Виділене людське антитіло, яке специфічно зв’язується з фактором росту нервової тканини (ngf)

1. Виділене людське антитіло, що специфічно зв'язується з NGF, причому антитіло містить важкий ланцюг, що має варіабельну ділянку важкого ланцюга, і легкий ланцюг, що має варіабельну ділянку легкого ланцюга, де згадана варіабельна ділянка важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 10 та згадана варіабельна ділянка легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 12, або антигензв'язувальний фрагмент даного антитіла. 2. Антитіло за п. 1, яке містить: а) остовні ділянки людського важкого ланцюга, CDR1 ділянку людського важкого ланцюга (SEQ ID NO: 22), CDR2 ділянку людського важкого ланцюга (SEQ ID NO: 18) та CDR3 ділянку людського важкого ланцюга, де згаданою CDR3 ділянкою людського важкого ланцюга є SEQ ID NO: 14, послідовності SEQ ID NO: 10; та 2 (19) 1 3 13. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 2, де згадане антитіло містить легкий ланцюг, який включає SEQ ID NO: 44. 14. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 2, де згадане антитіло містить важкий ланцюг, який включає SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 або SEQ ID NO: 43. 15. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 2, де згадане антитіло містить легкий ланцюг, який включає SEQ ID NO: 44, та важкий ланцюг, який включає SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 або SEQ ID NO: 43. 16. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент за п. 15, де згадане антитіло містить легкий ланцюг, який включає SEQ ID NO: 44, та важкий ланцюг, який включає SEQ ID NO: 40. 17. Спосіб лікування стану, спричиненого підвищеною експресією NGF або підвищеною чутливістю хворого до NGF, який включає введення хворому фармацевтично ефективної кількості антитіла за п. 12. 18. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, що згаданим станом є гострий біль, зубний біль, біль, викликаний травмою, біль, викликаний хірургічним втручанням, біль унаслідок ампутації або абсцесу, каузалгія, демієлінізаційні захворювання, невралгія трійчастого нерва, рак, хронічний алкоголізм, інсульт, таламічний больовий синдром, діабет, синдром набутого імунодефіциту ("СНІД"), токсини, хіміотерапія, головний біль у цілому, мігрень, сильний нападоподібний головний біль з періодичними рецидивами, змішані серцево-судинні та несерцево-судинні синдроми, головний біль, викликаний гіпер- або гіпотензією, запалення у цілому, артрит, ревматичні захворювання, вовчак, остеоартрит, фіброміалгія, запальні захворювання кишечнику, синдром подразненої товстої кишки, запальні захворювання очей, запальні розлади або нестабільність сечового міхура, псоріаз, шкірні захворювання із запальними складовими, сонячна еритема, кардит, дерматит, міозит, неврит, дифузна хвороба сполучної тканини судин, хронічні запальні стани, запальний біль та пов'язані з цим гіпералгезія та алодинія, невропатичний біль та пов'язані з цим гіпералгезія та алодинія, діабетичний невропатичний біль, біль унаслідок пошкодження симпатичних сенсорних нервів, синдроми деаферентації, астма, пошкодження або дисфункція епітеліальної тканини, простий герпес, порушення вісцеральної рухливості на респіраторних, статево-сечових, шлунково-кишкових або серцевосудинних ділянках, рани, опіки, алергічні шкірні реакції, прурит, вітиліго, загальні захворювання шлунково-кишкового тракту, коліт, виразки шлунка, виразки дванадцятипалої кишки, вазомоторний або алергічний риніт, бронхіальні розлади, дисменорея, диспепсія, гастроезофагеальний рефлюкс, панкреатит або вісцералгія. 19. Фармацевтична композиція, яка містить фармацевтично прийнятний носій і терапевтично ефективну кількість антитіла за п. 12. 20. Спосіб лікування стану, спричиненого підвищеною експресією NGF або підвищеною чутливістю хворого до NGF, який включає введення хворому фармацевтичної композиції за п. 19. 97086 4 21. Спосіб виявлення NGF у біологічній пробі, який включає: а) контактування згаданої проби з антитілом за будь-яким із п. 1 або п. 2 за умов, що надають можливість зв'язування згаданого антитіла з NGF; та b) визначення рівня зв'язаного антитіла у згаданій пробі. 22. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка включає нуклеотидну послідовність, що кодує антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за будь-яким із пп. 1-12. 23. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 22, яка містить: a) SEQ ID NO: 9 та SEQ ID NO: 11; або b) SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 13 та SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 15. 24. Лікарський засіб для лікування болісного розладу або стану, пов'язаного з підвищеною експресією NGF або підвищеною чутливістю до NGF, цей лікарський засіб містить фармацевтично ефективну кількість моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, або фармацевтично прийнятних солей моноклонального антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, причому згаданим моноклональним антитілом є щонайменше одне з моноклональних антитіл за будь-яким із п. 1 або п. 2, а також фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач. 25. Лікарський засіб за п. 24, який відрізняється тим, що згадане моноклональне антитіло відділяється від людського NGF поліпептиду з KD прибли-9 зно 110 або менше і нейтралізує біологічну активність людського NGF у стандартній in vitro -8 реакції з IC50 приблизно 110 М або менше. 26. Лікарський засіб за п. 24, який відрізняється тим, що згадане антитіло відділяється від людсь-10 кого NGF поліпептиду з KD приблизно 110 або менше і нейтралізує біологічну активність людського NGF у стандартній in vitro реакції з IC50 приб-9 лизно 110 М або менше. 27. Лікарський засіб за п. 24, який відрізняється тим, що згадане антитіло відділяється від людсь-11 кого NGF поліпептиду з KD приблизно 110 або менше і нейтралізує біологічну активність людського NGF у стандартній in vitro реакції з IC50 приб-9 лизно 0,210 М або менше. 28. Застосування фармацевтично ефективної кількості антитіла за п. 1 для виготовлення лікарського засобу, придатного для лікування болісного розладу або стану, пов'язаного з підвищеною експресією NGF або підвищеною чутливістю до NGF. 29. Застосування за п. 28, яке відрізняється тим, що згадане моноклональне антитіло відділяється від людського NGF поліпептиду з KD приблизно -9 110 або менше і нейтралізує біологічну активність людського NGF у стандартній in vitro реакції з -8 IC50 приблизно 110 М або менше. 30. Застосування за п. 28, яке відрізняється тим, що згадане антитіло відділяється від людського -10 NGF поліпептиду з KD приблизно 110 або менше і нейтралізує біологічну активність людського NGF у стандартній in vitro реакції з IC50 приблизно -9 110 М або менше. 5 97086 6 31. Застосування за п. 28, яке відрізняється тим, що згадане антитіло відділяється від людського -11 NGF поліпептиду з KD приблизно 110 або менше і нейтралізує біологічну активність людського NGF у стандартній in vitro реакції з IC50 приблизно -9 0,210 М або менше. 32. Застосування за п. 31, яке відрізняється тим, що згаданий болісний розлад або стан вибраний з групи, яку складають гострий біль, зубний біль, біль, викликаний травмою, біль, викликаний хірургічним втручанням, біль унаслідок ампутації або абсцесу, каузалгія, демієлінізаційні захворювання, невралгія трійчастого нерва, рак, хронічний алкоголізм, інсульт, таламічний больовий синдром, діабет, синдром набутого імунодефіциту ("СНІД"), токсини, хіміотерапія, головний біль у цілому, мігрень, сильний нападоподібний головний біль з періодичними рецидивами, змішані серцевосудинні та несерцево-судинні синдроми, головний біль, викликаний гіпер- або гіпотензією, запалення у цілому, артрит, ревматичні захворювання, вовчак, остеоартрит, фіброміалгія, запальні захворювання кишечнику, синдром подразненої товстої кишки, запальні захворювання очей, запальні розлади або нестабільність сечового міхура, псоріаз, шкірні захворювання із запальними складовими, сонячна еритема, кардит, дерматит, міозит, неврит, дифузна хвороба сполучної тканини судин, хронічні запальні стани, запальний біль та пов'язані з цим гіпералгезія та алодинія, невропатичний біль та пов'язані з цим гіпералгезія та алодинія, діабетичний невропатичний біль, біль унаслідок пошкодження симпатичних сенсорних нервів, синдроми деаферентації, астма, пошкодження або дисфункція епітеліальної тканини, простий герпес, порушення вісцеральної рухливості на респіраторних, статево-сечових, шлунково-кишкових або серцево-судинних ділянках, рани, опіки, алергічні шкірні реакції, прурит, вітиліго, загальні захворювання шлунково-кишкового тракту, коліт, виразки шлунка, виразки дванадцятипалої кишки, вазомоторний або алергічний риніт, бронхіальні розлади, дисменорея, диспепсія, гастроезофагеальний рефлюкс, панкреатит або вісцералгія. 33. Виділена клітина-хазяїн, що містить нуклеїнову кислоту за будь-яким із пп. 22 або 23. 34. Виділена клітинна лінія, що продукує антитіло або антигензв'язувальний фрагмент згаданого антитіла за будь-яким із пп. 1-12. Ця заявка стосується і претендує на пріоритет тимчасової заявки на патент США № 60/487,431, поданої 15 липня 2003 року, розкриття якої включено до цього опису шляхом посилання. Цей винахід стосується людських моноклональних антитіл, що зв'язують фактор росту нервової тканини (NGF). Описуються також композиції та способи лікування болю та розладів, пов'язаних із болем. Передумови створення винаходу Кожного дня у Сполучених Штатах хронічний біль позбавляє працездатності більше двох мільйонів людей (Джессел (Jessell), Келлі (Kelly), 1991, "Pain and Analgesia" in PRINCIPLES OF NEURAL SCIENCE, 3 видання, (редактори Кандел (Kandel), Шварц (Schwartz), Джессел (Jessell)), Elsevier, Нью-Йорк). На жаль, існуючі способи лікування болю мають лише часткову ефективність і багато з цих способів лікування самі по собі спричинюють ослаблення здоров'я або мають небезпечні побічні ефекти. Наприклад, незважаючи на те, що такі нестероїдні протизапальні лікарські засоби ("NSAIDs") як аспірин, ібупрофен та індометацин, є помірно ефективними проти запального болю, вони також є нирковими токсинами, і високі дози цих засобів є спричиненням подразнення шлунковокишкового тракту, виникнення виразок, кровотеч та появи сплутаності свідомості. Хворі, ліковані опіоїдами, також часто відчувають сплутаність свідомості, а тривале застосування опіоїдів пов'язується із звичністю та залежністю. Місцеві анестезуючі засоби, наприклад, лідокаїн та мексілетин, одночасно пригнічують біль і викликають втрату нормальної чутливості. Біль являє собою відчуття, основу якого становлять сигнали, що надходять із навколишнього середовища, а передаються і інтерпретуються нервовою системою (дивись оглядову статтю Міллан (Мillan), 1999, Prog. Neurobiol. 57:1-164). Шкідливі подразники, наприклад, тепло та торкання, примушують спеціалізовані чутливі нервові закінчення у шкірі надсилати сигнали до центральної нервової системи ("ЦНС"). Цей процес називають сприйняттям болю, а периферичні чутливі нейрони, що його опосередковують, носять назву ноці(ре)цепторів (больових рецепторів). У залежності від інтенсивності сигналу від ноціцептора(-ів) та виділення і обробки цього сигналу ЦНС, особа може сприйняти або може не сприйняти шкідливий подразник як больовий. Коли сприйняття болю особою відповідним чином співвідноситься з інтенсивністю подразника, біль виконує призначену йому захисну функцію. Однак пошкодження тканин певних типів викликає явище, відоме як гіпералгезія або підвищена больова чутливість, у разі якої відносно нешкідливі подразники сприймаються як сильно болючі, оскільки больовий поріг особи знизився. Гіпералгезія може викликатись як запальним пошкодженням, так і пошкодженням нервової тканини. Особи, уражені запальними станами, наприклад, сонячною еритемою, остеоартритом, колітом, кардитом, дерматитом, міозитом, невритом, дифузною хворобою сполучної тканини судин (яка включає ревматоїдний артрит і вовчак) тощо, часто відчувають посилене сприйняття болю. Подібним же чином травма, хірургічне втручання, ампутація, абсцес, каузалгія, дифузна хвороба сполучної тканини судин, демієлінізуюче захворювання, невралгія трійчастого нерва, рак, хронічний 7 алкоголізм, інсульт, таламічний больовий синдром, діабет, герпетичні інфекції, синдром набутого імунодефіциту ("СНІД"), токсини та хіміотерапія спричиняють пошкодження нервової тканини, наслідком чого є надмірний біль. Оскільки механізми передачі ноціцепторами зовнішніх сигналів за нормальних та гіпералгетичних умов стають краще зрозумілими, на процеси, залучені до гіпералгезії, можна цілеспрямовано впливати для запобігання зниження больового порогу і, таким чином, зниження інтенсивності болю, що сприймається. Було показано, що нейротрофні фактори відіграють значну роль у передачі фізіологічного та патологічного болю. Особливо важливим видається фактор росту нервової тканини (NGF) (дивись оглядові статті Макмагон (McMahon), 1996, Phil. Trans. R. Soc. Lond. 351:431-440; та Апфел (Apfel), 2000, The Clinical Journal of Pain 16:S7-S11). Було показано, що як місцеве, так і системне введення NGF викликає гіпералгезію і алодинію (Левін (Lewin) та інші, 1994, Eur. J. Neurosci. 6:1903-1912). Внутрішньовенне вливання NGF викликає у людей міалгію усього тіла, у той час як місцеве введення, окрім системних ефектів, спричинює гіпералгезію і алодинію на місці ін'єкції (Апфел (Apfel) та інші, 1998, Neurology 51:695-702). Значний обсяг даних вказує також на причетність ендогенного NGF до станів, головною особливістю яких є біль. Наприклад, активація NGF спостерігається у шваннівських клітинах гангліїв задніх корінців головного мозку (DRG) впродовж щонайменше 2 місяців після пошкодження периферичної нервової тканини. Повідомляли про підвищені рівні NGF у суглобах тварин, що страждають від різноманітних моделей артриту (наприклад, Алоу (Aloe) та інші, 1993, Growth Factors 9:149-155). Щодо людей, то рівні NGF підвищені у синовіальній рідині хворих на ревматоїдний артрит або артрити інших типів (наприклад, Алоу (Aloe) та інші, 1992, Arthritis and Rheumatism 35:351-355). Окрім того, було показано, що антагонізм функції NGF запобігає виникненню гіпералгезії та алодинії, на моделях невропатичного та хронічного запального болю. Наприклад, на тваринних моделях невропатичного болю (наприклад, перев'язка нервового стовбура або спинномозкового нерва) системна ін'єкція NGF-нейтралізуючих антитіл запобігає виникненню як алодинії, так і гіпералгезії (Ремер (Ramer) та інші, 1999, Eur. J. Neurosci. 11:837-846; та Ро (Ro) та інші, 1999, Pain 79:265-274). Приклади антиNGF антитіл, відомих у цій галузі, наведені, наприклад, у публікаціях WO 01/78698, WO 01/64247, WO 02/096458 та WO 2004/032870; патентах США № 5,844,092, № 5,877,016 та № 6,153,189; Хонго (Hongo) та інші, 2000, Hybridoma 19:215-227; Хонго (Hongo) та інші, 1993, Cell. Моl. Вiol. 13:559-568; депонуваннях GenBank'y № U39608, № U39609, № L17078 або № L17077. Зрозуміло, що існує потреба у нових безпечних та ефективних способах лікування болю, зокрема, шляхом цільового впливу на медіатори або загострювані болю невеликої молекулярної маси, наприклад, NGF. 97086 8 Цей винахід пропонує нові людські моноклональні антитіла, що є терапевтично придатними для зняття болю. Зокрема, цей винахід пропонує моноклональні антитіла, що зв'язуються з фактором росту нервової тканини (NGF). За варіантом, якому віддають перевагу, згаданими моноклональними антитілами є людські моноклональні антитіла, що нейтралізують біологічні активності NGF і є придатними для поліпшення ефектів NGFопосередкованих больових реакцій. Цим винаходом пропонуються також клітини, що продукують і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, секретують до культуральних середовищ моноклональні антитіла за цим винаходом. Окрім їх застосування для лікування та зняття болю, антитіла за цим винаходом є придатними для лікування реакцій, пов'язаних з невропатичним та запальним болем. Цей винахід додатково пропонує гібридні білки, що містять послідовність Fc-ділянки антитіла і одну або декілька послідовностей, позначених як ПОСЛІДОВНІСТЬ № 10, ПОСЛІДОВНІСТЬ № 12, ПОСЛІДОВНІСТЬ № 14, ПОСЛІДОВНІСТЬ № 16, ПОСЛІДОВНІСТЬ № 18, ПОСЛІДОВНІСТЬ № 20, ПОСЛІДОВНІСТЬ № 22 і ПОСЛІДОВНОСТІ № 79130. Такі молекули можна одержати за допомогою способів, описаних, наприклад, у публікації міжнародної заявки WO 00/24782, яку включено до цього опису шляхом посилання. Такі молекули можуть експресуватись, наприклад, у клітинах ссавців (наприклад, у клітинах яєчника китайського хом'ячка) або бактеріальних клітинах (наприклад,у клітинах Е. соlі). За певними аспектами, цей винахід пропонує антитіла, за варіантом, якому віддають перевагу, моноклональні антитіла, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, людські антитіла і людські моноклональні антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 2, ПОСЛІДОВНІСТЮ № 4 або ПОСЛІДОВНІСТЮ № 6, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 10, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За варіантом, якому віддають перевагу, важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 4. За певними аспектами, цей винахід пропонує антитіла, за варіантом, якому віддають перевагу, людські антитіла, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, моноклональні антитіла, за варіантом, якому віддають , найбільшу перевагу, людські моноклональні антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить константну ділянку важкого ланцюга, вибрану з групи, що включає константні ділянки важкого ланцюга IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA та IgE або будь-який їхній алельний варіант (як обговорюється у роботі Кабат (Kabat) та інших, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, п'яте видання, U.S.Department of Health and 9 Human Services, NIH Publication No. 91-3242, що включена до цього опису шляхом посилання), а варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 10, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За варіантом, якому віддають перевагу, антитіло за цим винаходом містить амінокислотну послідовність константної ділянки важкого ланцюга IgG2, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 4, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За певними аспектами, цей винахід пропонує антитіла, за варіантом, якому віддають перевагу, людські антитіла, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, моноклональні антитіла, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, людські моноклональні антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 8, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 12, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За певними аспектами, антитіла за цим винаходом містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 10, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За іншими аспектами, варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 12, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За додатковими аспектами, важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 14, ПОСЛІДОВНІСТЮ № 18 або ПОСЛІДОВНІСТЮ № 20, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За ще іншими додатковими аспектами, легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену будь-якою з ПОСЛІДОВНОСТІ № 16, ПОСЛІДОВНОСТІ № 20, ПОСЛІДОВНОСТІ № 24, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. Цей винахід пропонує також антитіла, що специфічно зв'язуються з NGF, важкий ланцюг яких містить варіабельну ділянку, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 10, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а легкий ланцюг містить варіабельну ділянку, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 12, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. Цей винахід додатково пропонує виділені людські антитіла, що специфічно зв'язуються з NGF, де згадані антитіла містять: 97086 10 (а) важкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 79, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 80, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент; (b) важкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 81, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 82, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент; (c) важкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 83, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 84, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент; або (d) важкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 86, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 87, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За певними аспектами, цей винахід пропонує також антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга і де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше 75%, за варіантом, якому віддають перевагу, 80%, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 85%, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, приблизно 99% ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою ПОСЛІДОВНІСТЮ № 10, і де згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, і де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше 80%, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше 85%, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, приблизно 99% ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою ПОСЛІДОВНІСТЮ № 12, де згадане антитіло специфічно зв'язується з NGF. 11 Цей винахід пропонує також антитіла, що специфічно зв'язуються з NGF, важкий ланцюг яких містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 14, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 16, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За певними аспектами, цей винахід пропонує антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, і де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше 75%, за варіантом, якому віддають перевагу, 80%, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 85%, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% і за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, приблизно 99% ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою будь-якою з ПОСЛІДОВНОСТІ № 14, ПОСЛІДОВНОСТІ № 18, ПОСЛІДОВНОСТІ № 22, і де згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, і де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 80%, за варіантом, якому відцають перевагу, щонайменше 85%, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, приблизно 99% ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою ПОСЛІДОВНІСТЮ № 16, де згадане антитіло специфічно зв'язується з NGF. Цей винахід пропонує також одноланцюгові антитіла, одноланцюгові Fv антитіла, F(ab) антитіла, F(ab)' антитіла і (Fab')2 антитіла. За конкретними аспектами, цей винахід пропонує легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 16, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. На додаток до цього, цей винахід пропонує важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, представлену будь-якою з ПОСЛІДОВНОСТІ № 14, ПОСЛІДОВНОСТІ № 18 або ПОСЛІДОВНОСТІ № 22, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. Цей винахід має також відношення до виділених людських антитіл, що специфічно зв'язують NGF, де згадане антитіло містить: (а) остовні ділянки людського важкого ланцюга, CDR1 ділянку людського важкого ланцюга, CDR2 ділянку людського важкого ланцюга та CDR3 ділянку людського важкого ланцюга; і (b) остовні ділянки людського легкого ланцюга, CDR1 ділянку людського легкого ланцюга, CDR2 ділянку людського легкого ланцюга та CDR3 ділянку людського легкого ланцюга. За певними аспектами, CDR1 ділянка людського важкого ланцюга може бути CDR1 ділянкою важкого ланцюга моноклонального антитіла (mAb), позна 97086 12 ченого 4D4, як показано ПОСЛІДОВНІСТЮ № 22, a CDR1 ділянка людського легкого ланцюга може бути CDR1 ділянкою легкого ланцюга моноклонального антитіла 4D4, як показано ПОСЛІДОВНІСТЮ № 24. За іншими аспектами, CDR2 ділянка людського важкого ланцюга може бути CDR2 ділянкою важкого ланцюга моноклонального антитіла 4D4, як показано ПОСЛІДОВНІСТЮ № 18, а CDR2 ділянка людського легкого ланцюга може бути CDR2 ділянкою легкого ланцюга моноклонального антитіла 4D4, як показано ПОСЛІДОВНІСТЮ № 20. За ще іншими аспектами, CDR3 ділянка людського важкого ланцюга є CDR3 ділянкою важкого ланцюга моноклонального антитіла 4D4, як показано ПОСЛІДОВНІСТЮ № 14, a CDR3 ділянка людського легкого ланцюга є CDR3 ділянкою легкого ланцюга моноклонального антитіла 4D4, як показано ПОСЛІДОВНІСТЮ № 16. Цей винахід пропонує також виділені людські антитіла, що специфічно зв'язують фактор росту нервової тканини, які містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 10, ПОСЛІДОВНІСТЮ № 79, ПОСЛІДОВНІСТЮ № 81, ПОСЛІДОВНІСТЮ № 83, ПОСЛІДОВНІСТЮ № 85 або ПОСЛІДОВНІСТЮ № 87, або її антигензв'язувальний чиімунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. Цей винахід додатково пропонує виділені людські антитіла, що специфічно зв'язують NGF, які містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 12, ПОСЛІДОВНІСТЮ № 80, ПОСЛІДОВНІСТЮ № 82, ПОСЛІДОВНІСТЮ № 84, ПОСЛІДОВНІСТЮ № 86, ПОСЛІДОВНІСТЮ № 88, ПОСЛІДОВНІСТЮ № 89, ПОСЛІДОВНІСТЮ № 90, ПОСЛІДОВНІСТЮ № 91 або ПОСЛІДОВНІСТЮ №131, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. Антитіла за цим винаходом характеризуються здатністю антагонізувати щонайменше одну in vitro та/або in vivo активність, пов'язану з NGF поліпептидами. За варіантом, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує виділені людські антитіла проти людського NGF з високою спорідненістю зв'язування з NGF поліпептидами, де згадані антитіла зв'язуються з людським NGF поліпептидом і відділяються від людського NGF поліпептиду з -12 константою дисоціації (KD) приблизно 50×10 Μ або менше, як визначається за допомогою KinЕхА, або які пригнічують NGF-індуковану виживаність у -8 in vitro реакції нейтралізації з ІС50 приблизно 1×10 Μ або менше. За варіантом, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує виділене людське антитіло проти людського NGF, що має наведені нижче характеристики: a) пригнічує NGF-індуковану виживаність у in -9 vitro реакції нейтралізації з ІС50 приблизно 1×10 M або менше; 13 b) має CDR3 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 14; і c) має CDR3 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 16. Цей винахід пропонує також виділені людські антитіла або їх антигензв'язувальні чи імунологічно функціональні імуноглобулінові фрагменти, що специфічно зв'язуються з NGF з високою спорідненістю, де згадані антитіла або фрагменти відділяються від людського NGF поліпептиду з ΚD при-9 близно 1×10 або менше і нейтралізують біологічну активність людського NGF у стандартній -8 in vitro реакції з ІС50 приблизно 1×10 Μ або менше, і де антитіла або фрагменти містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить: a) CDR1 ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули: де: 1 а - полярний гідрофільний амінокислотний 2 залишок; а - ароматичний амінокислотний зали3 шок; а - аліфатичний, полярний гідрофобний, 4 ароматичний амінокислотний залишок; а - нейтральний гідрофобний або аліфатичний амінокис5 лотний залишок; і а - аліфатичний або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; b) CDR2 ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули: де: 1 b - аліфатичний, полярний гідрофобний або 2 ароматичний амінокислотний залишок; b - аліфа3 тичний гідрофобний амінокислотний залишок; b полярний гідрофільний або ароматичний аміноки4 слотний залишок; b - полярний гідрофільний, гідрофобний або ароматичний амінокислотний за5 9 лишок; b -b , незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні або аліфатичні аміноки10 слотні залишки; b - полярний гідрофільний, ароматичний або аліфатичний амінокислотний зали11 шок; b - ароматичний або гідрофобний 12 амінокислотний залишок; b - аліфатичний гідрофобний або полярний гідрофільний амінокислот13 ний залишок; b - аліфатичний, гідрофобний або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; 14 16 b і b , незалежно одна від одної, являють собою 15 полярні гідрофільні амінокислотні залишки; b аліфатичний або ароматичний гідрофобний аміно17 кислотний залишок; і b - аліфатичний кислий амінокислотний залишок; і c) CDR3 ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули: де: 1 с - відсутня або являє собою аліфатичний 2 амінокислотний залишок; с - відсутня або являє собою полярний гідрофільний або ароматичний 3 4 гідрофобний амінокислотний залишок; с і с , незалежно одна від одної, відсутні або являють собою полярні гідрофільні, ароматичні гідрофобні 5 або аліфатичні амінокислотні залишки; с - відсутня або являє собою полярний гідрофільний, алі 97086 14 фатичний або ароматичний амінокислотний зали6 шок; с - відсутня або являє собою полярний гідрофільний або аліфатичний амінокислотний за7 лишок; с - полярний гідрофільний або 8 аліфатичний амінокислотний залишок; с - полярний гідрофільний, гідрофобний або ароматичний 9 амінокислотний залишок; с - полярний гідрофільний, ароматичний гідрофобний або аліфатичний 10 гідрофобний амінокислотний залишок; с - полярний гідрофільний, ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний зали11 13 шок; с -с , незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні або ароматичні гідро14 фобні амінокислотні залишки; с - аліфатичний або ароматичний гідрофобний амінокислотний 15 залишок; с - полярний гідрофільний або нейтра16 льний гідрофобний амінокислотний залишок; с відсутня або являє собою полярний гідрофільний 17 амінокислотний залишок; і с - ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок. 1 За одним аспектом, а - полярний гідрофіль2 ний амінокислотний залишок; а - ароматичний 3 гідрофобний амінокислотний залишок; а - аліфа4 тичний гідрофобний амінокислотний залишок; а нейтральний гідрофобний амінокислотний зали5 шок; а - полярний гідрофільний амінокислотний 1 залишок; b - аліфатичний або ароматичний аміно2 3 кислотний залишок; b - llе; b - полярний гідрофі4 льний амінокислотний залишок; b - полярний гідрофільний або ароматичний амінокислотний 5 9 залишок; b -b , незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні або аліфатичні аміноки10 слотні залишки; b - аліфатичний амінокислотний 11 12 залишок; b - Тут; b - аліфатичний гідрофобний 13 амінокислотний залишок; b - аліфатичний або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; 14 16 b і b , незалежно одна від одної, являють собою 15 полярні гідрофільні амінокислотні залишки; і b аліфатичний гідрофобний амінокислотний зали17 шок; b - аліфатичний кислий амінокислотний за1 лишок; с - відсутня або являє собою аліфатичний 2 амінокислотний залишок; с - відсутня або являє собою полярний гідрофільний або ароматичний 3 4 гідрофобний амінокислотний залишок; с і с , незалежно одна від одної, відсутні або являють собою полярні гідрофільні, ароматичні гідрофобні 5 або аліфатичні амінокислотні залишки; с - відсутня або являє собою полярний гідрофільний аміно6 кислотний г залишок; с - відсутня або являє собою полярний гідрофільний або аліфатичний 7 амінокислотний залишок; с - полярний гідрофіль8 ний або аліфатичний амінокислотний залишок; с полярний гідрофільний, гідрофобний або арома9 тичний амінокислотний залишок; с - полярний гідрофільний, аліфатичний або ароматичний гід10 рофобний амінокислотний залишок; с - полярний гідрофільний, ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; 11 13 с -с , незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні або ароматичні гідрофобні 14 амінокислотні залишки; с - аліфатичний або ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; 15 с - полярний гідрофільний або нейтральний гід16 рофобний амінокислотний залишок; с - відсутня 15 або являє собою полярний гідрофільний амінокис17 лотний залишок; і с - ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок. 1 За конкретним аспектом, а - Ser, Asp або Thr; 2 3 4 5 a - Туr; а - Ala, Ser, Trp або Gly; a - Met або Ile; a 1 2 - His, Gly або Asn; b - Туr, Gly, lle або Asp; b - lle; 3 4 5 b - Ser, Thr, Tyr або Asn; b - Trp, Arg або Pro; b 6 7 Ser, Asn або Gly; b - Ser, Arg, Asp або Gly; b - Ser, 8 9 His або Gly; b - Ser, lle, Asp або Thr; b - Leu, Ile 10 11 12 або Thr; b - Gly, Lys або Phe; b - Tyr; b - Ala 13 14 15 або Ser; b - Asp, Gly або Pro; b - Ser; b - Val 16 17 1 або Phe; b - Lys або Gln; b - Gly; c - відсутня або являє собою аліфатичний амінокислотний 2 3 залишок; с - відсутня або являє собою Туr; с та 4 с , незалежно одна від одної, відсутні або являють 5 собою Tyr, Asn, Val або Glu; с відсутня або являє 6 собою Ser, Gly або Trp; с відсутня або являє со7 8 бою Ser, Gly, Glu або Leu; с - Gly, Arg або Asp; с 9 10 Trp, Pro, Ser або Thr; c - His, Gly або Tyr; c - Val, 11 13 Tyr або Arg; c -c , незалежно одна від одної, яв14 ляють собою Ser, Phe, Tyr, Asp або Asn; с - Phe, 15 16 Val або Gly; с - Met або Asp; с відсутня або яв17 ляє собою Asp або Asn; і с - Туr або Val. 1 За іншим конкретним аспектом, а - Ser або 2 3 4 5 Asp; a - Tyr; a - Ala або Ser; а - Met або llе; а 1 2 3 His або Asn; b - Туr або Gly; b - llе; b - Ser, Thr, 4 5 Tyr або Asn; b - Trp, Arg або Pro; b - Ser або Asn; 6 7 8 9 b - Ser або Arg; b - His або Gly; b - Ile або Thr; b 10 11 12 - Leu, Ile або Thr; b - Gly або Phe; b - Tyr; b 13 14 15 Ala або Ser; b - Asp або Gly; b - Ser; b - Val або 16 17 1 Phe; b - Lys або Gln; b - Gly; c - відсутня або 2 являє собою Gly; с - відсутня або являє собою 3 4 Туr; с та с , незалежно одна від одної, відсутні 5 або являють собою Туr, Gly або Val; с відсутня 6 7 або являє собою Ser; с - Ser або Gly; с - Gly або 8 9 10 Arg; с - Trp або Pro; с - His, Gly або Туr; с - Val 11 13 або Туr; с -с , незалежно одна від одної, являють 14 15 собою Ser, Tyr, Phe або Asp; с - Phe або Val; с 16 Met або Asp; с відсутня або являє собою Asp; і 17 с - Туr або Val. За іншими конкретними аспектами: a) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 22, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 18, і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 14; b) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 92, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 93, і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ №94; c) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 98, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 99, і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 100; d) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 97086 16 104, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 105, і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 106; e) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 110, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 111, і CDR3 важкого ланцфга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 112; f) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 116, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 117, і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 118. Цей винахід пропонує також виділене людське антитіло або його антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, що специфічно зв'язується з NGF, де згадане антитіло або фрагмент містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить: a) CDR1 ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули: де: 1 а - полярний гідрофільний амінокислотний 2 11 12 залишок; а , а і а , незалежно одна від одної, являють собою аліфатичні або гідрофобні аміно3 5 7 8 кислотні залишки; а , а , а і а , незалежно одна від одної, являють собою аліфатичні, полярні гід4 рофільні або гідрофобні амінокислотні залишки; а - полярний гідрофільний амінокислотний залишок; 6 а - аліфатичний або гідрофобний амінокислотний 9 залишок; а - відсутня або являє собою аліфатичний або полярний гідрофільний амінокислотний 10 залишок; і а - аліфатичний, ароматичний або гідрофобний амінокислотний залишок; b) CDR2 ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули: де: 1 b - аліфатичний, полярний гідрофобний або 2 гідрофобний амінокислотний залишок; b - аліфатичний або гідрофобний амінокислотний залишок; 3 4 b та b , незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні, аліфатичні або гідрофобні 5 амінокислотні залишки; b - полярний гідрофільний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний 6 залишок; b - полярний гідрофільний або аліфати7 чний гідрофобний амінокислотний залишок; і b полярний гідрофільний амінокислотний залишок; і c) CDR3 ділянку, що містить амінокислотну послідовність формули: де: 1 2 с і с , незалежно одна від одної, являють со3 бою полярні гідрофільні амінокислотні залишки; с - полярний гідрофільний, аліфатичний або гідро4 5 6 фобний амінокислотний залишок; с , с і с , незалежно одна від одної, являють собою аліфатичні, 17 полярні гідрофільні або гідрофобні амінокислотні 7 залишки; с - відсутня або являє собою полярний гідрофільний або аліфатичний гідрофобний аміно8 кислотний залишок; с - полярний гідрофільний 9 або гідрофобний амінокислотний залишок; і с полярний гідрофільний амінокислотний залишок; і де згадане антитіло або фрагмент відділяється від -9 людського NGF поліпептиду з KD приблизно 1×10 або менше і нейтралізує біологічну активність людського NGF у стандартній in vitro реакції з ІС50 -8 приблизно 1×10 Μ або менше. 1 3 4 7 8 За одним аспектом, а , а , а , а і а , незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофі2 6 11 12 льні амінокислотні залишки; а , а , а і а , незалежно одна від одної, являють собою аліфатичні 5 гідрофобні амінокислотні залишки; а - полярний гідрофільний або аліфатичний амінокислотний 9 залишок; а - відсутня або являє собою аліфатичний або полярний гідрофільний амінокислотний 10 залишок; а - аліфатичний або ароматичний амі1 нокислотний залишок; b - аліфатичний, полярний гідрофобний або гідрофобний амінокислотний 2 залишок; b - аліфатичний гідрофобний амінокис3 4 7 лотний залишок; b , b і b , незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні аміноки5 6 слотні залишки; b і b , незалежно одна від одної, являють собою полярні гідрофільні або аліфатичні 1 2 гідрофобні амінокислотні залишки; с і с , незалежно одна від одної, являють собою полярні гідро3 фільні амінокислотні залишки; с - полярний гідрофільний, аліфатичний або гідрофобний 4 5 6 амінокислотний залишок; с , с і с , незалежно одна від одної, являють собою аліфатичні, полярні гідрофільні або гідрофобні амінокислотні залишки; 7 с - відсутня або являє собою аліфатичний гідро8 фобний амінокислотний залишок; с - гідрофобний 9 амінокислотний залишок; і с - полярний гідрофільний амінокислотний залишок. 1 3 4 7 За конкретним аспектом, а , а , а і а - Arg, 2 5 Ser, Gln та Ser, відповідно; а - Ala; a - Gly або 8 9 10 Ser; a - Ser або Ilе; а - відсутня, Ser або Gly; a 1 2 Ala, Туr, Тrр або Phe; b - Asp, Gly, Ala або Val; b і 3 4 5 b - Ala та Ser, відповідно; b - Ser або Asn; b - Leu 6 7 1 або Arg; b - Glu, Ala або Gln; b - Ser або Thr; c і 2 3 4 с - Gln; с - Phe, Туr, Arg або Ala; с - Asn, Gly або 5 6 7 Ser; c - Ser або Asn; с - Туr, Ser, Тrр або Phe; с 8 9 відсутня, Pro або His; с - Leu, Trp, Туr або Arg; і с - Thr. 1 2 3 4 За іншим конкретним аспектом, а , а , а , а і 7 5 а - Arg, Ala, Ser, Gln та Ser, відповідно; а - Gly 8 9 або Ser; a - Ser або Ile; a - відсутня, Ser або Gly; 10 1 2 3 a - Ala або Туr; b - Asp або Gly; b і b - Ala та 4 5 Ser, відповідно; b - Ser або . Asn; b - Leu або Arg; 6 7 1 2 3 b - Glu, Ala або Gln; b - Ser або Thr; c і с - Gln; с 4 5 - Phe, Туr, Arg або Ala; с - Asn, Gly або Ser; c 6 7 Ser або Asn; c - Tyr, Ser, Trp або Phe; c - відсут8 9 ня, Pro або His; c - Leu, Trp, Tyr або Arg; і с - Thr. За іншими конкретними аспектами: a) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 24, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 20, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 16; 97086 18 b) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 95, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 96, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ №97; c) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 101, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 102, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 103; d) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 107, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 108, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 109; e) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 113, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 114, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 115; f) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 119, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 120, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 121; g) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 122, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 123, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 124; h) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 125, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 126, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 127; і) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 128, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 129, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 130; j) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 132, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 133, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 134. Частиною цього винаходу є також полінуклеотидні послідовності, що кодують нові людські антитіла проти людського NGF, вектори, що містять 19 полінуклеотидні послідовності, що кодують людські антитіла проти людського NGF, клітини-хазяї, трансформовані векторами, що містять полінуклеотиди, що кодують людські антитіла проти людського NGF, композиції, що містять людські антитіла проти людського NGF та способи її одержання та застосування. Цей винахід пропонує також способи визначення рівня NGF у біологічній пробі, що включають стадію контактування згаданої проби з антитілом за цим винаходом або його антигензв'язувальним фрагментом. Анти-NGF антитіло за цим винаходом може застосовуватись у будь-якому відомому аналітичному методі, наприклад, реакціях конкурентного зв'язування, прямих та непрямих сендвічметодах, методах імунопреципітації та твердофазному імуноферментному аналізі (ELISA) (дивись Сола (Sola), 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, cтop. 147-158, CRC Press, Inc.) для виявлення та кількісного визначення NGF. Антитіла можуть зв'язувати NGF зі спорідненістю, що відповідає застосованому аналітичному методу. На додаток до цього, цей винахід пропонує способи лікування захворювання, пов'язаного з підвищеним продукуванням NGF або підвищеною чутливістю до NGF, що включають стадію введення фармацевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить щонайменше одне антитіло за цим винаходом або його антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, індивіду, який цього потребує. Конкретні варіанти здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, стануть очевидними з наведеного нижче докладнішого опису певних варіантів здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, та формули винаходу. На Фіг. 1 зображені графіки, що демонструють нейтралізацію активності NGF у реакції нейтралізації на основі нейронів DRG моноклональними антитілами 4D4, очищеними з кондиціонованих середовищ для гібридом. На Фіг. 2 зображені графіки, що демонструють експресію VR1, стимульовану активністю людського NGF і нейтралізацію активності NGF у реакціях нейтралізації на основі нейронів DRG анти-NGF моноклональним антитілом (4D4), очищеним із кондиціонованих середовищ для гібридом. На Фіг. 3 зображені графіки, що демонструють нейтралізацію активності NGF у реакціях нейтралізації на основі нейронів DRG тимчасово експресованими рекомбінантними моноклональними антиNGF антитілами 4D4, експресованими як IgG1 або IgG2 та у клітинах, вирощених у ролерній культурі (R) або у спін-культурі (S). На Фіг. 4 зображений порівняльний аналіз послідовностей нейротрофінів. Цифрові позначення та елементи вторинної структури над послідовностями відносяться до зрілого людського NGF. Консервативні залишки помічені зірочкою, а ділянки з низькою гомологією послідовностей заштриховані. Людський NGF - ПОСЛІДОВНІСТЬ № 135; мишачий NGF-ПОСЛІДОВНІСТЬ № 136; BDNF - № 137; NT3 - ПОСЛІДОВНІСТЬ № 138. 97086 20 На Фіг. 5 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності CDR1 важкого ланцюга антиNGF антитіл 14D10 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 98), 6Н9 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 104), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 110), 4G6 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 116), 14D11 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 92) та 4D4 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 22). На Фіг. 6 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності CDR2 важкого ланцюга антиNGF антитіл 14D10 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 99), 6Н9 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 105), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 111), 4G6 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 117), 14D11 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 93) та 4D4 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 18). На Фіг. 7 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності CDR3 важкого ланцюга антиNGF антитіл 14D10 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 100), 6Н9 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 106), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 112), 4G6 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 118), 14D11 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 94) та 4D4 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 14). На Фіг. 8 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності CDR1 легкого ланцюга антиNGF антитіл 14D10 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 95), 6Н9 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 107), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 113), 4G6a (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 119), 4G6b (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 122), 4G6c (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 125), 4G6d (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 128), 4G6e (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 132), 14D11 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 95) та 4D4 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 24) (антитіло 4G6a на різних Фігурах позначається як 20031028340; антитіло 4G6b на різних Фігурах позначається як 20031028351; антитіло 4G6c на різних Фігурах позначається як 20031071526; антитіло 4G6d на різних Фігурах позначається як 20031028344; антитіло 4G6e на різних Фігурах позначається як 20031000528). На Фіг. 9 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності CDR2 легкого ланцюга антиNGF антитіл 14D10 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 96), 6Н9 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 108), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 114), 4G6a (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 120), 4G6b (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 123), 4G6c (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 126), 4G6d (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 129), 4G6e (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 133), 14D11 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 96) та 4D4 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 20) (антитіло 4G6a на різних Фігурах позначається як 20031028340; антитіло 4G6b на різних Фігурах позначається як 20031028351; антитіло 4G6c на різних Фігурах позначається як 20031071526; антитіло 4G6d на різних Фігурах позначається як 20031028344; антитіло 4G6e на різних Фігурах позначається як 20031000528). На Фіг. 10 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності CDR3 легкого ланцюга антиNGF антитіл 14D10 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 97), 6Н9 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 109), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 115), 4G6a (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 121), 4G6b (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 124), 4G6c (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 127), 4G6d (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 130), 4G6e (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 134), 14D11 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 97) та 4D4 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 16) (антитіло 4G6a на різних Фігурах позначається як 20031028340; антитіло 4G6b на різних Фігурах позначається як 20031028351; антитіло 4G6c на різ 21 них Фігурах позначається як 20031071526; антитіло 4G6d на різних Фігурах позначається як 20031028344; антитіло 4G6e на різних Фігурах позначається як 20031000528). На Фіг. 11 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності легкого ланцюга анти-NGF антитіл 14D10 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 82), 6Н9 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 84), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 86), 4G6a (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 88), 4G6b (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 89), 4G6c (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 90), 4G6d (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 91), 4G6e (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 131), 14D11 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 80) та 4D4 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 12) (антитіло 4G6a на різних Фігурах позначається як 20031028340; антитіло 4G6b на різних Фігурах позначається як 20031028351; антитіло 4G6c на різних Фігурах позначається як 20031071526; антитіло 4G6d на різних Фігурах позначається як 20031028344; антитіло 4G6e на різних Фігурах позначається як 20031000528). На Фіг. 12 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності важкого ланцюга анти-NGF антитіл 4D4 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 10), 4G6 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 87), 14D10 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 81), 14D11 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 79), 7Н2 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 85) та 6Н9 (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 83). Докладний опис конкретних варіантів здійснення винаходу, яким віддають перевагу Назви розділів, що застосовуються у цьому описі, переслідують лише організаційні цілі і не повинні розглядатись як такі, що обмежують об'єкт опису. Усі посилання, згадані у цьому описі, включено до цього опису шляхом посилання для будьякої цілі. Визначення Для одержання рекомбінантних ДНК, синтезу олігонуклеотидів, культивування та трансформації тканин можна вдаватись до традиційних методів (наприклад, електропорацїї, ліпофекції). Ферментативні реакції та методи очищення можуть здійснюватись за специфікаціями виробника, за традиційними для цієї галузі методиками або за наведеним описом. Подальші методики та процедури можуть, у цілому, здійснюватись за способами, добре відомими у цій галузі, та за описами, наведеними у різноманітних загальних та спеціалізованих джерелах, які наводяться шляхом посилання та обговорюються у цьому описі. Дивись, наприклад, довідник Сембрук (Sambrook) та інші, 2001, MOLECULAR CLONING: A LFBORATORY MANUAL, 3 видання, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, який включено до цього опису шляхом посилання з будь-якою метою. У разі відсутності конкретних визначень, у цьому описі у зв'язку з та по відношенню до лабораторних процедур та методів аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії, медичної та фармацевтичної хімії застосовується номенклатура, що є добре відомою і традиційно застосовуваною у цій галузі. Подібним чином, для хімічного синтезу, хімічних аналізів, одержання фармацевтичних препаратів, композицій, їх доставки та лікування хворих можуть застосовуватись традиційні методи. 97086 22 Слід розуміти, що наведені нижче терміни, що вживаються у описі цього винаходу, у разі відсутності інших визначень, мають таке значення: Словосполучення "біологічна властивість", "біологічна характеристика" і термін "активність" відносно антитіла за цим винаходом застосовуються у цьому описі взаємозамінно і означають (але не обмежуються) спорідненість і специфічність відносно антигенної детермінанти (наприклад, зв'язування людського антитіла проти людського NGF з людським NGF), здатність до антагонізування активності цільового поліпептиду (наприклад, активності NGF), in vivo стабільність антитіла та імуногенні властивості антитіла. Іншими біологічними властивостями або характеристиками антитіла, що піддаються визначенню і визнаються у цій галузі, є, наприклад, перехресна реактивність (тобто з гомологами цільового поліпептиду нелюдського походження або, взагалі, з іншими білками або тканинами) і здатність до збереження високих рівнів експресії білка у клітинах ссавців. Вищезгадані властивості або характеристики можуть спостерігатись або вимірюватись за допомогою визнаних у цій галузі методів, у тому числі, але без обмеження, за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA), конкурентного ELISA, аналізу поверхневого плазмонного резонансу, in vitro та in vivo реакцій нейтралізації (наприклад, Приклад 2) та імуногістохімічних методів зі зрізами тканин із різних джерел, у тому числі від людей, приматів або з будь-якого іншого джерела, відповідно до потреб. Конкретні активності та біологічні властивості людських антитіл проти людського NGF докладно описані у наведених нижче Прикладах. Словосполучення "виділений полінуклеотид", що застосовується у цьому описі, означає полінуклеотид геномного, кДНК або синтетичного походження чи їх комбінації, причому, завдяки своєму походженню, згаданий виділений полінуклеотид (1) не є пов'язаним із цілим полінуклеотидом або частиною полінуклеотиду, у складі якого виділений полінуклеотид знаходиться за природних умов, (2) є зв'язаним із полінуклеотидом, з яким він не є зв'язаним за природних умов або (3) не зустрічається за природних умов, як частина більшої послідовності. Словосполучення "виділений білок", що згадується у цьому описі, означає, що цільовий білок (1) є вільним від щонайменше деяких інших білків, з якими він знаходиться за нормальних умов, (2) є по суті вільним від інших білків з того самого джерела, наприклад, від того самого виду, (3) експресується клітиною іншого виду, (4) було відділено від щонайменше приблизно 50 відсотків полінуклеотидів, ліпідів, вуглеводів або інших матеріалів, з якими він є пов'язаним за природних умов, (5) не є зв'язаним (ковалентною або нековалентною взаємодією) з частинами білка, з якими згаданий "виділений білок" є зв'язаним за природних умов, (6) є функціонально зв'язаним (ковалентною або нековалентною взаємодією) з поліпептидом, з яким він не є зв'язаним за природних умов або (7) не зустрічається за природних умов. Такий виділений білок може кодуватись геномною ДНК, кДНК, мРНК або іншою РНК синтетичного походження чи будь 23 якою їх комбінацією. За варіантом, якому віддають перевагу, згаданий виділений білок є по суті вільним від білків або поліпептидів чи інших забруднювачів, що знаходяться у його природному оточенні, які могли б перешкоджати його застосуванню (терапевтичному, діагностичному, профілактичному, науково-дослідному тощо). "Виділеним" антитілом є антитіло, яке було ідентифіковане і відділене та/або виділене зі складової його природного оточення. Забруднювальними складовими його природного оточення є матеріали, які могли б перешкодити діагностичному або терапевтичному застосуванням антитіла, і вони можуть включати ферменти, гормони та інші білкові або небілкові розчинені речовини. За варіантом, якому віддають перевагу, антитіло буде очищеним (1) до рівня, що перевищує 95% (мас.) антитіла, що визначається за методом Лоурі, а за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, до рівня, що перевищує 99% (мас), (2) до ступеня, достатнього для одержання щонайменше 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності за допомогою секвенатора з центрифугальною чашкою, або (3) до однорідності за допомогою електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (SDSPAGE) за відновних або невідновних умов із застосуванням барвника кумасі блакитного або, за варіантом, якому віддають перевагу, срібла. Виділене антитіло включає антитіло in situ у межах рекомбінантних клітин, оскільки щонайменше одна складова природного середовища антитіла буде відсутньою. Терміни "поліпептид" або "білок" означають молекули, що мають послідовність нативних білків, тобто білків, продукованих природними клітинами та специфічними нерекомбінантними клітинами, генно-інженерними або рекомбінантними клітинами, і включають молекули, що мають амінокислотну послідовність нативного білка або молекули, з яких були видалені, до яких були додані та/або замінені одна або декілька амінокислот нативної послідовності. Терміни "поліпептид" та "білок", зокрема, означають анти-NGF антитіла або послідовності, з яких були видалені, до яких були додані та/або замінені одна або декілька амінокислот анти-NGF антитіла. Термін "фрагмент поліпептиду" означає поліпептид, що має делецію на амінокінці, делецію на карбоксильному кінці та/або внутрішню делецію. За певних варіантів здійснення довжина фрагментів становить від щонайменше 5 амінокислот до приблизно 500 амінокислот. Буде зрозуміло, що, за певними варіантами здійснення довжина фрагментів становить щонайменше 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 або 450 амінокислот. Особливо придатні фрагменти поліпептидів містять функціональні домени, у тому числі зв'язувальні домени. У разі анти-NGF антитіла, придатні фрагменти містять (але не обмежуються) CDR (гіперваріабельну) ділянку, варіабельну ділянку важкого або легкого ланцюга, частину ланцюга антитіла або лише його варіабельну ділянку, що містить дві гіперваріабельні ділянки тощо. 97086 24 Термін "специфічний зв'язувальний агент" означає природну або штучну молекулу, яка специфічно зв'язується з мішенню. Прикладами специфічних зв'язувальних агентів є (але ними не обмежуються) білки, пептиди, нуклеїнові кислоти, вуглеводи і ліпіди. За певними варіантами здійснення специфічним зв'язувальним агентом є антитіло. Термін "специфічний NGF-зв'язувальний агент" означає специфічний зв'язувальний агент, який специфічно зв'язує будь-яку частину NGF. За певними варіантами здійснення специфічним NGF-зв'язувальним агентом є антитіло, що специфічно зв'язується з NGF. Термін "імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент", що застосовується у цьому описі, означає фрагмент поліпептиду, що містить щонайменше гіперваріабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів імуноглобуліну. Імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент за цим винаходом є здатним до зв'язування з антигеном. За варіантами, яким віддають перевагу, антиген являє собою ліганд, що специфічно зв'язується з рецептором. За цими варіантами здійснення зв'язування імунологічно функціонального імуноглобулінового фрагмента за цим винаходом запобігає зв'язуванню ліганду з його рецептором, з перериванням біологічної реакції, що є наслідком зв'язування ліганду з рецептором. За варіантом, якому віддають перевагу, імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент за цим винаходом специфічно зв'язується з NGF. За варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, згаданий фрагмент специфічно зв'язується з людським NGF. Термін "природний", що застосовується у цьому описі і стосується об'єкта, означає те, що цей об'єкт може бути знайденим у природі. Наприклад, поліпептидна або полінуклеотидна послідовність, присутня у організмі (у тому числі вірусах), яка може бути виділена із природного джерела і навмисно людиною не модифікувалась, є природною. Термін "функціонально зв'язаний" означає, що складові, до яких застосовується цей термін, знаходяться у взаємозв'язку, який надає їм можливість здійснення притаманних їм функцій за відповідних умов. Наприклад, контрольна послідовність, "функціонально зв'язана" з кодувальною послідовністю білка, є сполучена з нею таким чином, що експресія кодувальної послідовності білка відбувається за умов, сумісних із транскрипційною активністю контрольних послідовностей. Термін "контрольна послідовність", що застосовується у цьому описі, означає полінуклеотидні послідовності, які можуть забезпечувати експресію, процесинг або внутрішньоклітинну локалізацію кодувальних послідовностей, з якими вони зв'язані. Природа таких контрольних послідовностей може залежати від організму-хазяїна. За конкретними варіантами здійснення контрольні послідовності для прокаріот можуть містити промотор, сайт зв'язування рибосом і термінатор транскрипції. За іншими конкретними варіантами здійснення, контрольні послідовності для еукаріот можуть включа 25 ти промотори, що містять один або множину сайтів упізнання факторів транскрипції, енхансерних послідовностей транскрипції, термінаторів транскрипції та послідовностей поліаденілування. За певними варіантами здійснення "контрольні послідовності" можуть включати лідерні послідовності та/або послідовності гібридизаційного партнера. Термін "полінуклеотид", що застосовується у цьому описі, означає одноланцюгові або дволанцюгові нуклеїновокислотні полімери довжиною щонайменше 10 нуклеотидів. За певними варіантами здійснення нуклеотидами, що входять до складу полінуклеотиду, можуть бути рибонуклеотиди або дезоксирибонуклеотиди чи модифікована форма нуклеотиду будь-якого з цих типів. Згадані модифікації включають модифікації основ, наприклад, бромуридину, модифікації рибоз, наприклад, арабінозиду та 2'3'-дидезоксирибози та модифікації внутрішньонуклеотидних зв'язків, наприклад, фосфоротіоату, фосфородітіоату, фосфороселеноату, фосфородиселеноату, фосфороанілотіоату, фосфороаніладату і фосфороамідату. Термін "полінуклеотид", зокрема, включає однониткові та двониткові форми ДНК. Термін "олігонуклеотид", що застосовується у цьому описі, включає природні і модифіковані нуклеотиди, зв'язані природними та/або штучними олігонуклеотидними зв'язками. Олігонуклеотиди являють собою субпопуляцію полінуклеотидів, члени якої є, як правило, однонитковими і мають у довжину 200 або менше нуклеотидів. За певними варіантами здійснення олігонуклеотиди мають від 10 нуклеотидів до 60 нуклеотидів у довжину. За певними варіантами здійснення олігонуклеотиди мають 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 нуклеотидів або від 20 нуклеотидів до 40 нуклеотидів у довжину. Олігонуклеотиди можуть бути однонитковими або двонитковими, наприклад, для застосування при конструюванні генетичного мутанту. Олігонуклеотиди за цим винаходом можуть бути смисловими або антисмисловими олігонуклеотидами відносно білок-кодувальної послідовності. Термін "природні нуклеотиди" означає дезоксирибонуклеотиди і рибонуклеотиди. Термін "модифіковані нуклеотиди" означає нуклеотиди з модифікованими або заміненими цукровими групами тощо. Термін "олігонуклеотидні зв'язки" означає олігонуклеотидні зв'язки, наприклад, фосфоротіоат, фосфородітіоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанілотіоат, фосфороаніладат, фосфороамідат тощо. Дивись, наприклад, Лапланш (LaPlanche) та інші, 1986, Nucl. Acids Res., 14:9081; Стек (Stec) та інші, 1984, J. Am. Chem. Soc., 106:6077; Стейн (Stein) та інші, 1988, Nucl. Acids Res., 16:3209; Зон (Zon) та інші, 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539; Зон (Zon) та інші, 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, cтop. 87-108, (редактор Ф. Екстейн (F. Eckstein)), Oxford University Press, Oxford England; Стек (Stec) та інші, патент CШA № 5,151,510; Ульман (Uhlmann), Пейман (Peyman), 1990, Chemical Reviews, 90:543, розкриття яких наведено у цьому описі шляхом посилання для будь-якої мети. Олігонуклеотид може містити ви 97086 26 явну мітку, яка надає можливість виявлення олігонуклеотиду або його гібридизації. Термін "вектор" означає нуклеїновокислотну молекулу, здатну до транспортування іншої нуклеїнової кислоти, з якою вона зв'язана. Вектором одного з типів є "плазміда", що являє собою кільцеву петлю двониткової ДНК, до якої можуть бути ліговані додаткові сегменти ДНК. Вектором іншого типу є вектор на основі вірусного геному, де додаткові сегменти ДНК можуть бути лігованими до вірусного геному. Певні вектори є здатними до автономної реплікації у клітини-хазяїні, до якої вони були введені (наприклад, вектори на основі бактеріального геному, що мають бактеріальний сайт ініціювання реплікації та вектори на основі епісом ссавців). Інші вектори (наприклад, вектори не на основі епісом ссавців) можуть бути інтегровані до геному клітини-хазяїна при введенні до згаданої клітини і, таким чином, розмножуватися разом із геномом хазяїна. Більше того, певні вектори є здатними до спрямування експресії генів, з якими вони є функціонально зв'язані. Такі вектори згадуються у цьому описі, як "рекомбінантні вектори експресії" (або просто "експресійні вектори"). Взагалі, експресійні вектори, придатні для методу рекомбінантних ДНК, часто мають форму плазмід. У цьому описі терміни "плазміда" і "вектор" можуть застосовуватись взаємозамінно, оскільки плазміда являє собою найпоширенішу форму вектора. Цей винахід, однак, включає інші форми експресійних векторів, наприклад, вектори на основі вірусного геному (наприклад, реплікаційно-дефектні ретровіруси, аденовіруси та аденоасоційовані віруси), які здійснюють еквівалентні функції. Словосполучення "рекомбінантна клітинахазяїн" (або просто "клітина-хазяїн") означає клітину, до якої було введено рекомбінантний експресійний вектор. Фахівцям у цій галузі буде зрозуміло, що такі терміни, як мається на увазі, означають не лише конкретну клітину-об'єкт, але і потомство такої клітини. Оскільки у подальших генераціях можуть відбуватись певні модифікації унаслідок мутацій або впливу навколишнього середовища, таке потомство може, по суті не бути ідентичним батьківській клітині, однак воно, як і до того, включається до обсягу терміну "клітинахазяїн", який застосовується у цьому описі. Для експресії антитіл за цим винаходом можуть застосовуватись найрізноманітніші системи експресії в хазяїні, у тому числі бактеріальні, дріжджові, бакуловірусні системи експресії та системи експресії у ссавцях (а також системи експресії з фаговою індикацією). Прикладом придатного експресійного вектора на основі бактеріального геному є pUC19. Для рекомбінантної експресії антитіл, клітинахазяїн трансфікується одним або декількома рекомбінантними експресійними векторами, що несуть фрагменти ДНК, що кодує легкі та важкі ланцюги антитіла таким чином, що згадані легкі та важкі ланцюги експресуються у клітині-хазяїні і, за варіантом, якому віддають перевагу, секретуються до живильного середовища, у якому культивуються клітини-хазяї, з якого згадані антитіла можуть виділятись. Стандартна методика рекомбінантних ДНК застосовується для одержання генів важких і 27 легких ланцюгів антитіла, включення цих генів до рекомбінантних експресійних векторів та введення цих векторів до клітин-хазяїв, описаних, наприклад, у довіднику Сембрук (Sambrook) та інші, 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories, (під редакцією Осбел Ф.М. (Ausubel F.M.) та інших, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associaties, (1989)) та у патенті США № 4,816,397 на ім'я Босс (Boss) та інші. Термін "клітина-хазяїн" застосовують для позначення клітини, яку було трансформовано або яка є здатною до трансформування нуклеїновокислотною послідовністю з подальшою експресією вибраного гена, який становить інтерес. Згаданий термін доти включає потомство батьківської клітини, незалежно від того, чи є згадане потомство ідентичним вихідній батьківській клітині за морфологією або організацією генетичного матеріалу, доки є присутнім вибраний ген. Термін "трансдукція" означає перенесення генів від однієї бактерії до іншої, як правило, за допомогою фага. "Трансдукція" означає також набуття та перенесення еукаріотних клітинних послідовностей ретровірусами. Термін "трансфекція" означає захоплення клітиною чужорідної або екзогенної ДНК і клітина є "трансфікованою" у разі, коли екзогенна ДНК була введена досередини клітинної мембрани. У цій галузі добре відомі численні методи трансфекції, які розкриваються у цьому описі. Дивись, наприклад, Грехем (Graham) та інші, 1973, Virology 52:456; Сембрук (Sambrook) та інші, 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Девіс (Davis) та інші, 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; Чу (Chu) та інші, 1981, Gene, 13:197. Такі методи можуть застосовуватись для введення до придатних клітин-хазяїв однієї або декількох екзогенних ДНК. Термін "трансформація", що застосовується у цьому описі, означає зміну генетичних характеристик клітини, і клітина є трансформованою у тому разі, коли вона була модифікована таким чином, що містить нову ДНК. Наприклад, клітина є трансформованою у тому разі, коли її піддали генетичній модифікації порівняно з її нативним станом. Після трансфекції або трансдукції, трансформуюча ДНК може рекомбінуватись із ДНК клітини шляхом фізичної інтеграції з хромосомою клітини або може тимчасово підтримуватись як епісомний елемент без реплікації або може реплікуватись незалежно як плазміда. Клітина вважається стабільно трансформованою, коли ДНК реплікується разом із поділом клітини. Термін "природний" або "нативний", у разі застосування у зв'язку з біологічними матеріалами, наприклад, молекулами нуклеїнової кислоти, поліпептидами, клітинами-хазяями тощо, означає матеріали, які знаходяться у природі, і не зазнавали маніпуляції з боку людини. Аналогічно, термін "штучний" або "ненативний", що застосовується у цьому описі, означає матеріал, який є відсутнім у природі або який був структурно модифікованим або синтезованим людиною. 97086 28 Термін "антиген" означає молекулу або частину молекули, здатну до зв'язування селективним зв'язувальним агентом, наприклад, антитілом, і додатково здатну до застосування у організмі тварини для продукування антитіл, здатних до зв'язування з антигенною детермінантою цього антигену. Антиген може мати одну або декілька антигенних детермінант. Термін "ідентичність", як відомо у цій галузі, означає спорідненість між послідовностями двох чи декількох поліпептидних молекул або двох чи декількох нуклеїновокислотних молекул, що визначається шляхом порівняння їх послідовностей. Термін "ідентичність" у цій галузі означає також ступінь спорідненості послідовностей між нуклеїновокислотними молекулами або поліпептидами, відповідно, що визначається сумісністю ниток двох чи декількох нуклеотидних або двох чи декількох амінокислотних послідовностей. "Ідентичність" встановлює відсоток ідентичних співпадінь між меншими з двох або декількох послідовностей з впорядкованим розміщенням двониткових розривів (у разі їх присутності), який визначають за допомогою конкретної математичної моделі або комп'ютерної програми (тобто "алгоритмів"). Термін "подібність" застосовують у цій галузі відносно спорідненої концепції, але на відміну від "ідентичності", "подібність" означає ступінь спорідненості, який включає як ідентичні співпадіння, так і консервативні замінні співпадіння. Якщо дві поліпептидні послідовності мають, наприклад, 10/20 ідентичних амінокислот, а усі залишкові амінокислоти є неконсервативними замінами, у такому разі відсоток як ідентичності, так і подібності буде дорівнювати 50%. Якщо, у тому самому прикладі, є п'ять додаткових позицій, де є консервативні заміни, у такому разі відсоток ідентичності залишиться на рівні 50%, а відсоток подібності буде становити 75% (15/20). Таким чином, у тих випадках, де є консервативні заміни, відсоток подібності між двома поліпептидами буде вищим за відсоток ідентичності між цими двома поліпептидами. Ідентичність і подібність споріднених нуклеїнових кислот і поліпептидів може бути легко обчислена за відомими методами. До них належать (але ними не обмежуються) методи, описані у COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY (редактор Леек А.М. (Lesk AM.)), 1988, Oxford University Press, New York; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (редактор Сміт Д.В. (Smith D.W.)), 1993, Academic Press, New York; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Part 1, (редактори Гріффін A.M. (Griffin A.M.), Гріффін Г.Дж. (Griffin H.G.)), 1994, Humana Press, New Jersey; фон Гейне Дж. (von Heinje G.), SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (ГрібсковВ. (Gribskov V.), Деверо Дж. (Devereux J.)), 1991, M. Stockton Press, New York; Карілло (Carillo), 1988,SIAM J. Applied Math., 48:1073; Дурбін (Durbin) та інші, 1998, BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press. Методи визначення ідентичності, яким віддають перевагу, розробляються таким чином, щоб вони забезпечували найбільшу сумісність між пос 29 лідовностями, що перевіряються. Методи визначення ідентичності описуються у доступних комп'ютерних програмах. Методи комп'ютерних програм із визначення ідентичності двох послідовностей, яким віддають перевагу, включають (але ними не обмежуються) пакет програм GCG, що містить програми GAP (Деверо (Devereux) та інші, 1984, Nucl. Acid Res., 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, штат Вісконсін), BLASTP, BLASTN та FASTA (Алтигул (Altschul) та інші, 1990, J. Моl. Вiol., 215:403-410). Програма BLASTX є доступною від Національного центру з біотехнологічної інформації (National Center for Biotechnology Information (NCBI)) та з інших джерел (BLAST Manual, Алтшул (Altschul) та інші, NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Алтшул (Altschul) та інші, 1990, дивись вище). Для визначення ідентичності може застосовуватись також добре відомий алгоритм Сміта Уотермена (Smith Waterman algorithm). Наслідком застосування певних схем порівняльного аналізу з впорядованим розміщенням двох амінокислотних послідовностей може виявитись сумісність лише короткої ділянки двох згаданих послідовностей, і ця невелика впорядковано розміщена ділянка може мати дуже високу ідентичність послідовностей, незважаючи навіть на відсутність значної спорідненості між двома непроцесованими послідовностями. Відповідно, за певними варіантами здійснення наслідком застосування вибраного методу порівняльного аналізу (програма GAP) виявиться впорядковане розміщення, що охоплює щонайменше 50 суміжних амінокислот цільового поліпептиду. Наприклад, у разі застосування комп'ютерного алгоритму GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, штат Вісконсін), два поліпептиди, у яких слід визначити відсоток ідентичності послідовностей, впорядковано розміщуються для оптимального співпадіння їх відповідних амінокислот ("суміщений відрізок", як визначається алгоритмом). За певними варіантами здійснення разом з алгоритмом застосовують штрафні бали за розрив (які обчислюються, як потроєна середня діагональ, де "середня діагональ" є середнім значенням діагоналі застосованої порівняльної матриці; "діагональ" являє собою бал або число, що приписується кожному абсолютному співпадінню амінокислоти конкретною порівняльною матрицею) і штрафні бали за довжину розриву (які, як правило, дорівнюють одній десятій штрафних балів за розрив), а також порівняльну матрицю, наприклад, РАМ 250 або BLOSUM 62. За певними варіантами здійснення алгоритмом застосовується також стандартна порівняльна матриця (дивись Дейхофф (Dayhoff) та інші, 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352 щодо порівняльної матриці РАМ 250; Хенікофф (Henikoff) та інші, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:1091510919 щодо порівняльної матриці BLOSUM 62). За певними варіантами здійснення параметри порівняння поліпептидних послідовностей охоплюють наведене нижче: алгоритм: Нідлмен (Needleman) та інші, 1970, J. Моl. Віоl., 48:443-453; 97086 30 порівняльна матриця: BLOSUM 62 від Хенікофф (Henikofi) та інші, 1992, дивись вище; штрафні бали за розрив: 12; штрафні бали за довжину розриву: 4; поріг подібності: 0. З вищенаведеними параметрами корисною може бути програма GAP. За певними варіантами здійснення вищезгадані параметри є параметрами за замовчуванням для порівняння поліпептидних послідовностей (без штрафних балів за закінчення розриву) із застосуванням алгоритму GAP. Термін "гомологія" означає ступінь подібності між білковими або нуклеїновокислотними послідовностями. Інформація щодо гомології є корисною для розуміння генетичної спорідненості певних видів білків або нуклеїнових кислот. Гомологія може визначатись шляхом впорядкованого розміщення і порівняння послідовностей. За типовим варіантом, для визначення гомології амінокислот, білкову послідовність порівнюють із базою даних відомих білкових послідовностей. Гомологічні послідовності мають спільні функціональні одиниці на якійсь ділянці своїх послідовностей. Високий ступінь подібності або ідентичності, як правило, є свідченням гомології, хоча низький ступінь подібності або ідентичності не обов'язково вказує на відсутність гомолога. Для визначення гомолога шляхом порівняння амінокислот однієї послідовності з амінокислотами іншої послідовності може застосовуватись декілька варіантів підходів. Взагалі, згадані варіанти підходів можна підрозділити на дві категорії: (1) порівняння фізичних характеристик, а саме полярності, заряду, вандерваальсівського об'єму, для створення порівняльної матриці; і (2) порівняння ймовірної заміни амінокислоти у послідовності будь-якою іншою амінокислотою, що ґрунтується на спостереженні багатьох білкових послідовностей відомих гомологічних білків, і створення Матриці Прийнятних Точкових Мутацій (Point Accepted Mutation Matrix (РАМ)). Відсоток ідентичності може обчислюватись шляхом застосування голки для відбирання програм (пакет програм EMBOSS) або розширювача програм (пакет програм EMBOSS) чи узгоджування програм X, як модуля вектора NTI пакета програм 9.0.0, із застосуванням значень параметрів, за замовчуванням (наприклад, 5 штрафних балів за присутність двониткового розриву, 15 штрафних балів за відкриття двониткового розриву, 6,6 штрафних балів за довжину двониткового розриву). У цьому описі застосовуються двадцять традиційних амінокислот та їхні скорочені позначення. Дивись довідник IMMUNOLOGY - A SYNTHESIS 2 видання, (редактори Е.С.Голаб (E.S. Golub), Д.Р. Грен (D.R. Gren)), Sinauer Associates: Sunderland, штат Массачусетс, 1991, який включено до цього опису шляхом посилання для будь-яких цілей. Стереоізомери (наприклад, D-амінокислоти) двадцяти традиційних амінокислот; штучні амінокислоти, наприклад, а-, а-двозаміщені амінокислоти, N-алкіламінокислоти, молочна кислота та інші нетрадиційні амінокислоти можуть також бути придатними складовими для поліпептидів за цим вина 31 ходом. Прикладами нетрадиційних амінокислот є: 4-гідроксипролін, γ-карбоксиглутамат, ε-Ν,Ν,Νтриметиллізин, ε-Ν-ацетиллізин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формілметіонін, 3метилгістидин, 5-гідроксилізин, σ-Ν-метиларгінін та інші подібні амінокислоти та імінокислоти (наприклад, 4-гідроксипролін). У позначенні поліпептидів, яке застосовується у цьому описі, лівостороннім напрямом є напрям до амінокінця, а правостороннім напрямом є напрям до карбоксильного кінця, відповідно до стандартного застосування і традиції. Природні залишки можуть підрозділятись на класи на основі властивостей звичайних бічних ланцюгів: 1) гідрофобні: норлейцин (Nor), Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro; 2) полярні гідрофільні: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr; 3) аліфатичні: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro; 4) аліфатичні гідрофобні: Ala, Ile, Leu, Val, Pro; 5) нейтральні гідрофільні: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 6) кислі: Asp, Glu; 7) основні: His, Lys, Arg; 8) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: Gly, Pro; 9) ароматичні: His, Trp, Tyr, Phe; і 10) ароматичні гідрофобні: Phe, Trp, Туr. Консервативні амінокислотні заміни можуть включати заміну члена одного з цих класів іншим членом того самого класу. Консервативні амінокислотні заміни можуть охоплювати штучні амінокислотні залишки, які, як правило, включаються скоріше хімічним синтезом пептидів, аніж синтезом у біологічних системах. Сюди включаються пептидоміметики та інші обернені або інвертовані форми амінокислотних складових. Неконсервативні заміни можуть включати заміну члена одного з цих класів членом іншого класу. Такі замінені залишки можуть вводитись на ділянки людського антитіла, що є гомологічними з антитілами нелюдського походження або на негомологічні ділянки молекули. У разі здійснення таких замін, за певними варіантами здійснення, до уваги може прийматись гідропатичний індекс амінокислот. Кожній амінокислоті, на основі характеристик її гідрофобності та заряду, був приписаний гідропатичний індекс. Вони є такими: ізолейцин (+4,5); валін (+4,2); лейцин (+3,8); фенілаланін (+2,8); цистеїн/цистин (+2,5); метіонін (+1,9); аланін (+1,8); гліцин (-0,4); треонін (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролін (-1,6); гістидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамін (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагін (-3,5); лізин (3,9); і аргінін (-4,5). Важливість гідропатичного індексу амінокислот при наданні білку інтерактивної біологічної функції є зрозумілою у цій галузі (дивись, наприклад, Кайт (Kyte) та інші, 1982, J. Моl. Віоl., 157:105-131). Відомо, що певні амінокислоти можуть бути замінені іншими амінокислотами, що мають подібний гідропатичний індекс або коефіцієнт, і зберегти, як і досі, подібну біологічну активність. При здійсненні замін, виходячи з гідропатич 97086 32 ного індексу, за певними варіантами здійснення включають заміну амінокислот, гідропатичні індекси яких знаходяться у межах ±2. За певними варіантами здійснення включають амінокислоти, гідропатичні індекси яких знаходяться у межах ±1, і за певними варіантами здійснення включають амінокислоти, гідропатичні індекси яких знаходяться у межах ±0,5. У цій галузі зрозуміло також, що заміна подібних амінокислот може здійснюватись ефективніше на основі гідрофільності, зокрема, у тому разі, коли одержаний таким чином біологічно функціональний білок або пептид призначається для застосування у імунологічних варіантах здійснення, що розкриваються у цьому описі. За певними варіантами здійснення найбільша місцева середня гідрофільність білка, яка регулюється гідрофільністю прилеглих амінокислот, корелює з його імуногенністю та антигенністю, тобто з біологічними властивостями білка. Цим амінокислотним залишкам були приписані наведені нижче значення гідрофільності: аргінін (+3,0); лізин (+3,0); аспартат (+3,0±1); глутамат (+3,0+1); серин (+0,3); аспарагін (+0,2); глутамін (+0,2); гліцин (0); треонін (-0,4); пролін (-0,5+1); аланін (-0,5); гістидин (-0,5); цистеїн (-1,0); метіонін (-1,3); валін (-1,5); лейцин (-1,8); ізолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенілаланін (-2,5); і триптофан (3,4). При здійсненні замін, виходячи з подібних значень гідрофільності, за певними варіантами здійснення включають заміну амінокислот, значення гідрофільності яких знаходяться у межах ±2, за певними варіантами здійснення включають амінокислоти, значення гідрофільності яких знаходяться у межах +1, і за певними варіантами здійснення включають амінокислоти, значення гідрофільності яких знаходяться у межах +0,5. За послідовностями основних амінокислот, на основі гідрофільності, можуть також бути ідентифіковані антигенні детермінанти. Ці ділянки називають також "коровими ділянками антигенних детермінант". Зразкові амінокислотні заміни наведені у Таблиці 1. Таблиця 1 Амінокислотні заміни Вихідні залишки Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His lle Leu Заміни, яким віддають перевагу Val, Leu, lle Val Lys, Gln, Asn Lys Gln Gln Glu Glu Ser, Ala Ser Asn Asn Asp Asp Pro,Ala Ala Asn, Gln, Lys, Arg Arg Leu, Val, Met, Ala, Phe, Leu норлейцин норлейцин, llе, Val, Met, lle Ala, Phe Зразкові заміни 33 Lys Met Phe Pro Ser Thr Тrp Туr Val Arg, 1,4 діаміномасляна кислота, Gln, Asn Leu, Phe, lle Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Ala Thr, Ala, Cys Ser Tyr, Phe Тrp, Phe, Thr, Ser lle, Met, Leu, Phe, Ala, норлейцин 97086 Arg Leu Leu Gly Thr Ser Туr Phe Leu Досвідчений фахівець зможе визначити відповідні варіанти поліпептиду, як наведено у цьому описі, за допомогою добре відомих методів. За певними варіантами здійснення фахівець у цій галузі може визначити відповідні ділянки молекули, які можуть бути змінені без руйнування активності, обираючи мішенню ті ділянки, які, як гадають, не є важливими для активності. За іншими варіантами здійснень досвідчений фахівець може визначити залишки та ділянки молекул, які зберігаються серед подібних поліпептидів. За додатковими варіантами здійснень навіть ділянки, які можуть бути важливими для біологічної активності або для структури, можуть бути піддані консервативним амінокислотним замінам без знищення біологічної активності або без виявлення негативного впливу на структуру поліпептидів. На додаток до цього, фахівець у цій галузі може переглянути дані структурно-функціональних досліджень, які визначають залишки подібних поліпептидів, що є важливими для активності або структури. Приймаючи до уваги результати такого порівняння, досвідчений фахівець може прогнозувати важливість амінокислотних залишків у білку, що відповідають амінокислотним залишкам, важливим для активності або структури у подібних білків. Фахівець у цій галузі для таких визначених важливих амінокислотних залишків може вибрати хімічно подібні амінокислотні заміни. Фахівець у цій галузі може також проаналізувати об'ємну структуру і амінокислотну послідовність у зв'язку з такою структурою у подібних поліпептидів. Приймаючи до уваги таку інформацію, фахівець у цій галузі може прогнозувати впорядковане розміщення амінокислотних залишків антитіла відповідно до його об'ємної структури. За певними варіантами здійснення фахівець у цій галузі може уникнути варіанта внесення радикальних змін до амінокислотних залишків, які передбачаються на поверхні білка, оскільки такі залишки можуть бути залученими до важливих взаємодій з іншими молекулами. Більше того, фахівець у цій галузі може розробити експериментальні варіанти, які включають заміну однієї амінокислоти на кожному бажаному амінокислотному залишку. Після цього згадані варіанти можуть перевірятись у реакціях визначення активності, відомих фахівцям у цій галузі. Такі варіанти можуть застосовуватись для збирання інформації щодо придатних варіантів. Наприклад, у разі визначення того, що наслідком заміни певного амінокислотного залишку є знищена, небажано знижена або невідповідна активність, варіанти з такою заміною можуть виклю 34 чатись. Іншими словами, виходячи з інформації, зібраної шляхом подібних звичайних експериментів, фахівець у цій галузі може легко визначити амінокислоти, які слід виключити з процесу замін або самостійно, або у поєднанні з іншими мутаціями. Ряд наукових публікацій присвячено прогнозуванню вторинної структури. Дивись Молт (Moult), 1996, Curr. Op. in Biotech., 7:422-427; Чу (Chou) та інші, 1974, Biochemistry, 13:222-245; Чу (Chou) та інші, 1974, Biochemistry, 113:211-222: Чу (Chou) та інші, 1978, Adv. Enzymol Relat. Areas Моl. Biol., 47:45-148; Чу (Chou) та інші, 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; Чу (Chou) та інші, 1979, Biophys. J., 26:367-384. Окрім того, зараз є доступними комп'ютерні програми, що допомагають визначити вторинну структуру. Один із методів прогнозування вторинної структури базується на моделюванні гомології. Наприклад, два поліпептиди або білки, що мають ідентичність послідовності, яка перевищує 30%, або подібність, яка перевищує 40%, часто мають подібну структурну топологію. Нещодавнє збільшення обсягу бази даних із структури білків (PDB) забезпечує значне посилення ступеню прогнозованості вторинної структури, у тому числі потенційної кількості складок у межах структури поліпептиду або білка. Дивись Холм (Holm) та інші, 1999, Nucl. Acid. Res., 27:244-247. Висунули припущення (Бреннер (Brenner) та інші, 1997, Curr. Op. Struct. Biol., 7:369-376) про існування обмеженої кількості складок у даного поліпептиду або білка і про те, що після визначення критичної кількості структур, структурне прогнозування стане набагато точнішим. Додаткові методи прогнозування вторинної структури включають "нарізання різьби" (Джоунс (Jones), 1997, Curr. Op. Struct. Biol., 7:377-387; Сіпші (Sippl) та інші, 1996, Structure 4:15-19), "аналіз профілю" (Боуі (Bowie) та інші, 1991, Science 253:164-170; Грібсков (Gribskov) та інші, 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Грібсков (Gribskov) та інші, 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358) та "еволюційний зв'язок" (дивись Холм (Holm), 1999, (дивись вище); та Бреннер (Brenner), 1997 (дивись вище)). За певними варіантами здійснення варіанти антитіл включають глікозиловані варіанти, де кількість та/або тип сайту глікозилування був змінений, порівняно з амінокислотними послідовностями вихідного поліпептиду. За певними варіантами здійснення білкові варіанти включають більшу або меншу кількість N-зв'язаних сайтів глікозилування, аніж нативний білок. N-зв'язаний сайт глікозилування характеризується послідовністю: Asn-X-Ser або Asn-X-Thr, де амінокислотним залишком, позначеним як X, може бути будь-який амінокислотний залишок, за винятком проліну. Заміна амінокислотних залишків для одержання цієї послідовності забезпечує одержання потенційно нового сайту для додання N-зв'язаного вуглеводного ланцюга. За альтернативним варіантом заміни, які ліквідують цю послідовність, будуть видаляти існуючий N-зв'язаний вуглеводний ланцюг. Пропонується також реаранжування N-зв'язаних вуглеводних ланцюгів, де один або декілька N 35 зв'язаних сайтів глікозилування (як правило, природних) ліквідуються з утворенням одного або декількох нових N-зв'язаних сайтів. Додаткові варіанти антитіл, яким віддають перевагу, включають цистеїнові варіанти, де, порівняно з вихідною амінокислотною послідовністю, один або декілька цистеїнових залишків видаляють або замінюють на іншу амінокислоту (наприклад, серин). Цистеїнові варіанти можуть бути придатними у тому разі, коли антитіла повинні повторно укладатись до біологічно активної конформації, такої як, наприклад, після виділення нерозчинних тілець включення. Цистеїнові варіанти, як правило, мають меншу кількість залишків цистеїну, аніж нативний білок і, типово, мають парну їх кількість для зведення до мінімуму взаємодій, що є наслідком неспарованих залишків цистеїну. За додатковими варіантами здійснення варіанти антитіл можуть включати антитіла, що містять модифікований Fc-фрагмент або модифіковану константну ділянку важкого ланцюга. Fc-фрагмент (де скорочення означає "фрагмент, що кристалізується") або константна ділянка важкого ланцюга можуть бути модифіковані шляхом мутації для надання антитілу змінених характеристик зв'язування. Дивись, наприклад, Бартон (Burton), Буф (Woof), 1992, Advances in Immunology 51:1-84; Равеч (Ravetch), Болланд (Bolland), 2001, Annu. Rev. Immunol. 19:275-290; Шілдс (Shields) та інші, 2001, Journal of Вiol. Chem. 276:6591-6604; Теллман (Telleman), Джунханс (Junghans), 2000, Immunology 100:245-251; Медсан (Medesan) та інші, 1998, Eur. J. Immunol. 28:2092-2100; усі ці роботи включено до цього опису шляхом посилання. Такі мутації можуть включати заміни, додання, делеції або будь-яку їх комбінацію, і здійснюються, як правило, сайт-спрямованим мутагенезом із застосуванням одного або декількох мутагенних олігонуклеотидів за методами, опис яких наведено у цьому описі, або за методами, відомими у цій галузі (дивись, наприклад, Сембрук (Sambrook) та інші, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3 видання, 2001, Cold Spring Harbor, N.Y. та Бергер (Berger), Кіммел (Kimmel), METHODS IN ENZYMOLOGY, том 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, штат Каліфорнія, які включено до цього опису шляхом посилання). За певними варіантами здійснення амінокислотними замшами є заміни, які: (1) знижують сприйнятливість до протеолізу, (2) знижують сприйнятливість до окиснення, (3) змінюють зв'язувальну спорідненість для утворення білкових комплексів, (4) змінюють зв'язувальні спорідненості та/або (5) надають або модифікують інші фізикохімічні або функціональні властивості таких поліпептидів. За певними варіантами здійснення одиночна амінокислотна заміна або численні амінокислотні заміни (за певними варіантами здійснення консервативні амінокислотні заміни) можуть здійснюватись у природній послідовності (за певними варіантами здійснення на ділянці поліпептиду за межами домену(-ів), що забезпечує міжмолекулярні контакти). За варіантами здійснення, яким віддають перевагу, консервативна амінокислотна 97086 36 заміна, як правило, суттєво не змінює структурних характеристик вихідної послідовності (наприклад, замінна амінокислота не руйнує спіралі, що існує у вихідній послідовності, і не руйнує вторинної структури інших типів, що характеризує вихідну послідовність). Приклади визнаних у цій галузі вторинних та третинних структур поліпептидів описані у PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, (редактор Крейтон (Creighton)), 1984, W.H. Freeman and Company, New York; INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (редактори К. Бренден (С. Branden), Дж. Туз (J. Tooze)), 1991, Garland Publishing, New York, N.Y.; Торнтон (Thornton) та інші, 1991, Nature 354:105; кожну з цих робот включено до цього опису шляхом посилання. Аналоги пептидів широко застосовують у фармацевтичній промисловості як непептидні лікарські засоби з властивостями, аналогічними властивостям матричного пептиду. Непептидні сполуки такого типу називають "пептидними міметиками" або "пептидоміметиками". Дивись Фошер (Fauchere), 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Вебер (Veber), Фрідінгер (Freidinger), 1985, TINS, 392; Еванс (Evans) та інші, 1987, J. Med. Chem. 30:1229; усі ці роботи включено до цього опису шляхом посилання для будь-яких цілей. Такі сполуки часто розробляються за допомогою комп'ютеризованого молекулярного моделювання. Пептидоміметики, структурно подібні до терапевтично придатних пептидів, можуть застосовуватись для одержання подібного терапевтичного або профілактичного ефекту. Взагалі, пептидоміметики є структурно подібними до парадигматичного поліпептиду (тобто поліпептиду, що має біохімічну властивість або фармакологічну активність), наприклад, людського антитіла, але мають один або декілька пептидних зв'язків, факультативно заміненими зв'язком, вибраним з групи, що включає: -CH2-NH-, -CH2-S-, СН2-СН2-, -СН=СН- (цис і транс), -СООСН2-, СН(ОН)СН2- і -CH2SO-, методами, добре відомими у цій галузі. Систематична заміна однієї або декількох амінокислот консенсусної послідовності на D-амінокислоту того самого типу (наприклад, Dлізин замість L-лізину) може застосовуватись у певних варіантах здійснення для одержання більш стійких пептидів. На додаток до цього, обмежені пептиди, що містять консенсусну послідовність або по суті ідентичний варіант консенсусної послідовності, можуть одержуватись за допомогою методів, відомих у цій галузі (Різо (Rizo), Гераш (Gierasch), 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387; ця робота включена до цього опису шляхом посилання для будь-якої цілі); наприклад, шляхом додання внутрішніх залишків цистеїну, здатних до утворення міжмолекулярних дисульфідних містків, що циклізують пептид. Термін "антитіло" або "антитіло-пептид(-и)" означає інтактне антитіло або його зв'язувальний фрагмент, що конкурує з інтактним антитілом за специфічне зв'язування. За певними варіантами здійснення зв'язувальні фрагменти одержують методами рекомбінантних ДНК. За додатковими варіантами здійснення зв'язувальні фрагменти одержують шляхом ферментативного або хімічного розщеплення інтактних антитіл. Зв'язувальні 37 фрагменти включають (але ними не обмежуються) F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv та одноланцюгові антитіла. Термін "важкий ланцюг" включає будь-який імуноглобуліновий поліпептид, що має достатню послідовність варіабельної ділянки для надання специфічності відносно NGF. Термін "легкий ланцюг" включає будь-який імуноглобуліновий поліпептид, що має достатню послідовність варіабельної ділянки для надання специфічності відносно NGF. Непроцесований важкий ланцюг включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, Уц-ділянку, та три константні ділянки важкого ланцюга, СН1, СН2 і СН3. VH-ділянка знаходиться на амінокінці поліпептиду, СН3-ділянка знаходиться на карбоксильному кінці. Термін "важкий ланцюг", що застосовується у цьому описі, означає непроцесований важкий ланцюг та його фрагменти. Непроцесований легкий ланцюг включає варіабельну ділянку легкого ланцюга, VL-ділянку, та константну ділянку легкого ланцюга, CL-ділянку. Подібно важкому ланцюгу, варіабельна ділянка легкого ланцюга знаходиться на амінокінці поліпептиду. Термін "легкий ланцюг", що застосовується у цьому описі, означає непроцесований легкий ланцюг та його фрагменти. F(аb)-фрагмент включає один легкий ланцюг, CH1 і варіабельні ділянки одного важкого ланцюга. Важкий ланцюг молекули F(ab) не може утворювати дисульфідний зв'язок з іншою молекулою важкого ланцюга. F(ab')-фрагмент включає один легкий ланцюг і один важкий ланцюг, що містить більшу частину константної ділянки, між ділянками СH1 і СН2, завдяки чому між двома важкими ланцюгами може утворюватись міжланцюговий дисульфідний зв'язок з утворенням молекули F(ab')2. Fv-ділянка включає варіабельні ділянки як важкого, так і легкого ланцюгів, однак їй бракує константних ділянок. Одноланцюгові антитіла є молекулами Fv, у яких варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів з'єднуються гнучким лінкером з утворенням одного поліпептидного ланцюга, який являє собою антигензв'язувальну ділянку. Одноланцюгові антитіла докладно обговорюються у публікації міжнародної заявки на WO 88/01649 і патентах США № 4,946,778 і № 5,260,203. Слід розуміти, що двовалентне антитіло, окрім "мультиспецифічного" або "мультифункціонального" антитіла, за певними варіантами здійснення включає зв'язувальні сайти, що мають ідентичну антигенну специфічність. При визначенні зв'язування та специфічності антитіла за цим винаходом, антитіло по суті пригнічує адгезію ліганду до рецептора, коли надлишок антитіла зменшує кількість ліганду, зв'язаного з рецептором щонайменше приблизно на 20%, 40%, 60%, 80%, 85% або більше (що визначається, inter alia, із застосуванням in vitro реакції конкурентного зв'язування). Словосполучення "нейтралізуюче антитіло" означає молекулу антитіла, здатну блокувати або суттєво знизити ефекторну функцію антигенамішені, з яким вона зв'язується. Відповідно, "нейтралізуюче" анти-NGF антитіло є здатним блокувати або суттєво знизити ефекторну функцію NGF, наприклад, зв'язування з рецептором та/або викликання клітинної реакції. Словосполучення "сут 97086 38 тєво знизити" означає щонайменше приблизно 60%, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше приблизно 70%, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше приблизно 75%, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 80%, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 85%, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, щонайменше приблизно 90% зниження ефекторної функції антигена-мішені (наприклад, людського NGF). Термін "антигенна детермінанта" включає будь-яку детермінанту, за варіантом, якому віддають перевагу, поліпептидну детермінанту, здатну до специфічного зв'язування з імуноглобуліном або Т-клітинним рецептором. За певними варіантами здійснення антигенні детермінанти включають хімічно активні поверхневі групи молекул, наприклад, амінокислоти, бічні ланцюги цукрів, фосфорильні групи або сульфонільні групи, і за певними варіантами здійснення можуть мати специфічні об'ємні структурні характеристики та/або специфічні зарядні характеристики. Антигенна детермінанта являє собою ділянку антигену, яка зв'язується антитілом. За певними варіантами здійснення кажуть, що антитіло специфічно зв'язується з антигеном, коли воно переважно розпізнає свій антиген-мішень у складній суміші білків та/або макромолекул. За варіантами, яким віддають перевагу, кажуть, що антитіло специфічно зв'язується з антигеном, коли константа дисоціації у стані -8 рівноваги становить ≤10 М, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, коли константа дисоці-9 ації у стані рівноваги становить ≤10 Μ і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, коли константа дисоціації у стані рівноваги становить -10 ≤10 М. Антитіло зв'язує "по суті ту саму антигенну детермінанту", що і еталонне антитіло, коли два антитіла розпізнають ідентичні антигенні детермінанти або антигенні детермінанти, що стерично перекриваються. Найширше застосовуваними і швидкими методами визначення того, чи зв'язують два антитіла ідентичні антигенні детермінанти або антигенні детермінанти, що стерично перекриваються, є конкурентні реакції, які можуть розроблятись для здійснення у найрізноманітніших форматах, із застосуванням міченого антигену або міченого антитіла. Як правило, антиген іммобілізують на субстраті, і здатність немічених антитіл до блокування зв'язування мічених антитіл визначається за допомогою радіоактивних або ферментних міток. Термін "агент" застосовують у цьому описі для позначення хімічної сполуки, суміші хімічних сполук, біологічної макромолекули або екстракту, одержаного з біологічних матеріалів. Терміни "мітка" або "мічений", що застосовуються у цьому описі, означають включення виявного маркера, наприклад, шляхом включення амінокислоти, міченої радіоактивним ізотопом, або приєднання до поліпептиду біотинових складових, які можуть бути виявлені міченим авідином (наприклад, стрептавідином, який, за варіантом, якому віддають перевагу, містить виявний маркер, 39 наприклад, флуоресцентний маркер, хемілюмінесцентний маркер, або який має ферментативну активність, що може бути виявлена оптичними або колориметричними методами). За певними варіантами здійснення згадана мітка може також бути терапевтичною. У цій галузі відомі різні методи мічення поліпептидів і глікопротеїнів, які можуть ефективно бути застосовані у методах, що розкриваються у цьому описі. Прикладами міток для поліпептидів є (але ними не обмежуються) наведені нижче: радіоактивні ізотопи або радіоактивні 3 14 15 35 90 99m нукліди (наприклад, Н, С, N, S, Y, Tc, 111 125 131 Іn, I, I), флуоресцентні мітки (наприклад, флуоресцинізотіоціанат або FITC, родамін або лантаноїдні люмінофори), ферментативні мітки (наприклад, пероксидаза з хрону, β-галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза), хемілюмінесцентні мітки, гаптенові мітки, наприклад, біотинільні групи, та попередньо визначені поліпептидні антигенні детермінанти, розпізнані вторинним репортером (наприклад послідовності зі зв'язаними парами залишків лейцину, зв'язувальні сайти вторинних антитіл, ділянки зв'язування металів або мітки антигенних детермінант). За певними варіантами здійснення мітки приєднуються спейсерними групами (наприклад (СН2)n, де n