Виділене людське або гуманізоване антитіло, яке специфічно зв’язується з іl-13

1. Виділене людське або гуманізоване антитіло, яке специфічно зв’язується з IL-13, що містить антигензв’язуючу ділянку, у якій H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3, і L-CDR1, L-CDR2 і L-CDR3 ділянки, представлені на амінокислотній послідовності, разом являють собою SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 і SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21. 2. Антитіло за п. 1, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка має послідовність SEQ ID NO:31, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка має послідовність SEQ ID NO:33, або послідовність, ідентичну їм щонайменше на 90 %. 3. Антитіло за п. 1 або п. 2, яке являє собою IgG1 або IgG4. 4. Фармацевтична композиція, що містить антитіло або його функціонально активний фрагмент за будь-яким з пп. 1-3 та фармацевтично прийнятний носій або ексципієнт. UA (21) a200804983 (22) 19.10.2006 (24) 10.11.2011 (86) PCT/EP2006/010098, 19.10.2006 (31) 0521509.0 (32) 21.10.2005 (33) GB (31) 0616666.4 (32) 22.08.2006 (33) GB (46) 10.11.2011, Бюл.№ 21, 2011 р. (72) КЕМПБЕЛЛ ЕММА МІШЕЛЬ, GB, ПАРВІН СОФІЯ, GB, БЮХЛЕР ДЖО, US, ВЕЛКІРС ГУНАРС, US (73) НОВАРТІС АГ, CH (56) WO 2004050850 A, 17.06.2004. WO 2005007699 A2, 27.01.2005. WO 2005091853 A, 06.10.2005. WO 2006055638 A, 26.05.2006. WO 2006124451 A, 23.11.2006. YANG G ET AL: "Anti-IL-13 monoclonal antibody inhibits airway hyperresponsiveness, inflammation and airway remodeling" CYTOKINE, ACADEMIC PRESS LTD, PHILADELPHIA, PA, US, vol. 28, no. 6, 21 December 2004 (2004-12-21), pages 224-232, XP004654755 ISSN: 1043-4666. C2 2 (19) 1 3 1497-1504, Corrigan С. J. і А. В. Kay, Int Arch Allergy Appl Immunol, 94 (1-4), 1991, cc. 270-271, Bentley A. M. і ін., Am J Respir Cell Mol Biol, 1993]. Хоча вперше IL-13 ідентифікований як цитокін, виведений з Th2-CD4+-лімфоцитів, він продукується також Th1-CD4+- Т-клітинами, NK-клітинами типу CD8+-T лімфоцитів і популяціями клітин, що не відносяться до Т-клітин, такими як опасисті клітини, базофіли, еозинофіли, макрофаги, моноцити і гладком'язові клітини дихальних шляхів. Відомо, що IL-13 проявляє свою дію через систему рецепторів, що включає ланцюг (IL-4R) рецептора IL-4, що сама по собі може зв'язуватися з IL-4, але не з IL-13, і по меншій два інших білка клітинної поверхні, IL-13R1 і IL-13R2 [Murata T. і ін., Int J Hematol, 69(1), 1999, cc. 13-20, Andrews A.L. і ін., J Biol Chem, 277(48), 2002, cc. 4607346078.]. IL-13R1 може зв'язуватися з IL-13 з низкою афінністю і, як наслідок, залучає IL- 4R у формування функціонального рецептора, який має високу афінність, що бере участь у передачі сигналів [Miloux В. і ін., FEBS Lett, 401 (2-3), 1997, сс. 163-166, Hilton D. J. і ін., Proc Natl Acad Sci USA, 93 (1), 1996, сс. 497-501]. У базі даних Genbank амінокислотна послідовність і нуклеотидна послідовність IL-13R1 перебувають під номерами NP 001551 і Y10659 відповідно. Дослідження, проведене з використанням мишей з дефіцитом STAT6 (signal transducer and activator of transcription 6, трансдуктор сигналу і активатор транскрипції 6), дозволило встановити, що IL-13, аналогічно IL-4 передає сигнали за допомогою JAK-STAT6-шляхи [Kuperman D. і ін., J Exp Med, 187 (6), 1998, сс. 939948, Nelms K. і ін., Annu Rev Immunol, 17, 1999, сс. 701-738.]. Амінокислотна послідовність IL-13R2 ідентична на 37% послідовності IL-13R1 і зв'язується з IL-13 з високою афінністю [Zhang J. G. і ін., J Biol Chem, 272 (14), 1997, сс. p. 9474- 9480, Caput D. і ін., J Biol Chem, 271 (28), 1996, сс. 16921-16926.]. Однак IL-13R2 має більш короткий цитоплазматичний «хвіст», позбавлений відомих мотивів, що беруть участь у передачі сигналу. Клітини, що експресують IL-13R2, не мають чутливості до IL-13 навіть у присутності IL-4R [Kawakami K. і ін., Blood, 97 (9), 2001, сс. 2673-2679]. Таким чином, вважається, що IL-13R2 діє у якості рецептора-«пастки», що регулює функцію IL-13, але не регулює функцію IL-4. Це підтверджено дослідженнями, проведеними з використанням мишей з дефіцитом IL-13R2, фенотип яких відрізнявся підвищеною здатністю відповідати на IL-13 [Wood N. і ін., J Exp Med, 197 (6), 2003, сс. 703-709, Chiaramonte М. G. і ін., J Exp Med, 197 (6), 2003, сс. 687-701]. У базі даних Genbank амінокислотна послідовність і нуклеотидна послідовність IL-13R2 перебувають під номерами NP000631 і Y08768 відповідно. Короткий виклад суті винаходу Одним з варіантів здійснення винаходу є виділене людське або гуманізоване антитіло, або його функціонально активний фрагмент із антигензв'язуючою ділянкою, що має специфічність відносно білка-мішені, тобто IL-13, де антитіло або його функціонально активний фрагмент зв'язується з 96426 4 IL-13. У спорідненому варіанті здійснення винаходу зв'язування з IL-13 визначають щонайменше по зв'язуванню рецептора, що знаходиться на клітинній поверхні, IL-13, що попереджає вивільнення медіатора запалення. Наступним об'єктом даного винаходу є виділена антигензв'язуюча ділянка антитіла або його функціонального фрагмента. У конкретних варіантах здійснення винаходу антигензв'язуюча ділянка включає H-CDR3-ділянку, що має амінокислотну послідовність, обрану з SEQ ID NO:9-10 і їхніх консервативних варіантів. Як описано нижче, консервативні варіанти включають амінокислотні залишки з будь-яких ідентифікованих амінокислотних послідовностей. У спорідненому варіанті здійснення винаходу виділена антигензв' язуюча ділянка являє собою H-CDR2-ділянку, що має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:8, і її консервативні варіанти. В іншому спорідненому варіанті здійснення винаходу виділена антигензв'язуюча ділянка являє собою H-CDR1-ділянку, що має амінокислотну послідовність, обрану з SEQ ID NO:6-7 і їхніх консервативних варіантів. В іншому варіанті здійснення винаходу виділена антигензв'язуюча ділянка являє собою L-CDR3ділянку, що має амінокислотну послідовність, обрану з SEQ ID NO:20-22 і їхніх консервативних варіантів. У ще одному спорідненому варіанті здійснення винаходу виділена антигензв'язуюча ділянка являє собою L-CDR1-ділянку, що має амінокислотну послідовність, обрану з SEQ ID NO:16-18 і їхніх консервативних варіантів. У наступному спорідненому варіанті здійснення винаходу виділена антигензв'язуюча ділянка являє собою L-CDR2ділянку, що має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:19, і її консервативні варіанти. У конкретних варіантах здійснення винаходу антигензв'язуюча ділянка являє собою варіабельну область легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, обрану з SEQ ID: 16-22 і їхніх консервативних варіантів. В іншому варіанті здійснення винаходу виділена антигензв'язуюча ділянка являє собою важкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність, обрану з однієї-трьох послідовностей, представлених в SEQ ID: 6-10, і де послідовність ідентична щонайменше на 60, 70, 80, 90 або 95% CDRділянкам, де CDR-ділянки мають послідовність, представлену в SEQ ID NO:6-10. У спорідненому варіанті здійснення винаходу виділена антигензв'язуюча ділянка являє собою легкий ланцюг, амінокислотну послідовність якої вибирають із однієїтрьох послідовностей, представлених в SEQ ID: 16-22, і де послідовність ідентична щонайменше на 60, 70, 80, 90 або 95% CDR-ділянкам, де CDRділянки мають послідов-ність, представлену в SEQ ID NO:16-22. У конкретному варіанті здійснення винаходу виділене антитіло являє собою IgG. В іншому варіанті здійснення винаходу виділене антитіло являє собою IgG1 або IgG4. Наступним варіантом здійснення винаходу є виділене людське або гуманізоване антитіло, або його функціонально активний фрагмент, антигенз 5 в'язуюча ділянка якого є специфічною по відношенню до епітопу IL-13, і де антитіло або його функціонально активний фрагмент зв'язуються з розташованими на поверхні клітин рецепторами IL-13. Спорідненим варіантом здійснення винаходу є виділене людське або гуманізоване антитіло, або його функціональний фрагмент, антигензв'язуюча ділянка якого є специфічною по відношенню до епітопу IL-13-мішені, і де епітоп містить один або кілька амінокислотних залишків з амінокислотних залишків 1-112 IL-13-мішені. У спорідненому варіанті здійснення винаходу епітоп являє собою конфірмаційний епітоп. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло або функціонально активний фрагмент являє собою Fab- або scFv-фрагмент антитіла. У спорідненому варіанті здійснення винаходу виділене антитіло являє собою IgG. В іншому спорідненому варіанті здійснення винаходу виділене антитіло являє собою IgG1 або IgG4. Іншим варіантом здійснення винаходу є фармацевтична композиція, що містить щонайменше одне із зазначених вище антитіл або їх функціонально активних фрагментів, або консервативних варіантів і фармацевтично прийнятний носій або ексципієнт. Наступним варіантом здійснення винаходу є трансгенна тварина, що несе ген, що кодує кожне(ий) із зазначених вище антитіл або їх функціонально активних фрагментів. Конкретними варіантами здійснення винаходу є спосіб лікування порушення або стану, асоційованого із присутністю клітини, що несе рецептормішень для IL-13. Спосіб полягає в тому, що вводять індивідууму, який цього потребує, в ефективній кількості кожну із зазначених вище фармацевтичних композицій. У спорідненому варіанті здійснення винаходу підлягаюче лікуванню порушення або стан представляє респіраторне порушення. В іншому варіанті здійснення винаходу порушення або стан, що потребує лікування, являє собою бронхіальну астму, що представляє собою загальне персистентне запальне захворювання легенів, що характеризується гіперчутливістю дихальних шляхів (AHR), надлишковим виробленням слизу, фіброзом і підвищеними рівнями IgE у сироватці. Li зі співавторами в: рефераті постера, представленого на The American Thoraics Society Annual Meeting, 2003, Сіетл, представили дані про вплив нейтралізуючого антитіла до мишачого IL13, отримані при використанні моделі хронічної астми, створеної на мишах. В іншому варіанті здійснення винаходу порушення або стан, що потребує лікування, являє собою хронічне обструктивне захворювання легенів (ХОЗЛ). Zheng зі співавторами в: J Clin Invest, 106 (9), 2000, cc. 1081-1093, продемонстрували, що надекспресія IL-13 у легенях мишей викликала емфізему, підвищене вироблення слизу й запалення, що відповідає ознакам людського ХОЗЛ. Встановлено, що рівні мРНК IL-13 вище в отриманих при аутопсії зразках з організму індивідуумів, що мають в історії хвороби ХОЗЛ, у порівнянні зі зразками легенів з організму індивідуумів без 96426 6 ознак захворювання легенів (J. Elias, усна доповідь на American Thoracic Society Annual Meeting 2002). В іншому дослідженні підвищені рівні IL-13 продемонстровані за допомогою імуногістохімічного аналізу в периферичних зрізах легені пацієнтів, що страждають на ХОЗЛ [Wardlaw A. J., Clin Med, 1 (3), 2001, cc. 214-218]. В іншому варіанті здійснення винаходу порушення або стан, що потребує лікування, вибирають із інших запальних або обструктивних захворювань і станів дихальних шляхів, таких як гостре легеневе ушкодження (ALI), гострий/респіраторний дистрес-синдром дорослих (РДСД), задишка, алергійне запалення дихальних шляхів, захворювання дрібних дихальних шляхів, карционома легені, гострий грудний синдром у пацієнтів із захворюванням серповидних еритроцитів і легеневою гіпертензією, а також загострення гіперактивності дихальних шляхів, пов'язане з іншою лікарською терапією, насамперед іншою інгаляційною лікарською терапією. В іншому варіанті здійснення винаходу порушення або стан, що потребує лікування, являє собою бронхіт будь-якого типу і генеза, у тому числі, наприклад, гострий, арахідний, катаральний, крупозний, хронічний або гнійний туберкульозний бронхіт. У наступному варіанті здійснення винаходу порушення або стан, що потребує лікування, являє собою пневмоконіоз (запальне зазвичай професійне захворювання легенів, що часто супроводжується обструкцією дихальних шляхів, що може бути хронічним або гострим, і причиною якого є повторюване вдихання пилу) будь-якого типу й генезу, включаючи, наприклад, алюміноз, антракоз, асбестоз, халікоз, птилоз, синероз, силікоз, табакоз і бісиноз. В іншому варіанті здійснення винаходу порушення або стан, що потребує лікування, вибирають із атопічного риніту (сінна лихоманка), алергійного дерматиту (екзема) і хронічного синуситу. Підвищені рівні IL-13 виявлені в людей, що страждають атопічним ринітом (сінна лихоманка), алергійним дерматитом (екзема) і хронічним синуситом. Наприклад, у пацієнтів, що страждають на астму, більш високі рівні IL-13 у порівнянні з контролем виявлені в клітинах, отриманих при біопсії легені, у мокротинні й бронхоальвеолярному лаважі (БАЛ) [Humbert М. і ін., J Allergy Clin Immunol, 99 (5), 1997, cc. p. 657-665, Kotsimbos Т. С., P. Ernst і Q. A. Hamid, Proc Assoc Am Physicians, 108 (5), 1996, cc. 368-373, Komai-Koma M., F.Y. Liew і P.C. Wilkinson, J Immunol, 155 (3), 1995, cc. 11101116, Naseer T. і ін., Am J Respir Crit Care Med, 1997]. У наступному варіанті здійснення винаходу порушення або стан, що потребує лікування, вибирають із інших запальних захворювань шкіри, наприклад, псоріазу або червоного вовчака. В іншому варіанті здійснення винаходу порушення або стан, що потребує лікування, являє собою запальне захворювання кишечника, таке як неспецифічний виразковий коліт і хвороба Крона. Heller зі співавторами, Immunity, 17 (5), 2002, сс. 629-638, опублікували дані про те, що нейтраліза 7 ція IL-13 за допомогою введення розчинного IL13R2 полегшувала запалення ободової кишки на мишачій моделі людського неспецифічного виразкового коліту. Рівень експресії IL-13 виявився відповідно більш високим у зразках ректальної біопсії, взятих у пацієнтів з неспецифічним виразковим колітом, у порівнянні з контролем. У наступному варіанті здійснення винаходу порушення або стан, що потребує лікування, вибирають із інших фіброзних станів, таких як системний склероз, фіброз легені, ідіопатичний легеневий фіброз або фіброма легені. Підвищені рівні IL13 виявлені в сироватці пацієнтів, що страждають системним склерозом [Hasegawa M. і ін., J Rheumatol, 24 (2), 1997, сс. 328-332], і в зразках БАЛ пацієнтів, уражених іншими формами фіброзу легенів [Hancock А. і ін., Am J Respir Cell Mol Biol, 1998]. В іншому варіанті здійснення винаходу порушення або стан, що потребує лікування, являє собою фіброз печінки. Специфічне інгібування IL13 за допомогою введення розчинного IL-13R2 або порушення гена IL-13 при збереженні здатності до вироблення IL-4 попереджало фіброгенез у печінці [Fallon P. G. і ін., J Immunol, 164 (5), 2000, сс. 2585-2591, Chiaramonte M.G. і ін., J Clin Invest, 104 (6), 1999, сс. 777-785, Chiaramonte М. G. і ін., Hepatology, 34(2), 2001, сс. 273-282.]. У наступному варіанті здійснення винаходу порушення або стан, що потребує лікування, являє собою хворобу Ходжкіна. Хвороба Ходжкіна відрізняється від інших злоякісних захворювань тим, що на частку неопластичних клітин РідаШтернберга (двоядерні клітини), які часто утворюються з B-клітин, припадає лише невелика частина маси клітин, що виявляється клінічно. Лінії клітин, виділені при хворобі Ходжкіна, і первинні клітини Ріда-Штернберга часто експресують IL-13 і його рецептор [Skinnider В. F. і ін., Blood, 97(1), 2001, сс. 250-255]. Оскільки IL-13 збільшує виживання і клітинну проліферацію здорових B-клітин, зроблено припущення про те, що IL-13 може впливати у якості фактора росту клітин Ріда-Штернберга. Skinnider зі співавторами продемонстрували, що нейтралізуючі антитіла до IL-13 можуть in vitro інгібувати лінії клітин, виділені при хворобі Ходжкіна [Kapp U. і ін., J Exp Med, 189 (12), 1999, сс. 19391946.]. Ці дані дозволяють припустити, що в клітин Ріда-Штернберга може підвищуватися їхня здатність до виживання за допомогою аутокринної і паракринної цитокінової петлі IL-13. Відповідно до зазначеної гіпотези підвищені рівні IL-13 виявлені в сироватці деяких пацієнтів, що страждають на хворобу Ходжкіна, у порівнянні зі здоровими людьми, які використовуються у якості контролю [Fiumara P., F. Cabanillas і A. Younes, Blood, 98 (9), 2001, сс. 2877-2878.]. Таким чином, інгібітори IL-13 можуть перешкоджати розвитку хвороби шляхом інгібування проліферації злоякісних клітин РідаШтернберга. В іншому варіанті здійснення винаходу порушення або стан, що потребує лікування, являє собою рецидив або метастази пухлини. Установлено, що інгібування IL-13 підвищує ефективність противірусних вакцин на моделях, створених з 96426 8 використанням тварин, і може сприятливо впливати при лікуванні пов'язаних з ВІЧ і інших інфекційних хвороб [Ahlers J. D. і ін., Proc Natl Acad Sсi USA, 2002]. Цілий ряд людських ракових клітин експресує імуногенні специфічні для пухлини антигени. Однак хоча для цілого ряду пухлин характерний спонтанний регрес, багато пухлин «ухиляються» від дії імунної системи (імунологічний нагляд), придушуючи опосередкований Тклітинами імунітет. Terabe зі співавторами в: Nat Immunol, 1 (6), 2001, сс. 515-520, продемонстрували роль IL-13 в імуносупресії на мишачій моделі, на якій відбувався спонтанний регрес пухлин після початкового росту, а потім спостерігався рецидив. Специфічне інгібування IL-13 за допомогою розчинного IL-13R2 захищало мишей від рецидиву пухлин. Terabe зі співавторами просунулися далі, довівши, що IL-13 придушує диференціровку специфічних для пухлин цитотоксичних СD8+лімфоцитів, які опоскредковують протипухлинні імунні відповіді. У наступному варіанті здійснення винаходу порушення або стан, що потребує лікування, являє собою респіраторну вірусну інфекцію, що загострює хронічні стани, які лежать в їх основі, такі як астма, хронічний бронхіт, ХОЗЛ, запалення середнього вуха й синусит. Підлягаючому лікуванню респіраторна вірусна інфекція може бути пов'язана із вторинною бактеріальною інфекцією, такою як запалення середнього вуха, синусит або пневмонія. В іншому варіанті здійснення винаходу порушення або стан, що потребує лікування, вибирають із інших захворювань або станів, насамперед захворювань або станів, які мають запальний компонент, наприклад, хвороб кісткової тканини й суглобів, включаючи ревматоїдний артрит, псоріатичний артрит, і інших захворювань, таких як атеросклероз, розсіяний склероз і гостре й хронічне відторгнення трансплантата, наприклад, після трансплантації серця, нирки, печінки, легкого або кісткового мозку. У наступному варіанті здійснення винаходу порушення або стан, що потребує лікування, являє собою ендотоксичний шок, гломерулонефрит, церебральну і кардинальну ішемію, хворобу Альцгеймера, фіброзно-кістозну дегенерацію, вірусні інфекції й пов'язані з ними загострення захворювань, синдром набутого імундефіциту (СНІД), розсіяний склероз (PC), асоційований з Helicobacter pylori гастрит і різні форми раку, насамперед ріст раку яєчника. В іншому варіанті здійснення винаходу порушення або стан, що потребує лікування, являє собою симптоми, що викликані вірусною інфекцією в людини, збудниками яких є людський риновірус, інші ентеровіруси, коронавірус, вірус герпеса простого, вірус грипу, вірус парагрипу, респіраторносинцитиальний вірус або аденовірус. Згідно з даним винаходом лікування може бути симптоматичним або профілактичним. Ефективність агента, що пропонується у винаході, у відношенні інгібування запальних станів, наприклад, запальних захворювань дихальних шляхів, можна продемонструвати на створені на 9 тваринних моделях, наприклад, мишачої, щурячої або кролячої моделі, запалення дихальних шляхів або інших запальних станів, які описані, наприклад, в Wada і ін., J. Exp. Med, 180, 1994, сс. 11351140; Sekido і ін., Nature, 365, 1993, сс. 654-657; Modelska і ін., Am. J. Respir. Crit. Care. Med, 160, 1999, сс. 1450-1456; і Laffon і ін., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160, 1999, сс. 1443-1449. Наступним об'єктом винаходу є спосіб ідентифікації клітини, що несе рецептор IL-13. Зазначений спосіб полягає в тому, що приводять у контакт клітину з кожним з вищеописаних антитіл або фрагментів антитіл, які додатково мають мітку, що виявляється. Мітка може являти собою радіоактивну, флуоресцентну, магнітну, парамагнітну або хемілюмінісцентну мітку. Спосіб може полягати також у тому, що здійснюють будь-яку візуалізацію або виявлення міченої клітини. В іншому варіанті здійснення винаходу будьякі з вищевказаних людських або гуманізованих антитіл або фрагментів антитіл є синтетичними. Наступним варіантом здійснення винаходу є фармацевтична композиція і додатковий терапевтичний агент. Додатковий терапевтичний агент можна вибирати із групи, що включає протизапальні, бронходілататорні, протигістамінні або протикашльові лікарські субстанції, насамперед призначені для лікування обструктивних або запальних захворювань дихальних шляхів, таких як перераховані вище захворювання, наприклад, як підсилювачі терапевтичної активності таких лікарських засобів або для зниження необхідних доз або можливих побічних дій зазначених лікарських засобів. Терапевтичний агент, що пропонується у винаході, можна змішувати з іншою лікарською субстанцією у фіксованій фармацевтичній композиції або його можна вводити окремо, до, одночасно або після іншої лікарської субстанції. Таким чином, винахід, що відноситься до комбінації агента, який пропонується у винаході, як він зазначений вище, з протизапальною, бронходілататорною, протигістамінною або протикашлевою лікарською субстанцією, причому зазначений агент, що пропонується у винаході, і зазначена лікарська субстанція можуть перебувати в одній і тій же або різних фармацевтичних композиціях. Прийнятними протизапальними лікарськими субстанціями є стероїди, зокрема, глюкокортикостероїди, такі як будесонід, бекламетазону дипропіонат, флутиказону пропіонат, циклесонід або мометазона фуроат, або стероїди, описані в WO 02/88167, WO 02/12266, WO 02/100879, WO 02/00679 (насамперед описані в прикладах 3, 11, 14, 17, 19, 26, 34, 37, 39, 51, 60, 67, 72, 73, 90, 99 і 101), WO 03/35668, WO 03/48181, WO 03/62259, WO 03/64445, WO 03/72592, WO 04/39827 і WO 04/66920; нестероїдні агоністи глюкокортикоїдного рецептора, наприклад, описані в DE 10261874, WO 00/00531, WO 02/10143, WO 03/82280, WO 96426 10 03/82787, WO 03/86294, WO 03/104195, WO 03/101932, WO 04/05229, WO 04/18429, WO 04/19935 і WO 04/26248; антагоністи LTB4 (лейкотріен B4), такі як BIIL 284, СР-195543, DPC11870, LTB4 етаноламід, LY 293111, LY 255283, CGS025019C, СР-195543, ONO-4057, SB 209247, SC-53228 і описані в US 5451700; антагоністи LTD4 (лейкотріен D4), такі як монтелукаст, пранлукаст, зафірлукаст, аколат, SR2640, Wy-48,252, ІСІ 198615, МK-571, LY-171883, Ro 24-5913 і L-648051; інгібітори PDE4 (циклічна нуклеотидна фосфодиестераза 4), такі як циломіласт (Ariflo® фірма GlaxoSmithKline), рофлуміласт (фірма Byk Gulden),V-11294А (фірма Napp), BAY19-8004 (фірма Bayer), SCH-351591 (фірма Schering-Plough), арофілін (фірма Almirall Prodesfarma), PD189659 / PD168787 (фірма Parke-Davis), AWD-12-281 (фірма Asta Medica), CDC-801 (фірма Celgene), Se1CID(TM) CC-10004 (фірма Celgene), VM554/UM565 (фірма Vernalis), T-440 (фірма Tanabe), KW-4490 (фірма Kyowa Hakko Kogyo) і описані в WO 92/19594, WO 93/19749, WO 93/19750, WO 93/19751, WO 98/18796, WO 99/16766, WO 01/13953, WO 03/104204, WO 03/104205, WO 03/39544, WO 04/000814, WO 04/000839, WO 04/005258, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/018431, WO 04/018449, WO 04/018450, WO 04/018451, WO 04/018457, WO 04/018465, WO 04/019944, WO 04/019945, WO 04/045607 і WO 04/037805; агоністи А2А, наприклад, описані в ЕР 1052264, EP 1241176, EP 409595A2, WO 94/17090, WO 96/02543, WO 96/02553, WO 98/28319, WO 99/24449, WO 99/24450, WO 99/24451, WO 99/38877, WO 99/41267, WO 99/67263, WO 99/67264, WO 99/67265, WO 99/67266, WO 00/23457, WO 00/77018, WO 00/78774, WO 01/23399, WO 01/27130, WO 01/27131, WO 01/60835, WO 01/94368, WO 02/00676, WO 02/22630, WO 02/96462 і WO 03/086408; і антагоністи А2В, наприклад, описані в WO 02/42298. Прийнятними бронходілататорними лікарськими засобами є антихолінергіські або антимускаринні агенти, зокрема, іпратропія бромід, окситропія бромід, солі тіотропія та CHF 4226 (фірма Chiesi), і глікопіролат, а також описані в ЕР 424021, US 3714357, US 5171744, WO 01/04118, WO 02/00652, WO 02/51841, WO 02/53564, WO 03/00840, WO 03/33495, WO 03/53966, WO 03/87094, WO 04/018422 і WO 04/05285; і агоністи бета-2-адренорецептора, такі як албутерол (салбутамол), метапротеренол, тербуталін, салметерол, фенотерол, прокатерол і насамперед форматерол, кармотерол і його фармацевтично прийнятні солі, і сполуки (у вільній формі або у формі солі або сольвату) формули І, описані в WO 00/75114, що включений у даний опис як посилання, переважно сполуки з наведених у зазначеному документі прикладів, насамперед сполуки формули 11 тобто (5-[(R)-2-(5,6-диетиліндан-2-іламіно)-1гідроксиетил]-8-гідрокси-1Н-хінолін-2-он), і її фармацевтично прийнятні солі, а також сполуки (у вільній формі або у формі солі або сольвату) формули І, описані в WO 04/16601, а також сполуки, описані в ЕР 1440966, JP 05025045, WO 93/18007, WO 99/64035, US 2002/0055651, WO 01/42193, WO 01/83462, WO 02/66422, WO 02/ 70490, WO 02/76933, WO 03/24439, WO 03/42160, WO 03/42164, WO 03/72539, WO 03/91204, WO 03/99764, WO 04/16578, WO 04/22547, WO 04/32921, WO 04/33412, WO 04/37768, WO 04/37773, WO 04/37807, WO 04/39762, WO 04/39766, WO 04/45618 WO 04/46083 , WO 04/80964, EP1460064, WO 04/087142, WO 04/089892, EP 01477167, US 2004/0242622, US 2004/0229904, WO 04/108675, WO 04/108676, WO 05/033121, WO 05/040103 і WO 05/044787. Прийнятні протизапальні та бронходілататорні лікарські засоби подвійної дії включають агоністи, що мають подвійну дію, бета-2 адренорецептора /мускаринові антагоністи, наприклад, описані в US 2004/0167167, WO 04/74246 і WO 04/74812. Прийнятними антигістамінними лікарськими субстанціями є цетиризина гідрохлорид, ацетамінофен, клемастину фумарат, прометазин, лоратидін, деслоратидін, дифенгідрамін і фексофенадіну гідрохлорид, активастін, астемізол, азеластін, ебастін, епінастін, мізоластін і тефенадін, а також описані в JP 2004107299, WO 03/099807 і WO 04/026841. Можна застосовувати також комбінації терапевтичних агентів, що пропонуються у винаході, і антихолінергічних або антимускарінних агентів, стероїдів, агоністів бета-2, інгібіторів PDE4, агоністів рецептора допаміну, антагоністів LTD4 або антагоністів LTB4. Іншими прийнятними комбінаціями агентів, що пропонуються у винаході, і протизапальних лікарських засобів є комбінації з іншими антагоністами хемокінових рецепторів, наприклад, CCR-1, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9 і CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, зокрема антагоністи CCR-5, такі як антагоністи фірми Schering-Plough SC-351125, SCH-55700 і SCH-D, антагоністи фірми Takeda, такі як хлорид N-[[4-[[[6,7-дигідро-2-(4метилфеніл)-5Н-бензоциклогептен-8іл]карбоніл]аміно]феніл]метил]тетрагідро-N,Nдиметил-2Н-піран-4-аміно (ТАK-770), антагоністи CCR-5, описані в US 6166037 (насамперед у п.п. 18 і 19), WO 0066558 (насамперед за п. 8), WO 0066559 (насамперед у п. 9), WO 04/018425 і WO 04/026873. 96426 12 Додатковий терапевтичний агент можна вибирати із групи, що включає молекули, що зв'язують інші цитокіни, насамперед антитіла до інших цитокінів, зокрема, комбінацію з антитілом до IL4, описану в РСТ/ЕР2005/00836, з антитілом до IgE, таким як Xolair®, антитілом до IL31, антитілом до IL31R, антитілом до TSLP, антитілом до рецептора TSLP, антитілом до ендоглину, антитілом до IL1b або антитілом до IL13, наприклад, описане в WO 05/007699. Конкретним варіантом здійснення винаходу є антитіло, що має першу амінокислотну послідовність, що являє собою послідовність важкого ланцюга, обрану з 1-3 послідовностей, представлених в SEQ ID NO:6-10, і послідовність, що щонайменше на 60, 70, 80, 90 або 95% ідентична послідовності CDR-ділянок, де CDR-ділянки мають послідовність, представлену в SEQ ID NO:6-10; і другу амінокислотну послідовність, що являє собою послідовність легкого ланцюга, обрану з 1-3 послідовностей, представлених в SEQ ID NO:16-22, і послідовність, що щонайменше на 60, 70, 80, 90 або 95% ідентична послідовності CDR-ділянок, де CDR-ділянки мають послідовність, представлену в SEQ ID NO:16-22. Наступним варіантом здійснення винаходу є імунокон'югат, що складається з першого компонента, що являє собою антитіло або його фрагмент, і другого компонента, що має другу амінокислотну послідовність. Наприклад, імунокон'югат являє собою цитотоксин, або імунокон'югат являє собою єднальний білок або антитіло, що має здатність до специфічного зв'язування з мішенню, відмінною від IL-13. Конкретним варіантом здійснення винаходу є біспецифічне антитіло. Іншим варіантом здійснення винаходу є набір, що містить антитіло або фрагмент антитіла. У деяких варіантах здійснення винаходу набір містить фармацевтично прийнятний носій або ексципієнт. В інших споріднених варіантах здійснення винаходу антитіло в наборі присутнє у вигляді стандартної дози. В іншому спорідненому варіанті здійснення винаходу набір включає інструкції із застосування для пацієнта. Докладний опис винаходу Даний винахід відноситься до виділених антитіл, насамперед людським антитілам, які специфічно зв'язуються з IL-13 і які інгібують функціональну активність IL-13. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла, що пропонуються у винаході, одержують із конкретних послідовностей важкого та легкого ланцюга, і/або вони містять конкретні структурні особливості, такі як CDR-ділянки, які містять конкретні амінокислотні послідовності. У винаході пропонуються виділені антитіла, способи одержання зазначених антитіл, імунокон'югати і біспецифічні молекули, що містять зазначені антитіла, і фармацевтичні композиції, які містять антитіла, імунокон'югати або біспецифічні молекули, що пропонуються у винаході. Винахід відноситься також до способів застосування антитіл для інгібування порушення або стану, асоційованого з присутністю клітинного рецептора IL-13-мішені, наприклад, при лікуванні запального або алергійного 13 стану, насамперед запального або обструктивного захворювання дихальних шляхів. З метою кращого розуміння даного винаходу спочатку дані визначення деяких понять. Інші поняття визначені в докладному описі винаходу. Поняття «інтерлейкін-13» або «IL-13» позначає, якщо в контексті опису не зазначено інше, людський IL-13. У даному винаході пропонуються антитіла до людського L-13, насамперед людські антитіла, які дають перехресну реакцію з отриманим з організму крім людини, а саме з організму приматів IL-13, включаючи IL-13 яванського макака-крабоїда й макака-резус. Відповідно до деяких варіантів здійснення даного винаходу антитіла розпізнають варіант IL-13, у якому залишок аргініну в положенні 130 амінокислотної послідовності замінений на глутамін. Іншими об'єктами й варіантами здійснення даного винаходу є специфічні єднальні представники (субстанції), антагоністичні у відношенні IL-13 мишеподібних гризунів, насамперед мишачого IL-13. Поняття «імунна відповідь» відноситься до дії, наприклад, лімфоцитів, антигенпрезентуючих клітин, фагоцитів, гранулоцитів і розчинних макромолекул, що продукуються зазначеними вище клітинами або печінкою (включаючи антитіла, цитокіни і комплемент), результатом якого є виборне ушкодження, деструкція або елімінація з організму хазяїна патогенів, що впроваджуються, клітин або тканин, заражених патогенами, раковими клітинами, або у випадку аутоімунітету або патологічного запалення, здорових клітин або тканин людини. Поняття «шлях трансдукції сигналу» відноситься до біохімічного взаємозв'язку між різними молекулами трансдукції сигналу, які відіграють роль у передачі сигналу від однієї частини клітин до іншої частини клітин. У контексті даного опису фраза «рецептор клітинної поверхні, рецептор, розташований на поверхні клітини» включає, наприклад, молекули й комплекси молекул, які мають здатність одержувати сигнал і володіють здатністю передавати зазначений сигнал через плазматичну мембрану клітини. Прикладом «рецептора клітинної поверхні» у контексті даного опису є IL-13-Рецептор, з яким зв'язується молекула білка IL-13. Поняття «антитіло» у контексті даного опису включає повні антитіла й будь-який антигензв'язуючий фрагмент (тобто «антигензв'язуючу ділянку») або їх одноланцюгові варіанти. "Антитіло", що зустрічається в природних умовах, являє собою глікопротеїн, що містить щонайменше два важкі (Н) ланцюги й два легкі (L) ланцюги, зв'язані між собою дисульфідними містками. Кожний важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга (скорочено позначений у контексті даного опису як VH) і константної області важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга складається із трьох доменів, тобто СН1, СН2 і СН3. Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (скорочено позначений у контексті даного опису як VL) і константної області легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга складається з одного домену, тобто СL, VH- і VL-області можна додатково підрозділяти на обла 96426 14 сті гіперваріабель-ності, які називають гіперваріабельними ділянками (CDR), які перемежовуються з більш консервативними ділянками, які називають каркасними ділянками (FR). Кожна VH і VL складається із трьох CDR і чотирьох FR, які в напрямку від амінокінця до карбоксильного кінця мають наступний порядок розташування: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Варіабельні області важких і легких ланцюгів містять єднальний домен, що взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл можуть опосередкувати зв'язування імуноглобуліну із тканинами або факторами хазяїна, у тому числі різними клітинами імунної системи (наприклад, ефекторними клітинами) і першим компонентом (C1q) класичної системи комплементу. Поняття «антигензв'язуючий центр» антитіла (або коротше «антигенний центр» («область детермінанти») у контексті даного опису відноситься до одного або декількох фрагментів антитіла, які зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (наприклад, IL-13). Було встановлено, що антигензв'язуючу функцію антитіла можна здійснювати за допомогою фрагментів повнорозмірного антитіла. Прикладами фрагментів, що зв'язуються, що підпадають під поняття «антигензв'язуючий центр» антитіла є Fab-фрагмент, одновалентний фрагмент, що складається з VL-, VH-, CL- і СН1 доменів; F(ab)2 - фрагмент, двовалентний фрагмент, що складається з двох Fab-фрагментів, зв'язаних дисульфідним містком у шарнірній області; Fd-фрагмент, що складається з VH- і СН1 доменів; Fv-фрагмент, що складається з VL- і VH-доменів одного плеча антитіла; dAb-фрагмент (Ward і ін., Nature 341, 1989, сс. 544-546), що складається з VH-домена; і виділена гіперваріабельна ділянка (CDR). Крім того, незважаючи на те, що два домени Fv-фрагменти, т.е. VL і VH, кодуються різними генами, їх можна з'єднувати за допомогою методів рекомбінації синтетичним лінкером, що дозволяє створювати з них один білковий ланцюг, у якій пари VL- і VH-областей формує одновалентні молекули (відомі за назвою одноланцюговий Fvфрагмент (scFv); див., наприклад, Bird і ін., Science 242, 1988, сс. 423-426; і Huston і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 1988, сс. 5879-5883). Такі одноланцюгові антитіла також підпадають під поняття «антигензв'язуючий центр» антитіла. Зазначені фрагменти антитіла одержують за допомогою загальноприйнятих методів, відомих фахівцям у даній галузі, і фрагменти піддають скринінгу відносно можливості їхнього застосування, аналогічного застосуванню інтактних антитіл. Поняття «виділене антитіло» у контексті даного опису відноситься до антитіла, що практично вільне від інших антитіл з іншою антигенною специфічністю (наприклад, виділене антитіло, що специфічно зв'язується з IL-13, практично вільно від антитіл, які специфічно зв'язуються з антигенами, відмінними від IL-13). Однак виділене антитіло, що специфічно зв'язується з IL-13, може давати перехресну реакцію з іншими антигенами, такими як молекули IL-13 з інших видів. Крім того, виділене антитіло може бути практично вільне від 15 іншого клітинного матеріалу і/або хімічних речовин. Поняття «моноклональне антитіло» або «композиція моноклонального антитіла» у контексті даного опису відноситься до одержання молекул антитіл однакового молекулярного складу. Композиція моноклональних антитіл має однакову специфічність зв'язування і афінність у відношенні конкретного епітопу. Мається на увазі, що поняття «людське антитіло» у контексті даного опису відноситься до антитіл, що несуть варіабельні області, у яких як каркасні, так і CDR-ділянки виводять із послідовностей людського походження. Крім того, якщо антитіло містить константну область, то константну область також виводять із таких людських послідовностей, наприклад, послідовностей людської зародкової лінії, або мутантних версій послідовностей людської зародкової лінії. Людські антитіла, що пропонуються у винаході, можуть включати також амінокислотні залишки, які не кодуються людськими послідовностями (наприклад, у результаті мутацій, інтродуційованих шляхом випадкового або сайтнапрямленого мутагенезу in vitro або соматичної мутації in vivo). Однак у контексті даного опису мається на увазі, що поняття «людське антитіло» не відноситься до антитіл, у яких послідовності CDR, виведені із зародкової лінії інших ссавців, таких як миша, трансплантовані в людські послідовності каркасних ділянок. Поняття «людське моноклональне антитіло» відноситься до антитіл, які мають однакову специфічність зв'язування, мають варіабельні області, у яких як каркасні, так і CDR-ділянки отримані з людських послідовностей. В одному з варіантів здійснення винаходу людські моноклональні антитіла одержують за допомогою гібридоми, що включає B-клітину, отриману із трансгенної тварини крім людини, наприклад, трансгенної миші, у геномі якої міститься трансген людського важкого ланцюга і трансген легкого ланцюга, злитий з іморталізованою клітиною. Поняття «рекомбінантне людське антитіло» у контексті даного опису відноситься до всіх людських антитіл, які одержують, експресують, створюють або виділяють за допомогою методів рекомбінації, наприклад, до антитіл, виділених із тварини (наприклад, миші), що є трансгенною або трансхромосомною завдяки інтродукції генів людського імуноглобуліну, або які отримані з гібридоми, до антитіл, виділеним із клітини-хазяїна, трансформованої з метою експресії людського антитіла, наприклад, з використанням трансфектоми, до антитіл, виділених з рекомбінантної комбінаторної бібліотеки людських антитіл, і до антитіл, отриманих, експресованим, створеним або виділеним будь-якими іншими шляхами, які включають сплайсінг усього гену людського імуноглобуліну або його частини, послідовностям до інших послідовностей ДНК. Зазначені рекомбінантні людські антитіла несуть варіабельні області, у яких каркасні і CDR-ділянки виводять із послідовностей імуноглобуліну людської зародкової лінії. Однак у деяких варіантах здійснення винаходу зазначені рекомбінантні людські антитіла можна піддавати 96426 16 мутагенезу in vitro (або, коли для одержання людських послідовностей Ig використовують трансгенних тварин, соматичному мутагенезу in vivo), і в результаті амінокислотні послідовності VH- і VLобластей рекомбінантних антитіл являють собою послідовності, які хоча й виведені і є спорідненими послідовностям VH і VL людської зародкової лінії, можуть не зустрічатися в природних умовах у популяції антитіл людської зародкової лінії in vivo. У контексті даного опису поняття «ізотип» відноситься до класу антитіл (наприклад, IgM, IgE, IgG, такий як IgG1 або IgG4), що кодується генами константної області важкого ланцюга. Фраза «антитіло, що розпізнає антиген» і «антитіло, специфічне відносно антигену» у контексті даного опису застосовують взаємозамінно з поняттям «антитіло, що зв'язується специфічно з антигеном». У контексті даного опису мається на увазі, що антитіло, що «специфічно зв'язується з людським IL-13» відноситься до антитіла, зв'язування якого з людським IL-13 характеризується значенням KD, -9 що становить 510 М або менше. Антитіло, що «дає перехресну реакцію з антигеном, відмінним від людського IL-13» означає антитіло, зв'язування якого з антигеном характеризується значенням KD, -9 що становить 510 М або менше. Антитіло, що «не дає перехресну реакцію з конкретним антигеном» означає антитіло, зв'язування якого з антигеном характеризується значенням KD, що становить -8 1,510 М або більше або значенням KD, що ста-8 -7 новить 5-10510 М або 1510 М або більше. У конкретних варіантах здійснення винаходу ті антитіла, які не дають перехресну реакцію з антигеном, характеризуються практично, зв'язуванням, що не виявляється, із цими білками при оцінці за допомогою стандартних аналізів зв'язування. У контексті даного опису антитіло, що «інгібує зв'язування IL-13 з рецептором IL-13» означає антитіло, здатність якого інгібувати зв'язування IL13 з рецептором характеризується значенням KD, що становить 5нМ або менше. У контексті даного опису антитіло, що «інгібує вивільнення запального медіатора» означає антитіло, інгібування яким індукованого IL-13 вивільнення еотаксину з фібробластів легенів людини характеризується значенням ІС50, що становить менше 10нМ, 5нМ, 2,5нМ, 1,0нМ, 0,5нМ або менше. Поняття «Kassoc» або «Kа» у контексті даного опису відноситься до швидкості асоціації взаємодії конкретного антитіла-антигену, а поняття «KdIs» або «KD» у контексті даного опису відноситься до швидкості дисоціації взаємодії конкретного антитіла-антигену. У контексті даного опису мається на увазі, що поняття «KD» відноситься до константи дисоціації, що одержують зі співвідношення Kd до Kа (тобто Kd/Ka) і виражають у молярній концентрації (М). Значення KD для антитіл можна визначати за допомогою методів, добре відомих у даній галузі. Метод визначення значення KD антитіла являє собою метод, заснований на резонансі поверхневого плазмону, або метод, заснований на застосуванні біосенсорної системи Віасоrе®. 17 У контексті даного опису поняття «висока афінність» відносно антитіла ізотипу IgG відноситься до антитіла, для якого значення KD віднос-8 но антигену-мішені складає 10 М або менше, 10 9 -10 М або менше, або 10 М або менше. У контексті даного опису поняття «індивідуум» відноситься до будь-якої людини або тварини крім людини. Поняття «тварина крім людини» включає всіх хребетних тварин, наприклад, ссавців і тварин, що не відносяться до ссавців, таких як примати окрім людини, вівці, собаки, кішки, коня, корови, кури, амфібії, рептилії і т.д. Різні об'єкти винаходу описані більш докладно в наведених нижче підрозділах. Стандартні аналізи, призначені для оцінки здатності до зв'язування антитіл з IL-13 різних видів, відомі в даній галузі і включають, наприклад, ELISA, Вестерн-блотінг і PIA. Прийнятні аналізи описані докладно в прикладах. Кінетичні характеристики зв'язування (наприклад, афінність до зв'язування) антитіл також можна визначати за допомогою стандартних аналізів, відомих у даній галузі, таких як Віасоrе-аналіз. Аналізи, призначені для оцінки впливів антитіл на функціональну активність IL-13, описані більш докладно в прикладах. Таким чином, варто розуміти, що антитіло, що «інгібує» одну або декілька з видів активності IL-13 (наприклад, біохімічну, імунохімічну, клітинну, фізіологічну або інший види біологічної активності або т.п.), що визначають на основі методик, відомих у даній галузі і представлених у даному описі, означає, що антитіло статистично значиме знижує конкретний вид активності у порівнянні з варіантом без антитіла (або, наприклад, коли є присутнім контрольне антитіло з невідповідною специфічністю). Антитіло, що інгібує активність IL-13, викликає статистично значиме зниження оцінюваного параметра щонайменше на 10%, щонайменше на 50%, 80% або 90%, і в конкретних варіантах здійснення винаходу антитіло, що пропонується у винаході, може інгібувати більш ніж на 95%, 98% або 99% функціональну активність IL-13. Моноклональні антитіла Антитіла, що пропонуються у винаході, являють собою людські моноклональні антитіла, виділені й структурно охарактеризовані відповідно до методів, описаних у прикладах 1-5. Амінокислотні послідовності VH антитіл представлені в SEQ ID NO: 6-10 відповідно. Амінокислотні послідовності VL антитіл представлені в SEQ ID NO: 16-22 відповідно. Інші антитіла, що пропонуються у винаході, містять змінені в результаті мутацій амінокислоти, але CDR-ділянки яких ще зберігають щонайменше 60, 70, 80, 90 або 95% ідентичності з CDRділянками зазначених вище послідовностей. Оскільки кожне із зазначених антитіл може зв'язуватися з IL-13, то послідовності VH і VL можна «змішувати й сполучати» для створення інших, що пропонуються у винаході, антагоністичних молекул (молекул антитіл), що зв'язуються з IL-13. Зв'язування з IL-13 зазначених отриманих у результаті «змішання й сполучення» антитіл можна оцінювати за допомогою описаних вище й у прикладах аналізів зв'язування (наприклад, ELISA). Коли ла 96426 18 нцюги VH і VL змішують і сполучають, то послідовність VH з конкретної пари VH/VL варто заміщати структурно подібною послідовністю VH. Аналогічно цьому, послідовність VL з конкретної пари VH/VL варто заміщати структурно подібною послідовністю VL. Послідовності VH і VL антитіл, що пропонуються у даному винаході, особливо придатні для змішування й сполучення, оскільки для створення цих антитіл застосовують послідовності VH і VL, виведені з послідовностей однієї й тієї ж зародкової лінії, і тому вони мають структурну подібність. Іншим об'єктом винаходу є антитіла, які містять CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга і легкого ланцюга антитіл або їхньої комбінації. Амінокислотні послідовності CDR1 VH антитіл представлені в SEQ ID NO: 6-7. Амінокислотна послідовність CDR2 VH антитіл представлена в SEQ ID NO: 8. Амінокислотні послідовності CDR3 VH антитіл представлені в SEQ ID NO: 9-10. Амінокислотні послідовності CDR1 VL антитіл представлені в SEQ ID NO: 16-18. Амінокислотна послідовність CDR2 VL антитіл представлена в SEQ ID NO: 19. Амінокислотні послідовності CDR3 VL антитіл представлені в SEQ ID NO: 20-22. CDR-ділянки описують за допомогою системи Кебота (Kabat Е. А. і ін., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е вид., вид-во U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). З обліком того, що кожне із зазначених антитіл може зв'язуватися з IL-13 і що специфічність зв'язування з антигеном забезпечується насамперед ділянками CDR1, 2 і 3, послідовності CDR1, 2 і 3 VH і послідовності CDR1, 2 і 3 VL можна «змішувати й сполучати» (тобто, CDR з різних антитіл можна змішувати й сполучати, хоча кожне антитіло повинне містити CDR1, 2 і 3 VH і CDR1, 2 і 3 VL для створення інших антитіл, що зв'язуються з IL-13 молекул, що пропонуються у винаході. Зв'язування з IL-13 зазначених отриманих у результаті «змішання й сполучення» антитіл можна оцінювати за допомогою описаних вище і у прикладах аналізів зв'язування (наприклад, ELISA). Коли змішують і сполучають CDR-послідовності VH, то послідовність CDR1, CDR2 і/або CDR3 з конкретної послідовності VH варто заміняти структурно подібною(ми) послідовністю(ями). Аналогічно цьому, коли змішують і сполучають CDR-послідовності VL, то послідовність CDR1, CDR2 і/або CDR3 з конкретної послідовності VL варто заміняти структурно подібною(ми) послідовністю(ями). Звичайному фахівцеві в даній галузі повинно бути очевидно, що нові послідовності VH і VL можна створювати шляхом заміни однієї або декількох послідовностей CDR-ділянок VH і/або VL на структурно подібні послідовності CDR, зазначені в даному описі для моноклональних антитіл, що пропонуються у даному винаході. Виділене моноклональне антитіло або його антигензв'язуючий центр містить: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 6-7; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8; CDR3 варіабельної області важкого 19 ланцюга, що має амінокислотну послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 9-10; CDRl варіабельної області легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, обрану із групи, SEQ ID NO: 16-18; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 19; і CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 2022; де антитіло специфічно зв'язується з IL-13. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло складається з: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 6; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 9; CDRl варіабельної області легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 16; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 19; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 20. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло складається з: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 7; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 10; CDRl варіабельної області легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 17; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 19; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 21. У ще одному варіанті здійснення винаходу антитіло складається з: CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 7; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8; CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 10; CDRl варіабельної області легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 18; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 19; і CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 22. Згідно із даним описом людське антитіло містить варіабельні області важкого або легкого ланцюга, які «є продуктом» або «виведені з» послідовності конкретної зародкової лінії, якщо варіабельні області антитіла одержують із системи, заснованої на застосуванні генів імуноглобуліну людської зародкової лінії. Для створення таких систем здійснюють імунізацію трансгенної миші, що несе людські гени імуноглобулінів, з використанням антигену, що представляє інтерес, або здійснюють скринінг бібліотеки людських генів імуноглобулінів, що презентується фагом, з використанням, антигену, що представляє інтерес. Людсь 96426 20 ке антитіло, що «є продуктом» або «виведено з» послідовності імуноглобуліну людської зародкової лінії, можна ідентифікувати індивідуально шляхом порівняння амінокислотної послідовності людського антитіла й амінокислотних послідовностей імуноглобулінів людської зародкової лінії й відбору послідовності імуноглобуліну людської зародкової лінії, що є найбільш близькою по послідовності (тобто має найвищий % ідентичності) з послідовністю людського антитіла. Людське антитіло, що «є продуктом» або «виведено з» конкретної послідовності імуноглобуліну людської зародкової лінії, може мати розходження в амінокислотах у порівнянні з послідовністю зародкової лінії, наприклад, у результаті соматичних мутацій, що зустрічаються в природних умовах, або навмисної інтродукції сайтнапрямленої мутації. Однак амінокислотна послідовність відібраного людського антитіла, як правило, щонайменше на 90% ідентична амінокислотній послідовності, що кодується геном людського імуноглобуліну зародкової лінії, і містить амінокислотні залишки, які ідентифікують, що людське антитіло є людським, при порівнянні з амінокислотними послідовностями імуноглобулінів зародкових ліній інших видів (наприклад, послідовності мишачої зародкової лінії). У певних випадках амінокислотна послідовність людського антитіла може бути щонайменше на 60%, 70%, 80%, 90% або щонайменше на 95% або навіть щонайменше на 96%, 97%, 98% або 99% ідентична амінокислотної послідовності, що кодується геном імуноглобуліну зародкової лінії. Як правило, людське антитіло, виведене з конкретної послідовності людської зародкової лінії, повинно мати не більше 10 амінокислотних розходжень у порівнянні з амінокислотною послідовністю, що кодується геном імуноглобуліну людської зародкової лінії. У певних випадках людське антитіло може мати не більше 5 або навіть не більше 4, 3, 2 або 1 амінокислотне розходження у порівнянні з амінокислотною послідовністю, що кодується геном імуноглобуліну зародкової лінії. Гомологічні антитіла Згідно ще з одним варіантом здійснення винаходу антитіло, що пропонується у винаході, має варіабельні області важких і легких ланцюгів, амінокислотні послідовності яких гомологічні амінокислотним послідовностям представлених у даному описі антитіл, і при цьому антитіла зберігають необхідні функціональні властивості антитіл до IL-13, що пропонуються у винаході. Наприклад, у винаході запропоновано виділене моноклональне антитіло або його антигензв'язуючий центр, які містять варіабельну область важкого ланцюга й варіабельну область легкого ланцюга, де: варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, що щонайменше на 80% гомологічна амінокислотній послідовності, обраній із групи, що включає SEQ ID NO: 6-10; варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, що щонайменше на 80% гомологічна амінокислотній послідовності, обраній з групи, що включає SEQ ID NO: 16-22; антитіло специфічно зв'язується з IL-13, і антитіло володіє щонайменше одним з наступних 21 функціональних властивостей: антитіло інгібує зв'язування білка IL-13 з рецептором IL-13 або антитіло інгібує зв'язування рецептора IL-13, попереджаючи або полегшуючи запалення або алергійний стан, насамперед запальне або обструктивне захворювання дихальних шляхів, або антитіло інгібує зв'язування рецептора IL-13, попереджаючи або полегшуючи астму, або антитіло інгібує зв'язування рецептора IL-13, попереджаючи або полегшуючи ХОЗЛ. У різних варіантах здійснення винаходу антитіло може володіти одним або декількома, двома або декількома або трьома описаними вище функціональними властивостями. Антитіло може являти собою, наприклад, людське антитіло, гуманізоване антитіло або химерне антитіло. В інших варіантах здійснення винаходу амінокислотні послідовності VH і/або VL можуть бути на 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% гомологічні зазначеним вище послідовностям. Антитіло, у якого VH- і VL-області мають високий рівень (тобто 80% або вище) гомології з VH- і VLобластями, представленими в SEQ ID NO: 6-10 і 16-22 відповідно, можна одержувати шляхом мутагенезу (наприклад, сайтнапрямленого або опосередковуваного ПЦР мутагенезу) молекул нуклеїнових кислот, які кодують SEQ ID NO: 6-10 і/або 16-22, з наступним тестуванням зміненого антитіла, що кодується, відносно збереження функції (тобто перерахованих вище функцій) за допомогою наведених у даному описі функціональних аналізів. Згідно із сьогоденням опису відсоток гомології двох амінокислотних послідовностей еквівалентний відсотку ідентичності двох послідовностей. Відсоток ідентичності двох послідовностей є функцією кількості ідентичних положень у послідовностях (тобто % гомології = кількість ідентичних положень/загальна кількість положень  100), беручи до уваги кількість проломів і довжину кожного пролому, яку необхідно інтродиціювати для оптимального порівняльного аналізу первинної структури двох послідовностей. Порівняння послідовностей і визначення відсотка ідентичності двох послідовностей можна здійснювати за допомогою математичного алгоритму, описаного нижче в прикладах, які не обмежують обсяг винаходу. Відсоток ідентичності двох амінокислотних послідовностей можна визначати за допомогою алгоритму Е. Meyers і W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4, 988, cc. 11-17), що включений у програму ALIGN (версія 2.0), з використанням таблиці зважених залишків РАМ 120, штрафу за довжину пролому 12 і штрафу за пролом 4. Крім того, відсоток ідентичності двох амінокислотних послідовностей можна визначати за допомогою алгоритму Needleman і Wunsch (J. Mol, Biol. 48, 1970, cc. 444453), що включений у програму GAP, що входить у пакет програм GCG (яка доступна на сайті http://www.gcg.com), з використанням матриці Blossom 62 або матриці РАМ250 і ваги пролому 16, 14, 12, 10, 8, 6 або 4 і ваги довжини 1, 2, 3, 4, 5 або 6. В іншому або додатковому варіанті білкові послідовності, що пропонуються в даному винаході, 96426 22 можна застосовувати також у якості «запитуваної послідовності» («query sequence») при здійсненні пошуку в суспільних базах даних, наприклад, відносно ідентичності зі спорідненими послідовностями. Такий пошук можна здійснювати з використанням програми XBLAST (версія 2.0), розробленої Altschul, і ін., J.Mol. Biol. 215, 1990, cc. 403-410. BLAST-пошук білків можна здійснювати за допомогою програми XBLAST, у якій бал = 50, довжина слова = 3, для встановлення рівня гомології амінокислотних послідовностей з амінокислотними послідовностями молекул антитіл, що пропонуються у винаході. Для створення лінеарізованих послідовностей, що містять проломи, для цілей порівняння можна використовувати програму Gapped BLAST, описану в Altschul і ін., Nucleic Acids Res. 25(17), 1997, cc. 3389-3402. При застосуванні програм BLAST i Gapped BLAST можна використовувати прийняті за замовчуванням параметри відповідних програм (наприклад, XBLAST і NBLAST) (див. http:I1www.ncbi. nhn.nih.gov). Антитіла з консервативними модифікаціями У конкретних варіантах здійснення антитіло, що пропонується у винаході, має варіабельну область важкого ланцюга, що містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3, де одна або декілька зазначених послідовностей CDR являє собою специфічні амінокислотні послідовності, характерні для антитіл, що пропонуються у даному винаході, або їхні консервативні модифікації і де антитіла зберігають необхідні функціональні властивості антитіл до IL13, що пропонуються у винаході. Таким чином, у винаході пропонується виділене моноклональне антитіло або його антигензв'язуючий центр, що складається з варіабельної області важкого ланцюга, що містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3, де: послідовності CDR1 варіабельної області важкого ланцюга містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 6-7 і їхні консервативні модифікації; послідовність CDR2 варіабельної області важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8 і її консервативні модифікації; послідовності CDR3 варіабельної області важкого ланцюга містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 9-10 і їхні консервативні модифікації; послідовності CDR1 варіабельної області легкого ланцюга містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 16-18 і їхні консервативні модифікації; послідовність CDR2 варіабельної області легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 19 і її консервативні модифікації; послідовності CDR3 варіабельної області легкого ланцюга містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 20-22 і їхні консервативні модифікації; антитіло специфічно зв'язується з IL-13; і антитіло інгібує зв'язування рецептора IL 23 13, попереджаючи вивільнення запального медіатора. У різних варіантах здійснення винаходу антитіло може володіти одним або декількома, двома або більшою кількістю, трьома або більшою кількістю зазначених вище функціональних властивостей. Такі антитіла можуть, наприклад, являти собою людські антитіла, гуманізовані антитіла або химерні антитіла. У контексті даного опису поняття «консервативні модифікації послідовностей» відноситься до амінокислотних модифікацій, які не роблять істотного впливу або не істотно змінюють характеристики зв'язування антитіла, що містить зазначену амінокислотну послідовність. Зазначені консервативні модифікації включають амінокислотні заміни, додавання або делеції. Модифікації можна інтродуціювати в антитіло, що пропонується у винаході, за допомогою стандартних методів, відомих у даній галузі, таких як сайтнапрямлений мутагенез і ПЦР-опосередковуваний мутагенез. Консервативні амінокислотні заміни являють собою заміни, при яких амінокислотний залишок заміщають амінокислотним залишком, що має подібний бічний ланцюг. Сімейства амінокислотних залишків з подібними бічними ланцюгами відомі в даній галузі. Ці сімейства включають амінокислотні залишки з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидін), кислотними бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонин, тирозин, цистеїн, триптофан), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін), бетарозгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонин, валін, ізолейцин) і ароматичними бічними ланцюгами (наприклад тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Таким чином, один або кілька амінокислотних залишків в CDR-ділянках антитіла можна заміняти на інші амінокислотні залишки з того самого сімейства бічних ланцюгів, і змінене антитіло можна оцінювати відносно збереження їм функції за допомогою представлених у даному описі функціональних аналізів. Антитіла, які зв'язуються з тим же епітопом, що й антитіла до IL-13, що пропонуються у винаході Іншим варіантом здійснення винаходу є антитіла, які зв'язуються з тим же епітом, що і різні антитіла до IL-13, що пропонуються у винаході. Такі додаткові антитіла можна ідентифікувати по їхній здатності до перехресної конкуренції (наприклад, до конкурентного інгібування зв'язування на статистично значимому рівні) з іншими антитілами, пропонованими у винаході, у стандартних аналізах зв'язування IL-13. Здатність антитіла, що тестується, інгібувати зв'язування антитіл, що пропонуються у даному винаході, з людським IL-13 демонструє, щоантитіло, що тестується, може конкурувати з антитілом за зв'язування з людським IL-13; відповідно до однієї з можливих теорій таке антитіло може зв'язуватися з тим же або спорідненим (наприклад, структурно подібним або перебу 96426 24 ває в просторовій близькості) епітопом на людському IL-13, що й антитіло, з яким воно конкурує. У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіло, що зв'язується з тим же епітопом на людському IL-13, що й антитіла, що пропонуються в даному винаході, являє собою людське моноклональне антитіло. Зазначені людські моноклональні антитіла можна одержувати й виділяти згідно з описаними у прикладах способами. Сконструйовані і модифіковані антитіла Антитіло, що пропонується у винаході, можна одержувати з використанням антитіла, що має одну або кілька послідовностей VH і/або Vl, як вихідний продукт для створення модифікованого антитіла, де модифіковане антитіло може мати змінені властивості в порівнянні з вихідним антитілом. Антитіло можна створювати шляхом модифікації одного або декількох залишків в одній або обох варіабельних областях (тобто VH і/або VL), наприклад, в одній або декількох CDR-ділянках і/або в одній або декількох каркасних ділянках. У додатковому або альтернативному варіанті антитіло можна створювати шляхом модифікації залишків у константній(их) області(ях), наприклад, для зміни ефекторної(их) функції(ій) антитіла. Для здійснення одного з типів конструювання варіабельної області можна застосовувати трансплантацію CDR. Антитіла взаємодіють із антигенами-мішенями в основному за допомогою амінокислотних залишків, локалізованих у шести гіперваріабельних ділянках (CDR) важкого і легкого ланцюга. З цієї причини амінокислотні залишки в CDR найбільш значно різняться між індивідуальними антитілами, ніж послідовності поза CDR. Оскільки послідовності CDR відповідальні за більшу частину взаємодій антитіло-антиген, можна експресувати рекомбінантні антитіла, які імітують властивості конкретних антитіл, що зустрічаються в природних умовах, шляхом конструювання векторів експресії, які містять послідовності CDR з конкретного антитіла, що зустрічається в природних умовах, отримані шляхом трансплантації в послідовності каркасних ділянок з інших антитіл з іншими властивостями (див., наприклад Riechmann L. і ін., Nature 332, 1998, сс. 323-327; Jones P. і ін., Nature, 321, 1986, сс. 522-525; Queen С. і ін., Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86, 1989, сс. 10029-10033; U.S. 5225539 на ім'я Winter і U.S. 5530101; 5585089; 5693762 і 6180370 на ім'я Queen зі співавторами). Таким чином, наступним об'єктом винаходу є виділене моноклональне антитіло або його антигензв'язуюча область, що містить послідовності CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, які містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 6-7; послідовність CDR2, що містить амінокислотну послідовність ID NO: 8; послідовності CDR3, які містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 9-10 відповідно; і послідовності CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, які містять амінокислотні послідовності, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 16-18; послідовність CDR2, що містить амінокислотну послідовність ID NO: 8; і послідовності CDR3, які містять амінокислотні по 25 слідовності, обрані із групи, що включає SEQ ID NO: 20-22 відповідно. Таким чином, зазначені антитіла містять послідовності CDR VH і VL моноклональних антитіл, крім того, вони можуть містити різні послідовності каркасних ділянок зазначених антитіл. Зазначені послідовності каркасних ділянок, які містять послідовності генів антитіл зародкової лінії можна одержувати з публічних баз даних ДНК або опублікованих джерел. Наприклад, послідовності ДНК зародкової лінії генів варіабельних областей людських важких і легких ланцюгів можна знайти в базі даних послідовностей людської зародкової лінії «Vbase» (доступної в Інтернеті на сайті www.mrc- сре.cam.ac.uk/vbase), а також в Kabat Е. А. і ін., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991, 15-те вид. U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson I. M. і ін., J. fol. Biol. 227, 1992, сс. 776798; і Сох J. P. L. і ін., Eur. J Immunol. 24, 1994, сс. 827-836; зміст кожної з яких спеціально включене в даний опис у якості посилання. Прикладом послідовностей каркасних ділянок, призначених для застосування в антитілах, що пропонуються у винаході, є послідовності, структурно подібні до послідовностей каркасних ділянок, які входять у відібрані антитіла, що пропонуються у винаході, наприклад, консенсусні послідовності і/або послідовності каркасних ділянок, які входять у моноклональні антитіла, що пропонуються у винаході. Послідовності CDR1, 2 і 3 VH і послідовності CDR1, 2 і 3 VL можна трансплантувати у каркасні ділянки, які мають послідовність, ідентичну з послідовністю гена імуноглобуліну зародків лінії, з якого виведена послідовність каркасної ділянки, або послідовності CDR можна трансплантувати у каркасні ділянки, які містять одну або кілька мутацій у порівнянні з послідовностями зародкової лінії. Наприклад, було встановлено, що в певних випадках доцільно змінювати за допомогою мутації залишки в каркасних областях для підтримки або підвищення здатності антитіла зв'язуватися з антигеном (див., наприклад, U.S. 5530101; 5585089; 5693762 і 6180370 на ім'я Queen зі співавторами). Іншим типом модифікації варіабельної області є мутація амінокислотних залишків в CDR1, CDR2 і/або CDR3 VH- і/або VL-областей, що підвищує тим самим одну або кілька здібностей до зв'язування (наприклад, афінність) інтерес, що представляє, антитіла, що називають «дозріванням афінності». Для інтродукції мутації(й) і впливу на зв'язування антитіла або на іншу функціональну властивість, що представляє інтерес, можна застосовувати сайтнапрямлений мутагенез або ПЦРопосередкований мутагенез, що можна оцінювати за допомогою аналізів in vitro або in vivo, описаних нижче в прикладах. Можна інтродуціювати консервативні модифікації (зазначені вище). Мутації можуть являти собою амінокислотні заміни, додавання або делеції. Крім того, як правило, змінюють не більше 1, 2, 3, 4 або 5 залишків в CDR-ділянці. Таким чином, іншим варіантом здійснення винаходу є виділені моноклональні антитіла до IL-13 або їх антигензв'язуючі центри, що складаються з 96426 26 варіабельної області важкого ланцюга, що містить: CDR1 VH-області, що складається з амінокислотної послідовності, обраної із групи, що включає SEQ ID NO: 6-7, або амінокислотної послідовності з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями у порівнянні з SEQ ID NO: 6-7; CDR2 VH-області, що складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 8, або амінокислотної послідовності з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями у порівнянні з SEQ ID NO: 8; CDR3 VH-області, що складається з амінокислотної послідовності, обраної із групи, що включає SEQ ID NO: 9-10, або амінокислотної послідовності з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями у порівнянні з SEQ ID NO: 9-10; CDR1 VL-області, що складається з амінокислотної послідовності, обраної із групи, що включає SEQ ID NO: 16-18, або амінокислотної послідовності з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями в порівнянні з SEQ ID NO: 16-18; CDR2 VL-області, що складається з амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 19, або амінокислотної послідовності з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями у порівнянні з SEQ ID NO: 19; CDR3 VL-області, що складається з амінокислотної послідовності, обраної із групи, що включає SEQ ID NO: 20-22, або амінокислотної послідовності з 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотними замінами, делеціями або додаваннями в порівнянні з SEQ ID NO: 20-22. До створених антитіл, що пропонується у винаході, відносяться також антитіла, у яких виконані модифікації в залишках каркасних ділянок в VH і/або VL, наприклад, з метою поліпшення властивостей антитіла. Як правило, такі модифікації каркасних ділянок здійснюють для зниження імуногенності антитіла. Наприклад, один з підходів являє собою «зворотне мутування» одного або декількох залишків каркасної ділянки з одержанням відповідної послідовності зародкової лінії. Більш конкретно антитіло, що було піддано соматичної мутації, може містити залишки каркасної ділянки, що відрізняються від послідовності зародкової лінії, з якої виведене антитіло. Такі залишки можна ідентифікувати шляхом порівняння послідовностей каркасних ділянок антитіла з послідовностями зародкової лінії, з якої виведене антитіло. Для повернення послідовностей каркасної ділянки до вихідної конфігурації зародків лінії соматичні мутації можна піддавати «зворотному мутуванню» з одержанням послідовності зародкової лінії, наприклад, за допомогою сайтнапрямленого мутагенезу або ПЦР-опосередкованого мутагенезу. Такі антитіла зі «зворотними мутаціями» підпадають також під обсяг даного винаходу. Інший тип модифікації каркасної ділянки включає зміни шляхом мутації одного або декількох залишків у каркасній ділянці або навіть в одному або декількох CDR-ділянках для видалення Тклітинних епітопів з метою зниження потенційної імуногенності антитіла. Цей підхід позначають також як «деімунізація», і він описаний більш докладно в опублікованому U.S. № 20030153043 на ім'я Саrr із співавторами. 27 У додатковому або альтернативному варіанті крім модифікацій у каркасних ділянках або CDR, антитіла, що пропонуються у винаході, можуть включати модифікації в Fc-фрагменті, як правило, для зміни одного або декількох функціональних властивостей антитіла, таких як час напівжиття в сироватці, фіксація комплементу, зв'язування Fcрецептора і/або антитіло-обумовлена клітиннозалежна цитотоксичність. Крім того, антитіло, що пропонується у винаході, можна модифікувати хімічно (наприклад, до антитіла можна приєднувати один або кілька хімічних фрагментів) або можна модифікувати для зміни його глікозилірування, і в цьому випадку з метою зміни одного або декількох функціональних властивостей антитіла. Кожний із зазначених варіантів здійснення винаходу буде додатково описаний нижче. Нумерація залишків в Fc-фрагменті відповідає EU-індексу або нумерації Кебота. В одному з варіантів здійснення винаходу модифікують шарнірну область СН1 так, щоб змінювати, наприклад, збільшувати або знижувати, кількість цистеїнових залишків у шарнірній області. Цей підхід описаний також в U.S. 5677425 на ім'я Bodmer зі співавторами. Кількість цистеїнових залишків у шарнірній області СН1 змінюють, наприклад, для полегшення складання легких і важких ланцюгів або для підвищення або зниження стабільності антитіла. В іншому варіанті здійснення винаходу шарнірну область Fc-фрагменту антитіла можна змінювати за допомогою мутації для зниження біологічного часу напівжиття антитіла. Більш конкретно інтродуціюють один або кілька амінокислотних залишків в область контакту СН2-СН3-доменів шарнірної області Fc-фрагменту для погіршення зв'язування антитіла із протеїном А золотавим стафілококом Staphylococcyl (SpA) у порівнянні зі зв'язуванням нативної шарнірної області Fcфрагменту з SpA. Цей підхід описаний більш докладно в U.S. 6165745 на ім'я Ward зі співавторами. В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло модифікують для подовження біологічного часу напівжиття. При цьому можливо застосування різних підходів. Наприклад, можна інтродуціювати одну або декілька з наступних мутацій: T252L, T254S, T256F, описаних в U.S. 6277375 на ім'я Ward. В іншому варіанті для подовження біологічного часу напівжиття антитіло можна змінювати в СН1- або CL-області для інтродукції епітопа, що зв'язується з рецептором-«рятувальником», отриманого із двох петель СН2-домену Fc-фрагменту IgG, як описано в U.S. No. 5869046 і 6121022 на ім'я Presta зі співавторами. В інших варіантах здійснення винаходу Fcфрагмент змінюють шляхом заміни щонайменше одного амінокислотного залишку на інший амінокислотний залишок для зміни ефекторних функцій антитіла. Наприклад, один або кілька амінокислотних залишків можна заміняти на інший амінокислотний залишок так, щоб у такого антитіла змінювалася афінність до ефекторного ліганду, але зберігалася антигензв'язуюча здатність батьківського антитіла. Ефекторний ліганд, афінність до 96426 28 якого змінюють, може являти собою, наприклад, Fc-рецептор або С1-компонент комплементу. Цей підхід описаний більш докладно в U.S. 5624821 і 5648260, обидва на ім'я Winter зі співавторами. В іншому варіанті здійснення винаходу одну або кілька амінокислот, обраних з амінокислотних залишків, можна заміняти іншим амінокислотним залишком так, щоб антитіло мало змінену здатність до С1 q-зв'язування і/або знижену комплементзалежну цитотоксичність (CDC) або її відсутність. Цей підхід описаний більш докладно в U.S. 6194551 на ім'я Idusogie зі співавторами. В іншому варіанті здійснення винаходу один або кілька амінокислотних залишків змінюють, змінюючи тим самим здатність антитіла до фіксації комплементу. Цей підхід описаний також в опублікованій заявці РСТ WO 94/29351 на ім'я Bodmer зі співавторами. У ще одному варіанті здійснення винаходу Fcфрагмент модифікують для підвищення здатності антитіла викликати антитіло-обумовлену клітиннозалежну цитотоксичність (ADCC) і/або для підвищення афінності антитіла до Рс-рецептора за допомогою модифікації однієї або декількох амінокислот. Цей підхід описаний більш докладно в опублікованій заявці РСТ WO 00/42072 на ім'я Presta. Крім того, сайти зв'язування людського IgG1 з FcR1, FcRII, FcRIII і FcRn були картовані і описані варіанти з поліпшеною здатністю до зв'язування (див. Shields R.L. і ін., J. Biol. Chem. 276, 2001, cc. 6591-6604). У наступному варіанті здійснення винаходу модифікують глікозиліровані антитіла. Наприклад, можна створювати аглікозиліроване антитіло (тобто антитіло, у якому відсутнє глікозилірування). Глікозилірування можна змінювати, наприклад, для підвищення афінності антитіла до «антигену». Такі модифікації вуглеводів можна здійснювати шляхом, наприклад, зміни одного або декількох сайтів глікозилірування в послідовності антитіла. Наприклад, можна здійснювати одну або кілька амінокислотних замін, які приводять до елімінації одного або декількох сайтів глікозилірування каркасної ділянки варіабельної області, елімінуючи тим самим глікозилірування в цьому сайті. Зазначене аглікозилірування може підвищувати афінність антитіла до антигену. Цей підхід описаний більш докладно в U.S. No. 5714350 і 6350861 на ім'я Co зі співавторами. У додатковому або альтернативному варіанті можна створювати антитіло зі зміненим типом глікозилірування, наприклад, гіпофукозиліруване антитіло, що має знижену кількість фукозильних залишків, або антитіло з підвищеним вмістом поділяючих навпіл G1cNac-структур. Було продемонстровано, що такі змінені схеми глікозилірування підвищують АБСС-активність антитіл. Зазначені модифікації вуглеводів можна здійснювати, наприклад, шляхом експресії антитіла в клітині-хазяїні зі зміненим механізмом глікозилірування. Клітини зі зміненим механізмом глікозилірування відомі в даній галузі і їх можна застосовувати як клітинихазяїни, у яких експресують рекомбінантні антитіла, що пропонуються у винаході, для одержання тим самим антитіл зі зміненим глікозиліруванням. 29 Наприклад, в ЕР 1176195 на ім'я Hang зі співавторами описана лінія клітин з функціонально порушеним геном FUT8, що кодує фукозилтрансферазу, у результаті чого антитіла, що експресуються в такій клітинній лінії, характеризуються гіпофукозиліруванням. В опублікованій заявці РСТ WO 03/035835 на ім'я Presta описаний варіант лінії СНО-клітин, Lec13-клітини, зі зниженою здатністю приєднувати фукозу до пов'язаних з Asn(297) вуглеводів, що приводить також до гіпофукозилірування антитіл, що експресуються у цій клітиніхазяїні (див. також Shields R.L. і ін., J. Biol. Chem. 277, 2002, сс. 26733-26740). В опублікованій заявці РСТ WO 99/54342 на ім'я Umana зі співавторам, описані лінії клітин, сконструйовані для експресії глікозилтрансфераз, що модифікують глікопротеїн (наприклад, бета(1,4)-N-ацетилглюкозамінілтрансферази III (GnTIII)), у результаті чого антитіла, які експресуються в сконструйованих лініях клітин характеризуються підвищеним вмістом поділяючих навпіл G1cNac-структур, що приводить до підвищеної ADCC-активності антитіл (див. також Umana і ін., Nat. Biotech. 17, 1999, cc. 176-180). Іншою модифікацією антитіл, що підпадає під обсяг винаходу, є пегілювання. Антитіло можна пегілювати, наприклад, для подовження біологічного (наприклад, у сироватці) часу напівжиття антитіла. Для пегілювання антитіла, як правило, антитіло або його фрагмент піддають взаємодії з поліетиленгліколем (ПЕГ), таким як реакційноздатний складний ефір або альдегідна похідна ПЕГ, в умовах, при яких одна або декілька ПЕГ-груп приєднується до антитіла або фрагмента антитіла. Пегілювання можна здійснювати за допомогою реакції ацилювання або реакції алкілювання з реакційноздатною молекулою ПЕГ (або аналогічним реакційноздатним водорозчинним полімером). У контексті даного опису мається на увазі, що поняття «поліетиленгліколь» відноситься до будь-яких форм ПЕГ, які використовують для дериватизації інших білків, таким як моно(С1-С10)алкокси- або арилоксиполіетилен-гліколь або поліетиленглікольмалеімід. У конкретних варіантах здійснення винаходу антитіло, що підлягає пегілюванню, являє собою агліколізоване антитіло. Способи пегілювання білків відомі в даній галузі, і їх можна застосовувати до антитіл, що пропонуються у винаході (див., наприклад, ЕР 0154316 на ім'я Nishimura зі співавторами та ЕР 0401384 на ім'я Ishikawa зі співавторами). Способи створення антитіл Як зазначено вище, антитіла до IL-13, які мають вищевказані послідовності VH і VL, можна застосовувати для створення нових антитіл до IL-13 шляхом модифікації послідовностей VH і/або VL або з'єднаної(их) з ними константної(их) області(ей). Таким чином, відповідно до наступного об'єкта винаходу структурні особливості антитіла до IL-13, що пропонується у винаході, використовують для створення структурно споріднених антитіл до IL-13, які зберігають щонайменше одну з функціональних властивостей антитіл, що пропонуються у винаході, таких як зв'язування з людським IL13, а також інгібування однієї або декількох функціональних властивостей IL-13 (наприклад, зв'язу 96426 30 вання з рецептором, інгібування вивільнення медіатора). Наприклад, одна або декілька CDR-ділянок антитіл, що пропонуються у даному винаході, або їхніх мутантів можна поєднувати рекомбінантно з відомими каркасними ділянками і/або іншими CDR для створення додаткових, створених за допомогою рекомбінантної ДНК антитіл до IL-13, що пропонуються у винаході, за допомогою зазначених вище методів. Інші типи модифікацій включають модифікації, описані в попередньому розділі. Вихідним продуктом для методу конструювання є одна або кілька послідовностей VH і/або VL, представлених у даному описі, або один або декілька з їх CDR-ділянок. Для створення сконструйованого антитіла не є необхідним фактичне одержання (тобто експресія у вигляді білка) антитіла, що має одну або декілька з послідовностей VH і/або VL, представлених у даному описі, або однієї або декількох їх CDR-ділянок. Переважно інформацію, що міститься в послідовності(ях), використовують як вихідний продукт для створення послідовності(ей) «другого покоління», виведеної(их) з вихідної(их) послідовності(ей), і потім одержують послідовність(і) другого покоління та експресують у вигляді білка. Таким чином, ще одним варіантом здійснення винаходу є спосіб одержання антитіла до IL-13, що складається з: послідовності варіабельної області важкого ланцюга антитіла, що містить послідовність CDR1, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 6-7, послідовність CDR2 SEQ ID NO: 8 і/або послідовність CDR3, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 9-10; і послідовності варіабельної області легкого ланцюга антитіла, що містить послідовність CDR1, обрану із групи, що включає SEQ ID NO: 16-18, послідовності CDR2 SEQ ID NO: 19 і/або послідовності CDR3, обраної із групи, що включає SEQ ID NO: 20-22; що полягає в тому, що змінюють щонайменше один амінокислотний залишок у послідовності варіабельної області важкого ланцюга антитіла і/або варіабельної області легкого ланцюга антитіла для створення щонайменше однієї зміненої послідовності антитіла; і експресують змінену послідовність антитіла у вигляді білка. Для одержання й експресії зміненої послідовності антитіла можна застосовувати стандартні методи молекулярної біології. Антитіло, що кодується зміненою(ими) послідовністю(ями), являє собою антитіло, що зберігає одну, декілька або всі функціональні властивості антитіл до IL-13, представлених у даному описі, де функціональні властивості являють собою (але не обмежуючись ними) специфічне зв'язування з людським IL-13; і антитіло має щонайменше одну з наступних функціональних властивостей: антитіло інгібує зв'язування білка IL-13 з IL-13-рецептором, або антитіло інгібує зв'язування IL-13-рецептора, попереджаючи або полегшуючи запальний, фіброзний або алергійний стан, насамперед запальне або обструктивне захворювання дихальних шляхів, або антитіло інгібує зв'язування IL-13-рецептора, тим самим попереджаючи або полегшуючи астму. 31 Змінене антитіло може виявляти одну або більше, дві або більше, три або більше функціональних властивостей, обговорених вище. Функціональні властивості змінених антитіл можна оцінювати за допомогою стандартних аналізів, відомих у даній галузі і/або представлених у даному описі, таких як описані в прикладах (наприклад, ELISA). У конкретних варіантах способів створення антитіл, що пропонуються у винаході, мутації можна інтродуціювати довільно або вибірково у всю або в частину послідовності, що кодує, антитіла до IL-13 і отримані в результаті модифіковані антитіла до IL-13 можна піддавати скринінгу відносно єднальної активності і/або інших описаних вище функціональних властивостей. Методи інтродукції мутацій відомі в даній галузі. Наприклад, в опублікованій заявці РСТ WO 02/092780 на ім'я Short описані методи створення та скринінгу мутацій антитіл за допомогою мутагенезу, що насичує, синтетичного складання лігуванням або їхніх комбінацій. В опублікованій заявці РСТ WO 03/074679 на ім'я Lazar зі співавторами описані альтернативні методи, засновані на обчислювальному скринінгу для оптимізації фізико-хімічних властивостей антитіл. Молекули нуклеїнових кислот, що кодують антитіла, які пропонуються у винаході Наступним об'єктом винаходу є молекули нуклеїнових кислот, які кодують антитіла, що пропонуються у винаході. Нуклеїнові кислоти можуть бути присутні у цілих клітинах, у клітинних лізатах або можуть являти собою нуклеїнові кислоти в частково очищеній або практично чистій формі. Нуклеїнову кислоту «виділяють» або «одержують її в практично очищеному вигляді», коли її очищують від інших клітинних компонентів або інших забруднювачів, наприклад, інших присутніх у клітині нуклеїнових кислот або білків, за допомогою стандартних методів, включаючи обробку лугом/ДСН, CsC1-бендінг, хроматографію на колонках, електрофорез в агарозному гелі та інших методах, добре відомих у даній галузі (див. Current Protocols in Molecular Biology, під ред. F. Ausubel і ін., вид-во Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987). Нуклеїнова кислота, пропонована у винаході, може являти собою, наприклад, ДНК або РНК, і може містити інтронні послідовності або не містить їх. В одному з варіантів здійснення винаходу нуклеїнова кислота являє собою молекулу кДНК. Нуклеїнова кислота може бути присутня у векторі, такому як фаговий дисплейний вектор або рекомбінантний плазмідний вектор. Нуклеїнові кислоти, що пропонуються у винаході, можна одержувати за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Для антитіл, що експресуються гібридомами (наприклад, гібридомами, отриманими із трансгенних мишей, які несуть гени людських імуноглобулінів, що буде описано нижче), кДНК, які кодують легкі і важкі ланцюги антитіла, створені з використанням гібридоми, можна одержувати за допомогою стандартних методів ПЦР-ампліфікації або клонування кДНК. Для антитіл, які одержують із бібліотеки генів імуноглобулінів (наприклад, за допомогою методу фагової презентації), нуклеїнову кислоту, що 96426 32 кодує антитіло, можна виділяти з різних фагових клонів, які є компонентами бібліотеки. Після одержання ДНК-фрагментів, що кодують VH- і VL- області, ці ДНК-фрагменти можна піддавати додатковій обробці за допомогою стандартних методів рекомбінантної ДНК, наприклад, для перетворення генів варіабельної області в гени повнорозмірного ланцюга антитіла, у гени Fabфрагменту або в ген scFv-фрагменту. При здійсненні цього процесу ДНК-фрагмент, що кодує VL або VH, функціонально зв'язують з іншою молекулою ДНК або фрагментом, що кодує інший білок, такий як константна область антитіла або гнучкий лінкер. Поняття «функціонально зв'язаний» у контексті даного опису означає, що два ДНКфрагменти з'єднують функціональним чином, у результаті чого амінокислотні послідовності, що кодуються двома ДНК-фрагментами, зберігаються в рамці зчитування, або в результаті чого білок експресується під контролем необхідного промотору. Виділену ДНК, що кодує VH-область, можна перетворювати в ген повнорозмірного важкого ланцюга шляхом функціонального зв'язування ДНК, що кодує VH, з іншою молекулою ДНК, що кодує константні області важкого ланцюга (СН1, СН2 і СН3). Послідовності генів константної області важкого ланцюга відомі в даній галузі (див., наприклад, Kabat Е.А. і ін., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 15-е вид., вид-во U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991), і ДНК-фрагменти, що включають ці області, можна одержувати за допомогою стандартної ПЦР-ампліфікації. Константна область може являти собою константну область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM або IgD. Для гена важкого ланцюга Fab-фрагменту ДНК, що кодує VH, можна функціонально зв'язувати з іншою молекулою ДНК, що кодує тільки константну область СНІ важкого ланцюга. Виділену ДНК, що кодує VL-область, можна перетворювати в ген повнорозмірного легкого ланцюга (а також у ген легкого ланцюга Fabфрагменту) шляхом функціонального зв'язування ДНК, що кодує VL, з іншою молекулою ДНК, що кодує константну область легкого ланцюга, CL. Послідовності людських генів константної області легкого ланцюга відомі в даній галузі (див., наприклад, Kabat E.A. і ін., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 15-е вид., вид-во U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991), і ДНК-фрагменти, що включають ці області, можна одержувати за допомогою стандартної ПЦР-ампліфікації. Константна область легкого ланцюга може являти собою константну капа- або лямбда-область. Для створення гена scFv ДНК-фрагменти, які кодують VH і VL, функціонально зв'язують з іншим фрагментом, що кодує гнучкий лінкер, наприклад, що кодує амінокислотну послідовність (Gly4 -Ser)3, у результаті чого послідовності VH і VL можна експресувати у вигляді суміжного одноланцюжкового білка, у якому VL- і VH -області з'єднані гнучким лінкером (див., наприклад, Bird і ін., Science 242, 1988, сс. 423-426; Huston і ін., Рrос. Natl. Acad. Sci. 33 USA 85, 1988, сс. 5879-5883; McCafferty і ін., Nature 348, 1990, сс. 552-554). Одержання моноклональних антитіл, що пропонуються у винаході Моноклональні антитіла (мат) можна одержувати за допомогою різних методів, включаючи загальноприйняті методи одержання моноклональних антитіл, наприклад, за допомогою стандартного методу гібридизації соматичних клітин, описаного в Kohler на Milstein, Nature 256, 1975, с. 495. Для одержання моноклональних антитіл можна застосовувати численні методики, наприклад, трансформацію B-лімфоцитів вірусами або онкогенами. Застосовувана для одержання гібридом система тваринного походження являє собою систему, засновану на використанні мишей. Створення гібридоми в миші є добре відомою процедурою. Протоколи імунізації й методи виділення сенсибілізованих спленоцитів, призначених для злиття, добре відомі в даній галузі. Компоненти, що беруть участь у злитті (наприклад, клітини мишачої мієломи), і процедури злиття також добре відомі. Химерні або гуманізовані антитіла, що пропонуються в даному винаході, можна одержувати послідовності мишачого моноклонального антитіла, отриманого відповідно до описаного вище методу. ДНК, що кодує важкий і легкий ланцюг імуноглобулінів, можна одержувати із мишачої гібридоми, що представляє інтерес, та створювати так, щоб вона містила немишачі (наприклад, людські) послідовності імуноглобулінів, за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Наприклад, для створення химерного антитіла мишачі варіабельні області можна зв'язувати з людськими константними областями з використанням відомих у даній галузі методів (див., наприклад, U.S. 4816567 на ім'я Cabilly зі співавторами). Для створення гуманізованого антитіла мишачі CDRділянки можна вбудовувати в людську каркасну ділянку за допомогою відомих у даній галузі методів (див., наприклад, U.S. 5225539 на ім'я Winter і U.S. 5530101; 5585089; 5693762 і 6180370 на ім'я Queen зі співавторами). У конкретному варіанті здійснення винаходу антитіла, що пропонуються у винаході, являють собою людські моноклональні антитіла. Такі людські моноклональні антитіла до IL-13 можна створювати з використанням трансгенних або трансхромосомних мишей, що несуть більшою мірою фрагменти людської імунної системи, ніж мишачої системи. До цих трансгенних і трансхромосомних мишей відносяться миші, позначені в контексті даного опису як HuMAb-миші та KМ-миші відповідно, і мишей обох зазначених ліній позначають у контексті даного опису як «миші, що несуть людський Ig». Миші лінії HuMAb mouse® (фірма Medarex, Inc.) містять мінілокуси гену людського імуноглобуліну, що кодує неперегруповані послідовності людського важкого (μ і ) і легкого -ланцюга імуноглобуліну, у сполученні із цільовими мутаціями, які інактивують ендогенні локуси μ- і -ланцюга (див., наприклад, Lonberg і ін., Nature 368(6474), 1994, сс. 856-859). Таким чином, у миші знижена 96426 34 здатність експресувати мишачий IgM або ланцюг, і у відповідь на імунізацію інтродуційований людський важкий і легкий ланцюги трансгену піддаються перемиканню класу та соматичній мутації з утворенням людського моноклонального IgG, що має високу афінність (Lonberg N. і ін., 1994, вище; оглядова стаття Lonberg N., Handbook of Experimental Pharmacology 113, 1994, cc. 49-101; Lonberg N. і Huszar D., Intern. Rev. Immunol. 13, 1995, cc. 65-93 і Harding F. і Lonberg N.. Ann. N. Y. Acad. Sсi. 764, 1995, cc. 536-546). Одержання й застосування мишей лінії HuMAb і геномні модифікації, які несуть такі миші, описані також в Taylor L. і ін., Nucleic Acids Research 20, 1992, cc. 62876295; Chen J. І ін., International Immunology 5, 1993, cc. 647-656; Tuaillon і ін., Proc. Natl. Acad. Sсi. USA 94, 1993, cc. 3720-3724; Choi і ін., Nature Genetics 4, 1993, cc. 117-123; Chen J. і ін., EMBO J. 12, 1993, cc. 821-830; Tuaillon і ін., J. Immunol. 152, 1994, cc. 2912-2920; Taylor L. і ін., International Immunology, 1994, cc. 579-591; і Fishwild D. і ін., Nature Biotechnology 14, 1996, cc. 845-851, зміст всіх публікацій спеціально повністю включене в даний опис як посилання (див. також U.S. 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 і 5770429; усе на ім'я Lonberg і Kay; U.S. 5545807 на ім'я Surani зі співавторами; опубліковані заявки РСТ WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 і WO 99/45962, усе на ім'я Lonberg і Kay; і опубліковану заявку РСТ WO 01/14424 на ім'я Korman зі співавторами). В іншому варіанті здійснення винаходу людські антитіла, що пропонуються у винаході, можна одержувати з використанням миші, що несе послідовності людського імуноглобуліну у вигляді трансгенів і трансхромосом, наприклад миші, що несе трансген людського важкого ланцюга і трансхромосому людського легкого ланцюга. Такі миші, позначені в контексті даного опису як «KМ-миші», описані докладно в публікації РСТ WO 02/43478 на ім'я Ishida зі співавторами. У даній галузі відомі також інші системи на основі трансгенних тварин, що експресують гени людського імуноглобуліну, і їх можна застосовувати для одержання антитіл до IL-13, що пропонуються у винаході. Наприклад, можна використовувати іншу трансгенну систему, позначену як Xenomouse (фірма Abgenix, Inc.); такі миші описані, наприклад, в U.S. 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 і 6162963 на ім'я Kucherlapati зі співавторами. Крім того, у даній галузі відомі також інші системи на основі транехромосомних тварин, що експресують гени людського імуноглобуліну, і їх можна застосовувати для одержання антитіл до IL-13, що пропонуються у винаході. Наприклад, можна використовувати мишей, що несуть як трансхромосому людського важкого ланцюга, так і трансхромосому людського легкого ланцюга, позначених як «ТС-миші»; такі миші описані, наприклад, в Tomizuka і ін. Proc. Natl. Acad. SCi. USA 97, 2000, cc. 722-727. Крім того, у даній галузі відомі корови, що несуть транехромосоми людського важкого і легкого ланцюга (Kuroiwa і ін., Nature Biotechnology 35 20, 2002, cc. 889-894) і їх можна застосовувати для одержання антитіл до IL-13, що пропонуються у винаході. Людські моноклональні антитіла, що пропонуються у винаході, можна одержувати також з використанням методів фагової презентації для скринінгу бібліотек генів людських імуноглобулінів. У даній галузі розроблені такі методи фагової презентації для виділення людських антитіл (див., наприклад: U.S. 5223409; 5403484 і 5571698 на ім'я Ladner зі співавторами; U.S. 5427908 і 5580717 на ім'я Dower зі співавторами; U.S. 5969108 і 6172197 на ім'я McCafferty зі співавторами й U.S. 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 і 6593081 на ім'я Griffiths зі співавторами). Людські моноклональні антитіла, що пропонуються у винаході, можна одержувати також з використанням SCID (важкий комбінований імунодефіцит) - мишей, у яких відновлювали людські імуноцити для того, щоб при імунізації можна було одержувати людську гуморальну імунну відповідь. Такі миші описані, наприклад, в U.S. 5476996 і 5698767 на ім'я Wilson зі співавторами. Одержання людських моноклональних антитіл до IL-13 У якості антиген використовували очищений рекомбінантний людський (hr) IL-13, кон'югований з Pan DR-T-хелперними епітопами (Pan DR T helper Epitopes (PADRE)). Повністю людські монокональні антитіла до IL-13 одержували з використанням ліній НСо7 трансгенних HuMab-мишей, які експресують гени людських антитіл. У цій лінії мишей ендогенний ген легкого капа-ланцюга можна руйнувати в гомозиготі за допомогою методу, описаного в Chen і ін., ЕМВО J.12, 1993, сс. 811-820, а ендогенний мишачий ген важкого ланцюга можна руйнувати в гомозиготі відповідно до методу, описаного в прикладі 1 опублікованої заявки РСТ WO 01109187. Ця лінія мишей несе трансген людського легкого капа-ланцюга, тобто KСо5, описаний в Fishwild і ін., Nature Biotechnology 14, 1996, сс. 845851, і трансген НСо7 людського важкого ланцюга, описаний в U.S. 5545806; 5625825 і 5545807. Для одержання повністю людських моноклональних антитіл до IL-13, що пропонуються у винаході, HuMab-мишей імунізували сумішшю очищеного рекомбінантного IL-13 з кон'югату HEKEBNA/PADRE (42 мкг/мишу) і Quil A (15 мкг/мишу, фірма Accurate Chemical). Загальні схеми імунізації HuMab-мишей описані в Lonberg N. і ін., Nature 368(6474), 1994, cc. 856-859; Fishwild D. і ін., Nature Biotechnology 14, 1996, cc. 845-851 і в опублікованій заявці РСТ WO 98/24884. Трансгенних мишей імунізували або внутрішньовенно (IV), або підшкірно (SC) у період між 1-71 днем. Мишей піддавали бустер-ін'єкції шляхом внутрішньовенного введення антигену (без ад'юванту) за 2 дні для вмертвіння й виділення селезінки. РНК виділяли із селезінки за допомогою набору для виділення типу Nucleospin RNA II (фірма BD Biosciences/Clontech). РНК застосовували для створення фагової дисплейної бібліотеки довільно згрупованих варіабельних областей Н- і Lланцюгів у фаговій дисплейній бібліотеці Fabфрагментів відповідно до методу, описаного в US 96426 36 6794132. Фагову дисплейну бібліотеку піддавали п'яти циклам селекції з використанням біотинільованого hrIL-13 відповідно до описаного в патенті протоколу рівноважного зв'язування в рідкій фазі (у фазі розчину). У чотирьох перших циклах селе-8 кції використовували hrIL-13 у концентрації 10 М, а в останньому циклі селекції застосовували hrIL-9 13 у концентрації 10 М. При використанні цієї бібліотеки кінцеве відношення сигналу до шуму, що визначали по кількості бляшкоутворюючих одиниць (БУО), що утворилися в присутності антигену, ділена на кількість БУО, що утворилися без антигену, становило 37, що свідчить про те, що більше 90% відібраних фагів експресували антитіла, які зв'язувалися з hrIL-13. Потім фагову дисплейну бібліотеку субклонували в плазмідному векторі для експресії розчинного Fab-фрагменту відповідно до методу, описаного в US 6794132. Одержання трансфектом, продукуючих моноклональні антитіла Антитіла, що пропонуються у винаході, можна одержувати також у трансфектомі клітини-хазяїна з використанням, наприклад, комбінації методів рекомбінантної ДНК і методів генної трансфекції, які добре відомі в даній галузі (див., наприклад, Morrison S., Science 229,1985, с. 1202). Наприклад, для експресії антитіл або фрагментів антитіл ДНК, які кодують часткові або повнорозмірні легкі й важкі ланцюги, можна одержувати за допомогою стандартних методів молекулярної біології (наприклад, за допомогою ПЦРампліфікації або клонування кДНК із використанням гібридом, які експресують антитіло, що представляє інтерес,) і ДНК можна вбудовувати в експресіонні вектори таким чином, щоб гени були функціонально пов'язані з контролюючими транскрипцію й трансляцію послідовностями. У цьому контексті мається на увазі, що поняття «функціонально зв'язаний» означає, що ген антитіла вбудовують шляхом лігування у вектор таким чином, щоб присутні у векторі контролюючі транскрипцію й трансляцію послідовності виконували властиві їм функції регуляції транскрипції й трансляції гена антитіла. Вибрані експресіоний вектор і контролюючі експресію послідовності повинні бути сумісні з клітинною-хазяїном, що застосовується для експресії. Ген легкого ланцюга антитіла й ген важкого ланцюга антитіла можна вбудовувати в різні вектори або, як правило, обидва гени вбудовують у той самий експресіоний вектор. Гени антитіла вбудовують в експресіоний вектор стандартними методами (наприклад, вбудовують шляхом лігування комплементарних сайтів рестрикції у фрагмент гена антитіла або у вектор, або шляхом лігування «затуплених» кінців, якщо відсутні які-небудь сайти рестрикції). Варіабельні області легких і важких ланцюгів антитіл, що пропонуються у винаході, можна використовувати для створення повнорозмірних генів антитіл будь-яких ізотипів шляхом вбудовування їх в експресіонні вектори, які вже кодують константні області важкого ланцюга і константні області легкого ланцюга необхідного ізотипу, таким чином, щоб VH-область була функціонально пов'язана з СН-областю(ями) у векторі, а VLобласть функціонально пов'язана з CL-областю у 37 векторі. В іншому або додатковому варіанті рекомбінантний експресіонний вектор може кодувати сигнальний пептид, що полегшує секрецію антитіла із клітини-хазяїна. Ген ланцюга антитіла можна клонувати у векторі так, щоб сигнальний пептид був зв'язаний у рамці зчитування з N-кінцем гену ланцюга антитіла. Сигнальний пептид може являти собою сигнальний пептид імуноглобуліну або гетерологічний сигнальний пептид (тобто сигнальний пептид з білка, що не відноситься до імуноглобулінів). Крім генів ланцюга антитіла рекомбінантні експресіонні вектори, що пропонуються у винаході, несуть регуляторні послідовності, які контролюють експресію генів ланцюга антитіла в клітині-хазяїні. Мається на увазі, що поняття «регуляторна послідовність» відноситься до промоторів, енхансерів та інших контролюючих експресію елементів (наприклад, сигнали поліаденілювання), які контролюють транскрипцію або трансляцію генів ланцюга антитіла. Зазначені регуляторні послідовності описані, наприклад, в Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, вид-во Academic Press, San Diego, CA 1990). Фахівцям у даній галузі повинно бути очевидно, що створення вектору експресії, включаючи вибір регуляторних послідовностей, може залежати від таких факторів, як вибір клітини-хазяїна для трансформації, необхідного рівня експресії білка і т.д. Регуляторні послідовності для експресії в клітинах ссавців включають вірусні елементи, які забезпечують високі рівні експресії білка в клітинах ссавців, такі як промотори і/або енхансери, виведені із цитомегаловірусу (CMV), мавп'ячого вірусу 40 (ОВ-40), аденовірусу (наприклад, головний пізній промотор аденовірусу (AdMLP)) і вірусу поліоми. В альтернативному варіанті можна використовувати невірусні регуляторні послідовності, такі як промотор убікітину або промотор Р-глобіну. Крім того, можна застосовувати регуляторні елементи, що складаються із отриманих з різних джерел послідовностей, такі як промоторна система Sra, що містить послідовності раннього промотору ОВ-40 і довгий кільцевий повтор вірусу типу 1 людського Тклітинного лейкозу (Takebe Y. і ін., Моl. Cell. Biol. 8, 1988, cc. 466-472). Крім генів ланцюга антитіла й регуляторних послідовностей рекомбінантні вектори експресії, що пропонуються у винаході, можуть нести додаткові послідовності, наприклад, послідовності, які регулюють реплікацію вектора в клітинах-хазяях (наприклад, сайти ініціації реплікації) і гени маркерів, що селектуються. Гени маркерів, що селектуються, полегшують відбір клітин-хазяїв, у які інтродуційовано вектор (див., наприклад, U.S. 4399216, 4634665 і 5179017, усе на ім'я Axel зі співавторами). Наприклад, як правило, ген маркера, що селектується, обумовлює стійкість клітинихазяїна, у яку інтродуційовано вектор, до лікарських засобів, таким як G418, гігроміцин або метотрексат. До генів маркерів, що селектуються, відносяться ген дигідрофолатредуктази (DHFR) (для застосування в dhfr- клітинах-хазяях при селекції/ампліфікації в присутності метотрексату) і ген nео (для відбору в присутності G418). 96426 38 Для експресії легких і важких ланцюгів експресіонним(ими) вектором(ами), що кодує(ють) важкі й легкі ланцюги, трансфектують клітину-хазяїна стандартними методами. Під різні форми поняття «трансфекція» підпадає широка розмаїтість методів, звичайно застосовуваних для інтродукції екзогенної ДНК у прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїна, наприклад, електропорація, осадження фосфатом кальцію, трансфекція з використанням ДЕАЕ ((диетиламіно)етилцелюлоза)декстрану і т.п. Теоретично можна експресувати антитіла, що пропонуються у винаході, або в прокаріотичних, або в еукаріотичних клітинах-хазяях. Насамперед у контексті даного опису обговорюється експресія в еукаріотичних клітинах, насамперед у клітинах-хазяях ссавців, оскільки зазначені еукаріотичні і насамперед клітини ссавців, з більшою ймовірністю, ніж прокаріотичні клітини, можуть забезпечувати складання і секрецію імунологічно активного антитіла, що має правильну складчастість. Установлено, що експресія генів антитіл у прокаріотичних хазяях не може ефективно забезпечувати високі рівні вироблення активного антитіла (Boss М. А. і Wood С. R., Immunology Today 6, 1985, cc. 12-13). Клітини-хазяїни з ссавців, призначені для експресії рекомбінантних антитіл, що пропонуються у винаході, являють собою клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО-клітини) (включаючи СНОклітини з дефіцитом dhfr (dhfr-), які описані в Urlaub і Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,1980, cc. 4216-4220, які застосовують у сполученні із маркером DHFR, що селектується, наприклад, як описано в R.J. Kaufman і P.A. Sharp, Mol. Biol. 159, 1982, cc. 601-621, клітини мієломи лінії NSO, COSклітини та SP2-клітини. Коли рекомбінантні експресіонні вектори, що кодують гени антитіла, інтродують у клітини-хазяї зі ссавців, то антитіла одержують шляхом культивування клітин-хазяїв протягом періоду часу, достатнього для здійснення експресії антитіла в клітині-хазяїні або секреції антитіла в культуральне середовище, у якій вирощують клітини-хазяї. Антитіла можна виділяти з культурального середовища за допомогою стандартних методів очищення білків. Імунокон'югати Наступним об'єктом даного винаходу є антитіло до IL-13 або його фрагмент, кон'югований з терапевтичною дією, що володіє, фрагментом, таким як цитотоксин, лікарський засіб (наприклад, імунодепресант) або радіотоксин. Такі кон'югати позначені в контексті даного опису як «імунокон'югати». Імунокон'югати, які містять один або декілька цитотоксинів позначають як «імунотоксини». До цитотоксинів або цитотоксичних агентів відноситься будь-який агент, що ушкоджує (наприклад, знищує) клітини. Їхніми прикладами є таксон, цитохаласин В, граміцидин D, етідію бромід, еметін, мітоміцин, етопосид, тенопосид, вінкристин, вінбластин, t. колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксиантра-циндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин D, 1-дегідрокситестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин і їхні аналоги або гомологи. Терапевтичні агенти являють собою, наприклад, 39 антиметаболіти (наприклад, метотрексат, 6меркаптопурин, 6-тіогуанін, цитарабін, 5фторурацил, декарбазин), деструктуруючі агенти (наприклад, мехлоретамін, тіотепа, хлорамбуцил, міефалан, кармустин (BSNU) і ломустин (CCNU), циклотосфамід, бусулфан, дибромманіт, стрептозотоцин, мітоміцин С і цис-дихлордиамін платіни(ll) (DDP), цисплатін, антрацикліни (наприклад, даунорубіцин (колишня назва дауноміцин) і доксорубіцин), антибіотики (наприклад, дактіноміцин (колишня назва актиноміцин), блеоміцин, мітраміцин і антраміцин (АМС)) та антимітотичні агенти (наприклад, вінкристин і вінбластин). Іншими прикладами терапевтичних цитотоксинів, які можна кон'югувати із антитілом, що пропонується у винаході, є дуокарміцини, каліхеаміцини, майтансини і ауріститини та їхні похідні. Наприклад, у продажі є кон'югат антитіла з каліхеаміцином (Mylotarg™; фірма Wyeth-Ayerst). Цитотоксини можна кон'югувати з антитілами, пропонованими у винаході, з використанням відомої в даній галузі технології, що передбачає застосування лінкерів. Прикладами типів лінкерів, які можна використовувати для кон'югації цитотоксину з антитілом, є (але не обмежуючись ними) гідразони, складні тіоефіри, складні ефіри, дисульфіди та лінкери, що містять пептид. Можна вибирати лінкер, що, наприклад, чутливий до розщеплення при низькому значенні pH у компартменті лізосоми або чутливий до розщеплення протеазами, наприклад, протеазами, які переважно експресуються в пухлинних тканинах, такими як катепсини (наприклад, катепсини В, C,D). Додаткові дані про типи цитотоксинів, лінкерів і методи кон'югації терапевтичних агентів і антитіл наведені також в Saito G. і ін., Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 2003, cc. 199-215; Trai, P.A. і ін., Cancer Immunol. Immunother. 52 2003, cc. 328-337; Payne G., Cancer Cell 3, 2003, cc. 207-212; Allen T.M., Nat. Rev. Cancer 2, 2002, cc. 750-763; Pastan І. і Kreitman R. J., Curr. Opin. Investig. Drugs 3, 2002, cc. 1089-1091; Senter P.D. і Springer C.J., Adv. Drug Deliv. Rev. 53, 2001, cc. 247-264. Антитіла, що пропонуються у винаході, можна кон'югувати також з радіоактивними ізотопами з одержанням цитотоксичних радіоактивних фармацевтичних агентів, які називають також радіоімунокон'югатами. Прикладами радіоактивних ізотопів, які можна кон'югувати з антитілами для застосування в діагностичних або терапевтичних 131 цілях, є (але не обмежуючись ними) йод , ін111 90 177 дій , ітрій і лютецій . У даній галузі розроблені методи одержання радіоімуно-кон'югатів. Прикладами радіоімуно-кон'югатів, що надходять у продаж, є Zevalin™ (фірма DEC Pharmaceuticals) і Bexxar™ (фірма Corixa Pharmaceuticals), і аналогічні методи можна застосовувати для одержання радіоімуно-кон'югатів антитіл, що пропонуються у винаході. Кон'югати антитіл, що пропонуються у винаході, можна застосовувати для модифікації конкретної біологічної відповіді, і в контексті даного опису не вважається, що компонент, що представляє собою лікарський засіб, обмежений класичними хіміотерапевтичними агентами. Наприклад, ком 96426 40 понент, що представляє собою лікарський засіб, може являти собою білок або поліпептид, процесований з метою додання йому необхідної біологічної активності. Такі білки можуть являти собою, наприклад, токсин, що має ферментну активність, або його активний фрагмент, такий як абрин, рицин А, екзотоксин Pseudomonas або дифтерійний токсин; такий білок, як фактор некрозу пухлини або інтерферон -; або модифікатори біологічної відповіді, такі, наприклад, як лімфокіни, інтерлейкін-1 («IL-1»), інтерлейкін-2 («IL-2»), інтерлейкін-6 («IL-6»), колонієсимулюючий фактор гранулоцитів і макрофагів («GM-CSF»), колонієстимулюючий фактор гранулоцитів («G-CSF») або інші фактори росту. Методики кон'югування фрагмента, що має терапевтичну активність, з антитілами добре відомі (див., наприклад, Amon і ін., «Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy», в: Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, під ред. Reisfeld і ін., вид-во Alan R. Liss, Inc., cc. 243-56, 1985; Hellstrom і ін., «Antibodies For Drug Delivery», в: Controlled Drug Delivery (2-е вид.), під ред. Robinson і ін., під ред. Marcel Dekker, Inc., cc. 623-53, 1987; Thorpe, «Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review», в: Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, під ред. Pinchera і ін., 1985, cc. 475506; «Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy», в: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, під ред. Baldwin і ін., вид-во Academic Press, 1985, cc. 303-316 і Thorpe і ін., «The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates», Inmunol. Rev., 62,1982, cc. 119-158). Біспецифічні молекули Наступним об'єктом даного винаходу є біспецифічні молекули, що містять антитіло до IL-13 або його фрагмент, що пропонуються у винаході. Антитіло, що пропонується у винаході, або його антигензв'язуючі ділянки, можна дериватизувати або зв'язувати з іншою функціонально активною молекулою, наприклад, іншим пептидом або білком (наприклад, іншим антитілом або лігандом рецептора), з одержанням біспецифічної молекули, що зв'язується щонайменше із двома різними сайтами зв'язування або молекулами-мішенями. Антитіло, що пропонується у винаході, фактично може бути дериватизовано або зв'язане більш ніж з одною іншою функціонально активною молекулою з утворенням мультиспецифічних молекул, які зв'язуються більш ніж із двома різними сайтами зв'язування і/або молекулами-мішенями; мається на увазі, що в контексті даного опису зазначені мультиспецифічні молекули також підпадають під поняття «біспецифічна молекула». Для створення біспецифічної молекули, що пропонується у винаході, антитіло, що пропонується у винаході, можна функціонально зв'язувати (наприклад, шляхом хімічного сполучення, генетичного злиття, нековалентної асоціації або іншим способом) з однією або декількома іншими єднальними молекулами, такими як інше антитіло, фрагмент антитіла, пеп 41 тид або міметик зв'язування, з одержанням біспецифічної молекули. Таким чином, даний винахід відноситься до біспецифічних молекул, які мають по меншій мірі одну першу специфічність, що має здатність до зв'язування з IL-13, і другу специфічність, що має здатність до зв'язування із другим епітопоммішенню. Наприклад, другий епітоп-мішень являє собою Fc-рецептор, наприклад, людський FcR1 (CD64) або людський Fc-рецептор (CD89). Таким чином, винахід відноситься до біспецифічних молекул, які мають здатність зв'язуватися як з експресуючими FcR, FcR або FcR ефекторними клітинами (наприклад, моноцитами, макрофагами або поліморфонуклеарними клітинами (PMN)), так і з клітинами-мішенями, які експресують IL-13. Зазначені біспецифічні молекули направляють експресуючі IL-13 клітини до ефекторної клітини і запускають опосередковувані Fc-рецептором види активності ефекторної клітини, такі як фагоцитоз експресуючих IL-13 клітин, антитіло - обумовлену клітиннозалежну цитотоксичність (ADCC), вивільнення цитокінів або утворення аніона супероксиду. Крім того, у тому випадку, коли біспецифічна молекула являє собою мультиспецифічну молекулу, що пропонується у винаході, молекула може мати також третю специфічність до зв'язування на додаток до анти-Fс-специфічності до зв'язування і IL-13-специфічності до зв'язування. Наприклад, третя специфічність до зв'язування може являти собою фрагмент антистимулюючого фактора (EF), наприклад, молекулу, що зв'язується з поверхневим білком, що бере участь у цитотоксичній активності, і тим самим підвищує імунну відповідь проти мішені. «Фрагмент антистимулюючого фактора» може являти собою антитіло, функціонально активний фрагмент антитіла або ліганд, що зв'язується з необхідною молекулою, наприклад, антигеном або рецептором, і тим самим приводить до стимуляції ефекту зв'язування детермінант Fcрецептора або антигену клітини-мішені. «Фрагмент антистимулюючого фактора» може зв'язуватися з Fc-рецептором або антигеном клітини-мішені. В альтернативному варіанті фрагмент антистимулюючого фактора, може зв'язуватися із субстанцією, що відрізняється від субстанції, з якої зв'язуються перша і друга специфічність до зв'язування. Наприклад, фрагмент антистимулюючого фактора, може зв'язуватися з цитотоксичною Т-клітинною (наприклад, за допомогою CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD44, ІСАМ-1 або іншої імунної клітини, що приводить до підвищення імунної відповіді проти клітини-мішені). В одному з варіантів здійснення винаходу біспецифічні молекули, що пропонуються у винаході, містять як специфічність, що має здатність до зв'язування, щонайменше одне антитіло або фрагмент антитіла, наприклад, Fab, Fab', F(ab')2, Fv або одноланцюговий Fv. Антитіло може являти собою також димер легких ланцюгів або важких ланцюгів або будь-який його мінімальний фрагмент, такий як Fv або одноланцюгову конструкцію, описану в Ladner і ін., U.S. 4946778, зміст якого спеціально включено в даний опис у якості посилання. 96426 42 В одному з варіантів здійснення винаходу специфічність, що має здатність до зв'язування з Fcрецептором, являє собою моноклональне антитіло, зв'язування якого не блокується людським імуноглобуліном G (IgG). У контексті даного опису поняття «Ig-рецептор» відноситься до кожного з восьми генів -ланцюга, локалізованих на хромосомі 1. Ці гени кодують загалом дванадцять трансмембранних або розчинних ізоформ рецепторів, які об'єднані в три класи F-рецепторів: FcR1 (CD64), FcRII(CD32) і FcRIII (CD 16). В іншому варіанті здійснення винаходу Fc-рецептор являє собою людський FcRI, що має високу афінність. Людський FcRI являє собою молекулу з молекулярною масою 72 кДа, що володіє високою афінні8 9 -1 стю до мономерного IgG (10 -10 M ). Одержання й характеристики конкретних моноклональних антитіл до Fc описані в Fanger зі співавторами в опублікованій заявці РСТ WO 88/00052 і в U.S. 4954617, зміст яких повністю включено в даний опис у якості посилання. Ці антитіла зв'язуються з епітопом FcRI, FcRII або FcRIII у сайті, що відрізняється від єднального Fc сайту рецептора, і в результаті їхнє зв'язування не блокується в помітному ступені фізіологічними рівнями IgG. Специфічні антитіла до FcRI, які застосовують у даному винаході, являють собою МАт 22, МАт 32, МАт 44, МАт 62 і МАт 197. Гібридому, що продукує МАт 32, можна одержувати з Американської колекції типових культур (АТСС), реєстраційний номер НВ9469. В інших варіантах здійснення винаходу антитіло до Fc -рецептору являє собою гуманізовану форму моноклонального антитіла 22 (Н22). Одержання і характеристики антитіла Н22 описані в Graziano R.F. і ін., J. Immunol 155 (10), 1995, сс. 4996-5002 і в опублікованій заявці РСТ WO 94/10332. Лінія клітин, що продукує антитіло 1122, депонована в Американській колекції тканинних культур під позначенням HA022CL1 і реєстраційним номером CRL 11177. У наступних варіантах здійснення винаходу специфічність до зв'язування з Fc-рецептором опосередковується антитілом, що зв'язується з людським IgA-рецептором, наприклад, Fc-альфарецептором (FcRI (CD89)), зв'язування якого не може блокуватися людським імуноглобуліном A (IgA). Мається на увазі, що поняття « IgAрецептор» відноситься до генного продукту одного з генів (FcRI), локалізованому на хромосомі 19. Відомо, що цей ген кодує декілька отриманих у результаті альтернативного сплайсінгу трансмембранних ізоформ масою від 55 до 110 кДа. FcRI (CD89) конститутивно експресуєтся на моноцитах/монофагах, еозинофільних і нейтрофільних гранулоцитах, але не експресуєтся на популяції неефекторних клітин. FcRI має середній рівень 7 -1 афінності (5  10 М ) як до IgA1, так і до IgA2, що підвищується при обробці цитокінами, такими як G-CSF або GM-CSF (Morton H.C. і ін., Critical Reviews in Immunology 116, 1996, cc. 423-440). Описано чотири FcRI-специфічних моноклональних антитіла, позначених як A3, А59, А62 і А77, які зв'язуються з FcRI поза сайтом зв'язування ліга 43 нда IgA (Monteiro R.C. і ін., J. Immunol. 148,1992, с. 1764). FcRI i FcRI являють собою стимулюючі (що запускають) рецептори, призначені для застосування в біспецифічних молекулах, що пропонуються у винаході, оскільки вони експресуються в основному на імунних ефекторних клітинах, наприклад, моноцитах, PMN, макрофагах і дендритних клітинах; характеризуються високим рівнем експресії (наприклад, 5000-100000 на клітину); є медіаторами цитотоксичної активності (наприклад, ADCC, фагоцитоз); опосередковують підвищену презентацію антигенів, включаючи аутоантигени, забезпечуючи спрямований перенос до них. Інші антитіла, які можна застосовувати в біспецифічних молекулах, що пропонуються у винаході, являють собою мишачі, химерні та гуманізовані моноклональні антитіла. Біспецифічні молекули, що пропонуються в даному винаході, можна одержувати шляхом кон'югації компонентів, що мають здатність до зв'язування специфічностей, наприклад, що мають здатність до зв'язування специфічностей антитіл до FcR і антитіл до IL-13, за допомогою методів, відомих у даній галузі. Наприклад, кожну специфічність, що має здатність до зв'язування біспецифічної молекули можна створювати окремо і потім кон'югувати одну з одною. Коли специфічності, що володіють здатністю до зв'язування, являють собою білки або пептиди, для ковалентної кон'югації можна використовувати цілий ряд агентів для зв'язування або перехресного зшивання. Прикладами перехреснозшиваючих агентів є протеїн А, карбодиімід, N-сукцинімідил-S-ацетилтіоацетат (SATА), 5,5'-дитіобіс(2-натробензойна кислота) (DTNB), офенілендималеімід (oPDM), N-сукцинімідил-3-(2піридилдитіо)пропіонат (SPDP) і сульфосукцинімідил-4-(N-малеімідометил)цикло-гексан-1карбоксилат (сульфо-SMCC) (див., наприклад, Karpovsky і ін., J. Exp. Med. 160, 1984, с. 1686; Liu М.А. і ін., Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985, с. 8648). Інші методи являють собою методи, описані в Paulus, Behring Ins. Mitt. No. 78, 1985, cc. 118132; Brennan і ін., Science 229, 1985, cc. 81-83) і Glennie і ін., J. Immunol. 139, 1987, cc. 2367-2375). Такі призначені для кон'югації агенти, як SATA і сульфо-SMCC, обоє надходять у продаж від фірми Pierce Chemical Co. (Рокфорд, шт. Іллінойс). Коли специфічності, що мають здатність до зв'язування, являють собою антитіла, то їх можна кон'югувати за допомогою сульфгідрильного зв'язку С-кінцевих шарнірних областей двох важких ланцюгів. У конкретному варіанті здійснення винаходу шарнірну область модифікують так, щоб вона перед кон'югацією містила непарну кількість сульфгідрильних залишків, наприклад, один. В альтернативному варіанті обидві специфічності, що мають здатність до зв'язування, можна кодувати в тому самому векторі й експресувати і збирати в одній і тій же клітині-хазяїні. Цей метод є найбільш доцільним, коли біспецифічна молекула являє собою злитий білок, такий як МАт  МАт, МАт  Fab, Fab  F(ab')2 або ліганд  Fab. Біспецифічна молекула, пропонована у винаході, може являти собою одноланцюгову молекулу, що міс 96426 44 тить одноланцюгове антитіло і єднальний детермінант, або одноланцюгову біспецифічну молекулу, що містить два детермінанти, що зв'язуються. Біспецифічні молекули можуть містити по меншій мірі дві одноланцюгові молекули. Методи одержання біспецифічних молекул описані, наприклад, в U.S. 5260203; U.S. 5455030; U.S. 4881175; U.S. 5132405; U.S. 5091513; U.S. 5476786; U.S.5013653; U.S. 5258498; і U.S.5482858. Зв'язування біспецифічних молекул з їхніми специфічними мішенями можна підтверджувати, наприклад, твердофазним імуноферментним аналізом (ELISA), радіоімуноаналізом (PIA), FACSаналізом, біологічним аналізом (наприклад, інгібування росту) або аналізом методом Вестернблотінгу. Кожний із зазначених аналізів дозволяє виявляти присутність конкретних комплексів, що представляють інтерес, білок-антитіло при використанні міченого реагенту (наприклад, антитіла), специфічного у відношенні комплексу, що представляє інтерес. Наприклад, комплекси FcRантитіло можна виявляти за допомогою, наприклад, пов'язаного з ферментом антитіла або фрагмента антитіла, що розпізнає й специфічно зв'язується з комплексами антитіло-FcR. В альтернативному варіанті комплекси можна виявляти за допомогою цілого ряду інших імуноаналізів. Наприклад, антитіло може мати 4 радіоактивних мітки і його можна застосовувати в радіоімуноаналізі (PIA) (див., наприклад, Weintraub В., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, березень, 1986, публікація включена в даний опис у якості посилання). Радіоактивний ізотоп можна виявляти за допомогою таких пристроїв, як -лічильник або сцинтиляційний лічильник або за допомогою авторадіографії. Фармацевтичні композиції Наступним об'єктом даного винаходу є композиція, наприклад, фармацевтична композиція, що містить одне або комбінацію моноклональних антитіл або його(їх) антигензв'язуючий(і) центр(и), що пропонуються в даному винаході, у сполученні з фармацевтично прийнятним носієм. Такі композиції можуть включати одне або комбінацію (наприклад, два або більшу кількість різних) антитіл, або імунокон'югатів або біспецифічних молекул, що пропонуються у винаході. Наприклад, фармацевтична композиція, пропонована у винаході, може містити комбінацію антитіл (або імунокон'югатів або біспецифічних антитіл), які зв'язуються з різними епітопами на антигені-мішені, або які мають комплементарний вид активності. Фармацевтичні композиції, що пропонуються у винаході, можна застосовувати також у спільній терапії, тобто в сполученні з іншими агентами. Наприклад, у спільній терапії можна застосовувати антитіло до IL-13, що пропонується в даному винаході, у сполученні щонайменше з одним іншим протизапальним агентом. Приклади терапевтичних агентів, які можна застосовувати в спільній терапії, більш докладно описані нижче в розділі, присвяченому застосуванню антитіл, що пропонуються у винаході. 45 У контексті даного опису поняття «фармацевтично прийнятний носій» включає кожний і всі розчинники, дисперсійні середовища, матеріали для нанесення покриття, протибактеріальні та протигрибкові агенти, агенти, що надають ізотонічність, і агенти, сповільнюють абсорбцію, і т.п., які є фізіологічно сумісними. Носій повинен бути придатним для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, парентерального, спинального або епідермального введення (наприклад, шляхом ін'єкції або інфузії). Залежно від шляху введення на діючу речовину, тобто антитіло, імунокон'югат або біспецифічну молекулу, можна наносити покриття з матеріалу, що захищає з'єднання від впливу кислот та інших факторів навколишнього середовища, які можуть інактивувати з'єднання. Фармацевтичні з'єднання, що пропонуються у винаході, можуть включати одну або декілька фармацевтично прийнятних солей. Поняття «фармацевтично прийнятна сіль» відноситься до солі, що зберігає біологічну активність батьківського з'єднання й не викликає ніяких небажаних побічних дій (див., наприклад, Berge S.M., і ін., J. Pharm. Sci. 66, 1977, cc. 1-19). Прикладами таких солей є кислотно-адитивні солі та солі приєднання основ. До кислотно-адитивних солей відносяться солі, утворені з нетоксичних неорганічних кислот, таких як соляна, азотна, фосфорна, сірчана, бромистоводнева, йодистоводнева, фосфориста і т.п., а також з нетоксичних органічних кислот, таких як аліфатичні моно- і дикарбонові кислоти, заміщені фенілом алканові кислоти, оксиалканові кислоти, ароматичні кислоти, аліфатичні та ароматичні сульфонові кислоти і т.п. Солі приєднання основ включають солі, утворені з луго-земельними металами, такими як натрій, калій, магній, кальцій і т.п., а також з нетоксичними органічними амінами, такими як N,N'-дибензилетилендиамін, N-метилглюкамін, хлорпрокаїн, холін, диетаноламін, етилендиамін, прокаїн і т.п. Фармацевтична композиція, запропонована у винаході, може містити також фармацевтично прийнятний антиоксидант. Прикладами фармацевтично прийнятних антиоксидантів є: водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, гідрохлорид цистеїну, бісульфат натрію, метабісульфіт натрію і т.п.; жиророзчинні антиоксиданти, такі як аскорбілпальмітат, бутиліруваний гідроксианізол (БГА), бутиліруваний гідрокситолуол (БІТ), лецитін, пропілгалат, альфа-токоферол і т.п.; металхелатуючі агенти, такі як лимонна кислота, етилендиамінтетраоцтова кислота (ЕДТК), сорбіт, винна кислота, фосфорна кислота і т.п. Прикладами прийнятних водних і неводних носіїв, які можна застосовувати у фармацевтичних композиціях, що пропонуються у винаході, є вода, етанол, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетителенгліколь і т.п.) і їхні прийнятні суміші, рослинні масла, такі як маслинове масло, і придатні для ін'єкцій складні органічні ефіри, такі як етилолеат. Необхідну плинність можна підтримувати, наприклад, за допомогою застосовуваних для нанесення покриттів матеріалів, таких як лецитин, зберігаючи необхідний розмір часток у випадку 96426 46 дисперсій, і за допомогою поверхнево-активних речовин. Зазначені композиції можуть містити також ад'юванти, такі як консерванти, агенти для змочування, емульгатори та диспергуючі речовини. Відсутність мікроорганізмів можна гарантувати як за допомогою описаних вище процесів стерилізації, так і включенням різних антибактеріальних і протигрибкових агентів, таких, наприклад, як парабен, хлорбутанол, фенол, сорбінова кислота і т.п. Може виявитися бажаним включати в композиції агенти, що надають ізотоничність, такі як цукри, хлорид натрію і т.п. Крім того, можна одержувати фармацевтичну форму, що вводиться за допомогою ін'єкції, із пролонгованою абсорбцією, наприклад, шляхом включення агентів, які сповільнюють абсорбцію, таких як моностеарат алюмінію і желатин. Фармацевтично прийнятні носії являють собою стерильні водяні розчини або дисперсії і стерильні порошки для готування при необхідності стерильних розчинів, що вводяться за допомогою ін'єкції, або дисперсії. Застосування таких середовищ і агентів для фармацевтичних діючих речовин відомо в даній галузі. За винятком випадку, коли будь-які із загальноприйнятих середовищ або агентів не сумісні з діючою речовиною, передбачається їхнє застосування у фармацевтичних композиціях, що пропонуються у винаході. У композиції можна включати також додаткові діючі речовини. Терапевтичні композиції, як правило, повинні бути стерильними і стабільними в умовах готування та зберігання. Композиція може мати форму розчину, мікроемульсії, ліпосоми або мати іншу впорядковану структуру, придатну для включення високої концентрації лікарського засобу. Носій може являти собою розчинник або дисперсне середовище, що містить, наприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь і рідкий поліетиленгліколь і т.п.) і їхні прийнятні суміші. Необхідну плинність можна підтримувати, наприклад, за допомогою застосовуваних для нанесення покриттів матеріалів, таких як лецитин, зберігаючи необхідний розмір часток у випадку дисперсій, і за допомогою поверхнево-активних речовин. У багатьох випадках можна включати агенти, що надають ізотонічність, такі як цукри, багатоатомні спирти, такі як маніт, сорбіт, або хлорид натрію і т.п. Крім того, можна одержувати фармацевтичну форму, що вводиться шляхом ін'єкції, із пролонгованою абсорбцією, наприклад, шляхом включення агентів, які сповільнюють абсорбцію, таких як моностеарат алюмінію та желатин. Стерильні призначені для ін'єкцій розчини можна одержувати шляхом включення діючої речовини в необхідній кількості у відповідний розчинник або індивідуально, або якщо буде потреба в сполученні із зазначеними вище інгредієнтами, з наступною стерилізацією фільтрацією. Як правило, дисперсії одержують включенням діючої речовини в стерильний наповнювач, що містить основне дисперсійне середовище та необхідні інші перераховані вище інгредієнти. Методи одержання стерильних порошків, призначених для готування стерильних розчинів, що вводяться шляхом ін'єкції, являють собою вакуумне сушіння й сушіння 47 виморожуванням (ліофілізація), за допомогою яких одержують порошок діючої речовини в сполученні з будь-яким іншим необхідним інгредієнтом з попередньо стерилізованого фільтрацією розчину. Кількість діючої речовини, яку можна поєднувати з носієм для одержання форми у вигляді однократної дози, повинна варіюватися залежно від індивідуума, що підлягає обробці, і конкретного шляху введення. Кількість діючої речовини, яку можна поєднувати з носієм для одержання форми у вигляді однократної дози, як правило, являє собою кількість композиції, що має терапевтичну дію. Як правило, кількість за винятком випадку, коли вона становить сто відсотків, являє собою кількість, що становить від приблизно 0,01 до приблизно 99% діючої речовини, від 0,1 до приблизно 70% або від приблизно 1 до приблизно 30% діючої речовини в сполученні з фармацевтично прийнятним носієм. Схему прийому лікарського засобу регулюють для одержання оптимально необхідної відповіді (наприклад, терапевтичної відповіді). Наприклад, можна застосовувати однократну болюсну ін'єкцію, можна вводити кілька розділених доз протягом часу або дозу можна пропорційно знижувати або підвищувати залежно від конкретної терапевтичної ситуації. Найбільш доцільно наготовлювати композиції для парентерального введення у вигляді стандартних доз лікарського засобу, що полегшує їхнє застосування і однорідність доз. Під стандартною дозою лікарського засобу в контексті даного опису розуміють фізично дискретні одиниці для застосування у вигляді стандартних доз для індивідуума, що підлягає для лікування; кожна одиниця містить попередньо певну кількість діючої речовини, що відповідно до розрахунку повинно мати бажану терапевтичну дію, у сполученні з необхідними фармацевтичним носієм. Специфічні особливості форм у вигляді стандартних доз, що пропонуються у винаході, визначаються і безпосередньо залежать від індивідуальних характеристик діючої речовини і конкретної терапевтичної дії, яку необхідно досягати, і обмеженнями, відомими в галузі способами приготування препаративних форм такої діючої речовини, пов'язаними з лікуванням чутливих індивідуумів. Для введення антитіла дози становлять від приблизно 0,0001 до 100 мг/кг і більш конкретно від 0,01 до 5 мг/кг ваги хазяїна. Наприклад, дози можуть становити 0,3 мг/кг ваги тіла, 1 мг/кг ваги тіла, 3 мг/кг ваги тіла, 5 мг/кг ваги тіла або 10 мг/кг ваги тіла, або перебувають у діапазоні від 1 до 10 мг/кг. Приклад схеми лікування включає введення один раз у тиждень, один раз кожні два тижні, один раз кожні три тижні, один раз кожні чотири тижні, один раз на місяць, один раз кожні 3 місяці або один раз кожні 3-6 місяців. Схеми прийому антитіла до IL-13, що пропонується у винаході, можуть включати введення 1 мг/кг ваги тіла або 3 мг/кг ваги тіла шляхом внутрішньовенного або підшкірного застосування, при цьому антитіло вводять із використанням наступних режимів застосування: наприклад, кожні 4 тижні по 6 доз, потім кожні 3 місяці; кожні три тижні; 3 мг/кг ваги тіла, потім 1 мг/кг ваги тіла кожні 3 тижні. 96426 48 У деяких варіантах способу можна вводити два або велику кількість моноклональних антитіл з різними специфічностями зв'язування, у цьому випадку доза кожного антитіла, що вводиться, перебуває в зазначених діапазонах. Антитіло, як правило, вводять багаторазово. Можна використовувати, наприклад, наступні інтервали між кожним введенням доз: щотижня, щомісяця, кожні три місяці або щорічно. Інтервали можуть також бути нерегулярними залежно від визначених у крові пацієнта рівнів антитіла до антигену-мішені. У деяких варіантах способу дозу регулюють з метою досягнення концентрації антитіла в плазмі, що становить приблизно 1-1000 мкг/мл, а в деяких варіантах способу - концентрації, що становить приблизно 25-300 мкг/мл. В альтернативному варіанті антитіло можна вводити у вигляді форми з уповільненим вивільненням, у цьому випадку потрібна менша частота введення. Доза і частота введення варіюються залежно від часу напівжиття антитіла в організмі пацієнта. У цілому, людські антитіла мають найбільш тривалий час напівжиття, у порядку зниження цього показника антитіла розподіляються в такий спосіб: гуманізовані антитіла, химерні антитіла й антитіла з організмів крім людини. Доза і частота введення може варіюватися залежно від того, є лікування профілактичним або терапевтичним. При застосуванні в профілактичних цілях вводять відносно більш низькі дози з більш рідкісними інтервалами протягом тривалого періоду часу. Деякі пацієнти продовжують прийом лікарського засобу до протягом всього життя, що залишилося. При терапевтичному застосуванні іноді потрібне застосування щодо високої дози із введенням через відносно короткі інтервали аж до зниження швидкості розвитку захворювання або припинення його розвитку або до часткового або повного полегшення симптомів захворювання в пацієнта. Після цього пацієнта можна переводити на профілактичний режим застосування. Фактичні рівні доз діючих речовин у фармацевтичних композиціях, що пропонуються у даному винаході, можуть варіюватися таким чином, щоб одержувати кількість діючої речовини, ефективну для досягнення необхідної терапевтичної відповіді у конкретного пацієнта, при використанні конкретної композиції і шляхи введення, не маючи токсичності для пацієнта. Обраний рівень доз повинен залежати від різних фармакокінетичних факторів, включаючи активність застосовуваних конкретних композицій, що пропонуються у даному винаході, або складного ефіру, солі або аміду, шляху введення, часу введення, швидкості виділення конкретного застосовуваного з'єднання, тривалості лікування, інших лікарських засобів, з'єднань і/або матеріалів, застосовуваних у сполученні з конкретними застосовуваними композиціями, віку, статі, ваги, стану, загального стану здоров'я і попередньої історії хвороби підлягаючого лікуванню пацієнта і аналогічних добре відомих в галузі медицини факторів. «Терапевтично ефективна доза» антитіла до IL-13, що пропонується у винаході, може приводити до зменшення серйозності симптомів захворю 49 вання, підвищенню частоти і тривалості безсимптомних періодів захворювання або до попередження погіршення стану або непрацездатності, пов'язаної з ураженням хворобою. Композицію, що пропонується в даному винаході, можна вводити за допомогою одного або декількох шляхів введення з використанням одного або декількох різних методів, відомих у даній галузі. Як повинно бути очевидно фахівцеві в даній галузі, шлях і/або механізм введення повинен варіюватися залежно від необхідних результатів. Шляхи введення антитіл, що пропонуються у винаході, являють собою внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, внутрішньошкірний, внутрішньочеревинний, підшкірний, спинальний або інші парентеральні шляхи введення, наприклад, за допомогою ін'єкції або інфузії. Під «парентеральним введенням» у контексті даного опису розуміють шляхи введення, відмінні від ентерального та місцевого застосування, як правило, шляхом ін'єкції, і включають (але не обмежуючись ними) внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоартеріальну, внутрішньооболонкову, внутрішньокапсульну, внутрішньоокову, внутрішньосерцеву, внутрішньошкірну, внутрішньочеревинну, транстрахеальну, підшкірну, підкутикулярну, внутрішньосуглобну, підкапсульну, підпавутинну, інтраспінальну, епідуральну і надчеревну ін'єкцію та інфузію. В альтернативному варіанті антитіло, що пропонується у винаході, можна вводити непарентаральним шляхом, таким як місцевий, епідермальний шлях застосування або нанесення на слизову оболонку, наприклад, інтраназально, орально, вагінально, ректально, під'язично або місцево. Діючі речовини можна включати в препаративну форму у сполученні з носіями, які повинні захищати з'єднання від швидкого вивільнення, наприклад, у випадку препаративної форми з контрольованим вивільненням, у тому числі такої як імплантати, трансдермальні бляшки і мікрокапсульовані системи введення. Можна застосовувати біорозкладаємі, біосумісні полімери, такі як етиленвінілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, складні поліортороефіри і полімолочна кислота. Цілий ряд методів одержання таких препаративних форм запатентований або відомий фахівцям у даній галузі (див., наприклад, Sustained and Controlled Release Drag Delivery Systems, J.R. Robinson, вид-во Marcel Dekker, Inc., New York, 1978). Терапевтичні композиції можна вводити за допомогою відомих у даній галузі медичних пристроїв. Наприклад, в одному з варіантів здійснення винаходу терапевтичну композицію, що пропонується у винаході, можна вводити за допомогою безпринципного пристрою для гіподермічних ін'єкцій, наприклад, пристроїв, описаних в U.S. 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 або 4596556. Прикладами добре відомих імплантатів і модулів, які можна застосовувати в даному винаході, є: описаний в U.S. 4487603 придатний для імплантації насос для мікроінфузії дозованих медичних препаратів з контрольованою швидкістю; описаний в U.S. 4486194 терапевтич 96426 50 ний пристрій для введення медичних препаратів через шкіру; описаний в U.S. 4447233 насос для інфузїї медичних препаратів, призначений для введення лікарських засобів з точно встановленою швидкістю інфузії; описаний в U.S. 4447224 придатний для імплантації пристрій для інфузїї з потоком, що змінюється, призначений для тривалого введення лікарського засобу; описана в U.S. 4439196 система для осмотичного введення лікарських засобів, обладнана декількома компартаментами у вигляді камер; і описана в U.S. 4475196 система для осмотичного введення лікарських засобів. Зазначені патенти включені в даний опис у якості посилання. Цілий ряд інших пристроїв, таких як імплантати, системи для введення і модулі, відомі фахівцям у даній галузі. У конкретних варіантах здійснення винаходу людські моноклональні антитіла, що пропонуються у винаході, можна готувати у формах, що гарантують відповідний розподіл in vivo. Наприклад, гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ) не пропускає багато з'єднань, що мають високу гідрофільність. Для гарантії того, що з'єднання, що мають терапевтичну активність, які пропонуються у винаході, перетнуть ГЕБ (якщо це потрібно) їх можна включати, наприклад, у ліпосоми. Методи готування ліпосом описані, наприклад, в U.S. 4522811; 5374548 і 5399331. Ліпосоми можуть містити один або кілька фрагментів, які вибірково транспортуються в певні клітини або органи, що підвищує спрямоване введення лікарського засобу (див., наприклад, V.V. Ranade, J. Cline Pharmacol. 29, 1989, с. 685). Прикладами що забезпечують спрямований перенос молекул є фолат або біотин (див., наприклад, U.S. 5416016 на ім'я Low зі співавторами); манозиди (Umezawa і ін., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153, 1988, с. 1038); антитіла (P.G. Bloeman і ін., FEBS Lett. 357, 1995, с. 140; M. Owais і ін., Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1995, с. 180); поверхнево-активний рецептор протеїну A (Briscoe та ін., Am. J. Physiol.1233, 1995, с. 134); p120 (Schreier і ін., J. Biol. Chem. 269, 1994, с. 9090); (див. також K. Keinanen; M.L. Laukkanen, FEBSLett. 346, 1994, с123; J.J. Killion; I.J. Fidler, Imrnunomethods 4,1994, с. 273). Варіанти застосування і способи, що пропонуються у винаході Антитіла (і імунокон'югати, і біспецифічні молекули), що пропонуються в даному винаході, можна застосовувати in vitro і in vivo у діагностичних і терапевтичних цілях. Наприклад, ці молекули можна вводити в клітини у культурі, наприклад, in vitro або in vivo, або індивідуумові, наприклад, in vivo, для лікування, попередження або діагностики різних захворювань. Мається на увазі, що поняття «індивідуум» у контексті даного опису відноситься до людини і тварин крім людини. До тварин крім людини відносяться всі хребетні тварини, наприклад, ссавці і тварини, що не відносяться до ссавців, такі як примати крім людини, вівці, собаки, кішки, корови, коні, кури, амфібії та рептилії. Способи найбільш переважно застосовувати для лікування хворих людей, які страждають порушенням, асоційованим з аномальною експресією IL-13. Коли антитіла до IL-13 уводять у сполученні з іншим 51 агентом, то їх вводять або в будь-якому порядку, або одночасно. В одному з варіантів здійснення винаходу антитіла (і імунокон'югати, і біспецифічні молекули), що пропонуються у винаході, можна застосовувати для виявлення рівнів IL-13 або рівнів клітин, які містять IL-13. Для цієї мети можна, наприклад, приводити в контакт зразок (такий як зразок in vitro) і контрольний зразок з антитілом до IL-13 в умовах, які забезпечують утворення комплексу між антитілом і IL-13. Виявляють і порівнюють у зразку і контролі будь-які комплекси, що утворилися між антитілом і IL-13. Наприклад, стандартні методи виявлення, добре відомі в даній галузі, такі як ELISA і аналіз проточної цитометрії, можна здійснювати з використанням композицій, що пропонуються у винаході. Таким чином, одним з об'єктів винаходу є також способи виявлення присутності IL-13 (наприклад, людського антигену IL-13) у зразку або вимірювання кількості IL-13, що міститься в пропонованому у винаході, або його антигензв'язуючим центром, що специфічно зв'язується з IL13, зразку, що знаходиться в контакті з антитілом, і у контрольному зразку в умовах, які дозволяють утворитися комплексу між антитілом або його областю та IL-13. Потім виявляють утворення комплексу, при цьому розходження в утворенні комплексу між зразком у порівнянні з контролем свідчить про присутність IL-13 у зразку. Під обсяг винаходу підпадають також набори, що містять композиції (наприклад, антитіла, людські антитіла, імунокон'югати та біспецифічні молекули), що пропонуються у винаході, та інструкції із застосування. До складу набору може входити також щонайменше один додатковий реагент або одне або кілька додаткових антитіл, що пропонуються у винаході (наприклад, антитіло, що володіє додатковим видом активності, що зв'язується з епітопом на антигені-мішені, відмінним від першого антитіла). До складу набору, як правило, входить етикетка із вказівкою по застосуванню компонентів набору. Під поняття етикетка підпадає будьякий письмовий або зареєстрований матеріал, що входить у набір або іншим способом доданий до набору. Повністю описаний вище винахід додатково проілюстрований нижче за допомогою прикладів, які дані з метою ілюстрації винаходу і не спрямовані на його обмеження, і формули винаходу. Фахівцям у даній галузі повинні бути очевидні або вони можуть одержувати за допомогою не більш ніж рутинних експериментів численні еквіваленти конкретних представлених у даному описі процедур. Такі еквіваленти підпадають під обсяг даного винаходу й формулу винаходу. Зміст всіх посилань, включаючи видані патенти і опубліковані заявки на патент, які процитовані в даному описі, включено в нього у якості посилання. Приклади Приклад 1: Одержання людських IL-13специфічних антитіл з бібліотек імунізованих спленоцитів РНК із селезінки використовували для створення фагової дисплейної бібліотеки довільно 96426 52 згрупованих варіабельних областей Н- і Lланцюгів у фаговому дисплейному векторі Fab, що описаний в US 6794132. Фагову дисплейну бібліотеку піддавали п'яти циклам селекції з використанням біотінільованого hrIL-13 відповідно до описаного в патенті протоколу рівноважного зв'язування в рідкій фазі (у фазі розчину). У чотирьох перших циклах селекції використовували -8 hrIL-13 у концентрації 10 М, а в останньому циклі селекції застосовували ML-13 у концентрації -9 10 М. При використанні цієї бібліотеки кінцеве відношення сигналу до шуму, що визначали за кількістю БУО, що утворилися в присутності антигену, поділеною на кількість БУО, що утворилися без антигену, становило 37, що свідчить про те, що більше 90% відібраних фагів експресували антитіла, які зв'язувалися з hrIL-13. Потім фагову дисплейну бібліотеку субклонували в плазмідному векторі для експресії розчинного Fab-фрагменту відповідно до методу, описаного в US 6794132. Субклонування бібліотеки здійснювали в плазмідних векторах в Е. соlі, кожна плазміда кодувала моноклональный Fab-фрагмент. Субклон бібліотеки висівали і колонії, що представляють собою індивідуальні клони, відбирали для інокуляції 96ямкових планшетів. Після вирощування протягом ночі отримані на планшетах культури застосовували для створення заархівованих банків заморожених клітин для клонів, а також для посіву з метою створення точних копій в 96-ямкових планшетах, у яких індуціювали експресію моноклональних антитіл. Наступного дня ці культури на 96-ямкових планшетах піддавали екстракції детергентом і очищали для виділення антитіл у мікрограмових кількостях. Очищені антитіла обробляли для видалення ендотоксинів і піддавали остаточній стерилізації фільтрацією. Здійснювали ELISAаналізи з використанням біотінільованого rhIL-13, яким сенсибілізували авідинові планшети, для ідентифікації лунок, які були функціонально позитивними.Сандвіч-аналізи, призначені для оцінки константних областей антитіл, використовували для визначення концентрацій антитіл у різних лунках. Для оцінки біологічної активності застосовували результати, отримані для 96-ямкових планшетів з антитілами, і дані аналізів. Клони, що представляють інтерес, у банках заморожених в 96-ямкових планшетах клітин потім секвенували для ідентифікації клонів, що експресують унікальні антитіла. Потім заморожені банки клітин цих унікальних клонів застосовували для посіву з метою одержання культур у невеликих кількостях (маломасштабне виробництво) у колбах, що струшуються, і вирощували протягом ночі. Колби для напівпромислового одержання засівали отриманими протягом ночі культурами і потім індуціювали для експресії антитіл. Наступного дня культури в колбах механічно гомогенізували та очищали для одержання антитіл у міліграмових кількостях. Очищені Fab-фрагменти обробляли для видалення ентотоксинів і піддавали остаточній стерилізації фільтрацією. Функціональну активність цих антитіл демонстрували за допомогою ELISA з використанням біотінільованого rhIL-13, яким сенсибілізували авідинові планшети. Для визначення концентрації 53 96426 антитіл використовували вимірювання абсорбції при 280 нм. В очищених Fab-фрагментів оцінювали здатність до зв'язування in vitro і активність у клітинному аналізі. Приклад 2: Кількісний аналіз афінності до зв'язування: визначення перспективних Fabфрагментів (Fab-фрагментів-кандидатів) антитіл до людського IL-13 Кількісну оцінку методом резонансу поверхневих плазмонів взаємодії Fab-фрагментів антитіл до IL-13 з декількома hrIL-13 здійснювали за допомогою оптичного біосенсору ВІАсоrе 2000. Специфічне зв'язування IL-13 з відповідним Fabфрагментом антитіла до IL-13, імобілізованим на чипі ВІАсоrе, можна здійснювати шляхом оцінки наступного нагромадження ліганду на рецепторі. Значення швидкостей асоціації (kоn) і дисоціації (koff) можна оцінювати з використанням мікроскопа безпосередньо по швидкостях нагромадження маси на чипі і виражати в одиницях відповіді (RU). Fab-фрагмент антитіла до IL-13 імобілізували на поверхні чипу через вторинне антитіло до людського L (фірма Jackson Immunochemicals). Це імобілізоване антитіло ковалентно зв'язували з використанням набору для амінового сполучення («Amine coupling kit» (фірма ВІАсоrе, каталожний № BR-1000-50), рекомендованого в протоколах виробника. Вводили шляхом ін'єкції 250 мкл різних концентрацій hrIL-13 зі швидкістю потоку 20 мкл/хв. і оцінювали кінетичну траєкторію. Поверхню чипу регенерували шляхом двох стадій відмивання кислотної з використанням 100мм НСl і вводили шляхом ін'єкції 10 мкл зі швидкістю потоку 20 мкл/хв. Така обробка приводила до дисоціації комплексу Fab-IL-13 через оборотну кислотну денатурацію. Не виявлено істотної втрати активності до зв'язування, коли антитіло повторно вводили шляхом ін'єкції в наступному циклі. Кінетичні траєкторії оцінювали за допомогою програмного забезпечення фірми ВІАсоrе, застосовуючи ленгмюровську модель асоціації 1:1. Узагальнені дані про афінності до людського IL-13 представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Fab 01471/G6 03161/Н2 01951/G12 01771/ЕЮ KD [пМ], людський IL-13 100 ±2 197 ±12 480 ±68 343 ± 54 Приклад 3: Перетворення в Ig-формат Матриці для секвенування ДНК антитіла очищали з 3 мл культур за допомогою пристрою QIAprep minipreps (фірма Qiagen Inc.). Матриці секвенували за допомогою пристрою типу Applied Biosystems 3100 Avant Genetic Analyzer відповідно до специфікацій виробника. Варіабельні області важкого і легкого капа-ланцюга відібраних клонів ампліфіціювали окремо з використанням матриць для секвенування за допомогою ПЦР, очищали електрофорезом в агарозному гелі і вирізали з гелю та очищали. Плазміди, що кодують VH і VL, клонували в касетах експресії для людського лег 54 кого капа-ланцюгу та людського важкого ланцюгу IgG1. Батьківську лінію клітин Sp2/0 трансфектували двома векторами, один вектор для легкого ланцюга і один для важкого ланцюга. Трансфектовані клітини відбирали і ампліфіціювали в присутності G418 і метотрексату відповідно, що приводило до одержання стійких ампліфіційованих клітинних пулів, що продукують антитіла, титри яких становили 5-30 мг/л. Потім застосовували клонування методом серійних розведень, що приводить до виділення 127 життєздатних клонів із шести 96ямкових планшетів. Лінії клітин, що утворилися, потім тестували відносно продуктивності в шейкері у форматі з періодичним завантаженням. Оцінка стабільності підтвердила стабільну інтеграцію експресіонних конструкцій, і, крім того, протягом 90денного періоду здійснювали також оцінку збільшення експресії продукту. Аналіз методом Нозернблоттінгу виявив індивідуальні повнорозмірні РНК із однаковою інтенсивністю смуг, що свідчить про аналогічні рівні експресії як важкого, так і легкого ланцюга. Приклад 4: Характеристики повнорозмірних антитіл до IL-13 за допомогою клітинного аналізу in vitro IL-13 є сильним індуктором вивільнення еотоксину з фібробластів легкої людини. Здатність антитіл нейтралізувати біологічну активність IL-13 оцінювали за допомогою аналізу індукованого IL13 вивільнення еотоксину з використанням фібробластів легкої людини. У цілому, метод полягав у 4 наступному: клітини (2  10 клітин на лунку в обсязі 100 мкл) висівали в кожну лунку 96-ямкового планшету для культури тканин. Клітини стимулювали концентрацією IL-13, що забезпечувала 80%ве щодо максимального вивільнення еотаксину, що визначали заздалегідь для кожної партії клітин з використанням стандартної кривої, побудованої для концентрації IL-13 від 0 до 100 нг/мл. У клітини вносили різні концентрації антитіл. Клітини інкубували протягом 24 год. при 37°С, 5% СО2 і культуральні середовища збирали та зберігали при 20°С до застосування. Рівні еотаксину в середовищах вимірювали за допомогою специфічного ELISA (фірма R&D systems), чутливість методу становила 15-1000 пг/мл. У такий спосіб одержували значення ЕС50 Fab-фрагментів антитіла до IL13, які представлені нижче в таблиці 2. Таблиця 2 Антитіло 01471/G6 03161/Н2 01951/G12 01771/ElO ЕС50 [нМ], людський IL-13 1,23 ± 0,4 0,95 ± 0,2 0,33 ±0,1 1,71 ±0,5 Приклад 5: Аналіз послідовностей антитіл до IL-13 Визначали нуклеотидні послідовності варіабельних областей важких і легких ланцюгів (VH і VL) всіх антитіл. Амінокислотні послідовності гіперваріабельних ділянок (CDR) представлені нижче в таблиці 3 і 4. CDR, які визначали за системою Кебота (Е. Kabat і ін., 1991, Sequences of Proteins of 55 96426 Immunological Interest, 5-е вид., вид-во Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, 56 MD), представлені в таблиці 3а і 4а. Таблиця 3 Антитіло HCDR1 SEQ ID No. HCDR1 HCDR2 SEQ ID No. HCDR2 01471/G6 03161/Н2 01951/G12 01771/Е10 GFTFSNYG GFTFSNYG GFTFSSYG GFTFSSYG 1 1 2 2 IWYDGSN IWYDGSN IWYDGSN IWYDGSN 3 3 3 3 HCDR3 VKGSGDIP VKGSGDIP ARLWFGDLD ARLWFGDLD SEQ ID No. HCDR3 4 4 5 5 Таблиця 3а Антитіло HCDR1 01471/G6 03161/H2 0195 l/G 12 01771/ElO NYGMH NYGMH SYGMH SYGMH SEQ ID No. HCDR1 6 6 7 7 HCDR2 IIWYDGSNKYYADSVKG IIWYDGSNKYYADSVKG IIWYDGSNKYYADSVKG IIWYDGSNKYYADSVKG SEQ ID No. HCDR2 8 8 8 8 HCDR3 GSGDIPFDY GSGDIPFDY LWFGDLDAFDI LWFGDLDAFDI SEQ ID No HCDR3 9 9 10 10 Таблиця 4 Антитіло 01471/G6 03161/H2 01951/G12 01771/E10 LCDR1 QSVSSY QSVSSY QSVSSY QSVSSY SEQ ID No. LCDR1 11 11 11 11 LCDR2 DA DA DA DA SEQ ID No. LCDR2 LCDR3 12 12 12 12 HQRSHWPPI HQRSHWPPI QQRSSWPPV HQRSSWPPI SEQ ID No. LCDR3 13 13 14 15 Таблиця 4a Антитіло 01471/G6 03161/H2 01951/G12 01771/ElO LCDR1 RASQSVSSYLA RASQSVSSYLA RAGQSVSSYLV RASQSVSSYLA SEQ ID No. LCDR1 16 16 17 18 LCDR2 DASNRAT DASNRAT DASNRAT DASNRAT Нижче наведені послідовності антитіл, представлених у попередніх таблицях, включаючи їхні каркасні ділянки. Нижче наведені також константні області легкого і важкого ланцюга повнорозмірного антитіла типу IgG1, включаючи наприклад, варіабельні області антитіла1951/G12 (виділені жирним шрифтом). SEQ ID No. LCDR2 19 19 19 19 LCDR3 HQRSHWPPIFT HQRSHWPPIFT QQRSSWPPVYT HQRSSWPPIFT SEQ ID No. LCDR3 20 20 21 22 Послідовність антитіла 01471/G6 (І) Варіабельна область НС Амінокислотна послідовність варіабельної області НС 01471/G6 представлена в SEQ ID NO: 23, і вона кодується нуклеотидною послідовністю, представленою в SEQ ID NO: 24 57 96426 58 (II) Варіабельна область LC Амінокислотна послідовність варіабельної області LC 01471/G6 представлена в SEQ ID NO:25, і вона кодується нуклеотидною представленою в SEQ ID NO:26 послідовністю, Антитіло 03161/Н2 (І) Варіабельна область НС Амінокислотна послідовність варіабельної області НС 03161/Н2 представлена в SEQ ID NO: 27, і вона кодується нуклеотидною послідовністю, представленою в SEQ ID NO: SEQ ID NO: 28 (II) Варіабельна область LC Амінокислотна послідовність варіабельної області LC 03161/H2 представлена в SEQ ID NO: 29, і вона кодується нуклеотидною послідовністю, представленою в SEQ ID NO:30 59 96426 60 Послідовність антитіла 01951/G12 (І) Варіабельна область НС Амінокислотна послідовність НС 01951/G12 представлена в SEQ ID NO: 31, і вона кодується нуклеотидною послідовністю, представленою в SEQ ID NO: 32 (II) Варіабельну область LC Амінокислотна послідовність варіабельної області LC 01951/G12 представлена в SEQ ID NO:33, і вона кодується нуклеотидною послідовністю, представленою в SEQ ID NO:34