Кон’югати антитіло-лікарський засіб (adc), що зв’язуються з білками 191p4d12

Реферат: Винахід стосується кон'югату антитіло-лікарський засіб, що містить анти-191Р4D12 антитіло або його антиген-зв'язувальний фрагмент, де антитіло або його антиген-зв'язувальний фрагмент містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що складається з амінокислотного залишку 20 до амінокислотного залишку 136 SEQ ID NO:7, та варіабельної ділянки легкого ланцюга, що складається з амінокислотного залишку 23 до амінокислотного залишку 130 SEQ ID NO:8, і де антитіло або його антиген-зв'язувальний фрагмент кон'югований до монометилауристатину Е, а також стосується способу лікування раку із застосуванням такого кон'югата. UA 110495 C2 (12) UA 110495 C2 UA 110495 C2 5 10 Перехресне посилання на споріднені заявки Ця заявка є звичайною (не попередньою) патентною заявкою, в якій заявлено пріоритет попередньої заявки США № 61/387,933, поданої 29 вересня 2010 р. Зміст заявки, згаданої у цьому абзаці, повністю включений до цього опису шляхом посилання. ПОСИЛАННЯ НА ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ, ПОДАНИЙ ЗА ДОПОМОГОЮ СИСТЕМИ EFS-WEB Повний зміст вказаного нижче електронного подання переліку послідовностей через вебсервер Патентного відомства США EFS-WEB, авторизований та описаний в MPEP §1730 II.B.2(a)(C), повністю включений до цього опису шляхом посилання в усіх відношеннях. Перелік послідовностей зазначений у поданому електронним шляхом текстовому файлі таким чином: Назва файлу 511582008250Seqlist.txt 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Дата створення 27 вересня 2011р. Розмір (байтів) 41949 байтів ЗАЯВА ПРО ПРАВА НА ВИНАХОДИ, СТВОРЕНІ ВІДПОВІДНО ДО СПОНСОВАНОГО НА ФЕДЕРАЛЬНОМУ РІВНІ ДОСЛІДЖЕННЯ Немає. ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Описаний винахід стосується антитіл, зв’язувальних фрагментів та кон’югатів антитілолікарський засіб (ADS), які зв’язують білки, іменовані терміном "191P4D12". Винахід також стосується прогностичних, профілактичних і терапевтичних способів та композицій, придатних для лікування раку, що експресує 191P4D12. ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Рак є другою основною причиною людської смертності після ішемічної хвороби серця. В усьому світі мільйони людей вмирають від раку щороку. Лише у США, відповідно до повідомлень Американського співтовариства боротьби з раковими захворюваннями, рак спричиняє смерть значно більше півмільйона людей щороку, при діагностуванні понад 1,2 мільйона нових випадків щороку. Тоді як смертність від серцевих хвороб значно знижується, смертність від раку здебільшого зростає. Передбачають, що на початку наступного століття рак буде основною причиною смертності. У світі декілька видів раку виступають провідними вбивцями. Зокрема, карцинома легенів, передміхурової залози, молочної залози, товстої кишки, підшлункової залози, яєчників та сечового міхура є основними причинами смерті від раку. Ці та практично всі інші види карцином мають спільну летальну ознаку. За дуже незначною кількістю винятків, метастатична пухлина карциноми є невідворотною. Більше того, навіть для тих ракових пацієнтів, які спочатку долають первинний рак, загальний досвід показує, що їхнє життя різко змінюється. Багато ракових пацієнтів переживають сильні тривоги, спричинені усвідомленням потенційного рецидиву або неефективності лікування. Багато ракових пацієнтів переживають виснаження після лікування. Крім того, у багатьох ракових пацієнтів відбуваються рецидиви. У світі рак передміхурової залози є четвертим найпоширенішим видом раку серед чоловіків. У Північній Америці та Північній Європі він є безумовно найпоширенішим видом раку серед чоловіків і другою провідною причиною смертності від раку серед чоловіків. Лише у США, значно більше ніж 30 000 чоловіків щорічно вмирають від цієї хвороби - другої лише після раку легенів. Незважаючи на величину цих цифр, все ще не існує жодного ефективного лікування метастатичного раку передміхурової залози. Хірургічна простатектомія, променева терапія, гормон-пригнічувальна терапія, хірургічна кастрація та хіміотерапія продовжують бути основними способами лікування. На жаль, ці способи лікування є неефективними для багатьох і часто пов’язані з небажаними наслідками. З точки зору діагностики, відсутність маркера пухлини передміхурової залози, який міг би чітко виявити початкові, локалізовані пухлини, залишається значним обмеженням при діагностиці та керуванні перебігом цього захворювання. Хоча аналіз специфічного антигену простати (PSA) в сироватці є дуже корисним інструментом, небезпідставно вважають, що його специфічності та універсальності бракує декількох важливих аспектів. Прогрес у визначенні додаткових специфічних маркерів раку простати було покращено поколінням ксенотрансплантатів раку простати, які можуть відтворити різні стадії захворювання у мишей. Ксенотрансплантати LAPC (Лос-Анджелеського раку простати) є ксенотрансплантатами раку простати, які пережили перенесення мишам із тяжким комбінованим імунодефіцитом (ТКІД) та проявили здатність імітувати перехід від андрогенової залежності до андрогенової незалежності (Klein et al., 1997, Nat. Med. 3:402). Нещодавно виявленими маркерами раку простати є PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7252), специфічний до простати мембранний антиген (PSMA) (Pinto et al., Clin Cancer Res 1996 Sep 2 (9): 1445-51), STEAP (Hubert, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Dec 7; 96(25): 14523-8) та антиген стовбурових клітин простати (PSCA) (Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735). Хоча виявлені раніше маркери, такі як PSA, полегшували спроби діагностування та лікування раку простати, існує потреба у виявленні додаткових маркерів і терапевтичних мішеней для раку простати та споріднених видів раку для подальшого покращення діагностування та лікування. У 2000 р. в США мали місце приблизно 130 200 випадків колоректального раку, у тому числі 93 800 випадків раку товстої кишки та 36 400 раку прямої кишки. Колоректальний рак є третім найпоширенішим видом раку серед чоловіків та жінок. Коефіцієнт захворюваності значно знизився впродовж 1992-1996 років (-2,1 % на рік). Дослідження наводять на думку, що таке зниження було наслідком підвищеного скринінгу та видалення поліпів, запобігання перетворення поліпів на інвазивний рак. У 2000 р. мало місце близько 56 300 смертей (47 700 від раку товстої кишки, 8600 від раку прямої кишки), що становило близько 11 % всіх смертей від раку в США. Нині хірургічна операція є найпоширенішою формою лікування колоректального раку, а для раку, що не поширився, вона часто є радикальною. Хіміотерапію або хімію плюс опромінювання проводять перед або після хірургічної операції у більшості пацієнтів, у яких рак глибоко проник у стінки внутрішніх органів або поширився на лімфовузли. Іноді є потреба в перманентній колостомії (створенні черевного отвору для видалення виділень організму) при раку товстої кишки, а в поодиноких випадках вона є необхідною при раку прямої кишки. Продовжує існувати потреба в ефективних способах діагностування та лікування колоректального раку. З усіх нових випадків раку в США рак сечового міхура становить приблизно 5 % серед чоловіків (п’яте найпоширеніше новоутворення) і 3 % серед жінок (восьме найпоширеніше новоутворення). Захворюваність збільшується повільно, паралельно до збільшення населення похилого віку. У 1998 р. було близько 54 500 випадків, у тому числі 39 500 серед чоловіків і 15 000 серед жінок. Стандартизований за віком коефіцієнт захворюваності у США становить 32 на 100 000 у чоловіків та вісім на 100 000 у жінок. Історичне співвідношення чоловіків до жінок 3:1 може знижуватись відносно курців-жінок. У 1998 р. мало місце приблизно 11 000 смертей від раку сечового міхура (7800 серед чоловіків і 3900 серед жінок). Захворюваність на рак сечового міхура та смертність від цієї хвороби сильно підвищуються з віком, а зі старінням населення це буде проблемою, що зростає. Більшість видів раку сечового міхура рецидивують у сечовому міхурі. Стримування розвитку раку сечового міхура здійснюють за допомогою комбінації трансуретальної резекції сечового міхура (TUR) та внутрішньопухирцевої хіміотерапії або імунотерапії. Множинний та рецидивний характер раку сечового міхура свідчить про обмеження застосування TUR. Більшість видів раку з проростанням у м’язовий шар не піддаються лікуванню лише за допомогою TUR. Радикальна цистектомія та відведення сечі є найбільш ефективними способами знищення раку, але вони мають безперечний вплив на сечову та сексуальну функції. Продовжує існувати значна потреба у способах лікування, що є сприятливими для пацієнтів із раком сечового міхура. У 2000 році було приблизно 164 100 нових випадків раку легенів та бронхіального раку, що становило 14 % від всіх діагнозів раку у США. Коефіцієнт захворюваності на рак легенів та бронхіальний рак значно знижується у чоловіків, з 86,5 на 100 000 у 1984 році до 70,0 у 1996 році. У 1990-х роках темпи зростання захворюваності серед жінок почали знижуватись. У 1996 році коефіцієнт захворюваності у жінок становив 42,3 на 100 000. Рак легенів і бронхіальний рак спричинили приблизно 156 900 смертей у 2000 р., що становило 28 % від усіх смертей від раку. Впродовж 1992-1996 років смертність від раку легенів значно знизилась серед чоловіків (-1,7 % на рік), тоді як темпи захворюваності серед жінок все ще значно збільшувались (0,9 % на рік). З 1987 року більше жінок щороку вмирали від раку легенів, аніж від раку молочної залози, який, за понад 40 років, був основною причиною смертності від раку серед жінок. Зниження захворюваності на рак легенів та коефіцієнту смертності наімовірніше було наслідком зниження рівня тютюнопаління за попередні 30 років; однак, зниження кількості курців серед жінок є більшим, ніж у чоловіків. Викликає стурбованість той факт, що хоча зниження вживання тютюну дорослими уповільнилося, вживання тютюну серед молоді знову збільшується. Варіанти лікування раку легенів та бронхіального раку визначаються типом і стадією раку та включають хірургічну операцію, променеву терапію та хіміотерапію. Для багатьох видів локалізованого раку хірургічна операція звичайно є видом лікування, якому надають перевагу. Через те, що зазвичай хвороба вже розповсюдилася до моменту її виявлення, променева 2 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 терапія та хіміотерапія часто є необхідними у поєднанні з хірургічною операцією. Хіміотерапія окремо або у поєднанні з опромінюванням є видом лікування, якому надають перевагу, проти дрібноклітинного раку легенів; за такої схеми великий відсоток пацієнтів переживають ремісію, яка у деяких випадках триває довго. Однак, існує постійна потреба в ефективному лікуванні та підходах до діагностування раку легенів і бронхіального раку. Приблизно 182 800 нових випадків інвазивного раку молочної залози очікували серед жінок у США впродовж 2000 р. Крім того, близько 1400 нових випадків раку молочної залози очікували діагностувати у чоловіків у 2000 р. Після зростання близько на 4 % щороку у 1980-х, захворюваність на рак молочної залози у жінок вирівнялася у 1990-х до близько 110,6 випадків на 100 000. Лише у США було приблизно 41 200 смертей (40 800 серед жінок, 400 серед чоловіків) у 2000 році від раку молочної залози. Рак молочної залози займає друге місце серед смертей від раку у жінок. За найостаннішими даними, рівень смертності значно знизився впродовж 19921996 років з найбільшим зниженням серед молодих жінок, світлошкірих і темношкірих. Це зниження, ймовірно, було наслідком більш раннього виявлення та покращеного лікування. Враховуючи медичні обставини та преференції пацієнта, лікування раку молочної залози може включати лампектомію (місцеве видалення пухлини) та видалення лімфовузлів під пахвами; мастектомію (хірургічне видалення грудей) та видалення лімфовузлів під пахвами; променеву терапію; хіміотерапію; або гормональну терапію. Часто використовують два або більше методи у поєднанні. Численні дослідження показали, що для захворювання на ранній стадії показники тривалої виживаності після лампектомії плюс радіотерапії є подібними до показників виживаності після модифікованої радикальної мастектомії. Значний прогрес в обладнанні для хірургічного відновлення забезпечують декілька варіантів хірургічного відновлення грудей після мастектомії. Нещодавно таке хірургічне відновлення було проведено одночасно з мастектомією. Місцеве видалення протокової карциноми in situ (DCIS) з необхідними кількостями довколишньої здорової тканини грудей може запобігти місцевому рецидиву DCIS. Опромінювання молочної залози та/або тамоксифен можуть знизити ймовірність виникнення DCIS у решті тканини молочної залози. Це є важливим, оскільки DCIS, якщо її залишити без лікування, може перетворитися на інвазивний рак молочної залози. Між тим, існують серйозні побічні ефекти або ускладення від такого лікування. У зв’язку з цим, існує потреба в ефективному лікуванні раку молочної залози. У 2000 році було близько 23 100 нових випадків раку яєчників у США. Він є причиною 4 % всіх видів раку серед жінок і займає друге місце з-поміж видів гінекологічного раку. За період 1992-1996 років показники захворюваності на рак яєчників значно знизились. Внаслідок раку яєчників у 2000 році мало місце близько 14 000 смертей. Рак яєчників спричиняє більше смертей, ніж будь-який інший вид раку жіночої репродуктивної системи. Хірургічна операція, радіотерапія і хіміотерапія є варіантами лікування раку яєчників. Хірургічна операція звичайно включає видалення одного або обох яєчників, фаллопієвих труб (сальпінгооваріектомію) та матки (гістеректомію). При деяких видах дуже ранніх пухлин видаляють лише уражений яєчник, особливо у молодих жінок, які бажають мати дітей. При задавненій хворобі намагаються видалити всю хворобу в черевній порожнині для покращення ефекту від хіміотерапії. Існує постійна важлива потреба у варіантах ефективного лікування раку яєчників. У 2000 році було близько 28 300 нових випадків раку підшлункової залози в США. За останні 20 років показники раку підшлункової залози знизилися у чоловіків. Серед жінок показники залишалися приблизно постійними, але можуть починати знижуватись. Рак підшлункової залози був причиною близько 28 200 смертей у 2000 році в США. За останні 20 років було незначне, але важливе зниження показників смертності серед чоловіків (близько -0,9 % щороку), тоді як у жінок ці показники трохи підвищилися. Хірургічна операція, радіотерапія та хіміотерапія є варіантами лікування раку підшлункової залози. Ці варіанти лікування можуть подовжувати виживаність та/або полегшувати симптоми у багатьох пацієнтів, але навряд чи можуть вилікувати багатьох. Існує значна потреба у додаткових терапевтичних і діагностичних методах проти раку. До них відноситься застосування антитіл, вакцин і синтетичних препаратів як методів лікування. Крім того, існує також потреба у застосуванні цих методів як засобів для досліджень з метою діагностування, виявлення, контролю та розвитку рівня техніки в усіх сферах лікування і дослідження раку. Нині усвідомлюють терапевтичну корисність моноклональних антитіл (mAb) (G. Kohler and C. Milstein, Nature 256:495-497 (1975)). Нещодавно моноклональні антитіла було схвалено як терапію при трансплантуванні, раку, інфекційних захворюваннях, серцево-судинних 3 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 захворюваннях та запаленнях. Різні ізотипи мають різні ефекторні функції. Такі відмінності у функціонуванні відображені у відмінних 3-вимірних структурах для різноманітних імуноглобулінових ізотипів (P.M. Alzari et al., Annual Rev. Immunol., 6:555-580 (1988)). Оскільки миші є зручними для імунізації та визнають більшість людських антигенів як чужорідні, моноклональні антитіла проти людських мішеней з терапевтичним потенціалом звичайно мали мишаче походження. Однак, мишачі моноклональні антитіла мають властиві їм недоліки як людські терапевтичні засоби. Вони потребують більш частого дозування, оскільки моноклональні антитіла мають більш короткий період напіввиведення, що циркулює, у людей, аніж людські антитіла. Що є більш серйозним, повторне введення мишачих антитіл до людської імунної системи спричиняє реакцію людської імунної системи шляхом розпізнавання мишачого білка як чужорідного та вироблення людського протимишачого антитіла (HAMA). Така HAMA реакція може спричинити алергічну реакцію та швидке виведення мишачого антитіла із системи, зводячи лікування мишачим антитілом нанівець. Для уникнення таких ефектів були вчинені спроби створення людських імунних систем у мишей. Під час перших спроб сподівалися створити трансгенних мишей, здатних реагувати на антигени атитілами, що мають людські послідовності (див. Bruggemann et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 86:6709-6713 (1989)), але вони були обмежені кількістю ДНК, яку можна було стійко підтримувати доступними носіями для клонування. Використання клонувальних векторів штучних хромосом дріжджів (YAC) показало шлях введенню великих фрагментів зародкових шляхів локусу Ig людини трансгенним ссавцям. По суті, більшість людських генів ділянок V, D і J, розташованих на такій самій відстані, як у людському геномі, та людські константні ділянки було введено мишам із застосуванням YAC. Одна така лінія трансгенних мишей відома як миші XenoMouse® і є доступною в продажу у компанії Amgen Fremont, Inc. (Фремонт, штат Каліфорнія). СУТЬ ВИНАХОДУ Винахід забезпечує антитіла, зв’язувальні фрагменти та кон’югати антитіло-лікарський засіб (ADC), що зв’язуються з білками 191P4D12 та поліпептидними фрагментами білків 191P4D12. У деяких втіленнях винахід стосується повністю людських антитіл, кон’югованих з терапевтичним засобом. У деяких втіленнях є застереження, що вся нуклеотидна послідовність за Фігурою 3 не кодована та/або вся амінокислотна послідовність за Фігурою 2 є необробленою. У деяких втіленнях вся нуклеотидна послідовність за Фігурою 3 є кодованою та/або вся амінокислотна послідовність за Фігурою 2 є обробленою, кожна з яких перебуває у відповідній формі однократної дози для людини. Винахід також забезпечує різні імуногенні або терапевтичні композиції, такі як кон’югати антитіло-лікарський засіб, та стратегії лікування видів раку, що експресують 191P4D12, таких, як види раку тканин, перелік яких наведено у Таблиці I. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР Фігура 1. кДНК та амінокислотна послідовність 191P4D12 показана на Фігурі 1. Ініціювальний метіонін підкреслений. Відкрита рамка зчитування проходить від нуклеїнової кислоти 264-1796, що включає термінувальний кодон. Фігури 2A-B. Нуклеїнові та амінокислотні послідовності антитіл до 191P4D12. Фігура 2A. кДНК та амінокислотна послідовність важкого ланцюга Ha22-2(2,4)6.1. Двома лініями підкреслена лідерна послідовність, підкреслена варіабельна ділянка важкого ланцюга, пунктирною лінією підкреслена константна ділянка IgG1 людини. Фігура 2B. кДНК та амінокислотна послідовність легкого ланцюга Ha22-2(2,4)6.1. Двома лініями підкреслена лідерна послідовність, підкреслена варіабельна ділянка легкого ланцюга, а пунктирною лінією підкреслена константна ділянка, що містить легкий каппа ланцюг людини. Фігури 3A-B. Амінокислотні послідовності антитіл до 191P4D12. Фігура 3A. Амінокислотна послідовність важкого ланцюга Ha22-2(2,4)6.1. Двома лініями підкреслена лідерна послідовність, підкреслена варіабельна ділянка важкого ланцюга, пунктирною лінією підкреслена константна ділянка IgG1 людини. Фігура 3B. Амінокислотна послідовність легкого ланцюга Ha22-2(2,4)6.1. Двома лініями підкреслена лідерна послідовність, підкреслена варіабельна ділянка легкого ланцюга, а пунктирною лінією підкреслена константна ділянка, що містить легкий каппа ланцюг людини. Фігури 4A-B. Вирівнювання антитіл Ha22-2(2,4)6.1 до зародкової лінії Ig людини. Фігура 4A. Вирівнювання важкого ланцюга Ha22-2(2,4)6.1 до зародкової лінії Ig людини. Фігура 4B. Вирівнювання легкого ланцюга Ha22-2(2,4)6.1 до зародкової лінії Ig людини. Фігури 5A-B. Ha22-2(2,4)6.1 Аналіз зв’язування моноклональних антитіл (MAb). Фігура 5A: RAT-контроль і RAT-191P4D12 клітини забарвили моноклональним антитілом Ha22-2(2,4)6.1 з клітин гібридоми або із клітин яєчника китайського хом’ячка (клітинної лінії CHO). Зв’язування 4 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виявляли за допомогою протокової цитометрії. Результати показують, що моноклональне антитіло Ha22-2(2,4)6.1, рекомбінантним чином експресоване в клітинах CHO, секретується та зв’язується специфічним чином з 191P4D12 клітинної поверхні. Фігура 5B: Моноклональне антитіло Ha22-2(2,4)6.1 з клітин гібридоми або з клітин CHO аналізували на предмет зв’язування з рекомбінантним очищеним позаклітинним білком 191P4D12 за допомогою імунноферментного аналізу (ІФА). Результати показують, що зв’язування білка 191P4D12 з Ha222(2,4)6.1, виведеним з CHO та гібридоми, було ідентичним. Фігура 6. Ha22-2(2,4)6.1vcMMAE визначення афінності за допомогою аналізу FACS (сортування флуоресцентно-активованих клітин) із використанням клітин людини PC3191P4D12. Афінність становила 0,69 Kd. Фігура 7. Ha22-2(2,4)6.1vcMMAE визначення афінності за допомогою аналізу FACS із використанням клітин яванського макаки PC3-191P4D12. Афінність становила 0,34 Kd. Фігура 8. Ha22-2(2,4)6.1vcMMAE визначення афінності за допомогою аналізу FACS із використанням клітин пацюка PC3-191P4D12. Афінність становила 1,6 Kd. Фігури 9A-D. Цитотоксичність клітин, опосередкована Ha22-2(2,4)6.1vcMMAE. Фігура 9A: Аналіз цитотоксичності клітин із використанням клітин людини PC3-191P4D12. Фігура 9B: Аналіз цитотоксичності клітин із використанням клітин яванського макаки PC3-191P4D12. Фігура 9C: Аналіз цитотоксичності клітин із використанням клітин пацюка PC3-191P4D12. Фігура 9D: Аналіз цитотоксичності клітин із використанням клітин PC3-Neo. Фігура 10. Аналіз топографії доменів моноклонального антитіла до Ha22-(2,4)6.1 за допомогою аналізу FACS. Фігура 11. Аналіз топографії доменів моноклонального антитіла Ha22-2(2,4)6.1 за допомогою вестерн-блотингу. Фігура 12. Оцінювання моноклонального антитіла Ha22-2(2,4)6.1 на моделі утворення підшкірної пухлини у ксенотрансплантаті раку легенів людини AG-L4 у мишей із ТКІД. Результати показують, що моноклональні антитіла до 191P4D12 не інгібували значним чином росту пухлин у ксенотрансплантаті раку легенів людини AG-L4 у мишей із ТКІД. Фігура 13. Оцінювання моноклонального антитіла Ha22-2(2,4)6.1 на моделі утворення підшкірної пухлини у ксенотрансплантаті раку підшлункової залози людини HPAC у мишей із ТКІД. Результати показують, що моноклональні антитіла до 191P4D12 не інгібували росту пухлин у ксенотрансплантаті раку підшлункової залози людини у мишей із ТКІД порівняно з контрольним антитілом. Фігура 14. Оцінювання моноклонального антитіла Ha22-2(2,4)6.1 на моделі утворення підшкірної пухлини у ксенотрансплантаті раку підшлункової залози людини AG-Panc3 у мишей із ТКІД. Результати показують, що моноклональні антитіла 191P4D12 не інгібували росту пухлин у ксенотрансплантаті раку підшлункової залози людини у мишей із ТКІД порівняно з контрольним антитілом. Фігура 15. Ефективність Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE у підшкірному ксенотрансплантаті встановленого раку легенів людини AG-L4 у мишей із ТКІД. Результати показують, що лікування Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE значно інгібувало ріст ксенотрансплантатів раку легенів AG-L4, імплантованих підшкірно безтимусним мишам, порівняно з обробленим та необробленим контролем. Фігура 16. Ефективність Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE у підшкірному ксенотрансплантаті встановленого раку молочної залози людини BT-483 у мишей із ТКІД. Результати показують, що лікування Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE значно інгібувало ріст BT-483 ксенотрансплантатів пухлини молочної залози, імплантованих підшкірно мишам із ТКІД, порівняно з обробленим та необробленим контрольними кон’югатами антитіло-лікарський засіб. Фігура 17. Ефективність Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE у підшкірному ксенотрансплантаті встановленого раку сечового міхура людини AG-B1 у мишей із ТКІД. Результати показують, що лікування Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE значно інібувало ріст AG-B1 ксенотрансплантатів раку сечового міхура порівняно з контрольними кон’югатами антитіло-лікарський засіб. Фігура 18. Ефективність Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE у підшкірному ксенотрансплантаті встановленого раку підшлункової залози людини AG-Panc2 у мишей із ТКІД. Результати показують, що лікування Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE значно інібувало ріст AG-Panc2 ксенотрансплантатів раку підшлункової залози порівняно з контрольними кон’югатами антитілолікарський засіб. Фігура 19. Ефективність Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE у підшкірному ксенотрансплантаті встановленого раку легенів людини AG-Panc4 у мишей із ТКІД. Результати показують, що лікування Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE значно інібувало ріст AG-Panc4 ксенотрансплантатів раку підшлункової залози порівняно з контрольними кон’югатами антитіло-лікарський засіб. 5 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 20. Ефективність Ha22-2(2,4)6.1-vcMMAE при порівнювальному дозуванні у підшкірному ксенотрансплантаті встановленого раку сечового міхура людини AG-B8 у мишей із ТКІД. Результати показують, що лікування Ha22-2(2,4)6.1vcMMAE у дозі 10 мг/кг значно інгібувало ріст AG-B8 ксенотрансплантатів раку сечового міхура порівняно з Ha222(2,4)6.1vcMMAE у дозі 5 мг/кг. Фігури 21A-N. Виявлення білка 191P4D12 у зразках ракового пацієнта за допомогою ІГХ. На Фігурах 21A-B показані зразки раку сечового міхура. На Фігурах 21C-D показані зразки раку молочної залози. На Фігурах 21E-F показані зразки раку підшлункової залози. На Фігурах 21G-H показані зразки раку легенів. На Фігурах 21I-J показані зразки раку яєчників. На Фігурах 21K-L показані зразки раку стравоходу. На Фігурі 21M-N показані зразки раку стравоходу. Фігури 22A-B. Показані криві зв’язування, що їх використовують для визначення афінності моноклонального антитіла Ha22-2(2,4)6.1 та Ha22-2(2,4)6.1vcMMAE до очищеного рекомбінантного 191P4D12 (позаклітинний домен (ECD) амінокислоти 1-348). Фігури 23A-D. Показане зв’язування Ha22-2(2,4)6.1 з клітинами PC3, що експресують 191P4D12 (Фігура 23A), та ортологами яванського макаки (Фігура 23B), пацюка (Фігура 23C) та миші (Фігура 23D). Фігури 24A-D. Показане зв’язування Ha22-2(2,4)6.1 з подвійним мутантним A76I, S91N, яке є подібним до зв’язування мишачого ортолога. Фігура 25. Показана модель V-домену 191P4D12, що ґрунтується на опублікованих даних структури кристалу для членів сімейства 191P4D12, та Ig-домену, що містить білки, із використанням PyMOL. Показані положення Ala-76 (крапковим пунктиром) та Ser-91 (перехресним діагональним штрихуванням). Фігури 26A-C. Показане зв’язування Ha22-2(2,4)6.1 із V-доменом, що експресує клітини (Фігура 26A), а також з 191P4D12 дикого типу (Фігура 26B), але не з доменом C1C2, що експресує клітини, утворені раніше (Фігура 26C). ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Зміст розділів I.) Визначення. II.) Антитіла до 191P4D12. III.) Кон’югати антитіло-лікарський засіб у загальних рисах. III(A). Мейтанзиноїди. III(B). Ауристатини і долостатини. III(C). Каліхеаміцин. III(D). Інші цитотоксичні засоби. IV.) Кон’югати антитіло-лікарський засіб, які зв’язують 191P4D12. V.) Лінкерні одиниці. VI.) Розтягувальна одиниця. VII.) Амінокислотна одиниця. VIII.) Спейсерна одиниця. IX.) Одиниця лікарського засобу. X.) Завантаження лікарським засобом. XI.) Способи визначення цитотоксичного ефекту кон’югатів антитіло-лікарський засіб. XII.) Лікування видів раку, що експресують 191P4D12. XIII.) 191P4D12 як мішень для терапії із застосуванням антитіл. XIV.) Коктейлі кон’югату антитіло-лікарський засіб до 191P4D12. XV.) Комбінована терапія. XVI.) Набори/готові вироби. l.) Визначення Якщо не вказано інакше, передбачають, що всі технічні терміни, умовні позначення та інші наукові терміни або термінологія, використані у цьому описі, мають значення, які звичайно розуміють спеціалісти у галузі, до якої належить цій винахід. У деяких випадках терміни зі звичайно зрозумілими значеннями визначені у цьому описі для ясності та/або зручності, і включення таких визначень не обов’язково необхідно тлумачити як таке, що становить істотну відмінність від того, що звичайно розуміють у цій галузі. Багато методів і процедур, описаних у цьому описі або на які у ньому є посилання, є добре зрозумілими, і спеціалісти у цій галузі звичайно застосовують їх із використанням традиційної методології, як, наприклад, широко застосовані методології молекулярного клонування, описані Сембрук та ін. (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Якщо є доречним, процедури, пов’язані з використанням наявних у продажу наборів та реактивів, звичайно проводять відповідно до інструкцій та/або параметрів, 6 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визначених виробником, якщо не вказано інакше. При використанні у цьому описі торгового найменування, посилання на таке торгове найменування також стосується композиції продукту, ліків-дженериків та активного фармацевтичного інгредієнта або інгредієнтів продукту під торговим найменуванням, якщо в контексті не зазначено інакше. Терміни "розповсюджений рак", "місцево розповсюджений рак", "розповсюджена хвороба" та "місцево розповсюджена хвороба" означають види раку, які розповсюдилися крізь капсулу відповідної тканини, і розуміють, що вони включають хворобу на стадії С за системою Американської урологічної асоціації (AUA), хворобу на стадії C1 - C2 за системою ВітмораДжюета (Whitmore-Jewett) та хворобу на стадії T3 - T4 і N+ за системою TNM (пухлина, вузол, метастаз). Загалом, хірургічне втручання не рекомендують пацієнтам з місцево розповсюдженою хворобою, і ці пацієнти мають істотно менш сприятливі наслідки порівняно з пацієнтами, які мають клінічно локалізований (обмежений органом) рак. Скорочення "AFP" стосується диметилвалін-валін-долаізолеїн-долапроїн-фенілаланін-pфенілендіаміну (див. Формулу XVI нижче). Скорочення "MMAE" стосується монометилауристатину E (див. Формулу XI нижче). Скорочення "AEB" стосується складного ефіру, одержаного шляхом введення у реакцію ауристатину E з параацетилбензойною кислотою (див. Формулу XX нижче). Скорочення "AEVB" стосується складного ефіру, одержаного шляхом введення у реакцію ауристатину E з бензоїлвалеріяновою кислотою (див. Формулу XXI нижче). Скорочення "MMAF" стосується довалін-валін-долаізолеїн-долапроїн-фенілаланіну (див. Формулу XVIV нижче). Якщо не вказано інакше, термін "алкіл" стосується насиченого вуглеводню з прямим або розгалуженим ланцюгом, що має від близько 1 до близько 20 атомів вуглецю (та всіх комбінацій і субкомбінацій меж і конкретної кількості атомів вуглецю в них), причому перевагу надають наявності від близько 1 до близько 8 атомів вуглецю. Прикладами алкільних груп є метил, етил, н-пропіл, ізо-пропіл, н-бутил, ізо-бутил, сек-бутил, терт-бутил, н-пентил, 2-пентил, 3-пентил, 2метил-2-бутил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-ноніл, н-децил, 3-метил-2-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-1-бутил, 1-гексил, 2-гексил, 3-гексил, 2-метил-2-пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2пентил, 3-метил-3-пентил, 2-метил-3-пентил, 2,3-диметил-2-бутил і 3,3-диметил-2-бутил. Алкільні групи, окремо або як частина іншої групи, можуть бути необов’язково заміщені однією або більше групами, переважно 1-3 групами (та будь-якими додатковими замісниками, вибраними з галогену), включаючи, але це не є обмеженням, -галоген, -O-(C1-C8 алкіл), -O-(C2C8 алкеніл), -O-(C2-C8 алкініл), -арил, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, C(O)N(R’)2, -NHC(O)R’, -SR’, -SO3R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 і -CN, де кожний R’ незалежно вибирають з -H, -C1-C8 алкілу, -C2-C8 алкенілу, -C2-C8 алкінілу або арилу, і де згадані -O-(C1-C8 алкільна), -O-(C2-C8 алкенільна), -O-(C2-C8 алкінільна), -арильна, C1-C8 алкільна, -C2-C8 алкенільна та -C2-C8 алкінільна групи можуть необов’язково бути додатково заміщені однією або більше групами, включаючи, але це не є обмеженням, -C1-C8 алкіл, -C2-C8 алкеніл, -C2-C8 алкініл, -галоген, -O-(C1-C8 алкіл), -O-(C2-C8 алкеніл), -O-(C2-C8 алкініл), -арил, -C(O)R’’, -OC(O)R’’, -C(O)OR’’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’’, -C(O)N(R’’)2, -NHC(O)R’’, SR’’, -SO3R’’, -S(O)2R’’, -S(O)R’’, -OH, -N3, -NH2, -NH(R’’), -N(R’’)2 і -CN, де кожний R’’ незалежно вибирають з -H, -C1-C8 алкілу, -C2-C8 алкенілу, -C2-C8 алкінілу або -арилу. Якщо не вказано інакше, терміни "алкеніл" та "алкініл" стосуються прямих та розгалужених вуглецевих ланцюгів, що мають від близько 2 до близько 20 атомів вуглецю (та всіх комбінацій і субкомбінацій меж і конкретної кількості атомів вуглецю в них), причому перевагу надають наявності від близько 2 до близько 8 атомів вуглецю. Алкенільний ланцюг має принаймні один подвійний зв'язок в ланцюгу, а алкінільний ланцюг має принаймні один потрійний зв'язок в ланцюгу. Приклади алкенільних груп включають, але це не є обмеженням, етилен або вініл, аліл, -1-бутеніл, -2-бутеніл, -ізобутиленіл, -1-пентеніл, -2-пентеніл, -3-метил-1-бутеніл, -2-метил2-бутеніл і -2,3-диметил-2-бутеніл. Приклади алкінільних груп включають, але це не є обмеженням, ацетилен, пропаргіл, ацетиленіл, пропініл, -1-бутиніл, -2-бутиніл, -1-пентиніл, -2пентиніл і -3-метил-1 бутиніл. Алкенільні та алкінільні групи, окремо або як частина іншої групи, можуть бути необов’язково заміщені однією або більше групами, переважно 1-3 групами (та будь-якими додатковими замісниками, вибраними з галогену), включаючи, але це не є обмеженням, галоген, -O-(C1-C8 алкіл), -O-(C2-C8 алкеніл), -O-(C2-C8 алкініл), -арил, -C(O)R’, -OC(O)R’, C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2, -NHC(O)R’, -SR’, -SO3R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, =O, N3, -NH2, -NH(R'), -N(R’)2 та -CN, де кожний R’ незалежно вибирають з -H, -C1-C8 алкілу, -C2-C8 алкілену, -C2-C8 алкінілу або -арилу і де згадані -O-(C1-C8 алкільна), -O-(C2-C8 алкенільна), -O 7 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (C2-C8 алкінільна), -арильна, -C1-C8 алкільна, -C2-C8 алкенільна та -C2-C8 алкінільні групи можуть бути необов’язково додатково заміщені одним або більше замісниками, включаючи, але це не є обмеженням, -C1-C8 алкіл, -C2-C8 алкеніл, -C2-C8 алкініл, -галоген, -O-(C1-C8 алкіл), -O-(C2-C8 алкеніл), -O-(C2C8 алкініл), -арил, -C(O)R’’, -OC(O)R’’, -C(O)OR’’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’’, C(O)N(R’’)2, -NHC(O)R’’, -SR’’, -SO3R’’, -S(O)2R’’, -S(O)R’’, -OH, -N3, -NH2, -NH(R’’), -N(R’’)2 та -CN, де кожний R’’ незалежно вибирають з -H, -C1-C8 алкілу, -C2-C8 алкенілу, -C2-C8 алкінілу або арилу. Якщо не вказано інакше, термін "алкілен" стосується радикалу вуглеводня з насиченим розгалуженим або прямим ланцюгом, що має від близько 1 до близько 20 атомів вуглецю (та всіх комбінацій і субкомбінацій меж і конкретної кількості атомів вуглецю в них), причому перевагу надають наявності від близько 1 до близько 8 атомів вуглецю, і який має два центри одновалентного радикалу, виведені видаленням двох атомів водню з однакових або двох різних атомів вуглецю вихідного алкану. Типові алкілени включають, але це не є обмеженням, метилен, етилен, пропілен, бутилен, пентилен, гексилен, гептилен, оцитилен, нонілен, декален, 1,4-циклогексилен та подібне. Алкіленові групи, окремо або як частина іншої групи, можуть бути необов’язково заміщені однією або більше групами, переважно 1-3 групами (та будь-якими додатковими замісниками, вибраними з галогену), включаючи, але це не є обмеженням, галоген, -O-(C1-C8 алкіл), -O-(C2-C8 алкеніл), -O-(C2-C8 алкініл), -арил, -C(O)R’, -OC(O)R’, C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2, -NHC(O)R’, -SR’, -SO3R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, =O, N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 та -CN, де кожний R’ незалежно вибирають з -H, -C1-C8 алкілу, -C2-C8 алкенілу, -C2-C8 алкінілу або -арилу і де згадані -O-(C1-C8 алкільна), -O-(C2-C8 алкенільна), -O(C2-C8 алкінільна), -арильна, -C1-C8 алкільна, -C2-C8 алкенільна та -C2-C8 алкінільна групи можуть бути додатково необов’язково заміщена одним або більше замісниками, включаючи, але це не є обмеженням, -C1-C8 алкіл, -C2-C8 алкеніл, -C2-C8 алкініл, -галоген, -O-(C1-C8 алкіл), O-(C2-C8 алкеніл), -O-(C2-C8 алкініл), -арил, -C(O)R’’, -OC(O)R’’, -C(O)OR’’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’’, -C(O)N(R’’)2, -NHC(O)R’’, -SR’’, -SO3R’’, -S(O)2R’’, -S(O)R’’, -OH, -N3, -NH2, -NH(R’’), -N(R’’)2 і -CN, де кожний R’’ незалежно вибирають з -H, -C1-C8 алкілу, -C2-C8 алкенілу, -C2-C8 алкінілу або арилу. Якщо не вказано інакше, термін "алкенілен" стосується необов’язково заміщеної алкіленової групи, що містить принаймні один подвійний зв'язок вуглець-вуглець. Прикладами алкеніленових груп є, наприклад, етенілен (-CH = CH-) і пропенілен (-CH = CHCH2-). Якщо не вказано інакше, термін "алкінілен" стосується необов’язково заміщеної алкіленової групи, що містить принаймні один потрійний зв’язок вуглець-вуглець. Прикладами алкініленових груп є, наприклад, ацетилен (-CC-), пропаргіл (-CH2CC-) і 4-пентиніл (-CH2CH2CH2CCH-). Якщо не вказано інакше, термін "арил" стосується одновалентного ароматичного вуглеводневого радикалу з 6-20 атомами вуглецю (та всіх комбінацій і субкомбінацій меж і конкретної кількості атомів вуглецю в них), виведеного видаленням одного атому вуглецю з одного атому вуглецю материнської системи ароматичного кільця. Деякі арильні групи представлені в типових структурах як "Ar". Типові арильні групи включають, але це не є обмеженням, радикали, виведені з бензолу, заміщеного бензолу, фенілу, нафталену, антрацену, біфенілу та подібного. Арильна група, окремо або як частина іншої групи, може бути необов’язково заміщена однією або більше, переважно 1-5 або навіть 1-2 групами, включаючи, але це не є обмеженням, -галоген, -C1-C8 алкіл, -C2-C8 алкеніл, -C2-C8 алкініл, -O-(C1-C8 алкіл), -O-(C2-C8 алкеніл), -O-(C2C8 алкініл), -арил, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2, -NHC(O)R’, SR’, -SO3R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -NO2, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 і -CN, де кожний R’ незалежно вибирають з -H, -C1-C8 алкілу, -C2-C8 алкенілу, -C2-C8 алкінілу або -арилу, і коли згадані -C1-C8 алкільна, -C2-C8 алкенільна, -C2-C8 алкінільна, O-(C1-C8 алкільна), -O-(C2-C8 алкенільна), -O-(C2-C8 алкінільна) і -арильна групи можуть бути додатково необов’язково заміщені одним або більше замісниками, включаючи, але це не є обмеженням, -C1-C8 алкіл, -C2C8 алкеніл, -C2-C8 алкініл, -галоген, -O-(C1-C8 алкіл), -O-(C2-C8 алкеніл), -O-(C2-C8 алкініл), -арил, -C(O)R’’, -OC(O)R’’, -C(O)OR’’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’’, -C(O)N(R’’)2, -NHC(O)R’’, -SR’’, -SO3R’’, S(O)2R’’, -S(O)R’’, -OH, -N3, -NH2, -NH(R’’), -N(R’’)2 і -CN, де кожний R’’ незалежно вибирають з -H, -C1-C8 алкілу, -C2-C8 алкенілу, -C2-C8 алкінілу або -арилу. Якщо не вказано інакше, термін "арилен" стосується необов’язково заміщеної арильної групи, що є двовалентною (тобто виведеною видаленням двох атомів водню з одного або двох різних атомів вуглецю материнської системи ароматичного кільця) і може бути в орто, мета або пара конфігураціях, як показано в наведених нижче структурах з фенілом, як типова арильна група. 60 8 UA 110495 C2 , 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 , , Типовими "-(C1-C8 алкілен)арильною", "-(C2-C8 алкенілен)арильною" та "-(C2-C8 алкінілен)арильною" групами є, але це не є обмеженням, бензил, 2-фенілетан-1-іл, 2фенілетен-1-іл, нафтилметил, 2-нафтилетан-1-іл, 2-нафтилетен-1-іл, нафтобензил, 2нафтофенілетан-1-іл та подібне. Якщо не вказано інакше, термін "гетероцикл" стосується моноциклічної, біциклічної або поліциклічної кільцевої системи, що має від 3 до 14 кільцевих атомів (які також називають членами кільця), де принаймні один кільцевий атом в принаймні одному кільці є гетероатомом, вибраним із N, O, P або S (та всіх комбінацій і субкомбінацій меж і конкретної кількості атомів вуглецю і гетероатомів в них). Гетероцикл може мати від 1 до 4 кільцевих гетероатомів, незалежно вибраних з N, O, P або S. Один або більше з N, C або S атомів в гетероциклі можуть бути окислені. Моноциклічний гетероцикл переважно має від 3 до 7 членів кільця (наприклад, від 2 до 6 атомів вуглецю та від 1 до 3 гетероатомів, незалежно вибраних з N, O, P або S), а біциклічний гетероцикл переважно має від 5 до 10 членів кільця (наприклад, від 4 до 9 атомів вуглецю та від 1 до 3 гетероатомів, незалежно вибраних з N, O, P або S). Кільце, яке містить гетероатом, може бути ароматичним або неароматичним. Якщо не вказано інакше, гетероцикл прикріплений до своєї бічної підвішеної групи у будь-якому гетероатомі або атомі вуглецю, що дає стабільну структуру. Гетероцикли описані Пакветте (Paquette) у виданнях "Принципи сучасної гетероциклічної хімії" ("Principles of Modern Heterocyclic Chemistry", W.A. Benjamin, New York, 1968), зокрема в Главах 1, 3, 4, 6, 7 і 9; "Хімія гетероциклічних сполук, серія монографій" ("The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs", John Wiley & Sons, New York, з 1950 дотепер), зокрема в Томах 13, 14, 16, 19 і 28; та у "Журналі американського хімічного співтовариства" (J. Am. Chem. Soc. 82:5566 (1960)). Прикладами "гетероциклічних" груп є, суто як приклад і не як обмеження, піридил, дигідропіридил, тетрагідропіридил (піперидил), тіазоліл, піримідиніл, фураніл, тієніл, піроліл, піразоліл, імідазоліл, тетразоліл, бензофураніл, тіанафталеніл, індоліл, індоленіл, хінолініл, ізохінолініл, бензимідазоліл, піперидиніл, 4-піперидоніл, піролідиніл, 2-піролідоніл, піролініл, тетрагідрофураніл, біс-тетрагідрофураніл, тетрагідро-піраніл, біс-тетрагідропіраніл, тетрагідрохінолініл, тетрагідроізохінолініл, декагідроксинолініл, октагідроізохінолініл, азоциніл, тріазиніл, 6H-1,2,5-тіадіазиніл, 2H,6H-1,5,2-дитіазиніл, тієніл, тіантреніл, піраніл, ізобензофураніл, хроменіл, ксантеніл, феноксатиніл, 2H-піроліл, ізотіазоліл, ізоксазоліл, піразиніл, піридазиніл, індолізиніл, ізоіндоліл, 3H-індоліл, карбазоліл 1H-індазоліл, пуриніл, 4Hхінолізиніл, фталазиніл, нафтиридиніл, хіноксалініл, хіназолініл, цинолініл, птеридиніл, 4Hкарбазоліл, карбазоліл, β-карболініл, фенантридиніл, акридиніл, піримідиніл, фенантролініл, феназиніл, фенотіазиніл, фуразаніл, феноксазиніл, ізохроманіл, хроманіл, імідазолідиніл, імідазолініл, піразолідиніл, піразолініл, піперазиніл, індолініл, ізоіндолініл, хінуклідиніл, морфолініл, оксазолідиніл, бензотріазоліл, бензизоксазоліл, оксиндоліл, бензоксазолініл та ізатиноїл. "Гетероциклічними" групами, яким надають перевагу, є, але це не є обмеженням, бензофураніл, бензотіофеніл, індоліл, бензопіразоліл, коумариніл, ізохінолініл, піроліл, тіофеніл, фураніл, тіазоліл, імідазоліл, піразоліл, тріазоліл, хінолініл, піримідиніл, піридиніл, піридоніл, піразиніл, піридазиніл, ізотіазоліл, ізоксазоліл і тетразоліл. Гетероциклічна група, окремо або як частина іншої групи, може бути необов’язково заміщена однією або більше групами, переважно 1-2 групами, включаючи, але це не є обмеженням, -C1-C8 алкіл, -C2-C8 алкеніл, -C2-C8 алкініл, -галоген, -O-(C1-C8 алкіл), -O-(C2-C8 алкеніл), -O-(C2-C8 алкініл), -арил, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, C(O)N(R’)2, -NHC(O)R’, -SR’, -SO3R’, -S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 і -CN, де кожний R’ незалежно вибирають з -H, -C1-C8 алкілу, -C2-C8 алкенілу, -C2-C8 алкінілу або -арил і де згадані -O-(C1-C8 алкільна), -O-(C2-C8 алкенільна), -O-(C2-C8 алкінільна), -C1-C8 алкільна, -C2C8 алкенільна, -C2-C8 алкінільна та -арильна групи можуть бути додатково необов’язково заміщені одним або більше замісниками, включаючи, але це не є обмеженням, -C1-C8 алкіл, -C2C8 алкеніл, -C2-C8 алкініл, -галоген, -O-(C1-C8 алкіл), -O-(C2-C8 алкеніл), -O-(C2-C8 алкініл), -арил, -C(O)R’’, -OC(O)R’’, -C(O)OR’’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’’, -C(O)N(R’’)2, -NHC(O)R’’, -SR’’, -SO3R’’, S(O)2R’’, -S(O)R’’, -OH, -N3, -NH2, -NH(R’’), -N(R’’)2 і -CN, де кожний R’’ незалежно вибирають з -H, -C1-C8 алкілу, -C2-C8 алкенілу, -C2-C8 алкінілу або арилу. 9 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як приклад, а не обмеження, сполучені вуглецем гетероцикли можуть бути прикріплені у таких положеннях: положення 2, 3, 4, 5 або 6 піридину; положення 3, 4, 5 або 6 піридазину; положення 2, 4, 5 або 6 піримідину; положення 2, 3, 5 або 6 піразину; положення 2, 3, 4 або 5 фурану, тетрагідрофурану, тіофурану, тіофену, піролу або тетрагідропіролу; положення 2, 4 або 5 оксазолу, імідазолу або тіазолу; положення 3, 4 або 5 ізоксазолу, піразолу або ізотіазолу; положення 2 або 3 азиридину; положення 2, 3 або 4 азетидину; положення 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 хіноліну; або положення 1, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 ізохіноліну. Між тим, більш типовим є, коли сполученими вуглецем гетероцикли є 2-піридил, 3-піридил, 4-піридил, 5-піридил, 6-піридил, 3піридазиніл, 4-піридазиніл, 5-піридазиніл, 6-піридазиніл, 2-піримідиніл, 4-піримідиніл, 5піримідиніл, 6-піримідиніл, 2-піразиніл, 3-піразиніл, 5-піразиніл, 6-піразиніл, 2-тіазоліл, 4-тіазоліл або 5-тіазоліл. Як приклад, а не обмеження, сполучені азотом гетероцикли можуть бути прикріплені у положенні 1 азиридину, азетидину, піролу, піролидину, 2-піроліну, 3-піроліну, імідазолу, імідазолідину, 2-імідазоліну, 3-імідазоліну, піразолу, піразоліну, 2-піразоліну, 3-піразоліну, піперидину, піперазину, індолу, індоліну або 1H-індазолу; у положенні 2 ізоіндолу або ізоіндоліну; у положенні 4 морфоліну; та у положенні 9 карбазолу або β-карболіну. Між тим, є більш типовим, коли сполученими азотом гетероциклами є 1-азиридил, 1-азетедил, 1-піроліл, 1імідазоліл, 1-піразоліл і 1-піперидиніл. Якщо не вказано інакше, термін "карбоцикл" стосується насиченої або ненасиченої неароматичної моноциклічної, біциклічної або поліциклічної кільцевої системи, що має від 3 до 14 кільцевих атомів (та всіх комбінацій і субкомбінацій меж і конкретної кількості атомів вуглецю в них), в якій всі кільцеві атоми є атомами вуглецю. Моноциклічні карбоцикли переважно мають від 3 до 6 кільцевих атомів, але більшу перевагу надають наявності 5 або 6 кільцевих атомів. Біциклічні карбоцикли переважно мають від 7 до 12 кільцевих атомів, наприклад, розташованих у вигляді біцикло [4,5], [5,5], [5,6] або [6,6] системи або 9 чи 10 кільцевих атомів, розташованих у вигляді біцикло [5,6] або [6,6] системи. Термін "карбоцикл" включає, наприклад, моноциклічне карбоциклічне кільце, конденсоване з арильним кільцем (наприклад, моноциклічне карбоциклічне кільце, конденсоване з бензольним кільцем). Карбоцикли переважно мають від 3 до 8 кільцевих атомів вуглецю. Карбоциклічна група, окремо або як частина іншої групи, може бути необов’язково заміщена, наприклад, однією або більше групами, переважно 1 або 2 групами (та будь-якими додатковими замісниками, вибраними з галогену), включаючи, але це не є обмеженням, -галоген, -C1-C8 алкіл, -C2-C8 алкеніл, -C2-C8 алкініл, -O-(C1-C8 алкіл), -O-(C2-C8 алкеніл), -O-(C2-C8 алкініл), -арил, -C(O)R’, -OC(O)R’, -C(O)OR’, -C(O)NH2, -C(O)NHR’, -C(O)N(R’)2, -NHC(O)R’, -SR’, -SO3R’, S(O)2R’, -S(O)R’, -OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R’), -N(R’)2 та -CN, де кожний R’ незалежно вибирають з -H, -C1-C8 алкілу, -C2-C8 алкенілу, -C2-C8 алкінілу або -арилу і де згадані -C1-C8 алкільна, -C2-C8 алкенільна, -C2-C8 алкінільна, -O-(C1-C8 алкільна), -O-(C2-C8 алкенільна), -O-(C2-C8 алкінільна) та -арильна групи можуть бути додатково необов’язково заміщені одним або більше замісниками, включаючи, але це не є обмеженням, -C1-C8 алкіл, -C2-C8 алкеніл, -C2-C8 алкініл, -галоген, -O(C1-C8 алкіл), -O-(C2-C8 алкеніл), -O-(C2-C8 алкініл), -арил, -C(O)R’’, -OC(O)R’’, -C(O)OR’’, C(O)NH2, -C(O)NHR’’, -C(O)N(R’’)2, -NHC(O)R’’, -SR’’, -SO3R’’, -S(O)2R’’, -S(O)R’’, -OH, -N3, -NH2, NH(R’’), -N(R’’)2 і -CN, де кожний R’’ незалежно вибирають з -H, -C1-C8 алкілу, -C2-C8 алкенілу, C2-C8 алкінілу або -арилу. Прикладами моноциклічних карбоциклічних замісників є -цикло- пропіл, -циклобутил, циклопентил, -1-циклопент-1-еніл, -1-циклопент-2-еніл, -1-циклопент-3-еніл, циклогексил, -1циклогекс-1-еніл, -1-циклогекс-2-еніл, -1-цикло- гекс-3-еніл, -циклогептил, -циклооктил, -1,3циклогексадієніл, -1,4-цикло-гексадієніл, -1,3-циклогептадієніл, -1,3,5-циклогептатріеніл і -циклооктадієніл. Термін "карбоцикло", використаний окремо або як частина іншої групи, стосується необов’язково заміщеної карбоциклічної групи, як визначено вище, яка є двовалентною (тобто виведеною видаленням двох атомів водню з однакових або двох різних атомів вуглецю вихідної карбоциклічної кільцевої системи). Якщо не вказано інакше за контекстом, дефіс (-) позначає точку прикріплення до підвішеної молекули. Відповідно, термін "-(C1-C8 алкілен)арил" або "-C1-C8 алкілен(арил)" стосується C1-C8 алкіленового радикалу, як визначено тут, в якому алкіленовий радикал прикріплений до підвішеної молекули на будь-якому з атомів вуглецю алкіленового радикалу і один з атомів водню, зв’язаних з атомом вуглецю алкіленового радикалу, заміщений арильним радикалом, як визначено тут. Якщо певна група є "заміщеною", ця група може мати один або більше замісників, переважно від одного до п’яти замісників, ще краще від одного до трьох замісників, найкраще 10 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 від одного до двох замісників, незалежно вибраних з переліку замісників. Однак, така група може звичайно мати будь-яку кількість замісників, вибраних із галогену. Заміщені групи позначені відповідним чином. Треба розуміти, що визначення будь-якого замісника або змінної величини у певному місці розташування в молекулі не залежить від відповідного визначення в інших місцях у цій молекулі. Є зрозумілим, що замісники та моделі заміщення в сполуках за цим винаходом можуть бути обрані спеціалістом у цій галузі для одержання сполук, що є хімічно стабільними і які можна легко синтезувати за допомогою технічних прийомів, відомих у цій галузі, а також описаних тут способів. Використаний тут термін "захисні групи" стосується груп, які вибірково блокують, тимчасово або постійно, один реакційноспроможний центр в багатофункціональній сполуці. Підходящі гідрокси-захисні групи для застосування у цьому винаході є фармацевтично прийнятними і можуть потребувати або не потребувати відщеплення від вихідної сполуки після введення суб’єктові для забезпечення активності сполуки. Розщеплення відбувається шляхом звичайних метаболічних процесів в організмі. Гідрокси-захисні групи є добре відомими у цій галузі, див. видання "Захисні групи в органічному синтезі" (Protective Groups in Organic Synthesis авторів T.W. Greene та P.G.M. Wuts (John Wiley & sons, 3-тє видання), включене тут у всій повноті шляхом посилання і в усіх відношеннях, і включають, наприклад, ефірні (наприклад, алкілефірні та силілефірні, у тому числі, наприклад, діалкілсилілефірні, тріалкілсилілефірні, діалкілалкоксисилілефірні), складноефірні, карбонатні, карбаматні, сульфонатні та фосфатні захисні групи. Прикладами гідрокси-захисних груп є, але це не є обмеженням, метиловий ефір; метоксиметиловий ефір, метилтіометиловий ефір, (фенілдиметилсиліл) метоксиметиловий ефір, бензилоксиметиловий ефір, p-метоксибензил-оксиметиловий ефір, pнітробензилоксиметиловий ефір, o-нітробензилокси-метиловий ефір, (4метоксифенокси)метиловий ефір, гваяколметиловий ефір, t-бутоксиметиловий ефір, 4пентенілоксиметиловий ефір, силоксиметиловий ефір, 2-метоксіетоксиметиловий ефір, 2,2,2трихлоретоксиметиловий ефір, біс(2-хлоретокси)метиловий ефір, 2(триметилсиліл)етоксиметиловий ефір, метоксиметиловий ефір, тетрагідропіраніловий ефір, 1метоксициклогексиловий ефір, 4-метокситетрагідро-тіопіраніловий ефір, 4метокситетрагідротіопіраніловий ефір S,S-діоксид, 1-[(2-хлор-4-метил)феніл]-4метоксипіперидин-4-іловий ефір, 1-(2-фторфеніл)-4-метоксипіперидин-4-іловий ефір, 1,4діоксан-2-іловий ефір, тетрагідрофураніловий ефір, тетрагідротіофураніловий ефір; заміщені етилефіри, такі як 1-етоксіетиловий ефір, 1-(2-хлоретокси)етиловий ефір, 1-[2(триметилсиліл)етокси]етиловий ефір, 1-метил-1-метоксіетиловий ефір, 1-метил-1бензилоксіетиловий ефір, 1-метил-1-бензилокси-2-фторетиловий ефір, 1-метил-1феноксіетиловий ефір, 2-триметилсиліловий ефір, t-бутиловий ефір, алілефір, пропаргілові ефіри, p-хлорфеніловий ефір, p-метоксифеніловий ефір, бензиловий ефір, pметоксибензиловий ефір 3,4-диметоксибензилового ефіру, триметилсиліловий ефір, тріетилсиліловий ефір, трипропілсиліловий ефір, диметилізопропілсиліловий ефір, діетилізопропілсиліловий ефір, диметилгексил- силіловий ефір, t-бутилдиметилсиліловий ефір, дифенілметилсиліловий ефір, бензоїлформатний складний ефір, ацетатний складний ефір, хлорацетатний складний ефір, дихлорацетатний складний ефір, трихлорацетатний складний ефір, трифторацетатний складний ефір, метоксіацетатний складний ефір, трифенілметоксіацетатний складний ефір, фенілацетатний складний ефір, бензоатний складний ефір, алкілметиловий карбонат, алкіл 9-фторенілметиловий карбонат, алкілетиловий карбонат, алкіл 2,2,2,-трихлоретиловий карбонат, 1,1,-диметил-2,2,2-трихлоретиловий карбонат, алкілсульфонат, метансульфонат, бензилсульфонат, тозилат, метиленацеталь, етиліденацеталь і t-бутил-метиліденкеталь. Захисні групи, яким надають перевагу, представлені a a a a a a a a формулами -R , -Si(R )(R )(R ), -C(O)R , -C(O)OR , -C(O)NH(R ), -S(O)2R , -S(O)2OH, P(O)(OH)2 a a та -P(O)(OH)OR , де R означає C1-C20 алкіл, C2-C20 алкеніл, C2-C20 алкініл, -C1-C20 алкілен(карбоцикл), -C2-C20 алкенілен(карбоцикл), -C2-C20 алкінілен(карбоцикл), -C6-C10 арил, C1-C20 алкілен(арил), -C2-C20 алкенілен(арил), -C2-C20 алкінілен (арил), -C1-C20 алкілен(гетероцикл), -C2-C20 алкенілен(гетероцикл) або -C2-C20 алкінілен(гетероцикл), де радикали згаданих алкілу, алкенілу, алкінілу, алкілену, алкенілену, алкінілену, арилу, карбоциклу та гетероциклу, окремо або як частина іншої групи, є необов’язково заміщеними. "Змінення нативного профілю глікозилування" треба розуміти для цілей цього винаходу як таке, що означає видалення однієї або більше вуглеводневих часток, наявних у нативній послідовності 191P4D12 (або видаленням основного сайту глікозилування або видаленням глікозилування хімічним та/або ферментативним способом), та/або додавання одного або більше сайтів глікозилування, яких немає в нативній послідовності 191P4D12. Крім того, ця 11 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фраза включає кількісні зміни у глікозилуванні нативних білків, пов’язані зі зміною в основних властивостях та пропорціях різних присутніх вуглеводневих часток. Термін "аналог" стосується молекули, що є структурно подібною або має подібні чи відповідні характерні ознаки з іншою молекулою (наприклад, споріднений до 191P4D12 білок). Наприклад, аналог білка 191P4D12 може специфічним чином зв’язуватись антитілом або Тлімфоцитом, що специфічним чином зв’язується з 191P4D12. Термін "антитіло" використовують у найширшому смислі, якщо чітко не вказано інакше. Відповідно, "антитіло" може бути природного походження або штучним, таким як моноклональні антитіла, одержані традиційною гібридомною технологією. Антитіла до 191P4D12 включають моноклональні та поліклональні антитіла, а також фрагменти, що містять антиген-зв’язувальний домен та/або одну або більше гіперваріабельну ділянку цих антитіл. Використаний тут термін "антитіло" стосується будь-якої форми антитіла або його фрагменту, що специфічним чином зв’язується з 191P4D12 та/або проявляє бажану біологічну активність і специфічним чином покриває моноклональні антитіла (у тому числі повнорозмірні моноклональні антитіла), поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла) та фрагменти антитіл до тих пір, поки вони специфічним чином зв’язуються з 191P4D12 та/або проявляють бажану біологічну активність. Будь-яке специфічне антитіло може бути використане в передбачених тут способах та композиціях. Так, в одному втіленні термін "антитіло" охоплює молекулу, що містить принаймні одну варіабельну ділянку з легкого ланцюга імуноглобулінової молекули та принаймні одну варіабельну ділянку з молекули важкого ланцюга, які у поєднанні утворюють специфічний сайт зв’язування для антигену-мішені. В одному втіленні антитілом є IgG антитіло. Наприклад, антитілом є IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4 антитіло. Антитіла, придатні для способів і композицій за винаходом, можуть бути утворені в культурі клітин, в бактеріофазі або в різних тваринах, включаючи, але це не є обмеженням, корів, кролей, кіз, мишей, пацюків, хом’яків, морських свинок, овець, собак, кішок, мавп, шимпанзе та людиноподібних мавп. Відповідно, в одному втіленні антитілом за цим винаходом є антитіло ссавця. Бактеріофагові технічні прийоми можуть бути використані для відокремлення первісного антитіла або одержання варіантів зі зміненими характеристиками специфічності або авідності. Такі технічні прийоми є стандартними і добре відомими у цій галузі. В одному втіленні антитіло одержують рекомбінантними засобами, відомими у цій галузі. Наприклад, рекомбінантне антитіло може бути одержане шляхом трансфекції клітини-хазяїна вектором, що містить послідовність ДНК, що кодує антитіло. Можуть бути використані один або більше векторів для трансфектування послідовності ДНК, що експресує принаймні одну VL та одну VH ділянку в клітині-хазяїні. Типовими описами рекомбінантних засобів утворення та одержання антитіл є такі видання: Делвес "Вироблення антитіл: важливі технічні прийоми" (Delves, ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997)); Шефард та ін. "Моноклональні антитіла" (Shephard, et al., MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford University Press, 2000)); Гоудинг "Моноклональні антитіла: принципи та практика" (Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (Academic Press, 1993)); та "Сучасні протоколи в імунології" (CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, останнє видання)). Антитіло за цим винаходом може бути модифіковане рекомбінантними засобами для підвищення ефективності антитіла в опосередковуванні бажаної функції. Отже, до обсягу винаходу входить те, що антитіла можуть бути модифіковані за допомогою заміщень із використанням рекомбінантних засобів. Звичайно заміщення є консервативними заміщеннями. Наприклад, принаймні одна амінокислота в константній ділянці антитіла може бути заміщена іншим залишком. Див., наприклад, патент США № 5,624,821, патент США № 6,194,551, міжнародну заявку № WO 9958572; та Ангал та ін. "Молекулярна імунологія" (Angal, et al., Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993)). Модифікація в амінокислотах включає видалення, додавання та заміщення амінокислот. У деяких випадках такі зміни здійснюють для зниження небажаної діяльності, наприклад, комплементзалежної цитотоксичності. Часто антитіла мітять шляхом приєднання, ковалентним або нековалентним чином, речовини, що забезпечує помітний сигнал. Відомий широкий спектр міток та способів здійснення кон’югації, і про них широко повідомляють як в технічній, так і в патентній літературі. Ці антитіла можуть бути перевірені на предмет зв’язування з нормальним або дефектним 191P4D12. Див., наприклад, "Конструювання антитіл: практичний підхід" (Antibody Engineering: A Practical Approach, Oxford University Press, 1996). Підходящі антитіла з бажаною біологічною активністю можуть бути ідентифіковані із використанням наведених далі аналізів в умовах in vitro, включаючи такі, але це не є обмеженням: проліферація, міграція, прилипання, ріст м’якого агару, ангіогенез (розвиток кровоносних судин), комунікація клітинаклітина, апоптоз, транспортування, сигнальна трансдукція, і таких аналізів in vivo, як інгібування росту пухлин. Передбачені тут антитіла також можуть бути корисними для застосування в 12 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 діагностиці. Як імобілізовані або ненейтралізувальні антитіла їх можна перевірити на предмет їхньої здатності зв’язуватись зі специфічним антигеном без інгібування рецептор-звязувальної або біологічної активності антигену. Як нейтралізувальні антитіла вони можуть бути корисними в аналізах конкурентного зв’язування. Їх також можна використовувати для кількісного аналізу 191P4D12 або його рецептору. Використаний тут термін "антиген-зв’язувальна частка" антитіла або "фрагмент антитіла" (або просто "частка антитіла") стосується одного або більше фрагментів антитіла до 191P4D12, що зберігають здатність специфічним чином зв’язуватись з антигеном (наприклад, 191P4D12 та варіанти; Фігура 1). Було показано, що антиген-зв’язувальну функцію антитіла можуть виконувати фрагменти повнорозмірного антитіла. Приклади зв’язувальних фрагментів, охоплених терміном "антиген-зв’язувальна частка" антитіла, включають (i) Fab-фрагмент, одновалентний фрагмент, що складається з VL, VH, CL і CH1 доменів; (ii) F(ab')2 фрагмент, двовалентний фрагмент, що містить два Fab-фрагменти, сполучені дисульфідним містком в шарнірній ділянці; (iii) Fd-фрагмент, що складається з VH і CH1 доменів; (iv) Fv-фрагмент, що складається з VL і VH доменів непорівнюваного антитіла, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), що складається з VH домену; та (vi) ізольованої ділянки, що визначає компліментарність (CDR). Крім того, хоча два домени Fv-фрагменту, VL і VH, кодовані окремими генами, вони можуть бути поєднані, із застосуванням рекомбінантних методів, синтетичним лінкером, що дозволяє їм бути виробленими у вигляді єдиного білкового ланцюга, в якому VL і VH ділянки складають пари для утворення одновалентних молекул (відомого як єдиний ланцюг Fv (scFv); див., наприклад, Берд та ін. (Bird et al. (1988) Science 242:423-426); та Хастон та ін. (Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такі одноланцюгові антитіла також розуміють як такі, що охоплені терміном "антиген-зв’язувальна частка" антитіла. Ці фрагменти антитіл одержують із застосуванням традиційних технічних прийомів, відомих спеціалістам у цій галузі, і ці фрагменти перевіряють на придатність таким самим чином, як і інтактні антитіла. Як використано у цьому описі, будь-яка форма "антигену" може бути використана для одержання атитіла, що є специфічним для 191P4D12. Отже, виведений антиген може бути одиночним епітопом, множинними епітопами або повним білком окремо або у поєднанні з одним або більше агентами, що підвищують імуногенність, відомими у цій галузі. Виведений антиген може бути ізольованим повнорозмірним білком, білком клітинної поверхні (наприклад, який імунізує клітинами, трансфектованими принаймні частиною антигену) або розчинним білком (наприклад, який імунізує лише позаклітинну частину домену білка). Антиген може бути одержаний у генетично модифікованій клітині. ДНК, що кодує антиген, може бути геномною або негеномною (наприклад, кДНК), і кодує принаймні частину позаклітинного домену. Як використано у цьому описі, термін "частина" стосується мінімальної кількості амінокислот або нуклеїнових кислот, залежно від ситуації, для складання імуногенного епітопу антигену, що становить інтерес. Можуть бути використані будь-які генетичні вектори, придатні для трансформування клітин, що становлять інтерес, включаючи, але це не є обмеженням, аденовірусні вектори, плазміни та невірусні вектори, такі як катіонні ліпіди. В одному втіленні антитіло у способах та композиціях за цим винаходом специфічним чином зв’язуються із принаймні частиною позаклітинного домену 191P4D12, що становить інтерес. Антитіла або їхні антиген-зв’язувальні фрагменти, передбачені у цьому винаході, можуть бути кон’юговані з "біоактивним агентом". Як використано тут, термін "біоактивний агент" стосується будь-якої синтетичної або природної сполуки, яка зв’язує антиген та/або підвищує чи опосередковує бажаний біологічний ефект для посилення токсинів, що вбивають клітини. В одному втіленні зв’язувальні фрагменти, що є придатними для цього винаходу, є біологічноактивними фрагментами. Використаний тут термін "біологічно активний" стосується антитіла або фрагмента антитіла, здатного зв’язуватись із бажаним антигенним епітопом і прямо чи опосередковано чинити біологічний ефект. Прямі ефекти включають, але це не є обмеженням, модулювання, стимулювання та/або інгібування сигналу росту, модулювання, стимулювання та/або інгібування антиапоптичного сигналу, модулювання, стимулювання та/або інгібування апоптичного або некротичного сигналу, модулювання, стимулювання та/або інгібування каскаду ADCC (опосередкованої антитілами клітинної цитотоксичності) та модулювання, стимулювання та/або інгібування каскаду CDC (комплементзалежної цитотоксичності). "Біспецифічні" антитіла є також придатними для використання у способах та композиціях за цим винаходом. Використаний тут термін "біспецифічне антитіло" стосується антитіла, звичайно моноклонального антитіла, що має специфічність зв’язування принаймні двох різних антигенних епітопів. В одному втіленні епітопи походять з одного антигену. В іншому втіленні епітопи походять від двох різних антигенів. Способи одержання біспецифічних антитіл відомі у цій галузі техніки. Наприклад, біспецифічні антитіла можуть бути одержані рекомбінантним чином із 13 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосування ко-експресії двох пар важких ланцюгів/легких ланцюгів імуноглобуліну. Див., наприклад, Мільстейн та ін. (Milstein et al., Nature 305:537-39 (1983)). Як альтернатива, біспецифічні антитіла можуть бути одержані із застосуванням хімічного зв’язку. Див., наприклад, Бреннан та ін. (Brennan, et al., Science 229:81 (1985)). Біспецифічні антитіла включають фрагменти біспецифічних антитіл. Див., наприклад, Холінгер та ін. (Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48 (1993)), Грубер та ін. (Gruber, et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)). Описані тут моноклональні антитіла більш конкретно включають "химерні" антитіла, в яких частина важкого та/або легкого ланцюга є ідентичною або гомологічною відповідним послідовностям в антитілах, виведених з конкретного виду або які належать до певного класу або підкласу антитіл, а решта ланцюга (ланцюгів) є ідентичною або гомологічною відповідним послідовностям в антитілах, виведених з іншого виду або які належать до іншого класу чи підкласу антитіл, а також як фрагменти таких антитіл, поки вони специфічним чином зв’язуються із антигеном-мішенню та/або проявляють бажану біологічну активність (патент США № 4,816,567; та Морисон та ін. (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)). Термін "хіміотерапевтичний агент" стосується всіх хімічних сполук, що є ефективними в інгібуванні росту пухлин. Необмежувальними прикладами хіміотерапевтичних агентів є алкілувальні агенти; наприклад, азотисті іприти, етиленімінові сполуки та алкілсульфонати; антиметаболіти, наприклад, фолієва кислота, пуринові або піримідинові антагоністи; мітотичні інгібітори, наприклад, антитубулінові агенти, такі як вінкаалкалоїди, ауристатини та похідні подофілотоксину; цитотоксичні антибіотики; сполуки, що руйнують або втручаються в експресію чи реплікацію ДНК, наприклад, зв’язувачі малого рівчачка ДНК; та антагоністи рецепторів фактору росту. Крім того, хіміотерапевтичними агентами є цитотоксичні агенти (визначені тут), антитіла, біологічні молекули та малі молекули. Термін "сполука" стосується та охоплює саму хімічну сполуку, а також, незалежно від того, чи вказано про це чітко, чи ні, і якщо з контексту чітко не випливає, що наведене далі має бути виключене: аморфні та кристалічні форми сполуки, у тому числі поліморфні форми, де ці форми можуть бути частиною суміші або окремо; форми вільних кислот та вільних основ сполуки, якими звичайно є форми, показані у передбачених в цьому описі структурах; ізомери сполуки, що стосується оптичних ізомерів, і таутомерні ізомери, які включають енантіомери та діастереомери, хіральні ізомери та нехіральні ізомери, та оптичні ізомери включають ізольовані оптичні ізомери, а також суміші оптичних ізомерів, у тому числі рацемічні та нерацемічні суміші; де ізомер може бути в ізольованій формі або у суміші з одним або більше іншими ізомерами; ізотопи сполуки, у тому числі сполуки, які містять дейтерій і тритій, і у тому числі сполуки, що містять радіоізотопи, у тому числі терапевтично і діагностично ефективні радіоізотопи; мультимерні форми сполуки, у тому числі димерні, тримерні та інші форми; солі сполуки, переважно фармацевтично прийнятні солі, у тому числі солі приєднання кислоти та солі приєднання основи, у тому числі солі, що мають органічні протиіони та неорганічні протиіони, і у тому числі цвіттер-іонні форми, де якщо сполука сполучена з двома або більше протиіонами, два або більше протиіони можуть бути однаковими або різними; та сольвати сполуки, у тому числі гемісольвати, моносольвати, дисольвати тощо, у тому числі органічні сольвати та неорганічні сольвати, причому згадані неорганічні сольвати включають гідрати; де якщо сполука сполучена з двома або більше сольвентними молекулами, дві або більше сольвентні молекули можуть бути однаковими або різними. У деяких випадках посилання у цьому описі на сполуку за винаходом включає чітке посилання на одну або більше із вказаних вище форм, наприклад, солі та/або сольвати; проте, це посилання вказують лише з метою акцентування, і воно не повинно тлумачитись як таке, що виключає іншу із вказаних вище форм. Використаний тут термін "консервативне заміщення" стосується заміщень амінокислот, які відомі у цій галузі і можуть бути здійснені звичайно без зміни біологічної активності одержаної молекули. Спеціалісти у цій галузі розуміють, що, загалом, одиничні амінокислотні заміщення в ділянках поліпептиду, що не є незамінними, по суті не змінюють біологічної активності (див., наприклад, Watson, et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE ("Молекулярна біологія гену"), The Benjamin/Cummings Pub. Co., стор. 224 (4-те видання 1987)). Такі показові заміщення переважно здійснюють відповідно до тих, що вказані у Таблицях II і III(a-b). Наприклад, такі зміни включають заміщення будь-якого з ізолейцину (I), валіну (V) та лейцину (L) будь-якою іншою з цих гідрофобних амінокислот; аспарагінової кислоти (D) глютаміновою кислотою (E) та навпаки; глютаміну (Q) аспарагіном (N) і навпаки; та серину (S) треоніном (T) і навпаки. Інші заміщення також можна вважати консервативними залежно від довколишнього середовища конкретної амінокислоти та його ролі у тривимірній структурі білка. Наприклад, гліцин (G) та аланін (A) часто можуть бути взаємозамінними, так само як і аланін (A) і валін (V). Meтіонін (M), який є відносно гідрофобним, часто може чергуватись з лейцином та ізолейцином й іноді з 14 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 валіном. Лізин (K) та аргінін (R) є часто взаємозамінними в місцях, де істотною ознакою амінокислотного залишку є його заряд і відмінні pK цих двох амінокислотних залишків не є значними. Інші зміни також можна вважати "консервативними", зокрема, середовища (див., наприклад, Таблицю III(a) нижче; стор. 13-15 "Biochemistry" ("Біохімія"), 2-ге видання, видання Люберта Страйера (Lubert Stryer) (Стенфордский університет); Henikoff et al., PNAS 1992 Том. 89 10915-10919; Lei et al., J Biol Chem 19 травня 1995 р.; 270(20):11882-11886). Інші заміщення також припустимі і можуть бути визначені емпіричним шляхом або відповідно до відомих консервативних заміщень. Термін "цитотоксичний агент" стосується речовини, яка інгібує або запобігає експресійній активності клітин, функціонуванню клітин та/або спричиняє руйнування клітин. Цей термін розуміють як такий, що включає радіоактивні ізотопи, хіміотерапевтичні агенти й токсини, такі як токсини малих молекул або токсини, активні під впливом ферментів, бактерійного, грибкового, рослинного або тваринного походження, у тому числі їх фрагменти та/або варіанти. Прикладами цитотоксичних агентів є, але це не є обмеженням, ауристатини (наприклад, ауристатин E, ауристатин F, MMAE та MMAF), ауроміцини, мейтанзиноїди, рицин, рициновий Aланцюг, комбрестатин, дуокарміцини, доластатини, доксорубіцин, даунорубіцин, таксоли, цисплатин, cc1065, бромід етидію, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, дигідроксіантрациндіон, актиноміцин, дифтерійний токсин, екзотоксин синегнійної палички (PE) A, PE40, абрин, абриновий A-ланцюг, модециновий A-ланцюг, альфа-сарцин, гелонін, мітогелін, ретстриктоцин, феноміцин, еноміцин, куріцин, кротин, каліхеаміцин, інгібітор мильнянки лікарської і глюкокортикоїдні та інші хіміотерапевтичні агенти, а також радіоізотопи, 211 131 125 90 186 188 153 212 213 32 такі як At , I , I , Y , Re , Re , Sm , Bi або , P , та радіоактивні ізотопи Lu, у тому 177 числі Lu . Антитіла також можуть бути кон’юговані з протираковим активувальним ферментом проліків, здатним перетворювати проліки на їх активну форму. Використаний тут термін "діатіла" стосується малих фрагментів антитіла з двома антигензв’язувальними сайтами, причому фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (VH), сполучений з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) в одному поліпептидному ланцюгу (VH-VL). При використанні лінкера, що є надто коротким для того, щоб дозволили утворення пар між двома доменами в одному ланцюгу, домени змушені утворювати пари з комплементарними доменами іншого ланцюга та створювати два антиген-зв’язувальні сайти. Більш докладно діатіла описані, наприклад, у патенті EP 404,097; міжнародній заявці WO 93/11161; і Холінгером та ін. (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993)). Термін "виснажувати" в контексті дії зв’язувального агента 191P4D12 на клітини, що експресують 191P4D12, стосується зниження кількості або видалення клітин, що експресують 191P4D12. Термін "генний продукт" використаний тут для позначення пептиду/білка або мРНК. Наприклад, "генний продукт за винаходом" іноді в цьому описі називають "раковою амінокислотною послідовністю", "раковим білком", "білком раку, вказаного у Таблиці I", "раковою мРНК", "мРНК раку, вказаного у Таблиці I", тощо. В одному втіленні раковий білок кодують нуклеїновою кислотою за Фігурою 1. Раковий білок може бути фрагментом або, як альтернатива, повнорозмірним білком, кодованим нуклеїновими кислотами за Фігурою 1. В одному втіленні ракову амінокислотну послідовність використовують для визначення ідентичності або подібності послідовності. В іншому втіленні послідовності є природними алельними варіантами білка, кодованого нуклеїновою кислотою на Фігурою 1. В іншому втіленні послідовності є варіантами послідовності, як це буде описано далі. "Гетерокон’югатні" антитіла є придатними для застосування у способах та композиціях за винаходом. Використаний тут термін "гетерокон’юговане антитіло" стосується двох ковалентно сполучених антитіл. Такі антитіла можуть бути одержані із використанням способів, відомих у синтетичній хімії білків, у тому числі із застосуванням зшивальних агентів. Див., наприклад, патент США № 4,676,980. Термін "гомолог" стосується молекули, яка проявляє гомологію до іншої молекули, наприклад, наявністю послідовностей хімічних залишків, які є однаковими або подібними у відповідних положеннях. В одному втіленні передбачене тут антитіло є "людським антитілом". Використаний тут термін "людське антитіло" стосується антитіла, в якому по суті всі послідовності легкого ланцюга і послідовності важкого ланцюга, у тому числі ділянки, що визначають компліментарність (CDR), походять з людських генів. В одному втіленні людські моноклональні антитіла одержують тріома-технологією, технологією людських B-клітин (див., наприклад, Kozbor, et al., Immunol. Today 4: 72 (1983)), технологією трансформації ЕВБ (див., наприклад, Cole et al. Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy ("Моноклональні антитіла і лікування раку") 15 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 77-96 (1985)) або шляхом застосування фагового дисплею (див., наприклад, Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)). В одному конкретному втіленні людське антитіло одержують у трансгенної миші. Технології одержання таких від частково до повністю людських антитіл відомі у цій галузі, і може бути застосована будь-яка з таких технологій. Відповідно до одного такого втілення, якому надають особливу перевагу, послідовності повністю людських антитіл одержують в трансгенній миші, сконструйованій для експресії генів людських антитіл важкого та легкого ланцюгів. Приклад опису одержання трансгенних мишей, що виробляють людські антитіла, та їх потомства наведений у міжнародній заявці WO 02/43478 та патенті США № 6,657,103 (Abgenix). B-клітини трансгенних мишей, які виробляють бажане антитіло, потім можуть бути конденсовані для одержання лінії клітин гібридоми для безперервного вироблення антитіла. Див., наприклад, патенти США №№ 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; і 5,545,806; та статтю Якобовітса (Jakobovits, Adv. Drug Del. Rev. 31:33-42 (1998); Green, et al., J. Exp. Med. 188:483-95 (1998)). Використаний тут термін "гуманізоване антитіло" стосується форм антитіл, які містять послідовності нелюдських (наприклад, мишачих) антитіл, а також людські антитіла. Такі антитіла є химерними антитілами, що містять мінімальну послідовність, виведену з нелюдського імуноглобуліну. Загалом, гуманізоване антитіло міститиме по суті всі із принаймні одного, і звичайно двох, варіабельних доменів, в яких всі або по суті всі гіперваріабельні петлі відповідають петлям нелюдського імуноглобуліну, і всі або по суті всі FR-ділянки є ділянками людської імуноглобулінової послідовності. Гуманізоване антитіло необов’язково також міститиме принаймні частину імуноглобулінової константної ділянки (Fc), звичайно людського імуноглобуліну. Див., наприклад, патент США Кабіллі (Cabilly) № 4,816,567; статтю Квін та ін. (Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033); та статтю "Конструювання антитіл: практичний підхід" (Antibody Engineering: A Practical Approach (Oxford University Press 1996)). Терміни "інгібувати" або "інгібування", використані у цьому описі, означають знижувати на вимірювану кількість або повністю попереджати. Фрази "ізольований" або "біологічно чистий" стосуються матеріалу, який є значною мірою або по суті вільний від компонентів, що звичайно супроводжують матеріал, яким він є у природному стані. Відповідно, ізольовані пептиди відповідно до винаходу переважно не містять матеріалів, які звичайно пов’язані з пептидами у їх оточенні in situ. Наприклад, полінуклеотид називають "ізольованим", коли він по суті відокремлений від забруднювальних полінуклеотидів, що відповідають або є комплементарними до генів, окрім генів 191P4D12, або які кодують поліпептиди, окрім генного продукту 191P4D12 чи його фрагментів. Досвідчений спеціаліст може легко застосувати процедури ізолювання нуклеїнової кислоти для одержання ізольованого полінуклеотиду 191P4D12. Білок називають "ізольованим", наприклад, при застосуванні фізичних, механічних або хімічних способів для видалення білків 191P4D12 із клітинних складників, які звичайно пов’язані з білком. Досвідчений спеціаліст може легко застосувати стандартні методи очищення для одержання ізольованого білка 191P4D12. Як альтернатива, ізольований білок може бути одержаний хімічними засобами. Підходящі "мітки" включають радіонукліди, ферменти, субстрати, кофактори, інгібітори, флуоресцентні речовини, хемілюмінісценті речовини, магнітні частки та подібне. До патентів, в яких розкрито застосування таких міток, належать патенти США №№ 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350, 3,996,345, 4,277,437, 4,275,149 і 4,366,241. Крім того, передбачені в цьому винаході антитіла можуть бути використані як антиген-зв’язувальний компонент фтортіл. Див., наприклад, Зейтун та ін. (Zeytun et al., Nat. Biotechnol. 21:1473-79 (2003)). Термін "ссавець" стосується будь-якого організму, що його класифікують як ссавець, у тому числі мишей, пацюків, кролів, собак, кішок, корів, коней та людей. В одному втіленні винаходу ссавцем є миша. В іншому втіленні винаходу ссавцем є людина. Терміни "метастатичний рак" та "метастатичне захворювання" означають види раку, що поширився на регіональні лімфатичні вузли або віддалені ділянки, і включають стадію D захворювання за системою Американської урологічної асоціації (AUA) та стадію TxNxM+ за системою класифікації злоякісних пухлин (TNM). Термін "модулятор" або "випробувана сполука" або "потенційні ліки" або граматичні еквіваленти, використані в цьому описі, описують будь-яку молекулу, наприклад, білок, олігопептид, малу органічну молекулу, полісахарид, полінуклеотид тощо, що підлягають випробуванню на визначення здатності прямо чи непрямо змінювати раковий фенотип або експресію ракової послідовності, наприклад, нуклеотидної або білкової послідовності, або дію ракових послідовностей (наприклад, сигналювання, експресію генів, взаємодію білків тощо). В одному аспекті модулятор нейтралізуватиме дію білка раку за винаходом. Під "нейтралізуватиме" мають на увазі, що активність білка інгібується або блокується поряд із 16 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідним впливом на клітину. В іншому аспекті модулятор нейтралізуватиме дію гену та його відповідного білка за винаходом шляхом нормалізування рівнів згаданого білка. У втіленнях, яким надають перевагу, модулятори змінюють профілі експресії або нуклеїнові кислоти профілю експресії чи білки, передбачені цим винаходом, або шляхи ефектора, що лежить нижче. В одному втіленні модулятор пригнічує фенотип раку, наприклад, до "відбитку пальця" здорової тканини. В іншому втіленні модулятор індукує фенотип раку. Загалом, множину аналізованих сумішей досліджують паралельно з різними концентраціями засобу для одержання диференційованої відповіді на різні концентрації. Звичайно одна з цих концентрацій слугує негативним контролем, тобто при нульовій концентрації або нижче рівня виявлення. Модулятори, потенційні ліки або випробувані сполуки охоплюють численні хімічні класи, хоча звичайно вони є органічними молекулами, переважно малими органічними молекулами, що мають молекулярну вагу понад 100 і менш ніж близько 2500 Дальтонів. Кращі малі молекули важать менш ніж 2000, або менш ніж 1500, або менш ніж 1000, або менш ніж 500 Д. Потенційні засоби містять функціональні групи, необхідні для структурної взаємодії з білками, особливо для утворення водневого зв’язку, і звичайно включають принаймні амінову, карбонільну, гідроксильну або карбоксильну групу, краще принаймні дві з функціональних хімічних груп. Потенційні засоби часто містять циклічний вуглець або гетероциклічні структури та/або ароматичні чи поліароматичні структури, заміщені одним або більше із вказаних вище функціональних груп. Модулятори також містять біомолекули, такі як пептиди, сахариди, жирні кислоти, стероїди, пурини, піримідини, похідні, структурні аналоги або їх поєднання. Особливу перевагу надають пептидам. Одним класом модуляторів є пептиди, наприклад, що містять від п’яти до близько 35 амінокислот, причому перевагу надають наявності від п’яти до близько 20 амінокислот, а особливу перевагу надають наявності від 7 до близько 15 амінокислот. Краще, якщо модуляторний білок раку є розчинним, містить не-трансмембранну ділянку та/або має Nтермінальний Цис для сприяння розчинності. В одному втіленні C-кінець фрагмента тримають як вільну кислоту, а N-кінець є вільним аміном для сприяння зв’язуванню, тобто, з цистеїном. В одному втіленні білок раку за винаходом кон’югований з імуногенним засобом, що обговорюється в цьому описі. В одному втіленні білок раку кон’югований з BSA (бичачим сироватковим альбуміном). Пептиди за винаходом, наприклад, довжини, якій надають перевагу, можуть бути сполучені один з одним або з іншими амінокислотами для створення довшого пептиду/білка. Модуляторні пептиди можуть бути гідролізатами природних білків, як вказано вище, довільно вибраними пептидами або «зміщеними» довільно вибраними пептидами. У втіленні, якому надають перевагу, модуляторами на основі пептиду або білка є антитіла та їхні фрагменти, як визначено в цьому описі. Використаний у цьому описі термін "моноклональне антитіло" стосується антитіла, одержаного з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, що містять популяцію, є ідентичними, окрім можливих природних мутацій, які можуть бути наявними в незначній кількості. Моноклональні антитіла є високо специфічними, спрямованими проти одного антигенного епітопу. На відміну від цього, препарати звичайного (поліклонального) антитіла звичайно містять множину антитіл, спрямованих проти (або які є специфічними до) різних епітопів. В одному втіленні поліклональне антитіло містить множину моноклональних антитіл з різними епітопними специфічностями, афінностями або авідностями в одному антигені, що містить множину антигенних епітопів. Модифікатор "моноклональне" позначає ознаку антитіла як таке, що його одержують із по суті гомогенної популяції антитіл, і його не треба розуміти як такий, що передбачає одержання антитіла якимось конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла, що підлягають використанню відповідно до цього винаходу, можуть бути одержані гібридомним способом, який було вперше описано Колером та ін. (Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)), або можуть бути одержані методами рекомбінантної ДНК (див., наприклад, патент США №4,816,567). "Моноклональні антитіла" також можуть бути ізольовані з клонотек фагових антитіл із застосуванням технічних прийомів, описаних, наприклад, Клаксоном та ін. (Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)) та Марксом та ін. (Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)). Ці моноклональні антитіла звичайно зв’язуватимуться із Kd принаймні близько 1 мкмоль, частіше принаймні близько 300 нмоль, типово принаймні близько 30 нмоль, краще принаймні близько 10 нмоль, ще краще принаймні близько 3 нмоль або краще, що її звичайно визначають за допомогою імунно-ферментного аналізу (ІФА). "Фармацевтична допоміжна речовина" містить матеріал, такий як ад’ювант, носій, речовина для регулювання рівня pH та буферна речовина, речовини, що регулюють тонічність, зволожувальні засоби, консерванти та подібне. "Фармацевтично прийнятний" стосується нетоксичної, інертної композиції та/або композиції, що є фізіологічно сумісною з людиною або іншими ссавцями. 17 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "полінуклеотид" означає полімерну форму нуклеотидів, що мають принаймні 10 основ або основних пар за довжиною, рибонуклеотидів або деоксинуклеотидів, або модифіковану форму будь-якого типу нуклеотиду, і включає одно- і дволанцюгові форми ДНК та/або РНК. У цій галузі техніки цей термін часто використовують як синонім до "олігонуклеотид". Полінуклеотид може містити нуклеотидну послідовність, що розкрита в цьому описі, в якій тимідином (T), показаним, наприклад, на Фігурі 1, також може бути урацил (U); це визначення стосується відмінностей між хімічними структурами ДНК і РНК, зокрема, спостереження, що однією з чотирьох основних основ в РНК є урацил (U) замість тимідину (T). Термін "поліпептид" означає полімер із принаймні близько 4, 5, 6, 7 або 8 амінокислотами. В усьому описі використовують стандартні трибуквені або однобуквені позначення амінокислот. У цій галузі цей термін часто використовують як синонім до "пептид" або "білок". "Рекомбінантною" молекулою ДНК або РНК є молекула ДНК або РНК, яка зазнала молекулярної маніпуляції in vitro. Використаний тут термін "одноланцюгове Fv" або "scFv" або "одноланцюгове" антитіло стосується фрагментів антитіл, що містять VH і VL домени антитіла, де ці домени присутні в одному поліпептидному ланцюгу. Загалом, Fv поліпептид додатково містить поліпептидний лінкер між VH і VL доменами, який дозволяє sFv утворювати бажану структуру для зв’язування антигену. Для огляду sFv, див. Плактун "Фармакологія моноклональних антитіл" (Pluckthun, The Pharmacology Of Monoclonal Antibodies, том. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, Нью-Йорк, стор. 269-315 (1994).) Використані тут терміни "специфічний", "специфічним чином зв’язує" та "зв’язує специфічним чином" стосуються селективного зв’язування атитіла з епітопом антигену-мішені. Антитіла можуть бути випробувані для визначення специфічності зв’язування шляхом порівняння зв’язування з належним антигеном із зв’язуванням з нерелевантним антигеном або сумішшю антигенів за даних умов. Якщо антитіло зв’язується з належним антигеном принаймні у 2, 5, 7, а краще у 10 разів частіше, ніж з нерелевантним антигеном або сумішшю антигенів, тоді його вважають специфічним. В одному втіленні специфічним антитілом є антитіло, яке зв’язується лише з антигеном 191P4D12, але не зв’язується з нерелевантним антигеном. В іншому втіленні специфічним антитілом є антитіло, яке зв’язується з людським антигеном 191P4D12, але не зв’язується з нелюдським антигеном 191P4D12 з 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більшою амінокислотною гомологією з антигеном 191P4D12. В іншому втіленні специфічним антитілом є антитіло, яке зв’язується з антигеном 191P4D12 людини і зв’язується з антигеном 191P4D12 миші, але із високим ступенем зв’язування з антигеном людини. В іншому втіленні специфічним антитілом є антитіло, яке зв’язує антиген 191P4D12 людини і зв’язує антиген 191P4D12 примата, але з більш високим ступенем зв’язування антигену людини. В іншому втіленні специфічне антитіло зв’язується з антигеном 191P4D12 людини та будь-яким антигеном 191P4D12 не людини, але із більш високим ступенем зв’язування антигену людини або будь-якої їх комбінації. Використані тут терміни "лікувати" або "терапевтичний" та граматично споріднені до них терміни стосуються будь-якого покращення будь-якого наслідку хвороби, такого як подовжене виживання, зменшення смертності та/або полегшення побічних ефектів, які є побічними продуктами альтернативного терапевтичного впливу; у цій галузі є добре зрозумілим, що хоча перевагу надають повному усуненню хвороби, це не є вимогою для лікувальних дій. Термін "варіант" стосується молекули, яка проявляє відхилення від описаного типу або норми, такої як білок, яка має один або більше різні амінокислотні залишки у відповідному положенні або положеннях конкретно описаного білка (наприклад, білка 191P4D12, показаного на Фігурі 1). Аналог є прикладом варіантного білка. Іншими прикладами варіантів є сплайсингові ізоформи та однонуклеотидні поліморфізми (SNP). "Білки 191P4D12" та/або "споріднені до 191P4D12 білки" за винаходом включають білки, які конкретно описані в цьому описі (див. Фігуру 1), а також алельні варіанти, варіанти консервативного заміщення, аналоги та гомологи, які можуть бути ізольовані/одержані та охарактеризовані без проведення зайвих експериментів із дотриманням описаних тут способів або тих, що є легко доступними у цій галузі. До них також належать білки злиття, які поєднують частини різних білків 191P4D12 або їх фрагменти, а також білки злиття білка 191P4D12 та гетерологічний поліпептид. Такі білки 191P4D12 разом називають спорідненими до 191P4D12 білками, білками за винаходом або 191P4D12. Термін "споріднений до 191P4D12 білок" стосується поліпептидного фрагменту або послідовності білка 191P4D12 із 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або понад 25 амінокислотами; або щонайменше із 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 18 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 335, 339 або більше амінокислотами. ll.) Антитіла до 191P4D12 Інший аспект винаходу забезпечує антитіла, які зв’язуються із спорідненими до 191P4D12 білками (див. Фігуру 1). В одному втіленні антитілом, яке зв’язується із спорідненими до 191P4D12 білками, є антитіло, яке специфічним чином зв’язується з білком 191P4D12, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2. Антитіло, яке специфічним чином зв’язується з білком 191P4D12, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2, включає антитіла, які можуть зв’язуватись з іншими спорідненими до 191P4D12 білками. Наприклад, антитіла, які зв’язуються з білком 191P4D12, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2, можуть зв’язуватись зі спорідненими до 191P4D12 білками, такими як варіанти 191P4D12 та його гомологи чи аналоги. Антитіла до 191P4D12 за винаходом є особливо придатними для проведення прогностичного аналізу (див., наприклад, Таблицю I), візуалізації і методології терапії раку. Подібно до цього, такі антитіла є придатними для лікування та/або прогнозування раку товстої кишки та інших видів раку, в межах того, наскільки 191P4D12 також експресується або надмірно експресується в цих інших видах раку. Крім того, антитіла, що експресуються внутрішньоклітинно (наприклад, одноланцюгові антитіла) є терапевтично придатними для лікування видів раку, пов’язаних з експресією 191P4D12, таких як розповсюджений або метастатичний рак товстої кишки або інші види розповсюдженого або метастатичного раку. У цій галузі добре відомі різноманітні способи одержання антитіл, зокрема моноклональних антитіл. Наприклад, антитіл, які можуть бути одержані шляхом імунізації підходящого хазяїнассавця із застосуванням спорідненого до 191P4D12 білка, пептиду або фрагменту, в ізольованій або імунокон’югованій формі (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, and Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Крім того, також можуть бути використані білки злиття 191P4D12, такі як 191P4D12 GST-білок злиття. В окремому втіленні одержують GST білок злиття, що містить всі або більшість амінокислотних послідовностей за Фігурою 1, і потім використовують як імуноген для одержання відповідних антитіл. В іншому втіленні синтезують споріднений до 191P4D12 білок та використовують як імуноген. Крім того, використовують відомі у цій галузі технічні прийоми імунізації "оголеною" ДНК (з клітинами, що експресують очищений споріднений до 191P4D12 білок або 191P4D12, або без них) для одержання імунної відповіді на кодований імуноген (для огляду див. Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648). Амінокислотна послідовність білка 191P4D12, показана на Фігурі 1, може бути проаналізована для обрання специфічних ділянок білка 191P4D12 для вироблення антитіл. Наприклад, аналізи гідрофобності та гідрофільності амінокислотної послідовності 191P4D12 використовують для визначення гідрофільних ділянок у структурі 191P4D12. Ділянки білка 191P4D12, що мають імуногенну структуру, а також інші ділянки і домени можуть бути легко ідентифіковані із застосуванням різноманітних інших методів, відомих у цій галузі, таких як аналізи Чоу-Фасмана (Chou-Fasman), Гарньє-Робсона (Garnier-Robson), Кайт-Дулітла (KyteDoolittle), Айзенберга (Eisenberg), Карплуса-Шульца (Karplus-Schultz) або Джеймса-Вольфа (Jameson-Wolf). Профілі гідрофільності можуть бути одержані із застосуванням методу Хопа та Вудса (Hopp, T.P. and Woods, K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828). Профілі гідропатності (відносної гідрофобності або гідрофільності) можуть бути одержані із застосуванням методу Кайта і Дулітла (Kyte, J. and Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132). Профілі доступних осадів у процентному відношенні можуть бути одержані із застосуванням методу Яніна (Janin J., 1979, Nature 277:491-492). Профілі середньої гнучкості можуть бути одержані із застосуванням методу Баскарана та Понусвамі (Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255). Профілі бета-згину можуть бути одержані із застосуванням методу Деледжа та Роукса (Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289294). Таким чином, кожна ділянка, визначена будь-якою із цих програм або методів, входить до обсягу цього винаходу. Методи одержання антитіл до 191P4D12, яким надають перевагу, додатково проілюстровані за допомогою наведених далі прикладів. Способи одержання білка або поліпептиду для застосування як імуногенів є добре відомими у цій галузі. Також добре відомі у цій галузі способи одержання імуногенних кон’югатів білка з носієм, таких як BSA, KLH або інших білків-носіїв. У деяких випадках застосовують пряму кон’югацію із використанням, наприклад, карбодіімідних реактивів; у інших випадках ефективними є зв’язувальні реактиви, такі як ті, що їх постачає компанія Pierce Chemical Co., Рокфорд, штат Іллінойс,. Введення імуногенну 191P4D12 часто здійснюють шляхом ін’єкції впродовж підходящого періоду часу та із застосуванням підходящого ад’юванта, як це розуміють у цій галузі. Під час схеми імунізації можуть бути взяті титри антитіл для визначення адекватності утворення антитіл. 19 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Моноклональні антитіла до 191P4D12 можут бути одержані різними засобами, добре відомими у цій галузі. Наприклад, іморталізовані лінії клітин, які секретують бажане моноклональне антитіло, одержують із використанням стандартної гібридомної технології Келера (Kohler) та Мільштейна (Milstein) або модифікацій, що роблять безсмертними В-клітини, що виробляють антитіла, що є загально відомим. Іморталізовані лінії клітин, що секретують бажані антитіла, сортують за допомогою імуноаналізу, в якому антигеном є споріднений до 191P4D12 білок. Після визначення відповідної іморталізованої культури клітин клітини можуть бути розширені і одержані антитіла або з in vitro культур, або з вільної рідини черевної порожнини. Антитіла або фрагменти за винаходом також можуть бути одержані рекомбінантними засобами. Ділянки, які специфічним чином зв’язуються з бажаними ділянками білка 191P4D12, також можуть бути одержані в контексті прищеплених антитіл химерної ділянки або ділянки, що визначає компліментарність (CDR), що походять з множинних видів. Також можуть бути одержані гуманізовані або людські антитіла до 191P4D12, і їм надають перевагу при застосуванні у терапевтичному контексті. Добре відомими є способи гуманізації мишачих та інших нелюдських антитіл шляхом заміщення одного або більше із CDR нелюдських антитіл відповідними послідовностями антитіл людини (див., наприклад, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 15341536). Також див. Carter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 та Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296. У втіленні, якому надають перевагу, антитіла за цим винаходом містять повністю людські антитіла до 191P4D12 (моноклональне антитіло до 191P4D12 ). Різні методи у цій галузі забезпечують засоби одержання повністю людських моноклональних антитіл до 191P4D12. Наприклад, втілення, якому надають перевагу, забезпечує технічні прийоми із застосуванням трансгенних мишей, інактивованих для вироблення антитіл, сконструйованих з локусами людських важких та легких ланцюгів, що їх називають ксеномишами (Xenomouse) (Amgen Fremont, Inc.). Показовий опис одержання трансгенних мишей, що виробляють людські антитіла, можна знайти у патенті США № 6,657,103. Також див. патенти США №№ 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016 та 5,545,806; і Мендез та ін. (Mendez, et. al. Nature Genetics, 15: 146-156 (1998)); Келерман та Грін (Kellerman, S.A. & Green, L.L., Curr. Opin. Biotechnol 13, 593-597 (2002)). Крім того, людські антитіла за винаходом можуть бути одержані із застосуванням миші HuMAb (Medarex, Inc.), яка містить мінілокуси людського гену імуноглобуліну, що кодують неперебудовані імуноглобулінові послідовності людини важкого (мю та гамма) та легкого каппа ланцюгів, разом із цільовими мутаціями, що інактивують ендогенні локуси мю та каппа ланцюгів (див., наприклад, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). В іншому втіленні повністю людські антитіла за винаходом можуть бути одержані із використанням миші, що несе людські імуноглобулінові послідовності на трансгенах і трансхромосомах, такої як миша, що несе людський трансген важкого ланцюга та людську трансхромосому легкого ланцюга. Такі миші, які в цьому описі називають "КМ миші", описані Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727 та в публікації PCT WO 02/43478 на ім’я Томізука та ін. (Tomizuka, et al.). Людські моноклональні антитіла за винаходом також можуть бути одержані із застосуванням методів фагового відображення для сортування клонотек генів людських імуноглобулінів. Такі методи фагового відображення для ізолювання людських антитіл є прийнятими у цій галузі. Див., наприклад: патенти США №№ 5,223,409, 5,403,484 і 5,571,698 на ім’я Ладнер та ін. (Ladneret al.); патенти США №№ 5,427,908 і 5,580,717 на ім’я Доуер та ін. (Dower et al.); патенти США №№ 5,969,108 і 6,172,197 на ім’я МакКаферті та ін. (McCafferty et al.); та патенти США №№ 5,885,793, 6,521,404, 6,544,731, 6,555,313, 6,582,915 і 6,593,081 на ім’я Гріфітс та ін (Griffiths at al.). Людські моноклональні антитіла за винаходом також можуть бути одержані із використанням мишей із ТКІД, у яких були відновлені людські імунні клітини, так що може бути одержана відповідь людського антитіла після імунізації. Такі миші описані, наприклад, в патентах США №№ 5,476,996 і 5,698,767 на ім’я Вільсон та ін. (Wilson at al.). У кращому втіленні моноклональні антитіла до 191P4D12 за винаходом містять варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів антитіла, позначеного Ha22-2(2,4)6.1, виробленого гібридомою, депонованою в Американський колекції типових культур (ATCC) за інвентарним номером PTA-11267 (див. Фігуру 3), або важкі та легкі варіабельні ділянки, що містять амінокислотні послідовності, що є гомологічними до амінокислотних послідовностей варіабельних ділянок важкого та легкого ланцюгів Ha22-2(2,4)6.1, причому антитіла зберігають 20 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бажані функціональні властивості моноклональних антитіл до 191P4D12 за винаходом. Варіабельна ділянка важкого ланцюга Ha22-2(2,4)6.1 складається з амінокислотної послідовності, що простягається з 20-го E залишку до 136-го S залишку SEQ ID NO:7, а варіабельна ділянка легкого ланцюга Ha22-2(2,4)6.1 складається з амінокислотної послідовності, що простягається з 23-го D залишку до 130-го R залишку SEQ ID NO:8. Як константна ділянка антитіла за винаходом може бути вибраний будь-який підклас константних ділянок. В одному втіленні можуть бути використані константна ділянка людського IgG1 як константна ділянка важкого ланцюга і константна ділянка людського Ig каппа як константна ділянка легкого ланцюга. Наприклад, винахід забезпечує ізольоване моноклональне антитіло або його частину, що зв’язує антиген, яке містить варіабельну ділянку важкого ланцюга та варіабельну ділянку легкого ланцюга, де: (a) варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, що є принаймні на 80 % гомологічною до амінокислотної послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга, показаної на Фігурі 3; та (b) варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, що є принаймні на 80 % гомологічною до амінокислотної послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга, показаної на Фігурі 3. В інших втіленнях VH та/або VL амінокислотні послідовності можуть бути на 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % гомологічними до послідовностей VH і VL, показаних на Фігурі 3. В іншому втіленні винахід забезпечує ізольоване моноклональне антитіло або його частину, що зв’язує антиген, яке містить гуманізовану варіабельну ділянку важкого ланцюга та гуманізовану варіабельну ділянку легкого ланцюга, де: (a) варіабельна ділянка важкого ланцюга містить ділянки, що визначають компліментарність (CDR), які мають амінокислотні послідовності CDR варіабельної ділянки важкого ланцюга, показані на Фігурі 3; (b) варіабельна ділянка легкого ланцюга містить CDR, які мають амінокіслотні послідовності CDR варіабельної ділянки легкого ланцюга, показані на Фігурі 3. Сконструйовані антитіла за винаходом включають антитіла, в яких були здійснені модифікації в каркасних залишках всередині VH та/або VL (наприклад, для покращення властивостей антитіла). Звичайно такі каркасні модифікації роблять для зниження імуногенності антитіла. Наприклад, одним підходом є "зворотна мутація" одного або більше каркасних залишків до відповідної зародкової послідовності. Більш конкретно, антитіло, що зазнало соматичної мутації, може містити каркасні залишки, які відрізняються від зародкової послідовності, з якої було виведено антитіло. Такі залишки можуть бути встановлені шляхом порівняння каркасних послідовностей антитіла із зародковими послідовностями, з яких було виведене антитіло. Для повернення послідовностей каркасних ділянок до їх зародкової конфігурації соматичні мутації можуть зазнати "зворотної мутації" до зародкової послідовності, наприклад, за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу або ПЦР-опосередкованого мутагенезу (наприклад, "мутовані назад" з лейцину до метіоніну). Такі антитіла "зворотної мутації" також входять до обсягу цього винаходу. Інший вид каркасної модифікації стосується мутації одного або більше залишків у каркасній ділянці або навіть в одній або більше ділянках CDR для видалення епітопів T-лімфоцитів для зниження у такий спосіб потенційної імуногенності антитіла. Цей підход також називають "деімунізацією" і він докладно описаний у патентній публікації США № 2003/0153043 авторів Кар та ін. (Carr et al.). На додаток або як альтернатива до модифікацій, що їх здійснюють у межах каркасу або ділянки CDR, антитіла за винаходом можуть бути сконструйовані для включення модифікацій у межах Fc ділянки, звичайно для зміни однієї або більше функціональних властивостей антитіла, таких як період напіввиведення сірки, фіксація комплемента, зв’язування Fc-рецептору та/або антиген-залежна клітинна цитотоксичність. Крім того, моноклональне антитіло до 191P4D12 за винаходом може бути модифіковане хімічним чином (наприклад, одна або більше хімічні частки можуть бути прикріплені до антитіла) або модифіковане для зміни його глікозилування, також для зміни однієї або більше функціональних властивостей моноклонального антитіла. Кожне з цих втілень більш докладно описане нижче. В одному втіленні шарнір CH1 модифікують таким чином, що змінюється кількість цистеїнових залишків у шарнірі, наприклад, підвищується або знижується. Цей підхід більш докладно описаний у патенті США № 5,677,425 авторами Бодмер та ін. (Bodmer et al.). Кількість цистеїнових залишків в шарнірі CH1 змінюють, наприклад, для полегшення складання легких та 21 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 важких ланцюгів або для підвищення чи зниження стійкості моноклонального антитіла до 191P4D12. В іншому втіленні Fc-шарнір антитіла мутують для зниження біологічного періоду напіврозпаду моноклонального антитіла до 191P4D12. Більш конкретно, одну або більше амінокислотні мутації вводять у межеву ділянку доменів CH2-CH3 фрагменту Fc-шарніра, так що антитіло має погіршене зв’язування зі стафілококовим білком А (SpA) відносно зв’язування із SpA нативного домену Fc-шарніра. Цей підход описаний більш докладно у патенті США № 6,165,745 авторми Вард та ін. (Ward et al.). В іншому втіленні моноклональне антитіло до 191P4D12 модифікують для підвищення його біологічного періоду напіввиведення. Можливі різноманітні підходи. Наприклад, можуть бути введені мутації, як описано у патенті США № 6,277,375 на ім’я Вард (Ward). Як альтернатива, для підвищення біологічного періоду напіввиведення антитіло може бути змінене в межах ділянки CH1 або CL для уміщення реутилізаційної рецепторзв’язувальної антигенної детермінанти, взятої з двох петель домену CH2 Fc-ділянки IgG, як це описано у патентах США №№ 5,869,046 і 6,121,022 авторами Преста та ін. (Presta et al.). У ще інших втіленнях Fc ділянку змінюють шляхом заміни принаймні одного амінокислотного залишку іншим амінокислотним залишком для зміни ефекторної функції або функцій моноклонального антитіла до 191P4D12. Наприклад, одна або більше амінокислоти, вибрані зі специфічних залишків амінокислот, можуть бути заміщені іншим амінокислотним залишком, так щоб антитіло мало змінену афінність до ефекторного ліганда, але зберігало антигензв’язувальну здатність материнського антитіла. Ефекторним лігандом, афінність до якого змінюють, може бути, наприклад, Fc-рецептор або C1-компонент комплемента. Цей підхід описаний більш докладно у патентах США №№ 5,624,821 і 5,648,260, обидва авторами Вінтер та ін. (Winter et al.). Реакційна здатність антитіл до 191P4D12 зі спорідненим до 191P4D12 білком може бути визначена за допомогою низки добре відомих засобів, у тому числі вестерн-блотингом, імунопреципітацією, імунно-ферментним аналізом (ІФА) та FACS-аналізом із застосуванням, за потреби, споріднених до 191P4D12 білків, клітин, що експресують 191P4D12, або їх екстрактів. Антитіло до 191P4D12 або його фрагмент можуть бути мічені детектованим маркером або кон’юговані з другою молекулою. Підходящими детектованими маркерами є, але це не є обмеженням, радіоізотоп, флуоресцентна сполука, біолюмінісцентна сполука, хемілюмінесцентна сполука, хелатор металу або фермент. Крім того, бі-специфічні антитіла, що є специфічними для двох або більше епітопів 191P4D12, одержують із використанням методів, що є загальновідомими у цій галузі. Гомодимерні антитіла також можуть бути одержані за допомогою технологій перехресного зшивання, відомих у цій галузі (наприклад, Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565). У ще іншому втіленні, якому надають перевагу, моноклональним антитілом до 191P4D12 за винаходом є антитіло, що містить важкий і легкий ланцюги антитіла, позначеного Ha22-2(2,4)6.1. Важкий ланцюг Ha22-2(2,4)6.1 складається з амінокислотної послідовності, що простягається від 20-го E залишку до 466-го K залишку SEQ ID NO:7, а легкий ланцюг Ha22-2(2,4)6.1 складається з амінокислотної послідовності, що простягається з 23-го D залишку до 236-го C залишку SEQ ID NO:8. Його послідовність показана на Фігурах 2 і 3. У кращому втіленні Ha222(2,4)6.1 кон’юговане з цитотоксичним агентом. Гібридому, що виробляла антитіло, позначене Ha22-2(2,4)6.1, було надіслано (поштою Federal Express) до Американської колекції типових культур (ATCC), п/с 1549, Манассас, штат Вірджінія, 20108 18 серпня 2010 р., і їй було надано інвентарний номер PTA-11267. lll.) Кон’югати антитіло-лікарський засіб у загальних рисах В іншому аспекті винахід забезпечує кон’югати антитіло-лікарський засіб (ADC), які містять антитіло, кон’юговане з цитотоксичним засобом, таким як хіміотерапевтичний засіб, лікарський засіб, інгібітор росту, токсин (наприклад, ферментативно-активний токсин бактерійного, грибкового, рослинного або тваринного походження або його фрагменти) або радіоактивний ізотоп (тобто радіокон’югат). В іншому аспекті винахід також забезпечує способи застосування кон’югату антитіло-лікарський засіб. В одному аспекті кон’югат антитіло-лікарський засіб містить будь-яке з описаних тут моноклональних антитіл до 191P4D12, які ковалентно прикріплені до цитотоксичного засобу або детектованого засобу. Застосування кон’югатів антитіло-лікарський засіб для місцевого доставляння цитотоксичних або цитостатичних засобів, тобто ліків для знищення або інгібування росту клітин пухлини при лікуванні раку (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; патент США № 4,975,278), забезпечує цілеспрямоване доставляння лікарської речовини до пухлин та внутрішньоклітинне 22 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 накопичення в них, коли системне введення цих некон’югованих лікарських засобів може спричинити незадовільні рівні токсичності для здорових клітин, а також для клітин пухлини, які необхідно знищити (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review" ("Носії цитотоксичних агентів в антитілах у терапії раку: Огляд") у виданні Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications ("Моноклональні антитіла ’84: Біологічне та клінічне застосування"), A. Pinchera et al. (ed.s), стор. 475-506). Таким чином, намагаються досягати максимальної ефективності з мінімальною токсичністю. Повідомляли, що і поліклональні, і моноклональні антитіла є придатними для застосування у таких стратегіях (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). Ліками, що їх використовують у цих методах, є дауноміцин, доксорубіцин, метотрексат і віндезин (Rowland et al., (1986) вище). Токсини, що їх використовують у кон’югатах антитіло-токсин, включають бактерійні токсини, такі як дифтерійний токсин, рослинні токсини, такі як рицин, токсини малих молекул, такі як гельданаміцин (Mandler et al. (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), мейтанзиноїди (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:86188623) та каліхеаміцин (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Токсини можуть чинити цитотоксичну і цитостатичну дію за допомогою таких механізмів, як зв’язування тубулінів, зв’язування ДНК або інгібування топоізомерази. Деякі цитотоксичні ліки мають схильність бути неактивними або менш активними при кон’югуванні з великими антитілами або лігандами білкових рецепторів. Прикладами кон’югатів антитіло-лікарський засіб є ZEVALIN (ібтритумомаб тіуксетан, Biogen/Idec), що є кон’югатом антитіло-радіоізотоп, складеним з мишачого IgG1 каппа моноклонального антитіла, спрямованого проти антигену CD20, що його виявляють на поверхні 111 90 нормальних та злоякісних B лімфоцитів, та In або Y радіоізотопу, зв’язаного лінкеромхелатором тіосечовини (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Крім того, MYLOTARG (гемтузумаб озогаміцин, Wyeth Pharmaceuticals), кон’югат антитілолікарський засіб, складений із hu-CD33-антитіла, сполученого з каліхеаміцином, було схвалено у 2000 р. для лікування гострої мієлоїдної лейкемії шляхом ін’єкцій (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; патенти США №№ 4970198, 5079233, 5585089, 5606040, 5693762, 5739116, 5767285, 5773001). Крім того, кантузумаб мертанзин (Immunogen, Inc.), кон’югат антитіло-лікарський засіб, складений із huC242-антитіла, сполученого дисульфідним лінкером SPP з лікарською часткою мейтанзиноїду, DM1, переходить на ІІ стадію випробувань для лікування видів раку, що експресують CanAg, таких як рак товстої кишки, підшлункової залози, шлунка та інші види раку. Крім того, MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen, Inc.), кон’югат антитілолікарський засіб, складений з моноклонального антитіла до протипростатного специфічного мембранного антигену (PSMA), сполученого з лікарською часткою мейтанзиноїду, DM1, перебуває у стадії розробки для потенційного лікування пухлин передміхурової залози. Зрештою, ауристатинові пептиди, ауристатин E (AE) та монометилауристатин (MMAE), синтетичні аналоги доластатину, які були кон’юговані з химерними моноклональними антитілами cBR96 (специфічними до Lewis Y на карциномах) і cAC10 (специфічними до CD30 на гематологічних злоякісних пухлинах) (Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784), перебувають на стадії терапевтичної розробки. Крім того, описані хіміотерапевтичні засоби, придатні для одержання кон’югату антитілолікарський засіб. Ферментативно активні токсини та їхні фрагменти, які можуть бути використані, включають ланцюг дифтерії A, незв’язувальні активні фрагменти дифтерійного токсину, ланцюг екзотоксину A (із синьогнійної палички Pseudomonas aeruginosa), ланцюг ридину A, ланцюг абрину А, ланцюг модецину A, альфа-сарцин, білки тунгу молукського (Aleurites fordii), білки діантину, білки лаконосу американського (Phytolaca Americana) (PAPI, PAPII і PAP-S), інгібітор китайського гіркого гарбуза (momordica charantia), курцин, кротин, інгібітор мильнянки лікарської (sapaonaria officinalis), гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин та трикотецени. Див., наприклад, міжнародну заявку WO 93/21232, опубліковану 28 жовтня 1993 р. Низка радіонуклеотидів є доступними для одержання 212 131 131 90 186 радіокон’югованих антитіл. Прикладами є Bi, I, In, Y і Re. Кон’югати антитіла і цитотоксичного засобу одержують із використанням низки біфункціональних білокзв’язувальних речовин, таких як N-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіол) пропіонат (SPDP), імінотіолан (IT), біфункціональних похідних імідоефірів (таких як диметил адипімідат HCl), 23 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 активних складних ефірів (таких як дисукцинімідил суберат), альдегідів (таких як глютаральдегід), біс-азидо сполук (таких як біс(p-азидобензоїл) гександіамін), біс-діазонійних похідних (таких як біс-(p-діазонійбензоїл)-етилендіамін), діізоціанатів (таких як толуол 2,6діізоціанат) та біс-активних сполук фтору (таких як 1,5-дифтор-2,4-динітробензол). Наприклад, рициновий імунотоксин може бути одержаний, як описано Вітетта та ін. (Vitetta et al., (1987) Science, 238:1098). Вуглець-14-мічена 1-ізотіоціанатобензил-3-метилдіетилен тріамінпентаоцтова кислота (MX-DTPA) є прикладом хелатного агента для кон’югування радіонуклеотиду з антитілом (WO94/11026). Кон’югати антитіла та один або більше токсини малих молекул, такі як каліхеаміцин, мейтанзиноїди, доластатини, ауристатини, трихотецен і CC1065, та похідні цих токсинів, що мають токсичну активність, також входять до обсягу цього винаходу. III(A). Мейтанзиноїди Мейтанзинові сполуки, придатні для використання як мейтанзиноїдні лікарські речовини, є добре відомими у цій галузі, і їх можна ізолювати з природних джерел відповідно до відомих способів, одержати із застосуванням технічних прийомів генної інженерії (див. Yu et al. (2002) PNAS 99:7968-7973), або мейтанзинолу та мейтанзинолових аналогів, одержаних синтетичним шляхом за допомогою відомих способів. Прикладами мейтанзиноїдних лікарських речовин є ті, що мають змінене ароматичне кільце, такі як: C-19-дехлор (США 4256746) (одержана відновленням алюмогідриду літію з анзамітоцину P2); C-20-гідрокси (або C-20-деметил) +/-C-19-дехлор (патенти США №№ 4,361,650 і 4,307,016) (одержана деметилуванням із застосуванням стрептоміцет або актиноміцет або дехлоруванням із застосуванням алюмогідриду літію); і C-20-деметокси, C-20-ацилокси (-OCOR), +/-дехлор (патент США № 4,294,757) (одержана ацилуванням із застосуванням ацилхлоридів), і ті, що мають модифікації в інших положеннях. Прикладами мейтанзиноїдних лікарських речовин також є речовини, що мають такі модифікації, як: C-9-SH (патент США № 4,424,219) (одержана введенням у реакцію мейтанзинолу з H2S або P2S5); C-14-алкоксиметил (деметокси/CH2 OR) (патент США № 4331598); C-14-гідроксиметил або ацилоксиметил (CH2OH або CH2OAc) (патент США № 4450254) (одержані з бактерій роду нокардіоподібних (Nocardia)); C-15-гідрокси/ацилокси (патент США № 4,364,866) (одержана перетворенням мейтанзинолу стрептоміцетами); C-15метокси (патенти США №№ 4,313,946 і 4,315,929) (ізольована з Trewia nudlflora); C-18-Nдеметил (патенти США №№ 4,362,663 і 4,322,348) (одержана деметилуванням мейтанзинолу стрептоміцетами); і 4,5-деокси (патент США № 4,371,533) (одержана відновленням трихлориду титану/літій алюмогідриду мейтанзинолу). Кон’югати антитіло-лікарський засіб, що містять мейтанзиноїди, способи їх одержання та їх терапевтичне застосування розкриті, наприклад, у патентах США №№ 5,208,020, 5,416,064, 6,441,163 та європейському патенті EP 0 425 235 B1, розкриття яких чітко включено до цього опису шляхом посилання. Ліу та ін. (Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)) описували кон’югати антитіло-лікарський засіб, що містять мейтанзиноїд, позначений DM1, сполучений з моноклональним антитілом C242, спрямованим проти колоректального раку людини. Було виявлено, що цей кон’югат є високоцитоксичним відносно культивованих клітин раку товстої кишки, і він проявив протипухлинну активність в аналізі росту пухлини in vivo. Чарі та ін. (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)) описують кон’югати антитіло-лікарський засіб, в яких мейтанзиноїд кон’югують через дисульфідний лінкер з мишачим антитілом A7, що зв’язується з антигеном на лініях клітин раку товстої кишки людини або з іншим мишачим моноклональним антитілом TA.1, яке зв’язується з онкогеном HER-2/neu. Цитотоксичність TA.1мейтанзиноїдного кон’югату випробовували in vitro на лінії клітин раку молочної залози людини 5 SK-BR-3, що експресує 3  10 HER-2 поверхневих антигенів на клітину. Лікарський кон’югат досяг ступеню цитотоксичності, подібного до вільних мейтанзиноїдних ліків, який можна було підвищити шляхом збільшення числа молекул мейтанзиноїду на молекулу антитіла. A7мейтанзиноїдний кон’югат показав низьку системну цитотоксичність у мишей. III(B). Ауристатини і доластатини У деяких втіленнях кон’югат антитіло-лікарський засіб містить антитіло за винаходом, кон’юговане з доластатинами або пептидними аналогами та похідними долостатину, ауристатинами (патенти США №№ 5,635,483, 5,780,588). Виявили, що доластатини і ауристатини втручаються у динаміку мікротрубочок, гідроліз ГТФ і ядерний та клітинний поділ (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) і мають протиракову (патент США № 5,663,149) та протигрибкову дію (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). Доластатинові або ауристатинові лікарські складові можуть бути прикріплені до антитіла через N (аміно) кінець або C (карбоксильний) кінець пептидної 24 UA 110495 C2 5 лікарської складової (WO 02/088172). Прикладами втілень ауристатину є сполучені на N-кінці монометилауристатинові лікарські складові DE і DF, розкриті Сентер та ін. (Senter et al.) у "Proceedings of the American Association for Cancer Research" ("Протоколи Американської асоціації з дослідження раку"), Том 45, номер реферату 623, представлених 28 березня 2004 р. та описаних у патентній публікації США № 2005/0238649, розкриття якого чітко включено у всій повноті тут шляхом посилання. Прикладом втілення ауристатину є MMAE (де хвиляста лінія позначає ковалентне прикріплення до лінкера (L) лікарського кон’югату антитіла). H N N O OH N O 10 H N N O O O O MMAE Іншим прикладом втілення ауристатину є MMAF, де хвиляста лінія позначає ковалентне прикріплення до лінкера (L) лікарського кон’югата антитіла (US 2005/0238649): H N N O N O 15 H N N O O O O O OH MMAF Додаткові приклади втілення, що містять MMAE або MMAF та різні лінкерні компоненти (описані тут більш докладно), мають такі структури та скорочення (де Ab означає антитіло, S означає сірку антитіла, а p означає від 1 до близько 8): 20 Ab S O O O O N H N N H N N N O Val-Cit N H O O O O O O O OH H N OH p Ab-MC-vc-PAB-MMAF Ab S O O O O N H N N N N O Val-Cit N H O O O O O O p Ab-MC-vc-PAB-MMAE Ab S O N O O H N N O O H N N N O 25 O O O O OH p Ab-MC-MMAF 30 35 Звичайно основані на пептиді лікарські складові можуть бути одержані шляхом утворення пептидного зв’язку між двома або більше амінокислотами та/або пептидними фрагментами. Такі пептидні зв’язки можуть бути одержані, наприклад, методом рідиннофазного синтезу (див. E. Schröder and K. Lübke, "The Peptides", том 1, стор. 76-136, 1965, Academic Press), який є добре відомим в галузі пептидної хімії. Лікарські одиниці ауристатину/доластатину можуть бути одержані відповідно до способів, розкритих у патентах США №№ US 5635483, US 5780588, Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; та Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784. III(C). Каліхеаміцин В інших втіленнях кон’югат антитіло-лікарський засіб містить антитіло за винаходом, 25 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кон’юговане з однією або більше молекулами каліхеаміцину. Сімейство антитіл каліхеаміцину здатні виробляти розриви у дволанцюговій ДНК при під-пікомолярних концентраціях. Для одержання кон’югатів сімейства каліхеаміцину див. патенти США №№ 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (всі на ім’я American Cyanamid Company). Структурними аналогами каліхеаміцину, які можуть бути використані, є, але це не є I I I I I обмеженням, γ1 , α2 , α3 , N-ацетил-γ1 , PSAG і θ 1 (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) та вказані вище патенти США на ім’я American Cyanamid). Іншими протипухлинними ліками, з яким може бути кон’юговане антитіло, є QFA, що є антифолатом. Як каліхеаміцин, так і QFA мають внутрішньоклітинні сайти дії і легко не перетинають плазмову мембрану. Через це клітинне поглинання цих засобів шляхом опосередкованої антитілом інтерналізації значно посилює їхню цитотоксичну дію. III(D). Інші цитотоксичні засоби Іншими протипухлинними засобами, які можуть бути кон’юговані з антитілами за винаходом, є бісхлоретилнітрозосечовина (BCNU), стрептозойцин, вінкристин і 5-фторурацил - сімейство засобів, відомих під загальною назвою LL-E33288 комплекс, який описаний у патентах США №№ 5,053,394, 5,770,710, а також еспераміцини (патент США № 5,877,296). До ферментативно-активних токсинів та їх фрагментів, які можуть бути використані, відносяться А-ланцюг дифтерії, незв’язувальні активні фрагменти дифтерійного токсину, Аланцюг екзотоксину (із синьогнійної палички), А-ланцюг рицину, А-ланцюг абрину, А-ланцюг модецину, альфа-саркін, білки тунгового дерева (Aleurites fordii), білки діантину, білки лаконосу американського (Phytolaca Americana) (PAPI, PAPII і PAP-S), інгібітор китайського гіркого гарбуза (momordica charantia), курцин, кротин, інгібітор мильнянки лікарської (sapaonaria officinalis), гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин та трикотецени. Див., наприклад, міжнародну заявку WO 93/21232, опубліковану 28 жовтня 1993 р. Цей винахід також передбачає кон’югат антитіло-лікарський засіб, утворений між антитілом та сполукою з нуклеолітичною активністю (наприклад, рибонуклеазою або ДНК-ендонуклеазою, такою як деоксирибонуклеаза; ДНаза). Для селективного руйнування пухлини антитіло може містити високорадіоактивний атом. Існує широкий вибір радіоактивних ізотопів для одержання радіокон’югованих антитіл. 211 131 125 90 186 188 153 212 32 212 Прикладами є At , I , I , Y , Re , Re , Sm , Bi , P , Pb та радіоактивні ізотопи Lu. При використанні кон’югата для виявлення він може містити радіоактивний атом для 99m 123 сцинтиграфічних досліджень, наприклад, tc або I , або спинову мітку для ядерно-магнітнорезонансної (ЯМР) томографії (також відомої як магнітно-резонансна томографія, мрт), таку як йод-123, йод-131, індій-111, фтор-19, вуглець-13, азот-15, кисень-17, гадоліній, марганець або залізо. Радіо- або інші мітки можуть бути введені у кон’югат відомими способами. Наприклад, пептид може бути біосинтезований або може бути синтезований хімічним амінокислотним синтезом із використанням підходящих амінокислотних прекурсорів із залученням, наприклад, 99m 123 186 188 111 фтору-19 замість водню. Мітки, такі як tc або I , Re , Re і In , можуть бути прикріплені через цистеїновий залишок в пептиді. Ітрій-90 може бути прикріплений через лізиновий залишок. Метод йодування (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) може бути використаний для введення йоду-123. У виданні "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" ("Моноклональні антитіла в імуносцинтиграфії") (Chatal, CRC Press 1989) докладно описані інші методи. lV.) Сполуки кон’югатів антитіло-лікарський засіб, які зв’язують 191P4D12 Цей винахід забезпечує, з-поміж іншого, сполуки кон’югатів антитіло-лікарський засіб для цілеспрямованого доставляння ліків. Винахідники зробили відкриття, що сполуки кон’югатів антитіло-лікарський засіб мають потужну цитотоксичну та/або цитостатичну активність проти клітин, що експресують 191P4D12. Сполуки кон’югатів антитіло-лікарський засіб містять одиницю антитіла, ковалентно сполучену із принаймні однією одиницею ліків. Одиниці ліків можуть бути ковалентним чином сполучені безпосередньо або через лінкерну одиницю (LU). У деяких втіленнях сполука кон’югату антитіло-лікарський засіб має таку формулу: L - (LU-D)p (I) або її фармацевтично прийнятну сіль чи сольват, де: L означає одиницю антитіла, наприклад, моноклональне антитіло до 191P4D12 за цим винаходом, і (LU-D) означає компонент лінкерна одиниця-одиниця ліків, де: LU - є лінкерною одиницею, а -D є одиницею ліків, що має цитостатичну або цитотоксичну активність проти клітини-мішені; і 26 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 p означає ціле число від 1 до 20. У деяких втіленнях p коливається від 1 до 10, 1 до 9, 1 до 8, 1 до 7, 1 до 6, 1 до 5, 1 до 4, 1 до 3 або 1 до 2. У деяких втіленнях p коливається від 2 до 10, 2 до 9, 2 до 8, 2 до 7, 2 до 6, 2 до 5, 2 до 4 або 2 до 3. В інших втіленнях p означає 1, 2, 3, 4, 5 або 6. У деяких втіленнях p означає 2 або 4. У деяких втіленнях сполука кон’югату антитіло-лікарський засіб має таку формулу: L - (Aa-W w-Yy-D)p (lI) або її фармацевтично прийнятну сіль чи сольват, де: L означає частку антитіла, наприклад, моноклональне антитіло до 191P4D12; і -Aa-W w-Yy - означає лінкерну одиницю (LU), де: -A - означає розтягувальну частку, a означає 0 або 1, кожний -W - незалежно означає амінокислотну одиницю, w означає ціле число від 0 до 12, -Y- означає самоспалювальну спейсерну одиницю, y означає 0, 1 або 2; -D означає одиницю ліків, що має цитостатичну або цитотоксичну активність проти клітинимішені; і p означає ціле число від 1 до 20. У деяких втіленнях a означає 0 або 1, w означає 0 або 1 і y означає 0, 1 або 2. У деяких втіленнях a означає 0 або 1, w означає 0 або 1 і y означає 0 або 1. У деяких втіленнях p коливається від 1 до 10, 1 до 9, 1 до 8, 1 до 7, 1 до 6, 1 до 5, 1 до 4, 1 до 3 або 1 до 2. У деяких втіленнях p коливається від 2 до 8, 2 до 7, 2 до 6, 2 до 5, 2 до 4 або 2 до 3. В інших втіленнях p означає 1, 2, 3, 4, 5 або 6. У деяких втіленнях p означає 2 або 4. У деяких втіленнях коли w не є нуль, y означає 1 або 2. У деяких втіленнях коли w означає від 1 до 12, y означає 1 або 2. У деяких втіленнях w означає від 2 до 12 і y означає 1 або 2. У деяких втіленнях a означає 1 і w та y означають 0. Для композицій, що містять множину антитіл, введення ліків позначають p, що є середньою кількістю молекул ліків на антитіло. Введення ліків може коливатися від 1 до 20 ліків (D) на антитіло. Середня кількість ліків на антитіло при приготуванні реакцій кон’югації може характеризуватися традиційними засобами, такими як мас-спектроскопія, імунно-ферментний аналіз (ІФА) та ВЕРХ. Також може бути визначений кількісний розподіл кон’югатів антитілолікарський засіб з точки зору p. У деяких випадках відокремлення, очищення та визначення параметрів гомогенних кон’югатів антитіло-лікарський засіб, де p означає певну величину в кон’югатах антитіло-лікарський засіб із введенням інших ліків, можуть бути досягнені такими способами, як зворотнофазна ВЕРХ або електрофорез. У показових втіленнях p становить від 2 до 8. Одержання сполук кон’югатів антитіло-лікарський засіб може бути здійснене за допомогою будь-яких технічних прийомів, відомих спеціалістові у цій галузі. Коротко кажучи, сполуки кон’югатів антитіло-лікарський засіб містять моноклональне антитіло до 191P4D12 як одиницюантитіло, лікарський засіб та необов’язково лінкер, який зв’язує лікарський засіб та зв’язувальний засіб. У втіленні, якому надають перевагу, антитілом є моноклональне антитіло до 191P4D12, що містить варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів антитіла, позначеного Ha22-2(2,4)6.1, яке описане вище. У втіленні, якому надають більшу перевагу, антитілом є моноклональне антитіло до 191P4D12, що містить важкий та легкий ланцюг антитіла, позначеного Ha22-2(2,4)6.1, яке описане вище. Можлива низка різніх реакцій для ковалентного прикріплення ліків та/або лінкерів зі зв’язувальними засобами. Цього часто досягають реакцією амінокислотних залишків зв’язувального засобу, наприклад, молекули антитіла, включаючи амінові групи лізину, вільні групи карбонової кислоти глутамінової та аспарагінової кислот, сульфгідрильні групи цистеїну та різні частки ароматичних амінокислот. Одним найпоширенішим неспецифічним способом ковалентного прикріплення є карбодіімідна реакція для прикріплення карбокси (або аміно) групи сполуки до аміно (або карбокси) груп антитіла. Крім того, використовують біфункціональні засоби, такі як діальдегіди або іміноефіри, для сполучення аміногрупи сполуки з аміногрупами молекули антитіла. Також для прикріплення лікарських засобів до зв’язувальних засобів існує реакція основи Шиффа. Цей спосіб включає окислення перйодатом лікарського засобу, що містить гліколеві або гідрокси групи, з утворенням таким чином альдегіду, який потім вступає у реакцію із зв’язувальним агентом. Прикріплення відбувається шляхом утворення основи Шиффа з аміногрупами зв’язувального засобу. Ізотіоціанати також можуть бути використані як сполучні агенти для ковалентного прикріплення ліків до зв’язувальних засобів. Інші технічні прийоми відомі спеціалістові у цій 27 UA 110495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 галузі і входять до обсягу цього винаходу. У деяких втіленнях проміжна речовина, що є прекурсором лінкера, вступає у реакцію з лікарським засобом за підходящих умов. У деяких втіленнях використовують функціональні групи на лікарському засобі та/або проміжній сполуці. Продукт реакції між лікарським засобом та проміжною сполукою або дериватизованим лікарським засобом згодом вступає у реакцію з моноклональним антитілом до 191P4D12 за підходящих умов. Далі більш докладно описана кожна з конкретних одиниць сполуки кон’югатів антитілолікарський засіб. Синтез і структура показових лінкерних одиниць, розтягувальних одиниць, амінокислотних одиниць, самоспалювальної спейсерної одиниці та одиниці лікарського засобу також описані у публікаціях патентних заявок США №№ 2003-0083263, 2005-0238649 та 20050009751, кожна з яких повністю включена до цього опису шляхом посилання у всіх відношеннях. V.) Лінкерні одиниці Звичайно сполуки кон’югатів антитіло-лікарський засіб містять лінкерну одиницю між одиницею лікарського засобу та одиницею антитіла. У деяких втіленнях лінкер може бути розщеплений за внутрішньоклітинних умов, так що розщеплення лінкера вивільнює частину лікарського засобу з антитіла у внутрішньоклітинному середовищі. Ще в інших втіленнях лінкерна одиниця не придатна до розщеплення, і лікарський засіб вивільнуюється, наприклад, шляхом руйнування антитіла. У деяких втіленнях лінкер здатний до розщеплення за допомогою розщеплювального засобу, присутнього у внутрішньоклітинному середовищі (наприклад, всередині лізосоми, ендосоми або ямки на поверхні клітини). Лінкером може бути, наприклад, пептидильний лінкер, що його розщеплюють внутрішньоклітинним пептидазним або протезним ферментом, включаючи, але це не є обмеженням, лізосомну або ендосомну протеазу. У деяких втіленнях пептидильний лінкер має довжину принаймні двох амінокислот або принаймні трьох амінокислот. Розщеплювальні засоби можуть включати катепсини B і D та плазмін, всі з яких відомі як такі, що гідролізують дипептидні похідні лікарських засобів, спричиняючи вивільнення активного лікарського засобу всередині клітин-мішеней (див., наприклад, Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Найтиповішими є пептидні лінкери, здатні до розщеплення за допомогою ферментів, які присутні в клітинах, що експресують 191P4D12. Наприклад, може бути використаний пептидильний лінкер, здатний до розщеплення тіолзалежною протеазою катепсин-B, що сильно експресується в раковій тканині (наприклад, лінкер Phe-Leu або Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:9)). Інші приклади таких лінкерів описані, наприклад, у патенті США № 6,214,345, включеному до цього опису шляхом посилання в усій повноті і для всіх цілей. В окремому втіленні пептидильним лінкером, здатним до розщеплення внутрішньоклітинною протеазою, є лінкер Val-Cit або Phe-Lys (див., наприклад, патент США № 6,214,345, в якому описаний синтез доксорубіцину за допомогою лінкера Val-Cit). Одна перевага використання внутрішньоклітинного протеолітичного вивільнення терапевтичного засобу полягає в тому, що засіб звичайно є виснаженим при кон’югуванні, тоді як стійкість сироватки кон’югатів звичайно є високою. В інших втіленнях здатний до розщеплення лінкер є pH-чутливим, тобто чутливим до гідролізу за певних значень pH. Звичайно pH-чутливий лінкер є придатним до гідролізу за кислих умов. Наприклад, можуть бути використані кислотолабільний лінкер, придатний до гідролізу в лізосомі (наприклад, гідразон, семікарбазон, тіосемікарбазон, цис-аконітовий амід, ортоефір, ацеталь, кеталь або подібне). (Див., наприклад, патенти США №№ 5,122,368, 5,824,805, 5,622,929, Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661). Такі лінкери є відносно стабільними за нейтральних умов pH, таких як існують у крові, але є нестабільними при рівні pH нижче 5,5 або 5,0, приблизному рівні pH лізосоми. У деяких втіленнях придатним до гідролізу лінкером є тіоефірний лінкер (наприклад, тіоефір, прикріплений до терапевтичного засобу через ацилгідразоновий зв'язок (див., наприклад, патент США № 5,622,929). Ще в інших втіленнях лінкер є придатним до розщеплення за умов відновлення (наприклад, дисульфідний лінкер). У цій галузі відома низка дисульфідних лінкерів, у тому числі, наприклад, ті, що можуть бути утворені із використанням SATA (N-сукцинімідил-S-ацетилтіоацетату), SPDP (N-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонату), SPDB (N-сукцинімідил-3-(2піридилдитіо)бутирату) і SMPT (N-сукцинімідил-оксикарбоніл-альфа-метил-альфа-(2-піридилдитіо)толуолу), SPDB і SMPT (див., наприклад, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconugates: Antibody Conugates in Radioimagery and Therapy of Cancer ("Імунокон’югати: кон’югати антитіл у радіотерапії") (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Див. також патент США № 4,880,935.). Ще в інших конкретних втіленнях лінкером є малонатний лінкер (Johnson et al., 1995, 28