Гібридний білок cfp10-esat6, який індукує реакцію гіперчутливості уповільненого типу відносно m. tuberculosis, химерна нуклеїнова кислота, яка кодує його, і рекомбінантний плазмідний експресуючий вектор, який

1. Химерна нуклеїнова кислота, яка кодує гібридний білок CFP10-ESAT6 з М. tuberculosis, що індукує реакцію гіперчутливості уповільненого типу відносно M. tuberculosis і первинна структура якого описується амінокислотною послідовністю SEQ ID №1. 2. Химерна нуклеїнова кислота за п. 1, яка має 2 (19) 1 3 Винахід належить до галузі медицини, фармакології і біотехнології, конкретно до нового діагностикуму у вигляді дозованої лікарської форми для внутрішньошкірного введення, що дозволяє здійснити діагностику туберкульозного процесу, нового гібридного білка CFP10-ESAT6, який отримується за допомогою нової рекомбінантної плазмідної ДНК. Дослідження, проведені Всесвітньою організацією охорони здоров'я (ВОЗ), показали, що проблема туберкульозу (ТБ) як і раніше стоїть надзвичайно гостро, про що свідчить рівень інфікованості населення земної кулі, який складає понад 1 мільярда людей. Близько 8 мільйонів людей захворюють на туберкульоз кожний рік. При цьому 44% хворіють легеневою формою цього захворювання. Близько 2 млн. людей вмирає щорічно, що становить 23% смертельних випадків в світовому масштабі і перевищує 50% летальності в Африканських країнах (Dye С, Scheele S, Dolin P, Pathania V and Ravinglione MC, 1999, JAMA, 282, 7, 677-686). Для контролю за поширенням ТБ і значного зниження ризику поширення цього захворювання необхідно, в тому числі, створення ефективних реагентів для специфічної діагностики. Базовим методом виявлення туберкульозної інфекції багато років є реакція Манту. У основі цього методу лежить визначення гіперчутливості уповільненого типу відносно антигенних детермінант мікобактерій. Реагент для постановки шкірної проби являє собою сумарний екстракт антигенів з Mycobacterium bovis, що зумовлює дуже низький рівень специфічності реакції Манту. Позитивна проба не виявляє відмінностей між активною формою захворювання, попередньою сенсибілізацією в результаті контакту з M.tuberculosis, БЦЖ (BCG) вакцинацією або перехресною сенсибілізацією іншими видами мікобактерій. Більш того антигенні компоненти проби не стандартизовані і тому проби з різних джерел можуть розрізнюватися по шкірній реакції (Mustafa AS, T-cell subsets and cytokines interplay in infectious diseases, pp. 201-211). Таким чином, склалася настійна необхідність ідентифікувати антигени M.tuberculosis, які можуть стати кандидатами для виробництва поліпшених вакцин з універсальною ефективністю і специфічних діагностичних реагентів для детекції ТБ. Розвиток біотехнології, зокрема, використання технологій ДНК клонування і експресії, значно полегшив ідентифікацію декількох основних антигенів M.tuberculosis. На основі деяких з ідентифікованих антигенів M.tuberculosis (в основному це білки "теплового шоку", такі як hsp18, hsp60, hsp70 і секретовані білки-антигени) були розроблені методи діагностики гіперчутливості уповільненого типу (ГУТ) (див., наприклад, патент US 6458366, «Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods of their use», патент WO 0021983 «ТВ vaccine and diagnostic based on antigens from M.tuberculosis cell», патент US 6120776 «Diagnostic skin test for tuberculosis»). 92822 4 Спільним недоліком цих підходів є відсутність повної специфічності білкових, поліпептидних в тому числі, гібридних реагентів, що використовуються відносно M.tuberculosis, оскільки подібні білки-поліпептиди є в штамах інших мікобактерій і у вакцинному штамі БЦЖ. У разі наявності останньої обставини, розроблені підходи не придатні для диференціальної діагностики інфекційного імунітету від поствакцинального. У останні роки в результаті порівняльного аналізу геномів різних мікобактерій було встановлено, що M.tuberculosis забезпечує синтез двох секреторних білків ESAT6 і CFP10, які відсутні у M.Bovis і більшості непатогенних бактерій (Mustafa A.S., 2001, Carrent Pharmaceutical Biotechnology, 2, 157-173). На основі тільки пептидів білка ESAT6 була створена специфічна діагностична система, що дозволяє упевнено диференціювати гіперчутливість уповільненого типу (ГУТ) поствакцинального походження і ГУТ, що з'являється при інфікуванні M.tuberculosis (патент WO 00262248 «Tuberculosis diagnostic test»). На основі цього діагностикуму був розроблений метод діагностики туберкульозної інфекції шляхом індукції реакції гіперчутливості уповільненого типу інкубацією Т-лімфоцитів переважно периферичної крові пацієнта в умовах in vitro зі сумішшю вказаних вище антигенів. У разі позитивної реакції за допомогою чутливих імунологічних методів фіксувався підвищений рівень синтезу інтерферону. Однак відомий спосіб дуже складний в постановці, вимагає обладнання, що дорого коштує, і реагентів, а тому не придатний для масового застосування як скринінгового методу. У зв'язку з чим, авторами винаходу, що пропонується в даній заявці, був сконструйований неприродний гібридний білок, що містить антигенні детермінанти двох секреторних білків ESAT-6 (early secreted antigenic target) i CFP-10 (culture filtrate protein) M. tuberculosis, які відсутні у М. bovis і більшості непатогенних мікобактерій (патент РФ №2277540 «Спосіб діагностики туберкульозної інфекції, рекомбінантна плазмідна ДНК, що кодує синтез гібридного CFP10-ESAT6 з Mycobacterium tuberculosis, спосіб його отримання, гібридний білок CFP10-ESAT6 і його застосування» - прийнятий за прототип). При цьому вдалося експресувати гібридний білок в клітинах кишкової палички і отримати його в очищеному вигляді, придатному для встановлення шкірної проби. За допомогою цього поліпептиду вдається диференціювати інфекційний імунітет і імунні реакції, які розвиваються в результаті вакцинації. Однак на стадії передклінічних досліджень цього рекомбінантного білка була встановлена його підвищена неспецифічна імуногенність, в зв'язку з чим точність діагностики була не завжди задовільною, крім того, вихід білка був не достатньо високий, що ускладнювало процес отримання кінцевого чистого продукту. Задачею даного винаходу є усунення вказаних 5 недоліків, а саме, підвищення точності і функціональних можливостей діагностики туберкульозної інфекції, збільшення економічних показників у отримуваного діагностикуму. Мета досягається запропонованою сукупністю істотних ознак взаємопов'язаної групи винаходів. Так, сконструйована химерна нуклеїнова кислота (НК), що кодує гібридний білок CFP10-ESAT6 з М. tuberculosis, що індукує реакцію гіперчутливості уповільненого типу відносно М. tuberculosis, первинна структура якого описується амінокислотною послідовністю SEQ ID №1 (приведена в переліку послідовностей). Химерна НК може мати наступну нуклеотидну послідовність (SEQ ID №2) (приведена в переліку послідовностей) або аналогічну послідовність з урахуванням виродженості генетичного коду. Найбільш переважним способом отримання химерної НК є окрема зборка генів Cfp 10: CFP_F1, CFP_F2, CFP_F3, CFP_F4, CFP_R1, CFP_R2, CFP_R3, CFP_R4; Esat6: ESAT_F1, ESAT_F2, ESAT_F3, ESAT_F4, ESAT_R1, ESAT_R2, ESAT_R3, ESAT_R4 в реакції ПЛР з синтетичних олігонуклеотидів і клонуванням їх у векторі pGEM5Z по сайту EcoRV. Пропонується також рекомбінантний вектор експресії pET_Cfp_Esat, який містить химерну НК, що кодує поліпептид CFP10-ESAT6 з амінокислотною послідовністю SEQ ID №1, оперативно вбудовану в плазміду рЕТ22b(+) по сайтах рестрикції NdeI і Not І. Даний винахід також належить до способу отримання гібридного білка CFP10-ESAT6 для діагностики туберкульозної інфекції, що включає культивування штаму Е. соlі, трансформованого рекомбінантним вектором експресії, руйнування клітин штаму в буферному розчині ультразвуком і виділення білка з очищених тілець включення і з промивання тілець включення методом лігандообмінної хроматографії, відмінністю якого є те, що як рекомбінантний вектор експресії використовують описаний вище плазмідний рекомбінантний вектор pET_Cfp_Esat, яким трансформують клітини штаму BL21(DE3) Е. соlі. Даний винахід також належить до гібридного білка CFP10-ESAT6 з M.tuberculosis для діагностики туберкульозної інфекції, первинна структура якого описується амінокислотною послідовністю SEQ ID №1 і, переважно, отриманого вищезгаданим способом. Даний винахід також належить до дозованої лікарської форми для діагностики туберкульозної інфекції, яка являє собою ін'єкційний розчин для внутрішньошкірного введення, що містить гібридний білок CFP10-ESAT6 з М. tuberculosis, відмінністю якої є використання як гібридного білка, описаного вище, в дозі 0,2мкг в 0,1мл фізіологічного розчину на одне введення. Сукупність істотних ознак групи винаходів не відома з попереднього рівня техніки, і була встановлена дослідним шляхом і неочевидним чином пов'язана з технічним результатом, що досягається. Суть винаходу пояснюється за допомогою графічних матеріалів: 92822 6 Фіг. 1 містить порівняльний аналіз експресії гібридного білка CFP-10-ESAT-6 у векторних системах pTBD16 і рЕТ-22b. Електрофорез сумарних білків Е. соlі, які несуть плазміду pTBD16 (№2) і рЕТ-22b (№3) здійснений після двогодинної індукції ІПТГ; №1 - маркери молекулярної ваги. Фіг. 2 містить порівняльний аналіз ефективності хелатної хроматографії білків CFP-ESAT з N- і С-кінцевою локалізацією полігістидинів. Електрофорез гібридного білка отриманого методом хелатної хроматографії біомаси клітин Е. соlі, які несуть плазміду: №1 - рЕТ-22b (С-кінцева локалізація полігістидинів) №2 - pTBD16 (N-кінцева локалізація полігістидинів) Здійснення винаходу Винахід ілюструється наступними прикладами. Приклад 1 Конструювання рекомбінантного вектора для експресії гібридного білка CFP10-ESAT6 RD1 комплексу М. tuberculosis. Виявлені заміни в нуклеотидній структурі гібридного білка CFP10-ESAT6 по прототипу. При аналізі нуклеотидної послідовності гібридного гена Cfp10-Esat6, клонованого в плазміді pTBD16 (патент РФ № 2277540), виявлено декілька значних нуклеотидних замін (з природним сиквенсом гена Cfp10 можна ознайомитися в базі даних Pub Med по посиланню: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?term=CF P10&cmd=Search&db=nuccor e&QueryKey=1 гeнa Esat 6: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?term=ES AT%206&cmd=:Search&db=nuccore&QueryKey=4). Ці заміни показані жирним шрифтом і курсивом, відповідні ділянки правильної послідовності підкреслені, подвійною рамкою - кодони в місці зчленування генів (SEQ ID №3) (приведена в переліку послідовностей). Гени Cfp10 і Esat6 за винаходом, що пропонується, збирали в ПЛР з синтетичних олігонуклеотидів. Отримані гени окремо клонували у вектор pGEM5Z по сайту EcoRV. CFP_F1_Nde atccatatggcagagatgaagaccgatgccgctaccctcgcgcagga ggcaggt CFP_F2 ctcgcgcaggaggcaggtaatttcgagcggatctccggcgacctgaaa acccagatc CFP_F3 acctgaaaacccagatcgaccaggtggagtcgacggcaggttcgttgc agggccag CFP_F4aggttcgttgcagggccagtggcgcggcgcggcggg gacggccgcccaggccgcgg CFP_R1 cttctgcttattggctgcttcttggaagcgcaccaccgcggcctgggcggc cgtc CFP_R2 ctgacgaatattcgtcgagatctcgtcgagttcctgcttctgcttattggctg c CFP_R3 gctgctcctcgtcggccctcgagtattggacgccggcctgacgaatattc gtcgag CFP_R4_Bam 7 92822 atcggatccacctccgaagcccatttgcgaggacagcgcctgctgctgc tcctcgtcggc ESAT_F1_Bgl atcagatctacagagcagcagtggaatttcgcgggtatcgaggccgcg gcaagcgcaatc ESAT_F2 gccgcggcaagcgcaatccagggaaatgtcacgtccattcattccctcc ttgacgag ESAT_F3 cattccctccttgacgaggggaagcagtccctgaccaagctcgcagcg gcctggggcggtag ESAT_F4 agcggcctggggcggtagcggttcggaggcgtaccagggtgtccagc aaaaatg ESAT_R1 ctgcagcgcgttgttcagctcggtagccgtggcgtcccatttttgctggaca ccctg ESAT_R2 cattgcctgaccggcttcgctgatcgtccgcgccaggttctgcagcgcgtt gttcagc ESAT_R3 ccgctgcgaacatcccagtgacgttgccttcggtcgaagccattgcctga ccggcttc ESAT_R4_Not atcgcggccgctgcgaacatcccagtg Рекомбінантні клони відбирали в ПЛР (з використанням зовнішніх праймерів М13), безпомилковість послідовності генів Cfp10 і Esat6 у векторах pGEM_Esat і pGEM_Cfp підтверджували сиквенуванням по Сенгеру з універсальних праймерів 8 плазмідної ДНК відібраних клонів. Вектор pGEM_Esat гідролізували по сайтах Bgl II, Sac I, отриманий фрагмент клонували по сайтах Sac І і Ват НІ у вектор pGEM_Cfp. Рекомбінанти злитого білка (pGEM_Cfp_Esat) відбирали в ПЛР (з використанням зовнішніх праймерів М13). Плазмідну ДНК з відібраних клонів обробляли Ndel, Not І і вбудовували отриманий фрагмент у вектор рЕТ22b(+) по тим же сайтах (повністю послідовність рЕТ22b(+), її карту і дуже докладний опис ділянки клонування/експресія можна знайти на сайті: http://www.emdbiosciences.com/html/NVG/home.html ). Відбирали рекомбінанти і сиквенували гібридний ген по Сенгеру. Таким чином, в результаті конструювання, відбору і сиквенування отримали експресійну конструкцію pET_Cfp_Esat; послідовності злитого білка CFP_ESAT і гібридного гена Cfp_Esat показані нижче (жирним шрифтом відмічені лінкер GGGS і С-кінцева послідовність AAALEHHHHHH: (SEQ ID №1, SEQ ID №2, відповідно). Як випливає з приведеної нуклеотидної і амінокислотної послідовностей, в складі нової версії гібридного білка відсутня послідовність ентерокіназного сайта (її видалення, як виявилося приводило до зникнення запальної реакції, що показано в Таблиці 1), а полігістидиновий кластер розташований на С-кінці рекомбінантного білка. Таблиця 1 Тестування діагностичного реагента на основі гібридного білка (ГБ) для визначення неспецифічної запальної реакції** Дозування (мкг) 0,05 0,1 0,5 1 5 Діаметр еритеми після внутрішньошкірного введения (мм) ГБ+Flag* ГБ 0 0 2,0±1,0 0 3,0±1,3 0 3,5±1,5 0 4,5±1,6 0 ГБ+Flag* - білок, який містить послідовність ентерокіназного сайта. ** Як моделі використовували здорових морських свинок. У вибриту ділянку шкіри експериментальним тваринам вводили внутрішньошкірно по 0,05; 0,1; 0,5; 1 і 5мкг антигенів в 0,1мл PBS. Через 24 години оцінювали діаметр еритеми. Конструкцією pET_Cfp_Esat (pET-22b) трансформували клітини BL21(DE3) і з трансформантів відбирали клони по рівню біосинтезу цільового білка. З метою отримання максимального виходу цільового білка, підбирали часові умови індукції. SDS-PAAG аналіз клона з максимальною продукцією CFP-ESAT представлений в Прикладі 2. Приклад 2 Отримання гібридного білка ESAT6-CFP10. 2.1 Індукція синтезу білка. Отримували нічні культури BL21(DE3) E.coli, які несуть плазміду рЕТ-22b (pET_Cfp_Esat). Нічні культури засівали 1:100 в LB-aгapi і вирощували на шейкері при 37 °С до OD600=0,4. Потім вносили IPTG до 0,5мМ і продовжували інкубацію протягом 3 годин. Синтез цільового білка контролювали за допомогою ПААГелектрофорезу, зіставляючи спектр білків до і після індукції. Спостерігали синтез білка очікуваного розміру: 27 kD (відповідає даним Berthet, et al., 1998 Про рухомість CFP10 і ESAT6 в ПААЕЕ). 2.2 Порівняльний аналіз експресії CFP10ESAT6 у векторних системах pTBD16 i pET-22b. Клітини E.coli, що містять плазмідні ДНК pTBD16 і pET-22b з вбудованими генами, вирощували в стандартних умовах до оптичної густини 0,5-0,6, потім в культуральне середовище вносили IPTG як індуктор експресії генів. Після двох годин інкубації бактерійні клітини лізували і білковий склад аналізували в поліакриламідному гелі. Результати даних експериментів поданіна Фіг. 2. Як випливає з приведених даних, рівень синтезу цільового білка в клітинах E.coli, що містять плазмі 9 ду рЕТ-22b з геном Cfp-Esat, значно перевищує такий в клітинах, які несуть плазміду pTBD16. 2.3 Порівняльний аналіз ефективності хелатної хроматографії білків CFP-ESAT з N- і Скінцевою локалізацією полігістидинів. Експериментальні дані приведені на малюнку (Фіг. 2). Для хроматографічного очищення цільового білка CFP-ESAT використовували лізати двох штамів E.coli, що містять приблизно однакову кількість гібридного білка і рекомбінантні плазміди pTBD16 і рЕТ-22b, в яких полігістидиновий кластер мав N-кінцеву локалізацію у випадку (pTBD16) і Скінцеву локалізацію у випадку (рЕТ-22b). Після проведення хроматографії і елюції сорбованого на хелатному носії білка проводили електрофоретичний аналіз зібраного матеріалу. Як видно з представленого малюнка, вихід цільового продукту значно вищий у разі С-кінцевої локалізації полігістидинів. 2.4 Технологія виділення білка CFP10-ESAT6. Протокол виділення рекомбінантного білка CFP10-ESAT6 з біомаси штаму-продуцента E.coli методом лігандообмінної хроматографії. Буферні розчини. A. 0,1М Тріс-НСl буфер, 6М гуанідинхлорид, рН 8,0. B. 0,02М Тріс-НСl, 0,3М NaCl, 2мМ PMSF, рН 8,0. С 0,05М Тріс-НСl буфер, 6М сечовини, 0,4М NaCl і 0,02М імідазолу, рН 8,0. D. 0,05М Тріс-НСl буфер, 6М сечовини, 0,4М NaCl і 0,3М імідазолу, рН 8,0. E. 0,05М Тріс-НСl буфер, 6М сечовини і 0,4М NaCl, рН 8,0. F. 0,1М Тріс-НСl буфер, 0,5М NaCl і 2мМ ЕДТА, рН 8,0. G. 0,01М Тріс-НСl буфер, 0,15М NaCl, рН 8,0. Підготовка сорбенту до роботи. 1мл комерційної імінодіацетат-сефарози Chelating Sepharose CL-6B (Amersham Pharmacia Biotech) вміщують в Column Linbro Plastics колонку (ICN, каталожний номер 158690) і відмивають від консерванту (20%-ний етанол) 10мл деіонізованої води (тут і далі всі процеси на колонці проходять самопливом). Потім через колонку пропускають 2мл розчину (10мг/мл) NiSO4 7H2O (ДержСТ 446574), після чого сорбент промивають 10мл деіонізованої води і врівноважують колонку 5мл буфера А. Колонка використовується для виділення білка з 150мл біомаси. Отримання тілець включення. 1. До вологої біомаси з 150мл культурального середовища додають 5мл буфера В, гомогенізують ультразвуком протягом 1хв. (22-23кГц, 100Вт), гомогенат розливають по 1,5мл пластикових пробірках типу "Eppendorf" і центрифугують при 10000об/хв. 10хв. на настільній центрифузі "Eppendorf C5415" або аналогічній. Супернатант збирають окремо. 92822 10 2. Осад суспендують в 3мл буфера В без PMSF і знов центрифугують при 14000об/хв. (30хв., +4°С) на центрифузі "Eppendorf MiniSpin" або аналогічній. Процедуру промивання осаду повторюють 5 разів. Відмиті тільця включення ретельно відділяють від супернатанту і зберігають при - 30°С. Виділення білка з тілець включення. 1. Осад тілець включення з 150мл культурального середовища розчиняють в 5мл буфера А при перемішуванні на магнітній мішалці протягом 2 год. при кімнатній температурі. Розчин центрифугують при 14000об/хв. (20хв., +20°С) на "центрифузі Eppendorf MiniSpin", осад відкидають, супернатант використовують для отримання рекомбінантного білка CFP10-ESAT6.) 2. Супернатант з п. 1. наносять на колонку з 1мл підготовленого сорбенту за допомогою автоматичної піпетки "Ленпіпет". 3. Колонку промивають 10мл буфера А, потім 10мл буфера С, наносячи розчини на колонку за допомогою автоматичної піпетки "Ленпіпет" порціями по 2мл, не даючи сорбенту просохти. 4. Білок елююють 5мл буфера D в пеніциліновий флакон на 10мл. 5. Елюат розбавляють 5мл буфера Е, потім діалізують (18 год., +40°С) спочатку проти 1л буфера F, потім двічі проти 1л буфера G (2 18 год., +4°С). 6. Діалізат центрифугують при 4000 g (30 хв., +4 °С), осад відкидають, до супернатанту додають азид натрію до 0,02% і зберігають при +4°С.) 7. У супернатанті вимірюють концентрацію білка методом ВСА (калібрування по бичачому сироватковому альбуміну), чистоту білка визначають з допомогою електрофорезу по Леммі в 13%-ному ПААГ. Виділення рекомбінантного білка CFP10ESAT6 з промивання тілець включення. Всі промивання тілець включення розбавляють в 2 рази буфером А, центрифугують при 14000об/хв. (20хв., +20°С) на "центрифузі Eppendorf MiniSpin", осад відкидають, супернатант використовують для отримання рекомбінантного білка CFP10-ESAT6, починаючи з п. 2. Далі по методиці. Дані про чистоту отриманого продукту приведені на електрофореграмі білка в 13%-ному ПААЕ по Леммі (Фіг. 1) Приклад 3 Клінічні випробування шкірного тесту на пацієнтах з різними формами туберкульозної інфекції. Вивчення побічних реакцій і оптимізація дози (Дозволи Міністерства охорони здоров'я і соціального розвитку РФ №480 від 15 грудня 2006 року, №221 від 29 травня 2007 року, №412 від 17 жовтня 2007 року). Усього досліджено 55 чоловік (див. Табл. 2-5). З них здорових - 20 чоловік, хворих на туберкульоз - 35 чоловік. 11 92822 12 Таблиця 2 Результати клінічних досліджень препарату «Діаскінтест» і ППД-Л 2ТЕ на добровольцях (40 чоловік) Всього Здорові Хворі ТБ (без дисемінації) ППД-Л 2ТЕ 8 - негат. 1 - сумніви. 11 - сл.+(5-9мм) 3 - негат. 1 - сл.+ 13 - позит. 3 - не проводили 20 20 Діаскінтест 18 - негат. 2* - позит. 13 - негат. 7 - позит. * Працівники Цніітуб і МосЦентру по боротьбі з туберкульозом (17 і 13мм) Таблиця 3 Доза 0,1мкг в 0,1мл фізіологічного розчину (20 чоловік) Здорові Хворі ТБ (без дисемінації) Всього 10 ППД-Л 2ТЕ 10 10 - позит. на момент дослідження Діаскінтест 10 - негат. 7 - негат. 3 - ++ (17,7мм) Таблиця 4 Доза 0,2мкг в 0,1мл фізіологічного розчину (20 чоловік) Всього Здорові 10 Хворі ТБ (без дисемінації) 10 ППД-Л 2ТЕ 2 - негат. 8-++ Діаскінтест 8 - негат. 2* - позит. 6 - негат. 4 - позит. * Працівники Цніітуб і МосЦентру по боротьбі з туберкульозом (17 і 13мм) Висновок Вивчення безпеки і реактогенності «Діаскінтесту» на 40 добровольцях (20 здорових і 20 хворих на туберкульоз легень) показало відсутність гіперергічних, незвичайних, а також побічних системних і місцевих реакцій на препарат, як в дозі 0,1мкг, так в дозі 0,2мкг в 0,1мл фізіологічного розчину. Препарат не викликає позитивних реакцій у здорових людей. Позитивна реакція на «Діаскін тест» у хворих на туберкульоз легень вказує на незавершеність туберкульозного процесу, і про можливе інфікування практично здорових, або про латентний туберкульоз. Визначення оптимальної дози препарату «Діаскінтест»: результати дослідження проби з «Діаскінтестом» у хворих на туберкульоз легень в Московському Міському Центрі (15 чоловік). 13 92822 14 Таблиця 5 Результати реакцій на «Діаскінтест» в дозі 0,1мкг; 0,2мкг в 0,1мл фізіологічного розчину і проби Манту у хворих на туберкульоз легень Код хворого 011 012 013 014 015 002 005 007 009 010 001 003 004 006 008 Результат реакції Манту (негаРезультат реакції на «Діасікнтест» тивна, позитивна, розмір папу- (негативна, позитивна, розмір папули ли в мм) в мм) 1 група (маніфестні форми туберкульозу легень) 0,1мкг в 0,1мл Негативна 12 0,1мкг в 0,1мл 12 12 0,1мкг в 0,1мл 10 14 0,1мкг в 0,1мл Негативна Негативна 0,1мкг в 0,1мл 18 10 2 група (маніфестні форми туберкульозу легень) 0,2мкг в 0,1мл 17 14 0,2мкг в 0,1мл Негативна 10 0,2мкг в 0,1мл 10 15 0,2мкг в 0,1мл 10 10 0,2мкг в 0,1мл 10 15 3 група (туберкульоз легень в фазі стабілізації і вирішення процесу) 0,2мкг в 0,1мл 10 12 0,2мкг в 0,1мл 9 Негативна 0,2мкг в 0,1мл 10 9 0,2мкг в 0,1мл 12 Негативна 0,2мкг в 0,1мл 5 Негативна Доза «Діаскінтесту» Таблиця 6 Результати проби с «Діаскінтестом» в дозі 0,2мкг в 0,1мл фізіологічного розчину, Манту (2ТЕ ППД-Л) в залежності від активності туберкульозного процесу Активність туберкульозу легень за даними клініколабораторних і рентгенологічних досліджень (10 чоловік) «Діаскінтест»/2Т Е ППД-Л Активний процес 7 чоловік Не активний процес 3 людини 7/6 0/1 0/3 3/0 Реакція є Реакції немає Для «Діаскінтест» в дозі 0,2мкг характерні максимальна чутливість тесту (100%) і специфічність (100%). Відповідно, прогностична цінність позитивного результату тесту і прогностична цінність негативного результату тесту виявилися максимальними (1,0). У той же час чутливість тесту - проби Манту (2ТЕ ППД-Л) становила 0,875, а прогностична цінність позитивного тесту - 0,67. Висновок Вивчення реактогенності «Діаскінтесту» у 15 хворих на туберкульоз легень показало відсутність гіперергічних, незвичайних, а також побічних системних і місцевих реакцій на препарат, як в дозі 0,1мкг, так в дозі 0,2мкг в 0,1мл фізіологічного розчину. В результаті зіставлення даних, отриманих в дозі 0,1мкг і 0,2мкг «Діаскінтесту» і результатів проби Манту 2ТЕ ППД-Л, встановлена більш висо ка специфічна активність «Діаскінтесту» в дозі 0,2мкг в 0,1мл фізіологічного розчину. Результати дослідження свідчать про те, що позитивна реакція на «Діаскінтест» в дозі 0,2мкг спостерігається у хворих з активним туберкульозом легень, а негативна - у хворих із завершеним (по клініко-рентгенологічних і лабораторних показниках) туберкульозним процесом. При виключенні систематичних і випадкових помилок для «Діаскінтесту» в дозі 0,2мкг в 0,1мл характерна максимально висока (1,0) прогностична цінність позитивного і негативного результатів тесту. У той же час за результатами дослідження прогностична цінність позитивного результату проби Манту (2ТЕ ППД-Л) становила 0,67. Інтерпретація результатів. 15 92822 16 Таблиця 7 Можлива інтерпретація отримуваних результатів при сумісному застосуванні двох тестів Результат реакції Манту Результат «Діаскінтесту» негативна негативний позитивна негативний позитивна позитивний негативна позитивний Інтерпретація Цей результат свідчить про те, что у досліджуваноговідсутній ТБ і в той же час відсутній напружений імунітет проти ТБ. Цей результат свідчить про те, що у досліджуваного відсутній ТБ, в той же час наявний напружений імунітет проти мікобактерій. Цей результат свідчить про те, що досліджуваний інфікований ТБ. Цей результат свідчить про інфікованість ТБ і про відсутність імунітету проти ТБ, але в нормі цього не може відбуватися. Швидше цей результат свідчить про технічні помилки при встановленні реакції, неправильному зберіганні реагентів і т. п. 17 92822 18 19 92822 20 21 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 92822 Підписне 22 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601