Одноланцюговий поліпептидний гібридний білок

Реферат: Винахід стосується одноланцюгового поліпептидного гібридного білка, що містить нецитотоксичну протеазу, здатну розщеплювати білок системи клітини-мішені, що забезпечує злиття з мембраною при екзоцитозі, частину молекули, що забезпечує націлювання, домен, що забезпечує перенесення, ділянку для розщеплення першою протеазою, ділянку для розщеплення другою протеазою, та ковалентний зв’язок між частиною молекули, що забезпечує зв’язування, та доменом, що забезпечує перенесення, де пептид, який відноситься до частини молекули, що забезпечує націлювання, має вільний N-кінцевий домен і вільний Скінцевий домен. Винахід належить також до послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує гібридний білок, ДНК-вектора, способу одержання нецитотоксичного засобу та застосування одноланцюгового поліпептидного гібридного білка у лікуванні, попередженні або полегшенні медичного стану. UA 112985 C2 (12) UA 112985 C2 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід відноситься до конструювання нового класу спрямованих інгібіторів секреції (TSI), до способу для їх активації та до активованого продукту. Нецитотоксичні протеази являють собою загальновідому групу протеаз, які діють на клітинимішені, призводячи до порушення клітинної функції. Важливо, що нецитотоксичні протеази не вбивають клітини-мішені, на які вони діють. Деякі з найбільш відомих прикладів нецитотоксичних протеаз включають клостридіальні нейротоксини (наприклад, ботулінічний TM TM нейротоксин, який представлений на ринку під назвами, такими як Dysport , Neurobloc і TM Botox , та IgA-протеази. Нецитотоксичні протеази діють шляхом протеолітичного розщеплення внутрішньоклітинних транспортних білків, відомих як білки SNARE (наприклад, SNAP-25, VAMP або синтаксин), див. Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology” (4th edition) John Wiley & Sons, Inc. Абревіатура SNARE походить від виразу розчинний рецептор, що приєднує NSF (Soluble NSF Attachment Receptor), де NSF означає фактор, чутливий до N-етилмалеїміду (N-ethylmaleimide-Sensitive Factor). Білки SNARE є важливими для утворення внутрішньоклітинних везикул, і, отже, для секреції молекул шляхом транспорту везикул із клітини. Відповідно, після доставки у потрібну клітину-мішень нецитотоксична протеаза здатна інгібувати клітинну секрецію з клітини-мішені. Нецитотоксичні протеази можна використовувати в їх нативних або, по суті, нативних TM TM TM формах (тобто у вигляді холотоксинів, як наприклад, у випадку Dysport , Neurobloc і Botox ), причому у цьому випадку націлювання протеаз на конкретні типи клітин залежить від (i) локалізованого введення протеази та/або (ii) характерної зв'язувальної здатності нативної протеази. В альтернативному випадку, нецитотоксичні протеази можна використовувати у перенаціленій формі, у якій нативна протеаза є модифікованою з включенням екзогенного ліганду, відомого як частина молекули, що забезпечує націлювання (TM). TM вибирають так, щоб забезпечити специфічність зв'язування з потрібною клітиною-мішенню, та нативну зв'язувальну частину нецитотоксичної протеази можна видалити у ході процесу перенацілювання. Заявник даного винаходу був першим, хто практично реалізував ідею та розробку технології, заснованої на перенацілюванні клостридіального нейротоксину, та одержані у результаті гібридні білки відомі як спрямовані інгібітори секреції (TSI). Заміну TM можна здійснити за допомогою звичайних методик хімічного зв'язування, які добре відомі спеціалісту в даній галузі техніки. У зв'язку з цим слід згадати Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press; та Wong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press. Хімічне зв'язування, проте, часто є неточним. Наприклад, після зв'язування TM може стати приєднаною до іншої частини кон'югата за більш ніж однією ділянкою приєднання. Хімічне зв'язування також складно контролювати. Наприклад, TM може стати зв'язаною з іншою частиною модифікованого токсину за ділянкою приєднання на протеазному компоненті та/або на компоненті, що забезпечує перенесення. Проблема виникає у тому випадку, коли для терапевтичної ефективності є бажаним приєднання тільки до одного із зазначених компонентів (переважно за однією ділянкою). Отже, хімічне зв'язування дає у результаті змішану популяцію молекул модифікованого токсину, що є небажаним. У якості альтернативи хімічному зв'язуванню, заміну TM можна здійснити за допомогою рекомбінантного одержання одноланцюгового поліпептидного гібридного білка. Одержання таких молекул описано у патентному документі WO98/07864. Проте автори даного винаходу встановили, що методика з патентного документа WO98/07864 не є придатною для всіх типів TM. Систему, яка альтернативна системі з патентного документа WO98/07864, описано у патентному документі WO2006/059093. Згідно з патентним документом WO2006/059093 у межах одноланцюгового гібридного білка TM присутня по центру (CP) між компонентом на основі нецитотоксичної протеази та компонентом на основі домену, що забезпечує перенесення. Це приводить у результаті до одноланцюгового гібридного білка, що має наступну структуру: NH2-[протеазний компонент]-[TM]-[компонент, що забезпечує перенесення]-COOH Описані вище гібридні білки активуються обробкою протеазою, яка здійснює розщеплення за ділянкою, розташованою на C-кінці протеазного компонента. Цей спосіб активації приводить у результаті до дволанцюгового білка, який містить протеазний компонент, що є ковалентно приєднаним (за допомогою дисульфідного зв'язку) до компонента гібридного білка, що забезпечує перенесення. У випадку патентного документа WO2006/059093 одержана у результаті дволанцюгова молекула має зв'язану з пептидом TM, яка є зв'язаною через його Скінець з N-кінцем компонента на основі домену, що забезпечує перенесення. Відповідно, у такому випадку N-кінцева частина TM є вільною для взаємодії та зв'язування з потрібним 1 UA 112985 C2 рецептором. Це розміщення є важливим для класу TM, у яких вільний N-кінець або вільна Nкінцева частина є необхідними для зв'язування з рецептором. У якості прикладу в патентному документі WO2006/059093 після протеолітичної активації забезпечено поліпептиди, що мають наступну дволанцюгову конформацію: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 У зазначеній дволанцюговій конформації TM і компоненти, що забезпечують перенесення, присутні у формі одноланцюгового гібридного білка, де С-кінець TM є зв'язаним пептидним зв’язком з N-кінцем компонента, що забезпечує перенесення. Автори даного винаходу виявили, що системи, описані у патентних документах WO98/07864 і WO2006/059093, не є оптимальними для використання всіх типів TM, і, отже, можуть привести у результаті до продукції гібридних білків, що характеризуються небажаною/зниженою зв'язувальною здатністю по відношенню до передбаченої клітини-мішені. Таким чином, існує потреба в альтернативній або поліпшеній системі для конструювання TSI. Даний винахід забезпечує вирішення однієї або декількох із вищезгаданих проблем шляхом забезпечення одноланцюгового поліпептидного гібридного білка, що містить (a) нецитотоксичну протеазу або її фрагмент, причому протеаза або фрагмент протеази здатні розщеплювати білок системи клітини-мішені, що забезпечує злиття з мембраною при екзоцитозі; (b) частину молекули, що забезпечує націлювання, яка здатна зв'язуватися з ділянкою зв'язування на клітині-мішені, причому дана ділянка зв'язування здатна піддаватися ендоцитозу з включенням у ендосому у клітині-мішені; (c) домен, що забезпечує перенесення, який здатний переносити протеазу або фрагмент протеази із внутрішньої частини ендосоми, через мембрану ендосоми та у цитозоль клітинимішені; (d) ділянку для розщеплення першою протеазою, причому за даною ділянкою гібридний білок є розщеплюваним першою протеазою, при цьому ділянка для розщеплення першою протеазою розташована між нецитотоксичною протеазою та доменом, що забезпечує перенесення; (e) ділянку для розщеплення другою протеазою, причому за даною ділянкою гібридний білок є розщеплюваним другою протеазою, при цьому ділянка для розщеплення другою протеазою розташована між доменом, що забезпечує перенесення, та частиною молекули, що забезпечує націлювання; та (f) ковалентний зв'язок між частиною молекули, що забезпечує націлювання, та доменом, що забезпечує перенесення, причому після протеолітичного розщеплення за ділянкою для розщеплення другою протеазою частина молекули, що забезпечує націлювання, залишається зв’язаною з доменом, що забезпечує перенесення, за допомогою зазначеного ковалентного зв'язку. Система, описана у патентному документі WO2006/059093, забезпечує TSI, що мають TM із N-кінцем, який є вільним для взаємодії з ділянкою зв'язування на клітині-мішені. Проте автори даного винаходу виявили, що система, описана у патентному документі WO2006/059093, не є придатною для TM, для яких потрібні як вільний N-кінцевий домен, так і вільний C-кінцевий домен для взаємодії з ділянкою зв'язування на клітині-мішені. Отже, на відміну від патентного документа WO2006/059093, даний винахід передбачає систему для забезпечення TSI, де TM-компонент має як вільний N-кінцевий домен, так і вільний C-кінцевий домен. В одному варіанті здійснення даний винахід передбачає одноланцюговий гібридний білок, що має наступну орієнтацію від N-кінця до С-кінця, де P1 і P2 являють собою ділянки для розщеплення першою та другою протеазою: NH2-[протеазний компонент]-[P1]-[TM]-[P2]-[компонент, що забезпечує перенесення]-COOH Після розщеплення за першою та другою ділянками для розщеплення зазначений одноланцюговий гібридний білок набуває наступної триланцюгової структури, у якій TM і компоненти, що забезпечують перенесення, ковалентно зв'язані між собою, та при цьому: A) протеазний компонент ковалентно зв'язаний із TM-компонентом 2 UA 112985 C2 або B) протеазний компонент ковалентно зв'язаний із компонентом, що забезпечує перенесення 5 10 В іншому варіанті здійснення даний винахід передбачає одноланцюговий гібридний білок, що має наступну орієнтацію від N-кінця до С-кінця, де P1 і P2 являють собою ділянки для розщеплення першою та другою протеазою: NH2-[протеазний компонент]-[P1]-[компонент, що забезпечує перенесення]-[P2]-[TM]-COOH Після розщеплення за першою та другою ділянками для розщеплення зазначений одноланцюговий гібридний білок набуває наступної триланцюгової структури, у якій TM і компоненти, що забезпечують перенесення, ковалентно зв'язані між собою, та при цьому: A) протеазний компонент ковалентно зв'язаний із компонентом, що забезпечує перенесення або B) протеазний компонент ковалентно зв'язаний із TM-компонентом, що забезпечує перенесення 15 20 В іншому варіанті здійснення даний винахід передбачає одноланцюговий гібридний білок, що має наступну орієнтацію від N-кінця до С-кінця, де P1 і P2 являють собою ділянки для розщеплення першою та другою протеазою: NH2-[TM]-[P2]-[протеазний компонент]-[P1]-[компонент, що забезпечує перенесення]-COOH Після розщеплення за першою та другою ділянками для розщеплення зазначений одноланцюговий гібридний білок набуває наступної триланцюгової структури, у якій TM і компоненти, що забезпечують перенесення, ковалентно зв'язані між собою, та при цьому: A) протеазний компонент ковалентно зв'язаний із компонентом, що забезпечує перенесення 25 або B) протеазний компонент ковалентно зв'язаний із TM-компонентом: 30 При застосуванні поліпептидний TSI за даним винаходом зв'язується із клітиною-мішенню, причому зв'язування забезпечується TM. Потім компонент на основі домену, що забезпечує перенесення, здійснює транспорт компонента на основі нецитотоксичної протеази у цитозоль клітини-мішені. Як тільки він потрапив усередину, компонент на основі нецитотоксичної протеази інгібує у клітині-мішені процес злиття з мембраною при екзоцитозі. Отже, за допомогою інактивації системи клітини-мішені, що забезпечує злиття з мембраною при екзоцитозі, поліпептид за даним винаходом інгібує секрецію із неї. Відповідно, поліпептиди TSI 3 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 за даним винаходом можна застосовувати для ослаблення або лікування ряду патофізіологічних станів або симптомів, які пов'язані із клітинною секрецією. Нецитотоксична протеаза Біологічно активним компонентом поліпептидів TSI за даним винаходом є нецитотоксична протеаза. Отже, після доставки у цитозоль клітини-мішені, компонент на основі нецитотоксичної протеази здійснює розщеплення SNARE у потрібній клітині-мішені. Оскільки білки SNARE у клітинах-мішенях ссавців є необхідним компонентом для процесу секреції, їх протеолітична інактивація інгібує/пригнічує секрецію із зазначених клітин-мішеней. Нецитотоксичні протеази являють собою окремий клас молекул, які не вбивають клітини; замість цього вони діють шляхом інгібування клітинних процесів, що відрізняються від синтезу білка. Нецитотоксичні протеази продукуються рядом вищих організмів (наприклад, pослинами та тваринами), прикладом такого вищого організму є бразильський скорпіон. Нецитотоксичні протеази також продукуються багатьма мікроорганізмами, зокрема бактеріями, такими як Clostridium sp. і Neisseria sp. Клостридіальні нейротоксини являють собою важливу групу молекул токсинів, що не відносяться до цитотоксичних, і вони містять два поліпептидні ланцюги, з'єднані між собою дисульфідним зв'язком. Два ланцюги називають важким ланцюгом (H-ланцюг), який має молекулярну масу приблизно 100 кДа, та легким ланцюгом (L-ланцюг), який має молекулярну масу приблизно 50 кДа. L-ланцюг функціонує як протеаза та характеризується високою субстратною специфічністю по відношенню до білків, зв'язаних із везикулами та/або плазматичною мембраною (SNARE), які задіяні у процесі екзоцитозу (наприклад, синаптобревін, синтаксин, SNAP та/або VAMP). Ці субстрати є важливими компонентами секреторного апарату клітини. Представники Neisseria sp., особливо ті, що належать до виду N. gonorrhoeae, продукують функціонально подібні молекули токсинів, що не відносяться до цитотоксичних. Прикладом такої нецитотоксичної протеази є IgA-протеаза (див. патентний документ WO99/58571). Подібні IgA-протеази продукують стрептококи, наприклад Streptococcus pneumoniae. Отже, в одному варіанті здійснення нецитотоксична протеаза за даним винаходом може бути протеазою клостридіального нейротоксину або IgA-протеазою (див., наприклад, патентний документ WO99/032272). Іншим прикладом нецитотоксичних протеаз є протеаза отрути скорпіона, наприклад протеаза з отрути бразильського скорпіона Tityus serrulatus або протеаза antarease (див., наприклад, патентний документ WO2011/022357). Частина молекули, що забезпечує націлювання (TM) TM-компонент за даним винаходом є відповідальним за зв'язування поліпептиду за даним винаходом із ділянкою зв'язування на клітині-мішені. Отже, TM-компонент є лігандом, за допомогою якого поліпептид за даним винаходом зв'язується з вибраною клітиною-мішенню. У контексті даного винаходу клітина-мішень може являти собою будь-яку клітину ссавця (переважно людини). Таким чином, TM може зв'язуватися із клітиною, що не відноситься до нервової, та/або з нервовою клітиною. TM-компонент поліпептидів за даним винаходом має як вільну N-кінцеву частину, так і вільну C-кінцеву частину. Отже, в одному варіанті здійснення TM здатна взаємодіяти з ділянкою зв'язування (наприклад, рецептор або акцептор) на клітині-мішені шляхом взаємодії між Nкінцевою ділянкою частини молекули, що забезпечує націлювання, та доменом ділянки зв'язування. В іншому варіанті здійснення TM здатна здійснювати взаємодію між C-кінцевою ділянкою частини молекули, що забезпечує націлювання, та доменом ділянки зв'язування. В іншому варіанті здійснення TM здатна до подвійної взаємодії, причому N-кінцева ділянка частини молекули, що забезпечує націлювання, взаємодіє з доменом ділянки зв'язування, та Cкінцева ділянка частини молекули, що забезпечує націлювання, взаємодіє з доменом ділянки зв'язування. У даному варіанті здійснення, що наведений останнім, N- та C-кінцеві ділянки TM можуть зв'язуватися з одним і тим же або з різними доменами ділянки зв'язування та/або можуть зв'язуватися з доменами на різних ділянках зв'язування. Придатні TM для використання у поліпептидах за даним винаходом включають цитокіни, фактори росту, нейропептиди, лектини й антитіла, причому цей вираз включає моноклональні антитіла, каркасні структури, що зв'язують білки, фрагменти антитіл, такі як Fab, F(ab)’2, Fv, ScFv, та одноланцюгові антитіла, як наприклад, із верблюдових і т.ін. В одному варіанті здійснення TM-компонент містить або складається з пептидного ліганду (наприклад, пептидного гормона), який зв'язується з рецептором, присутнім на клітині-мішені. В одному варіанті здійснення пептидний ліганд має амінокислотну послідовність з 5-200 послідовних амінокислотних залишків. У якості прикладу зазначений пептидний ліганд 4 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 складається з або містить амінокислотну послідовність з 5-150, або 5-100, або 5-50, або 5-40, або 5-30, або 5-25, або 5-20, або 7-12, або приблизно 10 послідовних амінокислотних залишків. TM-компонент містить N-кінцеву частину та C-кінцеву ділянку. Кожна із зазначених ділянок звичайно містить щонайменше 5, щонайменше 10, щонайменше 15, щонайменше 20 або щонайменше 25 послідовних амінокислотних залишків. В одному варіанті здійснення TM містить або складається з пептидного ліганду (або його аналога), який зв'язується з рецептором, вибраним із MRGPRX1 (наприклад, рецептор пептиду з мозкової речовини бичачої надниркової залози (BAM)), рецептора опіоїдного пептиду, OPRM 1 або OPRD1 (наприклад, рецептор бета-ендорфінового пептиду), BDKRB1 або BDKRB2 (наприклад, рецептор брадикінінового пептиду), OPRM1 або OPRD1 (наприклад, рецептор метабо лей-енкефалінового пептиду), OPRK1 (наприклад, рецептор динорфінового пептиду), GALR1, GALR2 або GALR3 (наприклад, рецептор галанінового пептиду), OPRL1 (наприклад, рецептор ноцицептинового пептиду) і TACR1, TACR2 або TACR3 (наприклад, рецептор пептиду речовини P). В одному варіанті здійснення TM містить або складається пептидного ліганду (або його аналога), вибраного з пептиду з мозкової речовини бичачої надниркової залози (BAM), опіоїдного пептиду, бета-ендорфінового пептиду, брадикінінового пептиду, мет- або лейенкефалінового пептиду, динорфінового пептиду, галанінового пептиду, ноцицептинового пептиду та пептиду речовини P. В одному варіанті здійснення TM містить або складається з пептиду гонадотропін-рилізинггормона (GnRH). GnRH являє собою пептидний гормон, що складається з 10 амінокислот. Nкінцеві амінокислоти GnRH відіграють роль у активації рецептора, у той час як C-кінцеві амінокислоти необхідні для високої спорідненості зв'язування з рецептором GnRH (див. Flanagan, Millar & Illing (1997) Reviews of Reroduction, 2, 113-120, яку включено у даний документ у всій її повноті за допомогою посилання на неї). Функція GnRH in vivo полягає у дії на рецептори GnRH, що знаходяться у передній частині гіпофіза, та стимуляції синтезу та вивільнення гонадотропінів, таких як лютеїнізуючий гормон (LH) та фолікулостимулюючий гормон (FSH). Посилання на пептид GnRH охоплює всі його функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. У якості прикладу вираз пептид GnRH охоплює пептид GnRH, у який було вставлено амінокислоту цистеїн (фланкована двома ахіральними амінокислотними залишками, такими як гліцин та/або аланін) у якості замінної амінокислоти у положенні 6 пептиду GnRH. GnRH також є відомим як рилізинг-гормон лютеїнізуючого гормона (LHRH). Додаткові приклади включають пептиди GnRHI, пептиди GnRHII та пептиди GnRHIII, а також поліпептид повної довжини попередника GnRH, що складається з 92 амінокислот, і його усічені форми. В одному варіанті здійснення TM містить або складається з пептиду кортикотропін-рилізингфактора (CRF). CRF являє собою гіпоталамічний пептидний гормон, що складається з 41 амінокислоти, який взаємодіє із CRF1 і CRF2 рецепторами. Основна функція CRF in vivo полягає у стимуляції вивільнення ACTH із кортикотрофів у передній долі гіпофіза. Посилання на пептид CRF охоплює CRF повної довжини, урокортин 1 і урокортин 2, а також всі їх функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. В одному варіанті здійснення TM містить або складається з гастрин-рилізинг пептиду (GRP). GRP являє собою пептидний гормон, що складається з 27 амінокислот. GRP регулює численні функції шлунково-кишкового тракту та центральної нервової системи, у тому числі вивільнення гормонів шлунково-кишкового тракту, скорочення клітин гладкої мускулатури та проліферацію епітеліальних клітин, та є сильним мітогеном для пухлинних тканин. Посилання на пептид GRP охоплює всі його функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. В одному варіанті здійснення TM містить або складається з нейромедину B нього. Нейромедин B являє собою пептидний гормон, що складається з 10 амінокислот. Функція нейромедину B полягає у дії на BB1 рецептори in vivo, і він є сильним мітогеном і фактором росту для нормальної та пухлинної тканини легень і епітеліальної тканини шлунково-кишкового тракту. Посилання на нейромедин B охоплює усі його функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. Посилання на нейромедин B охоплює гомологічний пептид людини, бомбезин, і включає бомбезин повної довжини, пептид, що складається з 14 амінокислот, що спочатку був виділений зі шкіри жаби, а також його усічені форми та пептидні аналоги. В одному варіанті здійснення TM містить або складається з гастрину або холецистокініну (CCK). Гастрин являє собою пептидний гормон, що складається з 17 амінокислот, CCK являє собою пептидний гормон, що складається з 8 амінокислот. Як гастрин, так і холецистокінін діють на CCK1 і CCK2 рецептори in vivo у першу чергу у шлунково-кишковому тракті та ЦНС із модулюванням секреції ферментів підшлункової залози та скорочення гладкої мускулатури 5 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 жовчного міхура та шлунка, активності щодо тривоги, знеболення, збудження та нейролептичної активності. Посилання на пептиди гастрин і холецистокінін охоплює всі їх функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. В одному варіанті здійснення TM містить або складається з пептиду соматостатину (SST). Приклади придатних TM на основі пептиду SST включають SST повної довжини та кортистатин (CST), а також їх усічені форми та пептидні аналоги, такі як BIM 23052, BIM 23056 або BIM23268; октреотидні пептиди, ланреотидні пептиди, BIM23027, CYN154806, BIM23027, вапреотидні пептиди, сеглітидні пептиди та SOM230. Дані TM зв'язуються з sst рецепторами, наприклад, sst1, sst2, sst3, sst4 та sst5 рецепторами. SST і CST характеризуються високою структурною гомологією та зв'язуються з усіма відомими sst рецепторами. Посилання на пептиди SST або CST охоплює всі їх функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. В одному варіанті здійснення TM містить або складається з пептиду рилізинг-гормона гормона росту (GHRH). GHRH також є відомим як рилізинг-фактор гормона росту (GRF або GHRF) або соматокринін. Придатні пептиди GHRH включають пептид GHRH повної довжини (144) та його усічені форми, такі як GHRH (1-27, 1-28, 1-29), GHRH (1-37) і GHRH (1-40, 1-43)-OH, а також пептидні аналоги, такі як BIM 28011 або NC-9-96. Посилання на пептид GHRH охоплює всі його функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. В одному варіанті здійснення TM містить або складається з пептиду рецептора, який активується протеїназою (PAR), наприклад PAR1. Пептиди PAR являють собою унікальний підтип рецепторів, зв'язаних із G-білком, що складаються з 7 трансмембранних рецепторних доменів, які характеризуються тим, що вони протеолітично модифіковані так, що мають новий позаклітинний N-кінець, який діє як зв'язаного ліганд, що активує. Було виявлено агоністи PAR1 (наприклад, TFLLR), які активують їх когнатний рецептор. Посилання на пептид PAR охоплює всі його функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. В одному варіанті здійснення TM містить або складається з паратиреоїдного гормона (PTH). PTH являє собою пептид, який вивільняється паращитоподібною залозою та зв'язується з рецептором PTH-1. Цей рецептор характеризується широкою поширеністю, але є особливо поширеним у тканинах-мішенях для PTH, переважно у нирковій та у кістковій. Посилання на пептид PTH охоплює всі його функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. В одному варіанті здійснення TM містить або складається з пептиду, що зв'язується із клітиною, яка секретує слиз, або з нервовою клітиною, яка регулює або контролює секрецію слизу. Наприклад, TM зв'язується із (a) клітинами, які секретують муцини, як наприклад, бокалоподібні клітини епітелію та клітини підслизової залози, які секретують слиз, (b) клітинами, які секретують водні компоненти слизу, наприклад, клітини Клара та серозні клітини, та/або (c) клітинами, які регулюють або контролюють секрецію слизу, наприклад, "сенсорні-еферентні" Cволокна або волокна NANC нервової системи. Варто особливо згадати наступні пептидні TM: VIP; агоніст бета2-адренорецептора; гастрин-рилізинг пептид і пептид, пов'язаний з геном кальцитоніну. Посилання на ці пептидні TM охоплює всі їх функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. Отже, TSI згідно з даним варіантом здійснення мають терапевтичне застосування при лікуванні гіперсекреції слизу, астми та/або хронічного обструктивного захворювання легень. В іншому варіанті здійснення TM містить або складається з пептиду, що зв'язується з ендокринною клітиною. У даному документі варто особливо згадати GHRH; тиреотропний гормон (TSH); інсулін, інсуліноподібний фактор росту; TSH-рилізинг-гормон (протирелін); FSH/LH-рилізинггормон (гонадорелін); кортикотропін-рилізинг-гормон (CRH) і ACTH. Посилання на ці пептидні TM охоплює всі їх функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. Отже, TSI згідно з даним варіантом здійснення мають терапевтичне застосування при лікуванні ендокринних неоплазій, у тому числі MEN (множинна ендокринна неоплазія); тиреотоксикозу й інших захворювань, які пов'язані з гіперсекрецією з щитоподібної залози; акромегалії, гіперпролактинемії, хвороби Кушинга й інших захворювань, які пов'язані з гіперсекрецією з передньої частини гіпофіза; гіперандрогенізму, хронічної ановуляції й інших захворювань, асоційованих із синдромом полікістозних яєчників. В іншому варіанті здійснення TM містить або складається з пептиду, що зв'язується із клітинами, що задіяні у запальній реакції. У даному документі варто особливо згадати пептидні TM (i) для тучних клітин, наприклад, C4-домен Fc IgE; (ii) для еозинофілів, наприклад, ліганди рецептора комплементу C3a/C4a-R, антигени, здатні взаємодіяти з рецептором комплементу CR4; (iii) для макрофагів і моноцитів, наприклад, фактор, який стимулює макрофаги, (iv) для нейтрофілів, наприклад, антиген, асоційований з рецептором iC3b комплементу, або IL8. Посилання на ці пептидні TM охоплює всі їх функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. Отже, TSI згідно з даним варіантом здійснення мають терапевтичне застосування для 6 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лікування алергій (сезонні алергічні риніти (поліноз), алергічні кон'юнктивіти, вазомоторні риніти та харчова алергія), еозинофілії, астми, ревматоїдного артриту, системного червоного вовчака, дискоїдного червоного вовчака, виразкового коліту, хвороби Крона, геморою, свербежу, гломерулонефриту, гепатиту, панкреатиту, гастриту, васкуліту, міокардиту, псоріазу, екземи, хронічного радіаційно-індукованого фіброзу, рубцювання легень та інших фіброзних розладів. В іншому варіанті здійснення TM містить або складається пептиду, що зв'язується з екзокринною клітиною. У даному документі варто особливо згадати гіпофізарний пептид, який активує аденілатциклазу (PACAP-38). Посилання на ці пептидні TM охоплює всі їх функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. Отже, TSI згідно з даним варіантом здійснення мають терапевтичне застосування для лікування гіперсекреції слизу з клітин, які секретують слиз, що знаходяться у травному тракті, зокрема знаходяться у кишечнику. У додатковому варіанті здійснення TM містить або складається з пептиду, що зв'язується з імунною клітиною. У даному документі слід згадати ліганди, такі як фрагмент/поверхневий елемент вірусу Епштейна-Барр. Посилання на ці пептидні TM охоплює всі їх функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. Таким чином TSI згідно з даним варіантом здійснення мають терапевтичне застосування для лікування важкої міастенії, ревматоїдного артриту, системного червоного вовчака, дискоїдного червоного вовчака, при трансплантації органів, при трансплантації тканин, при трансплантації біологічної рідини, лікування хвороби Грейвса, тиреотоксикозу, аутоімунного діабету, гемолітичної анемії, тромбоцитопенічної пурпури, нейтропенії, хронічного аутоімунного гепатиту, аутоімунного гастриту, злоякісної анемії, тиреоїдиту Хашимото, хвороби Аддісона, синдрому Шегрена, первинного біліарного цирозу, поліміозиту, склеродермії, системного склерозу, звичайної пухирчатки, бульозного пемфігоїду, міокардиту, ревматичного кардиту, гломерулонефриту (типу Гудпасчера), увеїту, орхіту, виразкового коліту, васкуліту, атрофічного гастриту, злоякісної анемії, цукрового діабету 1 типу. У додатковому варіанті здійснення TM містить або складається з пептиду, що зв'язується із клітиною серцево-судинної системи. У даному документі слід згадати тромбін і TRAP (пептид агоніста тромбінового рецептора) та ліганди, які зв'язуються з ендотеліальними клітинами серцевосудинної системи, як наприклад, антитіла, які розпізнають поверхневий антиген GP1b. Посилання на ці пептидні TM охоплює всі їх функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. Отже, TSI згідно з даним варіантом здійснення мають терапевтичне застосування для лікування станів серцево-судинної системи та/або гіпертензії. У додатковому варіанті здійснення TM містить або складається з пептиду, що зв'язується із клітиною кісткової тканини. У даному документі слід згадати ліганди, які зв'язуються з остеобластами, для лікування захворювань, вибраних із остеопетрозу й остеопорозу, у тому числі кальцитонін, і ліганди, які зв'язуються з остеокластами, у тому числі фактори диференціювання остеокластів (наприклад, TRANCE, або RANKL, або OPGL). Посилання на ці пептидні TM охоплює всі їх функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. Отже, TSI згідно з даним варіантом здійснення мають терапевтичне застосування для лікування станів кісток. Лінійні та циклічні послідовності, що зв'язують інтегрини, являють собою додаткову групу пептидних TM за даним винаходом. Багато інтегринів розпізнають пептидну послідовність із трьох амінокислот Arg-Gly-Asp (RGD) (Ruoslahti, 1996). Мотив RGD виявили у понад 100 білках, у тому числі у фібронектині, тенасцині, фібриногені та вітронектині. Багато патогенів, у тому числі вірус Коксакі (Roivaninen et al., 1991) та аденовірус (Mathias et al., 1994), використовують взаємодію RGD-інтегрин у якості консервативного механізму для проникнення в клітину. Було показано, що лінійні та циклічні пептидні послідовності, PLAEIDGIEL і CPLAEIDGIELC, відповідно, зв'язуються з ДНК і забезпечують її інтерналізацію у клітини, які експресують інтегрин 91 (Schneider et al., 1999). Посилання на ці пептидні TM охоплює всі їх функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. Інші TM за даним винаходом включають ті, які було відкрито за допомогою методик фагового дисплею, зокрема ті, які націлюються на епітеліальні клітини дихальних шляхів та інтерналізуються ними. Вони включають лінійні та циклічні пептиди THALWHT (Jost et al., 2001); LEBP-1 (QPFMQCLCLIYDASC), LEBP-2 (RNVPPIFNDVYWIAF) і LEBP-3 (VFRVRPWYQSTSQS) (Wu et al., 2003); CDSAFVTVDWGRSMSLC (Florea et al., 2003); SERSMNF, YGLPHKF, PSGAARA, LPHKSMP, LQHKSMP (Writer et al., 2004); FSLSKPP, HSMQLST і STQAMFQ (Rahim et al., 2003). Посилання на ці пептидні TM охоплює всі їх функціональні зв'язувальні фрагменти, варіанти й аналоги. В одному варіанті здійснення TM містить або складається з першої та другої ділянок (наприклад, доменів). У одному варіанті здійснення перша та друга ділянки частини молекули, що забезпечує націлювання, можуть походити з одного й того ж ліганду (наприклад, будь-якого з вищезазначених TM-лігандів). Перша та друга ділянки можуть зв'язуватися з однією й тією ж 7 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 або з різними ділянками на одному й тому ж рецепторі. В альтернативному випадку перша та друга ділянки можуть зв'язуватися з ділянками на різних рецепторах. Перша та друга ділянки частини молекули, що забезпечує націлювання, можуть походити з різних лігандів (наприклад, будь-яких із вищезазначених TM-лігандів), які можуть зв'язуватися з одним і тим же або з різними рецепторами. Відповідно, TM може являти собою гібрид із двох TM. Перша та друга ділянки можуть зв'язуватися з однією й тією ж або різними ділянками на одному й тому ж рецепторі. В альтернативному випадку перша та друга ділянки можуть зв'язуватися з ділянками на різних рецепторах. TM можуть додатково містити третю та/або наступні частини з додаткових TM (наприклад, будь-які з вищезазначених TM-лігандів). В одному варіанті здійснення перша частина (наприклад, домен) містить або складається з ліганду, який зв'язується за допомогою вільної N-кінцевої ділянки (наприклад, вільний N-кінець) із його рецептором-мішенню. Прикладом такого ліганду є ліганд, який зв'язується з опіоїдним рецептором (наприклад, ліганд, який зв'язується з рецептором ORL1, як наприклад, опіоїдний пептид). Додаткові приклади опіоїдних пептидів включають ноцицептин, динорфін, бетаендорфін та енкефалін. Інші TM-ліганди на основі пептидів, що не відносяться до опіоїдних, включають пептиди BAM, галанін, речовину P, GnRH, CRF, GRP, нейромедин B, бомбезин, гастрин, CCK, SST, CST і GHRH (а також їх усічені форми, варіанти й аналоги). В іншому (або тому ж) варіанті здійснення друга ділянка (наприклад, домен) містить або складається з ліганду, який зв'язується за допомогою вільної C-кінцевої ділянки (наприклад, вільний C-кінець) із його рецептором-мішенню. Прикладом такого ліганду є ліганд, який зв'язується із брадикініновим рецептором (наприклад, брадикініновий пептид) або з рецептором речовини P (наприклад, пептид речовини P). Інші пептидні TM-ліганди включають пептиди BAM, галанін, речовину P, GnRH, CRF, GRP, нейромедин B, бомбезин, гастрин, CCK, SST, CST і GHRH (а також їх усічені форми, варіанти й аналоги). У якості прикладу гібридна TM включає першу ділянку, яка містить або складається з ноцицептинового пептиду, та другу ділянку, яка містить або складається з брадикінінового пептиду (або пептиду речовини P). У додаткових прикладах перша ділянка містить або складається з ноцицептинового пептиду, та друга ділянка містить або складається з пептиду, вибраного з пептиду BAM, опіоїдного пептиду, бета-ендорфінового пептиду, брадикінінового пептиду, енкефалінового пептиду, динорфінового пептиду, галанінового пептиду та пептиду речовини P. У іншому прикладі гібридна TM включає першу ділянку, яка містить або складається з динорфінового пептиду, та другу ділянку, яка містить або складається з брадикінінового пептиду (або пептиду речовини P). У додаткових прикладах перша ділянка містить або складається з динорфінового пептиду, та друга ділянка містить або складається з пептиду, вибраного з пептиду BAM, опіоїдного пептиду, бета-ендорфінового пептиду, брадикінінового пептиду, енкефалінового пептиду, ноцицептинового пептиду, галанінового пептиду та пептиду речовини P. У іншому прикладі гібридна TM включає першу ділянку, яка містить або складається з галанінового пептиду, та другу ділянку, яка містить або складається з брадикінінового пептиду (або пептиду речовини P). У додаткових прикладах перша ділянка містить або складається з галанінового пептиду, та друга ділянка містить або складається з пептиду, вибраного з пептиду BAM, опіоїдного пептиду, бета-ендорфінового пептиду, брадикінінового пептиду, енкефалінового пептиду, ноцицептинового пептиду, динорфінового пептиду та пептиду речовини P. У іншому прикладі гібридна TM включає першу ділянку, яка містить або складається з пептиду BAM, та другу ділянку, яка містить або складається з брадикінінового пептиду (або пептиду речовини P). У додаткових прикладах перша ділянка містить або складається з пептиду BAM, та друга ділянка містить або складається з пептиду, вибраного з опіоїдного пептиду, бетаендорфінового пептиду, брадикінінового пептиду, енкефалінового пептиду, ноцицептинового пептиду, динорфінового пептиду, галанінового пептиду та пептиду речовини P. У іншому прикладі гібридна TM включає першу ділянку, яка містить або складається з бетаендорфінового пептиду, та другу ділянку, яка містить або складається з брадикінінового пептиду (або пептиду речовини P). У додаткових прикладах перша ділянка містить або складається з бета-ендорфінового пептиду, та друга ділянка містить або складається з пептиду, вибраного з опіоїдного пептиду, пептиду BAM, брадикінінового пептиду, енкефалінового пептиду, ноцицептинового пептиду, динорфінового пептиду, галанінового пептиду та пептиду речовини P. 8 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У іншому прикладі гібридна TM включає першу ділянку, яка містить або складається з енкефалінового (наприклад, лей- або мет-енкефалінового) пептиду, та другу ділянку, яка містить або складається з брадикінінового пептиду (або пептиду речовини P). У додаткових прикладах перша ділянка містить або складається з енкефалінового пептиду, та друга ділянка містить або складається з пептиду, вибраного з опіоїдного пептиду, бета-ендорфінового пептиду, брадикінінового пептиду, пептиду BAM, ноцицептинового пептиду, динорфінового пептиду, галанінового пептиду та пептиду речовини P. В одному варіанті здійснення TM містить або складається з першої та другої ділянок (наприклад, доменів), які є ідентичними (або подібними) та у поєднанні забезпечують ефективну взаємодію з рецептором на клітині-мішені. Також може бути включено додаткові (наприклад, третю та необов'язково додаткові і т.ін.) ідентичні/подібні ділянки. Отже, у даному варіанті здійснення поліпептиди за даним винаходом містять повторювану структуру (наприклад, TMTM; TM-TM-TM і т.ін.) з однієї й тієї ж (або подібної) TM. Приклади таких повторюваних структур TM (наприклад, TM-TM; TM-TM-TM і т.ін.) представлені TM, вибраною з опіоїдного пептиду, бета-ендорфінового пептиду, брадикінінового пептиду, пептиду BAM, ноцицептинового пептиду, динорфінового пептиду, галанінового пептиду, енкефалінового пептиду, пептиду речовини P, пептиду GnRH, пептиду CRF, пептиду GRP, пептиду нейромедину B, бомбезинового пептиду, гастринового пептиду, пептиду CCK, пептиду SST, пептиду CST і пептиду GHRH (а також їх усічених форм, варіантів та аналогів). В одному варіанті здійснення перша та друга (та/або наступні) ділянки TM розділені спейсерною послідовністю, наприклад, пептидною послідовністю. В одному варіанті здійснення перша та друга (та/або наступні) частини можуть бути розділені послідовністю з не більше 40, або не більше 35, або не більше 30, або не більше 25, або не більше 20, або не більше 15, або не більше 10, не більше 5 амінокислотних залишків. В одному варіанті здійснення перша та друга (та/або наступні) частини можуть бути розділені послідовністю з 4, 3, 2, 1 або не розділені жодним амінокислотним залишком. Гібридні білки за даним винаходом, як правило, демонструють знижену спорідненість зв'язування (приблизно до 100 разів) по відношенню до клітин-мішеней порівняно з відповідною “вільною” TM (тобто виділеною TM per se). Однак, незважаючи на це спостереження, гібридні білки за даним винаходом демонструють хорошу ефективність. Це можна пояснити двома основними властивостями. По-перше, компонент на основі нецитотоксичної протеази є каталітичним, отже, терапевтичний ефект невеликої кількості таких молекул швидко посилюється у клітині-мішені. По-друге, рецептори, присутні на клітинах-мішенях потрібні тільки для того, щоб виступати в якості входу для проникнення терапевтичного засобу, та немає потреби у їх стимуляції до рівня, необхідного для досягнення фармакологічної реакції, опосередкованої взаємодією ліганду з рецептором. Відповідно, гібридні білки за даним винаходом можна вводити у дозі, яка є нижчою за ту, яку використовували б для інших типів терапевтичних молекул, які звичайно вводять у великих кількостях від мікрограмів до міліграмів (навіть до сотень міліграмів). На відміну від цього гібридні білки за даним винаходом можна вводити у набагато нижчих дозах, типово щонайменше у 10 разів нижчих і більш типово у 100 разів нижчих. Домен, що забезпечує перенесення Компонент, що забезпечує перенесення, за даним винаходом забезпечує перенесення нецитотоксичної протеази (або її фрагмента) у клітину-мішень, таким чином функціональний прояв протеазної активності має місце у цитозолі клітини-мішені. Компонент, що забезпечує перенесення, переважно здатний утворювати проникні для іонів пори у ліпідних мембранах (наприклад, ендосомальних мембранах) в умовах низького pH. Компонент, що забезпечує перенесення, можна одержати з мікробного джерела білка, наприклад, бактеріального або вірусного джерела білка. Таким чином, у одному варіанті здійснення компонент, що забезпечує перенесення, містить або складається з домену, що забезпечує перенесення ферменту, як наприклад, бактеріальний токсин. В іншому варіанті здійснення домен, що забезпечує перенесення, містить або складається з домену, що забезпечує перенесення вірусного білка. В одному варіанті здійснення компонент, що забезпечує перенесення, за даним винаходом може містити або складатися з H-ланцюга клостридіального нейротоксину або його фрагмента, такого як HN-домен клостридіального нейротоксину (або його фрагмент,що забезпечує перенесення). Ділянки для розщеплення першою та другою протеазою Поліпептиди за даним винаходом містять ділянку для розщеплення першою протеазою. Ділянка для розщеплення першою протеазою забезпечує розщеплення (наприклад, регульоване розщеплення) гібридного білка за положенням між компонентом на основі нецитотоксичної протеази та іншою частиною гібридного білка. Цей процес розщеплення 9 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 служить для “активації” одноланцюгової структури (нецитотоксична протеаза-домен, що забезпечує перенесення) та приводить у результаті до утворення “активованої” дволанцюгової структури, у якій компонент на основі нецитотоксичної протеази є ковалентно зв'язаним (наприклад, зв'язаний дисульфідним зв'язком) з іншою частиною гібридного білка. Поліпептиди за даним винаходом також містять ділянку для розщеплення другою протеазою. Ділянка для розщеплення другою протеазою забезпечує розщеплення (наприклад, регульоване розщеплення) гібридного білка за положенням між компонентом на основі частини молекули, що забезпечує націлювання, та компонентом на основі домену, що забезпечує перенесення. Цей процес розщеплення служить для розділення одноланцюгової структури (TMдомен, що забезпечує перенесення) та приводить у результаті до утворення розділеної дволанцюгової структури, у якій TM-компонент є ковалентно зв'язаним (наприклад, зв'язаний дисульфідним зв'язком) з компонентом, що забезпечує перенесення гібридного білка. При цьому структурне оточення TM-компонента змінюється так, що він набуває конформації, у якій як N-кінцева, так і C-кінцева ділянки (наприклад, домени) більше не зв'язані з пептидом з іншої частини гібридного білка та, отже, кожна з них може вільно взаємодіяти (наприклад, зв'язуватися) з різними зв'язувальними доменами на одному (або декількох) рецепторах. Отже, протеолітичне розщеплення за ділянками для розщеплення або першою, або другою протеазою перетворює одноланцюговий поліпептидний гібридний білок на дволанцюговий поліпептид. У випадку реакції розщеплення за ділянкою для розщеплення першою протеазою компонент на основі нецитотоксичної протеази залишається зв'язаним ковалентним зв'язком (наприклад, дисульфідним зв'язком) із компонентом на основі домену, що забезпечує перенесення, та/або з TM-компонентом. Зазначений ковалентний зв'язок може бути опосередкованим, наприклад, однією (або декількома) спейсерними або лінкерними молекулами, які самі зв'язані з компонентом на основі нецитотоксичної протеази, TMкомпонентом та/або компонентом, що забезпечує перенесення. Аналогічно, у випадку реакції розщеплення за ділянкою для розщеплення другою протеазою компонент на основі домену, що забезпечує перенесення, залишається зв'язаним із TM-компонентом за допомогою ковалентного зв'язку (наприклад, дисульфідного зв'язку). Зазначений ковалентний зв'язок може бути опосередкованим, наприклад, однією (або декількома) спейсерними або лінкерними молекулами, які самі по собі зв'язані з компонентом, що забезпечує перенесення, та/або TM. У випадку коли реакції розщеплення відбуваються за ділянками для розщеплення як першою, так і другою протеазами, гібридний білок на основі одноланцюгового поліпептиду перетворюється на триланцюговий поліпептид. Можна вводити ділянки для розщеплення першою та другою протеазою (та/або видаляти будь-які присутні спочатку послідовності для розщеплення) на рівні ДНК за допомогою звичайних способів, наприклад, за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу. Скринінг для підтвердження присутності послідовностей для розщеплення можна здійснювати вручну або за допомогою комп'ютерного програмного забезпечення (наприклад, програма MapDraw від DNASTAR, Inc.). Хоча у якості ділянки для розщеплення першою протеазою та/або у якості ділянки для розщеплення другою протеазою у поліпептидах за даним винаходом можна використовувати будь-яку ділянку для розщеплення протеазою, наступні є переважними. Ентерокіназа (DDDDK↓) Фактор Xa (IEGR↓ / IDGR↓) TEV(вірус гравірування тютюну) (ENLYFQ↓G) Тромбін (LVPR↓GS) PreScission (LEVLFQ↓GP) Додаткові необмежувальні приклади включають ділянку для розщеплення рослинним папаїном і ділянку для розщеплення папаїном комах, ділянку для розщеплення папаїном ракоподібних, ділянку для розщеплення протеазою 3C риновірусу людини, ділянку для розщеплення протеазою 3C ентеровірусу людини, ділянку для розщеплення протеазою вірусу гравірування тютюну (TEV), ділянку для розщеплення протеазою вірусу крапчастості жилок тютюну (TVMV), ділянку для розщеплення субтилізином, ділянку для гідроксиламіном або ділянку для розщеплення каспазою 3. Вираз ділянка для розщеплення протеазою також охоплює інтеїн, що являє собою послідовність, здатну до саморозщеплення. Реакцію самосплайсингу можна регулювати, наприклад, за допомогою зміни концентрації присутнього відновника. Вираз ділянка для розщеплення протеазою також охоплює послідовність для розщеплення, на яку діє нецитотоксична протеаза (наприклад, клостридіальний нейротоксин). Прикладом такої ділянки для розщеплення є послідовність ділянки для розщеплення білка SNARE, при цьому приклади 10 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 нативних послідовностей, що розпізнаються ділянки для розщеплення рядом нецитотоксичних протеаз, забезпечені наприкінці розділу даного винаходу. Перша та друга ділянки для розщеплення можуть бути однаковими або різними. Першу та другу ділянки для розщеплення може розщеплюватись (тільки) однією й тією ж або (тільки) різними протеазами. У якості окремого аспекту даного винаходу вищезгадані ділянки для розщеплення/протеазу, що здійснює розщеплення, можна використовувати окремо у якості ділянки для “деструктивного” розщеплення/протеази (обговорюється нижче) у випадку, якщо вони включені у поліпептид за даним винаходом. В одному варіанті здійснення у одноланцюговому поліпептиді компонент на основі нецитотоксичної протеази та компонент на основі домену, що забезпечує перенесення, зв'язані між собою за допомогою дисульфідного зв'язку. Таким чином, після розщеплення ділянки для розщеплення першою протеазою поліпептид набуває дволанцюгової конформації, де протеаза та компоненти, що забезпечують перенесення, залишаються зв'язаними між собою дисульфідним зв'язком. Цю реакцію розщеплення, як правило, називають етапом “активації”, оскільки вона дає у результаті компонент на основі нецитотоксичної протеази, що має підвищену (наприклад, оптимальну) протеазну активність. В одному варіанті здійснення компонент на основі нецитотоксичної протеази утворює ковалентний зв'язок із компонентом гібридного білка на основі домену, що забезпечує перенесення. Наприклад, в одному варіанті здійснення амінокислотний залишок протеазного компонента, який утворює ковалентний зв'язок, знаходиться у межах останніх 20, переважно у межах останніх 10 C-кінцевих амінокислотних залишків протеазного компонента. Аналогічно, в одному варіанті здійснення амінокислотний залишок у межах компонента, що забезпечує перенесення, який утворює другу частину ковалентного зв'язку, може знаходитися у межах перших 20, переважно у межах перших 10 N-кінцевих амінокислотних залишків компонента, що забезпечує перенесення. Описані вище розташування ковалентного зв'язку мають перевагу, яка полягає у тому, що протеаза та компоненти, що забезпечують перенесення, розташовані так само, як у нативній нецитотоксичній протеазі (наприклад, нативний клостридіальний нейротоксин). Для порівняння, у випадку первинної амінокислотної послідовності для нативного клостридіального нейротоксину, відповідні цистеїнові амінокислотні залишки розміщені на відстані від 8 до 27 амінокислотних залишків, що взято з Popoff, MR & Marvaud, J-C, 1999, Structural & genomic features of clostridial neurotoxins, Chapter 9, у The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins. Ed. Alouf & Freer. 35 Серотип BoNT/A1 BoNT/A2 BoNT/B BoNT/C BoNT/D BoNT/E BoNT/F BoNT/G TeNT 1 Послідовність CVRGIITSKTKS----LDKGYNKALNDLC CVRGIIPFKTKS----LDEGYNKALNDLC CKSVKAPG-------------------IC CHKAIDGRS----------LYNKTLDC CLRLTK---------------NSRDDSTC CKN-IVSVK----------GIRK---SIC CKS-VIPRK----------GTKAPP-RLC CKPVMYKNT----------GKSE----QC CKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELC 1 40 45 “Нативна” довжина від C до C 23 23 8 15 12 13 15 13 27 Інформація стосується тільки протеолітичних штамів. В одному варіанті здійснення компонент на основі нецитотоксичної протеази та компонент на основі ділянки для розщеплення першою протеазою одноланцюгового гібридного білка за даним винаходом розділені не більш ніж 30, 25, 20, 15 або 10 амінокислотними залишками. В одному варіанті здійснення зазначені два компоненти у одноланцюговому гібридному білку розділені не більш ніж 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотним залишком. В іншому варіанті здійснення зазначені два компоненти у одноланцюговому гібридному білку не розділені жодним амінокислотним залишком. Таким чином, в одному варіанті здійснення нецитотоксичну протеазу та ділянку для розщеплення першою протеазою можна розділити за допомогою першої спейсерної послідовності, причому зазначена спейсерна послідовність розташована ближче до N-кінця порівняно з ділянкою для розщеплення першою протеазою та ближче до C-кінця порівняно з компонентом на основі нецитотоксичної протеази. В одному варіанті здійснення перша 11 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 спейсерна послідовність може містити частину або всю ділянку для розщеплення першою протеазою або може являти собою частину компонента на основі нецитотоксичної протеази. В одному варіанті здійснення компонент на основі домену, що забезпечує перенесення (або TM), і компонент на основі ділянки розщеплення для першої протеази одноланцюгового гібридного білка розділені не більш ніж 30, 25, 20, 15 або 10 амінокислотними залишками. В одному варіанті здійснення зазначені два компоненти у одноланцюговому гібридному білку розділені не більш ніж 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотним залишком. В іншому варіанті здійснення зазначені два компоненти у одноланцюговому гібридному білку не розділені жодним амінокислотним залишком. Таким чином, в одному варіанті здійснення домен, що забезпечує перенесення (або TM), і ділянка для розщеплення першою протеазою можуть бути розділені другою спейсерною послідовністю, причому зазначена друга спейсерна послідовність розташована ближче до Cкінця порівняно з ділянкою для розщеплення першою протеазою та ближче до N-кінця порівняно з компонентом на основі домену, що забезпечує перенесення (або TM). Друга спейсерна послідовність може бути однаковою або відрізнятися від першої спейсерної послідовності, що розділяє нецитотоксичну протеазу та ділянку для розщеплення першою протеазою. В одному варіанті здійснення друга спейсерна послідовність може містити частину або всю ділянку для розщеплення другою протеазою або може являти собою частину компонента на основі домену, що забезпечує перенесення. В одному варіанті здійснення компонент на основі домену, що забезпечує перенесення, та компонент на основі ділянки для розщеплення другою протеазою одноланцюгового гібридного білка розділені не більш ніж 30, 25, 20, 15 або 10 амінокислотними залишками. В одному варіанті здійснення зазначені два компоненти у одноланцюговому гібридному білку розділені не більш ніж 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотним залишком. В іншому варіанті здійснення зазначені два компоненти у одноланцюговому гібридному білку не розділені жодним амінокислотним залишком. Таким чином, в одному варіанті здійснення домен, що забезпечує перенесення, та ділянка для розщеплення другою протеазою можуть бути розділені третьою спейсерною послідовністю, причому зазначена третя спейсерна послідовність розташована ближче до N-кінця або ближче до C-кінця порівняно з доменом, що забезпечує перенесення. Третя спейсерна послідовність може бути ідентичною (або відрізнятися від) однієї або обох із першої та другої спейсерної послідовностей. В одному варіанті здійснення третя спейсерна послідовність може містити частину або всю ділянку для розщеплення другою протеазою або може являти собою частину компонента на основі домену, що забезпечує перенесення. В одному варіанті здійснення частина молекули, що забезпечує націлювання, та ділянка для розщеплення другою протеазою розділені не більш ніж 30, 25, 20, 15 або 10 амінокислотними залишками. В одному варіанті здійснення зазначені два компоненти у одноланцюговому гібридному білку розділені не більш ніж 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотним залишком. В іншому варіанті здійснення зазначені два компоненти у одноланцюговому гібридному білку не розділені жодним амінокислотним залишком. Таким чином, після розщеплення за ділянкою для розщеплення другою протеазою забезпечується поліпептид із частиною молекули, що забезпечує націлювання, яка має Nкінцевий домен і C-кінцевий домен, що практично є вільними від іншої частини кон'югата. Це розміщення забезпечує взаємодію N-кінцевого і C-кінцевого компонентів частини молекули, що забезпечує націлювання, з ділянкою зв'язування на клітині-мішені. В одному варіанті здійснення частина молекули, що забезпечує націлювання, та ділянка для розщеплення другою протеазою можуть бути розділені четвертою спейсерною послідовністю, причому зазначена четверта спейсерна послідовність розташована ближче до N-кінця або ближче до C-кінця порівняно з частиною молекули, що забезпечує націлювання. Четверта спейсерна послідовність може бути ідентичною (або відрізнятися від) однієї, двох або всіх із першої, другої та третьої спейсерних послідовностей. В одному варіанті здійснення четверта спейсерна послідовність може містити частину або всю ділянку для розщеплення другою протеазою або може являти собою частину компонента на основі домену, що забезпечує перенесення. В одному варіанті здійснення перша протеаза (за допомогою якої можна розщеплювати ділянку для розщеплення першою протеазою) є такою ж, як і друга протеаза (за допомогою якої можна розщеплювати ділянку для розщеплення другою протеазою). Таким чином, в одному варіанті здійснення обробка одноланцюгового поліпептидного гібридного білка однією протеазою може приводити до розщеплення ділянки для розщеплення як першою, так і другою протеазою. 12 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ряд різних спейсерних молекул можна використовувати у будь-яких із гібридних білків за даним винаходом. Приклади таких спейсерних молекул включають GS5, GS10, GS15, GS20, GS25 і Hx27. Ковалентний зв'язок Поліпептидні гібридні білки за даним винаходом містять два ковалентні зв'язки, причому перший такий зв'язок знаходиться між компонентом на основі нецитотоксичної протеази й іншою частиною гібридного білка, та другий такий зв'язок знаходиться між частиною молекули, що забезпечує націлювання, та доменом, що забезпечує перенесення. Після протеолітичного розщеплення за (відповідною) першою та другою ділянками для розщеплення протеазою зазначені два ковалентні зв'язки залишаються інтактними. В одному варіанті здійснення ковалентні зв'язки не є пептидними зв'язками (тобто ковалентні зв'язки являють собою зв'язки, які не відносяться до пептидних). Наприклад, в одному варіанті здійснення один або обидва із зазначених ковалентних зв'язків являють собою дисульфідні зв'язки. Після протеолітичного розщеплення за ділянкою для розщеплення другою протеазою ковалентний зв'язок залишається інтактним. Розщеплення за ділянкою для розщеплення другою протеазою приводить у результаті до вільного N-кінця (або С-кінця) частини молекули, що забезпечує націлювання. Таким чином, розщеплення за ділянкою для розщеплення другою протеазою приводить до частини молекули, що забезпечує націлювання, яка має вільний Nкінець і вільний С-кінець. Отже, після розщеплення за ділянкою для розщеплення другою протеазою компонент на основі частини молекули, що забезпечує націлювання, більше не є частиною одного й того ж поліпептидного ланцюга, що і компонент на основі домену, що забезпечує перенесення, оскільки пептидний зв'язок між частиною молекули, що забезпечує націлювання, та доменом, що забезпечує перенесення, було розщеплено. Проте частина молекули, що забезпечує націлювання, залишається приєднаною до домену, що забезпечує перенесення, внаслідок присутності ковалентного зв'язку. Ковалентний зв'язок може включати будь-який ковалентний зв'язок, що може утворюватися або утворений між двома амінокислотними залишками у поліпептидному ланцюзі. В одному варіанті здійснення ковалентний зв'язок являє собою дисульфідний зв'язок. Дисульфідний зв'язок може бути утворений між будь-якими двома тіольними (тобто –SH) групами, присутніми у поліпептиді. У якості прикладу дисульфідні зв'язки можуть утворюватися між двома цистеїновими залишками (або їх функціонально еквівалентними варіантами), що знаходяться у поліпептидному ланцюзі. Таким чином, в одному варіанті здійснення цистеїновий залишок, що знаходиться у компоненті на основі домену, що забезпечує перенесення, утворює ковалентний зв'язок із іншим цистеїновим залишком, що знаходиться у компоненті на основі частини молекули, що забезпечує націлювання. Такий дисульфідний зв'язок залишається інтактним після розщеплення за ділянкою для розщеплення другою протеазою. Амінокислотні залишки, які знаходяться у компоненті на основі домену, що забезпечує перенесення, та у компоненті на основі частини молекули, що забезпечує націлювання, які з'єднані ковалентним зв'язком, можуть бути присутніми у зазначених компонентах у природних умовах. Отже, в одному варіанті здійснення ковалентний зв'язок утворюється між амінокислотним залишком, присутнім у природних умовах у компоненті на основі домену, що забезпечує перенесення, та амінокислотним залишком, присутнім у природних умовах у компоненті на основі частини молекули, що забезпечує націлювання. В альтернативному випадку один або обидва із зазначених амінокислотних залишків можна ввести у компонент на основі домену, що забезпечує перенесення, та/або компонент на основі частини молекули, що забезпечує націлювання. Амінокислотні залишки можна ввести у якості замін. В одному варіанті здійснення ковалентний зв'язок являє собою дисульфідний зв'язок, утворений між цистеїновим залишком, присутнім у природних умовах у компоненті на основі домену, що забезпечує перенесення, та цистеїновим залишком, присутнім у природних умовах у компоненті на основі частини молекули, що забезпечує націлювання. У альтернативному варіанті здійснення цистеїновий залишок є специфічно введеним або у домен, що забезпечує перенесення, або у частину молекули, що забезпечує націлювання, або в обидва з тим, щоб забезпечити або дати можливість утворення дисульфідного зв'язку між цими двома компонентами. В одному варіанті здійснення один або декілька цистеїнових залишків введені у TM та/або домен, що забезпечує перенесення. При цьому введений цистеїновий залишок(залишки) може бути фланкований двома невеликими ахіральними амінокислотними залишками (наприклад, гліцин та/або аланін). Використання таких амінокислотних залишків запобігає утворенню 13 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 третинної структури та забезпечує утворення дисульфідного зв'язку. Невеликі ахіральні амінокислотні залишки можуть бути присутніми у природних умовах або можуть бути введеними у TM та/або домен, що забезпечує перенесення. В одному варіанті здійснення, окрім ковалентного зв'язку, між доменом, що забезпечує перенесення, та частиною молекули, що забезпечує націлювання, може бути розташований короткий поліпептид (наприклад, 1-20, або 1-10, або 5-10 амінокислотних залишків), який забезпечує вторинну структуру поліпептиду. Зазначена вторинна структура поліпептиду сприяє розміщенню домену, що забезпечує перенесення, та частини молекули, що забезпечує націлювання, тим самим забезпечуючи (1) утворення ковалентного зв'язку між TM і доменом, що забезпечує перенесення, та/або (2) таке розміщення TM, що її C-кінцеві та N-кінцеві ділянки є відвернутими від компонента, що забезпечує перенесення. Таким чином, в одному варіанті здійснення вторинна структура поліпептиду забезпечує наближення сегмента частини молекули, що забезпечує націлювання, до домену, що забезпечує перенесення, тим самим роблячи утворення ковалентного зв'язку більш сприятливим у енергетичному відношенні. В одному варіанті здійснення поліпептид, здатний до утворення вторинної структури поліпептиду, що описана вище, являє собою поліпептидну послідовність, яка містить щонайменше один ”масивний” амінокислотний залишок, такий як проліновий залишок. Таким чином, в одному варіанті здійснення між доменом, що забезпечує перенесення, та частиною молекули, що забезпечує націлювання, розташований поліпептид, який містить щонайменше один масивний амінокислотний залишок. Зазначений масивний залишок сприяє утворенню вигину у поліпептидному ланцюзі так, щоб сегмент частини молекули, що забезпечує націлювання, наближався до домену, що забезпечує перенесення, ще ближче, ніж відбувалося б у іншому випадку. Відповідний ковалентний зв'язок між компонентом на основі нецитотоксичної протеази й іншою частиною гібридного білка (наприклад, компонентом, що забезпечує перенесення, та/або TM-компонентом) може бути утворений таким же способом, як описано вище для ковалентного зв'язку між компонентом на основі домену, що забезпечує перенесення, та TM-компонентом. Як описано вище, можна ввести одну або декілька вторинних структур та/або один або декілька масивних амінокислотних залишків. В одному варіанті здійснення ковалентний зв'язок між компонентом на основі нецитотоксичної протеази й іншою частиною гібридного білка знаходиться між компонентом на основі нецитотоксичної протеази та компонентом на основі домену, що забезпечує перенесення. В одному варіанті здійснення для ковалентного зв'язку між компонентом на основі нецитотоксичної протеази та компонентом на основі домену, що забезпечує перенесення, використовують цистеїнові залишки, що зустрічаються в природі, які знаходяться у відповідних компонентах, таких як, наприклад, один або декілька цистеїнових залишків, проілюстрованих у даному розділі опису раніше. В альтернативному випадку один придатний цистеїновий залишок або декілька придатних цистеїнових залишків можна ввести у відповідні компоненти. Гібридний білок може містити одну або декілька міток для очищення, які розташовані ближче до N-кінця порівняно із протеазним компонентом та/або ближче до C-кінця порівняно із компонентом, що забезпечує перенесення. Хоча можна використовувати будь-яку мітку для очищення, наступні є переважними: His-мітка (наприклад, 6 × гістидин) переважно у якості C-кінцевої та/або N-кінцевої мітки; MBP-мітка (білок, що зв'язує мальтозу) переважно у якості N-кінцевої мітки; GST-мітка (глутатіон-S-трансфераза) переважно у якості N-кінцевої мітки; His-MBP-мітка переважно у якості N-кінцевої мітки; GST-MBP-мітка переважно у якості N-кінцевої мітки; тіоредоксинова мітка переважно у якості N-кінцевої мітки; CBD-мітка (домен, який зв'язує хітин) переважно у якості N- кінцевої мітки. Терапевтичні застосування TM-компонент спрямовує терапевтичну молекулу на основі спрямованого інгібітора секреції (TSI) за даним винаходом на потрібну клітину-мішень. У якості прикладу, при використанні TM, описаних у даному описі (наприклад, опіоїдний пептид, бета-ендорфіновий пептид, брадикініновий пептид, пептид BAM, ноцицептиновий пептид, динорфіновий пептид, галаніновий пептид, енкефаліновий пептид, пептид, що відноситься до речовини P), терапевтична молекула на основі спрямованого інгібітора секреції (TSI) за даним винаходом спрямовується на чутливі до болю клітини (наприклад, первинні сенсорні аференти). Отже, одержані у результаті гібридні білки забезпечують терапевтичні молекули для ослаблення болю, причому заявник даного винаходу посилається на патентні документи WO2006/059093, 14 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 WO2007/138339 і WO96/33273, кожний із яких включено у даний документ у всій своїй повноті за допомогою посилання на нього. TM, описані у даному описі, можна використовувати для спрямування молекул на основі спрямованого інгібітора секреції (TSI) за даним винаходом на клітини, які стимулюють нейрогенне запалення. Відповідно, молекули спрямованого інгібітора секреції (TSI) за даним винаходом забезпечують терапевтичні молекули для ослаблення нейрогенного запалення, причому заявник даного винаходу посилається на патентні документи WO2010/138395, WO2010/138392, WO2010/138387, WO2010138382 і WO2010/138379, кожний із яких включено у даний документ у всій своїй повноті за допомогою посилання на нього. Переважні TM для використання у таких молекулах TSI та терапевтичних засобах включають опіоїдні TM, наприклад, ноцицептин і динорфін. TM, описані у даному описі, можна використовувати для спрямування молекул спрямованого інгібітора секреції (TSI) за даним винаходом на клітини, які пов'язані з неврологічними розладами сечостатевої системи, такими як гіперактивний сечовий міхур. Відповідно, молекули спрямованого інгібітора секреції (TSI) за даним винаходом забезпечують терапевтичні молекули для ослаблення неврологічних розладів сечостатевої системи, таких як гіперактивний сечовий міхур, причому заявник даного винаходу посилається на патентні документи WO2010/138393, WO2010/138389, WO2010/138384 і WO2010/138366, кожний із яких включено у даний документ у всій своїй повноті за допомогою посилання на нього. Переважні TM для використання у таких молекулах TSI та терапевтичних засобах включають опіоїдні TM, наприклад, ноцицептин і динорфін. TM, такі як пептид гонадотропін-рилізинг-гормона (GnRH), пептид CRF, пептид GRP, пептид нейромедину B, бомбезиновий пептид, гастриновий пептид, пептид CCK, пептид SST, пептид CST і пептид GHRH, можна використовувати для спрямування молекул TSI за даним винаходом на клітини, які пов'язані з раком або фактично являють собою ракові клітини per se. Відповідно, молекули спрямованого інгібітора секреції (TSI) за даним винаходом забезпечують терапевтичні молекули для ослаблення нейроендокринних станів, таких як акромегалія та хвороба Кушинга та для пригнічення раку (наприклад, раку легенів, раку нирок, раку головного мозку, раку молочної залози, раку підшлункової залози, раку товстої кишки, раку надниркової залози, раку стравоходу, лімфоми, лейкозу, гострого лейкозу, раку сечового міхура, раку кісток, раку кишечника, раку шийки матки, хронічного лімфоцитарного лейкозу, лімфоми Ходжкіна, раку печінки, раку шкіри, раку ротоглотки, мієломи, раку простати, раку шлунку, раку яєчка, раку матки або саркоми Капоші), причому заявник даного винаходу посилається на патентні документи WO2009/150489, WO2009/150470 і WO2010/055358, кожний із яких включено у даний документ у всій своїй повноті за допомогою посилання на нього. Переважні TM для використання у таких молекулах TSI та терапевтичних засобах включають пептиди GHRH, пептиди SST і пептиди CST. Ділянки для деструктивного розщеплення Поліпептиди за даним винаходом також можуть бути додатково модифіковані для зменшення або попередження небажаних побічних ефектів, пов'язаних із поширенням у області, що не відносяться до цільових. Згідно з даним варіантом здійснення поліпептид містить ділянку для деструктивного розщеплення. Ділянка для деструктивного розщеплення відрізняється від ділянки для “активації” (тобто для утворення дволанцюгової структури) та від ділянки для розщеплення другою протеазою (тобто для утворення TM із вільними C-кінцевим і N-кінцевим доменами). Зазначена ділянка для деструктивного розщеплення може розщеплюватися третьою протеазою, а не першою або другою протеазами. Окрім того, при такому розщепленні за ділянкою для деструктивного розщеплення третьою протеазою поліпептид за даним винаходом характеризується зниженою ефективністю (наприклад, зниженою зв'язувальною здатністю по відношенню до передбаченої клітини-мішені, зниженою активністю перенесення та/або зниженою активністю нецитотоксичної протеази). У якості прикладу заявник даного винаходу робить посилання на патентні документи WO 2010/094905 і WO 02/044199, кожний із яких включено у даний документ у всій своїй повноті за допомогою посилання на нього. Таким чином, згідно з даним варіантом здійснення, даний винахід передбачає поліпептид, який може піддаватися регульованій інактивації та/або руйнуванню при його потраплянні за межі потрібного місцезнаходження. В одному варіанті здійснення ділянка для деструктивного розщеплення розпізнається та розщеплюється третьою протеазою (тобто деструктивною протеазою), вибраною із протеази, що знаходиться у кровообігу (наприклад, позаклітинна протеаза, така як протеаза сироватки крові або протеаза з каскаду зсідання крові), протеази, асоційованої із тканиною (наприклад, матриксна металопротеаза (MMP), така як MMP м'язів), і внутрішньоклітинної протеази (переважно протеаза, 15 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 яка відсутня у клітині-мішені). Отже, при застосуванні, якщо поліпептид за даним винаходом буде розподілятися поза межами передбаченої клітини-мішені та/або поглинатися клітиною, що не відноситься до клітини-мішені, поліпептид буде інактивований шляхом розщеплення ділянки для деструктивного розщеплення (третьою протеазою). У контексті даного винаходу матриксні металопротеази (MMP) являють собою переважну групу деструктивних протеаз. У межах цієї групи ADAM17 (EC 3.4.24.86, також відома як TACE) є переважною та розщеплює багато заякорених на мембрані білків поверхні клітини з "відділенням" позаклітинних доменів. Додаткові переважні MMP включають адамалізини, сералізини та астацини. Інша група переважних деструктивних протеаз являє собою протеазу із крові ссавців, наприклад, тромбін, фактор зсідання крові VIIa, фактор зсідання крові IXa, фактор зсідання крові Xa, фактор зсідання крові XIa, фактор зсідання крові XIIa, калікреїн, білок C та MBP-асоційовану серинову протеазу. Згідно із другим аспектом даного винаходу забезпечено послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує описаний вище поліпептидний гібридний білок. У переважному аспекті даного винаходу послідовність ДНК одержують у якості частини ДНКвектора, де вектор містить промотор і термінатор. Послідовність ДНК, що кодує описаний вище поліпептидний гібридний білок, розташована нижче промотора; при цьому термінатор розташований нижче послідовності нуклеїнової кислоти. У переважному варіанті здійснення вектор має промотор, вибраний із наступного. Промотор Засіб для індукції Типові умови індукції tac (гібридний) IPTG 0,2 мМ (0,05-2,0 мМ) AraBAD L-арабіноза 0,2% (0,002-0,4%) lac-оператор T7 IPTG 0,2 мМ (0,05-2,0 мМ) Розробку ДНК-конструкта за даним винаходом переважно здійснюють in silico, та потім його синтезують за допомогою звичайних методик синтезу ДНК. Інформацію згаданої вище послідовності ДНК необов'язково модифікують у плані відхилення за використанням синонімічних кодонів відповідно до кінцевої системи експресії на основі клітини-хазяїна (наприклад, E. coli), яку будуть використовувати. Переважно здійснюють скринінг кістяка ДНК на предмет характерних послідовностей нуклеїнової кислоти, які при транскрипції та трансляції будуть давати амінокислотну послідовність, що відповідає ділянці для розщеплення протеазою, яку кодує друга кодуюча послідовність. Цей скринінг можна здійснювати вручну або за допомогою комп'ютерного програмного забезпечення (наприклад, програма MapDraw від DNASTAR, Inc.). Згідно з іншим варіантом здійснення даного винаходу забезпечено спосіб одержання одноланцюгового поліпептидного гібридного білка, що описаний вище, що включає етап, на якому забезпечують експресію послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує описаний вище гібридний білок, або ДНК-вектора, що описаний вище, у клітині-хазяїні. Згідно з додатковим варіантом здійснення даного винаходу забезпечено спосіб одержання нецитотоксичного засобу, що включає етапи, на яких: a. забезпечують розчин, що містить одноланцюговий поліпептидний гібридний білок за даним винаходом; b. додають до зазначеного розчину першу протеазу, здатну розщеплювати ділянку для розщеплення першою протеазою, та другу протеазу, здатну розщеплювати ділянку для розщеплення другою протеазою; c. забезпечують розщеплення ділянки розщеплення для першої протеази та ділянки розщеплення для другої протеази; тим самим забезпечують утворення триланцюгового гібридного білка. В одному варіанті здійснення першу протеазу та другу протеазу додають послідовно. У альтернативному варіанті здійснення другу протеазу додають перед першою протеазою. У ще одному варіанті здійснення першу протеазу та другу протеазу додають одночасно. У даному аспекті забезпечено триланцюговий поліпептид. Більш детально, одержаний у результаті триланцюговий поліпептид, звичайно має структуру, де a. перший ланцюг містить нецитотоксичну протеазу або її фрагмент, причому протеаза або фрагмент протеази здатні розщеплювати білок системи клітини-мішені, що забезпечує злиття з мембраною при екзоцитозі; b. другий ланцюг містить домен, що забезпечує перенесення, який здатний переносити протеазу або фрагмент протеази із внутрішньої частини ендосоми, через мембрану ендосоми та у цитозоль клітини-мішені; 16 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 c. третій ланцюг містить частину молекули, що забезпечує націлювання, яка здатна зв'язуватися з ділянкою зв'язування на клітині-мішені, причому ділянка зв'язування здатна піддаватися ендоцитозу із включенням у ендосому у клітині-мішені; d. перший і другий ланцюги зв'язані між собою дисульфідними зв'язками, та другий і третій домени зв’язані між собою ковалентним зв’язком, який не відноситься до пептидного. Доставка поліпептиду Згідно з додатковим аспектом даного винаходу забезпечено одноланцюговий поліпептидний гібридний білок, що описаний вище, або нецитотоксичний поліпептид, що описаний вище, для застосування при лікуванні, попередженні або полегшенні медичного стану. При застосуванні у даному винаході використовують фармацевтичну композицію, що містить поліпептид, разом із щонайменше одним компонентом, вибраним із фармацевтично прийнятного носія, наповнювача, допоміжної речовини, пропелента та/або солі. Поліпептиди за даним винаходом можна скласти для перорального, парентерального застосування, застосування з використанням безперервної інфузії, імплантату, інгаляції або місцевого застосування. Композиції, придатні для ін'єкції, можуть знаходитися у формі розчинів, суспензій, або емульсій, або сухих порошків, які перед застосуванням розчиняють або суспендують у придатному середовищі. Засоби для локальної доставки можуть включати аерозоль або інший спрей (наприклад, такий для небулайзера). У зв'язку з цим аерозольний склад на основі поліпептиду забезпечує доставку у легені, та/або носові ходи, та/або бронхіальні або дихальні шляхи. Переважний шлях введення вибирають із системного (наприклад, внутрішньовенне), лапароскопічного та/або введення за допомогою локальної ін'єкції (наприклад, транссфеноїдальна ін'єкція безпосередньо до клітинимішені, такої як пухлинної). У випадку складів для ін'єкції необов'язковим є включенні фармацевтично активної речовини для сприяння утриманню поліпептиду у місці введення або зменшення видалення поліпептиду з нього. Одним прикладом такої фармацевтично активної речовини є вазоконстриктор, такий як адреналін. Такий склад надає перевагу, яка полягає у збільшенні часу знаходження поліпептиду у організмі після введення і, отже, збільшує та/або посилює його ефект. Діапазони доз для введення поліпептидів за даним винаходом є такими, які забезпечують одержання необхідного терапевтичного ефекту. Буде зрозуміло, що необхідний діапазон доз залежить від точно визначених властивостей поліпептиду або композиції, шляху введення, властивостей складу, віку пацієнта, природи, ступеня або тяжкості стану пацієнта, протипоказань, якщо такі є, та рішення лікаря. Варіанти цих рівнів доз можна регулювати з використанням стандартних емпіричних методик оптимізації. Придатні добові дози (на кг ваги пацієнта) знаходяться у діапазоні 0,0001-1 мг/кг, переважно 0,0001-0,5 мг/кг, більш переважно 0,002-0,5 мг/кг та особливо переважно 0,004-0,5 мг/кг. Стандартна доза може варіювати від менше 1 мікрограма до 30 мг, але, як правило, буде становити від приблизно 0,01 мг до 1 мг на дозу, яку можна вводити щодоби або переважно менш часто, як наприклад, один раз на тиждень або один раз на шість місяців. Особливо переважна схема дозування основана на 2,5 нг поліпептиду у якості 1X дози. У зв'язку з цим переважні дози знаходяться у діапазоні 1X–100X (тобто 2,5-250 нг). Рідкі лікарські форми звичайно одержують з використанням поліпептиду й апірогенного стерильного середовища. Залежно від використовуваного середовища та концентрації поліпептид можна або розчиняти, або суспендувати у середовищі. При одержанні розчинів поліпептид можна розчиняти у середовищі, причому за потреби розчин роблять ізотонічним шляхом додавання хлориду натрію та стерилізують шляхом фільтрації за допомогою стерильного фільтра з використанням асептичних методик перед заповненням придатних стерильних флаконів або ампул та закупорюванням. У альтернативному випадку, якщо стабільність розчину є задовільною, розчин у герметичних контейнерах можна стерилізувати за допомогою автоклавування. Переважно у середовищі можна розчиняти добавки, такі як буферні, солюбілізувальні засоби, стабілізатори, консерванти або бактерицидні, суспендувальні або емульгувальні засоби і/або засоби для місцевої анестезії. Сухі порошки, які розчиняють або суспендують у придатному середовищі перед застосуванням, можна одержати шляхом заповнення стерильного контейнера попередньо стерилізованими інгредієнтами з використанням асептичної методики у стерильній зоні. У альтернативному випадку інгредієнти можна розчиняти у придатних контейнерах із використанням асептичної методики у стерильній зоні. Продукт потім ліофілізують і контейнери закупорюють в асептичних умовах. Суспензії для парентерального застосування, придатні для внутрішньом'язової, підшкірної або інтрадермальної ін'єкції, одержують, по суті, таким же чином, за винятком того, що 17 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стерильні компоненти суспендують у стерильному середовищі замість розчинення, та не можна здійснювати стерилізацію за допомогою фільтрації. Компоненти можна виділяти у стерильному стані або в альтернативному випадку їх можна стерилізувати після виділення, наприклад, за допомогою гамма-опромінення. Переважно суспендувальний засіб, наприклад, полівінілпіролідон, включають у композицію/композиції для забезпечення рівномірного розподілу компонентів. Розділ визначень Частина молекули, що забезпечує націлювання (TM), означає будь-яку хімічну структуру, яка функціонально взаємодіє з ділянкою зв'язування з виникненням фізичного зв’язку між поліпептидом за даним винаходом і поверхнею клітини-мішені. Вираз TM охоплює будь-яку молекулу (тобто молекулу, що зустрічається в природі, або її хімічно/фізично модифікований варіант), яка здатна зв'язуватися з ділянкою зв'язування на клітині-мішені, причому ділянка зв'язування здатна до інтерналізації (наприклад, утворення ендосоми), що також називають рецептор-опосередкованим ендоцитозом. TM може мати функцію, пов'язану з перенесенням через мембрану ендосоми, у цьому випадку присутність окремих компоненту на основі TM і компоненту на основі домену, що забезпечує перенесення, у засобі за даним винаходом не є необхідною. У попередній частині даного опису було описано конкретні TM. Посилання на зазначені TM є тільки ілюстративним, і при цьому даний винахід охоплює всі їх варіанти та похідні, які зберігають початкову зв'язувальну (тобто націлювальну) здатність TM, наведених у якості прикладу. Як згадувалось раніше, переважні TM включають антитіла (наприклад, фрагменти антитіл) і зв'язувальні каркасні структури; зокрема, комерційно доступні антитіла/фрагменти та каркасні структури, розроблені з метою зв'язування (наприклад, специфічного) із клітинами-мішенями. Білкові каркасні структури являють собою нове покоління універсальних зв'язувальних каркасів для доповнення розширеного спектра терапевтичних моноклональних антитіл і похідних, наприклад, scFv, молекул Fab, dAb (однодоменних антитіл), антитіл із верблюдових, діантитіл та мініантитіл, кожне з яких можна використовувати у якості TM за даним винаходом. У системах на основі каркасних структур створюють або модифікують відомі домени для розпізнавання білка або за допомогою створення нових каркасних структур, або за допомогою модифікації відомих доменів, що зв'язують білок. Такі каркасні структури включають без обмеження наступні: (i) каркасні структури на основі білка A - афітіла (Nord, K. et al 1997 “Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain”. Nat Biotechnol 15, 772– 777); (ii) каркасні структури на основі ліпокаліну – антикаліни (Skerra 2008 “Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities”. FEBS J. 275:2677-83); (iii) каркасні структури на основі фібронектину – аднектин (Dineen et al 2008 “The Adnectin CT-322 is a novel VEGF receptor 2 inhibitor that decreases tumor burden in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer”. BMC Cancer 8:352); (iv) авімери (Silverman et al 2005 “Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains”. Nat Biotechnol23:1556-61); (v) каркасні структури на основі анкірину – дарпіни (Zahnd et al 2006 “Selection and characterization of Her2 binding-designed ankyrin repeat proteins”. J Biol Chem. 281:35167-75); та (vi) центиринові каркасні структури – на основі укладання білка, що характеризується значною структурною гомологією до Ig-доменів, із петлями, які є аналогічними CDR. Ig-домени являють собою поширений модуль у білках людини та їх широко використовували в якості альтернативних каркасних білків. Кожна з вищезазначених публікацій, що стосуються каркасних структур, включена у даний документ (у всій її повноті) за допомогою посилання на неї. Зв'язувальні каркасні структури можна застосовувати для націлювання на певні типи клітин шляхом взаємодії зі специфічними білками поверхні клітини, рецепторами або іншими епітопами поверхні клітини, наприклад, цукровими групами. Для рекомбінантних поліпептидів на основі нецитотоксичної протеази за даним винаходом можна конструювати такі модифіковані каркасні структури. TM за даним винаходом зв'язується (переважно специфічно зв'язується) з цільовою клітиною-мішенню. Вираз “специфічно зв'язується” переважно означає, що дана TM зв'язується 6 -1 7 -1 із клітиною-мішенню зі спорідненості зв'язування (Ka) 10 M або більше, переважно 10 M або 8 -1 9 -1 більше, більш переважно 10 M або більше та найбільш переважно 10 M або більше. Посилання на TM у даному описі охоплює їх фрагменти та варіанти, які зберігають здатність зв'язуватися з цільовою клітиною-мішенню. У якості прикладу варіант може характеризуватися 18 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 щонайменше 80%, переважно щонайменше 90%, більш переважно щонайменше 95% та найбільш переважно щонайменше 97% або щонайменше 99% гомологією амінокислотної послідовності з еталонною TM. Таким чином, варіант може включати один або декілька аналогів амінокислоти (наприклад, амінокислота, що не зустрічається в природі) або заміщений зв'язок. Також, у якості прикладу, вираз фрагмент при використанні у зв'язку із TM означає пептид, що включає щонайменше десять, переважно щонайменше двадцять, більш переважно щонайменше тридцять і найбільш переважно щонайменше сорок амінокислотних залишків з еталонної TM. Вираз фрагмент також відноситься до вищезгаданих варіантів. Отже, у якості прикладу фрагмент за даним винаходом може містити пептидну послідовність, що включає щонайменше 10, 20, 30 або 40 амінокислот, де пептидна послідовність характеризується щонайменше 80% гомологією послідовності при порівнянні з відповідною пептидною послідовністю (із суміжних) амінокислот еталонного пептиду. Існує методика для підтвердження того, що TM зв'язується з вибраною клітиною-мішенню. Наприклад, можна використовувати простий експеримент із витісненням радіоактивної мітки, у якому тканину або клітини, що представляють цільові клітини-мішені, піддають впливу міченої (наприклад, тритильованої) TM у присутності надлишку неміченої TM. У такому експерименті можна оцінити відносні частки неспецифічного та специфічного зв'язування, тим самим забезпечуючи підтвердження того, що TM зв'язується із клітиною-мішенню. Аналіз може необов'язково включати один або декілька антагоністів зв'язування, а також аналіз може включати спостереження за втратою зв'язування із TM. Приклади цього типу експерименту можна знайти у Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pp. 303-311, у Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E.C. Hulme, Oxford University Press. У контексті даного винаходу посилання на пептидну TM охоплює її пептидні аналоги за умови, що аналог зв'язується із тим же рецептором, що і відповідна “еталонна” TM. Зазначені аналоги можуть включати синтетичні залишки, як наприклад, наступні: ß-Nal = ß-нафтилаланін; ß-Pal = ß-піридилаланін; hArg(Bu) = N-гуанідин(бутил)гомоаргінін; hArg(Et)2 = N,N'-гуанідин(диметил)гомоаргінін; ’ hArg(CH2CF3)2 = N,N -гуанідин-біс-(2,2,2-трифторетил)гомоаргінін; ’ hArg(CH3, гексил) = N,N -гуанідин(метил, гексил)гомоаргінін; e Lys(Me) = N -метиллізин; e Lys(iPr) = N -ізопропіллізин; AmPhe = амінометилфенілаланін; AChxAla = аміноциклогексилаланін; Abu = α-аміномасляна кислота; Tpo = 4-тіапролін; MeLeu = N-метиллейцин; Orn = орнітин; Nle = норлейцин; Nva = норвалін; Trp(Br) = 5-бромтриптофан; Trp(F) = 5-фтортриптофан; Trp(N02) = 5-нітротриптофан; Gaba = γ-аміномасляна кислота; Bmp = J-меркаптопропіоніл; Ac = ацетил; Pen = пенциламін. Поліпептиди за даним винаходом можуть не містити функціонального H C- або HCC-домену клостридіального нейротоксину. Відповідно, зазначені поліпептиди не здатні зв'язуватися із синаптосомальними мембранами щурів (за допомогою компонента на основі клостридіального HC) у аналізах зв'язування, як описано у Shone et al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82. В одному варіанті здійснення поліпептиди не містять останні 50 C-кінцевих амінокислот холотоксину клостридіального нейротоксину. В іншому варіанті здійснення поліпептиди не містять останні 100, 150, 200, 250 або 300 C-кінцевих амінокислотних залишків холотоксину клостридіального нейротоксину. В альтернативному випадку HC-зв'язувальну активність можна усунути/знизити за допомогою мутагенезу, причому у якості прикладу для зручності беруть BoNT/A у якому заміна шляхом мутації одного або двох амінокислотних залишків (W1266 на L і Y1267 на F) у зв'язувальній кишені для гангліозиду приводить до втрати H C-ділянкою функції зв'язування з рецептором. Аналогічні мутації можна здійснити у компонентах клостридіального пептиду, що 19 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 не відноситься до серотипу A, наприклад, конструкті на основі ботулінічного токсину B із мутаціями (W1262 на L і Y1263 на F) або ботулінічного токсину E (W1224 на L і Y1225 на F). При інших мутаціях у активній ділянці досягають такої ж втрати активності зв'язування H C з рецептором, наприклад, мутація Y1267S у ботулінічному токсині типу A та відповідного висококонсервативного залишку у інших клостридіальних нейротоксинах. Деталі, що стосуються цієї й інших мутацій, описано у Rummel et al (2004) (Molecular Microbiol. 51:631-634), яку включено у даний документ за допомогою посилання на неї. HC-пептид нативного клостридіального нейротоксину містить приблизно 400-440 амінокислотних залишків і складається із двох функціонально різних доменів, приблизно 25 кДа кожний, а саме N-кінцева ділянка (звичайно називається HCN-пептид або домен) і C-кінцева ділянка (звичайно називається HCC-пептид або домен). Окрім того, було встановлено, що Cкінцева ділянка (HCC), яка складається з 160-200 C-кінцевих амінокислотних залишків відповідає за зв'язування клостридіального нейротоксину з його природними клітинними рецепторами, а саме нервовими закінченнями у нервово-м'язовому з'єднанні. Таким чином, у всьому даному описі посилання на клостридіальний важкий ланцюг, що не містить функціонального H C-пептиду (або домену) важкого ланцюга, при цьому, отже, важкий ланцюг не здатний зв'язуватися з рецепторами на поверхні клітини, з якими зв'язується нативний клостридіальний нейротоксин, означає, що клостридіальний важкий ланцюг просто не містить функціонального H CC-пептиду. Іншими словами, ділянка HCC-пептиду є або частково, або повністю видаленою, або модифікованою іншим чином (наприклад, за допомогою звичайної хімічної або протеолітичної обробки) для інактивації її нативної зв'язувальної здатності по відношенню до нервових закінчень у нервово-м'язовому з'єднанні. Таким чином, в одному варіанті здійснення клостридіальний H N-пептид за даним винаходом не містить частину C-кінцевої ділянки пептиду (HCC) клостридіального нейротоксину й, отже, не має HC-зв'язувальної функції нативного клостридіального нейротоксину. У якості прикладу в одному варіанті здійснення подовжений на C-кінці клостридіальний HN-пептид не містить 40 Cкінцевих амінокислотних залишків, або 60 C-кінцевих амінокислотних залишків, або 80 Cкінцевих амінокислотних залишків, або 100 C-кінцевих амінокислотних залишків, або 120 Cкінцевих амінокислотних залишків, або 140 C-кінцевих амінокислотних залишків, або 150 Cкінцевих амінокислотних залишків, або 160 C-кінцевих амінокислотних залишків важкого ланцюга клостридіального нейротоксину. В іншому варіанті здійснення клостридіальний HNпептид за даним винаходом не містить усієї C-кінцевої ділянки пептиду (HCC) клостридіального нейротоксину й, отже, не має HC-зв'язувальної функції нативного клостридіального нейротоксину. У якості прикладу в одному варіанті здійснення клостридіальний HN-пептид не містить 165 C-кінцевих амінокислотних залишків, або 170 C-кінцевих амінокислотних залишків, або 175 C-кінцевих амінокислотних залишків, або 180 C-кінцевих амінокислотних залишків, або 185 C-кінцевих амінокислотних залишків, або 190 C-кінцевих амінокислотних залишків, або 195 C-кінцевих амінокислотних залишків важкого ланцюга клостридіального нейротоксину. У якості додаткового прикладу клостридіальний HN-пептид за даним винаходом не містить еталонної послідовності клостридіального HCC, вибраного із групи, яка включає наступне: ботулінічний нейротоксин типу A- амінокислотні залишки (Y1111-L1296); ботулінічний нейротоксин типу B - амінокислотні залишки (Y1098-E1291); ботулінічний нейротоксин типу C - амінокислотні залишки (Y1112-E1291); ботулінічний нейротоксин типу D - амінокислотні залишки (Y1099-E1276); ботулінічний нейротоксин типу E - амінокислотні залишки (Y1086-K1252); ботулінічний нейротоксин типу F - амінокислотні залишки (Y1106-E1274); ботулінічний нейротоксин типу G - амінокислотні залишки (Y1106-E1297); нейротоксин правця - амінокислотні залишки (Y1128-D1315). Вищезазначені еталонні послідовності слід розглядати як зразок, оскільки можуть виникати незначні варіації відповідно до субсеротипів. Протеаза за даним винаходом охоплює всі нецитотоксичні протеази, які здатні розщеплювати один або декілька білків системи, що забезпечує злиття з мембраною при екзоцитозі, у еукаріотичних клітинах. Протеаза за даним винаходом переважно являє собою бактеріальну протеазу (або її фрагмент). Більш переважно бактеріальна протеаза вибрана з таких, що одержані з роду Clostridium або Neisseria/Streptococcus (наприклад, клостридіальний L-ланцюг, або IgA-протеаза нейсерій, переважно з N. gonorrhoeae або S. pneumoniae). Даний винахід також охоплює варіантні нецитотоксичні протеази (тобто варіанти молекул протеаз, що зустрічаються в природі) за умови, що варіантні протеази усе ще демонструють необхідну протеазну активність. У якості прикладу варіант може характеризуватися щонайменше 70%, переважно щонайменше 80%, більш переважно щонайменше 90% і 20 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 найбільш переважно щонайменше 95% або щонайменше 98% гомології амінокислотної послідовності з еталонною послідовністю протеази. Таким чином, вираз варіант включає нецитотоксичні протеази, що мають підвищену (або знижену) ендопептидазну активність, причому у даному документі слід особливо згадати підвищену Kcat/Kmмутантів BoNT/A Q161A, E54A і K165L, див. Ahmed, S.A. (2008) Protein J. DOI 10.1007/s10930-007-9118-8, яку включено у даний документ за допомогою посилання на неї. Вираз фрагмент, при використанні у зв'язку із протеазою, звичайно означає пептид, що включає щонайменше 150, переважно щонайменше 200, більш переважно щонайменше 250 та найбільш переважно щонайменше 300 амінокислотних залишків еталонної протеази. Як і у випадку з компонентом на основі “фрагмента” TM (що обговорюється вище) “фрагменти” протеаз за даним винаходом охоплюють фрагменти варіантних протеаз на основі еталонної послідовності. Протеаза за даним винаходом переважно виявляє активність серинової протеази або металопротеази (наприклад, ендопептидазну активність). Протеаза переважно є специфічною по відношенню до білка SNARE (наприклад, SNAP-25, синаптобревін/VAMP або синтаксин). Особливо слід згадати протеазні домени нейротоксинів, наприклад протеазні домени бактеріальних нейротоксинів. Таким чином, даний винахід охоплює використання доменів нейротоксинів, які зустрічаються в природі, а також рекомбінантно одержаних варіантів зазначених нейротоксинів, що зустрічаються в природі. Наведені у якості прикладу нейротоксини продукуються клостридіями, і при цьому вираз клостридіальний нейротоксин охоплює нейротоксини, які продукуються C. tetani (TeNT) і C. botulinum (BoNT), що відносяться до серотипів A-G, так само, як і близькоспоріднені BoNT-подібні нейротоксини, які продукуються C. baratii та C. butyricum. Вищезгадані скорочення використовують у всьому даному описі. Наприклад, за допомогою умовного позначення BoNT/A позначають джерело нейротоксину як BoNT (серотип A). BoNT характеризуються загальною структурою, причому являють собою дволанцюгові білки ~150 кДа, що складаються з важкого ланцюга (H-ланцюг) ~100 кДа, ковалентно з'єднаного одним дисульфідним зв'язком із легким ланцюгом (L-ланцюг) ~50 кДа. H-ланцюг складається з двох доменів, кожний по ~50 кДа. C-кінцевий домен (HC) є необхідним для зв'язування з нейронами з високою спорідненістю, тоді як N-кінцевий домен (HN), як припускають, бере участь у перенесенні через мембрану. L-ланцюг являє собою цинк-залежну металопротеазу, яка відповідає за розщеплення субстратного білка SNARE. Вираз фрагмент L-ланцюга означає компонент L-ланцюга нейротоксину, причому даний фрагмент виявляє металопротеазну активність і здатний протеолітично розщеплювати білок, асоційований із везикулою і/або плазматичною мембраною, який бере участь у екзоцитозі із клітини. Приклади придатних (еталонних) послідовностей протеаз включають наступне: ботулінічний нейротоксин типу A - амінокислотні залишки (1-448); ботулінічний нейротоксин типу B - амінокислотні залишки (1-440); ботулінічний нейротоксин типу C - амінокислотні залишки (1-441); ботулінічний нейротоксин типу D - амінокислотні залишки (1-445); ботулінічний нейротоксин типу E - амінокислотні залишки (1-422); ботулінічний нейротоксин типу F - амінокислотні залишки (1-439); ботулінічний нейротоксин типу G - амінокислотні залишки (1-441); нейротоксин правця - амінокислотні залишки (1-457); IgA-протеаза - амінокислотні залишки (1-959)*. * Pohlner, J. et al. (1987). Nature 325, pp. 458-462, яку включено у даний документ за допомогою посилання на неї. Вищезазначену еталонну послідовність слід розглядати як зразок, оскільки можуть виникати незначні варіації відповідно до субсеротипів. У якості прикладу у патентному документі US 2007/0166332 (включеному у даний документ за допомогою посилання на нього) викладені дещо інші клостридіальні послідовності: ботулінічний нейротоксин типу A - амінокислотні залишки (M1-K448); ботулінічний нейротоксин типу B - амінокислотні залишки (M1-K441); ботулінічний нейротоксин типу C - амінокислотні залишки (M1-K449); ботулінічний нейротоксин типу D - амінокислотні залишки (M1-R445); ботулінічний нейротоксин типу E - амінокислотні залишки (M1-R422); ботулінічний нейротоксин типу F - амінокислотні залишки (M1-K439); ботулінічний нейротоксин типу G - амінокислотні залишки (M1-K446); нейротоксин правця - амінокислотні залишки (M1-A457). 21 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ряд фрагментів клостридіального токсину, що містять легкий ланцюг, можна застосовувати в аспектах даного винаходу за умови, що ці фрагменти легкого ланцюга можуть специфічно націлюватися на основні компоненти системи, що забезпечує вивільнення нейромедіатора, й, отже, брати участь у здійсненні загального клітинного механізму, за допомогою якого клостридіальний токсин протеолітично розщеплює субстрат. Легкі ланцюги клостридіальних токсинів мають довжину приблизно 420-460 амінокислот і містять ферментативний домен. За допомогою дослідження продемонстрували, що повна довжина легкого ланцюга клостридіального токсину не є потрібною для ферментативної активності ферментативного домену. У якості необмежувального прикладу, перші вісім амінокислот легкого ланцюга BoNT/A не є необхідними для ферментативної активності. У якості іншого необмежувального прикладу перші вісім амінокислот легкого ланцюга TeNT не є необхідними для ферментативної активності. Аналогічно, карбоксильний кінець легкого ланцюга не є необхідним для активності. У якості необмежувального прикладу останні 32 амінокислоти легкого ланцюга BoNT/A (залишки 417-448) не є необхідними для ферментативної активності. У якості іншого необмежувального прикладу останні 31 амінокислота легкого ланцюга TeNT (залишки 427-457) не є необхідними для ферментативної активності. Отже, аспекти даного варіанту здійснення можуть включати легкі ланцюги клостридіального токсину, які містять ферментативний домен, що має довжину, наприклад, щонайменше 350 амінокислот, щонайменше 375 амінокислот, щонайменше 400 амінокислот, щонайменше 425 амінокислот і щонайменше 450 амінокислот. Інші аспекти даного варіанту здійснення можуть включати легкі ланцюги клостридіального токсину, які містять ферментативний домен, що має довжину, наприклад, не більш ніж 350 амінокислот, не більш ніж 375 амінокислот, не більш ніж 400 амінокислот, не більш ніж 425 амінокислот і не більш ніж 450 амінокислот. В одному варіанті здійснення нецитотоксична протеаза розщеплює білок SNARE, що не відноситься до нервової клітини, наприклад, білок SNAP-23. В одному варіанті здійснення нецитотоксична протеаза являє собою модифікований L-ланцюг ботулінічного токсину, здатний розщеплювати SNAP-23. Приклад такого модифікованого L-ланцюга описаний Chen and Barbieri, PNAS, vol. 106, no. 23, p9180-9184, 2009. В одному варіанті здійснення нецитотоксична протеаза являє собою протеазу BoNT/A, BoNT/C або BoNT/E, і при цьому переважний мотив SNARE являє собою мотив SNAP (наприклад, SNAP 25). В іншому варіанті здійснення нецитотоксична протеаза являє собою протеазу BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F або BoNT/G або нейротоксину правця (TeNT), і при цьому переважний мотив SNARE являє собою мотив VAMP. В іншому варіанті здійснення нецитотоксична протеаза являє собою протеазу BoNT/C1, і при цьому переважний мотив SNARE являє собою синтаксиновий мотив. Поліпептиди за даним винаходом, особливо їх протеазний компонент, можуть бути пегільованими, причому це може сприяти підвищенню стабільності, наприклад тривалості дії протеазного компонента. Пегілювання є особливо переважним, якщо протеаза містить протеазу BoNT/A, B або C1. Пегілювання переважно передбачає додавання PEG (поліетиленгліколь) до N-кінця протеазного компонента. У якості прикладу N-кінець протеази може бути подовжений одним або декількома амінокислотними залишками (наприклад, цистеїн), які можуть бути однаковими або різними. У свою чергу до одного або декількох зазначених амінокислотних залишків може бути приєднана (наприклад, ковалентно приєднана) молекула PEG. Приклад цієї методики описаний у патентному документі WO2007/104567, який включений у даний документ у всій своїй повноті за допомогою посилання на нього. Домен, що забезпечує перенесення, являє собою молекулу, яка забезпечує перенесення протеази у клітину-мішень так, щоб функціональна експресія протеазної активності відбувалася у цитозолі клітини-мішені. Те, що будь-яка молекула (наприклад, білок або пептид) має необхідну функцію перенесення за даним винаходом, можна підтвердити за допомогою будьякого з ряду загальноприйнятих аналізів. Наприклад, Shone C. (1987) описує in vitro аналіз із використанням ліпосом, які навантажують тестовою молекулою. Присутність необхідної функції перенесення + підтверджують за допомогою вивільнення з ліпосом K та/або міченого NAD, яке можна легко відслідковувати [див. Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pp. 175-180]. Додатковий приклад забезпечений Blaustein R. (1987), який описує простий in vitro аналіз із використанням мембран на основі плоского подвійного фосфоліпідного шару. Мембрани навантажують тестовою молекулою та необхідну функцію перенесення підтверджують за підвищенням провідності через зазначені мембрани [див. Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: pp. 115120]. Додаткові методики для забезпечення оцінки злиття з мембраною й, отже, виявлення доменів, що забезпечують перенесення, придатних для застосування у даному винаході, 22 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 забезпечені у Methods in Enzymology Vol 220 and 221, Membrane Fusion Techniques, Parts A and B, Academic Press 1993. Даний винахід також охоплює варіантні домени, що забезпечують перенесення, за умови, що варіантні домени усе ще демонструють необхідну активність, пов'язану з перенесенням. У якості прикладу варіант може характеризуватися щонайменше 70%, переважно щонайменше 80%, більш переважно щонайменше 90% та найбільш переважно щонайменше 95% або щонайменше 98% гомології амінокислотної послідовності з еталонним доменом, що забезпечує перенесення. Вираз фрагмент, при використанні у зв'язку з доменом, що забезпечує перенесення, звичайно означає пептид, що включає щонайменше 20, переважно щонайменше 40, більш переважно щонайменше 80 та найбільш переважно щонайменше 100 амінокислотних залишків еталонного домену, що забезпечує перенесення. У випадку клостридіального домену, що забезпечує перенесення, фрагмент переважно включає щонайменше 100, переважно щонайменше 150, більш переважно щонайменше 200 та найбільш переважно щонайменше 250 амінокислотних залишків еталонного домену, що забезпечує перенесення (наприклад, HNдомену). Як і у випадку компонента на основі ”фрагмента” TM (що обговорюється вище), ”фрагменти”, що забезпечують перенесення, за даним винаходом охоплюють фрагменти варіантних доменів, що забезпечують перенесення, на основі еталонних послідовностей. Добре відомо, що певні домени молекул бактеріального токсину здатні утворювати такі пори. Також відомо, що певні домени, що забезпечують перенесення, з білків, що забезпечують злиття з мембраною, які експресуються вірусами, здатні утворювати такі пори. Такі домени можна використовувати у даному винаході. Домен, що забезпечує перенесення, може бути клостридіального походження, наприклад HN-домен (або його функціональний компонент). H N означає частину або фрагмент H-ланцюга клостридіального нейротоксину, приблизно еквівалентний половині, що містить аміно-кінець Hланцюга, або домен, що відповідає такому фрагменту в інтактному H-ланцюгу. У зв'язку з цим, якщо бажано усунути функцію зв'язування HC із клітиною, це можна здійснювати за допомогою видалення амінокислотної послідовності HC або HCC (або на рівні синтезу ДНК, або на постсинтетичному рівні за допомогою обробки нуклеазою або протеазою). В альтернативному випадку функцію HC можна інактивувати за допомогою хімічної або біологічної обробки. Приклади придатних (еталонних) доменів, що забезпечують перенесення, включають наступні: ботулінічний нейротоксин типу A - амінокислотні залишки (449-871); ботулінічний нейротоксин типу B - амінокислотні залишки (441-858); ботулінічний нейротоксин типу C - амінокислотні залишки (442-866), ботулінічний нейротоксин типу D - амінокислотні залишки (446-862); ботулінічний нейротоксин типу E - амінокислотні залишки (423-845); ботулінічний нейротоксин типу F - амінокислотні залишки (440-864); ботулінічний нейротоксин типу G - амінокислотні залишки (442-863); нейротоксин правця - амінокислотні залишки (458-879). Вищезазначену еталонну послідовність слід розглядати як зразок, оскільки можуть виникати незначні варіації відповідно до субсеротипів. У якості прикладу у патентному документі US 2007/0166332 (включеному у даний документ за допомогою посилання на нього) викладені дещо інші клостридіальні послідовності: ботулінічний нейротоксин типу A - амінокислотні залишки (A449-K871), ботулінічний нейротоксин типу B - амінокислотні залишки (A442-S858), ботулінічний нейротоксин типу C - амінокислотні залишки (T450-N866), ботулінічний нейротоксин типу D - амінокислотні залишки (D446-N862), ботулінічний нейротоксин типу E - амінокислотні залишки (K423-K845), ботулінічний нейротоксин типу F - амінокислотні залишки (A440-K864), ботулінічний нейротоксин типу G - амінокислотні залишки (S447-S863), нейротоксин правця - амінокислотні залишки (S458-V879). У контексті даного винаходу ряд HN-ділянок клостридіального токсину, які містять домен, що забезпечує перенесення, можна використовувати в аспектах даного винаходу за умови, що ці активні фрагменти можуть забезпечувати вивільнення нецитотоксичної протеази (наприклад, клостридіального L-ланцюга) із внутрішньоклітинних везикул у цитоплазму клітини-мішені й, отже, брати участь у функціонуванні загального клітинного механізму, за допомогою якого клостридіальний токсин протеолітично розщеплює субстрат. HN-ділянки з важких ланцюгів клостридіальних токсинів мають довжину приблизно 410-430 амінокислот і містять домен, що забезпечує перенесення. За допомогою дослідження продемонстрували, що повна довжина H Nділянки з важкого ланцюга клостридіального токсину не є необхідною для активності, пов'язаної 23 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з перенесенням, домену, що забезпечує перенесення. Таким чином, аспекти даного варіанту здійснення можуть включати HN-ділянки клостридіального токсину, які містять домен, що забезпечує перенесення, який має довжину, наприклад, щонайменше 350 амінокислот, щонайменше 375 амінокислот, щонайменше 400 амінокислот і щонайменше 425 амінокислот. Інші аспекти даного варіанту здійснення можуть включати H N-ділянки клостридіального токсину, які містять домен, що забезпечує перенесення, який має довжину, наприклад, не більш ніж 350 амінокислот, не більш ніж 375 амінокислот, не більш ніж 400 амінокислот і не більш ніж 425 амінокислот. Для додаткових деталей щодо генетичної основи продукування токсинів у Clostridium botulinum і C. tetani слід звернутися до Henderson et al (1997) у The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press. Вираз HN охоплює HN-ділянки нейротоксинів, що зустрічаються в природі, та модифіковані HN-ділянки, що мають амінокислотні послідовності, які не зустрічаються в природі, і/або синтетичні амінокислотні залишки за умови, що модифіковані HN-ділянки усе ще демонструють вищезгадану функцію перенесення. В альтернативному випадку домен, що забезпечує перенесення, може бути неклостридіального походження. Приклади неклостридіального походження (еталонних) доменів, що забезпечують перенесення, без обмеження включають домен, що забезпечує перенесення, дифтерійного токсину [O’Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 62026206; Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532; і London, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pp.25-51], домен, що забезпечує перенесення, з екзотоксину Pseudomonas типу A [Prior et al. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559], домени, що забезпечують перенесення, токсину збудника сибірської виразки [Blanke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 84378442], ряд фузогенних або гідрофобних пептидів із функцією перенесення [Plank et al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924; і Wagner et al (1992) PNAS, 89, pp.7934-7938] та амфіфільні пептиди [Murata et al (1992) Biochem., 31, pp.1986-1992]. Домен, що забезпечує перенесення може відображати домен, що забезпечує перенесення, присутній у білку, який зустрічається в природі, або може включати амінокислотні варіації за умови, що варіації не порушують здатність до перенесення, властиву домену, що забезпечує перенесення. Конкретні приклади вірусних (еталонних) доменів, що забезпечують перенесення, придатних для застосування у даному винаході, включають певні домени, що забезпечують перенесення, з білків, що забезпечують злиття з мембраною, які експресуються вірусами. Наприклад, Wagner et al. (1992) та Murata et al. (1992) описують функцію перенесення (тобто злиття з мембраною та утворення везикул) ряду фузогенних і амфіфільних пептидів, які походять із N-кінцевої ділянки гемаглютиніну вірусу грипу. Інші білки, які забезпечують злиття з мембраною та експресуються вірусами, що, як відомо, мають потрібну активність, пов'язану з перенесенням, являють собою домен, що забезпечує перенесення, фузогенного пептиду вірусу лісу Семлікі (SFV), домен, що забезпечує перенесення, глікопротеїну G вірусу везикулярного стоматиту (VSV), домен, що забезпечує перенесення, білка F вірусу SER і домен, що забезпечує перенесення, глікопротеїну оболонки вірусу пінистості. Білки Aspike, які кодуються вірусами, мають конкретне застосування у контексті даного винаходу, наприклад, білок E1 SFV і білок G, що являє собою білок G VSV. Використання (еталонних) доменів, що забезпечують перенесення, передбачає використання варіантів їх послідовностей. Варіант може містити одну або декілька консервативних нуклеотидних замін і/або делецій або вставок нуклеотидів за умови, що варіант має необхідну функцію перенесення. Варіант також може містити одну або декілька амінокислотних замін і/або делецій або вставок амінокислот за умови, що варіант має необхідну функцію перенесення. Поліпептиди за даним винаходом можуть додатково містити допоміжний домен, що забезпечує перенесення. Зазначений домен забезпечує доставку нецитотоксичної протеази у цитозоль клітини-мішені та описаний, наприклад, у патентних документах WO 08/008803 та WO 08/008805, кожний із яких включений у даний документ за допомогою посилання на нього. У якості прикладу придатні допоміжні домени, що забезпечують перенесення, включають домен фузогенного пептиду вірусу з оболонкою, наприклад, придатні домени фузогенного пептиду включають домен фузогенного пептиду вірусу грипу (наприклад, 23 амінокислотний домен фузогенного пептиду вірусу грипу A), домен фузогенного пептиду альфавірусу (наприклад, 26 амінокислотний домен фузогенного пептиду вірусу лісу Семлікі), домен фузогенного пептиду везикуловірусу (наприклад, 21 амінокислотний домен фузогенного пептиду вірусу везикулярного стоматиту), домен фузогенного пептиду респіраторного вірусу (наприклад, 25 амінокислотний домен фузогенного пептиду вірусу Сендай), домен фузогенного пептиду морбілівірусу (наприклад, 25 амінокислотний домен фузогенного пептиду вірусу чуми собак), домен фузогенного пептиду авулавірусу (наприклад, 25 амінокислотний домен 24 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фузогенного пептиду вірусу хвороби Ньюкасла), домен фузогенного пептиду геніпавірусу (наприклад, 25 амінокислотний домен фузогенного пептиду вірусу Хендра), домен фузогенного пептиду метапневмовірусу (наприклад, 25 амінокислотний домен фузогенного пептиду метапневмовірусу людини) або домен фузогенного пептиду спумавірусу, наприклад, домен фузогенного пептиду вірусу пінистості мавп; або їх фрагменти або варіанти. У якості додаткового прикладу допоміжний домен, що забезпечує перенесення, може містити HCN-домен клостридіального токсину або його фрагмент або варіант. Більш детально, допоміжний HCN-домен, що забезпечує перенесення, клостридіального токсину може мати довжину щонайменше 200 амінокислот, щонайменше 225 амінокислот, щонайменше 250 амінокислот, щонайменше 275 амінокислот. У зв'язку з цим допоміжний H CN-домен, що забезпечує перенесення, клостридіального токсину переважно має довжину не більш ніж 200 амінокислот, не більш ніж 225 амінокислот, не більш ніж 250 амінокислот, або не більш ніж 275 амінокислот. Конкретні (еталонні) приклади включають наступні: ботулінічний нейротоксин типу A - амінокислотні залишки (872-1110); ботулінічний нейротоксин типу B - амінокислотні залишки (859-1097); ботулінічний нейротоксин типу C - амінокислотні залишки (867-1111); ботулінічний нейротоксин типу D - амінокислотні залишки (863-1098); ботулінічний нейротоксин типу E - амінокислотні залишки (846-1085); ботулінічний нейротоксин типу F - амінокислотні залишки (865-1105); ботулінічний нейротоксин типу G - амінокислотні залишки (864-1105); нейротоксин правця - амінокислотні залишки (880-1127). Положення у вищезазначених послідовностях можуть незначною мірою варіювати відповідно до серотипу/підтипу, і додаткові приклади придатних (еталонних) H CN-доменів клостридіального токсину включають ботулінічний нейротоксин типу A - амінокислотні залишки (874-1110); ботулінічний нейротоксин типу B - амінокислотні залишки (861-1097); ботулінічний нейротоксин типу C - амінокислотні залишки (869-1111); ботулінічний нейротоксин типу D - амінокислотні залишки (865-1098); ботулінічний нейротоксин типу E - амінокислотні залишки (848-1085); ботулінічний нейротоксин типу F - амінокислотні залишки (867-1105); ботулінічний нейротоксин типу G - амінокислотні залишки (866-1105); нейротоксин правця - амінокислотні залишки (882-1127). Будь-який із вищеописаних допоміжних доменів можна об'єднати з будь-яким із раніше описаних пептидів на основі домену, що забезпечує перенесення, які є придатними для використання у даному винаході. Таким чином, у якості прикладу неклостридіальний допоміжний домен можна об'єднати з пептидом на основі неклостридіального домену, що забезпечує перенесення, або з пептидом на основі клостридіального домену, що забезпечує перенесення. В альтернативному випадку, допоміжний HCN-домен, що забезпечує перенесення, клостридіального токсину можна об'єднати з пептидом на основі неклостридіального домену, що забезпечує перенесення. В альтернативному випадку, допоміжний H CN-домен клостридіального токсину можна об'єднати з пептидом на основі клостридіального домену, що забезпечує перенесення, приклади якого включають наступні: ботулінічний нейротоксин типу A - амінокислотні залишки (449-1110); ботулінічний нейротоксин типу B - амінокислотні залишки (442-1097); ботулінічний нейротоксин типу C - амінокислотні залишки (450-1111); ботулінічний нейротоксин типу D - амінокислотні залишки (446-1098); ботулінічний нейротоксин типу E - амінокислотні залишки (423-1085); ботулінічний нейротоксин типу F - амінокислотні залишки (440-1105); ботулінічний нейротоксин типу G - амінокислотні залишки (447-1105); нейротоксин правця - амінокислотні залишки (458-1127). Гомологія послідовності Будь-який із ряду способів вирівнювання послідовностей можна застосовувати для визначення процентної ідентичності, у тому числі, без обмеження, способи глобального вирівнювання, способи локального вирівнювання та гібридні способи, такі як, наприклад, способи з сегментним підходом. Протоколи для визначення процентної ідентичності являють собою звичайні методики у межах знань спеціаліста у даній галузі техніки. Глобальні способи забезпечують вирівнювання послідовностей від початку до кінця молекули та визначення найкращого вирівнювання за допомогою складання балів окремих пар залишків і за допомогою накладення штрафів за геп. Необмежувальні способи включають, наприклад, CLUSTAL W, див., наприклад, Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple 25 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); та ітераційне уточнення, див., наприклад, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996). Локальні способи забезпечують вирівнювання послідовностей за допомогою виявлення одного або декількох консервативних мотивів, спільних для всіх із вихідних послідовностей. Необмежувальні способи включають, наприклад, Match-box, див., наприклад, Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992); семплування за Гіббсом, див., наприклад, C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993); Align-M, див., наприклад, Ivo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004). Таким чином, процентну ідентичність послідовностей визначають за допомогою звичайних способів. Див., наприклад, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 і Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992. Коротко, забезпечують вирівнювання двох амінокислотних послідовностей із оптимізацією балів вирівнювання з використанням штрафу за відкриття гепу 10, штрафу за продовження гепу 1 і матриці замін “blosum 62” згідно з Henikoff and Henikoff. По суті, гомологічні поліпептиди характеризуються тим, що мають одну або декілька амінокислотних замін, делецій або приєднань. Ці зміни переважно є незначущими, тобто консервативними амінокислотними замінами (див. нижче) та іншими замінами, які значно не впливають на укладання або активність поліпептиду; невеликі делеції, звичайно від однієї до приблизно 30 амінокислот, і невеликі подовження на аміно- або карбокси-кінці, наприклад, метіоніновий залишок на аміно-кінці, невеликий лінкерний пептид, що містить до приблизно 2025 залишків, або афінна мітка. Консервативні амінокислотні заміни: основні: аргінін, лізин, гістидин; кислотні: глутамінова кислота, аспарагінова кислота; полярні: глутамін, аспарагін; гідрофобні: лейцин, ізолейцин, валін; ароматичні: фенілаланін, триптофан, тирозин; невеликі: гліцин, аланін, серин, треонін, метіонін. Додатково до 20 стандартних амінокислот амінокислотні залишки поліпептидів за даним винаходом можна замінити амінокислотами, що не відносяться до стандартних (наприклад, 4гідроксипролін, 6-N-метиллізин, 2-аміноізомасляна кислота, ізовалін і α-метилсерин). Амінокислотні залишки клостридіального поліпептиду можна замінити обмеженою кількістю неконсервативних амінокислот, амінокислот, які не кодуються генетичним кодом, і амінокислот, які не відносяться до природних. Поліпептиди за даним винаходом також можуть містити амінокислотні залишки, які не зустрічаються в природі. Амінокислоти, які не зустрічаються в природі, без обмеження включають транс-3метилпролін, 2,4-метанопролін, цис-4-гідроксипролін, транс-4-гідроксипролін, N-метилгліцин, алотреонін, метилтреонін, гідроксіетилцистеїн, гідроксіетилгомоцистеїн, нітроглутамін, гомоглутамін, піпеколінова кислота, трет-лейцин, норвалін, 2-азафенілаланін, 3азафенілаланін, 4-азафенілаланін і 4-фторфенілаланін. З рівня техніки відомі декілька способів включення амінокислотних залишків, які не зустрічаються в природі, у білки. Наприклад, можна використовувати in vitro систему, у якій забезпечують супресію нонсенс-мутацій за допомогою хімічно аміноацильованих супресорних тРНК. Способи синтезу амінокислот і аміноацилювання тРНК відомі в даній галузі техніки. Транскрипцію та трансляцію плазмід, що містять нонсенсмутації, здійснюють у безклітинній системі, що містить екстракт E. coli S30 та комерційно доступні ферменти й інші реагенти. Білки очищують за допомогою хроматографії. Див., наприклад, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9, 1993; і Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993. У другому способі трансляцію здійснюють в ооцитах Xenopus за допомогою мікроін'єкції мутованої мРНК та хімічно аміноацильованих супресорних тРНК (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). У третьому способі клітини E. coli культивують за відсутності природної амінокислоти, яку потрібно замінити (наприклад, фенілаланіну), і у присутності необхідної амінокислоти(амінокислот), які не зустрічаються в природі (наприклад, 2азафенілаланін, 3-азафенілаланін, 4-азафенілаланін або 4-фторфенілаланін). Амінокислота, яка не зустрічається в природі, включається у поліпептид замість її природного еквівалента. Див., Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994. Амінокислотні залишки, які зустрічаються в природі, 26 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можна перетворити на різновиди, які не зустрічаються в природі, за допомогою хімічної модифікації in vitro. Хімічну модифікацію можна поєднати з сайт-спрямованим мутагенезом для додаткового розширення діапазону замін (Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993). Амінокислотні залишки поліпептидів за даним винаходом можна замінити обмеженою кількістю неконсервативних амінокислот, амінокислот, які не кодуються генетичним кодом, амінокислот, які не зустрічаються в природі, та амінокислот, які не відносяться до природних. Незамінні амінокислоти у поліпептидах за даним винаходом можна виявляти згідно з методиками, відомими з рівня техніки, такими як сайт-спрямований мутагенез або мутагенез зі скануванням аланіном (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Ділянки, які беруть участь у біологічній взаємодії, також можна визначити за допомогою фізичного аналізу структури, що визначається за допомогою таких методик, як ядерний магнітний резонанс, кристалографія, електронографія або фотоафінне мічення, у поєднанні з мутацією по амінокислотам гіпотетичної ділянки контакту. Див., наприклад, de Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Ідентичність незамінних амінокислот також можна одержати з аналізу гомології зі спорідненими компонентами (наприклад, компоненти, що забезпечують перенесення, або протеазні компоненти) поліпептидів за даним винаходом. Ряд амінокислотних замін можна забезпечити та дослідити за допомогою відомих способів мутагенезу та скринінгу, наприклад, таких, які розкрито у Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988) або Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989). Коротко, ці автори розкривають способи випадкового вибору одночасно двох або більше положень у поліпептиді, добору функціонального поліпептиду та подальшого секвенування поліпептидів, що містять мутацію, з визначенням спектра допустимих замін за кожним положенням. Інші способи, які можна застосовувати, включають фаговий дисплей (наприклад, Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991; патент США № 5223409, виданий Ladner et al.; публікація міжнародної заявки WO 92/06204, заявник Huse) та сайт-спрямований мутагенез (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988). Ряд амінокислотних замін можна забезпечити та дослідити за допомогою відомих способів мутагенезу та скринінгу, наприклад, таких, які розкрито у Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988) або Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989). Коротко, ці автори розкривають способи випадкового вибору одночасно двох або більше положень у поліпептиді, добору функціонального поліпептиду та подальшого секвенування поліпептидів, що містять мутацію, з визначенням спектра допустимих замін за кожним положенням. Інші способи, які можна застосовувати, включають фаговий дисплей (наприклад, Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991; патент США № 5223409, виданий Ladner et al.; публікація міжнародної заявки WO 92/06204, заявник Huse) та сайт-спрямований мутагенез (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988). Короткий опис прикладів Приклад 1. Створення білка LHD, який містить поліпептид GnRH на С-кінці HN-домену. Приклад 2. Створення білка LHA, який містить поліпептид GnRH на С-кінці HN-домену. Приклад 3. Створення білка LHD, який містить поліпептид GnRH на С-кінці HN-домену, де містяться дві різні ділянки для розпізнавання протеазою. Приклад 4. Спосіб одержання білка LHD, який містить поліпептид GnRH на С-кінці HNдомену. Приклад 5. Демонстрація присутності ковалентно приєднаного ліганду за допомогою вестерн-блотингу. Приклад 6. Демонстрація присутності ковалентно приєднаної TM за допомогою масспектрометрії. Приклад 7. Оцінка зв'язувальної здатності білка LHD, який містить поліпептид GnRH. Приклад 8. Оцінка in vitro функціональності білка LHD, який містить поліпептид GnRH. Приклад 9. Створення білка LHD, який містить динорфіновий і брадикініновий поліпептид на С-кінці HN-домену. Приклад 10. Створення білка LHA, який містить бета-ендорфіновий і брадикініновий поліпептид на С-кінці HN-домену. Приклад 11. Створення білка LHD, який містить два поліпептиди GHRH на С-кінці HNдомену. Приклад 12. Створення білка LHD, який містить поліпептид GnRH на С-кінці HN-домену, відокремлений 5 амінокислотами від ділянки для активації другою протеазою. Приклад 13. Створення білка LHA, який містить гастрин-рилізинг пептид на С-кінці HNдомену. 27 UA 112985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 14. Спосіб лікування пацієнтів, які страждають від раку простати. Приклад 15. Спосіб лікування пацієнтів, які страждають від нейрогенного запалення. Приклад 16. Спосіб лікування пацієнтів, які страждають від ендометріозу. Короткий опис фігур На фігурі 1 проілюстровано аналіз активованих зразків за допомогою SDS-PAGE (електрофорез у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію) (елюйованих 80 мМ + 250 мМ імідазольними фракціями) із прикладу 4 у відновних та невідновних умовах. Короткий опис SEQ ID NO Із всіх наступних SEQ ID NO можна виключити будь-який перший метіоніновий амінокислотний залишок (або відповідний кодон/послідовність нуклеїнової кислоти на N-кінці). SEQ ID 1 послідовність ДНК LHD-GnRH. SEQ ID 2 послідовність білка LHD-GnRH. SEQ ID 3 послідовність ДНК LHA-GnRH. SEQ ID 4 послідовність білка LHA-GnRH. SEQ ID 5 послідовність ДНК LHD-GnRH із двома різними ділянками для протеази. SEQ ID 6 послідовність білка LHD-GnRH із двома різними ділянками для протеази. SEQ ID 7 послідовність ДНК LHD, який містить динорфіновий і брадикініновий поліпептид на С-кінці HN-домену. SEQ ID 8 послідовність білка LHD, який містить динорфіновий і брадикініновий поліпептид на С-кінці HN-домену. SEQ ID 9 послідовність ДНК LHA, який містить бета-ендорфіновий і брадикініновий поліпептид на С-кінці HN-домену. SEQ ID 10 послідовність білка LHA, який містить бета-ендорфіновий і брадикініновий поліпептид на С-кінці HN-домену. SEQ ID 11 послідовність ДНК LHD, який містить два поліпептиди GHRH на С-кінці HNдомену. SEQ ID 12 послідовність білка LHD, який містить два поліпептиди GHRH на С-кінці HNдомену. SEQ ID 13 послідовність ДНК LHD, який містить GnRH на С-кінці HN-домену. SEQ ID 14 послідовність білка LHD, який містить GnRH на С-кінці HN-домену. SEQ ID 15 послідовність ДНК LHA, який містить гастрин-рилізинг пептид на С-кінці HNдомену. SEQ ID 16 послідовність білка LHA, який містить гастрин-рилізинг пептид на С-кінці HNдомену. Далі представлено опис конкретних варіантів здійснення за даним винаходом, проілюстрованих прикладами. Приклад 1. Створення білка LHD, який містить поліпептид GnRH на С-кінці HN-домену Первинну послідовність химерного білка, яку конструювали за допомогою злиття з використанням методик генної інженерії LHN-фрагмента BoNT/D та 10 амінокислотного пептиду GnRH, перевіряли на присутність амінокислотних рядків, які мають схожість із ділянкоюпрототипом для розпізнавання фактором Xa (IEGR). Якщо такий рядок не було знайдено, вибирали FXa для використання у якості протеази як для активації гібридного білка у місці з'єднання LC-HN, так і для розщеплення пептидного зв'язку між HN і TM (GnRH). ДНК, оптимізовану для експресії в E. coli, одержували від комерційного постачальника Entelechon (Німеччина), причому вона кодує гібридний білок, який має наступну структуру від Nдо С-кінця: - N-кінцева мітка для очищення, що складається з 10 His; - спейсер із 10 аспарагінових амінокислот; - LC BoNT/D; - міждоменний лінкер із первинною послідовністю, подібною до виявленої у BoNT/A, модифікований із включенням тетрапептиду IEGR, який являє собою субстрат для FXa; - HN BoNT/D, модифікований із включенням Cys на C-кінці; - спейсер Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, що містить послідовність пептиду IEGR на C-кінці; - 10 амінокислотний пептид GnRH, модифікований із включенням залишка Cys у положенні 6 замість природного Gly (QHWSYCLRPG). Частоту використання кодонів E. coli оцінювали за допомогою програмного забезпечення, такого як Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), а також % вмісту GC та співвідношення частоти використання кодонів оцінювали за допомогою опублікованих таблиць частоти використання кодонів (наприклад, GenBank, версія 143, 13 вересня 2004 р.) для гарантії того, що це конструювання не приведе до низького рівня використання кодонів. ДНК вбудовували у 28