Людські антитіла до людського, подібного до tnf ліганду 1a (tl1a)

Реферат: Винахід стосується виділеного людського антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, що специфічно зв'язують і нейтралізують активність людського TNF-подібного ліганду 1A (hTL1A), що містять три гіперваріабельні ділянки важкого ланцюга та три гіперваріабельні ділянки легкого ланцюга (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 та LCDR3), що містяться у парі послідовностей варіабельної ділянки важкого ланцюга (НСVR)/варіабельної ділянки легкого ланцюга (LCVR), вибраній з групи, яка складається з послідовностей SEQ ID NO:2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/116, 118/126, 134/136, 138/146, 154/156, 158/166, 174/176, 178/186, 194/196, 198/206, 214/216, 218/226 та 234/236. UA 110041 C2 (12) UA 110041 C2 UA 110041 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Даний винахід стосується людських антитіл і антигензв'язуючих фрагментів людських антитіл, які специфічно зв'язують людський, подібний до TNF ліганд 1А (hTL1A), і терапевтичних способів використання таких антитіл. Рівень техніки TL1A – це білок клітинної мембрани типу ІІ надродини факторів некрозу пухлини (TNFSF), що позначається також як TNFSF15. Він експресується на поверхні ендотеліальних клітин і активованих клітин гематопоетичної лінії, включаючи моноцити, макрофаги, лімфоцити, мононуклеарні клітини власної пластинки слизової оболонки, дендритні клітини і плазматичні клітини (Tan, K.B. et al., 1997, Gene 204:35-46; Prehn, J.L. et al., 2007, J Immunol 178:4033-4038). Він експресується також в нирках, легенях, передміхуровій залозі і зобній залозі (Tan et al., 1997, supra). В ендотеліальних клітинах експресія TL1A регулюється на підвищення через IL-1α і TNFα (Migone, T.S. et al., 2002, Immunity 16:479-492). В моноцитах свіжої крові людини і похідних від моноцитів дендритних клітинах експресія TL1A регулюється на підвищення опосередкованою FcγR або Toll-подібним рецептором (TLR) сигнальною системою (Prehn et al., 2007, supra; Meylan, F. et al., 2008, Immunity 29:79-89). TL1A може відщеплюватись від клітинної мембрани через механізм, аналогічний TNFα, і повідомлялось про розчинну ектодоменну форму TL1A (Migone et al., 2002, supra; Kim, S. et al., 2005, J Immunol Methods 298:1-8; Yang, C.R. et al., 2004, Cancer Res 64:1122-1129). Секвенування білка підтвердило, що ця форма TL1A вивільнюється після розщеплення прикріпленого до мембрани попередника між залишками Ala71 і Leu-72 (Migone et al., 2002, supra). Були ідентифіковані дві варіантні кДНК, які потенційно кодують N-термінально усічені версії TL1A: VEGI-174 (або TL1) (Zhai, Y. et al., 1999, FASEB J 13:181-189) і VEGI-192 (Chew, L.J. et al., 2002, FASEB J 16:742-744). Опубліковані дані дозволяють припустити, що біологічно активні продукти гену TL1A являють собою трансмембранний білок типу ІІ повної довжини (залишки 1-251) і його протеолітично розщеплений ектодомен (залишки 72-251) (Migone et al., 2002, supra; Jin et al., 2007, Biochem Biophys Res Commun 364:1-6). Варіант hTL1A, який позначається "Fhm", що містить заміщення однієї амінокислоти Gln-167 на Arg, є описаним в патенті США № 6,521,422. TL1A опосередковує сигнали через свій когнатний рецептор Рецептор Смерті 3 (DR3; відомий також як TNFRSF25; послідовності нуклеїнових кислот і амінокислот SEQ ID №: 251 і 252, відповідно), що сприяє виживанню клітин і секреції прозапальних цитокінів або апоптозу, в залежності від контексту. TL1A є одним з трьох відомих лігандів (на додачу до FasL і LIGHT), що зв'язуються ендогенним розчинним рецептором уловлювачем DcR3 (відомим також як TR6, NTR3 або TNFRSF21; послідовності нуклеїнових кислот і амінокислот SEQ ID №: 253 і 254, відповідно)) (Migone et al., 2002, supra; Yang C.R. et al., 2004, Cancer Res 64:1122-1129). DR3 – це зв'язаний з TNF рецептором рецептор домену смерті, який експресується на більшості активованих Т лімфоцитів і NK клітин (Migone et al., 2002, supra; Screaton G.R. et al., 1997, Proc Natl Acad Sci (США) 94:4615-4619). TL1A вступає у взаємодію з DR3 на T клітинах, посилюючи їх реактивну здатність у відношенні IL-2 (Migone et al., 2002, supra), потенціюючи проліферацію T клітин і вивільнення IFNγ і GM-CSF в умовах субоптимальної ко-стимуляції (Migone et al., 2002, supra; Meylan et al., 2008, supra). Було показано також, що TL1A вступає в + синергізм з субоптимальними рівнями IL-12/IL-18, індукуючи продукцію IFNγ клітинами CD4 T (Papadakis, K.A. et al., 2004, J Immunol 172:7002-7007; Prehn, J.L. et al., 2004, Clin Immunol 112:66-77; Papadakis, K.A. et al., 2005, J Immunol 174:4985-4990; Cassatella, M.A. et al., 2007, J Immunol 178:7325-7333). TL1A вважався задіяним в різних запальних захворюваннях та/або автоімунних захворюваннях, включаючи запальні хвороби кишечнику [наприклад, виразковий коліт (UC) і хворобу Крона (CD)], ревматоїдний артрит, розсіяний склероз (MS), атеросклероз, і т.п. (дивись Bayry, J., 2010, Nature Reviews/Rheumatology 6:67-68; Takedatsu, H. et al., 2008, Gastroenterology 135:552-567; Prehn et al., 2004, supra; Bamias, G. et al., 2008, Clin Immunol 129:249-255; Bull, M.J. et al., 2008, J Exp Med 205:2457-2464; Pappu, B.P. et al., 2008, J Exp Med 205:1049-1062; Bamias, G. et al., 2003, J Immunol 171:4868-4874; Kang, Y. et al., 2005, Cytokine 29:229-235). Хоча більшість опублікованих даних сходяться на центральній ролі TL1A в запуску диференціації ефекторної функції TH1 і TH17, в одному дослідженні останнього часу для взаємодії TL1A/DR3 було запропоновано роль в розвитку реакцій T H2 T клітин в моделях астми (Fang, L. et al., 2008, J Exp Med 205:1037-1048). Так, застосування інгібіторів TL1A, таких як повністю людські антитіла проти TL1A, з високою афінністю і нейтралізуючою активністю, окремо або в комбінації з наявними тепер протизапальними агентами, імуносупресантами (наприклад, антагоністами TNF-α, кортизоном або стероїдами і т.п.), та/або протиалергійними агентами, забезпечує ефективне лікування таких захворювань і розладів. 1 UA 110041 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Послідовності нуклеїнових кислот і амінокислот людського TL1A є показаними в SEQ ID №№: 243 і 244, відповідно, а послідовності Fhm є показаними в SEQ ID №№: 245 і 246, відповідно. Антитіла до TL1A є описаними, наприклад, в патентах США №№ 7,597,886 і 7,820,798 та в патентній заявці США № 2009/0280116. Суть винаходу У відповідності до першого аспекту, даний винахід пропонує повністю людські моноклональні антитіла (mAbs) та їх антигензв'язуючі фрагменти, які специфічно зв'язують і нейтралізують активність людського TL1A (hTL1A). Такі антитіла можуть бути повної довжини (наприклад, IgG1 або IgG4 антитіло) або можуть містити тільки антигензв'язуючу частину (наприклад, Fab, F(ab')2 або scFv фрагмент), і можуть бути модифікованими з метою зміни функціональності, наприклад щоб усунути залишкові ефекторні функції (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933). В одному варіанті здійснення даний винахід заявляє антитіло або антигензв'язуючий фрагмент антитіла, які містять варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR), вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID №№: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 118, 134, 138, 154, 158, 174, 178, 194, 198, 214, 218 і 234, або мають суттєво подібну послідовність, що характеризується щонайменше 90%, щонайменше 95%, щонайменше 98% або щонайменше 99% ідентичністю послідовностей. В іншому варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент містять HCVR, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID №№: 2, 18, 34, 50, 66, 134, 174 і 234. В ще іншому варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент містять HCVR, що має послідовність SEQ ID №№: 2, 18, 174 або 234. В одному варіанті здійснення антитіло або його фрагмент додатково містять варіабельну ділянку легкого ланцюга (LCVR), вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID №№: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 176, 186, 196, 206, 216, 226 і 236, або мають суттєво подібну послідовність, що характеризується щонайменше 90%, щонайменше 95%, щонайменше 98% або щонайменше 99% ідентичністю послідовностей. В іншому варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент містять LCVR, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID №№: 10, 26, 42, 58, 74, 136, 176 і 236. В ще іншому варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент містять LCVR, що має амінокислотну послідовність SEQ ID №№: 10, 26, 176 або 236. В подальших варіантах здійснення антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент містять пару послідовностей HCVR і LCVR (HCVR/LCVR), вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID №№: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/116, 118/126, 134/136, 138/146, 154/156, 158/166, 174/176, 178/186, 194/196, 198/206, 214/216, 218/226 і 234/236. В одному варіанті здійснення антитіло або його фрагмент містять HCVR і LCVR, вибрані з пар амінокислотних послідовностей SEQ ID №№: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 134/136, 174/176 і 234/236. В іншому варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент містять пару HCVR/LCVR з послідовностями SEQ ID №№: 2/10, 18/26, 174/176 і 234/236. У відповідності до другого аспекту, даний винахід пропонує антитіло або антигензв'язуючий фрагмент антитіла, які містять амінокислотну послідовність визначаючої комплементарність ділянки 3 важкого ланцюга (HCDR3), вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID №№: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 124, 144, 164, 184, 204 і 224, або суттєво подібну до неї послідовність, що характеризується щонайменше 90%, щонайменше 95%, щонайменше 98% або щонайменше 99% ідентичністю послідовностей; і амінокислотну послідовність CDR3 (LCDR3) легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID №№: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 132, 152, 172, 192, 212 і 232, або суттєво подібну до неї послідовність, що характеризується щонайменше 90%, щонайменше 95%, щонайменше 98% або щонайменше 99% ідентичністю послідовностей. В одному варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент містять пару амінокислотних послідовностей HCDR3/LCDR3, вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID №№: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 124/132, 144/152, 164/172, 184/192, 204/212 або 224/232. В іншому варіанті здійснення антитіло або його фрагмент містять пару амінокислотних послідовностей HCDR3/LCDR3, що являє собою SEQ ID №№: 8/16, 24/32, 164/172 або 224/232. В подальшому варіанті здійснення даний винахід пропонує антитіло або його фрагмент, які додатково містять амінокислотну послідовність CDR1 (HCDR1) важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID №№: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 120, 140, 160, 180, 200 і 220, або суттєво подібну до неї послідовність, що характеризується щонайменше 90%, щонайменше 95%, щонайменше 98% або щонайменше 99% ідентичністю послідовностей; 2 UA 110041 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотну послідовність CDR2 (HCDR2) важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID №№: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 122, 142, 162, 182, 202 і 222, або суттєво подібну до неї послідовність, що характеризується щонайменше 90%, щонайменше 95%, щонайменше 98% або щонайменше 99% ідентичністю послідовностей; та/або амінокислотну послідовність CDR1 (LCDR1) легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID №№: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 128, 148, 168, 188, 208 і 228, або суттєво подібну до неї послідовність, що характеризується щонайменше 90%, щонайменше 95%, щонайменше 98% або щонайменше 99% ідентичністю послідовностей; та/або амінокислотну послідовність CDR2 (LCDR2) легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID №№: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 130, 150, 170, 190, 210 і 230, або суттєво подібну до неї послідовність, що характеризується щонайменше 90%, щонайменше 95%, щонайменше 98% або щонайменше 99% ідентичністю послідовностей. В одному варіанті здійснення антитіло або його фрагмент містять комбінацію HCDR1/HCDR2/HCDR3, вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID №№: 4/6/8, 20/22/24, 36/38/40, 52/54/56, 68/70/72, 84/86/88, 100/102/104, 120/122/124, 140/142/144, 160/162/164, 180/182/184, 200/202/204 і 220/222/224; та/або комбінацію LCDR1/LCDR2/LCDR3, вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID №№: 12/14/16, 28/30/32, 44/46/48, 60/62/64, 76/78/80, 92/94/96, 108/110/112, 128/130/132, 148/150/152, 168/170/172, 188/190/192, 208/210/212 і 228/230/232. В іншому варіанті здійснення амінокислотні послідовності CDR важкого і легкого ланцюгів являють собою комбінацію послідовностей CDR, вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID №№: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112, 120/122/124/128/130/132, 140/142/144/148/150/152, 160/162/164/168/170/172, 180/182/184/188/190/192, 200/202/204/208/210/212 і 220/222/224/228/230/232. В іншому варіанті здійснення антитіло або його фрагмент, що несе антиген, послідовності CDR важкого і легкого ланцюгів SEQ ID №№: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 120/122/124/128/130/132, 160/162/164/168/170/172 або 220/222/224/228/230/232. В ще іншому варіанті здійснення амінокислотні послідовності CDR важкого і легкого ланцюгів являють собою комбінацію послідовностей CDR SEQ ID №№: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 160/162/164/168/170/172 або 220/222/224/228/230/232. В спорідненому варіанті здійснення даний винахід пропонує антитіло або антигензв'язуючий фрагмент антитіла, які специфічно зв'язують hTL1A, де це антитіло або його фрагмент являють собою домени CDR важкого і легкого ланцюгів, що містяться в парах послідовностей важкого і легкого ланцюгів, вибраних з групи, яка складається з SEQ ID №№: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/116, 118/126, 134/136, 138/146, 154/156, 158/166, 174/176, 178/186, 194/196, 198/206, 214/216, 218/226 і 234/236. Способи і методики для ідентифікації ділянок CDR в амінокислотних послідовностях HCVR і LCVR є відомими в цій галузі і можуть бути застосовані для ідентифікації CDR в тих амінокислотних послідовностях HCVR та/або LCVR, які є описаними тут. Звичайні дефініції, що можуть бути використані для ідентифікації меж ділянок CDR, включають дефініцію Kabat, дефініцію Chothia і дефініцію AbM. Загалом, дефініція Kabat базується на варіабельності послідовностей, дефініція Chothia базується на локалізації структурних петельних ділянок, а дефініція AbM є компромісом між підходами Kabat і Chothia. Дивись, наприклад, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); та Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Наявними є також доступні бази даних для ідентифікації послідовностей CDR в антитілі. В одному варіанті здійснення таке антитіло або його фрагмент являють собою послідовності CDR, що містяться в парі HCVR і LCVR, вибраній з групи, яка складається з пар амінокислотних послідовностей SEQ ID №№: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 134/136, 174/176 і 234/236. В іншому варіанті здійснення таке антитіло або його фрагмент являють собою послідовності CDR, що містяться в парі послідовностей HCVR і LCVR SEQ ID №№: 2/10, 18/26, 174/176 або 234/236. В іншому спорідненому варіанті здійснення даний винахід пропонує антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які конкурують за специфічне зв'язування з hTL1A, при цьому антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент являють собою послідовності CDR важкого і легкого ланцюгів SEQ ID №№: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 120/122/124/128/130/132, 160/162/164/168/170/172 або 220/222/224/228/230/232. В одному варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент конкурують за специфічне зв'язування з hTL1A з антитілом або антигензв'язуючим фрагментом, що являють собою послідовності CDR важкого і легкого ланцюгів SEQ ID №№: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 160/162/164/168/170/172 або 220/222/224/228/230/232. В 3 UA 110041 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 іншому варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за цим винаходом конкурують за специфічне зв'язування з hTL1A з антитілом або антигензв'язуючим фрагментом, що являють собою пару послідовностей HCVR/LCVR SEQ ID №№: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 134/136, 174/176 або 234/236. В ще іншому варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент конкурують за специфічне зв'язування з hTL1A з антитілом або антигензв'язуючим фрагментом, що являють собою пару послідовностей HCVR/LCVR SEQ ID №№: 2/10, 18/26, 174/176 або 234/236. В іншому спорідненому варіанті здійснення даний винахід пропонує антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які зв'язують той самий епітоп на hTL1A, що розпізнається антитілом або його фрагментом, які являють собою послідовності CDR важкого і легкого ланцюгів SEQ ID №№: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 120/122/124/128/130/132, 160/162/164/168/170/172 або 220/222/224/228/230/232. В одному варіанті здійснення таке антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент зв'язують той самий епітоп на hTL1A, що розпізнається антитілом або його фрагментом, які являють собою послідовності CDR важкого і легкого ланцюгів SEQ ID №№: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 160/162/164/168/170/172 або 220/222/224/228/230/232. В іншому варіанті здійснення антитіло або антигензв'язуючий фрагмент за цим винаходом розпізнають той самий епітоп на hTL1A, що розпізнається антитілом або його антигензв'язуючим фрагментом, які являють собою пару послідовностей HCVR/LCVR SEQ ID №№: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 134/136, 174/176 або 234/236. В ще іншому варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент розпізнають той самий епітоп на hTL1A, що розпізнається антитілом або його антигензв'язуючим фрагментом, які являють собою пару послідовностей HCVR/LCVR SEQ ID №№: 2/10, 18/26, 174/176 або 234/236. У відповідності до третього аспекту, даний винахід пропонує молекули нуклеїнової кислоти, кодуючі описані вище анти-TL1A антитіла або їх фрагменти. Рекомбінантні вектори експресії, що несуть нуклеїнові кислоти за цим винаходом, і виділені клітини-хазяї, наприклад бактеріальні клітини, такі як E. coli, або клітини ссавців, такі як клітини СНО, в які такі вектори були введені, також охоплюються цим винаходом, як і способи отримання антитіл шляхом культивування клітин-хазяїв в умовах, що забезпечують продукцію таких антитіл, а також способи виділення отриманих антитіл. В одному варіанті здійснення даний винахід пропонує антитіло або його фрагмент, що являють собою HCVR, кодовану послідовністю нуклеїнових кислот, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID №№: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 117, 133, 137, 153, 157, 173, 177, 193, 197, 213, 217 і 233, або суттєво ідентичною послідовністю, що має щонайменше 90%, щонайменше 95%, щонайменше 98% або щонайменше 99% гомологію з нею. В іншому варіанті здійснення антитіло або його фрагмент являють собою HCVR, кодовану послідовністю нуклеїнових кислот, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID №№: 1, 17, 33, 49, 65, 133, 173 і 233. В ще іншому варіанті здійснення антитіло або його фрагмент являють собою HCVR, кодовану послідовністю нуклеїнових кислот з SEQ ID №№: 1, 17, 173 або 233. В одному варіанті здійснення антитіло або його фрагмент додатково містять LCVR, кодовану послідовністю нуклеїнових кислот, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID №№: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 115, 125, 135, 145, 155, 165, 175, 185, 195, 205, 215, 225 і 235, або суттєво ідентичною послідовністю, що має щонайменше 90%, щонайменше 95%, щонайменше 98% або щонайменше 99% гомологію з нею. В іншому варіанті здійснення антитіло або його фрагмент містять LCVR, кодовану послідовністю нуклеїнових кислот, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID №№: 9, 25, 41, 57, 73, 135, 175 і 235. В ще іншому варіанті здійснення антитіло або його фрагмент містять LCVR, кодовану послідовністю нуклеїнових кислот SEQ ID №№: 9, 25, 175 або 235. В подальших варіантах здійснення антитіло або його фрагмент містять пару послідовностей HCVR і LCVR (HCVR/LCVR), кодовану парою послідовностей нуклеїнових кислот, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID №№: 1/9, 17/25, 33/41, 49/57, 65/73, 81/89, 97/105, 113/115, 117/125, 133/135, 137/145, 153/155, 157/165, 173/175, 177/185, 193/195, 197/205, 213/215, 217/225 і 233/235. В одному варіанті здійснення антитіло або його фрагмент містять пару послідовностей HCVR/LCVR, кодовану парою послідовностей нуклеїнових кислот, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID №№: 1/9, 17/25, 33/41, 49/57, 65/73, 133/135, 173/175 і 233/235. В ще іншому варіанті здійснення антитіло або його фрагмент містять пару послідовностей HCVR/LCVR, кодовану парою послідовностей нуклеїнових кислот SEQ ID №№: 1/9, 17/25, 173/175 або 233/235. В одному варіанті здійснення даний винахід пропонує антитіло або антигензв'язуючий фрагмент антитіла, що містить домен HCDR3, кодований нуклеотидною послідовністю, 4 UA 110041 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вибраною з групи, яка складається з SEQ ID №№: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 123, 143, 163, 183, 203 і 223, або суттєво ідентичною послідовністю, що має щонайменше 90%, щонайменше 95%, щонайменше 98% або щонайменше 99% гомологію з нею, і домен LCDR3, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID №№: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 131, 151, 171, 191, 211 і 231, або суттєво ідентичною послідовністю, що має щонайменше 90%, щонайменше 95%, щонайменше 98% або щонайменше 99% гомологію з нею. В іншому варіанті здійснення таке антитіло або його фрагмент містять пару послідовностей HCDR3 і LCDR3, кодованих парою послідовностей нуклеїнових кислот SEQ ID №№: 7/15, 23/31, 39/47, 55/63, 71/79, 123/131, 163/171 або 223/231. В ще іншому варіанті здійснення пара послідовностей HCDR3/LCDR3 кодується парою послідовностей нуклеїнових кислот SEQ ID №№: 7/15, 23/31, 163/171 або 223/231. В подальших варіантах здійснення антитіло або його фрагмент додатково містять домен HCDR1, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID №№: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 119, 139, 159, 179, 199 і 219, або суттєво ідентичною послідовністю, що має щонайменше 90%, щонайменше 95%, щонайменше 98% або щонайменше 99% гомологію з нею; домен HCDR2, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID №№: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 121, 141, 161, 181, 201 і 221, або суттєво ідентичною послідовністю, що має щонайменше 90%, щонайменше 95%, щонайменше 98% або щонайменше 99% гомологію з нею; домен LCDR1, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID №№: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 127, 147, 167, 187, 207 і 227, або суттєво ідентичною послідовністю, що має щонайменше 90%, щонайменше 95%, щонайменше 98% або щонайменше 99% гомологію з нею; і домен LCDR2, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID №№: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 129, 149, 169, 189, 209 і 229, або суттєво ідентичною послідовністю, що має щонайменше 90%, щонайменше 95%, щонайменше 98% або щонайменше 99% гомологію з нею. В одному варіанті здійснення антитіло або його фрагмент містять комбінацію HCDR1/HCDR2/HCDR3, кодовану SEQ ID №№: 3/5/7, 19/21/23, 35/37/39, 51/53/55, 67/69/71, 83/85/87, 99/101/103, 119/121/123, 139/141/143, 159/161/163, 179/181/183, 199/201/203 або 219/221/223; і комбінацію LCDR1/LCDR2/LCDR3, кодовану SEQ ID №№: 11/13/15, 27/29/31, 43/45/47, 59/61/63, 75/77/79, 91/93/95, 107/109/111, 127/129/131, 147/149/151, 167/169/171, 187/189/191, 207/209/211 або 227/229/231. В одному варіанті здійснення антитіло або його фрагмент містять послідовності CDR важкого і легкого ланцюгів, кодовані комбінацією послідовностей нуклеїнових кислот, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID №№: 3/5/7/11/13/15, 19/21/23/27/29/31, 35/37/39/43/45/47, 51/53/55/59/61/63, 67/69/71/75/77/79, 83/85/87/91/93/95, 99/101/103/107/109/111, 119/121/123/127/129/131, 139/141/143/147/149/151, 159/161/163/167/169/171, 179/181/183/187/189/191, 199/201/203/207/209/211 і 219/221/223/227/229/231. В іншому варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язуюча частина містять послідовності CDR важкого і легкого ланцюгів, кодовані комбінацією послідовностей нуклеїнових кислот SEQ ID №№: 3/5/7/11/13/15, 19/21/23/27/29/31, 35/37/39/43/45/47, 51/53/55/59/61/63, 67/69/71/75/77/79, 119/121/123/127/129/131, 159/161/163/167/169/171 або 219/221/223/227/229/231. В ще іншому варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язуюча частина містять послідовності CDR важкого і легкого ланцюгів, кодовані комбінацією послідовностей нуклеїнових кислот SEQ ID №№: 3/5/7/11/13/15, 19/21/23/27/29/31, 159/161/163/167/169/171 або 219/221/223/227/229/231. У відповідності до четвертого аспекту, даний винахід пропонує виділене антитіло або антигензв'язуючий фрагмент антитіла, що специфічно зв'язують hTL1A, які містять HCDR3 і 1 2 3 4 5 6 LCDR3, де HCDR3 являє собою амінокислотну послідовність формули X - X - X - X - X - X 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 X - X - X - X - X - X - X - X - X - X (SEQ ID №: 239), де X є Thr або Ala, X є Lys, Arg 3 4 5 6 або відсутній, X є Glu, Gly або відсутній, X є Asp, Pro або відсутній, X є Leu або відсутній, X є 7 8 9 Arg, Tyr, Glu або відсутній, X є Gly, Asp, Ala або відсутній, X є Asp, Ser або Tyr, X є Tyr або Trp, 10 11 12 13 14 X є Tyr або Asp, X є Tyr, Lys або Ile, X є Gly, Tyr, Asn або Ser, X є Val, Gly або Ser, X є 15 16 Phe або Met, X є Asp, і X є Tyr або Val; а LCDR3 являє собою амінокислотну послідовність 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 формули X - X - X - X - X - X - X - X - X (SEQ ID №: 242), де X є Gln, X є Gln, X є Tyr, Leu 4 5 6 7 8 або Phe, X є His, Tyr або Asn, X є Arg або Ser, X є Ser, Thr або Tyr, X є Trp або Pro, X є Phe, 9 Leu або відсутній, і X є Thr. В подальшому варіанті здійснення таке антитіло або його фрагмент додатково містять 1 2 3 4 послідовність HCDR1, що являє собою амінокислотну послідовність формули X - X - X - X 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 X - X - X - X (SEQ ID №: 237), де X є Gly, X є Phe, X є Thr, X є Phe, X є Ser, X є Thr, Ser 7 8 або Asn, X є Tyr, і X є Gly, Trp, Val або Ala; послідовність HCDR2 являє собою амінокислотну 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 послідовність формули X - X - X - X - X - X - X - X (SEQ ID №: 238), де X є Ile або Val, X є 5 UA 110041 C2 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4 5 6 7 Ser або Lys, X є Gly або Glu, X є Thr, Asp, Ser або Arg, X є Gly, X є Arg, Ser або Gly, X є Thr, 8 Glu або Ser, і X є Thr або Lys; послідовність LCDR1 являє собою амінокислотну послідовність 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 формули X - X - X - X - X - X - X - X - X - X - X - X (SEQ ID №: 240), де X є Gln, X є 3 4 5 6 7 Thr, Ser, Ala або Gly, X є Ile, X є Ser або Leu, X є Tyr або відсутній, X є Ser або відсутній, X є 8 9 10 11 Ser або відсутній, X є Asn або відсутній, X є Asn або відсутній, X є Lys або відсутній, X є Ser, 12 Asn або Thr, і X є Trp або Tyr; і послідовність LCDR2 являє собою амінокислотну послідовність 1 2 3 1 2 3 формули X - X - X (SEQ ID №: 241), де X є Ala, Trp або Ser, X є Ala або Thr, і X є Ser. У відповідності до п'ятого аспекту, даний винахід пропонує людське анти-TL1A антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які містять варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR), кодовану сегментами нуклеотидної послідовності, похідними від зародкових послідовностей V H, DH і JH, варіабельну ділянку легкого ланцюга (LCVR), кодовану сегментами нуклеотидної послідовності, похідними від зародкових послідовностей VK і JK. В певних варіантах здійснення таке антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент містять ділянки HCVR і LCVR, кодовані сегментами нуклеотидної послідовності, похідними від комбінації зародкових генів, вибраних з групи, яка складається з: (i) VH3-23, DH2-21, JH4, VK1-5 і JK1; (ii) VH3-7, DH1-7, JH6, VK4-1 і JK3; (iii) VH3-23, DH2-2, JH6, VK1-9 і JK2; (iv) VH3-23, DH6-6, JH4, VK1-9 і JK4; (v) VH1-2, DH2-15, JH3, VK1-12 і JK4; (vi) VH4-34, DH3-9, JH4, VK3-20 і JK4; (vii) VH4-34, DH1-1, JH4, VK3-20 і JK4; та (viii) VH4-34, DH33, JH4, VK2-24 і JK4. У відповідності до шостого аспекту, даний винахід пропонує антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, що специфічно зв'язуються з hTL1A або Fhm з рівноважною константою дисоціації (KD) близько 1 нМ або менше, як визначається за допомогою поверхневого плазмонного резонансного аналізу (наприклад, BIACORE™). В певних варіантах здійснення антитіло за цим винаходом демонструє KD близько 800 пМ або менше; близько 700 пМ або менше; близько 600 пМ або менше; близько 500 пМ або менше; близько 400 пМ або менше; близько 300 пМ або менше; близько 200 пМ або менше; близько 150 пМ або менше; близько 100 пМ або менше; близько 90 пМ або менше; близько 80 пМ або менше; близько 50 пМ або менше; або 30 пМ або менше. У відповідності до сьомого аспекту, даний винахід пропонує анти-hTL1A антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які зв'язують білок hTL1A послідовності SEQ ID №: 244, але перехресно не реагують з його варіантом, таким як Fhm послідовності SEQ ID №: 246, як було визначено, наприклад, за допомогою ELISA, поверхневого плазмонного резонансного аналізу або технології Luminex® xMAP® Technology, як тут описано. Fhm містить єдине амінокислотне заміщення в позиції 167, що відповідає Gln в hTL1A, на Arg (дивись патент США № 6,521,422). В споріднених варіантах здійснення даний винахід пропонує також анти-hTL1A антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які зв'язують білок hTL1A і перехресно реагують з Fhm. В іншому спорідненому варіанті здійснення даний винахід пропонує анти-hTL1A антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які перехресно не реагують з мишачим TL1A (mTL1A: SEQ ID №: 250, кодований нуклеотидною послідовністю SEQ ID №: 249), але перехресно реагують з TL1A яванського макаки (Macaca fascicularis, або MfTL1A: SEQ ID №: 248, кодований нуклеотидною послідовністю SEQ ID №: 247) або макаки-резус (Macaca mulatta: така сама амінокислотна послідовність, як у MfTL1A). В подальших споріднених варіантах здійснення даний винахід пропонує анти-hTL1A антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які перехресно реагують як з mTL1A, так і з MfTL1A. Даний винахід охоплює анти-hTL1A антитіла, що мають модифікований профіль глікозилювання. В певних застосуваннях може бути доцільною модифікація, спрямована на видалення небажаних сайтів глікозилювання або, наприклад, на видалення функціональної групи фукози для посилення функції залежної від антитіла клітинно-опосередкованої цитотоксичності (ADCC) (дивись Shield et al. (2002) JBC 277:26733). В інших застосуваннях видалення сайту N-глікозилювання може зменшити небажані імунні реакції проти терапевтичних антитіл або підвищити афінність таких антитіл. В ще інших застосуваннях може здійснюватись модифікація галактозилювання з метою змінити залежну від комплементу цитотоксичність (CDC). У відповідності до восьмого аспекту, даний винахід пропонує фармацевтичну композицію, що містить рекомбінантне людське антитіло або його фрагмент, які специфічно зв'язують hTL1A, і фармацевтично прийнятний носій. В одному варіанті здійснення даний винахід пропонує композицію, що є комбінацією антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента за цим винаходом і другого терапевтичного агента. Таким другим терапевтичним агентом може бути один або більше з будь-яких агентів, таких як імуносупресанти, протизапальні агенти, анальгетики, протиалергійні агенти і т.п., терапевтичні ефекти багатьох з яких накладаються один на інший. Імуносупресанти, придатні для використання в комбінації з анти-hTL1A 6 UA 110041 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 антитілами за цим винаходом, включають, не обмежуючись ними, глюкокортикоїди, циклоспорин, метотрексат, інтерферон β (IFN-β), такролімус, сіролімус, азатіоприн, меркаптопурин, опіоїди, мікофенолат, TNF-зв'язуючі білки, такі як інфліксимаб, етернацепт, адалімумаб і т.п., цитотоксичні антибіотики, такі як дактиноміцин, антрацикліни, мітоміцин С, блеоміцин, мітраміцин і т.п., націлені на імунні клітини антитіла, такі як анти-CD20 антитіла, анти-CD3 антитіла і т.п. Протизапальні агенти та/або анальгетики, придатні для комбінаційної терапії з анти-hTL1A антитілами за цим винаходом, включають кортикостероїди, не стероїдні протизапальні препарати (НСПЗП), такі як аспірин, ібупрофен, напроксен, інгібітори Сох-2 і т.п., антагоністи TNF-α, антагоністи IL-1, антагоністи IL-6, ацетамінофен, морфіноміметики і т.п. Придатні антиалергійні агенти включають антигістаміни, глюкокортикоїди, епінефрин (адреналін), теофілін, натрієва сіль кромоліну і анти-лейкотрієни, а також анти-холінергічні агенти, протизастійні агенти, стабілізатори тучних клітин і т.п. У відповідності до дев'ятого аспекту, даний винахід пропонує способи пригнічення активності hTL1A за допомогою анти-hTL1A антитіла або антигензв'язуючої частини антитіла за цим винаходом, де терапевтичні способи передбачають введення терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить антитіло або антигензв'язуючий фрагмент антитіла за цим винаходом і необов'язково один або більше додаткових терапевтичних агентів, описаних вище. Хворобою або розладом, що лікуються, може бути будь-яка хвороба або стан, які поліпшуються, покращуються, пригнічуються або попереджаються або частота яких зменшується порівняно з ситуацією без лікування анти-hTL1A антитілом, за рахунок усунення, пригнічення або зниження активності TL1A. Приклади захворювань або розладів, що лікуються способами за цим винаходом, включають, не обмежуючись ними, запальні хвороби та/або автоімунні хвороби, такі як запальні хвороби кишечнику (ЗХК), включаючи виразковий коліт (ВК) і хворобу Крона (ХК), ревматоїдний артрит (РА), розсіяний склероз (РС), діабет типу 1 і типу 2, псоріаз, псоріатичний артрит, анкілозуючий спондиліт, атопічний дерматит і т.п.; алергічні реакції або стани, включаючи астму, алергічне запалення легень і т.п.; різні види раку, атеросклероз, інфекції, нейродегенеративні захворювання, відторгнення трансплантату, реакція трансплантату проти хазяїна (РТПХ), серцево-судинні розлади/хвороби і т.п. Інші варіанти здійснення стануть очевидними після ознайомлення з наступним докладним описом. Докладний опис винаходу Перед тим, як описувати даний винахід докладно, слід зазначити, що він не обмежується конкретними способами і експериментальними умовами, оскільки такі способи і умови можуть змінюватись. Також має бути зрозумілим, що використовувана тут термінологія призначена тільки для цілей опису конкретних варіантів здійснення і не є обмежуючою, оскільки об'єм даного винаходу буде визначатись тільки формулою винаходу, що додається. Якщо вони не визначаються по-іншому, всі використовувані тут технічні і наукові терміни мають те саме значення, що є зрозумілим для звичайного спеціаліста в галузі, до якої належить цей винахід. Хоча будь-які методи і матеріали, подібні або еквівалентні до описаних тут, можуть бути застосовані при реалізації або випробуванні даного винаходу, перевагу слід віддавати методам і матеріалам, описаним тут. Всі публікації, згадані тут, є включеними сюди за посиланням у всій їх повноті. Дефініції Термін "людський TNF-подібний ліганд 1A" або "hTL1A", як він тут використовується, стосується hTL1A, що має послідовність нуклеїнових кислот, показану в SEQ ID №: 243, і амінокислотну послідовність SEQ ID №: 244, або його біологічно активного фрагмента, а також варіантів hTL1A, включаючи Fhm, що має послідовність нуклеїнових кислот, показану в SEQ ID №: 245, і амінокислотну послідовність SEQ ID №: 246, або його біологічно активний фрагмент, коли конкретно не вказується інше. Термін "антитіло", як він тут використовується, стосується молекул імуноглобуліну, що складаються з чотирьох поліпептидних ланцюгів – двох важких (Н) ланцюгів і двох легких (L) ланцюгів, взаємопов'язаних дисульфідними зв'язками. Кожний важкий ланцюг має варіабельну ділянку важкого ланцюга (HCVR) і постійну ділянку важкого ланцюга (C H; складену з доменів CH1, CH2 і CH3). Кожний легкий ланцюг має варіабельну ділянку легкого ланцюга (LCVR) і постійну ділянку важкого ланцюга (CL). HCVR і LCVR можуть далі підрозділятись на ділянки гіперваріабельності, які називають ділянками, що визначають комплементарність (CDR), в проміжках між якими знаходяться ділянки, що є більш збереженими, які називають каркасними ділянками (FR). Кожна HCVR і LCVR складається з трьох CDR і чотирьох FR, розміщених в наступному порядку від аміно-кінця і карбокси-кінця: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 і FR4. 7 UA 110041 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заміщення одного або більше CDR залишків або пропуск однієї або більше CDR також є можливим. В науковій літературі описані антитіла, в яких одна або дві CDR можуть бути вільними для зв'язування. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139) проаналізували контактні ділянки між антитілами та їх антигенами на основі опублікованих кристалічних структур і дійшли висновку, що тільки від однієї п'ятої до однієї третьої частини залишків CDR дійсно контактують з антигеном. Padlan також виявив багато антитіл, в яких одна або дві ділянки CDR не мали амінокислот в контакті з антигеном (дивись також, Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428). Залишки CDR, що не контактують з антигеном, можуть бути ідентифіковані на основі попередніх досліджень (наприклад, залишки H60-H65 в CDRH2 часто не є необхідними), з ділянок CDR Kabat, що лежать поза CDR Chothia, за допомогою молекулярного моделювання та/або емпірично. Коли CDR або її залишок (залишки) пропускаються, вони звичайно заміщуються амінокислотою, що займає відповідну позицію в іншій послідовності людського антитіла або консенсусі таких послідовностей. Позиції для заміщення в межах CDR і амінокислоти для заміщення можуть також вибиратись емпірично. Емпіричні заміщення можуть бути консервативними або неконсервативними заміщеннями. Термін "людське антитіло", як він тут використовується, включає антитіла, що мають варіабельні і постійні ділянки, похідні від зародкових імуноглобулінових послідовностей людини. Людські mAb за цим винаходом можуть містити амінокислотні залишки, не кодовані зародковими імуноглобуліновими послідовностями людини (наприклад, мутації, введені шляхом випадкового або специфічного до сайту мутагенезу in vitro або соматичною мутацією in vivo), наприклад в CDR і в конкретному CDR3. Однак термін "людське антитіло", як він тут використовується, не включає mAb, в яких послідовності CDR, похідні від зародкової лінії іншого виду ссавців (наприклад, миші), були пересаджені на послідовності людського FR. Повністю людські анти-TL1A антитіла, описані тут, можуть містити одне або більше амінокислотних заміщень, вставок та/або делецій в каркасних та/або CDR ділянках варіабельних доменів важкого і легкого ланцюгів порівняно з відповідними зародковими послідовностями. Такі мутації можуть легко виявлятись шляхом порівняння описаних тут амінокислотних послідовностей з зародковими послідовностями, які можна отримати з доступних баз даних щодо послідовностей антитіла. Даний винахід містить антитіла та їх антигензв'язуючі фрагменти, що є похідними від будь-якої з описаних тут амінокислотних послідовностей, в яких одна або більше амінокислот в межах однієї або більше каркасної та/або CDR ділянок піддані мутації до відповідного залишку (залишків) зародкової послідовності, від якої походить це антитіло, або до відповідного залишку (залишків) іншої людської зародкової послідовності, або до консервативного амінокислотного заміщення відповідного зародкового залишку (залишків) (такі зміни послідовності тут сукупно називаються "зародковими мутаціями"). Спеціаліст в цій галузі, виходячи з описаних тут послідовностей варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів, може легко отримати численні антитіла і антигензв'язуючі фрагменти, які містять одну або більше індивідуальних зародкових зворотних мутацій або їх комбінації. В певних варіантах здійснення всі каркасні та/або CDR залишки в межах доменів VH та/або VL є мутованими зворотно до залишків тієї початкової зародкової послідовності, від якої походить дане антитіло. В інших варіантах здійснення тільки певні залишки є мутованими зворотно до початкової зародкової послідовності, наприклад тільки мутовані залишки, що знаходяться в межах перших 8 амінокислот FR1 або в межах останніх 8 амінокислот FR4, або тільки мутовані залишки, що знаходяться в межах CDR1, CDR2 або CDR3. В інших варіантах здійснення один або більше каркасних та/або CDR залишків є мутованими до відповідних залишків іншої зародкової послідовності (тобто, зародкової послідовності, що відрізняється від тієї зародкової послідовності, з якої початково було отримане дане антитіло). Більше того, антитіла за даним винаходом можуть містити будь-яку комбінацію двох або більше зародкових мутацій в межах каркасних та/або CDR ділянок, наприклад коли певні індивідуальні залишки є мутованими до відповідних залишків конкретної зародкової послідовності, тоді як певні інші залишки, які відрізняються від початкової зародкової послідовності, є збереженими або мутованими до відповідного залишку іншої зародкової послідовності. Після отримання антитіла і антигензв'язуючі фрагменти, що містять одну або більше зародкових мутацій, можуть бути легко випробувані щодо однієї або більше бажаних властивостей, таких як поліпшена специфічність зв'язування, підвищена афінність до зв'язування, поліпшені або посилені антагоністичні або агоністичні біологічні властивості (в залежності від ситуації), знижена імуногенність і т.п. Антитіла і антигензв'язуючі фрагменти, одержані у такий загальний спосіб, охоплюються даним винаходом. Даний винахід включає також анти-TL1A антитіла, що містять варіанти будь-якої з HCVR, LCVR та/або CDR амінокислотних послідовностей, описаних тут, що мають одне або більше 8 UA 110041 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 консервативних заміщень. Наприклад, даний винахід включає анти-TL1A антитіла, що мають HCVR, LCVR та/або CDR амінокислотні послідовності з, наприклад, 10 або менше, 8 або менше, 6 або менше, 4 або менше, 2 або 1 консервативним амінокислотним заміщенням відносно будьякої з описаних тут HCVR, LCVR та/або CDR амінокислотних послідовностей. Коли конкретно не вказується інше, термін "антитіло" (Ab), як він тут використовується, має розумітись як такий, що охоплює молекули антитіла, що містять два імуноглобулінові важкі ланцюги і два імуноглобулінові легкі ланцюги (тобто, є "повними молекулами антитіла"), а також їх антигензв'язуючі фрагменти. Терміни "антигензв'язуюча частина" антитіла, "антигензв'язуючий фрагмент" антитіла і т.п., як вони тут використовуються, включають будьякий природний, отриманий ферментативним шляхом, синтетичний або генетично сконструйований поліпептид або глікопротеїн, який специфічно зв'язує антиген з утворенням комплексу. Антигензв'язуючі фрагменти антитіла можуть бути отримані, наприклад, з повних молекул антитіла за допомогою будь-яких доцільних стандартних методів, таких як протеолітичний гідроліз або генна інженерія, що передбачають маніпуляцію і експресію ДНК, кодуючої варіабельні і (необов'язково) постійні домени антитіла. Така ДНК є відомою і легко доступною з, наприклад, комерційних джерел, бібліотек ДНК (включаючи, наприклад, фагову дисплей-бібліотеку антитіл) або її можна синтезувати. Цю ДНК можна піддавати хімічному секвенуванню і маніпулюванню, або можна використовувати для цього методи молекулярної біології, наприклад щоб розмістити один або більше варіабельних та/або постійних доменів у відповідну конфігурацію або щоб ввести кодони, створити цистеїнові залишки, модифікувати, додати або вилучити амінокислоти і т.п. Не обмежуючі приклади антигензв'язуючих фрагментів включають: (i) фрагменти Fab; (ii) фрагменти F(ab')2; (iii) фрагменти Fd; (iv) фрагменти Fv; (v) одноланцюгові молекули Fv (scFv); (vi) фрагменти dAb; і (vii) мінімальні одиниці розпізнавання, які складаються з амінокислотних залишків, що імітують гіперваріабельну ділянку антитіла (наприклад, виділену ділянку, що визначає комплементарність (CDR), таку як пептид CDR3), або зв'язаний пептид FR3-CDR3FR4. Інші сконструйовані молекули, такі як домен-специфічні антитіла, антитіла з єдиним доменом, антитіла з делецією домену, химерні антитіла, антитіла з пересадженою CDR, діатіла, тріотіла, тетратіла, мінітіла, нанотіла (наприклад, одновалентні нанотіла, двохвалентні антитіла і т.д.), імунофармацевтичні засоби на основі модульного білка малого розміру (SMIPs) і варіабельні домени IgNAR акули також охоплюються виразом "антигензв'язуючий фрагмент", як він тут використовується. Антигензв'язуючий фрагмент антитіла типово буде містити щонайменше один варіабельний домен. Цей варіабельний домен може мати будь-який розмір або амінокислотний склад і загалом буде містити щонайменше одну CDR, яка є суміжною з однією або більше каркасних послідовностей або знаходиться в каркасі. В антигензв'язуючих фрагментах, що мають VH домен, зв'язаний з VL доменом, ці VH і VL домени можуть розміщуватись один відносно одного будь-яким доцільним чином. Наприклад, варіабельна ділянка може бути димерною і містити димери VH-VH, VH-VL або VL-VL. Як варіант, антигензв'язуючий фрагмент антитіла може містити мономерний домен VH або VL. В певних варіантах здійснення антигензв'язуючий фрагмент антитіла може містити щонайменше один варіабельний домен, ковалентно зв'язаний з щонайменше одним постійним доменом. Не обмежуючі, показові конфігурації варіабельних і постійних доменів, які можуть міститись в антигензв'язуючому фрагменті антитіла за цим винаходом, включають: (i) V H-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; та (xiv) VL-CL. При будь-якій конфігурації варіабельного і постійного доменів, включаючи будь-яку з наведених вище показових конфігурацій, варіабельний і постійний домени можуть бути зв'язаними один з одним безпосередньо або через повну або часткову шарнірну або лінкерну ділянку. Шарнірна ділянка може складатись щонайменше з 2 (наприклад, 5, 10, 15, 20, 40, 60 або більше) амінокислот, що забезпечує гнучкий або напівгнучкий зв'язок між суміжними варіабельними та/або постійними доменами в єдиній поліпептидній молекулі. Більше того, антигензв'язуючий фрагмент антитіла за цим винаходом може містити гомодимер або гетеродимер (або інший мультимер) будь-якої з наведених вище конфігурацій варіабельного і постійного доменів в не ковалентному зв'язку один з одним та/або з одним або більше мономерним доменом V H або VL (наприклад, через дисульфідний зв'язок (зв'язки)). Як і у випадку повних молекул антитіла, антигензв'язуючі фрагменти можуть бути моноспецифічними або мультиспецифічними (наприклад, біспецифічними). Мультиспецифічний антигензв'язуючий фрагмент антитіла типово буде містити щонайменше два різних варіабельних домени, де кожний варіабельний домен є здатним специфічно зв'язуватись з 9 UA 110041 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 окремим антигеном або з іншим епітопом на тому самому антигені. Будь-яку форму мультиспецифічного антитіла, включаючи описані тут показові форми біспецифічного антитіла, можна адаптувати для використання в контексті антигензв'язуючого фрагмента антитіла за цим винаходом за допомогою рутинних методів, наявних в цій галузі. В певних варіантах здійснення антитіло або фрагменти антитіла за цим винаходом можуть бути кон'юговані до терапевтичного агента ("імунокон'югат"), такого як цитотоксин, хіміотерапевтичний агент, імуносупресант або радіоізотоп. Термін "специфічно зв'язує" і т.п. означає, що антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент утворюють комплекс з антигеном, що є відносно стабільним за фізіологічних умов. Специфічне зв'язування може характеризуватись рівноважною константою дисоціації (KD) близько 3000 нМ або менше (менше значення KD означає більш щільне зв'язування), близько 2000 нМ або менше, близько 1000 нМ або менше, близько 500 нМ або менше, близько 300 нМ або менше, близько 200 нМ або менше, близько 100 нМ або менше, близько 50 нМ або менше, близько 1 нМ або менше або близько 0,5 нМ або менше. Методи для визначення того, або дві молекули зв'язуються специфічно, є добре відомими в цій галузі і включають, наприклад, рівноважний діаліз, поверхневий плазмонний резонанс і т.п. Виділене антитіло, яке специфічно зв'язує hTL1A, може однак демонструвати перехресну реактивність до інших антигенів, таких як молекули TL1A від інших видів, наприклад TL1A яванського макаки (SEQ ID №: 248), та/або TL1A миші (SEQ ID №: 250), та/або варіанту TL1A, такому як Fhm (SEQ ID №: 246). Більше того, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні), які зв'язуються з hTL1A і одним або більше додатковими антигенами, тим не менше вважаються антитілами, які "специфічно зв'язують" hTL1A, як цей термін тут використовується. Термін антитіло "високої афінності" стосується антитіл, що мають афінність зв'язування з -9 -9 hTL1A, яка виражається як KD близько 1 × 10 M або менше, близько 0,5 × 10 M або менше, -9 -10 -10 близько 0,25 × 10 M або менше, близько 1 × 10 M або менше або близько 0,5 × 10 M або менше, як визначається за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, наприклад BIACORE™, або з використанням для визначення афінності в розчині аналізу ELISA. Термін "KD", як він тут використовується, стосується рівноважної константи дисоціації конкретної взаємодії антитіло-антиген. Термін "повільна швидкість дисоціації", "константа дисоціації" або "k d" означає антитіло, яке -3 -1 -4 -1 дисоціює від hTL1A з константою швидкості 1 × 10 с або менше, переважно 1 × 10 с або менше, як визначається за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, наприклад BIACORE™. Термін "константа дійсної афінності" або "k a" означає антитіло, яке зв'язується з hTL1A з 3 -1 -1 константою швидкості близько 1 × 10 M с або більше, як визначається за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, наприклад BIACORE™. Термін "виділене антитіло", як він тут використовується, стосується антитіла, що є суттєво вільним від інших mAb, які мають відмінну антигенну специфічність (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язує hTL1A, є суттєво вільним від Ab, що специфічно зв'язують антигени, інші ніж hTL1A). Однак виділене антитіло, яке специфічно зв'язує hTL1A, демонструє перехресну реактивність до інших антигенів, таких як молекули TL1A від інших видів, таких як яванський макака і миша, та/або варіантів hTL1A, таких як Fhm. Термін "нейтралізуюче антитіло" (або "антитіло, яке нейтралізує активність TL1A), як він тут використовується, стосується антитіла, зв'язування якого з TL1A має своїм результатом пригнічення щонайменше однієї біологічної активності TL1A. Це пригнічення біологічної активності TL1A можна оцінити шляхом вимірювання одного або більше індикаторів біологічної активності TL1A одним або більше з кількох стандартних in vitro або in vivo аналізів, відомих в цій галузі (дивись також приклади, наведені далі). Термін "поверхневий плазмонний резонанс", як він тут використовується, стосується оптичного феномену, який забезпечує аналіз біспецифічних взаємодій в реальному часі шляхом виявлення змін в концентрації білка в біосенсорній матриці, наприклад з використанням системи BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Швеція і Piscataway, США). Термін "епітоп" стосується ділянки антигену, яка зв'язується з антитілом. Епітипи можуть визначатись як структурні або функціональні. Функціональні епітопи є загалом підгрупою структурних епітопів і мають ті залишки, які вносять безпосередній внесок в афінність цієї взаємодії. Епітопи можуть також бути конформаційними, тобто складеними з нелінійних амінокислот. В певних варіантах здійснення епітопи можуть включати детермінанти, які є хімічно активними поверхневими угрупуваннями молекул, таких як амінокислоти, бічні ланцюги цукру, фосфорильні групи або сульфонільні групи, і, в певних варіантах здійснення, можуть 10 UA 110041 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 мати специфічні тривимірні структурні характеристики та/або специфічні зарядні характеристики. Термін "суттєва ідентичність" або "суттєво ідентичний", коли він стосується нуклеїнової кислоти або її фрагменту, вказує на те, що при оптимальному зіставленні з відповідними нуклеотидними вставками або делеціями з іншою нуклеїновою кислотою (або її комплементарною ниткою) має місце ідентичність нуклеотидних послідовностей щонайменше близько 90%, а краще щонайменше близько 95%, 96%, 97%, 98% або 99% нуклеотидних основ, що визначається за допомогою добре відомого алгоритму ідентичності послідовностей, такого як FASTA, BLAST або GAP, як буде розглянуто далі. У застосуванні до поліпептидів термін "суттєва подібність" або "суттєво подібний" означає, що дві пептидні послідовності при оптимальному зіставленні, такому як за допомогою програм GAP або BESTFIT з використанням ваги пропусків за умовчанням, поділяють щонайменше 90% ідентичність послідовностей, а ще краще щонайменше 95%, 98% або 99% ідентичність послідовностей. Переважно, позиції залишків, які не є ідентичними, відрізняються консервативними амінокислотними заміщеннями. "Консервативне амінокислотне заміщення" – це таке заміщення, при якому амінокислотний залишок заміщується іншим амінокислотним залишком, що має бічний ланцюг (групу R) зі схожими хімічними властивостями (наприклад, зарядом або гідрофобністю). Загалом, консервативне амінокислотне заміщення не буде суттєво змінювати функціональні властивості білка. У випадках, коли дві або більше амінокислотні послідовності відрізняються одна від одної консервативними заміщеннями, відсоток або ступінь подібності можна підвищити, щоб внести поправку на консервативну природу такого заміщення. Засоби для здійснення такого регулювання є добре відомими спеціалістам в цій галузі. Дивись, наприклад, статтю Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331, яку включено сюди за посиланням. Приклади груп амінокислот, що мають бічні ланцюги з подібними хімічними властивостями, включають 1) аліфатичні бічні ланцюги: гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин; 2) аліфатичні-гідроксильні бічні ланцюги: серин і треонін; 3) бічні ланцюги, що містять амід: аспарагін і глютамін; 4) ароматичні бічні ланцюги: фенілаланін, тирозин і триптофан; 5) основні бічні ланцюги: лізин, аргінін і гістидин; 6) кислотні бічні ланцюги: аспартат і глутамат, і 7) бічні ланцюги, що містять сірку: цистеїн і метіонін. Кращими групами для консервативного амінокислотного заміщення є: валін-лейцин-ізолейцин, фенілаланін-тирозин, лізин-аргінін, аланін-валін, глутамат-аспартат і аспарагін-глютамін. Як варіант, консервативне заміщення – це будь-яка зміна, що має позитивну величину в матриці логарифмічної правдоподібності РАМ250, описаній у статті Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45, яку включено сюди за посиланням. "Помірно консервативне заміщення" – це будь-яка зміна, що має ненегативну величину в матриці логарифмічної правдоподібності РАМ250. Подібність послідовностей для поліпептидів типово оцінюється з використанням програми аналізу послідовностей. Програма аналізу білків підбирає подібні послідовності, використовуючи міри подібності, приписані різним заміщенням, делеціям або іншим модифікаціям, включаючи консервативні амінокислотні заміщення. Наприклад, програмне забезпечення GCG містить програми, такі як GAP і BESTFIT, які можуть використовуватись з параметрами за умовчанням для визначення гомології послідовностей або ідентичності послідовностей між близько спорідненими поліпептидами, такими як гомологічні поліпептиди від іншого виду організмів або між білком дикого типу і його мутеїном. Дивись, наприклад, GCG Version 6.1. Поліпептидні послідовності можна порівнювати також з використанням FASTA з параметрами за умовчанням або рекомендованими параметрами; програми в GCG Version 6.1. FASTA (наприклад, FASTA2 і FASTA3) забезпечує зіставлення і визначення відсотку ідентичності послідовностей ділянок найкращого перекриття між запитаною і пошуковою послідовностями (Pearson, 2000, supra). Іншим зручним алгоритмом для порівняння послідовності за цим винаходом з базою даних, що містить велику кількість послідовностей від різних організмів, є комп'ютерна програма BLAST, зокрема BLASTP або TBLASTN, яка використовує параметри за умовчанням. Дивись, наприклад, статті Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403 410 і, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389 402, кожну з яких включено сюди за посиланням. Вираз "терапевтично ефективна кількість" означає таку кількість, яка викликає бажаний ефект, для якого вона вводиться. Точна кількість буде залежати від мети лікування, віку і розміру суб'єкта, що лікується, шляху введення і т.п. і буде визначатись спеціалістом в цій галузі за допомогою відомих методик (дивись, наприклад, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding). Приготування людських антитіл 11 UA 110041 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Методи генерування людських антитіл в трансгенних мишах є відомими в цій галузі. Будь-які такі відомі методи можуть бути використані в контексті даного винаходу для одержання людських антитіл, які специфічно зв'язуються з TL1A. При використанні технології VELOCIMMUNE™ або будь-якого іншого відомого методу для генерування моноклональних антитіл спочатку виділяють високо афінні химерні антитіла до TL1A, що мають людську варіабельну ділянку і мишачу постійну ділянку. Як показано в наведеному далі експериментальному розділі, ці антитіла охарактеризовують і відбирають за бажаними характеристиками, включаючи афінність, селективність, епітоп і т.п. Загалом, антитіла за цим винаходом володіють дуже високою афінністю, типово маючи K D -12 -9 від близько 10 M до близько 10 M, при визначенні шляхом зв'язування з антигеном, іммобілізованим на твердій фазі або у фазі розчину. Мишачі постійні ділянки заміщуються бажаними людськими постійними ділянками, наприклад IgG1 дикого типу (SEQ ID №: 255) або IgG4 (SEQ ID №: 256), або модифікованим IgG1 або IgG4 (наприклад, IgG4 з Ser-108, заміщеним на Pro, як показано в SEQ ID №: 257), для створення повністю людських антитіл за цим винаходом. Тоді як вибрана постійна ділянка може варіювати у відповідності до конкретного використання, такі характеристики антитіла, як зв'язування антигену з високою афінністю і специфічність до мішені, належать варіабельній ділянці. Картування епітопів і споріднені технології Для скринінгу антитіл, що зв'язуються з конкретним епітопом, можна здійснити рутинний епітоп перехресний конкурентний аналіз, такий як описаний в Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Інші методи включають скануючий аланіном мутагенез, пептидний блотинг (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-63) (спеціально включено сюди за посиланням у всій повноті) або аналіз розщеплення пептидів. Крім того, можна скористатись такими методами, як висічення епітопу, екстракція епітопу і хімічна модифікація антигенів (Tomer, 2000, Protein Science 9: 487-496) (спеціально включено сюди за посиланням у всій повноті). Термін "епітоп" стосується місця на антигені, на яке реагують В та/або Т клітини. В-клітинні епітопи можуть бути утворені як з суміжних амінокислот, так і з несуміжних амінокислот, які накладаються при третинній укладці білка. Епітопи, утворені з суміжних амінокислот типово зберігаються під дією денатуруючих розчинників, тоді як епітопи, утворені шляхом третинної укладки типово втрачаються після обробки денатуруючими розчинниками. Епітоп типово містить щонайменше 3, а частіше щонайменше 5 або 8-10 амінокислот в унікальній просторовій конформації. Профілювання з використанням модифікації (MAP), відоме також як профілювання антитіла на основі структури антигену (ASAP), є методом, який розподіляє за категоріями великі кількості mAb, спрямованих проти того самого антигену, у відповідності до подібності профілю зв'язування кожного антитіла з хімічно або ферментативно модифікованими поверхнями антигену (патентна заявка США № 2004/0101920, спеціально включений сюди за посиланням у всій його повноті). Кожна категорія може відображати унікальний епітоп, який чітко відрізняється від епітопу, представленого іншою категорією, або частково перекривається з ним. Така технологія дозволяє швидко відфільтрувати генетично ідентичні mAb, так що встановлення характеристик може фокусуватись на генетично відмінних mAb. При застосуванні до скринінгу гібридом МАР може забезпечити ідентифікацію рідкісних клонів гібридом, які продукують mAb, що мають бажані характеристики. МАР можна скористатись для сортування анти-TL1A mAb за цим винаходом на групи mAb, що зв'язуються з різними епітопами. Даний винахід включає hTL1A антитіла, які зв'язуються з тим самим епітопом, що й будь-яке з описаних тут конкретних показових антитіл. Подібним чином, даний винахід включає також анти-hTL1A антитіла, які конкурують за зв'язування з hTL1A або фрагментом hTL1A з будь-яким з описаних тут конкретних показових антитіл. Можна легко визначити, або зв'язується антитіло з тим самим епітопом, що й контрольне анти-hTL1A антитіло, або воно конкурує за зв'язування з контрольним анти-hTL1A антитілом, користуючись рутинними методами, відомими в цій галузі. Наприклад, щоб визначити, або тестове антитіло зв'язується з тим самим епітопом, що й контрольне анти-hTL1A антитіло за цим винаходом, контрольному антитілу дозволяють зв'язатись з білком або пептидом hTL1A за умов насичення. Потім оцінюють здатність тестового антитіла зв'язуватись з молекулою hTL1A. Якщо тестове антитіло демонструє здатність зв'язуватись з hTL1A після зв'язування за умов насичення з контрольним анти-hTL1A антитілом, можна зробити висновок, що тестове антитіло зв'язується з іншим епітопом, ніж контрольне анти-hTL1A антитіло. З іншого боку, коли тестове антитіло не здатне зв'язуватись з молекулою hTL1A після насичуючого зв'язування з 12 UA 110041 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 контрольним анти-hTL1A антитілом, то це означає, що тестове антитіло може зв'язуватись з тим самим епітопом, що й епітоп, зв'язаний з контрольним анти-hTL1A антитілом за цим винаходом. Щоб визначити, або конкурує антитіло за зв'язування з контрольним анти-hTL1A антитілом, вищеописана методологія зв'язування здійснюється в двох орієнтаціях: В першій орієнтації контрольному антитілу дають зв'язатись з молекулою hTL1A за умов насичення, після чого оцінюють зв'язування тестового антитіла з молекулою hTL1A. В другій орієнтації тестовому антитілу дають зв'язатись з молекулою hTL1A за умов насичення, після чого оцінюють зв'язування контрольного антитіла з молекулою TL1A. Коли в обох орієнтаціях тільки перше (насичуюче) антитіло є здатним зв'язуватись з молекулою TL1A, робиться висновок про те, що тестове антитіло і контрольне антитіло конкурують за зв'язування з hTL1A. Як має бути зрозумілим для спеціаліста в цій галузі, антитіло, яке конкурує за зв'язування з контрольним антитілом, не обов'язково має зв'язуватись з епітопом, ідентичним тому, з яким зв'язується контрольне антитіло, але може просторово блокувати зв'язування контрольного антитіла зв'язуванням частково збіжного або суміжного епітопу. Два антитіла зв'язуються з тим самим або частково збіжним епітопом, якщо кожне конкурентно пригнічує (блокує) зв'язування іншого до антигену. Тобто, 1-, 5-, 10-, 20- або 100кратний надлишок одного антитіла пригнічує зв'язування іншого щонайменше на 50%, але краще на 75%, 90% або навіть 99%, що визначається в пробі на конкурентне зв'язування (дивись, наприклад, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Як варіант, два антитіла мають той самий епітоп, якщо суттєво всі амінокислотні мутації в антигені, які зменшують або усувають зв'язування одного антитіла зменшують або усувають зв'язування іншого. Потім можна провести додаткову рутинну експериментальну перевірку (наприклад, з використанням аналізів мутації пептидів і зв'язування), щоб переконатись у тому, що спостережувана відсутність зв'язування тестового антитіла дійсно пов'язана з його зв'язуванням з тим самим епітопом, що й контрольне антитіло, або в тому, що відповідальним за спостережувану відсутність зв'язування є просторове блокування (або інше явище). Експерименти цього виду можуть здійснюватись з використанням ELISA, RIA, поверхневого плазмонного резонансу, проточної цитометрії або будь-якої іншої кількісної або якісної проби на зв'язування антитіла, відомої в цій галузі. Імунокон'югати Даний винахід охоплює людське анти-TL1A моноклональне антитіло, кон'юговане до терапевтичного фрагмента ("імунокон'югат"), такого як цитотоксин, хіміотерапевтичний препарат, імуносупресант або радіоізотоп. Цитотоксинові агенти включають будь-який препарат, що є шкідливим для клітин. Приклади придатних цитотоксинових агентів і хіміотерапевтичних препаратів для утворення імунокон'югатів є відомими в цій галузі (дивись, наприклад, публікацію WO 05/103081, яку спеціально включено сюди за посиланням). Біспецифічні антитіла Антитіла за цим винаходом можуть бути моноспецифічними, біспецифічними або мультиспецифічними. Мультиспецифічні mAb можуть бути специфічними для різних епітопів одного цільового поліпептиду або можуть містити антигензв'язуючі домени, специфічні для більше ніж одного цільового поліпептиду. Дивись, наприклад, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69. Людські анти-hTL1A антитіла можуть бути зв'язаними з іншою функціональною молекулою або ко-експресуватись з іншою функціональною молекулою, наприклад іншим пептидом або білком. Наприклад, антитіло або його фрагмент можуть функціонально зв'язуватись (наприклад, шляхом хімічного з'єднання, генетичного злиття, нековалентної асоціації або по-іншому) з однією або більше іншими молекулярними одиницями, такими як інше антитіло або фрагмент антитіла, з отриманням біспецифічного або мультиспецифічного антитіла з другою специфічністю зв'язування. Форма показового біспецифічного антитіла, яка може використовуватись в контексті даного винаходу, передбачає застосування першого імуноглобулінового (Ig) домену CH3 і другого Ig домену CH3, при цьому перший і другий домени C H3 відрізняються один від одного щонайменше однією амінокислотою і щонайменше одна амінокислотна відмінність зменшує зв'язування біспецифічного антитіла з Білком А порівняно з біспецифічним антитілом з відсутньою відмінністю амінокислот. В одному варіанті здійснення перший імуноглобуліновий домену CH3 зв'язує Білок А, а другий Ig домен CH3 містить мутацію, яка зменшує або усуває зв'язування Білка А, таку як модифікація H95R (за нумерацією екзонів IMGT (ця нумерація починається з першого нуклеотиду першого кодону кожного екзону); H435R за нумерацією EU). Другий домен CH3 може додатково містити модифікацію Y96F (за IMGT; Y436F за EU). Подальші модифікації, які можуть бути знайдені в другому домені CH3, включають: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M і V82I (за IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M і V422I за EU) у випадку IgG1 антитіл; 13 UA 110041 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 N44S, K52N і V82I (IMGT; N384S, K392N і V422I за EU) у випадку IgG2 антитіл; та Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q і V82I (за IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q і V422I за EU) у випадку IgG4 антитіл. Припускається, що вищеописані варіації у формі біспецифічного антитіла входять до об'єму даного винаходу. Біоеквіваленти Анти-hTL1A антитіла і фрагменти антитіл за даним винаходом охоплюють білки, що мають амінокислотні послідовності, які відрізняються від послідовностей описаних mAb, але які зберігають здатність зв'язувати людський TL1A. Такі варіантні mAb і фрагменти антитіл містять одну або більше вставок, делецій або заміщень амінокислот у порівнянні з материнською послідовністю, але демонструють біологічну активність, яка є суттєво еквівалентною активності описаних mAb. Подібним чином, кодуючі hTL1A mAb послідовності ДНК за цим винаходом охоплюють послідовності, які містять одну або більше вставок, делецій або заміщень нуклеотидів у порівнянні з описаною послідовністю, але які кодують анти-hTL1A антитіло або фрагмент антитіла, що є суттєво біоеквівалентними анти-hTL1A антитілу або фрагменту антитіла за цим винаходом. Приклади таких варіантних амінокислотних і ДНК послідовностей вже наводились вище. Два антигензв'язуючі білки або антитіла вважаються біоеквівалентними, коли, наприклад, вони є фармацевтичними еквівалентами або фармацевтичними альтернативами, швидкість і ступінь абсорбції яких не показують значної різниці, коли вводяться в тій самій молярній дозі в подібних експериментальних умовах, після однієї або кількох введень. Певні антитіла будуть вважатись еквівалентами або фармацевтичними альтернативами, коли вони є еквівалентними у відношенні ступеня їх абсорбції і, крім того, можуть вважатись біоеквівалентними, оскільки такі відмінності в швидкості абсорбції є навмисними і є відображеними в позначенні, є несуттєвими для досягнення ефективної концентрації препарату в організмі після, наприклад, хронічного застосування і вважаються несуттєвими з медичної точки зору для конкретного досліджуваного лікарського продукту. В одному варіанті здійснення два антигензв'язуючі білки є біоеквівалентними, коли немає клінічно значимих відмінностей в їх безпечності, чистоті або активності. В одному варіанті здійснення два антигензв'язуючі білки є біоеквівалентними, коли пацієнта можна переключати один або більше разів між контрольним продуктом і біологічним продуктом без очікуваного підвищення ризику несприятливих ефектів, включаючи клінічно значиму зміну імуногенності або знижену ефективність у порівнянні з продовженням терапії без такого переключення. В одному варіанті здійснення два антигензв'язуючі білки є біоеквівалентними, коли обидва діють за спільним механізмом або механізмами дії у випадку стану або станів, для яких вони використовуються, до тієї міри, до якої такі механізми є відомими. Біоеквівалентність можна продемонструвати методами in vivo та in vitro. Міри біоеквівалентності включають, наприклад, (a) тест in vivo на людях або інших ссавцях, в якому концентрація антитіла або його метаболітів визначається в крові, плазмі, сироватці або іншій біологічній рідині як функція часу; (b) тест in vitro, який було скориговано з даними щодо біодоступності in vivo і який є надійно прогностичним для людини; (c) тест in vivo на людях або інших ссавцях, в якому відповідний гострий фармакологічний ефект антитіла (або його мішені) визначається як функція часу; і (d) в добре контрольованому клінічному випробуванні, яке встановлює безпечність, ефективність або біодоступність або біоеквівалентність антитіла. Біоеквівалентні варіанти анти-hTL1A антитіл за цим винаходом можуть конструюватись, наприклад, шляхом різних заміщень залишків або послідовностей або делеції термінальних або внутрішніх залишків або послідовностей, не потрібних для біологічної активності. Наприклад, цистеїнові залишки, несуттєві для біологічної активності, можуть бути піддані делеції або заміщенню іншими амінокислотами, щоб попередити утворення непотрібних або неправильних внутрішньо-молекулярних дисульфідних містків після ренатурації. Терапевтичне введення і препарати Даний винахід пропонує терапевтичні композиції, які містять анти-hTL1A антитіла або їх антигензв'язуючі фрагменти за цим винаходом, а також терапевтичні способи, в яких вони використовуються. Введення терапевтичних композицій у відповідності до даного винаходу передбачає застосування відповідних носіїв, допоміжних речовин та інших агентів, які включаються в лікарські препарати для забезпечення кращого перенесення, доставки, переносимості і т.п. Велику кількість відповідних препаратів можна знайти у формулярі, відомому всім фармацевтичним хімікам: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ці препарати включають, наприклад, порошки, пасти, мазі, желе, воски, олії, ліпіди, пухирці, що містять ліпіди (катіонні і аніонні) (такі як LIPOFECTIN™), кон'югати ДНК, 14 UA 110041 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 безводні абсорбційні пасти, емульсії олія-у-воді і вода-в олії, емульсії карбовакс (поліетилен гліколі різної молекулярної маси), напівтверді гелі і напівтверді суміші, що містять карбовакс. Дивись також Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA, 1998, J Pharm Sci Technol 52:238-311. Доза може коливатись в залежності від віку і розмірів суб'єкта, якому вона вводиться, цільової хвороби, мети лікування, умов, шляху введення і т.п. Коли антитіло за цим винаходом використовується для лікування різних станів і хвороб, прямо або непрямо пов'язаних з TL1A, включаючи запальні хвороби/розлади, автоімунні хвороби/розлади, алергічні реакції і т.п., у дорослого пацієнта, доцільно вводити антитіло за цим винаходом внутрішньовенно або підшкірно в єдиній дозі від близько 0,01 до близько 20 мг/кг маси тіла, краще від близько 0,02 до близько 7, від близько 0,03 до близько 5 або від близько 0,05 до близько 3 мг/кг маси тіла. В залежності від тяжкості стану, частота і тривалість лікування можуть регулюватись. В певних варіантах здійснення антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за цим винаходом можуть вводитись в початковій дозі від щонайменше близько 0,1 мг до близько 800 мг, від близько 1 до близько 500 мг, від близько 5 до близько 300 мг або від близько 10 до близько 200 мг, до близько 100 мг або до близько 50 мг. В певних варіантах здійснення за початковою дозою може слідувати введення другої або певної кількості наступних доз антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента в кількості, яка може бути такою ж або меншою ніж початкова доза, коли наступні дози відділяються щонайменше 1-3 днями, щонайменше тижнем, щонайменше 2 тижнями, щонайменше 3 тижнями; щонайменше 4 тижнями; щонайменше 5 тижнями; щонайменше 6 тижнями; щонайменше 7 тижнями; щонайменше 8 тижнями; щонайменше 9 тижнями; щонайменше 10 тижнями; щонайменше 12 тижнями; або щонайменше 14 тижнями. Різні системи доставки є відомими і можуть бути використані для введення фармацевтичної композиції за цим винаходом, наприклад інкапсуляція в ліпосоми, мікрочастки, мікрокапсули, рекомбінантні клітини, здатні експресу вати мутантні віруси, опосередкований рецептором ендоцитоз (дивись, наприклад, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Методи введення включають, не обмежуючись ними, інтрадермальний, внутрішньом'язовий, інтраперитонеальний, внутрішньовенний, підшкірний, інтраназальний, епідуральний і оральний шляхи. Така композиція може вводитись будь-яким звичайним шляхом, наприклад інфузії або болюсної ін'єкції, всмоктування через епітеліальні і слизово-шкірні вистилання (наприклад, оральну слизову оболонку, ректальну і кишкову слизову оболонку і т.п.) і може вводитись разом з іншими біологічно активними агентами. Введення може бути системним або місцевим. Фармацевтична композиція може доставлятись також в пухирцях, зокрема в ліпосомах (дивись Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., 1989, в Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; дивись загалом ibid.). В певних ситуаціях фармацевтична композиція може доставлятись за допомогою системи контрольованого вивільнення. В одному варіанті здійснення може використовуватись насос (дивись Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). В іншому варіанті здійснення можуть використовуватись полімерні матеріали; дивись, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974). В ще іншому варіанті здійснення система контрольованого вивільнення може розміщуватись поблизу мішені композиції, що вводиться, тим самим вимагаючи тільки частки системної дози (дивись, наприклад, Goodson, в Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984). Ін'єкційні препарати можуть включати лікарські форми для внутрішньовенних, підшкірних, інтрадермальних або внутрішньом'язових ін'єкцій, крапельних інфузій і т.п. Такі ін'єкційні препарати можуть готуватись загальновідомими методами. Наприклад, ін'єкційні препарати можуть готуватись, наприклад, шляхом розчинення, суспендування або емульгування антитіла або його солі, описаних вище, в стерильному водному середовищі або олійному середовищі, які звичайно використовуються для ін'єкцій. В якості водного середовища для ін'єкцій можуть використовуватись, наприклад, фізіологічний сольовий розчин, ізотонічний розчин, що містить глюкозу та інші допоміжні речовини, і т.п., які можуть комбінуватись з відповідними агентами для солюбілізації, такими як спирт (наприклад, етиловий спирт), поліспирт (наприклад, пропілен гліколь, поліпропілен гліколь), неіонний сурфактант [наприклад, полісорбат 80, HCO-50 (поліоксиетиленовий (50 моль) адукт гідрогенізованої рицинової олії)] і т.д. В якості олійного середовища для ін'єкцій можуть використовуватись, наприклад, кунжутна олія, соєва олія, які можуть комбінуватись з відповідними агентами для солюбілізації, такими як бензил бензоат, бензиловий спирт і т.д. Ін'єкційний матеріал, приготовлений у такий спосіб, переважно міститься у відповідних ампулах. Фармацевтична композиція за цим винаходом може доставлятись 15 UA 110041 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 підшкірно або внутрішньовенно стандартною голкою і шприцом. Крім того, що стосується підшкірної доставки, шприц-ручка може бути легко застосована для доставки фармацевтичної композиції за цим винаходом. Такі шприц-ручки можуть призначатись для одноразового і повторного використання. Шприц-ручка для повторного використання загалом використовує замінний картридж, який містить фармацевтичну композицію. Коли вся фармацевтична композиція з картриджу введена і картридж є порожнім, порожній картридж легко видаляється і замінюється новим картриджем, який містить фармацевтичну композицію. Шприц-ручка може потім використовуватись повторно. В одноразовому шприці-ручці немає замінного картриджу. Такий шприц-ручка попередньо наповнюється фармацевтичною композицією, яка утримується в резервуарі всередині ручки. Коли резервуар спорожняється, весь пристрій викидають. Численні шприци-ручки для повторного використання і автоінжекторні пристрої для доставки знаходять застосування для підшкірного введення фармацевтичної композиції за цим винаходом. Приклади включають, звичайно не обмежуючись ними, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Велика Британія), шприц-ручку DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Швейцарія), шприц-ручку HUMALOG MIX 75/25™, шприц-ручку HUMALOG™, шприц-ручку HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, США), NOVOPEN™ I, II and III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Данія), шприц-ручку BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, США), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ і OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Німеччина), щоб назвати тільки деякі. Приклади одноразових шприц-ручок для доставки медикаментів, що знаходять застосування для підшкірного введення фармацевтичної композиції за цим винаходом, включають, звичайно не обмежуючись ними, шприц-ручку SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) та KWIKPEN™ (Eli Lilly). Переважно, фармацевтичні композиції для орального або парентерального застосування, описані вище, готуються як лікарські форми в одноразовій дозі, яка відповідає дозі активних інгредієнтів. Такі лікарські форми в одноразовій дозі включають, наприклад, таблетки, пігулки, капсули, ін'єкції (ампули), супозиторії і т.п. Кількість раніше вказаного антитіла, що міститься в них, загалом становить від близько 0,1 до близько 800 мг на одну лікарську форму в одноразовій дозі; зокрема у формі ін'єкції, раніше вказане антитіло міститься в кількості від близько 1 до близько 500 мг, від близько 5 до 300 мг, від близько 8 до 200 мг і від близько 10 до близько 100 мг для інших лікарських форм. Комбінаційна терапія Даний винахід додатково пропонує терапевтичні способи лікування хвороб або розладів, які прямо або непрямо асоціюються з hTL1A, шляхом введення hTL1A mAb або його фрагмента за цим винаходом в комбінації з одним або більше додатковими терапевтичними агентами. Такий додатковий терапевтичний агент може бути одним або більше з будь-яких агентів, які з користю комбінуються з антитілом або його фрагментом за цим винаходом, включаючи імуносупресанти, протизапальні агенти, анальгетики, протиалергійні агенти і т.п. Придатні імуносупресанти включають, не обмежуючись ними, глюкокортикоїди, циклоспорин, метотрексат, інтерферон β (IFN-β), такролімус, сіролімус, азатіоприн, меркаптопурин, опіоїди, мікофенолат, білки, що зв'язують TNF, такі як інфліксімаб, етернацепт, адалімумаб і т.п., цитотоксичні антибіотики, такі як дактиноміцин, антрацикліни, мітоміцин C, блеоміцин, мітраміцин і т.п., антитіла, націлені на імунні клітини, такі як анти-CD20 антитіла, анти-CD3 антитіла і т.п. Придатні протизапальні агенти та/або анальгетики для комбінаційної терапії з анти-hTL1A антитілами включають кортикостероїди, не стероїдні протизапальні препарати (NSAIDs), такі як аспірин, ібупрофен, напроксен, інгібітори Cox-2 і т.п., антагоністи TNF-α (наприклад, інфліксімаб або REMICADE® від Centocor Inc.; голімумаб від Centocor Inc.; етанерцепт або ENBREL® від Amgen/Wyeth; адалімумаб або HUMIRA® від Abbott Laboratories і т.п.), антагоністи IL-1 (наприклад, IL-1зв'язуючі злиті білки, наприклад, Arcalyst® від Regeneron Pharmaceuticals, Inc., дивись патент США № 6,927,044; Kineret® від Amgen і т.п.), антагоністи IL-6 (наприклад, анти-IL-6 рецепторні антитіла, як описано в патенті США № 7,582,298, і Actemra® від Roche), ацетамінофен, морфіноміметики і т.п. Придатні протиалергійні агенти, які можуть блокувати дію медіаторів алергії або попереджати активацію клітин і процеси дегрануляції, включають антигістаміни, глюкокортикоїди, епінефрин (адреналін), теофілін, натрієву сіль кромоліну і анти-лейкотрієни, такі як монтелукаст (SINGULAIR® від Merck) або зафірлукаст (ACCOLATE® від AstraZeneca), а також анти-холінергічні агенти, протизастійні агенти, стабілізатори тучних клітин та інші сполуки, які можуть порушувати хемотаксис еозинофілів. hTL1A mAb або його фрагмент за цим винаходом і додатковий терапевтичний агент (агенти) можуть водитись разом або окремо. Коли використовуються окремі дозовані лікарські форми, антитіло або його фрагмент за цим винаходом і додатковий терапевтичний агент можуть 16 UA 110041 C2 5 10 15 20 25 30 35 водитись одночасно або окремо з певним зміщенням у часі, тобто послідовно, у певному порядку. ПРИКЛАДИ Наступні приклади наведені так, щоб забезпечити спеціаліста в цій галузі повним розкриттям і описом того, як здійснити і використати способи і композиції за цим винаходом, але вони не призначаютьсядля того, щоб обмежити об'єм того, що винахідники вважають своїм винаходом. Були вжиті заходи, щоб гарантувати точність у відношенні використаних цифр, але слід враховувати можливість певних експериментальних похибок і відхилень. Коли не вказується інше, молекулярна маса є середньою молекулярною масою, температура дається в градусах Цельсія, а тиск є атмосферним або близьким до атмосферного. Приклад 1: Генерування людських антитіл до людського TL1A Мишей VELOCIMMUNE™ було імунізовано людським TL1A, і гуморальна імунна відповідь контролювалась за допомогою антиген-специфічного імуноаналізу з використанням сироватки, отриманої від цих мишей. В клітини, що експресують анти-hTL1A антитіло, були зібрані з селезінок імунізованих мишей, які мали підвищені титри анти-hTL1A антитіла, і були злиті з клітинами мишачої мієломи з утворенням гібридом. Ці гібридоми були піддані скринінгу і відбору, щоб ідентифікувати клітинні лінії, що експресують hTL1A-специфічні антитіла, з використанням аналізів, які будуть описані далі. Ці аналізи дозволили ідентифікувати кілька клітинних ліній, які продукували химерні анти-hTL1A антитіла, позначені як H2M1681N, H2M1704N, H2M1804N, H2M1805N, H2M1817N і H2M1818N. Ці антитіла пізніше були перетворені на ізотип hIgG4 шляхом заміщення відповідних мишачих постійних ділянок амінокислотною послідовністю hIgG4 SEQ ID №: 257, яка містить мутацію S108P в шарнірній ділянці, і позначені як H4H1681N, H4H1704N, H4H1804N, H4H1805N, H4H1817N і H4H1818N, відповідно. Людські TL1A-специфічні антитіла були виділені також безпосередньо з імунізованих антигеном В клітин, без злиття з клітинами мієломи, як описано в патенті США № 7,582,298, який включено сюди за посиланням у всій його повноті. Варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів було клоновано, щоб генерувати повністю людські анти-hTL1A антитіла, позначені як H4H1719P, H4H1725P, H4H1738P, H4H1742P, H4H1745P, H4H1750P і H4H1752P. Були встановлені стабільні рекомбінантні клітинні лінії СНО, які експресують антитіло. Приклад 2: Аналіз утилізації варіабельного гену Щоб проаналізувати структуру отриманих антитіл, нуклеїнові кислоти, кодуючі варіабельні ділянки антитіла було клоновано і піддано секвенуванню. За послідовністю нуклеїнових кислот і прогнозованою амінокислотною послідовністю цих антитіл було ідентифіковано частоту використання гену для кожної варіабельної ділянки важкого ланцюга (HCVR) і варіабельної ділянки легкого ланцюга (LCVR). В Таблиці 1 наведена частота використання гену для вибраних антитіл у відповідності до цього винаходу. Таблиця 1 Антитіло H2M1704 H2M1681 H2M1817 H2M1804 H2M1818 H2M1805 H4H1719 H4H1725 H4H1738 H4H1742 H4H1745 H4H1750 H4H1752 40 VH 3-7 3-23 4-34 4-34 3-11 4-34 3-9 1-2 3-15 3-23 3-23 3-30 3-23 HCVR DH 1-7 2-21 3-9 1-1 4-17 3-3 3-3 2-15 4-4 2-2 6-6 4-17 1-7 LCVR JH 6 4 4 4 6 4 6 3 6 6 4 6 4 VK 4-1 1-5 3-20 3-20 4-1 2-24 2-28 1-12 2-28 1-9 1-9 1-17 1-5 JK 3 1 4 4 1 4 2 4 2 2 4 1 1 В Таблиці 2 наведені пари амінокислотних послідовностей варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів вибраних анти-hTL1A антитіл та їх відповідних антитільних ідентифікаторів. Позначення N і P стосуються антитіл, що мають важкий і легкий ланцюги, з ідентичними послідовностями CDR, але з варіаціями послідовностей на ділянках поза послідовностями CDR 17 UA 110041 C2 (тобто, на каркасних ділянках). Таким чином, варіанти N і P конкретного антитіла мають ідентичні послідовності CDR в межах варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів, але містять модифікації в межах каркасних ділянок. Таблиця 2 Назва mAb (H2M- або H4H-) 1704N 1681N 1804N 1805N 1817N 1818N 1719N 1719P 1725N 1725P Назва mAb (H2M- або H4H-) 1738N 1738P 1745N 1745P 1750N 1750P 1752N 1752P 1742N 1742P HCVR/LCVR SEQ ID №№: 2/10 18/26 34/42 50/58 66/74 82/90 98/106 114/116 118/126 134/136 HCVR/LCVR SEQ ID №№: 138/146 154/156 158/166 174/176 178/186 194/196 198/206 214/216 218/226 234/236 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Приклад 3: Визначення афінності до зв'язування TL1A Афінність до зв'язування і кінетичні константи визначались за допомогою поверхневого плазмонного резонансу при 25 °C і 37 °C, як показано в Таблицях 3-5 для зв'язування людських моноклональних анти-TL1A антитіл до наступних видових варіантів TL1A: людське (h) (CHOекспресоване, залишки 72-251 послідовності SEQ ID №: 244, з N-термінальною His6-міткою), яванського макаки (Mf) (E. coli-експресоване, залишки 72-251 послідовності SEQ ID №: 248, з або без N-термінального Met), яванського макаки (CHO-експресоване, залишки 72-251 послідовності SEQ ID №: 248, з N-термінальною His6-міткою), мишаче (m) (E. coli-експресоване, залишки 76-252 послідовності SEQ ID №: 250, з або без N-термінального Met), мишаче (CHOекспресоване, залишки 76-252 послідовності SEQ ID №: 250, з N-термінальною His6-міткою), і щуряче (CHO клітками-експресоване; залишки 76-252 послідовності SEQ ID №: 258, з Nтермінальною His6-міткою). Константи зв'язування також були визначені для варіанту hTL1A, Fhm (E. coli-експресований, залишки 72-251 послідовності SEQ ID №: 246, що містить заміщення Q167R, з або без N-термінального Met). Визначення здійснювались за допомогою приладу T100 BIACORE™. Антитіла, експресовані з мишачим Fc (позначений префіксом "H2M") або людським IgG4(S108P) Fc (позначений префіксом "H4H"), були захоплені на анти-Fc сенсорній поверхні, і щонайменше три різні концентрації розчинних білків TL1A в межах від 1,25 нМ до 100 нМ інжектували на сенсорну поверхню. Константи швидкості кінетичної асоціації (k a) і дисоціації (kd) були визначені шляхом підгонки даних до моделі зв'язування 1:1 з використанням програмного забезпечення для підгонки кривої BIAevaluation 4.1 (BIAcore Life Sciences). Молярні концентрації TL1A/Fhm, використані при підгонці даних, припускали мономерний стан для TL1A в розчині. Рівноважні константи дисоціації при зв'язуванні (KD) і півперіоди дисоціації (t1/2) обчислювались за кінетичними константами швидкості наступним чином: K D (M) = kd / ka; і t1/2 (хв.) = [ln2/(60*kd)]. NB: За тестових умов зв'язування відсутнє; NT: Не тестувалось в цьому -6 експерименті; *: Підібрані величини kd нижче 1x10 (1/с) є більш повільними ніж межа виявлення -6 за цих експериментальних умов; відповідно, величини k d були встановлені на 1x10 (1/с) з метою апроксимації KD і t1/2; **: Рівноважні константи дисоціації для антитіл визначались за умов, що встановились. Як показано в Таблицях 3 і 4, антитіла, зв'язані з високою афінністю з СНО-експресованими формами людського і мавпячого білків TL1A при 25 °C (13 і 12 антитіла з KD < 1 нМ, відповідно) і при 37 °C (13 і 12 антитіла з KD < 1 нМ, відповідно). H4H1750P зв'язувалось значно слабше з мавпячим порівняно з людським білком TL1A. H4H1704N зв'язувалось з CHO-експресованим mTL1A з KD 10000 >10000 44 NT 23 18 152 214 44 589 NB 69 102 NB NB 235 249 202 317 hDR3 MfTL1A 2 (CHO) IC50 (пМ) 141 61 42 NT 46 16 117 240 50 5209 110 71 81 26 13 101 137 123 239 >10000 NB >10000 NB hDR3 hDR3 1 1 hTL1A (CHO) Fhm (CHO) IC50 (пМ) IC50 (пМ) 17 13 77 NT 44 68 122 181 58 656 31 175 120 33 12 270 890 232 396 90 234 170 NT 45 85 150 231 85 626 NB >10000 >10000 436 2241 NT 666 NT NB DcR3 MfTL1A 4 (CHO) IC50 (пМ) 93 149 110 NT 61 145 68 127 118 NB 56 34 9 313 1138 322 776 1102 55 5300 >1000 NT 21000 17000 8600 NT NT DcR3 DcR3 3 3 hTL1A (CHO) Fhm (CHO) IC50 (пМ) IC50 (пМ) Приклад 6: Конкуренція за зв'язування TL1A антитіл на клітинній поверхні з розчинним hTL1A Клітини 293 людської ембріональної нирки, стабільно трансфіковані для над-експресії hTL1A клітинної поверхні, спочатку забарвлювались в проточно-цитометричному експерименті з вісьмома анти-hTL1A антитілами в чотирьох концентраціях (1; 0,1; 0,01 і 0,003 мкг/мл). Зв'язані людські антитіла виявлялись за допомогою міченого алофікоціаніном козячого F(ab') 2, специфічного до людського Fcγ [або анти-hFcγ-APC F(ab")2, Jackson ImmunoResearch, # 109136-170]. Потім в експерименті на конкурентне зв'язування використовувалась найнижча концентрація антитіла, яка забезпечувала суттєві рівні забарвлення. Контрольне антитіло негативного ізотипу (людський IgG4) використовувалось в концентрації 1 мкг/мл для визначення фонового сигналу. Для експерименту на конкурентне зв'язування зразки восьми антитіл в мінімальних концентраціях, ідентифікованих вище, спочатку оброблялись розчинним hTL1A, експресованим з СНО клітин, в концентраціях в межах від 0,03 мкг/мл до 10 мкг/мл. Після 23 UA 110041 C2 5 10 попередньої інкубації впродовж 30 хвилин на льоду суміш антитіло/hTL1A додавалась до клітин 293/HEK-hTL1A, які були виділені центрифугуванням в 96-лунковому конічному планшеті. Після інкубації впродовж додаткових 10 хвилин на льоду клітини промивались. Вторинний реагент, анти-hFcγ-APC F(ab")2, додавався до всіх лунок в 200-кратному розведенні, щоб виявити зв'язані антитіла. Зразки інкубувались 15 хвилин на льоду, подалі від світла, після чого промивались. Клітини обробляли на проточному цитометрі BD™ LSR II Flow Cytometer (BD Biosciences), щоб виявити анти-hTL1A антитіла, зв'язані з клітинною поверхнею, і дані аналізувались за допомогою програми FlowJo (версія 8.8.6; Tree Star Inc.). Результати наведені в Таблиці 9. Максимальний сигнал: Зв'язування анти-hTL1A антитіла за відсутності розчинного hTL1A; Мінімальний сигнал: Сигнал, записаний тоді, коли замість анти-hTL1A антитіла було додано 1 мкг/мл ізотопного контрольного антитіла. NT: Не тестувалось. Таблиця 9 Середня інтенсивність флуоресценції для зв'язування анти-hTL1A антитіл (H4H) до клітинної поверхні hTL1A 1704N 1725P 1742P 1804N Розчинний hTL1A (мкг/мл) 0.1 мкг/мл 0.1 мкг/мл 1 мкг/мл 0.1 мкг/мл 10 3 1 0,3 0,1 0,03 Максимальний сигнал Мінімальний сигнал 15 20 25 30 35 40 1805N 1817N 0.1 мкг/мл 1 мкг/мл 1681N 1745P 1 мкг/мл 1 мкг/мл NT 22,6 26 31,5 132 163 NT 34,9 29,2 40,7 84,5 207 NT 19,9 32,7 44,7 79,4 126 NT 28,9 33,7 33,5 51,1 126 NT 23,6 25,1 36,8 60,2 156 NT 25,2 29,1 23,6 97,2 85.3 16,9 28,5 80,9 236 327 318 15 19,5 26,9 115 93,1 80 116 211 126 127 158 110 320 87,2 27,5 27,5 27,5 27,5 27,5 27,5 17,9 17,9 Як показано в Таблиці 9, сигнали від восьми тестованих антитіл можуть бути знижені до базових рівнів шляхом додавання надлишку розчинного hTL1A, демонструючи специфічність зв'язування цих антитіл до hTL1A клітинної поверхні. + Приклад 7: Блокування залежної від hTL1A стимуляції CD4 T-клітин анти-TL1A антитілами Щоб визначити здатність анти-hTL1A антитіл блокувати hTL1A-залежну стимуляцію + людських CD4 T-клітин, було розроблено пробу in vitro, в якій hTL1A/анти-CD3/анти-CD28стимульоване вивільнення IFN-гамма (IFN-γ) оцінювалось в присутності або відсутності антитіл. + Людські CD4 T-клітини були виділені зі свіжих лейкоцитарних плівок, приготовлених зі зразків крові людини, отриманих з Центру крові Нью-Йорка. Клітини від одного донора тримали окремо + від клітин інших донорів для кожної проби. CD4 T-клітини додавались до лунок 96-лункового 5 планшета в кількості 3,5 × 10 клітин на лунку. До кожної лунки потім додали розчинний hTL1A (залишки 72-251 NP_005109.2 з N-термінальною гекса-гістидиновою міткою, експресовані клітинами CHO) до кінцевої концентрації 1 мкг/мл (16 нМ, в припущенні утворення hTL1A тримерів у розчині) в RPMI+10 % FBS, L-глютаміні і пеніциліні/стрептоміцині. До кожної лунки додали також анти-hTL1A антитіла або ізотипне контрольне антитіло до кінцевої концентрації 1,0 мкг/мл або 3,0 мкг/мл (6,7 нМ або 20 нМ, відповідно). Зразки інкубували впродовж 15 хвилин при 4C в темряві, після чого до кожної лунки додали анти-hCD3 (BD Pharmingen, cat # 555336) і анти-hCD28 (BD Pharmingen, cat # 555725) до кінцевої концентрації 1,0 мкг/мл. Зразки інкубували впродовж 24 годин при 37C, супернатанти збирали і визначали рівні IFN-γ за допомогою ELISA. Блокуючий ефект (середній з двох окремих лунок для кожних умов) кожного + антитіла у відношенні кожного людського донорського зразка CD4 T-клітин є представленим як зменшення від максимального сингалу, поділене на максимальне вікно реакції; тобто % Блокування = [(Max-Inhib)/(Max-Min)] × 100, де "Max", "Inhib", і "Min" – це концентрації IFN-γ, + визначені для оброблених CD4 людських T-клітин наступним чином: "Max" – оброблені [hTL1A + анти-hCD3 + анти-hCD28 + ізотипне контрольне mAb]; "Min: " – оброблені [анти-hCD3 + антиhCD28 + ізотипне контрольне mAb]; і "Inhib" – оброблені [hTL1A + анти-hCD3 + анти-hCD28 + анти-hTL1A тестове mAb]. Антитіла, для яких блокада IFN-γ перевищувала "Min" базовий рівень, є представленими як 100 % блокада. Відношення (Max/Min) – це відношення 24 UA 110041 C2 + 5 концентрації IFN-γ, отриманого з людських CD4 T-клітин, оброблених за Max і Min умов, як визначено вище. Як показано в Таблиці 10, антитіла H4H1725P, H4H1805N, H4H1817N і H4H1804N суттєво блокували стимульоване hTL1A вивільнення IFN-γ при обох концентраціях 1 мкг/мл і 3 мкг/мл, причому майже повна блокада (>80 %) спостерігалась для більшості донорів при підвищеній концентрації антитіла. Результати щодо блокади секреції IFN-γ тринадцятьма різними анти+ hTL1A антитілами проти CD4 T-клітин від 10 різних людських донорів підсумовані в Таблиці 11. SD: Стандартне відхилення. Таблиця 10 mAb ID H4H1725P H4H1805N H4H1817N H4H1804N H4H1725P H4H1805N H4H1817N H4H1804N Донор № Відношення (Max/Min) mAb 1 μg/ml (6.7 nM) mAb 3 μg/ml (20 nM) D1 % блокування продукції IFN-γ в людських T-клітинах від 10 донорів D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 5 4 10 10 4 3 4 3 8 2 90 100 100 95 95 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 70 90 90 80 95 95 100 95 85 100 90 90 100 100 100 100 45 100 100 100 90 80 100 100 80 100 45 50 80 100 100 100 60 100 55 10 90 100 100 100 85 100 100 100 100 100 100 100 50 90 55 50 90 70 95 100 95 100 80 0 100 100 85 80 10 Таблиця 11 Середній % блокування (SD) 0,1 мкг/мл mAb H4H1681N 20 % (24) H4H1704N 22 % (29) H4H1719P 10 % (22) H4H1725P 13 % (14) H4H1738P 25 % (30) H4H1742P 10 % (22) H4H1745P 22 % (27) H4H1750P 11 % (14) H4H1752P 18 % (25) H4H1804N 26 % (30) H4H1805N 21 % (28) H4H1817N 25 % (33) H4H1818N 25 % (33) Ізотипний контроль 16 % (21) mAb ID 15 Середній % блокування (SD) 1 мкг/мл mAb 45 % (30) 53 % (27) 37 % (23) 80 % (20) 41 % (35) 58 % (33) 36 % (36) 42 % (35) 52 % (35) 68 % (38) 98 % (4) 81 % (22) 42 % (33) 26 % (33) Середній % блокування (SD) 3 мкг/мл mAb 95 % (7) 98 % (5) 78 % (30) 94 % (7) 81 % (18) 83 % (16) 91 % (7) 89 % (15) 71 % (30) 98 % (6) 94 % (10) 98 % (5) 71 % (35) 28 % (27) Рівні IFN-γ були визначені також при шести різних концентраціях антитіла (в межах від 0,03 + мкг/мл до 10 мкг/мл) для кожного з шести різних антитіл, доданих до CD4 T-клітин від дванадцяти людських донорів. Підгонка кривої до цих даних забезпечила оцінку концентрації антитіла, при якій досягалась половина максимального пригнічення для кожного антитіла для кожного зразка донорських клітин. Середні ( SD) концентрації для досягнення половини максимального пригнічення наведені в Таблиці 12. 25 UA 110041 C2 Таблиця 12 Донор № D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 Середня (± SD) H4H1725P 3,4 3,2 5,4 4,7 7,0 5,4 13 12 6,4 4,1 6,1 6,4 6,4 (3,1) H4H1742P 24 4,6 10 13 12 10 31 27 56 12 27 14 20 (14) mAb IC50 (нМ) H4H1805N H4H1817N 2,4 6,6 5,5 3,1 3,4 4,7 2,5 2,4 2,9 8,5 3,4 4,7 8,0 7,0 5,1 7,0 5,9 9,5 2,8 7,3 3,0 7,3 3,1 9,4 4,0 6,5 (1,7) (2,3) H4H1804N 6,8 8,6 8,6 7,7 6,7 8,6 12 11 8,1 12 7,6 7,5 8,8 (1,9) H4H1704N _ _ _ _ 17 11 12 19 7,5 10 11 8,0 12 (4,1) Чотири антитіла H4H1725P, H4H1804N, H4H1805N і H4H1817N демонстрували середні концентрації півмаксимального пригнічення, нижчі за 10 нМ (в межах приблизно від 4 до 9 нМ). 5 26 UA 110041 C2 27 UA 110041 C2 28