Антитіла людини до дельта-подібного ліганду-4 людини (hdll4)

1. Антитіло людини або фрагмент антитіла, що специфічним чином зв'язує дельта-подібний ліганд-4 людини (hDLL4) з константою афінності (KD), що дорівнює або менша 500 пМ, необов'язково KD, що дорівнює або менше близько 300 пМ, за даними поверхневого плазмонного резонансу; зазначене антитіло людини або фрагмент антитіла містить: визначаючу комплементарність область 3 (CDR3) важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність формули Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10Х11-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16 (SEQ ID NO: 930), де X1 - Ala або Ser; X2 - Arg або Lys; X3 - Asp; X4 - Gly або His-; UA (21) a200907381 (22) 13.12.2007 (24) 26.04.2011 (86) PCT/US2007/025653, 13.12.2007 (31) 60/874,922 (32) 14.12.2006 (33) US (31) 60/916,415 (32) 07.05.2007 (33) US (31) 60/985,323 (32) 05.11.2007 (33) US (46) 26.04.2011, Бюл.№ 8, 2011 р. (72) ПАПАДОПУЛОС НІКОЛАС ДЖ., US, МАРТІН ДЖОЕЛ Х., US, СМІТ ЕРІК, US, НОГЕРА-ТРОІСЕ ІРЕНЕ, US, ТЕРСТОН ГЕВІН, US (73) РІДЖЕНЕРОН ФАРМАСЬЮТІКАЛЗ, ІНК., US (56) US A1 2006134121, 22.06.2006. WO A 2008060705, 22.05.2008. WILLIAMS CASSIN KIMMEL ET AL: "Up-regulation of the Notch ligand Delta-like 4 inhibits VEGF-induced endothelial cell function" BLOOD, W.B.SAUNDERS COMPANY, ORLANDO, FL, vol. 107, no. 3, 1 February 2006 (2006-02-01), pages 931-939, XP002457722 ISSN: 0006-4971. LAURET E ET AL: "Membrane-bound Delta-4 Notch ligand reduces the proliferative activity of primitive human hematopoietic CD34+CD38low cells while maintaining their LTC-IC potential" 20040401; 20040400, vol. 18, no. 4, 1 April 2004 (2004-04-01), pages 788-797, XP002421237. HAINAUD PATRICIA ET AL: "The role of the vascular endothelial growth factor-Delta-like 4 ligand/Notch4ephrin B2 cascade in tumor vessel remodeling and endothelial cell functions." CANCER RESEARCH 1 SEP 2006, vol. 66, no. 17, 1 September 2006 (200609-01), pages 8501-8510, XP002484535 ISSN: 15387445. DANDO JONATHAN S ET AL: "Notch/Delta4 interaction in human embryonic liver CD34+ CD38cells: positive influence on BFU-E production and LTC-IC potential maintenance." STEM CELLS 2 (19) 1 3 94305 4 X5 - Asp або Ala; X6 - Phe; X7 - Tyr або Arg; X8 - Ser; X9 - Gly; X10 - Tyr; X11 - Glu; X12 - Gly або His-; X13 Tyr або Trp; X14 - Phe або відсутня; X15 - Asp або відсутня; і X16 - Pro або відсутня, CDR3 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність формули Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 933), де X1 - Gin; X2 - Gin або His-; X3 Туr або Arg; X4 - Gly або Ser; X5 - Ser або Asn; X6 Trp або Ser; X7 - Pro; X8 - Pro або Arg; і X9 - Thr, CDR1 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність формули Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 928), де X1 - Gly; X2 - Phe; X3 - Thr; X4 Phe; X5 - Ser або Asn; X6 - Ser або Asn; X7 - Tyr або Phe; і X8 - Gly або Ala, CDR2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність формули Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-X6-X7-Х8 (SEQ ID NO: 929), де X1 - Ilе або Leu; X2 - Trp або Ser; X3 - Туr або Gly; X4 - Asp або Ser; X5 - Gly; X6 Ser, Thr або Val; X7 - Asn або Asp; і X8 - Lys або Arg, CDR1 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність формули Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7 (SEQ ID NO: 931), де X1 - Gin; X2 - Ser; X3 - Val; X4 - Arg або Ser; X5 - Ser; X6 - Ser або Tyr; і X7 - Tyr або відсутня, і CDR2 легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність формули X1-Х2-Х3 (SEQ ID NO: 932), де X1 - Gly або Asp; X2 - Ala або Thr; і X3 - Ser. 2. Антитіло людини або фрагмент антитіла за п. 1, де KD для димерного hDLL4 менше 50 пМ за даними поверхневого плазмонного резонансу. 3. Антитіло людини або фрагмент антитіла за будь-яким з попередніх пунктів, де вказаний важкий ланцюг CDR1, CDR2 та CDR3 включає CDR1, CDR2 та CDR3, переважно SEQ ID NO: 429 або SEQ ID NO: 901, та вказаний легкий ланцюг CDR1, CDR2 та CDR3 включає CDR1, CDR2 та CDR3, переважно SEQ ID NO: 437 або SEQ ID NO: 903, та де вказане антитіло людини або фрагмент антитіла зв'язує епітоп у N-термінальному-DSL домені hDLL4. 4. Антитіло людини або фрагмент антитіла за одним з попередніх пунктів, де антитіло або фрагмент антитіла містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга, що містять SEQ ID NO: 431, 433 і 435 відповідно. 5. Антитіло людини або фрагмент антитіла за одним з попередніх пунктів, де антитіло або фрагмент антитіла містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга, що містять SEQ ID NO: 439, 441 і 443 відповідно. 6. Антитіло людини або фрагмент антитіла за будь-яким з попередніх пунктів, де антитіло або фрагмент антитіла містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга, що містять SEQ ID NO: 431, 433 і 435 відповідно; і послідовності CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга, що містять SEQ ID NO: 439, 441 і 443 відповідно. 7. Антитіло людини або фрагмент антитіла за будь-яким з попередніх пунктів, що містять варіабельну область важкого ланцюга (HCVR), яку вибирають з SEQ ID NO: 429 і SEQ ID NO: 901. 8. Антитіло людини або фрагмент антитіла за будь-яким з попередніх пунктів, що містять варіабельну область легкого ланцюга (LCVR), яку вибирають з SEQ ID NO: 437 і SEQ ID NO: 903. 9. Антитіло людини або фрагмент антитіла за п. 7 або 8, де HCVR/LCVR вибираються з SEQ ID NO: 429/437 і 901/903. 10. Антитіло людини або фрагмент антитіла за будь-яким з попередніх пунктів, що далі містить константну область, яку вибирають з групи, що містить SEQ ID NO:950, 951 і 952. 11. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло або антигензв'язувальний фрагмент відповідно до одного з попередніх пунктів. 12. Вектор, що містить нуклеотидну послідовність за п. 11. 13. Система "хазяїн-вектор" для одержання антитіла або антигензв'язувального фрагмента антитіла, що специфічним чином зв'язує DLL4 людини, що містить вектор за п. 12, у придатній клітиніхазяїні. 14. Система "хазяїн-вектор" за п. 13, де клітинахазяїн є прокаріотичною або еукаріотичною клітиною, яку вибирають з Е. соlі або клітини СНО. 15. Спосіб одержання антитіла проти DLL4 людини або його антигензв'язувального фрагмента, що полягає у вирощуванні клітин системи "хазяїнвектор" за п. 13 або 14 в умовах, що допускають одержання антитіла або його фрагмента й одержання антитіла або фрагмента, зробленого в такий спосіб. 16. Застосування антитіла або антигензв'язувального фрагмента антитіла за будь-яким з пп. 1-10 при виробництві лікарського препарату, застосовуваного для пом'якшення або пригнічення захворювання або порушення в організмі людини, пов'язаного з DLL4. 17. Застосування за п. 16, де зв'язане з DLL4 захворювання або порушення являє собою патологічний ангіогенез, рак, імунну недостатність, реакцію відторгнення трансплантату або запальний процес. 18. Композиція, що включає антитіло або фрагмент антитіла за будь-яким з пп. 1-10 і прийнятний носій. Notch-сигнальний шлях являє собою систему передачі інформації між клітинами, використовуваний широким спектром еукаріот у багатьох біологічних процесах, у тому числі клітинній диференціації, проліферації і гомеостазі. Дельта-подібний 4 (Dl4) або дельта-подібний ліганд-4 (Dll4), далі іменований “Dll4”) входить у дельта-сімейство Notch-лігандів і з високою селективністю експресу ється судинним ендотелієм (Shutter et al. (2000) Genes Develop. 14:1313-1318). Dll4 виконує функції ліганда для Notch-рецепторів, у тому числі рецепторів Notch-1 і Notch-4. Послідовності нуклеїнових кислот і амінокислотні послідовності для Dll4 людини приведені в послідовностях SEQ ID №: 1-2, відповідно. 5 Способи одержання антитіл, корисних як лікарські препарати для людини, включають виробництво химерних антитіл і гуманізованих антитіл [див., наприклад, патент U.S. 6949245]. Див., наприклад, WO 94/02602 (Abgenix) і патент U.S. 6596541 (Regeneron Pharmaceuticals), де описані способи створення не відносних до людини трансгенних мишей, здатних виробляти антитіла людини. У заявці на патент Японії 2003/047470A2 (Asahi Kasei Kogyo) описані антитіла до позаклітинної частини білка Notch-ліганда людини. У першому аспекті даний винахід стосується антитіл людини, переважно рекомбінантних антитіл людини, що специфічно зв'язують дельтаподібний ліганд-4 людини (hDll4). Для цих антитіл характерне зв'язування з hDll4 з високою афінністю і здатність нейтралізувати активність Dll4. Антитіла згідно з винаходом здатні блокувати зв'язування Dll4 з Notch-рецептором (рецепторами) і тим самим інгібувати передачу сигналу через Dll4. Антитіла можуть бути повнорозмірними (наприклад, антитіла IgG1 або IgG4) або включати тільки антиген-зв’язувальну частину (наприклад, фрагмент Fab, F(ab’)2 або scFv) і можуть бути модифіковані з метою впливати на функціональність, наприклад, видаляти залишкові ефекторні функції (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933). В одному з варіантів здійснення даного винаходу антитіло містить варіабельну область важкого ланцюга (HCVR), вибрану з групи, що включає SEQ ID №: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 397, 413, 429, 445, 461, 477, 493, 509, 525, 541, 557, 573, 589, 605, 621, 637, 653, 669, 685, 701, 717, 733, 749, 765, 781, 797, 813, 893, 897, 901, 905, 909, 913, 917, 921, 925, 935, 939, 943 і 947, або її істотно ідентичну послідовність. У переважному варіанті здійснення винаходу HCVR є амінокислотною послідовністю SEQ ID №: 429 або 901. В одному з варіантів здійснення даного винаходу антитіло містить варіабельну область легкого ланцюга (LCVR), вибрану з групи, що включає SEQ ID №: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 405, 421, 437, 453, 469, 485, 501, 517, 533, 549, 565, 581, 597, 613, 629, 645, 661, 677, 693, 709, 725, 741, 757, 773, 789, 805, 821, 895, 899, 903, 907, 911, 915, 919, 923, 927, 937, 941, 945 і 949, або її істотно ідентичну послідовність. У переважному варіанті здійснення винаходу LCVR є амінокислотною послідовністю SEQ ID №: 437 або 903. В одному з варіантів здійснення даного винаходу антитіло містить HCVR, вибрану з групи, що включає SEQ ID №: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 397, 413, 429, 445, 461, 477, 493, 509, 525, 541, 557, 573, 589, 605, 621, 637, 653, 669, 685, 701, 717, 733, 749, 765, 781, 797, 813, 893, 897, 901, 905, 909, 913, 917, 921, 925, 935, 939, 943 і 947, або її істотно ідентичну послідовність, і LCVR, вибрану з групи, що включає SEQ ID №: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 94305 6 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 405, 421, 437, 453, 469, 485, 501, 517, 533, 549, 565, 581, 597, 613, 629, 645, 661, 677, 693, 709, 725, 741, 757, 773, 789, 805, 821, 895, 899, 903, 907, 911, 915, 919, 923, 927, 937, 941, 945 і 949, або її істотно ідентичну послідовність. У переважному варіанті здійснення винаходу HCVR/LCVR є парами амінокислотної послідовності SEQ ID №: 429/437 або 901/903. В одному з варіантів здійснення даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, в якому міститься визначаюча комплементарність область 1 (CDR1) важкого ланцюга, вибрана із групи, що включає SEQ ID №: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278 294, 310, 326, 342, 358, 374, 399, 415, 431, 447, 463, 479, 495, 511, 527, 543, 559, 575, 591, 607, 623, 639, 655, 671, 687, 703, 711, 719, 735, 751, 767, 783, 799, 815, 831, 847, 863 і 879, або її істотно ідентична послідовність. В одному з варіантів здійснення даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, в якому міститься визначаюча комплементарність область 2 (CDR2) важкого ланцюга, вибрана із групи, що включає SEQ ID №: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 401, 417, 433, 449, 465, 481, 497, 513, 529, 545, 561, 577, 593, 609, 625, 641, 657, 673, 689, 705, 721, 737, 753, 769, 785, 801, 817, 833, 849, 865 і 881, або її істотно ідентична послідовність. В одному з варіантів здійснення даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, в якому міститься визначаюча комплементарність область 3 (CDR3) важкого ланцюга, вибрана із групи, що включає SEQ ID №: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 403, 419, 435, 451, 467, 483, 499, 515, 531, 547, 563, 579, 595, 611, 627, 643, 659, 675, 691, 707, 723, 739, 755, 771, 787, 803, 819, 835, 851, 867 і 883, або її істотно ідентична послідовність. В одному з варіантів здійснення даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, в якому міститься CDR1 важкого ланцюга, вибрана із групи, що включає SEQ ID №: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278 294, 310, 326, 342, 358, 374, 399, 415, 431, 447, 463, 479, 495, 511, 527, 543, 559, 575, 591, 607, 623, 639, 655, 671, 687, 703, 711, 719, 735, 751, 767, 783, 799, 815, 831, 847, 863 і 879, або її істотно ідентична послідовність; CDR2 важкого ланцюга, вибрана із групи, що включає SEQ ID №: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 401, 417, 433, 449, 465, 481, 497, 513, 529, 545, 561, 577, 593, 609, 625, 641, 657, 673, 689, 705, 721, 737, 753, 769, 785, 801, 817, 833, 849, 865 і 881, або її істотно ідентична послідовність; і CDR3 важкого ланцюга, вибрана із групи, що включає SEQ ID №: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 403, 419, 435, 451, 467, 483, 499, 515, 531, 547, 563, 579, 595, 611, 627, 643, 659, 675, 691, 707, 723, 739, 7 755, 771, 787, 803, 819, 835, 851, 867 і 883, або її істотно ідентична послідовність. У переважному варіанті здійснення винаходу антитіло або фрагмент антитіла містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга, вибрані з групи, що містить SEQ ID №: 431/433/435; 374/376/378; 783/785/787; і 799/801/803. В одному з варіантів здійснення даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, в якому міститься CDR1 легкого ланцюга, вибрана із групи, що включає SEQ ID №: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 407, 423, 439, 455, 471, 487, 503, 519, 535, 551, 567, 583, 599, 615, 631, 647, 663, 679, 695, 711, 727, 743, 759, 775, 791, 807, 823, 839, 855, 871 і 887, або її істотно ідентична послідовність. В одному з варіантів здійснення даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, в якому міститься CDR2 легкого ланцюга, вибрана із групи, що включає SEQ ID №: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 409. 425, 441, 457, 473, 489, 505, 521, 537, 553, 569, 585, 601, 617, 633, 649, 665, 681, 697, 713, 729, 745, 761, 777, 793, 809, 825, 841, 857, 873 і 889, або її істотно ідентична послідовність. В одному з варіантів здійснення даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, в якому міститься CDR3 легкого ланцюга, вибрана із групи, що включає SEQ ID №: 18, 34, 50, 66, 82, 98, 11, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571, 587, 603, 619, 635, 651, 667, 683, 699, 715, 731, 747, 763, 779, 795, 811, 827, 843, 859, 875 і 891, або її істотно ідентична послідовність. В одному з варіантів здійснення даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, в якому міститься CDR1 легкого ланцюга, вибрана із групи, що включає SEQ ID №: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 407, 423, 439, 455, 471, 487, 503, 519, 535, 551, 567, 583, 599, 615, 631, 647, 663, 679, 695, 711, 727, 743, 759, 775, 791, 807, 823, 839, 855, 871 і 887, або її істотно ідентична послідовність; CDR2 легкого ланцюга, вибрана із групи, що включає SEQ ID №: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 409. 425, 441, 457, 473, 489, 505, 521, 537, 553, 569, 585, 601, 617, 633, 649, 665, 681, 697, 713, 729, 745, 761, 777, 793, 809, 825, 841, 857, 873 і 889, або її істотно ідентична послідовність; і CDR3 легкого ланцюга, вибрана із групи, що включає SEQ ID №: 18, 34, 50, 66, 82, 98, 11, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571, 587, 603, 619, 635, 651, 667, 683, 699, 715, 731, 747, 763, 779, 795, 811, 827, 843, 859, 875 і 891, або її істотно ідентична послідовність. У переважному варіанті здійснення винаходу антитіло або фрагмент антитіла містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга, вибрані з групи, що містить 94305 8 SEQ ID №: 439/441/443; 382/384/386; 791/793/795; і 807/809/811. В другому аспекті даного винаходу приводяться молекули нуклеїнової кислоти, що кодують антитіла або антиген-зв’язувальні області винаходу. Даний винахід також охоплює рекомбінантні вектори експресії, що несуть нуклеїнові кислоти даного винаходу, що кодують антитіла, і клітини-хазяї, в які включаються такі вектори, а також способи готування антитіл даного винаходу шляхом культивування клітин-хазяїв винаходу. В одному зі здійснень даного винаходу антитіло містить HCVR, кодовану нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID №: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556, 572, 588, 604, 620, 636, 652, 668, 684, 700, 716, 732, 748, 764, 780, 796, 812, 892, 896, 900, 904, 908, 912, 916, 920, 924, 934, 938, 942 і 946, або її істотно аналогічною послідовністю з гомологією не менше 95%. В одному з варіантів здійснення даного винаходу антитіло містить LCVR, кодовану нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID №: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516, 532, 548, 564, 580, 596, 612, 628, 644, 660, 676, 692, 708, 724, 740, 756, 772, 788, 804, 820, 894, 898, 902, 906, 910, 914, 918, 922, 926, 936, 940, 944 і 948, або її істотно аналогічною послідовністю з гомологією не менше 95%. В одному з варіантів здійснення даного винаходу антитіло містить HCVR, кодовану нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID №: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556, 572, 588, 604, 620, 636, 652, 668, 684, 700, 716, 732, 748, 764, 780, 796, 812, 892, 896, 900, 904, 908, 912, 916, 920, 924, 934, 938, 942 і 946, або її істотно аналогічну послідовністю з гомологією не менше 95%, і LCVR, кодовану нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID №: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516, 532, 548, 564, 580, 596, 612, 628, 644, 660, 676, 692, 708, 724, 740, 756, 772, 788, 804, 820, 894, 898, 902, 906, 910, 914, 918, 922, 926, 936, 940, 944 і 948, або її істотно аналогічною послідовністю з гомологією не менше 95%. В одному з варіантів здійснення даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, в якому міститься CDR1 важкого ланцюга, кодована нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID №: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510, 526, 542, 558, 574, 590, 606, 622, 638, 654, 670, 686, 702, 718, 734, 750, 766, 782, 798, 814, 830, 846, 862 і 878, 9 або її істотно аналогічною послідовністю з гомологією не менше 95%. В одному з варіантів здійснення даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, що містить CDR2 важкого ланцюга, кодовану нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID №: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 100, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560, 576, 592, 608, 624, 640, 656, 672, 688, 704, 720, 736, 752, 768, 784, 800, 816, 832, 848, 864 і 880, або її істотно аналогічною послідовністю з гомологією не менше 95%. В одному з варіантів здійснення даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, в якому міститься CDR3 важкого ланцюга, кодовану нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID №: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562, 578, 594, 610, 626, 642, 658, 674, 690, 706, 722, 738, 754, 770, 786, 802, 818, 834, 850, 866 і 882, або її істотно аналогічною послідовністю з гомологією не менше 95%. В одному з варіантів здійснення даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, в якому міститься CDR1 важкого ланцюга, кодовану нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID №: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510, 526, 542, 558, 574, 590, 606, 622, 638, 654, 670, 686, 702, 718, 734, 750, 766, 782, 798, 814, 830, 846, 862 і 878, або її істотно аналогічною послідовністю з гомологією не менше 95%; CDR2 важкого ланцюга, кодована нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID №: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 100, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560, 576, 592, 608, 624, 640, 656, 672, 688, 704, 720, 736, 752, 768, 784, 800, 816, 832, 848, 864 і 880, або її істотно аналогічною послідовністю з гомологією не менше 95%; і CDR3 важкого ланцюга, кодована нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID №: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562, 578, 594, 610, 626, 642, 658, 674, 690, 706, 722, 738, 754, 770, 786, 802, 818, 834, 850, 866 і 882, або її істотно аналогічною послідовністю з гомологією не менше 95%. У переважному варіанті здійснення винаходу антитіло або фрагмент антитіла містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга, кодовані послідовністю нуклеїнової кислоти, вибраною з групи, що містить SEQ ID №: 430/432/434; 373/375/377; 782/784/786; і 798/800/802. В одному з варіантів здійснення даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, що містить CDR1 легкого ланцюга, кодо 94305 10 вану нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID №: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518, 534, 550, 566, 582, 598, 614, 630, 646, 662, 678, 694, 710, 726, 742, 758, 774, 790, 806, 822, 838, 854, 870 і 886, або її істотно аналогічною послідовністю з гомологією не менше 95%. В одному з варіантів здійснення даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, в якому міститься CDR2 легкого ланцюга, кодована нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID №: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520, 536, 552, 568, 584, 600, 616, 632, 648, 664, 680, 696, 712, 728, 744, 760, 776, 792, 808, 824, 840, 856, 872 і 888, або її істотно аналогічною послідовністю з гомологією не менше 95%. В одному з варіантів здійснення даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, в якому міститься CDR3 легкого ланцюга, кодована нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID №: 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, 586, 602, 618, 634, 650, 666, 682, 698, 714, 730, 746, 762, 778, 794, 810, 826, 842, 858, 874 і 890, або її істотно аналогічною послідовністю з гомологією не менше 95%. В одному з варіантів здійснення даного винаходу приводиться антитіло людини або фрагмент антитіла, в якому міститься CDR1 легкого ланцюга, кодована нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID №: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518, 534, 550, 566, 582, 598, 614, 630, 646, 662, 678, 694, 710, 726, 742, 758, 774, 790, 806, 822, 838, 854, 870 і 886, або її істотно аналогічною послідовністю з гомологією не менше 95%; CDR2 легкого ланцюга, кодована нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID №: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520, 536, 552, 568, 584, 600, 616, 632, 648, 664, 680, 696, 712, 728, 744, 760, 776, 792, 808, 824, 840, 856, 872 і 888, або її істотно аналогічною послідовністю з гомологією не менше 95%, і CDR3 легкого ланцюга, кодована нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що включає SEQ ID №: 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, 586, 602, 618, 634, 650, 666, 682, 698, 714, 730, 746, 762, 778, 794, 810, 826, 842, 858, 874 і 890, або її істотно аналогічною послідовністю з гомологією не менше 95%. У переважному варіанті здійснення винаходу антитіло або фрагмент антитіла містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцю 11 га, кодовані послідовністю нуклеїнової кислоти, вибраною з групи, що містить SEQ ID №: 438/440/442; 381/383/385; 790/792/794; і 806/808/810. У третьому аспекті даного винаходу приводиться виділене антитіло людини або фрагмент антитіла, з яким специфічним чином зв'язується hDll4 людини, і в який містяться CDR 1, 2 і 3, вибрані з групи, що включає (a) область CDR1 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність формули X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8 (SEQ ID №: 928), де X1 – Gly; X2 – Phe або Tyr; X3 – Thr; X4 – Phe; X5 – Ser, Thr або Asn; X6 – Ser, Asn або Tyr; X7 – Tyr або Phe; і X8 – Gly або Ala; (b) область CDR2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність формули X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8 (SEQ ID №: 929), де X1 – Ile або Leu; X2 – Trp або Ser; X3 – Tyr, Ala або Gly; X4 – Asp, Ser або Tyr; X5 – Gly або Asp; X6 – Ser, Gly, Thr або Val; X7 – Asn або Asp; і X8 – Lys або Arg; (c) область CDR3 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність формули X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8–X9–X10X11–X12–X13–X14–X15–X16(SEQ ID №: 930), де X1 – Ala або Ser; X2 – Arg або Lys; X3 – Asp або Tyr; X4 – Ser, Gly або His; X5 – Asp, Ala або Trp; X6 – Asn, або Phe; X7 – Tyr, Arg або Lys; X8 – His або Ser; X9 – Gly або Trp; X10 – Tyr або Phe; X11 – Glu або Asp; X12 – Gly, His або Pro; X13 – Tyr, Trp або відсутня; X14 – Phe або відсутня; X15 – Asp або відсутня; і X16 – Pro або відсутня. У переважному варіанті здійснення винаходу антитіло людини або фрагмент антитіла містить послідовності CDR 1, 2 і 3 важкого ланцюга, вибрані з групи, що включає (a) область CDR1 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність формули X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8 (SEQ ID №: 928), де X1 – Gly; X2 – Phe; X3 – Thr; X4 – Phe; X5 – Ser або Asn; X6 – Ser або Asn; X7 – Tyr або Phe; і X8 – Gly або Ala; (b) область CDR2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність 1 2 3 4 5 6 7 8 формули X –X –X –X –X –X –X –X (SEQ ID №: 1 2 929), де X – Ile або Leu; X – Trp або Ser; X3 – Tyr або Gly; X4 – Asp або Ser; X5 – Gly; X6 – Ser, Thr або Val; X7 – Asn або Asp; і X8 – Lys або Arg; (c) область CDR3 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність формули X1–X2–X3–X4–X5– X6–X7–X8–X9–X10-X11–X12–X13–X14–X15–X16 (SEQ ID №: 930), де X1 – Ala або Ser; X2 – Arg або Lys; X3 – Asp; X4 – Gly або His; X5 – Asp або Ala; X6 – Phe; X7 – Tyr або Arg; X8 – Ser; X9 – Gly; X10 – Tyr; X11 – Glu; X12 – Gly або His; X13 – Tyr або Trp; X14 – Phe або відсутня; X15 – Asp або відсутня; і X16 – Pro або відсутня. У ще одному варіанті здійснення винаходу виділене антитіло людини або фрагмент антитіла також містить (d) область CDR1 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність формули X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7 (SEQ ID №: 931), де X1 – Gln; X2 – Ser; X3 – Val; X4 – Arg, Ser або Thr; X5 – Ser або Gly; X6 – Ser або Tyr; і X7 – Tyr або відсутня; (e) область CDR2 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність формули X1–X2–X3 (SEQ ID №: 932), де X1 – Gly або Asp; X2 – Ala або Thr; і X3 – Ser; і (f) область CDR3 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність формули 94305 12 X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8–X9 (SEQ ID №: 933), де X1 – Gln; X2 – Gln або His; X3 – Tyr, Arg або Ser; X4 – Gly, Ser або Ala; X5 – Ser, Asn або Phe; X6 – Trp або Ser; X7 – Pro; X8 – Trp, Pro або Arg; і X9 – Thr. У переважному варіанті здійснення винаходу виділене антитіло людини або фрагмент антитіла також містить (d) область CDR1 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність формули X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7 (SEQ ID №: 931), де X1 – Gln; X2 – Ser; X3 – Val; X4 – Arg або Ser; X5 – Ser; X6 – Ser або Tyr; і X7 – Tyr або відсутня; (e) область CDR2 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність формули X1–X2–X3 (SEQ ID №: 932), де X1 – Gly або Asp; X2 – Ala або Thr; і X3 – Ser; і (f) область CDR3 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність формули X1–X2–X3–X4–X5– X6–X7–X8–X9 (SEQ ID №: 933), де X1 – Gln; X2 – Gln або His; X3 – Tyr або Arg; X4 – Gly або Ser; X5 – Ser або Asn; X6 – Trp або Ser; X7 – Pro; X8 – Pro або Arg; і X9 – Thr. У четвертому аспекті даного винаходу приводиться цілком людське антитіло або фрагмент антитіла, з яким зв'язується hDll4 з концентрацією IC50 менше 10 нМ, відповідно до результатів вимірювання in vitro або аналізу блокування Dll4 на основі ELISA (описано нижче). У переважному варіанті здійснення даного винаходу IC50 антитіла складає приблизно 500 пМ або менше. У ще більш переважному варіанті здійснення даного винаходу IC50 антитіла складає приблизно 100 пМ або менше. В одному варіанті здійснення даного винаходу приводиться цілком людське моноклональне антитіло, що специфічним чином зв'язує і інгібує Dll4 людини і має IC50 менше або таке що дорівнює приблизно 150 пМ, 100 пМ, 75 пМ або 50 пМ, відповідно до результатів вимірювання біологічної активності індукованої Notch-рецептором люциферази з hDll4-Fc. Як показано в розділі прикладів нижче, антитіла проти hDll4 даного винаходу не вступають у перехресну реакцію з близькородинними дельта-білками, такими як hDll1 і hDll3. В одному варіанті здійснення даний винахід стосується виділеного антитіла людини або його антиген-зв’язувальної області, що зв'язують hDll4 з константою афінності (KD) менше чим приблизно 500 пМ, переважніше, менше чим приблизно 300 пМ, ще переважніше, менше чим приблизно 100 пМ, менше чим приблизно 50 пМ, менше чим приблизно 10 пМ, за даними поверхневого плазмонного резонансу (BIACORE™), наприклад, із застосуванням димерного hDll4 (таблиця 2). Даний винахід стосується антитіла проти hDll4 з модифікованою картиною глікозилування. У деяких випадках може виявитися корисним видалити небажані сайти глікозилування або використовувати антитіло без фукозного фрагмента в олігосахаридному ланцюгу, наприклад для посилення функції антитілозалежної клітинно-обумовленої цитотоксичності (ADCC) [див. Shield et al. (2002) JBC 277:26733]. В інших варіантах використання може здійснюватися модифікація галактозилування, для того щоб змінити комплементзалежну цитотоксичність (CDC). 13 Даний винахід стосується антитіл проти hDll4, що зв'язують конкретні епітопи hDll4 і здатні блокувати біологічну активність hDll4. Позаклітинний домен Dll4 складається з N-термінального домена, домена Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) і восьми тандемних ЕФР (епідермальний фактор росту) - подібних повторів. Загалом, ЕФР домени знаходяться приблизно в області амінокислотних залишків 218-251 (домен 1), 252-282 (домен 2), 284-322 (домен 3), 324-360 (домен 4) і 362-400 (домен 5), домен DSL – приблизно в області амінокислотних залишків 173-217, а N-термінальний домен – приблизно в області амінокислотних залишків 27-172 hDll4 (SEQ ID №:2). В одному з варіантів здійснення даного винаходу блокуюче антитіло згідно з винаходом зв'язується з амінокислотними залишками з 27 по 524 послідовності SEQ ID №:2. У більш конкретному варіанті здійснення блокуюче антитіло, згідно з винаходом зв'язується з епітопом у Nтермінальному-DSL доменах 27-217 послідовності SEQ ID №: 2; у ще більш конкретному варіанті здійснення блокуюче антитіло, зв'язується з епітопом приблизно в області амінокислотних залишків 27-172 (N-термінальний домен) або 173-217 (домен DSL). В іншому варіанті здійснення блокуюче антитіло, згідно з винаходом зв'язується з епітопом ЕФР-2 приблизно в області амінокислотних залишків 252-282 послідовності SEQ ID №: 2. У п'ятому аспекті даний винахід стосується композиції, що містить рекомбінантне антитіло проти hDll4 людини і прийнятний носій. Винахід також включає вектори і вектори, що складаються з клітин-хазяїв, що містять молекули нуклеїнових кислот, які кодують антитіло проти hDll4 людини згідно з даним винаходом, а також способи одержання таких нових антитіл, що полягають у культивуванні клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує антитіло проти hDll4 людини згідно з даним винаходом або фрагмент такого антитіла, в умовах, що допускають продукцію білка і виділення продукованого в такий спосіб білка. У шостому аспекті даний винахід стосується способів інгібування активності hDll4 за допомогою приведеного в даному винаході антитіла або його антиген-зв’язувальної області. В одному з варіантів здійснення спосіб включає взаємодію hDll4 з антитілом згідно з даним винаходом або його антиген-зв’язувальною областю таким чином, що при цьому відбувається інгібування активності hDll4 у результаті зв'язку з Notch-рецептором, наприклад, рецептором Notch-1. В іншому варіанті здійснення спосіб включає введення антитіла згідно з даним винаходом або його антиген-зв’язувальної області людині, що страждає порушенням, стан при який поліпшується при інгібуванні активності Dll4. Такі порушення включають хвороби або патологічні стани, що можуть бути куповані, полегшені, ослаблені або відвернені за рахунок блокування, інгібування або зниження активності Dll4, наприклад патологічний розвиток кровоносної мережі, зв'язаний з ангіогенезом у пухлинах і раком, імунодефіцитні стани, відторгнення трансплантів або запалення, а також нейродегенеративні порушення, наприклад зв'язані з пріонними захворюваннями. 94305 14 Даний винахід також передбачає використання антитіла або антиген-зв’язувальної області антитіла відповідно до наведеного вище опису, при виробництві лікарських препаратів, застосовуваних для пом'якшення або інгібування захворювань або порушень в організмі людини, опосередкованих Dll4. Інші цілі і переваги стануть очевидними при ознайомленні з наведеним нижче докладним описом. Перш ніж переходити до опису способів, що представляються, необхідно відзначити, що даний винахід не обмежується описаними конкретними способами і викладеними експериментальними умовами, оскільки такі способи й умови можуть змінюватися. Варто також розуміти, що використовувана в даному документі термінологія призначена винятково для опису конкретних варіантів здійснення винаходу і не носить обмежувального характеру, оскільки охоплення даного винаходу буде обмежуватися тільки прикладеними пунктами формули винаходу. Використання в даному описі й у прикладених пунктах формули винаходу однини має на увазі посилання на множину, за винятком випадків, коли з контексту явно випливає зворотне. Так, наприклад, згадування «способу» має на увазі один або кілька способів і/або стадій описаного в тексті типу, і/або методів або стадій, що будуть очевидні фахівцям у даній галузі при ознайомленні з описом даного винаходу. Якщо не зазначене інше, усі технічні і наукові терміни, використовувані в даному документі, мають таке ж значення, що загальновідомо рядовим фахівцям в галузі, до якої належить даний винахід. Хоча на практиці або при перевірці даного винаходу можуть використовуватися будь-які способи і матеріали, аналогічні або ідентичні описаним у даному документі, нижче приводиться опис переважних способів і матеріалів. Визначення Терміни «дельта-подібний ліганд-4», «Dll4», «hDll4» є взаємозамінними при позначенні білка, кодованого послідовністю нуклеїнової кислоти SEQ ID №: 1, і білка, що містить послідовність амінокислоти SEQ ID №: 2. Використовуваний у даному документі термін «антитіло» призначений для позначення молекул імуноглобуліну, складених з чотирьох поліпептидних ланцюгів, при цьому два важкі (Н) ланцюги і дві легені (L) ланцюги зв'язуються один з одним дисульфідними зв'язками. Кожен важкий ланцюг містить варіабельну область важкого ланцюга (яка скорочено називається в даному документі HCVR, або VH) і константну область важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга складається з трьох доменів: CH1, CH2 і CH3. Кожний легкий ланцюг містить варіабельну область легкого ланцюга (яка скорочено називається в даному документі LCVR, або VL) і константну область легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга складається з одного домена: CL. Області VH і VL можуть далі підрозділятися на області гіперваріабельності, що називаються визначаючими комплементарність областями (CDR), що перемежо 15 вуються областями з більш високим рівнем консервативності, які називаються основними областями (FR). Кожна область VH і VL утворена трьома CDR і чотирма FR, розташованими від амінотермінального кінця до карбокси-термінального кінця в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Використовуваний у даному документі термін «антитіло високої афінності» стосується антитіл, що мають афінність зв'язування з hDll4 не менше 10-8М; переважно 10-9М; ще більш переважно 1010 М, за результатами вимірювання методом поверхневого плазмонного резонансу, наприклад BIACORE™, або результатами вимірювання афінності в розчині методом імуноферментного аналізу (ELISA). Під використовуваним у даному документі терміном “повільно дисоціююче” або “Koff” мається на увазі антитіло, комплекс якого з hDll4 дисоціює з константою швидкості 110-3 сек-1 або нижче, переважно 110-4 сек-1 або нижче, за результатами вимірювання методом поверхневого плазмонного резонансу, наприклад BIACORE™. Під використовуваним у даному документі терміном «нейтралізуюче», або «блокуюче антитіло», розуміється антитіло, зв'язування якого з Dll4 приводить до інгібування біологічної активності Dll4. Таке інгібування біологічної активності Dll4 може оцінюватися за допомогою вимірювання одного або декількох показників біологічної активності Dll4. Дані показники біологічної активності Dll4 можуть оцінюватися за допомогою одного або декількох методів аналізу in vitro або in vivo, відомих фахівцям (див. приклади нижче). Здатність антитіла нейтралізувати активність Dll4 переважно повинна оцінюватися за інгібуванням зв'язування Dll4 з Notch-рецептором. Використовуваний у даному документі термін «антиген-зв’язувальна область» антитіла (або просто «частина антитіла» або «фрагмент антитіла») позначає один або кілька фрагментів антитіла, що зберігають здатність до специфічного зв'язування з антигеном (наприклад, hDll4). Було показано, що антиген-зв’язувальна функція антитіла може здійснюватися фрагментами всієї послідовності антитіла. До прикладів зв’язувальних фрагментів, включених у термін «антигензв’язувальна область» антитіла, належать (i) фрагмент Fab, моновалентний фрагмент, що складається з доменів VL, VH, CL і CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, бівалентний фрагмент, що складається з двох фрагментів Fab, зв'язаних дисульфідним містком у шарнірній області; (iii) фрагмент Fd, що складається з доменів VH і CH1; (iv) фрагмент Fv, що складається з доменів VL і VH окремої області антитіла; (v) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), що складається з домена VH; і (vi) ізольований CDR. Більше того, незважаючи на те, що два домени у фрагменті Fv, VL і VH, кодуються різними генами, їх можна об'єднати, використовуючи рекомбінантні технології, за допомогою синтетичного лінкера, що дозволяє побудувати з них єдиний білковий ланцюжок, в якого області VL і VH зв'язуються з утворенням моновалентних молекул (відомих як одиночний 94305 16 ланцюг Fv (scFv); див., наприклад, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; і Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такі одноланцюжкові антитіла також включаються в сферу охоплення терміна «антиген-зв’язувальна область» антитіла. Сюди ж входять і інші форми одноланцюжкових антитіл, наприклад діатіла. Діатіла являють собою бівалентні біспецифічні антитіла, в яких домени VH і VL експресуються на одному поліпептидному ланцюзі, але довжина з'єднуючого їх лінкера занадто мала для зв'язування двох доменів на одному і тому самому ланцюзі, що змушує домени одного ланцюга зв'язуватися з комплементарними доменами іншого ланцюга, створюючи тим самим два сайти зв'язування антигену [див., наприклад, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123]. Далі, антитіло або його антиген-зв’язувальна область можуть бути частиною більш великої імуноадгезивної молекули, утвореної ковалентною або нековалентною асоціацією антитіла або частини антитіла й однією або декількома іншими білковими молекулами або пептидами. Приклади таких імуноадгезивних молекул включають використання області ядра стрептавідину для одержання тетрамерної молекули scFv (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101), і використання залишку цистеїну, маркер-пептиду і C-термінальної полігістидинової мітки для одержання бівалентних і біотинілованих молекул scFv (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:10471058). Частини антитіл, такі як фрагменти Fab і F(ab')2, можуть бути одержані з цільних антитіл за допомогою стандартних методик, таких як папаїнове і пепсинове розщеплення цільних антитіл, відповідно. Крім того, антитіла, частини антитіл і імуноадгезивні молекули можуть бути одержані з використанням стандартних технологій рекомбінантної ДНК, як описано в даному документі. Використовуваний у даному документі термін «антитіло людини» призначений для позначення антитіл з варіабельною і константною областями, одержаних з імуноглобулінових послідовностей зародкових ліній людини. Описувані в даному винаході антитіла людини можуть включати амінокислотні залишки, не кодовані імуноглобуліновими послідовностями зародкових ліній людини (наприклад, мутації, викликані випадковим або сайтспецифічним мутагенезом in vitro або соматичними мутаціями in vivo), наприклад, в областях CDR, особливо в області CDR3. Однак використовуваний у даному документі термін "антитіло людини " не має на увазі включення антитіл, в яких на зародкові послідовності людини щеплені CDR послідовності, одержані із зародкових ліній іншого виду ссавців, наприклад миші. Використовуваний у даному документі термін "рекомбінантне антитіло людини" має на увазі включення всіх типів антитіл людини, що одержують, експресують, створюють або виділяють з використанням рекомбінантних технологій, у тому числі антитіл, що експресуються з використанням рекомбінантного вектора експресії, трансфікованого в клітину-хазяїна (як описано нижче), антитіл, 17 виділених з рекомбінантної комбінаторної бібліотеки антитіл людини (як описано нижче), антитіл, виділених із тварини (наприклад, миші), трансгенної по відношенню до генів імуноглобуліну людини [див., наприклад, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295], а також антитіл, одержаних, експресованих, створених або виділених з використанням будь-яких інших методів, що використовують сплайсінг послідовностей гена імуноглобуліну людини на інші послідовності ДНК. Такі рекомбінантні антитіла людини мають варіабельну і константну області, одержані з імуноглобулінових послідовностей зародкових ліній людини. У ряді здійснень, однак, такі рекомбінантні антитіла людини піддаються мутагенезу in vitro (або, при використанні тварин, трансгенних по імуноглобуліну людини, соматичному мутагенезу in vivo), і, таким чином, амінокислотні послідовності областей VH і VL рекомбінантних антитіл виявляються послідовностями, що, хоча й одержані з послідовностей VH і VL областей зародкових ліній людини, а також зв'язані з ними, можуть бути відсутніми у природно існуючому in vivo наборі послідовностей зародкових ліній людини. Використовуваний у даному документі термін "виділене антитіло" призначений для позначення антитіла, істотно вільного від інших антитіл, що володіють іншою антигенною специфічністю (наприклад, виділене антитіло, що специфічно зв'язує hDll4, істотно вільне від антитіл, що специфічно зв'язують антигени, відмінні від hDll4). Виділене антитіло, що специфічно зв'язує hDll4, проте, може мати перехресну реактивність до інших антигенів, наприклад, молекул hDll4 з інших видів. Більше того, виділене антитіло може бути істотно вільне від інших клітинних матеріалів і/або хімічних реагентів. Використовуваний у даному документі термін «поверхневий плазмонний резонанс» стосується оптичного явища, що дозволяє проводити аналіз біоспецифічних взаємодій у реальному часі за рахунок детектування змін концентрацій білка в біосенсорній матриці, наприклад за допомогою системи Biscoe™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.). Використовуваний у даному документі термін «KD» призначений для позначення константи дисоціації конкретної взаємодії антитіло-антиген. Використовуваний у даному документі термін “епітоп” включає кожну детермінанту, переважно поліпептидну детермінанту, здатну до специфічного зв'язування з імуноглобуліном або рецептором Т-клітини. У ряді здійснень епітопні детермінанти включають хімічно активні угрупування на поверхні молекул, таких як амінокислот, бічних ланцюгів цукрів, фосфорильних груп або сульфонільних груп, і в ряді здійснень можуть мати специфічні тривимірні структурні характеристики і/або специфічні зарядові характеристики. Епітоп являє собою область антигену, в якій відбувається зв'язування з антитілом. У ряді здійснень вважається, що антитіло специфічно зв'язується з антигеном, якщо воно переважно впізнає свою антиген-мішень у складній суміші білків і/або макромолекул. У переважних варіантах здійснення винаходу вважаєть 94305 18 ся, що антитіло специфічно зв'язується з антигеном, якщо рівноважна константа дисоціації не перевищує 10-8М, більш переважно, якщо рівноважна константа дисоціації не перевищує 10-9М, і найбільше переважно, якщо рівноважна константа дисоціації не перевищує 10-10М. Білок або поліпептид є "істотно чистим", "істотно однорідним" або "істотно очищеним", якщо принаймні приблизно від 60 до 75% зразка містить один вид поліпептиду. Поліпептид або білок може бути мономерним або мультимерним. Істотно чистий поліпептид або білок звичайно складає приблизно 50, 60, 70, 80 або 90 вагових відсотків зразка білка, як правило зразково 95%, і, переважно, є чистим більш ніж на 99%. Чистота або однорідність білка може бути доведена задопомогою ряду добре відомих у даній галузі методів, наприклад електрофорезом зразка білка в поліакриламідному гелі з наступним одержанням однієї поліпептидної смуги при фарбуванні гелю одним з добре відомих у даній галузі барвників. У ряді випадків для одержання більш високого розрізнення може використовуватися ВЕРХ або інші методи очищення, добре відомі фахівцям у даній галузі. Використовуваний у даному документі термін "поліпептидний аналог або варіант" стосується поліпептиду, що містить сегмент довжиною не менше 25 амінокислотних залишків, що істотно збігається з ділянкою амінокислотної послідовності і володіє принаймні однією з наступних властивостей: (1) специфічно зв'язується з hDll4 у необхідних для зв'язування умовах, або (2) здатний блокувати зв'язування Dll4 з Notch-рецептором. Як правило, поліпептидні аналоги або варіанти містять консервативну заміну (або вставку або видалення) амінокислот у порівнянні з вихідною природною послідовністю. Аналоги, як правило, мають довжину не менше 20 амінокислотних залишків, переважно не менше 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 або 200 амінокислотних залишків або більше, і часто можуть мати ту саму довжину, що і повнорозмірний природний поліпептид. Переважними для заміщення амінокислот є групи, що: (1) знижують чутливість до протеолізу, (2) знижують чутливість до окислювання, (3) змінюють афінність зв'язування при утворенні білкових комплексів, (4) змінюють афінності зв'язування, і (4) додають або змінюють інші фізико-хімічні або функціональні властивості таких аналогів. Аналоги можуть містити різні мутації послідовності в порівнянні з природною пептидною послідовністю. Наприклад, у вихідній природній послідовності (переважно в області поліпептиду за межами утворюючих міжмолекулярні контакти доменів) можуть бути зроблені одиночні або множинні заміни амінокислот (переважно консервативні заміни амінокислот). Консервативна заміна амінокислот не повинна істотно змінювати структурні характеристики вихідної послідовності (наприклад, заміняюча амінокислота не повинна сприяти розриву наявної у вихідній послідовності спіралі або іншим способом порушувати складові елементи вторинної структури, характерної для вихідної послідовності). Приклади загальноприйнятих у даній галузі 19 елементів вторинної і третинної структури поліпептидів описані в книгах «Proteins, Structures and Molecular Principles» (Creighton 1984 W. H. Freeman and Company, New York) «Introduction to Protein Structure» (Branden & Tooze, eds., 1991, Garland Publishing, NY), а також у Thornton et at. 1991 Nature 354:105. Непептидні аналоги широко використовуються у фармацевтичній галузі як лікарські препарати з властивостями, аналогічними властивостям вихідного пептиду-матриці. Подібні непептидні сполуки одержали назву "міметики пептидів" або "пептидоміметики" [див. наприклад, Fauchere (1986) J. Adv. Drug Res. 15:29; and Evans et al. (1987) J. Med. Chem. 30:1229]. Систематична заміна однієї або більше амінокислот погодженої послідовності на D-амінокислоту того ж типу (наприклад, на Dлізин замість L-лізину) може також використовуватися для одержання більш стабільних пептидів. Крім того, відомими в даній галузі методами (Rizo et al. (1992) Ann. Rev. Biochem. 61:387) можуть бути одержані пептиди з додатковими структурними обмеженнями, що містять погоджену послідовність або істотно ідентичну варіацію погодженої послідовності, наприклад шляхом введення додаткових внутрішніх залишків цистеїну, здатних до утворення внутрішньомолекулярних дисульфідних містків, що приводять до циклізації пептиду. Термін "процентна міра ідентичності послідовності" у контексті послідовностей нуклеїнових кислот стосується залишків у двох послідовностях, що виявляються однаковими при зіставленні двох послідовностей для досягнення максимальної погодженості. Довжина ділянки порівняння для встановлення міри ідентичності послідовностей може складати не менше 9 нуклеотидів або більше, звичайно принаймні 18 нуклеотидів, більш звичайно принаймні 24 нуклеотиди, як правило не менш зразково 28 нуклеотидів, більш типово принаймні 32 нуклеотиди, і переважніше не менше приблизно 36, 48 або більше нуклеотидів. Існує декілька відомих у даній галузі різних алгоритмів, що можуть бути використані для вимірювання міри ідентичності послідовностей нуклеотидів. Наприклад, полінуклеотидні послідовності можуть порівнюватися з використанням програм FASTA, Gap або Bestfit, що входять у пакет Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis. Набір програм FASTA, що включає, наприклад, програми FASTA2 і FASTA3, дозволяє виконати зіставлення і визначити процентну міру ідентичності послідовності областей найкращого перекривання між заданою і досліджуваною послідовностями (Pearson (1990) Methods Enzymol. 183:63-98 and (2000) Methods Mol. Biol. 132:185219). Якщо не обговорено особливо, для програм і алгоритмів використовуються стандартні параметри за умовчанням. Наприклад, для визначення процентної міри ідентичності послідовності нуклеїнових кислот можна використовувати програми FASTA зі своїми параметрами за умовчанням (розмір слова 6 і опція NOPAM для побудови матриці оцінки) або програми Gap зі своїми значеннями за умовчанням, зазначеними в пакеті GCG Version 6.1. 94305 20 Посилання на послідовність нуклеїнової кислоти мають на увазі одночасно і комплементарну послідовність, якщо інше не обговорено явно. Так, посилання на молекулу нуклеїнової кислоти з конкретною послідовністю нуклеотидів повинні розумітися також як посилання і на комплементарний ланцюг з комплементарною послідовністю. Загалом, у даній галузі терміни "процентна міра ідентичності послідовності", "процентна подібність послідовностей" і "відсоток гомологічності послідовностей" вважаються взаємозамінними. У даному документі ці терміни будуть мати те саме значення у відношенні послідовностей нуклеїнових кислот. Термін «істотна аналогічність» або «власно кажучи аналогічні» у відношенні нуклеїнової кислоти або її фрагмента означає, що при оптимальному зіставленні з іншою нуклеїновою кислотою (або її комплементарним ланцюгом) з відповідними додаваннями або делеціями спостерігається ідентичність нуклеотидної послідовності на рівні не менше приблизно 90%, переважно, не менше приблизно 95%, більш переважно, не менше приблизно 96%, 97%, 98% або 99% основ нуклеотидів, що вимірюється за допомогою будь-якого відомого алгоритму ідентичності послідовностей, наприклад FASTA, BLAST або Gap, що описувалися вище. Застосовуваний у відношенні поліпептидів термін «істотна ідентичність» або «власно кажучи ідентичні» означає, що дві пептидні послідовності при їх оптимальному зіставленні, наприклад за допомогою програм GAP або BESTFIT з урахуванням внеску пропусків, демонструють не менше 80% ідентичності послідовностей, більш переважно не менше 90% або 95% ідентичності послідовностей і, ще більш переважно, не менше 98% або 99% ідентичності послідовностей. Переважно, положення неідентичних залишків відрізняється лише консервативним заміщенням амінокислот. «Консервативне заміщення амінокислот» - це таке заміщення, при якому один амінокислотний залишок заміщається іншим амінокислотним залишком, що має бічний ланцюг (групу R) з аналогічними хімічними властивостями (наприклад, заряд або гідрофобність). У загальному випадку, консервативне заміщення амінокислот не буде приводити до істотних змін функціональних властивостей білка. У випадку якщо дві або більше амінокислотні послідовності відрізняються одна від одної консервативним заміщенням, відсоток ідентичності послідовності або міра аналогічності може коректуватися убік збільшення, для того щоб врахувати консервативний характер заміщення. Способи такого коректування добре відомі фахівцям у даній галузі. Див. наприклад, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. До прикладів груп амінокислот, що мають бічні ланцюги з аналогічними хімічними властивостями, належать 1) аліфатичні бічні ланцюги: гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин; 2) аліфатичні гідроксиловані бічні ланцюги: серин і треонін; 3) бічні ланцюги з амідною групою: аспарагін і глутамін; 4) ароматичні бічні ланцюги: фенілаланін, тирозин і триптофан; 5) бічні ланцюги з властивостями основи: лізин, аргінін і гістидін; і (6) сірковмісні бічні ланцюги - цистеїн і метіонін. Пе 21 реважними групами для консервативного заміщення амінокислот є: валін-лейцин-ізолейцин, фенілаланін-тирозин, лізин-аргінін, аланін-валін, глутамат-аспартат і аспарагін-глутамін. В альтернативному варіанті консервативне заміщення являє собою будь-яку зміну, що приводить до позитивного значення в логарифмічній матриці імовірностей PAM250, описаної в роботі Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. «Помірковано консервативним» заміщенням називається будь-яка зміна, що приводить до ненегативного значення в логарифмічній матриці імовірностей PAM250. Подібність послідовностей поліпептидів, що також називають ідентичністю послідовностей, звичайно визначають за допомогою програмного забезпечення для аналізу послідовності. Програма для аналізу білків зіставляє подібні послідовності з використанням показників аналогічності, що задаються для різних заміщень, делецій і інших модифікацій, у тому числі для консервативного заміщення амінокислот. Наприклад, програмне забезпечення GCG містить такі програми, як Gap і Bestfit, що можуть використовуватися з параметрами за умовчанням для визначення гомології послідовності або ідентичності послідовності між близькородинними поліпептидами, наприклад гомологічними поліпептидами різних видів або організмів між вихідним білком і його мутантом. Див., наприклад, GCG Вір. 6.1. Поліпептидні послідовності можуть також зіставлятися за допомогою FASTA - програми, включеної в GCG Вер. 6.1, - з використанням параметрів за умовчанням або параметрами, що рекомендуються. FASTA (наприклад, FASTA2 і FASTA3) забезпечує зіставлення і визначає відсоток ідентичності послідовностей в областях з найбільшим перекриванням між заданою і досліджуваною послідовностями [див. вище Pearson (2000)]. Іншим переважним алгоритмом зіставлення послідовності даного винаходу з базою даних, що містить велике число послідовностей різних організмів, є комп'ютерна програма BLAST, особливо blastp або tblastn, що використовує параметри за умовчанням. Див., наприклад, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 і Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402. Довжина поліпептидних послідовностей, порівнюваних для визначення міри гомології, як правило, складає не менше приблизно 16 амінокислотних залишків, звичайно не менше приблизно 20 залишків, найчастіше не менше приблизно 24 залишків, у більшості випадків не менше приблизно 28 залишків, і переважно більше 35 залишків. При пошуку в базі даних, що містять послідовності з великої кількості різних організмів, переважно порівнювати послідовності амінокислот. Одержання антитіл людини До методів одержання антитіл людини належать, наприклад, VELOCIMMUNE® (Regeneron Pharmaceuticals), технологія XENOMOUSE™ (Abgenix), «мінілокусний» метод і фаговий дисплей. Технологія VELOCIMMUNE® (патент U.S. 6596541) включає метод одержання цілком людських антитіл з високою специфічністю відносно вибраного антигену. Дана технологія припускає одержання трансгенних мишей з геномом, що містить 94305 22 варіабельні області важкого і легкого ланцюга людини, що функціонально зв'язані з ендогенними локусами константної області миші, так що у відповідь на антигенну стимуляцію миша продукує антитіло, що містить варіабельну область людини і константну область миші. ДНК, що кодує варіабельні області важкого і легкого ланцюга антитіла, виділяють і функціонально зв'язують із ДНК, що кодує константні важкі і легкі ланцюги людини. Потім ДНК експресують у клітині, що у стані експресувати цілком людське антитіло. У конкретному варіанті здійснення такою клітиною є клітина СНО. Технологією XENOMOUSE™ (Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21) одержують мишу, що володіє як варіабельною, так і константною областями людини з локусів важкого ланцюга і легкого ланцюга каппа. В іншому варіанті використовувався підхід «мінілокус», в якому екзогенний локус Ig імітувався шляхом включення індивідуальних генів з локусу Ig [див., наприклад, патент U.S. 5545807]. Виділена ДНК, що кодує варіабельні області, може мати або не мати функціональний зв'язок із ДНК, що кодує константні важкі і легкі ланцюги людини. Відомі також інші методи виробництва антитіл людини, у тому числі шляхом одержання від донора. Див., наприклад, GCG Вер. 6787637. Антитіла можуть використовуватися в терапевтичних цілях для блокування ліганд-рецепторної взаємодії або інгібування взаємодії рецепторних компонентів замість знищення клітин за рахунок фіксації комплементу й участі в клітиннообумовленій цитотоксичності (CDC). Константна область антитіла важлива для забезпечення здатності антитіла фіксувати комплемент і брати участь у CDC або безпосередньому знищенні клітин за рахунок антитілозалежної клітиннообумовленої цитотоксичності (ADCC). Тому ізотип антитіла можна вибирати в залежності від того, наскільки бажано, щоб антитіло фіксувало комплемент. Імуноглобуліни людини можуть існувати в двох формах, що зв'язано з гетерогенністю шарнірної області. В одній з форм молекула імуноглобуліну містить стабільну чотирьохланцюжкову конструкцію вагою приблизно 150-160 кДа, в якій димери утримуються зв’язуючим важкі ланцюги дисульфідним містком. В другій формі димери не зв'язані міжланцюжковим дисульфідним містком, і утворюється молекула з приблизною вагою 75-80 кДа, що складається з одного легкого і важкого ланцюга. Розділення цих форм було пов’язане із труднощами, навіть після афінного очищення. Частота проявів другої форми в різних ізотипах інтактного IgG викликана, крім іншого, структурними розходженнями, зв'язаними з ізотипом шарнірної області антитіла. Дійсно, заміна однієї амінокислоти в шарнірній області людського IgG4 може істотно знизити частку другої форми (Angal et al. 1993 Molecular Immunology 30:105) до рівнів, звичайно характерних при використанні шарнірної області людського IgG1. У сферу охоплення даного винаходу входять антитіла, що мають одну або кілька мутацій у шарнірній області, областях CH2 або CH3, що можуть бути бажані, наприклад, при 23 продукуванні антитіл для підвищення виходу або для модулювання ефекторних функцій. Антитіла згідно з даним винаходом переважно виходять з використанням технології ® VELOCIMMUNE . Трансгенні миші, в яких варіабельні області важкого і легкого ланцюгів ендогенного імуноглобуліну заміняються відповідними варіабельними областями людини, стимулюються антигеном, що представляє інтерес, і в миші, що експресує антитіла, беруться лімфатичні клітини (наприклад, В-клітини). Лімфатичні клітини можуть зливатися з лінією мієлоїдних клітин для одержання іморталізованих ліній клітин гібридоми, і такі лінії клітин гібридоми проходять скринінг і селекцію для ідентифікації тих ліній клітин гібридоми, що продукують антитіла специфічні до антигена, що представляє інтерес. ДНК, що кодує варіабельні області важкого і легкого ланцюга антитіла, можна виділити і зв'язувати з потрібними ізотипічними константними областями важкого і легкого ланцюгів. Такий білок антитіла може продукуватися в клітині, наприклад у клітині СНО. В альтернативному варіанті ДНК, що кодує антигенспецифічні химерні антитіла, можна виділити безпосередньо з антигенспецифічних лімфоцитів. У різних варіантах здійснення трансгенна миша містить 12 функціональних варіабельних генів важкого ланцюга людини і 11 функціональних варіабельних генів каппа легкого ланцюга людини; від 25 до 30 варіабельних генів важкого ланцюга людини і від 18 до 20 варіабельних генів каппа легкого ланцюга людини; від 43 до 48 варіабельних генів важкого ланцюга людини і від 20 до 22 варіабельних генів каппа легкого ланцюга людини; або приблизно 80 варіабельних генів важкого ланцюга людини і приблизно 40 варіабельних генів каппа легкого ланцюга людини. У загальному випадку антитіла згідно з даним винаходом володіють дуже високою афінністю, як правило з KD від приблизно 10-9 до приблизно 1011 M, якщо вимірювати по зв'язуванню з антигеном, іммобілізованим на твердій підкладці або аналізованим у розчині. Константні області миші заміняються бажаними константними областями людини, для того щоб одержати цілком людські антитіла, описані в даному винаході, наприклад вихідний або модифікований IgG1 або IgG4 (наприклад, SEQ ID №: 950, 951, 952). Вибрана константна область може мінятися в залежності від конкретного здійснення, а властивості високої афінності антиген-зв'язування і необхідна специфічність визначаються варіабельною областю. Рак, інфекційні захворювання, аутоімунні порушення, імунодефіцитні стани, відторгнення трансплантів, запалення, травми і дегенеративні порушення можна лікувати за допомогою модуляції імунної системи. У випадку хвороб, зв'язаних з неправильним функціонуванням або зайвою активністю імунної системи, таких як аутоімунні порушення і запалення, позитивний ефект може бути досягнутий за рахунок придушення функцій імунних клітин або зниження їхньої кількості. Для цього можна використовувати або блокування позитивних сигналів, або стимулювання негативних сигналів для популяцій імунних клітин, критично важли 94305 24 вих для протікання даного захворювання, наприклад T-клітин, B-клітин, NK-клітин, нейтрофілів, макрофагів, антиген-представляючих клітин, мастоцитів або клітин інших типів. Для придушення підвищеної активності може також використовуватися елімінація популяцій різних імунних клітин шляхом стимулювання апоптозу, спрямованого впливу на специфічні поверхневі рецептори антитілами, що елімінують, або кон’югатами антитілліки, а також блокування або зміни диференціювання ліній імунних клітин або конкретних типів клітин. Неефективність або знижена активність імунної функції може привести до виникнення або ускладнення таких захворювань, як рак, інфекційні хвороби й інші імунодефіцитні стани. Зі зниженою активністю імунної системи можна боротися шляхом активування імунних клітин, стимулюючи позитивні сигнали за допомогою крос-зшивання або агоністичні антитіла, або блокуючи негативні сигнали. Підвищення популяції імунних клітин може бути досягнуте шляхом стимуляції розвитку деяких або всіх ліній диференціювання імунних клітин, блокування апоптозу або усунення інгібіторних сигналів. У конкретному додатку антитіла згідно з даним винаходом корисні для лікування, придушення або полегшення таких станів або хвороб, як, наприклад, рак, імунодефіцитні стани, відторгнення транспланту або запалення. Епітопне картирування і зв'язані з ним технології Для скринінга антитіл, що зв'язуються з конкретним епітопом (наприклад, що блокують зв'язування IgE з відповідним рецептором, що володіє високою афінністю), можна проводити стандартний перехресний конкурентний аналіз (crossblocking) подібно описаному в Harlow and Lane (1990) вище. До інших методів належать мутанти сканування аланіну, пептидний блотінг (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), і аналіз розщеплення пептидів. Крім того, можуть використовуватися такі методи, як вирізання епітопа, екстракція епітопа і хімічна модифікація антигенів (Tomer (2000) Protein Science: 487-496). Використовуваний у даному документі термін "епітоп" стосується сайту антигену, на який реагують B- і/або T-клітини. Епітопи B-клітин можуть бути утворені як безупинною послідовністю амінокислот, так і розрізненими амінокислотами, що опинилися в необхідному взаємному положенні в результаті фолдінга білка в третинну структуру. Епітопи, утворені безупинною послідовністю амінокислот, як правило, зберігаються при впливі денатуруючих розчинників, тоді як епітопи, що виникли в результаті фолдінга білка в третинну структуру, руйнуються при обробці денатуруючими розчинниками. Епітоп, як правило, формується принаймні 3, а звичайно принаймні 5 або 8-10 амінокислотами в унікальній просторовій конформації. Визначення профілю за допомогою модифікації (MAP), також відоме як визначення профілю антитіл на основі структури антигену (ASAP) являє собою метод класифікації великого числа моноклональних антитіл (mAbs) до того самого антигену відповідно до подібностей профілю зв'язування 25 кожного антитіла з хімічно або ензиматично модифікованими антигенними поверхнями (публікація патенту США No. 2004/0101920). Кожна категорія може відбивати унікальний епітоп, що або чітко відрізняється від епітопа, представленого в будьякій іншій категорії, або частково перекривається з ним. Подібна технологія дозволяє швидко відокремлювати генетично ідентичні антитіла, так що їхня ідентифікація може бути сконцентрована на антитілах, що генетично відрізняються. У випадку застосування для скринінга гібридоми, MAP може сприяти ідентифікації рідких клонів гібридоми, що виробляють mAbs з потрібними характеристиками. MAP може використовуватися для сортування антитіл hDll4 згідно з даним винаходом в групи антитіл, що зв'язують різні епітопи. До агентів, використовуваних для зміни структури іммобілізованих антигенів, належать ферменти, наприклад протеолітичні ферменти, такі як трипсин, ендопротеїназа Glu-C, ендопротеїназа Asp-N, хімотрипсин і т.п. До агентів, використовуваних для зміни структури іммобілізованих антигенів, також можуть належати хімічні речовини, такі як сукцинімідні ефіри і їх похідні, первинні аміновмісні сполуки, гідразини і карбогідразини, вільні амінокислоти і т.п. Антигенний білок може імобілізуватися на поверхнях чипа біосенсора або полістирольних гранулах. Останні можуть аналізуватися, наприклад, з використанням методу мультиплексного аналізу LUMINEX™ (Luminex Corp., Austin, TX). Оскільки LUMINEX™ дозволяє проводити мультиплексний аналіз до 100 різних типів гранул, він забезпечує майже нескінченну антигенну поверхню з різними модифікаціями, що гарантує більш високе розрізнення профілювання епітопов антитіл у порівнянні з аналізом на біосенсорах. Терапевтичне застосування і сполуки препаратів Введення терапевтичних препаратів відповідно до даного винаходу здійснюється в придатних носіях, наповнювачах і інших речовинах, що включаються до складу препаратів, щоб забезпечити більш ефективне поширення, доставку, переносимість і т.п. Множину відповідних сполук можна знайти у формулярах, відомих усім фахівцям в галузі фармацевтичної хімії: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA). До таких препаратів, наприклад, належать порошки, пасти, мазі, желе, віски, олії, ліпіди, ліпідвмісні (катіонні або аніонні) везикули (наприклад, LIPOFECTIN™), кон’югати ДНК, безводні абсорбційні пасти, емульсії олія-в-воді і вода-в-олії, емульсії карбовакса (поліетиленгліколі різної молекулярної ваги), напівтверді гелі і напівтверді суміші, що містять карбовакс. Кожна з приведених вище сумішей може підходити для лікування і проведення терапії відповідно до даного винаходу, за умови, що активний інгредієнт сполуки не інактивується компонентами препарату, і що сполука є фізіологічно сумісною і прийнятною для способу введення. Див. також у Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol. 52:238-311 і в цитованій там літературі додаткову 94305 26 інформацію, що стосується наповнювачів і носіїв, добре відомих фахівцям в галузі фармацевтичної хімії. Приклад 1. Одержання антитіл людини до рецептора людини Dll4. Миші можуть бути імунізовані за допомогою будь-якого методу, відомого фахівцям в галузі (див., наприклад, Harlow and Lane вище). В одному з варіантів здійснення винаходу мишам, одержаним за допомогою VELOCIMMUNE®, вводиться безпосередньо антиген hDll4, що містить локуси ДНК, які кодують варіабельні області важкого ланцюга людського Ig і варіабельні області легкого ланцюга каппа, в ад’юванті для стимулювання імунної відповіді. Такий ад’ювант включає повний і неповний ад’ювант Фройнда, систему ад’юванта MPL+TDM (Sigma) або RIBI (мураміл-дипептид) (див. О'Hаgаn (2000) Vaccine Adjuvant, by Human Press, Totawa, NJ). Вироблення антитіл як імунної відповіді контролюється стандартними методами антиген-специфічного імуноаналізу. Після одержання потрібної імунної відповіді антитілоекспресуючі В-клітини збирали і поєднували з клітинами мієломи миші для збереження їхньої життєздатності, з утворенням ліній клітин гібридоми. Такі лінії клітин гібридоми проходять скринінг і селекцію для ідентифікації тих ліній клітин, що продукують антитіла до антигена, що представляє інтерес, використовуючи аналізи, описані нижче. Альтернативним методом є виділення клітин гібридоми для антигена, що представляє інтерес, способом проточної цитометрії. Після об'єднання з клітинами мієломи зібрані разом клітини гібридоми вирощували протягом 10 днів у гіпоксантинаміноптеринтимідиновому середовищі. Потім клітини збирали й забарвлювали міченим біотином Dll4 при концентрації 2 мг/мл протягом 1 години, з наступним додаванням фікоеритринстрептавідину. Флуоресцентно-мічені клітини сортували методом проточної цитометрії (одна клітина на ямку в 96-ямковому планшеті із середовищем для вирощування клітин гібридоми), культивували 8-10 днів, потім проводили скринінг у кондиціонованому середовищі на наявність функціонально бажаних моноклональних антитіл як описано нижче. Антитіла проти hDll4 одержували прямим виділенням спленоцитів. Антиген-специфічні антитіла можна також виділяти прямо з антигенімунізованих B-клітин без об'єднання з клітинами мієломи, як описано в патенті США 2007/0280945 A1. З виділених рекомбінантів одержували стабільні CHO клітинні лінії з експресією рекомбінантних антитіл. Приклад 2. Визначення антиген-зв’язувальної афінності антигена Константи дисоціації (величини KD) комплексів антигена з рядом описаних вище антитіл визначали поверхневою кінетикою методом плазмонного резонансу на поверхні біосенсора в реальному часі (BIACORE™ 2000). Антитіло утримували на поверхні поліклонального антимишачого антитіла кози IgG, утвореній за допомогою прямого хімічного зв'язування з чипом BIACORE™ для формування поверхні зв'язаного антитіла. На поверхню за 27 94305 хоплених антитіл наносили мономерні hDll4 або димерні hDll4-hFc у різних концентраціях, і зв'язування і дисоціація комплексу антигену - антитіла контролювали в реальному часі. Розрахунок KD, констант швидкості дисоціації і напівперіоду дисоціації комплексу антиген/антитіло здійснювали за допомогою кінетичного аналізу (таблиця 1). Аналогічний метод використовували і для визначення характеристик одержаних з одиночних моноклональних антитіл B-клітин, модифікованих введенням константного домена IgG людини. Антитіла вводили в контакт з реагентом, що містить анти-hFc поликлональні тіла кози (Jackson Immuno Research Lab), іммобілізованим на поверхні чипа BIACORE™, і обробляли димерним білком Dll4mFc або мономерним білком Dll4 (таблиця 2). Аффинность зв'язування комплексу антигенантитіло також може бути визначена шляхом конкурентного аналізу в розчині на основі ELISA. Коротко: антитіла (у вигляді очищених білків або у кондиціонованому середовищі) попередньо змішували на 96-ямковому титраційному мікропланшеті з послідовним розведенням антигенного білка (мономерного або димерного) у межах від 0 до 10 мкг/мл, при постійній концентрації антитіла. Після 28 2 годин інкубування антигена з антитілом розчини переносили на титраційний мікропланшет з попередньо нанесеним антигеном для визначення вільного антитіла (MAXISORB™, VWR, West Chester, PA). На планшет наносили розчин 1 мкг/мл білка hDll4-hFc у фосфатно-сольовому буфері, планшет витримували протягом ночі при температурі 4C, неспецифічні сайти зв'язування блокували обробкою БСА протягом двох годин. Після переносу й інкубації протягом години планшет промивали, і зв'язані з поверхнею планшета антитіла визначали за допомогою реагенту, що містить кон’югат пероксидази хрону і поліклонального антимишачого IgG антитіла кози (Jackson Immuno Laboratory), і виявляли за допомогою колориметричних субстратів (OPTEIA™; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Ферментативну реакцію зупиняли 1М розчином фосфорної кислоти, вимірювали оптичне поглинання на 450 нм, одержані дані аналізували в моделі сигмоїдальної залежності відгуку від дози, визначені в такий спосіб концентрації IC50 наведені нижче (таблиця 1). Таблиця 1 Антитіло 13B6 15E10 22G12 24C8 VAV 2H4-19 VAV 4H10-9 VAV 7B9-9 VAW 10E4-9 VAW 10G11-2 VAW 1C6-1 VAW 1G2-4 VAW 1H2-2 VAW 2H3-2 VAW 3A7-2 VAW 3A9-5 VAW 3F12-8 VAW 6B8-12 VAW 6C6-2 VAW 6G12-10 VAW 7C10-11 VAW 8A10-14 VAW 8G1-12 VAW 9B11-2 VAW 9F12-6 VAW 9G10-1 KD Dll4 (нМ) 2,79 0,55 1,29 0,52 1,51 13,70 0,88 89,00 31,30 45,80 83,80 67,00 0,30 1,64 н.д. 8,12 0,89 91,70 3,74 17,10 1,41 6,09 62,20 16,00 56,10 KD Dll4-Fc (нМ) 0,188 0,023 0,076 0,047 0,611 0,662 0,021 0,468 1,430 0,092 0,035 0,148 0,150 0,162 2,510 0,648 0,060 0,092 0,527 0,853 0,648 8,300 0,048 1,350 0,555 IC50 Dll4-Fc (нМ) 0,06 0,58 0,03 0,01 0,10 0,30 0,27 0,06 1,66 0,25 0,40 0,30 0,26 0,02 16,00 0,07 0,43 0,50 0,19 0,28 0,08 8,60 0,00 0,02 0,10 29 94305 30 Таблиця 2 Антитіло 314266-06F12-B7 318518-01A04-D5 318518-01A10-D8 318518-01B09-C3 318518-01B11-D4 318518-01E07-H2 318518-01G04-F3 318518-01G05-B5 318518-02A07-B3 318518-02B06-E2 318518-02B08-F7 318518-02C04-D1 318518-02F05-D10 318518-02G03-F2 318518-02G04-B11 318518-02G08-F11 318518-03A03-B2 318518-03C10-F2 318518-03D04-B5 318518-03D07-G11 318518-03F04-A6 318518-03F06-A3 318518-03H03-F3 318518-14A06-E7 318518-14A07-C4 318518-14D08-G1 318518-14H08-A2 318518-1H08-E9 Приклад 3. Інгібування взаємодії Dll4 з Notchрецептором Здатність антитіл блокувати зв'язування Dll4 з Notch-рецептором оцінювали методом імуноферментного аналізу на твердому носії (ELISA). Розчин 1 мг/мл рекомбінантного білка Notch-hFc у фосфатно-сольовому буфері наносили на 96ямковий планшет і витримували протягом ночі при температурі 4°C, неспецифічні сайти зв'язування блокували обробкою БСА. Приготовлений у такий спосіб планшет використовували для вимірювання вільного біотин-Dll4-hFc у розчинах зразків для титрування антитіл. Для готування зразків для титрування антитіл однакову кількість біотин-Dll4hFc при концентрації 25 пМ змішували з різними кількостями антитіла, або у вигляді вихідного неочищеного середовища для кондиціонування гібридоми, або у вигляді очищеного білка антитіла, у KD Dll4 (нМ) 2,17 0,237 0,399 0,833 0,382 0,165 0,501 1,06 0,208 2,15 н.д. 0,478 1,28 1,31 0,813 н.д. 0,136 1,18 0,904 3,74 0,501 0,556 8,89 4,54 0,235 0,541 6,67 0,225 KD Dll4-Fc (нМ) 0,075 0,244 0,018 0,180 0,088 0,238 0,107 0,196 0,148 0,193 н.д. 0,331 0,035 0,042 0,048 н.д. 0,124 0,131 0,136 0,163 0,088 0,037 0,084 0,282 0,035 0,046 0,128 0,050 діапазоні концентрацій від 0 до ~50 нМ у послідовних розведеннях, потім проводили двогодинне інкубування при кімнатній температурі для досягнення рівноваги зв'язування антиген-антитіло. Після досягнення рівноваги розчини переносили на покриті Notch-hFc планшети для вимірювання вільний біотин-Dll4-hFc. Після годинної інкубації для зв'язування планшет промивали, зв'язаний біотинDll4-hFc визначали за допомогою кон’югата перксидази хрону і стрептавідину (Poly HRP streptavidin, Pierce Endogen) і виявляли за допомогою субстрату, що містить тетраметилбензидин (BD Pharmigen). Одержані дані аналізували в програмному пакеті GraphPad Prism, і концентрації IC50 визначали як кількості антитіла, необхідні для 50% зниження біотин-Dll4-hFc, зв'язаного з нанесеним на планшет Notch-Fc (таблиця 3) (*кондиціоноване середовище). Таблиця 3 Антитіло VAV 2H4-19 VAW 3A7-2 VAW 9G10-1 VAW 10E4-9 VAW 8A10-11 VAW 9F12-6 VAW 3F12-8 IC50 (нМ) 0,01 0,017 0,019 0,032 0,04 0,059 0,066 31 94305 32 Продовження таблиці 3 VAW 1C6-1 VAW 1G2-4 VAW 6C6-2 VAV 7B9-4 VAW 1H2-2 VAW 2H3-2 VAW 6B8-12 VAW 6G12-10 VAW 7C10-11 VAV 4H10-9 VAW 10G11-2 VAW 3A9-5 VAW 8G1-12 VAW 9B11-2 15E10* 22G12 13B6 24C8 314266-06F12-B7 318518-01A04-D5 318518-01A10-D8 318518-01B09-C3 318518-01B11-D4 318518-01E07-H2 318518-01G04-F3 318518-01G05-B5 318518-02A07-B3 318518-02B06-E2 318518-02B08-F7 318518-02C04-D1 318518-02F05-D10 318518-02G03-F2 318518-02G04-B11 318518-02G08-F11 318518-03A03-B2 318518-03C10-F2 318518-03D04-B5 318518-03D07-G11 318518-03F04-A6 318518-03F06-A3 318518-03H03-F3 318518-14A06-E7 318518-14A07-C4 318518-14D08-G1 318518-14H08-A2 318518-1H08-E9 Здатність вибраних очищених антитіл проти hDll4 блокувати зв'язування Dll4 з Notchрецептором також оцінювали описаним вище методом імуноферментного аналізу (ELISA), модифікованого заміною 25 пм біотин-Dll4-hFc на 30 пм біотин-Dll4-hFc і скороченням тривалості інкубації антиген-антитіло від двох до однієї години. Для зручності користування антитіло 318518-01A10-D8 0,086 0,11 0,119 0,123 0,154 0,168 0,255 0,257 0,273 0,599 0,931 3,8 10,7 0,069 0,04 0,10 0,11 0,031 0,07 0,11 0,05 0,03 0,03 1,17 0,02 1,08 0,03 0,09 н.д. 0,60 0,16 0,07 1,09 н.д. 0,57 0,12 0,04 0,45 0,01 0,02 0,17 0,04 0,02 0,14 0,25 0,03 перейменували в «REGN281» (HCVR/LCVR SEQ ID №№: 429/437 і hIg1 SEQ ID №: 950). Протестовані похідні антитіла включали REGN421 (HCVR/LCVR SEQ ID №: 901/903, hIg1 SEQ ID №: 950) і REGN422 (HCVR/LCVR SEQ ID №: 901/903 з модифікованим hIg4 SEQ ID №: 952). Результати наведені в таблиці 4. 33 94305 34 Таблиця 4 Антитіло IC50 (нМ) 0,042 0,045 0,039 REGN281 REGN421 REGN422 Здатність антитіла нейтралізувати опосередковувану Dll4 клітинну функцію також перевіряли in vitro на експресуючих Dll4 ендотеліальних клітинах пупкової вени людини (HUVEC). Інгібування опосередковуваною Notch-системою експресії генів hHes1 і Eph2 у клітинах HUVEC похідними антитілами контролювали в такий спосіб: клітини HUVEC з малим числом пересівань культивували в середовищі MCDB-131 (VecTechnologies). За день до аналізу клітини HUVEC висівали з щільністю 2105 клітин на ямку на 24-ямкових планшетах із загальним об’ємом середовища 1 мл. Антитіло, що перевіряється, або інший інгібітор вводили безпосередньо в окремі ямки планшета, використовуючи по три ямки на зразок, потім йшло культивування протягом 5 годин при 37C. По закінченні періоду культивування середовище видаляли і сумарну РНК виділяли з використанням лізуючого реагенту QIAZOL™ і набору RNEASY™ для витягування РНК із тканин з високим вмістом ліпідів (Qiagen). Кількісне визначення мРНК проводили з використанням ПЛР і флуорогенного 5' нуклеазного аналізу (TAQMAN® assay, Appied Biosystems). Для кожного зразка синтезували кДНК із 1-2 мг сумарної РНК. кДНК, одержана з еквівалентної кількості вихідної РНК (як правило 25 нг), вміщували на оптичні реакційні планшети ABI PRISM™ (також з потрійним повтором). Для кожного зразка РНК також готували контрольний зразок без додавання зворотної транскриптази “no RT” для вирахування можливого внеску геномної ДНК у сигнал. У кожну реакцію вводили 2x Mastermix (TAQMAN® 2x PCR Mastermix; ABI) до кінцевої концентрації 1x. Крім того, у кожну реакцію також вводили зонд TAQMAN® і праймери для контрольованого гена. Кожен праймер використовували при кінцевій концентрації 900 нм, зонд вводили до кінцевої концентрації 200 нм. Як стандарт використовували геномну ДНК людини. Аналіз проводили в стандартних умовах методики TAQMAN® на аналізаторі ABI 7900HT. Виміряні рівні експресії Hes1 і Ephrin2 нормували на ендогенний контрольний ген (циклофілін) (таблиця 5). Використані зонди і праймери: зонд на Hes1 людини (SEQ ID №: 387); олігонуклеотиди: hHes1869F (SEQ ID №: 388); hHes1-940R (SEQ ID №: 389), зонд на ephrin2 людини: hEph2-773T (SEQ ID №: 390); олігонуклеотиди: hEph2-752F (SEQ ID №: 391) hEph2-812R (SEQ ID №: 392); циклофілін людини: зонд: hCyclophilin-343T (SEQ ID №: 393); олігонуклеотиди: hCyclophilin-323F (SEQ ID №: 394); hCyclophilin-389R (SEQ ID №: 395). Таблиця 5 Антитіло 22G12 15E10 VAW 3A7-2 314266-06F12-B7 318518-01A10-D8 318518-01G04-F3 318518-01H08-E9 318518-02A07-B3 318518-03F04-A6 318518-03F06-A3 318518-014A07-C4 318518-014D08-G1 hDll4-hFc IC50 експресії Ephrin2 (нМ) 0,379 2,56 0,409 0,239 0,305 0,088 0,413 0,398 0,158 0,304 0,175 0,510 0,843 Тест на розмноження клітин HUVEC Здатність антитіл блокувати опосередковуване Dll4 інгібування росту ендотеліальних клітин пупкової вени людини (HUVEC) перевіряли в in vitro тесті на розмноження клітин. Одержані клітини HUVEC з малим числом пересівань культивували в середовищі MCDB-131 (Vec Technologies). За день до аналізу на 12-ямкові культуральні планшети наносили розчин hDll4-hFc у фосфатносольовому буфері (0,2 мкг/мл; 0,5 мл ФСБ/ямка). Планшети витримували ніч при температурі 4C і IC50 експресії Hes1 (нМ) 0,381 4,49 0,533 0,405 0,329 0,172 0,548 0,128 0,115 0,692 0,312 0,568 0,974 однократно промивали фосфатно-сольовим буфером. На планшети висівали клітини HUVEC із щільністю 4103 клітин на ямку із загальним об’ємом середовища 1,0 мл. Для одержання кривої інгібування відразу ж після висівання клітин у ямки вводили антитіла проти hDll4 у сумарному об’ємі 0,5 мл з концентрацією, що варіюється. Клітини інкубували протягом 96 годин при 37°C. Для визначення чисельності клітин використовували реагент CCK-8 (Dojindo). Усі 35 94305 тести були проведені по три рази. (Таблиця 6, 36 «н.б.» – «не блокує»). Таблиця 6 Антитіло IC50 (нМ) 0,284 1,868 н.б. 5,01 н.б. 0,198 0,214 0,888 2,067 0,096 0,106 0,188 0,200 0,184 0,188 0,159 0,165 15E10 VAW9B11-2 VAW8D8-12 13B6 VAW2H4-19 VAW3A7-2 VAW8A10-14 22G12 318518-06F12-B7 318518-01A10-D8 318518-01G04-F3 318518-01H08-E9 318518-02A07-B3 318518-03F04-A6 318518-03F06-A3 318518-014A07-C4 318518-014D08-G1 Тест на Notch-індуковану активність люциферази Для визначення здатності вибраних очищених антитіл нейтралізувати опосередковувану Dll4 клітинну функцію був розроблений in vitro тест на основі рекомбінантної клітинної лінії HEK293 (ATCC), що постійно експресує Notch-1 людини й містить Notch-реактивний промотор, що стимулює активність люциферази. Міру інгібування Notchіндукованої активності люциферази визначали в такий спосіб: за день до аналізу в кожну ямку непрозорого 96-ямкового культурального планшета піпетували по 100 мкл 1 нМ або 1,5 нМ розчину hDll4-hFc у фосфатно-сольовому буфері, планшет витримували ніч при температурі 4C. Клітини висівали на планшет у середовищі в кількості 2104 клітин/ямка. Клітини інкубували протягом 24 годин при 37C з очищеним білком антитіла в послідовних розведеннях у клітинному середовищі, починаючи з 2 нМ. Активність люциферази визначали шляхом додавання субстрату STEADY-GLO (Promega) до повного заповнення ямки (таблиця 7). Таблиця 7 Антитіло REGN281 REGN421 REGN422 IC50 (пМ) 1 нМ hDll4-hFc 50,5 54,4 88,2 Приклад 4. Інгібування розщеплення Notch-1 Здатність вибраних антитіл проти hDll4 інгібувати розщеплення Notch-1 перевіряли аналізом повної кількості відщепленого белка Notch-1 методом електрофорезу в поліакриламідному гелі с додецилсульфатом натрію (SDS-PAGE)/вестернблотінгом. Клітини HUVEC з невеликим числом пересівань культивували як описано вище. За день до аналізу на 6-ямкові планшети наносили розчин hDll4-hFc в фосфатно-сольовому буфері (0,2 мкг/мл; 1,0 мл ФСБ/ямка). Планшети витримували ніч при температурі 4C і однократно промивали фосфатно-сольовим буфером. На планшети 5 висівали клітини HUVEC з щільністю 7,510 клітин на ямку із загальним об’ємом середовища 2,0 мл. Відразу ж після висівання клітин в ямки вводили антитіла проти hDll4 до кінцевої концентрації 10 нМ. Клітини інкубували протягом 24 годин при 37C, потім готували екстракти з цільних клітин, які аналізували методом SDS-PAGE. Рівні розщепле 1,5 нМ hDll4-hFc 78,7 87,3 131,1 ного Notch-1 визначала за допомогою антирозщепленого Notch-1 (Val1744) антитіла (Cell Signaling) і стандартних методик вестерн-блотінга. Антитіла проти hDll4 проявили здатність повністю блокувати розщеплення Notch-1, індуковане нанесеним на планшет hDll4-hFc (дані не наводяться). Приклад 5. Тести ADCC і CDC Антитілозалежну клітинно-опосередковувану цитотоксичність (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity/ADCC), індуковану двома тестованими антитілами (REGN421, REGN422), перевіряли на наборі восьми ліній клітин-мішеней з різними рівнями експресії hDll4. Використовували наступні 8 ліній клітин-мішеней: (1) клітини HUVEC; (2) клітини HUVEC, стимульовані 10 нм ФРЕС протягом 24 годин; (3) клітини Colo205; (4) рекомбінантні клітини C6 гліоми щура, експресуючі eGFP; (5) рекомбінантні клітини C6 гліоми щура, експресуючі hDll4; (6) рекомбінантні клітини HT1080, експресуючі eGFP; (7) рекомбінантні клітини HT1080, експре 37 94305 суючі hDll4; і (8) клітини HT29. Dll4 або eGFP людини вбудовували в геном клітини C6 або HT1080 шляхом ретровірусної трансфекції. Для цього клітини кожної лінії клітин-мішеней (10000 клітин/ямка в 50 мкл) спочатку змішували з рівним об’ємом послідовно розведених антитіл REGN421 або REGN422 з одержанням кінцевої концентрації антитіл у діапазоні від 0,169 пМ до 10 нм, і інкубували протягом 10 хвилин при кімнатній температурі на 96-ямкових планшетах (як контроль використовували ямки без антитіла). Окремо готували мононуклеарні клітини периферичної крові людині (PBMC, клітини-ефектори), відповідно до стандартної процедури градієнтного центрифугуючого збагачення Ficoll-Hypaque. До кожної суміші антитіла і клітин-мішеней додавали приблизно по 300000 клітин PBMC, створюючи в результаті кінцеве співвідношення клітин-ефекторів до клітинмішеней приблизно 30:1. Приготовлені в такий спосіб 96-ямкові планшети потім інкубували протя 38 гом 4 годин при 37C, в атмосфері 5% CO2, з наступним центрифугуванням при 250g. Супернатанти збирали і тестували на активність лактатдегідрогенази (LDH), використовуючи тестувальну систему для нерадіоактивного контролю цитотоксичності CYTOTOX 96® (Promega). Результати наведені в таблиці 8. Індукований REGN421 залежний від дози лізис клітин спостерігався тільки в клітинах C6, експресуючих hDll4 (колонка 5), що демонстрували найвищу експресію hDll4 із усіх досліджених ліній клітин (за результатами аналізу методом імуноосадження з наступним вестерн блотом і проточною цитометрією). Максимальна цитотоксичність клітин у лінії C6-hDll4 коливалася від 20% до 60%. В інших сімох лініях клітинмішеней індукований REGN421 лізис клітин не спостерігався. Антитіло REGN422 не індукувало лізису клітин у жодній з досліджених ліній клітинмішеней. Таблиця 8 Ab REGN421 REGN422 1 0 0 2 0 0 Максимальна цитотоксичність, % 3 4 5 6 0 0 20-60 0 0 0 0 0 Індукована REGN421 комплементарнозалежна цитотоксичність (Complement-dependent cytotoxicity/CDC) перевірялася на тому самому наборі клітинних ліній, описаному вище. Для цього клітини кожної лінії клітин-мішеней (50000 клітин/ямка в 50 мкл) спочатку змішували з рівним об’ємом послідовно розведених антитіл REGN421 з одержанням кінцевої концентрації антитіл у діапазоні від 0,169 пМ до 10 нм, і інкубували протягом 10 хвилин при кімнатній температурі на 96ямкових планшетах. Потім у кожну ямку додавали нормальну сироватку крові людини з комплементарними компонентами (Quidel Corp., San Diego, CA) до одержання кінцевої концентрації сироватки 5%. Приготовлені в такий спосіб 96-ямкові планшети потім інкубували протягом 2 годин при 37C, в атмосфері 5% CO2, з наступним додаванням реагенту CELLTITER-BLUE (Promega) (як контроль використовували ямки без антитіла і ямки з антитілом, але без сироватки). Планшети інкубували протягом ночі, після чого визначали міру виживання клітин (рівні цитотоксичності CDC). Як позитивний контроль використовували клітини Daudi, оброблені ритуксимабом. Антитіло REGN421 не показало цитотоксичності CDC по відношенню до жодної з досліджених клітинних ліній (дані не наводяться). Приклад 6. Епітопне картирування і специфічність Для визначення специфічності зв'язування з епітопом приготували групу із семи химерних білків Dll4, в яких специфічні домени білка Dll4 людини були в такий спосіб вбудовані в білок Dll4 миші: 7 0 0 8 0 0 №1 містив N-термінальний і DSL домени людини (S27-Q218); №2 містив N-термінальний, DSL і ЕФР-1 домени людини (S27-N252); №3 містив Nтермінальний, DSL, ЕФР-1 і ЕФР-2 домени людини (S27-Q283); №4 містив N-термінальний, DSL, ЕФР1, ЕФР-2, ЕФР-3, ЕФР-4 і ЕФР-5 домени людини; №5 містив N-термінальний домен людини (S27R172); №6 містив DSL домен людини (V173-Q218); і №7 містив ЕФР-2 домен людини (E252-D282). Химерні білки поєднували з фрагментом IgG2a-Fc миші і експресували в клітинах CHO-K1. Вестернблотінг зібраного кондиціонованого середовища підтвердив експресію білка. Специфічність зв'язування антитіл, що перевіряються, з hDll4, mDll4 і химерними білками №1, №2, №3 і №4 перевіряли в такий спосіб: очищені антитіла 22G12, VAW3A7-2 і 15E10 зв'язували через аміногрупу в кількості 5000-6000 RU на чипі CM5. Кондиціоноване середовище клітин CHO K1, що містять химерні білки Dll4, hDll4-mFc і mDll4mFc, послідовно наносили на чип з наступною регенерацією поверхні над покритою антитілом поверхнею. Як контроль на неспецифічне зв'язування кондиціонованого середовища використовували вільну аміно-зв’язану поверхню проточного осередку. Результати приводяться в таблиці 9. Антитіло 22G12 зв'язувалося з епітопом між S27-Q218 hDll4; антитіло VAW3A7-2 зв'язувалося з епітопом між Q283-E400 hDll4; і антитіло 15E10 зв'язувалося з епітопом між E252-D282 hDll4. 39 94305 40 Таблиця 9 Антитіло hDll4-mFc mDll4-mFc + + + 22G12 VAW3A7-2 15E10 1 + Визначали специфічність зв'язування очищеного випробуваного mAb до hDll4, mDll4 і описаних вище химерних білків (REGN279=314266-6F12-B7; REGN287=318518-1G04-F3; REGN289=3185181H08-E9; REGN290=318518-2A07-B3; REGN306=318518-3F06-A3). Для цього кожен білок Dll4 зв'язували (70-130 RU) на поверхні антимишачого IgG антитіла кози з наступним введенням випробуваного mAb у концентрації 100 мкг/мл. Як Химерні білки 2 3 + + + 4 + + + позитивний контроль використовували антитіло, що зв'язує mDll4-mFc (позитивний контроль=6C10). Результати (таблиця 10) показали, що антитіло REGN279 зв'язувалося з епітопом між S27-Q218 hDll4; антитіло REGN287 зв'язувалося між Q283-E400 hDll4; антитіла REGN289, REGN290 і REGN306 зв'язувалися між S27-E400 hDll4. Таблиця 10 Антитіло REGN279 REGN287 REGN289 REGN290 REGN306 Контроль hDll4-mFc mDll4-mFc + + + + + + + Описаним вище чином також проводили визначення специфічності епітопного зв'язування для наступних очищених випробуваних антитіл: REGN281=318518-1A10-D8; REGN305=3185183F04-A6; REGN309=318518-14A07-C4; Химерні білки Dll4 людини-миші 2 3 4 5 + + + + + + + + + + + + + + + + + + 1 + + + + + 6 + + + + 7 + REGN310=318518-14D08-G1; REGN421 і REGN422. Для цього кожен білок Dll4 зв'язували (240-470 RU) на поверхні антимишачого IgG антитіла кози з наступним введенням випробуваного mAb у концентрації 100 мкг/мл (таблиця 11). Таблиця 11 Антитіло REGN281 REGN305 REGN309 REGN310 REGN421 REGN422 hDll4-mFc + + + + + + mDll4-mFc Вестерн-блотінг. Специфічність зв'язування вибраних антитіл з химерними білками Dll4, білками Dll4 людини і миші визначали вестернблотінгом. Для цього виконували електрофорез hDll4-mFc (200 нг на доріжку), mDll4-mFc (200 нг на доріжку) і химерних білків №1-№7 (приблизно 150 нг на доріжку) на подвійних гелях (SDS-PAGE) з використанням невідновлювального буфера. Кожен гель потім переносили на мембрану (PVDF). Блоти спочатку обробляли антитілом REGN421 у концентрації 0,2 мкг/мл і потім кон’югатом пероксидази хрону й антитіла анти-hIgG (Pierce). Контрольні блоти обробляли кон’югатом перксидази хрону й антитіла анти-mFc (Pierce). Результати: антитіло REGN421 впізнали hDll4-mFc і химерні білки, що містять N-термінальний домен людини (№5), DSL домен людини (№6), або обидва цих 1 + + + + Химерні білки Dll4 людини-миші 2 3 4 5 + + + + + + + + + + + + + + + + + + 6 + + + + + 7 + домени №1, №2, №3 і №4). Антитіло REGN421 не впізнало химерний протеїн, що містить домен ЕФР-2 людини (№7). Аналіз протеазного розщеплення. Зв'язування між антитілом REGN281 і hDll4 також оцінювали методом аналізу захисту від протеазного розщеплення з використанням рідинної хроматографії/мас-спектрометрії (РХ/МС) на хроматомасспектрометрі HPLC1100 (Agilent) і масспектрометрі LCQ Classical Ion Trap Mass Spectrometer (Thermo). Для цього суміш hDll4 і REGN281 у мольному співвідношенні 1:5, або тільки hDll4, інкубували протягом ночі з протеазою при 25°C (для Glu протеази) або 37°C (для трипсину). Потім кожну з одержаних протеолітичних сумішей аналізували методом РХ/МС. Характерні пептидні піки, що є присутніми для протеолітичних сумішей, 41 94305 вироблених під час відсутності антитіла REGN281, що зменшувалися або зникали для протеолітичних сумішей, вироблених у присутності REGN281, вказували потенційні місця зв'язування REGN281 з hDll4, що захищалися від протеазного розщеплен 42 ня при зв'язуванні REGN281 з hDll4. Ці характерні піки аналізували мас-спектроскопічно. Одержані маси, очікувані маси, і N-термінальні послідовності пептидів наведені в таблиці 12. Таблиця 12 Пік Одержана маса Очікувана маса G1 G2 T1 T2 T3 T4 T5 T7 T8 521 1362,8 758 587,1 1607,4 1399 569,2 2615 1807,2 521,5 1363,4 760,8 587,2 1607,6 1400,7 569,3 2613,4 1806,9 Пептид hDll4 (SEQ ID №: 2) Phe37-Glu40 Ala121-Glu132 Pro49-Arg55 Tyr169-Arg172 Val173-Arg186 Gly42-Arg55 Thr56-Arg59 Ile143-Arg166 Ser27-Arg41 Приклад 7. Афінність зв'язування очищених антитіл Dll4 людини і мавпи Афінність зв'язування деяких очищених антитіл з мономерами Dll4, Dll4 M. facscicularis (mfDll4, SEQ IN №: 956) і Dll4 M. mulatta (mmDll4, SEQ ID №: 957) визначали за допомогою BIACORE™ 2000 і 3000. Для фіксації антитіл REGN281, REGN421 і REGN422 використовували поліклональні анти Протеаза Домен GluC GluC Трипсин Трипсин Трипсин Трипсин Трипсин Трипсин Трипсин N-термінал N-термінал N-термінал N-термінал DSL N-термінал N-термінал N-термінал N-термінал hFc антитіла кози, іммобілізовані на поверхні чипа BIACORE™. Як аналізований матеріал, що вводиться на покриту антитілами поверхню, використовували різні концентрації кожного білка, hDll4 (від 12,5 нм до 100 нм), mfDll4 (від 3,13 нм до 100 нм), і mmDll4 (від 12,5 нм до 100 нм). Зв'язування антиген-антитіло і дисоціацію зв'язаних комплексів спостерігали в реальному часі (таблиця 13). Таблиця 13 hDll4 REGN281 1,56×105 REGN421 1,63×105 REGN422 1,64×105 ka (M-1s-1) mfDll4 6,64×104 7,28×104 8,01×104 mmDll4 9,27×104 9,70×104 9,27×104 hDll4 2,30×10-5 2,17×10-5 2,36×10-5 Афінність зв'язування антитіл проти hDll4 стосовно димерів hDll4 і mmDll4 також визначали за допомогою BIACORE™ 2000 і методу, описаного вище, з тією відмінністю, що hDll4 заміняли на kd (s-1) mfDll4 2,04×10-5 2,02×10-5 2,88×10-5 mmDll4 3,05×10-5 3,23×10-5 3,41×10-5 hDll4 0,148 0,133 0,144 KD (нМ) mfDll4 mmDll4 0,307 0,329 0,278 0,333 0,360 0,375 hDll4-mFc (з 3,13 нМ до 100 нМ) або mmDll4 з mmDll4-mFc (з 0,78 нМ до 25 нМ) як аналізований матеріал (таблиця 14). Таблиця 14 REGN281 REGN421 REGN422 ka (M-1s-1) hDll4-mFc mmDll4-mFc 3,02×105 3,16×105 5 3,43×10 3,35×105 5 3,46×10 4,23×105 hDll4-mFc 4,96×10-6 4,70×10-6 4,60×10-6 Приклад 8. Перехресна реактивність антитіл з hDll1, hDll3, mDll4 і mfDll4 Також визначали перехресну реактивність антитіл до білка дельта-подібного ліганда 1 людини (SEQ ID №: 953) і білка дельта-подібного ліганда 3 людини (SEQ ID №: 954). Антитіла REGN281, REGN421 і REGN422 приводили в контакт з утримуючим поліклональні антитіла анти-каппа людини (h) кози реагентом (Southern Biotech), іммобілізованим на поверхні чипа BIACORE™, як аналізований матеріал, що вводиться на покриту антитілом поверхню, використовували білок hDll4-hFc або hDll1-hFc у концентрації 100 мкг/мл. Усі три антиті kd (s-1) mmDll4-mFc 4,64×10-6 3,80×10-6 4,15×10-6 KD (нМ) hDll4-mFc mmDll4-mFc 0,0163 0,0147 0,0137 0,013 0,0133 0,0098 ла проти hDll4 зв'язувалися тільки з hDll4-hFc, і не зв'язувалися з hDll1-hFc. Інший формат BIACORE™ використовували для оцінки перехресної реактивності між антитілом проти hDll4 і лігандами hDll1-hFc і hDll3-hFc. Для цього кожний з лігандів hDll4-hFc, hDll1-hFc і hDll3hFc ковалентно зв'язували через аміногрупу з поверхнею чипа CM-5 у діапазоні RU приблизно від 8000 до 10000. Потім антитіло REGN421 у концентрації 300 мкг/мл, вводили на поверхню кожного чипа. Антитіло REGN421 зв'язувалося тільки з hDll4-hFc; зв'язування з hDll1-hFc і hDll3-hFc не спостерігалося. Ті ж результати одержали і при заміні REGN421 на REGN422. 43 94305 Для визначення зв'язування між вибраними очищеними антитілами проти hDll4 і hDll4-hFc, hDll3-hFc, hDll1-hFc, mfDll4-mmh або mDll4-mFc використовували тест на зв'язування на основі TM системи OCTET . Для цього стрептавідинові FA біосенсори з високою зв’язувальною здатністю (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA) спочатку інкубували з біотин-анти-hк при концентрації 5 мкг/мл протягом 10 хвилин при 30°C для досягнення насичення. Потім зв'язані з біотин-анти-hк біосенсори інкубувалися з антитілами REGN281, REGN421 або REGN422 при концентрації 20 мкг/мл протягом 10 хвилин при 30°C для досягнення насичення. Зв'язані з антитілом біосенсори потім інкубували або з hDll4-hFc, або з hDll3-hFc, hDll1-hFc або mDll4-mFc при 200 нМ, або mfDll4-mmh при 100 нМ, протягом 10 хвилин при 30C. Після кожної інкубації вимірювали зміну в'язкості біологічного шару. Знайшли, що Dll4-hFc людини і mfDll4-mmh зв'язувалися з біосенсором, зв'язаним з антитілом проти hDll4, тоді як hDll3-hFc, hDll1-hFc і mDll4-mFc не зв'язувалися з біосенсором, зв'язаним з антитілом проти hDll4. Приклад 9. Вплив антитіла проти hDll4 на ріст пухлини Ефект антитіла REGN421 на ріст пухлини перевіряли на пухлинах, імплантованих мишам з важкою комбінованою імунонедостатністю (Severe Combined Immunodeficiency/SCID), що експресували гуманізований білок Dll4 (SCIDxhDll4). Для цьо 44 го готували гуманізовані по Dll4 миші шляхом заміни всього позаклітинного домена гена Dll4 миші на відповідну позаклітинну ділянку гена Dll4 людини (7kb) у зародкових стовбурових клітинах (ЗСК). Підготовлені в такий спосіб гомозиготні по hDll4 миші доводили до необхідного стану (SCID). Потім кожній миші підшкірно вводили 2,5106 пухлинних клітин людини HT1080. Після фіксації пухлин у мишах (~100-150 мм3 на 18 день після імплантації), мишей обстежували і вводили hFc, hDLL4-Fc або REGN421. 7 мишей розділили на три групи. Миші першої групи (n=3) одержували підшкірно hFc (25 мг/кг); миші другої групи (n=1) одержували hDll4-Fc (25 мг/кг); і миші третьої групи (n=3) одержували REGN421 (10 мг/кг). Препарат вводили кожні 48 годин, починаючи з 18 дня. Результати вимірювання пухлини in vivo одержували за три дні до першого введення препарату (15 день), у день кожного введення (18, 20 і 22 дні), і на 25 день. Розмір пухлини розраховували по формулі lw2/2. Результати наведені в таблиці 15. На 25 день мишей умертвляли, кожну пухлину витягали, вимірювали ex vivo і розраховували (довжина  ширина  глибина) (таблиця 16). Крім того, групі SCID мишей, експресуючих ендогенний mDll4 (n=2), також імплантували пухлинні клітини і проводили курс hDll4-Fc (25 мг/кг) за тим самим графіком. Таблиця 15 Миша Процес SCID SCID SCIDxhDll4 SCIDxhDll4 SCIDxhDll4 SCIDxhDll4 SCIDxhDll4 SCIDxhDll4 SCIDxhDll4 hDll4-hFc hDll4-hFc hDll4-hFc hFc hFc hFc REGN421 REGN421 REGN421 День 15 162,0 22,5 288,0 162,0 162,0 93,8 144,0 87,5 144,0 Розмір пухлини (мм3) День 18 День 20 День 22 232,8 320,0 336,0 117,0 117,0 108,0 320,0 352,0 446,0 288,0 320,0 500,0 220,5 352,0 662,0 135,0 179,6 352,0 245,0 320,0 162,0 162,0 153,0 225,0 196,0 272,0 162,0 День 25 253,1 68,8 320,0 550,0 661,5 726,0 144,0 135,0 152,5 Таблиця 16 Миша SCID SCID SCIDxhDll4 SCIDxhDll4 SCIDxhDll4 SCIDxhDll4 SCIDxhDll4 SCIDxhDll4 SCIDxhDll4 Процес hDll4-hFc hDll4-hFc hDll4-hFc hFc hFc hFc REGN421 REGN421 REGN421 Розмір пухлини (мм3) 308,0 105,0 480,0 924,0 1020,0 792,0 168,0 84,0 189,0 45 94305 46 47 94305 48 49 94305 50 51 94305 52 53 94305 54 55 94305 56 57 94305 58 59 94305 60