кількістю сегментів генів, застосовують штучні хромосоми дріжджів (YAC). Розміри YAC можуть варіювати від кількох сотень кілобаз до 1 Mb, і їх вводять у геном миші (або іншої підходящої тварини) шляхом мікроін'єкції безпосередньо в яйцеклітину або шляхом переносу YAC у лінії ембріональних стовбурних клітин (СК). У загальному випадку, YAC вносять у СК шляхом ліпофекції очищеної ДНК, або злиття сферопластів дріжджів, де очищену ДНК переносять у міцелах, і злиття здійснюють способом, аналогічним описаному в протоколах злиття гібридом. Селекцію СК відповідно до винаходу після переносу ДНК проводять шляхом включення до складу YAC кожного із селективних маркерів, відомих у даній області. Як інший варіант, застосовують вектори на основі бактеріофага P1, які ампліфікують у бактеріальній клітині-хазяїні E. coli. Оскільки зазначені вектори несуть менше внесеної ДНК, чим YAC, клони спочатку вирощують із досить високим виходом для здійснення прямої мікроін'єкції в яйцеклітину. Було показано, що застосування сумішей різних векторів P1 дозволяє досягти високих рівнів гомологічної рекомбінації. Після виявлення підходящої трансгенної миші (або іншої підходящої тварини) із застосуванням кожної з відомих методик визначення рівнів антитіла, що циркулює в сироватці (наприклад, методу твердофазного ІФА), трансгенну тварина схрещують із мишею, у геномі якої був виключений локус ендогенних Ig. У результаті одержують потомство, в організмі якого по суті всі В-клітини продукують антитіла людини. У ще одному варіанті, локус, що кодує Ig тварини, цілком заміщають на локус, що кодує Ig людини, і отримана тварина продукує тільки антитіла людини. Відповідно до іншого способу, ділянки локусу генома тварини заміщають специфічними й відповідними ділянками локусу генома людини. В окремих випадках тварини, отримані із застосуванням зазначеної методики, можуть експресувати химерні антитіла, на противагу повністю людським антитілам, залежно від типу заміни в локусі генома миші, що кодує Ig. Також антитіла людини шляхом впливу на спленоцити (B- або T-клітини) людини антигеном in vitro, і наступного відтворення "навчених" клітин в організмі миші з імунною недостатністю, наприклад, SCID (ТКИН) або nod/SCID. Див. Brams et al., J Immunol, 160: 2051-2058 [1998]; Carballido et al., Nat Med, 6: 103-106 [2000]. Відповідно до одного способу, приживлення зародкової тканини людини в організм миші SCID (SCID-hu) стимулює стабільний гемопоез і розвиток Т-клетин людини [McCune et al., Science 241:1532-1639 (1988); Ifversen et al., Sem Immunol 8:243-248 (1996)]. Будь-яка гуморальна імунна відповідь у таких химерних мишей повністю залежить від спільного розвитку T-клітин в організмі [Martensson et al., Immunol 15 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 83:1271-179 (1994)]. Відповідно до іншого способу, лімфоцити периферичної крові людини внутрішньочеревинним (або іншим) шляхом трансплантують миші SCID [Mosier et al., Nature 335:256-259 (1988)]. При впливі на трансплантовані клітини або ініціюючої (праймуючим) агентом, таким як ентероітоксин A стафілокока (SEA) [Martensson et al., Immunol 84: 224-230 (1995)], або будь-яке моноклональне антитіло до сироватки людини, що несе маркер CD40[Murphy et al., Blood 86:1946-1953 (1995)], досягають більш високих рівнів продукції Bклітин. Відповідно до іншого способу, повністю синтетичний репертуар важкого ланцюга людини одержують із не перегрупованих (не перебудованих) сегментів гена V шляхом зборки кожного сегмента VH людини із сегментами D з випадково обраних нуклеотидів разом із сегментом J людини [Hoogenboom et al., J Mol Biol 227:381-388 (1992)]. Подібним чином, одержують набір легкого ланцюга, шляхом об'єднання кожного сегмента V людини із сегментом J [Griffiths et al., EMBO J 13:3245-3260 (1994)]. Нуклеотиди, що кодують повне антитіло (тобто, і важкий, і легкий ланцюг) зв'язують у єдиний Fv фрагмент одного ланцюга, і отриманий полінуклеотид легують з нуклеотидом, що кодує білок оболонки нитковидного бактеріофага. При експресії описаного злитого білка на поверхні фага, полінуклеотид, що кодує специфічне антитіло, визначають шляхом селекції із застосуванням імобілізованого антигену. Згідно ще одному способу, фрагменти антитіла поєднують як два фрагменти Fab шляхом злиття одного ланцюга з білком фага й секреції іншої в периплазматичний простір бактерії [Hoogenboom et al., Nucl Acids Res 19:4133-4137 [1991]; Barbas et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 88:7978-7982 (1991)]. Широкомасштабне виробництво химерних, гуманізованих, CDR-щеплених, і повністю людських антитіл, або антигензв'язувальних областей антитіл людини зазвичай здійснюють за допомогою методів рекомбінації. Полінуклеотидну послідовність (послідовності), що кодує важкий і легкий ланцюг кожного антитіла, можна ввести в клітину-хазяїна й експресувати із використанням речовин і способів, описаних у тексті даної заявки. У переважному варіанті реалізації, антитіла одержують уклітинах-хазяїнах організму ссавця, наприклад, у клітинах CHO. Подробиці зазначеного способу одержання наведені в даному описі. До складу специфічних зв'язувальних агентів згідно із даним винаходом, таких як антитіла, фрагменти антитіл і похідні антитіл відповідно до винаходу далі можна включити будь-яку відому константну область. Константна область у складі легкого ланцюга може належати, наприклад, до типу каппа або лямбда константних областей легкого ланцюга, наприклад, константна область легкого ланцюга антитіла людини типу каппа або лямбда. Константна область у складі важкого ланцюга може являти собою константну область важкого ланцюга типу альфа, дельта, епсилон, гама або мю, наприклад, константну область важкого ланцюга антитіла людини типу альфа, дельта, епсилон, гама або мю. В одному варіанті реалізації, константні області в складі важкого або легкого ланцюга являють собою фрагмент, похідне, варіант або мутеїн константної області, що зустрічається в природі. В одному варіанті реалізації, специфічні зв'язувальні агенти відповідно до винаходу, такі як антитіла, фрагменти антитіл, і похідні антитіл, включають IgG. Відомі методики одержання антитіла іншого підкласу або ізотипу з антитіла відповідно до винаходу, тобто, перемикання підкласу. Так, наприклад, можна одержати антитіло IgG з антитіла IgM, і навпаки. Такі методики дають можливість одержувати нові антитіла, що мають антигензв'язувальні властивості даного антитіла (батьківського антитіла), але біологічні властивості, що також проявляють, властиві ізотипу або підкласу антитіла, відмінного від батьківського антитіла. Можливе застосування методик рекомбінантної ДНК. В описаних процесах можна застосовувати клоновану ДНК, що кодує специфічні поліпептиди антитіла, наприклад, ДНК, що кодує константну область антитіла необхідного ізотипу. Див. також Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-16. Специфічні зв'язувальні агенти згідно із даним винаходом, такі як антитіла, фрагменти антитіл, і похідні антитіл відповідно до винаходу, можуть включати константну область важкого ланцюга IgG1 або фрагмент області важкого ланцюга IgG1. Антитіла, фрагменти антитіл, і похідні антитіл відповідно до винаходу, можуть далі включати константну область легкого ланцюга каппа або лямбда або фрагменти константних областей. Константні області легкого ланцюга й полінуклеотиди, що кодують їх, наведені нижче. В одному варіанті реалізації, антитіла, фрагменти антитіл, і похідні антитіл відповідно до винаходу, додатково включають константну область важкого ланцюга або її фрагмент, наприклад, константну область важкого ланцюга IgG2, також наведену нижче в даному документі. Нуклеїнова кислота (ДНК), що кодує константні області важкого й легкого ланцюга, а також амінокислотні послідовності константних областей важкого й легкого ланцюгів наведені нижче в 16 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 даній заявці. Можна здійснювати злиття варіабельних областей лямбда з константними областями лямбда, і здійснювати злиття варіабельних областей каппа з константними областями каппа. Послідовність ДНК константної області важкого ланцюга IgG2 (SEQ ID NO: 41): gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtca aggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcag gactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaac accaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttc cccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtc cagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtca gcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgaga aaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggt cagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagac cacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctc atgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga Послідовність білка константної області важкого ланцюга IgG2 (SEQ ID NO: 42): ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKE YKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Послідовність ДНК константної області легкого ланцюга Каппа (SEQ ID NO: 43): cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataactt ctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagca aggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccat cagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag Послідовність Білка константної області легкого ланцюга Каппа (SEQ ID NO: 44): RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Послідовність ДНК константної області легкого ланцюга Лямбда (SEQ ID NO: 45): ggccaaccgaaagcggcgccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcata agtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaa acaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtca cgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatag Послідовність білка константної області легкого ланцюга Лямбда (SEQ ID NO: 46): GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNK YAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS Специфічні зв'язувальні агенти згідно із даним винаходом, такі як антитіла, фрагменти антитіл і похідні антитіл відповідно до винаходу, включають молекули, що містять, наприклад, наступні комбінації варіабельних областей: H6L7, H5L7, H4L13, H11L7, H4L7, H10L7, H5L6, H2L7, H5L8, H6L8, H3L7, H5L4, H4L12, H6L6, H4L2, H4L6, H4L4, H5L11, H5L1, H4L11, H5L12, H5L9 необхідного ізотипу (наприклад, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, і IgD), а також їхні фрагменти Fab або F(ab")2. Більше того, у випадку, якщо необхідним ізотипом є IgG4, також може знадобитися введення точечної мутації в шарнірну область, як описано в Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407 (включеної в даний документ за допомогою посилання) для зниження тенденції до формування дисульфідних зв'язків усередині H ланцюга, що може призвести до появи гетерогенності антитіл IgG4. Додаткова Корисна Інформація про Послідовності Наступні послідовності ізотипов Ig1, Ig2, Ig3, і Ig4 застосовують у сполученні з послідовностями варіабельних областей важких ланцюгів антитіл згідно із даним винаходом з одержанням конкретного необхідного ізотипу зазначеного антитіла: 17 UA 102683 C2 5 IgG1 Людини ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK IgG2 Людини 10 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKE YKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 15 IgG3 Людини 20 25 30 35 40 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPE PKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK IgG4 Людини ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Послідовності важкого ланцюга антитіл згідно із даним винаходом у формі IgG2 Наступні послідовності являють собою послідовності важких ланцюгів антитіл згідно із даним винаходом у формі IgG2. Послідовності легких ланцюгів ті ж, що наведено в Прикладах. Підкреслені ділянки послідовностей являють собою послідовності IgG2: H2 evqlvqsgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvsyisssgstieyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavy ycardlldydiltgygywgqgtlvtvssASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVA GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVV SVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK 45 50 H3 evqlvqsgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvsyisssgstiqyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedt avyycardlldydiltgygywgqgtlvtvssASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPP VAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR VVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK 18 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 H6 evqlvqsgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvsyisssgstiyyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedt avyycardlldydiytgygywgqgtlvtvssASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPP VAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR VVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK H10 evqlvqsgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvsyisssgstiyyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedt avyycardlldydiltgyglwgqgtlvtvssASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPV AGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK H11 evqlvqsgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvsyisssgstiyyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedt avyycardlldydiltgygmwgqgtlvtvssASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPP VAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR VVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK H4 evqlvqsgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvsyisssgstiyyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedt avyycardlldydlltgygywgqgtlvtvssASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPP VAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR VVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK H5 evqlvqsgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvsyisssgstiyyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedt avyycardlldydiwtgygywgqgtlvtvssASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAP PVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF RVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK 45 50 55 60 Партнери специфічних зв'язувальних агентів по злиттю Згідно ще одному варіанту реалізації, можливо здійснювати злиття поліпептидів, що містять амінокислотну послідовність варіабельних областей антитіл до Ang-2, наприклад, варіабельної області важкого ланцюга, з амінокислотною послідовністю, описаною в даній заявці, як за N-, так і за C-кінцем, з однієї або більше областю фрагмента Fc IgG людини. При вбудовуванні Fcфрагмента в одну конструкцію з терапевтичним білком, наприклад, Fab або антитілом, специфічним до Ang-2, Fc фрагмент може подовжувати період напівжиття або забезпечити такі функції, як зв'язування рецептора Fc, зв'язування білка A, фіксація комплементу й, можливо, навіть плацентарне перенесення. [Capon et al., Nature, 337: 525-531 (1989)]. В одному прикладі, можливо здійснюють злиття шарнірної області антитіла, областей CH2 й CH3 як по N-, так і по C-кінцю специфічних зв'язувальних агентів, таких як фрагменти Fab або Fv, спрямованих проти Ang-2 (отримані, наприклад, з бібліотеки фагового відображення), з використанням методів, відомих фахівцеві в даній області. Отриманий злитий білок може бути очищений з використанням афінної колонки з білком A або білком G. Було виявлено, що пептиди або білки, злиті з Fc фрагментом, мають значно більш тривалий період напівжиття in 19 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 vivo, чим їхні аналоги, не піддані злиттю. Також, злиття Fc фрагментом дозволяє здійснювати димеризацію/мультимеризацію злитого поліпептиду. Fc-фрагмент може являти собою Fcфрагмент, що зустрічається в природі, або він може бути модифікований з поліпшенням певних властивостей, наприклад, терапевтичних властивостей, часу циркуляції, зниженням проблем, пов'язаних з агрегацією, і т.д. Інші відомі в даній області приклади включають Fc-фрагмент, можливо, отриманий з організму людини або інших видів, або, можливо, синтезований, злитий з N-кінцем CD30L, для лікування хвороби Ходжкіна, анапластичної лімфоми й T-клітинної лейкемії (патент США № 5,480,981), і Fc фрагмент, злитий з рецептором ФНО, для лікування септичного шоку [Fisher et al., N Engl J Med, 334: 1697-1702 (1996)], а також Fc-фрагмент, злитий з рецептором Cd4, для лікування СНІДу [Capon et al., Nature, 337: 525-31 (1989)]. Каталітичні антитіла являють собою інший тип злитих молекул і включають антитіла, у складі яких до специфічного зв'язувального агента приєднана одна або більше молекул, що мають цитотоксичну активність, або, у більше загальному випадку, одну або більше біологічно активних молекул. Див., наприклад, Rader et al., Chem Eur J 12:2091-2095 (2000). Цитотоксичні агенти такого типу поліпшують опосередковувану антитілом цитотоксичність, і включають такі молекули, як цитокіни, які прямо або опосередковано стимулюють загибель клітин, радіоізотопи, хемотерапевтичні препарати (включаючи проліки), бактеріальні токсини (наприклад, екзотоксин псевдомонад, дифтерійний токсин, і т.д.), рослинні токсини (наприклад, рицин, гелонин, і т.д.), хімічні кон'югаты (наприклад, майтансиноїди, калихеаміцин, і т.д.), радіокон'югати, кон'югати ферментів (кон'югати РНКази, фермент/пролекова терапія антитілами направленої дії [ADEPT)]) і т.п. Відповідно до одного аспекту, цитотоксичний агент може бути "приєднаний" до одного компонента біспецифічного або мультиспецифічного антитіла шляхом зв'язування зазначеного агента з одним з альтернативних сайтів розпізнавання антигену на поверхні антитіла. Як альтернативний варіант, білкові цитотоксини можна експресувати у формі білків, злитих зі специфічним зв'язувальним агентом, після чого полінуклеотид, що кодує токсин, легують з полінуклеотидом, що кодує зв'язувальний агент. Ще одним альтернативним варіантом є ковалентна модифікація специфічного зв'язувального агента із включенням необхідного цитотоксину. Прикладами таких злитих білків є імуногенні поліпептиди, білки з тривалим періодом напівжиття, такі як константні області імуноглобулінів, маркерні білки, білки або поліпептиди, що сприяють очищенню необхідного поліпептидного специфічного зв'язувального агента, і послідовності поліпептидів, що сприяють утворенню мультимерних білків (наприклад, мотиви лейцинових "блискавок", корисні в утворенні димерів і доданні їм стабільності). Такий варіант, одержуваний шляхом вставок, зазвичай містить нативну молекулу цілком, або її істотну частину, приєднану за N- або C-кінцем до другого цілого поліпептиду або до його частини. Наприклад, злиті білки зазвичай включають лідерні послідовності, отримані з інших видів, для рекомбінантної експресії білка в гетерологічному хазяїні. Інший корисний злитий білок включає додаткову імунологично активну область, наприклад, епітоп антитіла, що сприяє очищенню злитого білка. Введення сайту розщеплення в область злиття, або поруч із нею, буде сприяти видаленню чужорідного поліпептиду після очищення. Інші корисні продукти злиття включають функціональні області, наприклад, активних сайтів ферментів, областей глікозилювання, сигналів клітинного націлювання або трансмембранних ділянок. Існують різні комерційно доступні системи для експресії білків злиття, які можна застосовувати згідно із даним винаходом. Особливо корисні системи включають, але не обмежуються наступними: система, що включає глутатіон-S-трансферазу (GST) (Pharmacia), система, що включає зв'язуючий мальтозу білок (NEB, Beverley, MA), система FLAG (IBI, New Haven, CT), і система 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA). Зазначені системи дозволяють продукувати рекомбінантні поліпептиди, що включають лише дуже невелику кількість додаткових амінокислот, які є небажаними через можливість впливу на антигенні властивості рекомбінантного поліпептиду. Наприклад, системи FLAG й 6xHis додають лише короткі послідовності, обидві мають слабку антигенність, і не впливають на згортання поліпептиду в нативну конформацію. Інше злиття за N-кінцем, що розглядається як корисне, являє собою приєднання дипептиду Met-Lys дипептиду в N-кінцевій ділянці білка або пептидів. Таке злиття може призвести до сприятливого підвищення рівня експресії або активності білка. Особливо ефективною може бути злита конструкція, у складі якої пептидний специфічний зв'язувальний агент злитий з гаптеном (напівантигеном) з підвищенням антигенності злитої конструкції специфічного зв'язувального агента, що корисно, наприклад, при створенні антиідиотипічних антитіл згідно із даним винаходом. Такі злиті конструкції з підвищеною імуногенністю добре відомі фахівцям у даній області, наприклад, злиття специфічного зв'язувального агента з хелперним антигеном, таким як hsp70 або пептидними 20 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовностями, наприклад, з ланцюга дифтерійного токсину або цитокіну, такого як IL-2, забезпечить стимуляцію імунної відповіді. В інших варіантах реалізації, можна створити злиту конструкцію, що буде поліпшувати націлювання композиції з антигензв'язувальним агентом на специфічний сайт або клітину. Також запропоновані інші злиті конструкції, що включають гетерологічні поліпептиди з бажаними властивостями, наприклад, константну область Ig, використовувану для збільшення періоду напівжиття, або антитіло або фрагмент антитіла, використовувані для націлювання. Інші злиті системи дозволяють одержувати гібриди поліпептидів, для яких необхідне відділення партнера по злиттю від поліпептиду відповідно до винаходу. В одному варіанті реалізації, молекула партнера по злиттю пов'язана з рекомбінантним поліпептидним специфічним зв'язувальним агентом послідовністю пептиду, що містить специфічну послідовність, розпізнавану протеазою. Приклади підходящих послідовностей являють собою послідовності, розпізнавані протеазою вірусу гравірування тютюну (Life Technologies, Gaithersburg, MD) або Фактором Xa (New England Biolabs, Beverley, MA). Також відповідно до винаходу запропоновані злиті поліпептиди, що включають цілу варіабельну область антитіла до Ang-2 або її частина, наприклад, варіабельну область важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовністю, наведену в даному описі, варіабельна область легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, наведену в даному описі, у комбінації з укороченим тканевым фактором (tTF), агентом, що направлено впливає (націлює) на судини, який складається з укороченої форми білка, яка викликає коагуляцію, що функціонує як агент, що коагулює, у кровоносних судинах пухлини. Злиття tTF з антитілом до Ang-2, або його фрагментами, може сприяти доставці агента, спрямованого проти Ang-2, до клітинок-мішеней. Варіанти Специфічних Зв'язувальних Агентів Варіанти Специфічних зв'язувальних Агентів згідно із даним винаходу включають варіанти, отримані шляхом вставок, делецій, і/або замін. В одному аспекті винаходу, запропоновані варіанти, одержувані шляхом вставки, у складі яких послідовність специфічного зв'язувального агента доповнена одним або більше залишками амінокислот. Вставки можуть бути внесені на будь-якому кінці білка, або по обох кінцях, або у внутрішні області амінокислотної послідовності специфічного зв'язувального агента. Варіанти, отримані шляхом вставок, з додатковими залишками амінокислот на кожному з кінців, або на обох кінцях, можуть включати, наприклад, злиті білки й білки, що містять амінокислотні мітки. Варіанти, отримані шляхом вставок, включають поліпептидні специфічні зв'язувальні агенти, до амінокислотної послідовності яких доданий один або більше залишок амінокислоти, або їхні фрагменти. Варіантні продукти відповідно до винаходу також включають зрілі форми специфічних зв'язувальних агентів. Зі складу таких форм специфічного зв'язувального агента вилучені лідерні або сигнальні послідовності, але кінцевий білок містить аміно-кінцеві залишки, також як поліпептид Ang-2 дикого типу. Додаткові аміно-кінцеві залишки можуть бути отримані з іншого білка, або вони можуть включати один або більше залишків, які ідентифіковані як отримані з конкретного білка. Передбачено форми специфічного зв'язувального агента з додатковим залишком метіоніну в положенні -1 (Met-1-специфічний зв'язувальний агент), а також форми специфічного зв'язувального агента з додатковими залишками метіоніну й лізину в положеннях -2 -1 -2 і -1 (Met -Lys - специфічний зв'язувальний агент). Варіанти специфічних зв'язувальних агентів з додатковими залишками Met, Met-Lys, Lys (загалом, один або більше основний залишок) особливо ефективні для збільшення продукції рекомбінантного білка в бактеріальних клітинах-хазяїнах. Також винахід включає варіанти специфічних зв'язувальних агентів, що містять додаткові залишки амінокислот, отримані шляхом застосування специфічних систем експресії. Наприклад, застосування комерційно доступних векторів, експресуючих поліпептид відповідно до винаходу у формі частини продукту злиття із глутатион-S-трансферазою (GST), дозволяє одержувати поліпептид відповідно до винаходу, що містить додатковий залишок гліцину в положенні амінокислот -1 після відщіплення компонента GST від поліпептиду відповідно до винаходу. Також передбачені варіанти, утворені шляхом експресії в інших системах експресії, включаючи системи, у яких в амінокислотну послідовність внесені полі-гістидинові мітки, зазвичай в карбокси- і/або аміно-кінцева ділянка послідовності. Варіанти, одержувані шляхом вставок, також включають злиті білки, описані вище, де карбокси- або аміно-кінцева ділянка поліпептидного специфічного зв'язувального агента злита з іншим поліпептидом, або його фрагментом, або з амінокислотними послідовностями, не ідентифікованими як послідовності якого-небудь специфічного білка. 21 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому аспекті винаходу запропоновані варіанти, отримані шляхом делеції, у яких один або більше залишків амінокислот у складі поліпептиду специфічного зв'язувального агента вилучені. Делеції можуть бути здійснені в одному кінці або в обох кінцях поліпептиду специфічного зв'язувального агента, або шляхом видалення одного або більше залишків з послідовності специфічного зв'язувального агента. Варіанти, отримані шляхом делеції, обов'язково включають всі фрагменти поліпептиду специфічного зв'язувального агента. Фрагменти антитіл включають ділянки антитіл, що зв'язуються з епітопом на поліпептиді антигену. Приклади таких фрагментів включають фрагменти Fab й F(ab´) 2, отримані, наприклад, шляхом ферментативного або хімічного розщеплення повнорозмірних антитіл. Інші зв'язувальні агенти включають агенти, отримані з використанням технології рекомбінантної ДНК, наприклад, шляхом експресії рекомбінантних плазмид, що містять послідовності нуклеїнових кислот, що кодують варіабельні області антитіла. Винахід також охоплює фрагменти поліпептидів агента, що зв'язує Ang-2, які зберігають здатність специфічно зв'язувати поліпептид Ang-2. Передбачено фрагменти, що складаються з 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або 50 або більше амінокислот пептиду або поліпептиду згідно із даним винаходом. Переважні фрагменти поліпептиду проявляють імунологічні властивості, характерні для антигензв'язувального агента відповідно до винаходу. Фрагменти відповідно до винаходу, що мають бажані імунологічні властивості, можуть бути отримані кожним з методів, добре відомих і рутинно застосовуваних у даній області. У ще одному аспекті винаходу запропоновані варіанти специфічних зв'язувальних агентів відповідно до винаходу, одержувані шляхом заміни. Варіанти, одержувані шляхом заміни, зазвичай вважають "аналогічними" вихідному поліпептиду або що мають певний "відсоток ідентичності" з вихідним поліпептидом, і включають поліпептиди, у складі яких один або більше амінокислотних залишків вилучені й замінені на альтернативні залишки. В одному аспекті, заміни є консервативними по природі, проте, обсяг винаходу також охоплює не консервативні заміни. Ідентичність і подібність родинних поліпептидів можна з легкістю розрахувати з використанням відомих методів. Такі методи включають, але не обмежуються методами, описаними в Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); and Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Переважними способами визначення споріднення або відсотка ідентичності двох поліпептидів є способи, що дозволяють визначити максимальний збіг двох досліджуваних послідовностей. Способи визначення ідентичності описані в загальнодоступних комп'ютерних програмах. Переважні способи визначення ідентичності двох послідовностей, забезпечувані комп'ютерними програмами, включають, але не обмежуються наступними: пакет програм GCG, включаючи GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). Програма BLASTX загальнодоступна в Національному Центрі Біотехнологічної Інформації (NCBI) і інших джерелах (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., supra (1990)). Широко відомий алгоритм СмітаВатермана також можна застосовувати для визначення ідентичності. Деякі схеми зіставлення, призначені для зіставлення двох амінокислотних послідовностей, можуть давати збіги лише коротких ділянок двох послідовностей, і така невелика вирівняна ділянка може мати дуже високу ідентичність у послідовностях, навіть якщо між двома повнорозмірними послідовностями відсутнє істотне споріднення. Відповідно, в окремих варіантах реалізації, застосування обраного методу зіставлення (програми GAP) буде призводити до зіставлення, що охоплює, щонайменше, десять відсотків повної довжини порівнюваного поліпептида-мішени тобто, щонайменше, 40 сусідніх амінокислот, у випадку, коли довжина порівнюваних амінокислотних послідовностей становить, щонайменше, 400 амінокислот, 30 сусідніх амінокислот, у випадку, коли довжина порівнюваних послідовностей перебуває в проміжку від 300 до, приблизно, 400 амінокислот, щонайменше, 20 сусідніх амінокислот, у випадку, коли довжина порівнюваних послідовностей перебуває в проміжку від 200 до, приблизно, 300 амінокислот, і, щонайменше, 10 сусідніх амінокислот, у випадку, коли довжина порівнюваних послідовностей перебуває в проміжку від 100 до 200 амінокислот. Наприклад, шляхом застосування комп'ютерного алгоритму GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), два поліпептиди, для яких потрібно визначити відсоток 22 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ідентичності послідовностей, вирівнюють для оптимального збігу відповідних амінокислот ("ділянка зіставлення", як визначено алгоритмом). В окремих варіантах реалізації, у сполученні з алгоритмом застосовують штраф за відкриття пробілу (який зазвичай розраховують як 3Х середню діагональ; "середня діагональ" являє собою середнє значення використовуваної матриці порівняння; "діагональ" представляє номер, визначений для кожної завершеної пари амінокислот у конкретній матриці порівняння) і штраф на продовження пробілу (який зазвичай становить 1/10 штрафу за відкриття пробілу), а також матрицю порівняння, наприклад PAM 250 або BLOSUM 62. В окремих варіантах реалізації, алгоритмом також застосовується стандартна матриця порівняння (див. Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978) для матриці порівняння PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992) для матриці порівняння BLOSUM 62). В окремих варіантах реалізації, параметри для порівняння послідовності поліпептиду включають наступні: Алгоритм: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970); Матриця порівняння: BLOSUM 62 from Henikoff et al., supra (1992); Штраф за пробіл у послідовності: 12 Штраф за подовження пробілу: 4 Гранична Подібність: 0 Програма GAP може бути корисна при введенні зазначених вище параметрів. В окремих варіантах реалізації, параметри, зазначені вище, є параметрами за замовчуванням при порівнянні поліпептидів (разом з відсутністю штрафу за кінцеві пробіли) при застосуванні алгоритму GAP. В окремих варіантах реалізації, параметри для порівняння послідовності молекули полінуклеотиду включають наступні: Алгоритм: Needleman et al., supra (1970); Матриця порівняння: відповідності = +10, невідповідність = 0 Штраф за пробіл у послідовності: 50 Штраф за подовження пробілу: 3. Програма GAP також можна застосовувати із зазначеними вище параметрами. Параметри, зазначені вище, є параметрами за замовчуванням при порівнянні молекул полінуклеотиду. Можливе застосування інших прикладів алгоритмів, штрафів за внесення пробілу, штрафів на продовження делеції, матриць порівняння, порогів подібності й т.д., включаючи наведені в Посібнику з Роботи із Програмою Пакета Wisconsin, Версія 9, Вересень, 1997. Вибір у конкретних випадках буде зрозумілий фахівцям у даній області, і буде залежати від конкретного здійснюваного порівняння, наприклад, ДНК-ДНК, білок-білок, білок-ДНК; і, також, чи здійснюють порівняння даних пар (у цьому випадку, зазвичай, кращими є GAP або BestFit) або порівняння послідовності й великої бази даних послідовностей (у цьому випадку переважними є FASTA або BLASTA). Двадцять стандартних амінокислот й їхньої абревіатури, використовувані в даному описі, відповідають загальноприйнятій номенклатурі. Див. Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), внесений у даний документ за допомогою посилання з будь-якою метою. Амінокислоти можуть мати форму L- або D- стереоізомерів (за винятком Gly, що не має L й D стереоізомерів), і поліпептиди й композиції поліпептидів згідно із даним винаходом можуть містити сполучення стереомірних варіантів. Проте, стереохімія L є переважною. Також, відповідно до винаходу запропоновані звернені молекули, у складі яких аміно-кінцева послідовність амінокислот замінена на карбокси-кінцеву. Наприклад, поворот молекули з нормальною послідовністю X1-X2-X3 буде виглядати як X3-X2-X1. Також, відповідно до винаходу запропоновані звернені молекули, у складі яких, як описано вище, аміно-кінцева послідовність амінокислот замінена на карбокси-кінцеву, і залишки, які в нормі перебувають у стані енантіомерів "L", замінені на стереоізомерную форму "D". Стереоізомери (наприклад, D-амінокислоти) двадцяти стандартних (незамінних) амінокислот, неприродних амінокислот, наприклад, (-, (-дизаміщених амінокислот, N-алкіл амінокислот, молочної кислоти, й інших нестандартних амінокислот також можуть бути придатними як компоненти поліпептидів згідно із даним винаходом. Приклади нестандартних амінокислот включають, без обмежень, наступні: аміноадипінова кислота, бета-аланін, бетаамінопропіонова кислота, аміномасляна кислота, піперидинова кислота, амінокапронова кислота, аміногептанова кислота, аміноізомасляна кислота, амінопимелинова кислота, диаміномасляна кислота, десмозин, диамінопимелинова кислота, диамінопропіонова кислота, N-етилгліцин, N-етиласпарагін, гідроксилізин, ало-гідроксилізин, гідроксипролін, ізодесмозин, 23 UA 102683 C2 5 10 15 20 ало-ізолейцин, N-метилгліцин, саркозин, N-метилізолейцин, N-метилвалин, норвалін, норлейцин, оритин, 4-гідроксипролін, (-карбоксиглутамат, (-N,N,N-триметиллізин, (-Nацетиллізин, O-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формілметионін, 3-метилгистидин, 5-гідролізин, (-N-метиларгинін, й інші двійники амінокислот та амінокислоти (наприклад, 4-гідроксипролін). Також, якщо не зазначено зворотного, лівий кінець одноланцюгових полінуклеотидних послідовностей являє собою 5' кінець; лівий напрямок (проти годинникової стрілки) позначений як 5' напрямок. Напрямок від 5' до 3' зростаючих транскриптів РНК позначено як напрямок транскрипції; ділянки послідовності на ланцюзі ДНК, що мають таку ж послідовність, що й РНК, і розташовуються від 5' до 3' кінцю транскрипту РНК позначені як "послідовності "вище по ходу транскрипції"; ділянки послідовності на ланцюзі ДНК, що мають таку ж послідовність, що й РНК, і розташовуються від 3' до 5' кінця транскрипту РНК позначені як " послідовності "нижче по ходу транскрипції". Консервативні заміни амінокислот можуть охоплювати не амінокислотні залишки, що зустрічаються в природі, які зазвичай вносять шляхом пептидного хімічного синтезу скоріше, ніж шляхом синтезу в біологічних системах. Такі молекули включають пептидоміметики й інші реверсовані або інверсовані форми амінокислотних залишків. Залишки, що зустрічаються в природі, можна розділити на класи на основі властивостей бічних ланцюгів: 1) гідрофобні: Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) нейтральні гідрофільні: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) кислотні: Asp, Glu; 4) основні: His, Lys, Arg; 5) залишки, що впливають на орієнтацію ланцюга: Gly, Pro; і 6) ароматичні: Trp, Tyr, Phe. 25 30 35 40 45 50 55 60 Наприклад, не консервативні заміни можуть включати заміну представника одного з перерахованих класів на представника іншого класу. Такі заміщені залишки можна вводити в області антитіла людини, що є гомологічними антитілами, отриманими не з організму людини, або в не гомологічні області молекули. При внесенні зазначених змін, відповідно до окремих варіантів реалізації, може бути необхідно врахувати гідропатичний індекс амінокислот. Для кожної амінокислоти був визначений гідропатичний індекс на основі її гідрофобності й характеристик заряду. Такі індекси дорівнюють: ізолейцин (+4.5); валин (+4.2); лейцин (+3.8); фенілаланін (+2.8); цистеїн/цистин (+2.5); метіонін (+1.9); аланін (+1.8); гліцин (-0.4); треонін (-0.7); серин (-0.8); триптофан (-0.9); тирозин (-1.3); пролін (-1.6); гістидин (-3.2); глутамат (-3.5); глутамін (-3.5); аспартат (-3.5); аспарагін (-3.5); лізин (-3.9); і аргінін (-4.5). Важливість гідропатичного індексу в доданні інтерактивної біологічної функції білку відома в даній області. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Відомо, що окремі амінокислоти можна заміщати на інші амінокислоти з подібним гідропатичним індексом або значенням зі збереженням подібної біологічної активності. При внесенні змін на основі гідропатичного індексу, в окремих варіантах реалізації, передбачені заміни амінокислот, значення гідропатичних індексів яких перебувають у границях ±2. В окремих варіантах реалізації, передбачені значення гідропатичних індексів таких амінокислот, що перебувають у границях ±1, і, в окремих варіантах реалізації, передбачені значення гідропатичних індексів таких амінокислот, що перебувають у границях ±0.5. Також у даній області відомо, що заміни аналогічних амінокислот можна ефективно здійснювати на основі гідрофільності, особливо у випадках, коли біологічно активний білок або пептид, одержуваний за допомогою таких замін, призначений для застосування в імунологічних варіантах реалізації, як у даному випадку. В окремих варіантах реалізації, максимальна локальна середня гідрофільність білка, що визначається гідрофільністю складових його амінокислот, корелює з імуногенністю й антигенністю білка, тобто, з його біологічними властивостями. Далі наведені значення гідрофільності, які були визначені для наступних амінокислотних залишків: аргінін (+3.0); лізин (+3.0); аспартат (+3.0±1); глутамат (+3.0±1); серин (+0.3); аспарагін (+0.2); глутамін (+0.2); гліцин (0); треонін (-0.4); пролін (-0.5±1); аланін (-0.5); гістидин (-0.5); цистеїн (-1.0); метіонін (-1.3); валін (-1.5); лейцин (-1.8); ізолейцин (-1.8); тирозин (-2.3); фенілаланін (-2.5) і триптофан (-3.4). При внесенні змін на основі значень гідрофільності, в окремих варіантах реалізації передбачені заміни амінокислот, значення гідрофільності яких перебувають у границях ±2. В окремих варіантах реалізації, передбачені значення гідрофільності таких амінокислот, що перебувають у границях ±1, і, в окремих варіантах 24 UA 102683 C2 реалізації, передбачені значення гідрофільності таких амінокислот, що перебувають у границях ±0.5. Також на основі гідрофільності можна визначити епітопи первинних амінокислотних послідовностей. Такі області також позначають як "корові області епітопа". Приклади замін амінокислот наведені в Таблиці 1. 5 Таблиця 1 Заміни Амінокислот Вихідні Залишки Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val 10 15 20 25 30 Приклади Замін Val, Leu, Ile Lys, Gln, Asn Gln, Glu, Asp Glu, Gln, Asn Ser, Ala Asn, Glu, Asp Asp, Asn, Gln Pro, Ala Asn, Gln, Lys, Arg Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucine Norleucine, Ile, Val, Met, Ala, Phe Arg, 1,4 Diamino-butyric Acid, Gln, Asn Leu, Phe, Ile Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Ala Thr, Ala, Cys Ser Tyr, Phe Trp, Phe, Thr, Ser Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucine Кращі Заміни Val Lys Gln Glu Ser Asn Asp Ala Arg Leu Ile Arg Leu Leu Gly Thr Ser Tyr Phe Leu Фахівець у даній області зможе визначити підходящі варіанти поліпептиду згідно даному опису із використанням відомих методик. У деяких варіантах реалізації, фахівець у даній області може визначити підходящі області молекули, у які можна внести зміни без порушення активності дільниць-мішеней, що не вважаються важливими для біологічної активності. У деяких варіантах реалізації, можна визначити залишки й частини молекул, що є консервативними для подібних поліпептидів. В окремих варіантах реалізації, навіть області, які можуть мати значення в біологічній активності або в структурі, можна піддавати консервативним замінам амінокислот без порушення біологічної активності або без значного впливу на структуру поліпептиду. Також, фахівець у даній області може ознайомитися зі структурно-функціональними дослідженнями з визначення залишків у складі подібних поліпептидів, що мають важливе значення для активності або структури поліпептидів. З метою проведення такого порівняння, можна передбачити значення амінокислотних залишків у складі білка, який буде відповідати амінокислотним залишкам, що мають важливе значення для активності або структури подібних білків. Фахівець у даній області може зробити вибір серед хімічних замін амінокислот для таких передбачуваних значимих амінокислотних залишків. Фахівець у даній області також може аналізувати тривимірну структуру й амінокислотну послідовність у порівнянні із цими ж параметрами подібних поліпептидів. З огляду на таку інформацію, фахівець у даній області може прогнозувати зіставлення амінокислотних залишків антитіла відповідно до його тривимірної структури. В окремих варіантах реалізації, фахівець у даній області може не проводити радикальних змін в амінокислотних залишках, виходячи із прогнозу, розташованих на поверхні білка, тому що такі залишки можуть бути залучені у важливі взаємодії з іншими молекулами. Більше того, фахівець у даній області може розробити експериментальні варіанти, що містять одну амінокислотну заміну в кожного необхідного амінокислотного залишка. Потім можна провести скринінг варіантів шляхом застосування 25 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 аналізів активності, відомих фахівцям у даній області. Такі варіанти можна використати для збору інформації про корисні варіанти. Наприклад, якщо дослідник з'ясував, що заміна на конкретний залишок призвела до порушеної, небажано зниженої, або невідповідної активності, варіантів з такою заміною можна уникати. Інакше кажучи, на основі інформації, отриманої в кожному з рутинних експериментів, фахівець у даній області може з легкістю визначити, у яких випадках варто уникати подальших замін як окремо, так й у сполученні з іншими мутаціями. Ряд наукових публікацій був присв'ячений прогнозуванню вторинної структури. Див. Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 й Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Більш того, у цей час доступні комп'ютерні програми, що допомагають передбачати вторинну структуру. Один спосіб прогнозування вторинної структури заснований на моделюванні гомології. Наприклад, два поліпептиди або білка, які мають ідентичність послідовності більше 30 %, або подібність вище 40 % часто мають подібні структурні топології. Недавнє розростання бази даних білкових структур (PDB) надало більшу передбачуваність вторинної структури, включаючи потенційну кількість складок усередині структури поліпептиду або білка. Див. Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Було припущено, що (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)) існує обмежена кількість складок у даному поліпептиді або білку, і коли буде розшифроване критичне число структур, прогнозування структури стане значно більш точним. Додаткові способи прогнозування вторинної структури включають "нарізку" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1):15-19 (1996)), "аналіз профілю" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)), і "еволюційне сполучення" (див. Holm, supra (1999), and, supra (1997)). В окремих варіантах реалізації, варіанти антитіла включають варіанти, отримані шляхом гліколізування, де число й/або тип сайтів гліколізування змінюють відповідно до амінокислотних послідовностей батьківського поліпептиду. В окремих варіантах реалізації, варіанти білка містять більше або менше число N-зв'язаних сайтів гліколізування, чим нативний білок. Nзв'язаний сайт гліколізування характеризується послідовністю: Asn-X-Ser або Asn-X-Thr, де амінокислотний залишок, позначений як X, може бути будь-яким амінокислотним залишком за винятком проліну. Заміна амінокислотних залишків зі створенням такої послідовності надає потенційно новий сайт для додавання N-зв'язаного вуглеводного ланцюга. Як альтернативний варіант, заміни, що порушують таку послідовність, будуть призводити до видалення існуючого N-зв'язаного вуглеводного ланцюга. Також запропоновано реаранжирування N-зв'язаних вуглеводних ланцюгів, де один або більше N-зв'язаних сайтів гліколізування (що зазвичай зустрічаються в природі) вилучено, і один або більше N-зв'язаних сайтів створено.Додаткові переважні варіанти включають варіанти цистеїну, де один або більше залишків цистеїну вилучений або заміщений на іншу амінокислоту (наприклад, на серин) у порівнянні з батьківською амінокислотною послідовністю. Варіанти цистеїну можуть бути корисні, коли не потрібно, щоб антитіла згортались у біологічно активну конформацію, як після видалення нерозчинних антитіл включення. Варіанти цистеїну зазвичай мають менше амінокислотних залишків, чим нативний білок, і зазвичай містять парне число залишків для зведення до мінімуму взаємодій, що виникають через наявність непарного цистеїну. Відповідно до деяких варіантів реалізації, амінокислотними замінами є: (1) що знижують чутливість до протеолізу, (2) що знижують чутливість до окислювання, (3) що змінюють афінність зв'язування з утворенням білкових комплексів, (4) що змінюють афінності зв'язування, і/або (5) що надають або змінюють інші функціональні властивості таких поліпептидів. Відповідно до деяких варіантів реалізації, можна зробити одну або кілька замін амінокислот (в окремих варіантах реалізації, замін консервативних амінокислотних залишків) у послідовності, що зустрічається в природі (в окремих варіантах реалізації, у ділянці молекукли поліпептиду, що перебуває поза областю (областями), що утворюють міжмолекулярні контакти). В окремих варіантах реалізації, заміна консервативної амінокислоти, зазвичай, значно не змінює структурні параметри батьківської послідовності (наприклад, заміна амінокислоти не повинна зруйнувати спіраль батьківської послідовності, або порушувати інші типи вторинної структури, характерної для батьківської послідовності). Приклади прийнятих у даній області техніки вторинних і третинних структур описані в Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden 26 UA 102683 C2 5 and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); і Thornton et at. Nature 354:105 (1991). Молекули специфічних з'єднуючих агентів, що згідно із даним винаходом є молекулами поліпептидів або варіантів поліпептидів, отриманих шляхом внесення заміни, можуть містити до, приблизно, десяти або дванадцяти відсотків вихідної амінокислотної послідовності. Для варіантів антитіла важкий ланцюг може містити 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, або 1 заміну амінокислоти, тоді як легкий ланцюг може містити 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, або 1 заміну амінокислоти. 10 15 20 25 30 Похідні Специфічних Єднальних Агентів Відповідно до винаходу також запропоновані похідні поліпептидів специфічного зв'язувального агента. Похідні включають поліпептиди специфічних зв'язувальних агентів, що містять модифікації, відмінні від вставок, делецій або замін амінокислотних залишків. Переважними є модифікації, що ковалентні за структурою, і включають, наприклад, хімічне сполучення з полімерами, ліпідами, іншими органічними й неорганічними молекулами. Похідні відповідно до винаходу можна створювати із продовженням періоду напівжиття поліпептиду специфічного зв'язувального агента, або вони можуть бути призначені для поліпшення здатності направленості на клітини, тканини й органи, відповідно до винаходу. Крім того, винахід включає похідні зв'язувальних агентів, що ковалентно модифіковані із приєднанням одного або більше водорозчинних полімерів, наприклад, поліетиленгліколю, поліоксиетиленгліколю, або поліпропіленгліколю, як описано в патентах США № 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 й 4,179,337. Також, до корисних полімерів, відомих у даній області, відносяться монометокси-поліетиленгліколь, декстран, целюлоза, або інші полімери на основі вуглеводнів, полі-(N-вініл піролідон)-гомополімери поліетиленгліколю, пропіленгліколю, сополімер поліпропіленоксиду/етиленоксиду, поліоксиетиловані поліоли (наприклад, гліцерол) і полівініловий спирт, а також суміші перерахованих полімерів. Особливо переважними є продукти специфічних зв'язувальних агентів, що ковалентно модифіковані за допомогою субодиниць поліетиленгліколю (ПЕГ, PEG). Можна утворювати зв'язку з водорозчинними полімерами в специфічних положеннях, наприклад, в аміно-кінці продуктів специфічних зв'язувальних агентів, або довільно приєднувати до одного або більше бічних ланцюгів поліпептиду. Застосування ПЕГ для поліпшення терапевтичних властивостей специфічного зв'язувального агента й гуманізованих антитіл, зокрема, описано в патенті США № 6, 133, 426 to Gonzales et al., виданому 17 жовтня, 2000. 35 40 45 50 55 60 Сайти-Мішені для Мутагенезу Антитіл Дляманіпуляцій із власними властивостями специфічного антитіла до Ang-1 й/або Ang-2-, такими як афінність антитіла до його мішені, можна застосовувати певні стратегії. Такі стратегії включають застосування сайт-спрямованого або випадкового мутагенезу молекули полінуклеотиду, яка кодує антитіло, з одержанням варіантів антитіл, за яким йде етап скринінгу, призначений для виявлення варіантів антитіла, що містять необхідну заміну, наприклад, підвищену або знижену афінність. Залишки амінокислот, які найчастіше є мішенями в стратегіях мутагенезу, знаходяться у гіперваріабельних ділянках. Як описано вище, такі області містять залишки, що по суті взаємодіють з Ang-1 й/або Ang-2 й інші амінокислоти, що впливають на просторове розташування таких залишків. Проте, було показано, що амінокислоти в каркасній ділянці варіабельних ділянок поза гіперваріабельними ділянками також вносять істотний вклад в антигензв'язувальні здатності антитіла, і можуть служити мішенню для маніпуляцій з такими властивостями. Див. Hudson, Curr Opin Biotech, 9:395-402 (1999) і наведені в ній посилання. Бібліотеки варіантів антитіл меншого розміру й піддані більше ефективному скринінгу можна одержувати шляхом обмеження випадкового або сайт-направленого мутагенезу в сайтах CDR, які відповідають областям, підданим "супер-мутации" у ході соматичного процесу афінного дозрівання. Див. Chowdhury and Pastan, Nature Biotech, 17: 568-572 [1999] і наведені в них посилання. Типи відомих елементів ДНК, що визначають сайти супер-мутації, включають прямі й зворотні повтори, окремі консенсусні послідовності, вторинні структури і паліндроми. Консенсусні послідовності ДНК включають чотирьохосновну послідовність Пурин-G-піримідинA/T (тобто, A або G-G-C або T-A або T) і кодон серину AGY (де Y може являти собою C або T). Отже, відповідно до одного варіанта реалізації даного винаходу, запропоновані стратегії мутагенезу, метою яких є підвищення ступеню зв'язування цього антитіла мішенню. Такі стратегії включають мутагенез цілої варіабельної області важкого й легкого ланцюга, мутагенез 27 UA 102683 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тільки ділянок, мутагенез консенсусних сайтів супермутації в межах гіперваріабельних ділянок, мутагенез областей рамки зчитування, або будь-яку комбінацію перерахованих способів ("мутагенез" у даному контексті може носити випадковий або сайт-направлений характер). Можна виконати повне картування гіперваріабельних ділянок і визначення залишків, що складають сайт зв'язування антитіла з визначенням структури антитіла, і комплексу антитілоліганд із використанням відомої фахівцям у даній області, наприклад, рентгенівської кристалографії. Різні способи, засновані на аналізі й характеристиці кристалічних структур зазначених антитіл, відомі фахівцям у даній області, і можливо їхнє застосування для приблизного, неточного, розрахунку гіперваріабельних ділянок. Приклади таких зазвичай застосовуваних методів включають Kabat, Chothia, Ab й і контактні алгоритми. Позначення Kabat засновані на варіабельності послідовності, і найчастіше застосовуються для прогнозування структури гіперваріабельних ділянок. [Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 28: 214-8 (2000)]. Алгоритм Chothia заснований на локалізації петель у структурі. [Chothia et al., J Mol Biol, 196: 901-17 (1986); Chothia et al., Nature, 342: 877-83 (1989)]. Алгоритм Ab є проміжним варіантом між алгоритмами Kabat й Chothia. Ab являє собою цілісний набір програм для моделювання структури антитіла, зроблений Оксфордскою Молекулярною Групою [Martin et al., TM Proc Natl Acad Sci (USA) 86:9268-9272 (1989); Rees, et al., ABM , комп'ютерна програма для моделювання варіабельних областей антитіл, Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd.]. Набір Ab моделює третинну структуру антитіла за первинною послідовностю шляхом використання комбінації баз даних знань і неемперичних методів. Додатковий алгоритм, відомий як контактний алгоритм. [MacCallum et al., J Mol Biol, 5:732-45 (1996)], був введений у недавній час. Цей алгоритм заснований на аналізі доступних складних кристалічних структур. Гіперваріабельні ділянки важкого ланцюга прийнято позначати H1, H2 й H3, й їх послідовно нумерують один по одному, рахунок ведуть від аміно-кінця до карбоксильного кінця. Гіперваріабельні ділянки легкого ланцюга прийнято позначати L1, L2 й L3 і їх послідовно нумерують один по одному, рахунок ведуть від аміно-кінця до карбоксильного кінця. CDR-H1 має в довжину, приблизно, від 10 до 12 залишків, і зазвичай починається через 4 залишки після Cys, відповідно до позначень Chothia й Ab, або через 5 залишку після, відповідно до алгоритму Kabat. Після H1 зазвичай йде Trp, зазвичай Trp-Val, але також Trp-Ile, або Trp-Ala. Довжина H1 складається з, приблизно 10-12 залишків відповідно до алгоритму Ab, тоді як алгоритм Chothia виключає останні 4 залишки. CDR-H2 зазвичай починається через 15 залишків після закінчення H1 відповідно до позначень Kabat й Ab. Залишками, що передують H2, зазвичай є Leu-Glu-Trp-Ile-Gly, але існують деякі варіації. Після H2 зазвичай йде амінокислотна послідовність Lys/ArgLeu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala. Відповідно до алгоритму Kabat, довжина H2 становить, приблизно, 16-19 залишків, тоді як алгоритм Ab передбачає 9-12 залишків у довжину. CDR-H3 зазвичай починається через 33 залишку після закінчення H2, і йому зазвичай передує амінокислотна послідовність (зазвичай Cys-Ala-Arg). Після H3 зазвичай йде амінокислотна послідовність-Gly. Довжина H3 може бути будь-якою, у проміжку від 3 до 25 залишків. CDR-L1 зазвичай починається, приблизно, з 24 залишку, і зазвичай йде за залишком Cys. Залишком після CDR-L1 завжди є Trp, що зазвичай є початком послідовності Trp-Tyr-Gln, TrpLeu-Gln, Trp-Phe-Gln, або Trp-Tyr-Leu. Довжина CDR-L1 становить, приблизно, від 10 до 17 залишків. Пунитивный CDR-L1 для антитіл відповідно до винаходу чітко слідує цьому патерну із залишком Cys, за яким йдуть 15 амінокислот, і потім Trp-Tyr-Gln. CDR-L2 починається, приблизно, через 16 залишків після закінчення L1. Зазвичай, він йде за залишками Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys або Ile-Phe. Довжина CDR-L2 становить, приблизно, 7 залишків. CDR-L3 зазвичай починається через 33 залишки після закінчення L2, і зазвичай, йде за Cys. Після L3 зазвичай йде амінокислотна послідовність Phe-Gly-XXX-Gly. Довжина L3 становить, приблизно, від 7 до 11 залишків. У даній області описані різні способи модифікації антитіл. Наприклад, патент США № 5,530,101 (to Queen et al., June 25, 1996) описує способи одержання гуманізованих антитіл, у складі яких послідовність каркасної ділянки варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого імуноглобуліну на 65 % - 95 % ідентична послідовності каркасної ділянки варіабельної області важкого ланцюга донорного імуноглобуліну. Кожний гуманізований ланцюг імуноглобуліну зазвичай буде містити, на додаток до гіперваріабельних ділянок амінокислоти з каркасної ділянки донорного імуноглобуліну, які, наприклад, здатні взаємодіяти з ділянками CDR з порушенням зв'язувальної здатності, наприклад, одна або більше амінокислот, які безпосередньо примикають до CDR у складі донорного імуноглобуліну, або в межах 3 ангстрем, 28