Реконструйоване людське анти-нм 1.24 антитіло, днк, що його кодує, вектор, клітина-хазяїн, спосіб одержання реконструйованого людського антитіла, фармацевтична композиція та лікарський засіб для лікування мієло

1. V-ділянка реконструйованого людського Lланцюга, де вказана V-ділянка має амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO:106. 2. V-ділянка реконструйованого людського Нланцюга, де вказана V-ділянка має амінокислотну 2 (19) 1 3 76934 4 ну послідовність, представлену SEQ ID NO:28 або 18. Клітина-хазяїн, трансформована експресуючим 102. вектором за п. 17. 13. ДНК, що кодує реконструйований людський L19. Спосіб одержання реконструйованого людсьланцюг за п. 3 або 4. кого антитіла за п. 7, що передбачає стадії культи14. ДНК за п. 13, де V-ділянка вказаного реконствування клітини-хазяїна, котрансформованої ексруйованого людського L-ланцюга кодується нуклепресуючим вектором за п. 17, що містить ДНК за отидною послідовністю, представленою SEQ ID будь-яким з пп. 13 або 14, і експресуючим вектоNO:9. ром за п. 17, що містить ДНК за будь-яким з пп. 15 15. ДНК, що кодує реконструйований людський Набо 16, і виділення потрібного антитіла. ланцюг за п. 5 або 6. 20. Фармацевтична композиція, що містить як ак16. ДНК за п. 15, де V-ділянка вказаного реконсттивний інгредієнт реконструйоване людське антируйованого людського Н-ланцюга кодується нукНМ 1.24 антитіло за п. 7. леотидною послідовністю, представленою SEQ ID 21. Лікарський засіб для лікування мієломи, що NO:28 або 102. містить як активний інгредієнт реконструйоване 17. Експресуючий вектор, що містить ДНК за будьлюдське анти-НМ 1.24 антитіло за п. 7. яким з пп. 9-16, що знаходиться під контролем ділянки, яка регулює експресію. Цей винахід стосується реконструйованих людських анти-НМ 1.24 антитіл та химерних анти-НМ 1.24 антитіл, генів, що їх кодують, способів одержання зазначених антитіл і .використання названих антитіл. Реконструйовані людські антитіла та химерні антитіла відповідно до цього винаходу можуть застосовуватись як терапевтичні агенти, наприклад, для лікування мієломи. Людські В-клітини проходять через різні процеси, які класифікуються на основі типу поверхневих антигенів, що експресуються, і врешті-решт дозрівають у плазмоцити, які продукують антитіла. На цій кінцевій стадії свого диференціювання В-клітини, з одного боку, набувають здатності продукувати цитоплазматичні імуноглобуліни, і, з іншого боку, зникають зв'язані з В-клітинами антигени, такі як імуноглобуліни клітинної поверхні, HLA-DR, CD20, Fc-рецептори, С3-рецептори системи комплементу тощо [Ling, N. R. et al. , Leucocyte Typing III (1986) p320, Oxford, UK, Oxford]. До цього часу є повідомлення про такі моноклональні антитіла, як анти-РСА-1 [Anderson, К. С. et al. , J. Immunol. (1983) 130, 1132], анти-РС-1 [Anderson, К. С et al. , J. Immunol. (1983) 132, 3172], анти-ММ4 [Tong, A. W. et al., Blood (1987) 69 238] тощо, які розпізнають антигени на клітинній мембрані плазмоцитів. Однак, анти-СD38 моноклональне антитіло все ще використовують для визначення плазмоцитів та мієломних клітин [Epstein, J. et al. , N. Engl. J. Med. (1990) 322, 664, Terstappen, L. W. M. M. et al. , Blood (1990) 76, 1739, Leo, R. et al., Ann. Hematol. (1992) 64, 132, Shimazaki, C. et al., Am. J. Hematol. (1992) 39, 159, Hata, H. et al., Blood (1993) 81, 3357, Harada, H. et al., Blood (1993) 81, 2658, Billadeae, D. et al., J. Exp. Med. (1993) 178, 1023]. Однак, анти-СD38 моноклональне антитіло є антигеном, зв'язаним скоріше з активацією Тклітин, ніж антигеном, пов'язаним з диференціюванням В-клітин, та експресується на різних клітинах окрім В-клітин. Крім того, хоча CD38 не експресується на деяких лімфоплазмацитоїдах, він сильно експресується на клітинах попередниках гемопоезу. З цієї причини вважають, що анти-СD38 моноклональне антитіло не придатне для дослідження диференціювання та дозрівання людських В-клітин або для лікування захворювань, пов'язаних з плазмоцитами. Goto, Т. et al. повідомляли про мишаче антиНМ 1.24 моноклональне антитіло, яке розпізнає антиген з молекулярною масою від 29 до 33кДа, що специфічно експресується на лініях В-клітин [Blood (1994) 84, 1922-1930]. На основі того факту, що антиген, який розпізнається анти-НМ 1.24 моноклональним антитілом, вважається пов'язаним з остаточним диференціюванням В-клітин [Goto, T. et al., Jpn. Clin. Immun. (1992) 16, 688691], і що введення анти-НМ 1.24 моноклонального антитіла мишам з трансплантованою плазмацитомою призводить до специфічного накопичування цього антитіла у пухлині [Sheji Ozaki et al., The Program of General Assembly of the 19th Japan Myeloma Study Meeting, general presentation 3], висловлювалось припущення, що мічене радіоізотопом анти-НМ 1.24 моноклональне антитіло, можна використовувати для діагностики локалізації пухлини, для спрямованої терапії, такої, як радіоімунотерапія, тощо. Крім того, у зазначеній вище статті, яку було опубліковано в Blood, описано, що анти-НМ 1.24 моноклональне антитіло має комплемент - залежною цитотоксичною активністю відносно до мієломної клітинної лінії людини RPMI8226. Мієлома являє собою неопластичне захворювання, що характеризується накопичуванням моноклональних плазмацитів (мієломних клітин) у кістковому мозку. Мієлома є захворюванням, при якому остаточно диференційовані В-клітини, які продукують і секретують імуноглобуліни, або плазмоцити, моноклонально проліферують, головним чином, у кістковому мозку, і відповідно, моноклональні імуноглобуліни або компоненти, що їх складають, L-ланцюги чи Η-ланцюги, визначаються у сироватці [Masaaki Kosaka et al., Nippon Rinsho (1995) 53, 91-99]. Як правило, для лікування мієломи використовували хіміотерапевтичні засоби, але не було 5 76934 6 знайдено ефективних терапевтичних засобів, які струйованого людського антитіла зв'язують з конмогли б привести до ремісії у хворих мієломою і стантною ділянкою людського антитіла. Частина, до подовження життя хворих на мієлому. Тому отримана з відмінної від людської амінокислотної давно існує потреба в створенні ліків, які справпослідовності в остаточно реконструйованому ляли би терапевтичний вплив на мієлому. гуманізованому антитілі, є CDR, і складає лише Мишачі моноклональні антитіла мають височастину FR. CDR складається з гіперваріабельної ку імуногенність (яку інколи називають "антигенамінокислотної послідовності, що не містить виністю") у людей. Відповідно, медична терапевтидоспецифічних послідовностей. Таким чином, чна цінність мишачих моноклональних антитіл гуманізоване антитіло, що містить мишачий CDR, для застосування у людей є обмеженою. Так, не повинно бути більш імуногенним, ніж природнаприклад, мишаче антитіло, введене людині, не людське антитіло, яке містить CDR людського може метаболізуватись як чужорідна речовина, антитіла. так що термін напіврозпаду мишачого антитіла в Щодо гуманізованого антитіла дивись організмі людини відносно малий, і тому воно не [Riechmann, L. et al. , Nature, 332, 323-327, 1988; може повністю продемонструвати очікуваний Verhoeye, M. et al., Science, 239, 1534-1536, 1988; ефект. Крім того, людські анти-мишачі антитіла, Kettleborough, C. A. et al. , Protein Engng., 4, 773які виробляються проти введеного мишачого ан783, 1991; Meada, H. et al., Human Antibodies and титіла, можуть запустити імунологічні реакції, що Hybridoma, 2, 124-134, 1991; Groman, S. D. et al., є несприятливими та небезпечними для пацієнProc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4181-4185, 1991; тів, такі як захворювання сироватки, інші алергічні Tempest, P. R. et al. , Bio/Technology, 9, 266-271, реакції тощо. Тому мишаче моноклональне анти1991; Co, M. S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, тіло не можна часто вводити людям. 88, 2869-2873, 1991; Carter, . P. et al. , Proc. Natl. Для вирішення цих проблем було розроблено Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992; Co, M. S. et спосіб зниження імуногенності антитіл, отриманих al., J. Immunol., 148, 1149-1154, 1992; і Sato, K. et не від людини, таких як отримані з мишей монокal, Cancer Res., 53, 851-856, 1993]. лональні антитіла. Одним з таких прикладів є Queen et al. (публікація міжнародної заявки спосіб одержання химерного антитіла, в якому № WO90-07861) розкриває спосіб одержання варіабельна ділянка (V-ділянка) антитіла одергуманізованого антитіла з антитіла проти рецепжана з вихідної миші, а його константна ділянка тора IL-2 Anti-Tac. Однак, важко повністю гумані(С-ділянка) отримана з підхожого людського анзувати всі антитіла, навіть додержуючись спосотитіла. бу, що його розкрито у WO 90-07861. Так, WO 90Оскільки отримане таким чином химерне ан07861 не розкриває загальний спосіб гуманізації титіло містить варіабельну ділянку вихідного миантитіл, а просто описує спосіб гуманізації антишачого антитіла в інтактній формі, очікується, що тіла Anti-Tac, яке є одним з антитіл проти рецепвоно буде зв'язуватися з антигеном зі специфічтора IL-2. Крім того, навіть якщо повністю додерністю, ідентичною до специфічності вихідного жуватись способу WO 90-07862, виявляється мишачого антитіла. Крім того, у химерному антискладним отримати гуманізоване антитіло, яке тілі кількість амінокислотних послідовностей, має активність, що є повністю ідентичною до акотриманих з організму, що не є людським, істотно тивності вихідного мишачого антитіла. знижена, і тому очікується, що таке антитіло буде Взагалі, амінокислотні послідовності CDR/FR мати знижену імуногенність порівняно з вихідним окремих антитіл відрізняються. Відповідно, вимишачим антитілом. Химерне антитіло може значення амінокислотного залишку, який слід зв'язуватися з антигеном так само, як і вихідне замінити для створення гуманізованого антитіла, мишаче моноклональне антитіло, і може включаі вибір амінокислотного залишку, яким слід заміти імунологічні реакції проти варіабельної ділянки нити зазначений амінокислотний залишок, різні мишачого антитіла, незважаючи на те, що його для кожного окремого антитіла. Тому спосіб одеімуногенність є зниженою [LoBuglio, A. F. et al., ржання гуманізованих антитіл, наведений раніше Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224, 1989]. в WO 90-07861, не можна застосувати для гумаДругий спосіб зниження імуногенності мишанізації всіх антитіл. чого антитіла, хоча і значно більш складний, до[Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989) зволяє ще більше зменшити потенційну імуно86, 10029-10033] зробив те ж саме відкриття, що генність мишачого антитіла. В цьому способі його викладено у WO 90-07861. У цьому посилише ділянка, що визначає комплементарність ланні зазначається, що лише одна третина акти(CDR) варіабельної ділянки мишачого антитіла вності вихідного мишачого антитіла досягається трансплантують у варіабельну ділянку людського для гуманізованого антитіла, отриманого у споантитіла, одержуючи варіабельну ділянку "реконсіб, викладений у WO 90-07861. Іншими словами, струйованого" людського антитіла. це показує, що спосіб WO 90-07861 сам собою не Однак, для того, щоб зробити структуру варіможе привести до продукування повністю гуманіабельної ділянки реконструйованого людського зованого антитіла, яке б мало активність, що доантитіла якомога більш близькою до структури рівнює активності вихідного мишачого антитіла. вихідного мишачого антитіла, необхідно, щоб [Co et al., Cancer Research (1996) 56, 1118частину амінокислотної послідовності каркасної 1125] опубліковано групою зазначених вище ділянки (FR), яка підтримує CDR, можна було б Queen et al. У цьому посиланні зазначено, що трансплантувати з варіабельної ділянки мишачогуманізоване антитіло, яке має активність, що го антитіла у варіабельну ділянку людського андорівнює активності вихідного мишачого антитітитіла. Потім цю V-ділянку гуманізованого реконла, не можна сконструювати навіть у спосіб оде 7 76934 8 ржання гуманізованих антитіл, як це викладено у тичних цілей, але гуманізовані анти-НМ 1.24 моWO 90-07861. Цей факт не тільки свідчить, що ноклональні антитіла не відомі і навіть не запроспосіб WO 90-07 861 сам собою не може привеспоновані. Крім того, не існує доступного стандарти до одержання повністю гуманізованого антитітного способу, який можна було б застосувати до ла, яке має активність, що дорівнює активності будь-якого з антитіл для одержання гуманізовавихідного мишачого антитіла, але і що цей спосіб ного антитіла, і треба вдаватись до різних хитроконструювання гуманізованого антитіла, як це мудрощів, щоб сконструювати та гуманізувати подано далі у WO 90-07861, не можна застосуваантитіло, яке демонструвало би достатню активти до гуманізації всіх антитіл. ність зв'язування, активність інгібування зв'язу[Ohtomo et al., Molecular Immunology (1995) вання і нейтралізуючу активність [наприклад, 32, 407-416] описує гуманізацію мишачого ONSSato, К. et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1993]. M21 антитіла. З цього посилання випливає, що У цьому винаході запропоновані реконструамінокислотний залишок, який пропонувався для йовані антитіла анти-НМ 1.24 антитіла. Далі у гуманізації анти-Тас антитіла у WO 90-07861, не цьому винаході запропоновано людські/мишачі має відношення до активності, і спосіб у тому химерні антитіла, які можна використовувати у вигляді, як його викладено, у WO 90-07861, не процесі конструювання зазначених реконструйоможе застосовуватись. ваних антитіл. У цьому винаході запропоновано [Kettleborough et al. Protein Eng. (1991) 4, 773фрагменти реконструйованих антитіл. Далі у 783] зазначає, що було сконструйовано кілька цьому винаході запропоновано експресій ну сисгуманізованих антитіл з мишачого антитіла в ретему для одержання химерних реконструйованих зультаті заміни амінокислотних залишків. Однак антитіл антитіл та їх фрагментів. У цьому винапри цьому вимагається заміщення більшого чисході запропоновані способи одержання химерних ла залишків, ніж пропонується у способі гуманіантитіл з анти-НМ 1.24 антитіла та його фрагмензації анти-Тас антитіла, як зазначається у WO 90тів, а також способи одержання реконструйова07 861. них антитіл з анти-НМ 1.24 антитіла та його фраУ наведених вище посиланнях вказано, що гментів. спосіб одержання гуманізованих антитіл, як заБільш конкретно, у цьому винаході запропопропоновано далі у WO 90-07861, являє собою новані химерні антитіла й реконструйовані антиметодику, що є застосовною лише до описаного тіла, які специфічно розпізнають поліпептид з там анти-Тас антитіла, і що навіть використання амінокислотною послідовністю, що її наведено зазначеної методики не приведе до досягнення далі у Послідовності ІД №103. кДНК, яка кодує активності, яка дорівнюватиме активності вихідназваний поліпептид, було вбудовано між ХbаІ ного мишачого антитіла. сайтами розщеплення вектору pUC19, і таким Вихідні мишачі антитіла, що описуються в чином, було одержано як плазміду pRS38-pUC19. цих посиланнях, містять амінокислотні послідовEscherichia coli, що містить цю плазміду pRS38ності, які відрізняються від послідовності антиpUC19, була інтернаціонально депонована 5 жоТас антитіла, описаного у WO 90-07861. Відповівтня 1993 року National Institute of Bioscience and дно, цей спосіб конструювання гуманізованого Human-.Technology, Agency of Industrial Science антитіла, що його можна було застосувати до and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, анти-Тас антитіла, не можна застосувати до інTsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan) як ших антитіл. Аналогічно, оскільки мишаче антиEscherichia coli DH5 (pRS3 8-pUC19) під реєстНМ 1.24 моноклональне антитіло відповідно до раційним номером FERM BP-4434 згідно з Будацього винаходу має амінокислотну послідовність, пештською угодою [див. японську патентну публіщо відрізняється від послідовності анти-Тас антикацію без експертизи (Кокаі) №7-196694]. тіла, не можна застосувати спосіб конструювання Як одне з втілень таких химерних антитіл або гуманізованого антитіла для анти-Тас антитіла. реконструйованих антитіл, згадується химерне Крім того, успішно сконструйоване гуманізоване анти-НМ 1.24 антитіло або реконструйоване людантитіло відповідно до цього винаходу має аміноське анти-НМ 1.24 антитіло. Докладний опис хикислотну послідовність, яка відрізняється від померного анти-НМ 1.24 антитіла або реконструйослідовності гуманізованого анти-Тас антитіла, ваного людського анти-НМ 1.24 антитіла буде описаного у WO 90-07861. Цей факт також вказує наведено далі. на те, що один і той самий спосіб не можна викоТак, у даному винаході запропоновані також ристовувати для гуманізації антитіл з різними химерні L-ланцюги, що включають константну CDR-FR послідовностями. ділянку (С-ділянку) людського легкого (L-) ланцюТаким чином, навіть якщо вихідне гуманізога і варіабельну (V-) ділянку L-ланцюга анти-НМ ване мишаче антитіло відомо, ідентичність CDR1.24 антитіла, та химерний Η-ланцюг, що включає FR послідовності гуманізованого антитіла, що константну ділянку людського важкого (Н-) ланмає активність, підтверджується лише методом цюга і V-ділянку важкого (Н-) ланцюга анти-НМ спроб і помилок. У WO 90-07861 не згадується 1.24 антитіла. про FR послідовність, що об'єднана у гуманізоваДалі у цьому винаході запропоновано химерному антитілі, сконструйованому у цьому винахоні антитіла, що включають: ді, а також про той факт, що активне гуманізова(1) L-ланцюг, який включає С-ділянку людсьне антитіло можна отримати з комбінації з FR, кого L-ланцюга і V-ділянку L-ланцюга анти-НМ значно меншої послідовності CDR. 1.24 антитіла; і Як зазначалось вище, гуманізовані антитіла, (2) Η-ланцюг, який включає С-ділянку людсьяк очікують, повинні бути корисними для терапевкого Η-ланцюга і V-ділянку Η-ланцюга анти-НМ 9 76934 10 1.24 антитіла. (1) С-ділянку людського L-ланцюга; і Далі у цьому винаході запропоновано V(2) V-ділянку L-ланцюга, що включає FR людділянку реконструйованого людського L-ланцюга ського L-ланцюга та CDR L-ланцюга анти-НМ анти-НМ 1.24 антитіла, що включає: 1.24 антитіла; та (1) каркасну ділянку (FR) V-ділянки людського ДНК, яка кодує реконструйований людський L-ланцюга, та Η-ланцюг анти-НМ 1.24 антитіла, що включає: (2) CDR V-ділянки L-ланцюга анти-НМ 1.2 4 (1) С-ділянку людського Η-ланцюга; і антитіла; і V-ділянку реконструйованого людсько(2) V-ділянку Η-ланцюга, що включає FR го Η-ланцюга анти-НМ 1.2 4 антитіла, що вклюлюдського Н-ланцюга і CDR Η-ланцюга анти-НМ чає: 1.24 антитіла. (1) FR V-ділянки людського Η-ланцюга, і Далі у цьому винаході запропоновано вектор, (2) CDR V-ділянки Η-ланцюга анти-НМ 1.24 який включає будь-яку з зазначених вище ДНК. антитіла. Далі у цьому винаході запропоновано У даному винаході запропонована клітинареконструйований людський L-ланцюг антихазяїн, трансформована названим вище вектоНМ 1.24 антитіла, що включає; ром. (1) С-ділянку людського L-ланцюга, та У цьому винаході запропоновані способи (2) V-ділянку L-ланцюга, яка включає FR одержання химерного антитіла анти-НМ 1.24 анлюдського L-ланцюга, і CDR L-ланцюга анти-НМ титіла, які включають стадії культивування кліти1.24 антитіла; і ни-хазяїна, яку було котрансформовано експререконструйований людський Η-ланцюг антисувальним вектором, що включає ДНК, яка кодує НМ 1.24 антитіла, що включає: названий химерний L-ланцюг, і з вектором екс(1) С-ділянку людського Η-ланцюга, і пресії, що включає ДНК, яка кодує зазначений Η(2) V-ділянку Η-ланцюга, яка включає FR ланцюг, та виділення бажаного антитіла. людського Н-ланцюга, та CDR Η-ланцюга антиДалі у цьому винаході запропоновані способи НМ 1.24 антитіла. одержання реконструйованого людського антитіДалі у цьому винаході запропоновано реконла анти-НМ 1.24 антитіла, які включають стадії струйоване людське антитіло анти-НМ 1.24 антикультивування клітини-хазяїна, яку було котрантіла, що включає: сформовано експресувальним вектором, що (A) L-ланцюг, який включає: включає ДНК, яка кодує зазначений реконструйо(1) С-ділянку людського L-ланцюга; та ваний людський L-ланцюг, і з вектором експресії, (2) V-ділянку L-ланцюга, що включає FR людщо включає ДНК, яка кодує названий реконструського L-ланцюга і CDR L-ланцюга анти-НМ 1.24 йований людський Η-ланцюг, та виділення бажаантитіла; і ного антитіла. (B) Н-ланцюг, який включає: Далі у цьому винаході запропоновані фарма(1) С-ділянку людського Η-ланцюга, і цевтичні композиції, особливо терапевтичні аген(2) V-ділянку Η-ланцюга, яка включає FR ти для лікування мієломи, які містять зазначене людського Н-ланцюга і CDR Η-ланцюга анти-НМ химерне антитіло або реконструйоване людське 1.24 антитіла. антитіло. Цей винахід пропонує далі ДНК, що кодує VДалі у цьому винаході запропоновані фармаділянку L-ланцюга анти-НМ 1.24 антитіла, і ДНК, цевтичні композиції, що містять як активний інгяка кодує V-ділянку Н-ланцюга анти-НМ 1.24 анредієнт химерне антитіло, яке специфічно розпітитіла. знає поліпептид з амінокислотною послідовністю, Далі цей винахід пропонує ДНК, яка кодує наведеною у Послідовності ІД №103, та фармахимерний L-ланцюг, що включає: цевтичні композиції, що містять як активний інг(1) С-ділянку людського L-ланцюга; і редієнт реконструйоване людське антитіло, яке (2) V-ділянку L-ланцюга анти-НМ 1.2 4 антитіспецифічно розпізнає поліпептид з амінокислотла, та ДНК, яка кодує химерний Η-ланцюг, що ною послідовністю, наведеною в Послідовності ІД включає: №103. Як фармацевтичну композицію конкретно (1) С-ділянку людського Η-ланцюга; і запропоновано терапевтичний агент для лікуван(2) V-ділянку Η-ланцюга анти-НМ 1.24 антиня мієломи. тіла. Фіг.1 являє собою графік, який демонструє, Даний винахід пропонує далі що в FCM аналізі з використанням клітинної лінії ДНК, що кодує V-ділянку реконструйованого мієломи людини КРММ2, інтенсивність флуореслюдського L-ланцюга анти-НМ 1.24 антитіла, що ценції химерного анти-НМ 1.24 антитіла зсувавключає: ється аналогічно до зсуву для мишачого анти-НМ (1) FR V-ділянки людського L-ланцюга; і 1.2 4 антитіла, при порівнянні з контрольним ан(2) CDR V-ділянки L-ланцюга анти-НМ 1.24 титілом. антитіла; та ДНК, яка кодує V-ділянку реконструФіг.2 являє собою графік, який демонструє, йованого людського Н-ланцюга анти-НМ 1.24 що в клітинному ELISA з використанням WISHантитіла, що включає: клітин, химерне анти-НМ 1.24 антитіло по анало(1) FR V-ділянки людського Η-ланцюга; і гії з мишачим анти-НМ 1.24 антитілом дозозале(2) CDR V-ділянки Η-ланцюга анти-НМ 1.24 жно інгібує зв'язування біотинільованого мишачоантитіла. го анти-НМ 1.24 антитіла з WISH-клітинами. У цьому винаході запропоновано Фіг.3 являє собою графік, який демонструє, ДНК, яка кодує реконструйований людський що контрольний людський IgGl або мишаче антиL-ланцюг анти-НМ 1.24 антитіла, що включає: НМ 1.24 антитіло не мають цитотоксичності, тоді 11 76934 12 як химерне анти-НМ 1.24 антитіло демонструє Фіг.17 являє собою графік, який демонструє підвищену цитотоксичність щодо RPMI 8226 кліактивність зв'язування антигену варіантів а, b, с і f тин при зростанні відношення Е/Т. Н-ланцюга реконструйованого людського антиФіг.4 являє собою схему способу конструюНМ 1.24 антитіла і химерного анти-НМ 1.24 антивання L-ланцюга реконструйованого людського тіла. анти-НМ 1.24 антитіла в результаті трансплантаФіг.18 являє собою графік, який демонструє ції CDR методом ПЛР. активність зв'язування антигену варіантів а та g Фіг.5 являє собою схему способу складання Η-ланцюга реконструйованого людського антиолігонуклеотидів RVH1, RVH2, RVH3 і RVH4 меНМ 1.24 антитіла і химерного анти-НМ 1.24 антитодом ПЛР при створенні Η-ланцюга реконструтіла. йованого людського анти-НМ 1.24 антитіла. Фіг.19 являє собою графік, який демонструє Фіг.6 являє собою схему способу конструюактивність інгібування зв'язування варіантів а і g вання V-ділянки Η-ланцюга людського/мишачого Η-ланцюга реконструйованого людського антигібридного анти-НМ 1.24 антитіла методом ПЛР. НМ 1.24 антитіла і химерного анти-НМ 1.24 антиФіг.7 являє собою схему способу конструютіла. вання V-ділянки Н-ланцюга мишачого/людського Фіг.20 являє собою графік, який демонструє гібридного анти-НМ 1.24 антитіла методом ПЛР. активність зв'язування антигену варіантів h і і НФіг.8 являє собою графік, який демонструє, ланцюга реконструйованого Η людського антищо варіант а L-ланцюга реконструйованого людНМ 1.24 антитіла і химерного анти-НМ 1.24 антиського анти-НМ 1.24 антитіла має антигентіла. зв'язувальну активність, що дорівнює активності Фіг.21 являє собою графік, який демонструє химерного анти-НМ 1.24 антитіла. -1 і -2 вказують активність зв'язування антигену варіантів f, h, і j на те, що це різні групи. Η-ланцюга реконструйованого людського антиФіг.9 являє собою графік, який демонструє НМ 1.24 антитіла і химерного анти-НМ 1.24 антиантиген-зв'язувальну активність реконструйоватіла. ного людського анти-НМ 1.24 антитіла, де варіант Фіг.22 являє собою графік, який демонструє a L-ланцюга і варіант a, b, f або h Η-ланцюга були активність інгібування зв'язування варіантів h та і об'єднані, і химерного анти-НМ 1.24 антитіла. Н-ланцюга реконструйованого людського антиФіг.10 являє собою графік, якай демонструє НМ 1.24 антитіла і химерного анти-НМ 1.24 антиактивність зв'язування реконструйованого людсьтіла. кого анти-НМ 1.24 антитіла, де варіант b LФіг.23 являє собою графік, який демонструє ланцюга і варіант a, b, f або h H-ланцюга були активність інгібування зв'язування варіантів f, h і j об'єднані, і химерного анти-НМ 1.24 антитіла. Н-ланцюга реконструйованого людського антиФіг.11 являє собою графік, який демонструє НМ 1.24 антитіла і химерного анти-НМ 1.24 антиактивність інгібування зв'язування реконструйотіла. ваного людського анти-НМ 1.24 антитіла, де варіФіг.24 являє собою графік, який демонструє ант a L-ланцюга і варіант a, b, f або h Η-ланцюга активність зв'язування антигену варіантів h, k, I, були об'єднані, і химерного анти-НМ 1.24 антиm, n і о Н-ланцюга реконструйованого людського тіла. анти-НМ 1.24 антитіла і химерного анти-НМ 1.24 Фіг.12 являє собою графік, який демонструє антитіла. активність інгібування зв'язування реконструйоФіг.25 являє собою графік, який демонструє ваного людського анти-НМ 1.24 антитіла, де варіактивність зв'язування антигену варіантів a, h, p і ант b L-ланцюга і варіант a, b, f або h Η-ланцюга q Η-ланцюга реконструйованого людського антибули об'єднані, і химерного анти-НМ 1.24 антиНМ 1.24 антитіла і химерного анти-НМ 1.24 антитіла. тіла. Фіг.13 являє собою графік, який демонструє Фіг.26 являє собою графік, який демонструє активність зв'язування антигену варіантів а, b, с активність інгібування зв'язування з WISHта d Н-ланцюга реконструйованого людського клітинами варіантів h, k, 1, m, n і о Н-ланцюга анти-НМ 1.24 антитіла, і химерного анти-НМ 1.24 реконструйованого людського анти-НМ 1.24 анантитіла. титіла та химерного анти-НМ 1.24 антитіла. Фіг.14 являє собою графік, який демонструє Фіг.27 являє собою графік, який демонструє активність зв'язування антигену варіантів а і є Нактивність інгібування зв'язування варіантів a, h, ланцюга реконструйованого людського анти-НМ p і q Η-ланцюга реконструйованого людського 1.24 антитіла, і химерого анти-НМ 1.24 антитіла. анти-НМ 1.24 антитіла і химерного анти-НМ 1.24 1 і -2 вказують на те, що вони належать до різних антитіла. груп. Фіг.28 являє собою графік, який демонструє Фіг.15 являє собою графік, який демонструє активність зв'язування антигену варіантів а, с, р активність інгібування зв'язування варіантів а, с, та r Н-ланцюга реконструйованого людського p та r Н-ланцюга реконструйованого людського анти-НМ 1.24 антитіла і химерного анти-НМ 1.24 анти-НМ 1.24 антитіла, і химерного анти-НМ 1.24 антитіла. антитіла. Фіг.29 являє собою графік, який демонструє, Фіг.16 являє собою графік, який демонструє що варіант s реконструйованого людського антиактивність зв'язування антигену людськоНМ 1.24 антитіла має антиген-зв'язувальну актиго/мишачого гібридного анти-НМ 1.24 антитіла, вність, яка дорівнює активності варіанту г реконсмишачого/людського гібридного анти-НМ 1.24 труйованого людського анти-НМ 1.24 антитіла. антитіла та химерного анти-НМ 1.24 антитіла. Фіг.30 являє собою графік, який демонструє, 13 76934 14 що варіант s реконструйованого людського антилюдського анти-НМ 1.24 антитіла, інгібує підвиНМ 1.24 антитіла має активність інгібування зв'ящення рівня людського IgG у сироватці. зування, що дорівнює активності варіанту г рекоФіг.40 являє собою графік, який демонструє, нструйованого людського анти-НМ 1.24 антитіла. що у мишей з трансплантованими мієломними Фіг.31 являє собою графік, який демонструє, клітинами людини. введення реконструйованого що очищене реконструйоване людське анти-НМ людського анти-НМ 1.24 антитіла, спричинює 1.24 антитіло має активність зв'язування антигепролонгування періоду виживання порівняно з ну, яка дорівнює активності химерного анти-НМ періодом після введення мелфалану або контро1.24 антитіла. льного людського IgG1. Фіг.32 являє собою графік, який демонструє, 1. Конструювання химерного антитіла що очищене реконструйоване анти-НМ 1.24 ан(1) Клонування ДНК, яка кодує V-ділянку мититіло має активність інгібування зв'язування, що шачого анти-НМ 1.24 моноклонального антитіла дорівнює активності химерного анти-НМ 1.24 анОдержання мРНК титіла. Для клонування ДНК, шо кодує V-ділянку Фіг.33 являє собою графік, який демонструє, мишачого анти-НМ 1.24 моноклонального антитіщо введення химерного анти-НМ 1.24 антитіла ла, одержують повну РНК з виділеної гибридоми, спричинює подовження часу життя порівняно з використовуючи відомий спосіб, такий як спосіб з введенням контрольного людського IgGl у мишей використанням гуанідин-ультрацентрифугування з трансплантованими клітинами мієломи людини. [Chirgwin, J. Μ. et al., Biochemistry (1979), 18, Фіг.34 являє собою графік, який демонструє, 5294-5299], спосіб AGPC [Chomczynski, P. et al, що якщо клітини, отримані з периферійної крові (1987), 162, 156-159] тощо, і мРНК одержують, здорової людини, використовують як ефекторні використовуючи спан-колонку з оліго(дТ)клітини, контрольний людський IgGl не демонцелюлозою, доповненою з набором для очищенструє цитотоксичності відносно до клітин КРММ2, ня мРНК (mRNA Purification Kit, Pharmacia) тощо. і що мишаче анти-НМ 1.24 антитіло також має Крім того, використовуючи QuickPrep mRNA слабку цитотоксичність, тоді як реконструйоване Purification Kit (Pharmacia), мРНК можна одержалюдське анти-НМ 1.24 антитіло демонструє висоти без стадії виділення повної РНК. ку цитотоксичність щодо клітин КРММ2. Одержання і ампліфікація кДНК Фіг.35 являє собою графік, який демонструє, З мРНК, отриманої на наведеній вище стадії що якщо використовують клітини, отримані з пеодержання мРНК, кожну кДНК для V-ділянок Lриферійної крові здорової людини, як еффекторні ланцюга і Η-ланцюга синтезують, використовуюклітини, контрольний людський IgG1 не демончи зворотну транскриптазу. кДНК V-ділянки Lструє цитотоксичності відносно до клітин ARH-77, ланцюга синтезують, використовуючи набір для і що мишаче анти-НМ 1.24 антитіло також має синтезу першого ланцюжка кДНК AMV зворотної слабку цитотоксичність, тоді як реконструйоване транскриптази (AMV Reverse Transcriptase Firstлюдське анти-НМ 1.24 антитіло демонструє висоStrand cDNA Synthesis Kit). Для ампліфікації синку цитотоксичність відносно до клітин ARH-77. тезованої кДНК використовують відповідний Фіг.36 являє собою графік, який демонструє, праймер, який гибридизується з лідерною посліщо якщо як еффекторні клітини використовують довністю і С-ділянкою гену антитіла (наприклад, клітини, отримані з кісткового мозку мишей SCID, праймер MKV, нуклеотидна послідовність якого контрольний людський IgGl не демонструє цитопредставлена Послідовностями ІД №29-39, і токсичності відносно до клітин КРММ2, тоді як праймер МКС нуклеотидна послідовність якого реконструйоване людське анти-НМ 1.24 антитіло представлена Послідовністю ІД №40). демонструє цитотоксичність відносно до клітин Синтез та ампліфікацію кДНК V-ділянки ΗКРММ2, яка підвищується із зростанням концентланцюга можна здійснити за допомогою ПЛР (порації антитіл. лімеразної ланцюгової реакції) методом 5'-RACE Фіг.37 являє собою графік, який демонструє, [Frohman, Μ. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, що у мишей з трансплантованими клітинами міє85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic. Acids ломи людини рівень людського IgG у сироватці Res. 17, 2919-2932, 1989], використовуючи набір підвищується після введення контрольного люд5'-Ampli FINDER RACE (CLONTECH). 3 5'-кінцем ського IgG1 порівняно з рівнем до його введення, синтезованої раніше кДНК лігують Ampli FINDER тоді як введення реконструйованого людського Anchor, а як праймер для ампліфікації V-ділянки анти-НМ 1.24 антитіла інгібує підвищення рівня Η-ланцюга, можна використовувати праймер, людського IgG у сироватці. який специфічно гибридизується з праймером Фіг.38 являє собою графік, який демонструє, Anchor (Послідовність ІД №77) і константною діщо у мишей з трансплантованими мієломними лянкою (С -ділянка) мишачого Η-ланцюга (наприклітинами людини введення реконструйованого клад, праймер МНС2а, нуклеотидна послідовлюдського анти-НМ 1.24 антитіла спричинює поність якого представлена послідовністю ІД №42) довження часу життя порівняно із строком після Виділення ДНК і визначення її нуклеотидної введення контрольного IgG1 людини. послідовності Фіг.39 являє собою графік, який демонструє, Продукт ПЛР піддають електрофорезу в агащо у мишей з трансплантованими мієломними розному гелі, використовуючи відомі методики, клітинами людини рівень людського IgG у сиродля вирізання потрібного ДНК фрагменту, і ДНК ватці підвищується після введення мелфалану і виділяють з нього та очищають, а потім лігують з контрольного людського IgG1 порівняно з рівнем векторною ДНК. до введення, тоді як введення реконструйованого ДНК можна очистити, використовуючи коме 15 76934 16 рційний набір (наприклад, GENECLEAN II; ділянку людського антитіла, вже присутнього в ВІО101). Відому векторну ДНК (наприклад, експресувальному векторі для клітин ссавців. В pUC19, Bluescript тощо) можна використовувати іншому варіанті він включає зв'язування мишачої для зберігання фрагментів ДНК. лідерної послідовності з послідовністю V-ділянки, Зазначену вище ДНК і зазначений вище веквже наявної у клонованій кДНК, з послідовністю, тор лігують, використовуючи відомий набір для що кодує С-ділянку людського антитіла, що потім літування (виробник Takara Shuzo) для одержанзв'язують з вектором експресії для клітин ссавців. ня рекомбінантного вектору. Потім одержаний С-ділянка людського антитіла може бути Срекомбінантний вектор вводять в Escherichia coli ділянкою будь-якого Η-ланцюга і С-ділянкою JM109, після чого стійкі до ампіциліну колонії відбудь-якого L-ланцюга. Так, можна, наприклад, бирають, і векторну ДНК одержують на основі згадати C 1, С 2, С 3 або С 4 людського Ηвідомого методу [J. Sambrook, et al. , "Molecular ланцюга, або C чи С L-ланцюга. Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Для одержання химерного антитіла констру1989]. юють два типи експресувальних векторів: вони Після розщеплення зазначеної вище векторявляють собою експресувальний вектор, який ної ДНК ферментами рестрикції, у відомий спосіб включає ДНК, що кодує V-ділянку мишачого Lвизначають нуклеотидну послідовність бажаної ланцюга і С-ділянку людського L-ланцюга під конДНК (наприклад, "дидезокси" методом) [J. тролем ділянки, що регулює експресію, такої, як Sambrook, et al., "Molecular Cloning", Cold Spring система енхансер/промотор, і експресувальний Harbor Laboratory Press, 1989]. Згідно з цим винавектор, який включає ДНК, що кодує V-ділянку ходом можна використовувати автоматичну сисмишачого Η-ланцюга, і С-ділянку людського Ηтему секвенування (DNA Sequencer 373A; виробланцюга під контролем ділянки, яка регулює ексник АВІ Co. Ltd.). пресію, такої, як система енхансер/промотор. Ділянка, що визначає комплементарність Потім, використовуючи ці експресувальні вектоV-ділянка Η-ланцюга і V-ділянка L-ланцюга ри, піддають котрансформації такі клітини хазяїутворюють антиген-зв'язувальний сайт, причому на, як клітини ссавців, і ці трансформовані клітиїх повні структури мають аналогічні властивості. ни культивують in vitro або in vivo, одержуючи Так, кожна з чотирьох каркасних ділянок (FR) химерне антитіло (наприклад, WO 91-16928). лігували з трьома гіперваріабельними ділянками, В іншому варіанті, ДНК, яка кодує мишачу літобто ділянками, які визначають комплементардерну послідовність та V-ділянку L-ланцюга і Сність (CDR). Амінокислотні послідовності FRs ділянку людського L-ланцюга, та ДНК, яка кодує були відносно стійко консервативними, тоді як мишачу лідерну послідовність, та V-ділянку Ηсеред амінокислотних послідовностей CDR діляланцюга і С-ділянку людського Η-ланцюга, преднок варіації трапляються надзвичайно часто ставлені у клонованій кДНК, вводять в один екс[Rabat, E. A. et al., "Sequence of Proteins of пресувальний вектор [див. публікацію міжнародImmunological Interest", US Dept. Health and ної заявки WO 94-11523], і клітину-хазяїна Human Services, 1983]. трансформують, використовуючи названий векЧисленні частини зазначених вище чотирьох тор. Потім цю трансформовану клітину-хазяїна FRs набувають структури -листа, що веде до культивують in vitro або in vivo, одержуючи цільоутворення трьох CDR-петель. ве химерне антитіло. Інколи CDR можуть складати частину струк1) Конструювання химерного Η-ланцюга тури -листа. Три CDR стерично зберігаються у Вектор експресії для Η-ланцюга химерного тісній близькості одна до одної, і утворюють антиантитіла можна отримати в результаті введення ген-зв'язувальний сайт з трьома CDR ділянками кДНК, що кодує V-ділянку мишачого Η-ланцюга, у спарювання. відповідний експресувальний вектор експресії, На основі цих фактів амінокислотну послідоякий містить геномну ДНК або кДНК, яка кодує Свність варіабельної ділянки мишачого анти-НМ ділянку Η-ланцюга людського антитіла. Як С1.24 антитіла підігнано до даних для амінокислоділянки Η-ланцюга можна назвати, наприклад, тних послідовностей антитіл, отриманих [Kabat et C 1, С 2, С 3 або С 4. al. "Sequence of Proteins of Iiranunological Interest", Конструювання експресувального вектору US Dept. Health and Human Services, 1983], для для химерного Η-ланцюга, що містить геномну дослідження гомології і, таким чином, для визнаДНК для С 1 чення CDR ділянок. Як експресувальний вектор, що містить гено(2) Конструювання векторів експресії для химну ДНК для С 1, як С-ділянку Η-ланцюга, можна мерного антитіла використовувати, наприклад, HFE-PMh-g 1 (пубПісля того, як клоновано фрагмент ДНК, який лікації міжнародної заявки WO 92/19759), або кодує V-ділянки мишачого L-ланцюга і Η-ланцюга DHFR- Ε-RVh-PM1f [публікація міжнародної заямишачого моноклонального антитіла, можна вки WO 92/19759]. отримати химерне анти-НМ 1.24 антитіло за раДля вбудовування кДНК, що кодує V-ділянку хунок зв'язування цих мишачих V-ділянок з ДНК, мишачого Н-ланцюга в ці експресувальні вектори, що кодує константну ділянку людського антитіла, можна методом ПЛР ввести підхожі нуклеотидні і подальшої їх експресії. послідовності. Ці підхожі нуклеотидні послідовноОсновний спосіб конструювання химерного сті можна ввести методом ПЛР, використовуючи антитіла включає зв'язування мишачої лідерної ПЛР-праймер, сконструйований так, щоб він міспослідовності та послідовності V-ділянки, наявної тив послідовність, що розпізнає, для підхожого у клонованій кДНК, з послідовністю, що кодує Сферменту рестрикції 5'-кінця, та консенсусну пос 17 76934 18 лідовність Kozak безпосередньо перед стартовим геномною ДНК або кДНК, що кодує С-ділянку Lкодоном, та ПЛР-праймер, сконструйований так, ланцюга людського антитіла, а потім вводячи її у щоб він включав з 3'-кінця послідовність, що розпідхожий експресувальний вектор. Як С-ділянку пізнає, для відповідного ферменту рестрикції, та L-ланцюга можна назвати, наприклад, -ланцюг сплайсинговий донорний. сайт, де первинний або -ланцюг. транскрипт геномної ДНК піддається відповідноКонструювання експресувального вектору му сплайсингу, для перетворення на мРНК. для к-ланцюга кДНК химерного L-ланцюга Сконструйовану таким чином кДНК, яка кодує Для конструювання експресувального вектоV-ділянку мишачого Η-ланцюга, обробляють підру, який містить кДНК, яка кодує V-ділянку мишахожими ферментами рестрикції, вбудовують у чого L-ланцюга, можна ввести підхожу нуклеотизазначений вище експресувальний вектор, і мождну послідовність, використовуючи метод ПЛР. на сконструювати химерний Η-ланцюгТак наприклад, ці підхожі нуклеотидні послідовекспресувальний вектор, що включає ДНК C 1. ності можна ввести методом ПЛР, використовуюКонструювання експресувального вектору чи ПЛР-праймер, сконструйований таким чином, для кДНК химерного Н-ланцюга щоб він містив послідовність, що розпізнає, для Експресувальний вектор, що містить кДНК підхожого ферменту рестрикції і консенсусну поС 1 як С-ділянку Η-ланцюга, можна сконструюваслідовність Kozak у 5'-кінця, та ПЛР-праймер, ти так. Його можна сконструювати, одержуючи сконструйований таким чином, щоб він містив мРНК з СНО-клітини, в якій були інтегровані експослідовність, що розпізнає, для підхожого ферменту рестрикції 3'-кінця. пресувальний вектор DHFR- E-RVh-PM1f [публікація міжнародної заявки WO 92/19759], що кодує С-ділянку -ланцюга людського L-ланцюга геномну ДНК V-ділянки Η-ланцюга гуманізованого для зв'язування з V-ділянкою мишачого Lланцюга можна сконструювати, наприклад, з РМ1 антитіла і С-ділянку С 1 Η-ланцюга людськоHEF-PM1k-g [публікація міжнародної заявки WO го антитіла [N. Takahashi, et al., Cell 29, 671-679, 1982], і експресувальний вектор RV1-PM1a [пуб92/19759], що містить геномну ДНК. Вектор екслікація міжнародної заявки WO 92/19759], що пресії для к-ланцюга L-ланцюга кДНК химерного кодує геномну ДНК V-ділянки L-ланцюга гуманіантитіла можна сконструювати, вводячи послідовності, що розпізнають, підхожих ферментів ресзованого РМ1 антитіла і С-ділянку -ланцюга гутрикції з 5'-кінця або з 3'-кінця ДНК, що кодує Сманізованого РМ1 антитіла, і С-ділянка к-ланцюга L-ланцюга людського антитіла; клонуючи кДНК, ділянку -ланцюга L-ланцюга методом ПЛР, лігущо включає V-ділянку Η-ланцюга гуманізованого ючи сконструйовану таким чином V-ділянку мишачого L-ланцюга з С-ділянкою к-ланцюга LРМ1 антитіла і С-ділянку С 1 Η-ланцюга людськоланцюга, а потім вбудовуючи у такий експресуго антитіла методом ОТ-ПЛР; та лігуючи в підховальний вектор, як pCOS1 або рСНО1. жий експресувальний вектор для клітин тварин, 2. Конструювання реконструйованого людсьвикористовуючи підхожі сайта для ферментів кого антитіла рестрикції. (1) Конструювання V-ділянки реконструйоваДля безпосереднього літування кДНК, що коного людського анти-НМ 1.24 антитіла дує V-ділянку мишачого Η-ланцюга з кДНК, що Для конструювання реконструйованого людмістить С-ділянку С 1 Н-ланцюга людського анського антитіла, в якому CDR мишачого моноклотитіла, можна ввести підхожі нуклеотидні послінального антитіла було трансплантовано у люддовності методом ПЛР. Так наприклад, ці підхожі ське антитіло, бажано, щоб існувала нуклеотидні послідовності можна ввести методом гомологічність між FR мишачого моноклональноПЛР, використовуючи ПЛР-праймер, сконструйого антитіла і FR людського антитіла. Так, Vваний таким чином, що він містить послідовність, ділянки L-ланцюга і Η-ланцюга мишачого антищо розпізнає, для підхожого ферменту рестрикції НМ 1.24 антитіла порівнюють з V-ділянками всіх з 5'-кінця та консенсусну послідовність Kozak відомих антитіл, структури яких було встановлебезпосередньо перед стартовим кодоном, і ПЛРно, використовуючи банк даних Protein Data Bank. праймер, сконструйований таким чином, що він V-ділянка L-ланцюга мишачого анти-НМ 1.24 містить послідовність, що розпізнає, для підхожоантитіла є найбільш близькою до консенсусної го ферменту рестрикції, який використовується послідовності підгрупи IV V-ділянки L-ланцюга для прямого літування С-ділянки С 1 Η-ланцюга людського антитіла (HSGIV) з гомо логічністю у 3'-кінця. 66,4%. З іншого боку, вона демонструє гомологіЕкспресувальний вектор, що містить кДНК чність 56,9%, 55,8% і 61,5% з HSGI, HSGII і химерного Н-ланцюга, можна сконструювати, HSGIII, відповідно. обробляючи сконструйовану таким чином кДНК, V-ділянка L-ланцюга мишачого анти-НМ 1.24 яка кодує V-ділянку мишачого Η-ланцюга, підхоантитіла, при порівнянні з V-ділянкою L-ланцюга жим ферментом рестрикції, лігуючи з вищезазнавідомих людських антитіл, демонструє гомологічченою кДНК, що містить С-ділянку С 1 Ηність 67,0% з V-ділянкою L-ланцюга людського ланцюга, і вбудовуючи у такий експресувальний антитіла REI, одного з підгрупи І V-ділянки Lвектор, як pCOS1 або рСНО1. ланцюга людського антитіла. Тому FR з REI ви2) Конструювання L-ланцюга химерного антикористовують як вихідний матеріал для конструтіла ювання V-ділянки L-ланцюга реконструйованого Експресувальний вектор для L-ланцюга хилюдського анти-НМ 1.24 антитіла. мерного антитіла можна отримати, зв'язуючи Конструюють варіант а V-ділянки L-ланцюга кДНК, яка кодує V-ділянку мишачого L-ланцюга, з реконструйованого людського анти-НМ 1.24 ан 19 76934 20 титіла. У цьому варіанті FR людського антитіла тять антисмислову послідовність ДНК, причому роблять ідентичним FR на основі REI, присутньокожен містить послідовність ДНК (20-23п.н.), комго у реконструйованому людському САМРАТН-ІН плементарну до послідовності ДНК у 5'-кінця антитілі [див. Riechmann, L. et al. , Nature 322, 21праймерів L1S, L2S і L3S, відповідно. 25 (1988), FR, що міститься у варіанті а V-ділянки На першій стадії ПЛР здійснюють чотири реаL-ланцюга реконструйованого людського РМ-1 кції: A-L1A, L1S-L2A, L2S-L3A та L3S-H, і кожен антитіла, описаного в публікації міжнародної заяпродукт ПЛР очищають. Чотирьом продуктам вки WO 92/19759], і мишачий CDR роблять іденПЛР з першої ПЛР дають можливість зв'язатися тичним з CDR у V-ділянці L-ланцюга мишачого один з одним згідно з їх власною комплементаранти-НМ 1.24 антитіла. ністю [див. WO 92-19759]. Потім додають зовнішV-ділянка Η-ланцюга мишачого анти-НМ 1.24 ні праймери А і Η для ампліфікації повної довжиантитіла найбільш близька до консенсусної посни ДНК, що кодує V-ділянку L-ланцюга лідовності V-ділянки Н-ланцюга людського антиреконструйованого людського анти-НМ 1.24 антіла (HSGI) з гомологічністю 54,7%. З іншого боку, титіла (друга ПЛР). У зазначеній вище ПЛР як вона демонструє гомологічність 34,6% та 48,1% з матрицю можна використовувати плазміду HEFHSGII і HSGIII, відповідно. При порівнянні VRVL-M21a [публікація міжнародної заявки WO 95ділянки Η-ланцюга мишачого анти-НМ 1.24 анти14041], що кодує варіант а V-ділянки L-ланцюга тіла з V-ділянкою Η-ланцюга відомих людських реконструйованого людського ONS-M21 антитіла, антитіл, виявляється, що FR1 до FR3 найбільш основаного на FR, отриманого з людського антиблизькі з V-ділянкою Η-ланцюга людського антитіла REI. тіла HG3, одного з підгрупи І V-ділянки людського На першій стадії ПЛР використовують матриΗ-ланцюга [Rechavi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. чну ДНК і кожний з праймерів. USA, 80, 855-859] з гомо логічністю 67,3%. Продукти ПЛР A-L1A (215п.н.), L1S-L2A Тому FR людського антитіла HG3 використо(98п.н.), L2S-L3A (140п.н.) і L3S-H (151п.н.) очивують як вихідний матеріал для конструювання щають, використовуючи 1,5% агарозний гель з V-ділянки Η-ланцюга реконструйованого людсьнизькою температурою плавлення, і з'єднують у кого анти-НМ 1.24 антитіла. другій ПЛР. У другій ПЛР використовують кожний Однак, оскільки амінокислотну послідовність продукт першої ПЛР і кожний зовнішній праймер FR4 людського антитіла HG3 не було описано, як (А та Н). FR4 використовують амінокислотну послідовність Фрагмент ДНК завдовжки 516п.н., отриманий FR4 людського антитіла JH6 [Ravetch, J. V. et al. , у другій ПЛР, очищають, використовуючи 1,5% Cell, 27, 583-591], яка демонструє найвищу гомоагарозний гель з низькою температурою плавлогічність з FR4 мишачого анти-НМ 1.24 антитіла. лення, розщепляють ВаmНІ і Hindlll, і отримані FR4 JH6 має ту ж саму амінокислотну послідовтаким чином фрагменти клонують в HEF експреність, що і FR4 Н-ланцюга мишачого анти-НМ сувальний вектор HEF-VL-g . Після визначення 1.24 антитіла, за винятком лише однієї амінокиспослідовності ДНК плазміду, що містить фраглоти. мент ДНК з правильною амінокислотною посліУ першому варіанті а V-ділянки Η-ланцюга довністю V-ділянки L-ланцюга реконструйованого реконструйованого людського анти-НМ 1.24 анлюдського анти-НМ 1.24 антитіла, називають титіла, FR1-FR3 роблять ідентичними до FR1плазмідою HEF-RVLa-AHM-g . Амінокислотна FR3 людського антитіла HG3, за винятком того, послідовність і нуклеотидна послідовність Vщо амінокислоти у положенні 30 в людського FR1 ділянки L-ланцюга, які містяться в цій плазміді і в положенні 71 людського FR3 роблять ідентичHEF-RVLa-AHM-g , наведені у Послідовності ІД ними амінокислотам мишачого анти-НМ 1.24 ан№9. титіла, і CDR роблять ідентичним CDR в VВаріант b V-ділянки L-ланцюга реконструйоділянці Н-ланцюга мишачого анти-НМ 1.24 антиваного людського анти-НМ 1.24 антитіла, можна тіла. сконструювати за допомогою мутагенезу, викори(2) Конструювання V-ділянки L-ланцюга рекостовуючи ПЛР. Праймери мутагенезу FTY-1 (Понструйованого людського анти-НМ 1.24 антитіла. слідовність ІД №55) і FTY-2 (Послідовність ІД L-ланцюг реконструйованого людського анти№56) сконструйовані таким чином, щоб здійснити НМ 1.24 антитіла конструюють, використовуючи мутацію фенілаланіну у положенні 71 на тирозин. трансплантацію CDR методом ПЛР. Цей метод Після того, як вищезазначені праймери ампсхематично подано на Фіг.4. Вісім ПЛР-праймерів ліфіковані з використанням плазміди HEF-RVLaвикористовують для конструювання реконструйоAHM-g як матриці, кінцевий продукт очищають. ваного людського анти-НМ 1.24 антитіла (варіант Розщепляючи ВаmНІ і Hindlll, одержані фрагмена), що містить FR, отриманий з людського антитіти ДНК клонують в HEF експресувальний вектор ла REI. Зовнішні праймери А (Послідовність ІД HEF-VL-g для одержання плазміди HEF-RVLb№47) і Н (Послідовність ІД №48) створюють для AHM-g . Амінокислотну послідовність і нуклеотигібридизації з послідовністю ДНК HEF експресудну послідовність V-ділянки L-ланцюга, що місвального вектору HEF-VL-g . тяться у цій плазміді HEF-RVLb-AHM-g , подані в CDR трансплантовані праймери L1S (ПосліПослідовності ІД №10. довність ІД №49), L2S (Послідовність ІД №50) і (3) Конструювання V-ділянки Η-ланцюга реL3S (Послідовність ІД №51) містять смислову конструйованого людського анти-НМ 1.24 антипослідовність ДНК. CDR трансплантовані прайтіла мери L1A (Послідовність ІД №52), L2A (Послідов3-1. Конструювання варіантів а-e V-ділянки Нність ІД №53) і L3A (Послідовність ІД №54) місланцюга реконструйованого людського анти-НМ 21 76934 22 1.24 антитіла довність і нуклеотидну послідовність V-ділянки НДНК, що кодує V-ділянку Η-ланцюга реконстланцюга, що міститься в цій плазміді HEF-RVHbруйованого людського анти-НМ 1.24 антитіла, AHM-g 1, подані у Послідовності ІД №12. можна сконструювати так. Зв'язуючи послідовВикористовуючи праймер мутагенезу CS ність ДНК, що кодує FR 1-3 людського антитіла (Послідовність ІД №65) і СА (Послідовність ІД HG3, і FR4 людського антитіла JH6 з послідовніс№66), сконструйовані для здійснення мутації тю ДНК, яка кодує CDR V-ділянки Η-ланцюга митреоніну у положенні 73 на лізин, і як матричну шачого анти-НМ 1.24 антитіла, можна сконструюДНК плазміду HEF-RVHa-AHM-g 1 методом ПЛР, вати ДНК повної довжини, що кодує V-ділянку Ηваріант с ампліфікують для одержання плазміди ланцюга реконструйованого людського анти-НМ HEF-RVHc-AHM-g 1. Амінокислотну послідовність 1.24 антитіла. і нуклеотидну послідовність V-ділянки Η-ланцюга, Потім Hindlll розпізнавальний що міститься в цій плазміді HEF-RVHc-AHM-g 1, сайт/консенсусну послідовність KOZAK і ВатНІ подано у Послідовності ІД №13. розпізнавальний сайт/сплайсингову донорну посВикористовуючи праймер мутагенезу DS лідовність, відповідно, приєднують до 5'-кінця та (Послідовність ІД №67) і DA (Послідовність ІД 3'-кінця цієї послідовності ДНК, для того, щоб №68), сконструйовані для здійснення мутації арзабезпечити вбудовування експресувального гініну в положенні 66 на лізин та треоніну в половектору HEF. женні 73 на лізин, і як матричну ДНК плазміду Сконструйовану таким чином послідовність HEF-RVHa-AHM-g 1 за допомогою ПЛР, варіант d ДНК поділяють на 4 олігонуклеотиди. Потім оліампліфікують для одержання плазміди HEFгонуклеотиди, які потенційно перешкоджають RVHd-AHM-g 1. Амінокислотну послідовність і складанню цих нуклеотидів, піддають комп'ютернуклеотидну послідовність V-ділянки Н-ланцюга, ному аналізу щодо вторинної структури. що міститься в цій плазміді HEF-RVHd-AHM-g 1, Послідовності чотирьох олігонуклеотидів подані в Послідовності ІД №14. RVH1-RVH4 подані далі у Послідовностях ІД Використовуючи як праймер мутагенезу ES №57-60. Довжина цих нуклеотидів становить 119(Последовательность ІД №69) і ЕА (Послідов144 основ, і вони мають ділянку, що перекриваність ІД №70) , сконструйовані для здійснення ється, у 25-26 основ. Серед цих нуклеотидів мутації валіну в положенні 67 на аланін і метіоніRVH2 (Послідовність ІД №58) і RVH4 (Послідовну в положенні 69 на лейцин, і як матричну ДНК ність ІД №60) мають смислову послідовність ДНК, плазміду HEF-RVHa-AHM-g 1, варіант є ампліфіa RVH1 (Послідовність ІД №57) і RVH3 (Послідокують для одержання плазміди HEF-RVHe-AHMвність ІД №59) мають антисмислову послідовg 1. Амінокислотну послідовність і нуклеотидну ність. Спосіб складання цих чотирьох олігонуклепослідовність V-ділянки Η-ланцюга, що міститься отидів за допомогою ПЛР наведено на Фіг.5. в цій плазміді HEF-RVHe-AHM-g 1, подані в ПосПЛР здійснюють, використовуючи чотири олілідовності ІД №15. гонуклеотиди і RHP1 (Послідовність ІД №60) та 3-2. Конструювання гібридної V-ділянки НRHP2 (Послідовність ІД №62) як зовнішні прайланцюга мери. Конструюючи гібридну V-ділянку Η-ланцюга, Ампліфікований фрагмент ДНК завдовжки можна визначити, який FR V-ділянки гуманізова438 основ очищають, розщепляють HindIІІ і ного антитіла робить внесок у активність зв'язуВаmНІ, а потім клонують в експресувальний веквання і в активність інгібування зв'язування. З тор HEF-VH-g 1. Після визначення нуклеотидноі двох сконструйованих послідовностей, амінокиспослідовності, плазміду, що містить фрагмент лотні послідовності FR1 і FR2 отримано з мишаДНК, що кодує правильну амінокислотну послідочого анти-НМ 1.24 антитіла, тоді як FR3 і FR4 вність V-ділянки Н-ланцюга називають HEFотримані з варіанту а V-ділянки Н-ланцюга рекоRVHa-AHM-g 1. Амінокислотну послідовність та нструйованого людського анти-НМ 1.24 антитіла нуклеотидну послідовність V-ділянки Η-ланцюга, (мишаче/людське гібридне анти-НМ 1.24 антитіщо міститься у цій плазміді HEF-RVHa-AHM-g 1, ло) в одному, і амінокислотні послідовності FR1 і подані у Послідовності ІД №11. FR2 отримано з варіанту а V-ділянки Η-ланцюга Кожен з варіантів b, с, d та є V-ділянки Ηреконструйованого людського анти-НМ 1.24 анланцюга реконструйованого людського анти-НМ титіла, a FR3 і FR4 отримані з мишачого анти-НМ 1.24 антитіла, конструюють так. При конструю1.2 4 антитіла (людське/мишаче гібридне антиванні кожного з варіантів b і далі V-ділянки ΗНМ 1.24 антитіло) в іншому. Всі амінокислотні ланцюга реконструйованого людського анти-НМ послідовності CDR ділянок отримані з мишачого 1.24 антитіла, тривимірну структурну модель Vанти-НМ 1.24 антитіла. ділянки мишачого анти-НМ 1.24 антитіла можна Дві гібридні V-ділянки Η-ланцюга конструюсконструювати, щоб завбачити положення аміноють методом ПЛР. Цей метод схематично зобракислотного залишку, якай слід замінити у молежено на Фіг.6 та 7. Для конструювання двох гібкулі антитіла. ридних V-ділянок Η-ланцюга можна застосувати Використовуючи праймер мутагенезу BS (Почотири праймери. Зовнішні праймери а (Послідослідовність ІД №63) і ВА (Послідовність ІД №64), вність ІД №71) та h (Послідовність ІД №72) ствосконструйовані для здійснення мутації аргініну у рюють для гібридизації з послідовністю ДНК векположенні 66 на лізин, і як матричну ДНК плазмітору експресувального вектору HEF HEF-VH-g 1. ду HEF-RVHa-AHM-g 1 за допомогою методу Праймер HYS гібридної конструкції Н-ланцюга ПЛР, варіант b ампліфікують для одержання пла(Послідовність ІД №73) конструюють таким чизміди HEF-RVHb-AHM-g 1. Амінокислотну послі 23 76934 24 ном, щоб він мав смислову послідовність ДНК, а RVH-AHM-g 1. гібридний праймер HYA Н-ланцюга (ПослідовАмінокислотну послідовність і нуклеотидну ність ІД №74) мав антисмислову послідовність послідовність V-ділянки Η-ланцюга, що міститься ДНК так, щоб ці послідовності ДНК були б комв цій плазміді HEF-MH-RVH-AHM-g 1, наведено у плементарними одна до одної. Послідовності ІД №75. Також, плазміду, що місДля конструювання гібридної V-ділянки Ηтить фрагмент ДНК, що кодує правильну аміноланцюга, де амінокислотні послідовності з FR1 і кислотну послідовність гібридної V-ділянки ΗFR2 одержані з мишачого анти-ИМ 1.24 антитіла, ланцюга, де амінокислотні послідовності FR1 і a FR3 і FR4 отримані з варіанту а V-ділянки ΗFR2 отримані з варіанту а реконструйованого ланцюга реконструйованого людського анти-НМ людського анти-НМ 1.24 антитіла, а послідовності 1.24 антитіла, ПЛР з використанням плазміди FR3 і FR4 отримані з V-ділянки Η-ланцюга мишаHEF-1.24-gyl як матриці, зовнішнього праймера а, чого анти-НМ 1.24 антитіла, називають HEF-HMі гібридного праймера Η-ланцюга НYА, та ПЛР з RVH-AHM-g 1. Амінокислотну послідовність і нуквикористанням плазміди HEF-RVHa-AHM-g 1 як леотидну послідовність V-ділянки Н-ланцюга, що матриці, гібридного праймера ΗΥΑ Η-ланцюга, міститься в цій плазміді HEF-HM-RVH-AHM-AHMзовнішнього праймера h, здійснюють на першій g 1, подано у Послідовності ІД №76. стадії ПЛР, і кожний продукт ПЛР очищають. 3-3. Конструювання варіантів f-s V-ділянки ΗДвом продуктам першої ПЛР дають з'єднатиланцюга реконструйованого людського анти-НМ ся за рахунок їх власної комплементарності [пуб1.24 антитіла лікація міжнародної заявки WO 92-19759]. Потім, Кожен з варіантів f, g, h, і, j , k, 1, m, n, ο, p, q, додаючи зовнішні праймери а та h, повної довr та s V-ділянки Н-ланцюга реконструйованого жини ДНК, яка кодує гібридну V-ділянку Ηлюдського анти-НМ 1.2 4 антитіла конструюють ланцюга, де амінокислотні послідовності FR1 і так. При конструюванні кожного з варіантів f і далі FR2 отримані з мишачого анти-НМ 1.24 антитіла, V-ділянки Η-ланцюга реконструйованого людсьа послідовності FR3 і FR4 отримані з варіанту а кого анти-НМ 1.24 антитіла, можна сконструюваV-ділянки Η-ланцюга реконструйованого людсьти тривимірну структурну модель V-ділянки микого анти-НМ 1.24 антитіла, ампліфікують на друшачого анти-НМ 1.24 антитіла, як зазначалось гій стадії ПЛР. раніше, для того, щоб завбачити положення аміДля конструювання гібридної V-ділянки Ηнокислотного залишку, який треба .замістити у ланцюга, де амінокислотні послідовності з FR1 і молекулі антитіла. FR2 одержано з варіанту а V-ділянки Η-ланцюга Використовуючи праймер мутагенезу FS (Пореконструйованого людського анти-НМ 1.24 анслідовність ІД №78) і FA (Послідовність ІД №79), титіла, а послідовності з FR3i FR4 отримані з мисконструйовані так, щоб здійснити мутацію треошачого анти-НМ 1.24 антитіла, ПЛР з викорисніну в положенні 75 на серин, і валіну в положенні танням плазміди HEF-RVHa-AHM-g 1 як матриці, 78 на аланін, і як матричну ДНК плазміду HEFзовнішнього праймера а, і гібридного праймера RVHe-AHM-g 1, методом ПЛР варіант f ампліфіН-ланцюга HYA, ПЛР з використанням плазміди кують до одержання плазміди HEF-RVHf-AHMHEF-1.24-g 1 як матриці, гібридного праймера g 1. Амінокислотну послідовність і нуклеотидну HYS Η-ланцюга, і зовнішнього праймера h, здійспослідовність V-ділянки Η-ланцюга, що міститься нюють на першій стадії ПЛР, і кожний продукт в плазміді HEF-RVHf-AHM-g 1, наведені в ПосліПЛР очищають. довності ІД №16. Двом очищеним продуктам першої ПЛР даВикористовуючи праймер мутагенезу GS ють можливість з'єднатися за рахунок їх власної (Послідовність ІД №80) і GA (Послідовність ІД комплементарності [публікація міжнародної заяв№81), сконструйовані так, щоб здійснити мутацію ки WO 92-19759]. Потім, додаючи зовнішні прайаланіну в положенні 40 на аргінін, і як матричну мери а та h, отриману ДНК повної довжини/ що ДНК плазміду HEF-RVHa-AHM-g 1, варіант g амкодує гібридну V-ділянку Η-ланцюга, де амінокиспліфікують до одержання плазміди HEF-RVHgлотні послідовності FR1 і FR2 отримані з варіанту AHM-g 1. Амінокислотну послідовність і нуклеоа Н-ланцюга реконструйованого людського антитидну послідовність V-ділянки Н-ланцюга, що НМ 1.24 антитіла, а послідовності FR3 і FR4 міститься у плазміді HEF-RVHg-AHM-g 1, навеотримані з мишачого анти-НМ 1.24 антитіла, амдені в Послідовності ІД №17. пліфікують на другій стадії ПЛР. Використовуючи праймер мутагенезу FS і FA Методи першої ПЛР, очищення продуктів і як матричну ДНК плазміду HEF-RVHb-AHM-g 1, ПЛР складання, другої ПЛР та клонування в HEF варіант h ампліфікують до одержання плазміди експресувальний вектор HEF-VH-g 1 здійснюють HEF-RVHh-AHM-g 1. Амінокислотну послідовзгідно з способом, наведеним у прикладі 9 "Консність і нуклеотидну послідовність V-ділянки Ηтруювання V-ділянки L-ланцюга реконструйоваланцюга, що міститься в плазміді HEF-RVHhного людського анти-НМ 1.24 антитіла". Після AHM-g 1, подано в Послідовності ІД №18. визначення послідовності ДНК плазміду, яка місВикористовуючи праймер мутагенезу IS (Потить фрагмент ДНК, що кодує правильну амінослідовність ІД №82) та ІА (Послідовність ІД №83), кислотну послідовність гібридної V-ділянки Ηсконструйовані так, щоб здійснити мутацію аргініланцюга, де амінокислотні послідовності FR1 і ну в положенні 83 на аланін і серину в положенні FR2 отримані з мишачого анти-НМ 1.24 антитіла, 84 на фенілаланін, і як матричну ДНК плазміду а послідовності FR3 і FR4 отримані з варіанту а HEF-RVRh-AHM-g 1, варіант і ампліфікують до V-ділянки Η-ланцюга реконструйованого людсьодержання плазміди HEF-RVHi-AHM-g 1. Амінокого анти-НМ 1.24 антитіла, називають HEF-MH 25 76934 26 кислотну послідовність і нуклеотидну послідов№95), сконструйовані таким чином, щоб здійсниність V-ділянки Н-ланцюга, що міститься' в плазти мутацію треоніну в положенні 87 на серин, і як міді HEF-RVHi-AHM-g 1, наведені у Послідовності матричну ДНК плазміду HEF-RVHn-AHM-g 1, ваІД №19. ріант о ампліфікують до одержання плазміди Використовуючи праймер мутагенезу JS (ПоHEF-RVHo-AHM-g 1. Амінокислотну послідовслідовність ІД №84) та JA (Послідовність ІД ність і нуклеотидну послідовність V-ділянки- Н№85), сконструйовані таким чином, щоб здійсниланцюга, що міститься у плазміді HEF-RVHoти мутацію аргініну в положенні 66 на лізин, і як AHM-g 1, наведено у Послідовності ІД №25. матричну ДНК плазміду HEF-RVHf-AHM-g 1, ваВикористовуючи праймер мутагенезу PS (Поріант j ампліфікують до одержання плазміди HEFслідовність ІД №96) і РА (Послідовність ІД №97), RVHj-AHM-g 1. Амінокислотну послідовність і сконструйовані таким чином, щоб здійснити мунуклеотидну послідовність V-ділянки Η-ланцюга, тацію валіну в положенні 78 на аланін, і як матщо міститься в плазміді HEF-RVHj-AHM-g 1, ричну ДНК плазміду HEF-RVHa-AHM-g 1, варіант наведені у Послідовності ІД №20. p ампліфікують за допомогою ПЛР до одержання Використовуючи праймер мутагенезу KS (Поплазміди HEF-RVHp-AHM-g 1. Амінокислотну слідовність ІД №86) і КА (Послідовність ІД №87), послідовність і нуклеотидну послідовність Vсконструйовані таким чином, щоб здійснити муділянки Η-ланцюга, що міститься у плазміді HEFтацію глутаміновоі кислоти в положенні 81 на RVHp-AHM-g 1, наведені в Послідовності ІД №26. глутамін, і як матричну ДНК плазміду HEF-RVHhВикористовуючи праймер мутагенезу QS AHM-g 1, варіант k ампліфікують до одержання (Послідовність ІД №98) і QA (Послідовність ІД плазміди HEF-RVHk-AHM-g 1. Амінокислотну №99), сконструйовані таким чином, щоб здійснипослідовність і нуклеотидну послідовність Vти мутацію треоніну в положенні 75 на серин, і як ділянки Η-ланцюга, що міститься в плазміді HEFматричну ДНК плазміду HEF-RVHa-AHM-g 1, ваRVHk-AHM-g 1, подані у Послідовності ІД №21. ріант q ампліфікують за допомогою ПЛР до одеВикористовуючи праймер мутагенезу LS (Поржання плазміди HEF-RVHq-AHM-g 1. Амінокисслідовність ІД №88) і LA (Послідовність ІД №89), лотну послідовність та нуклеотидну послідовність сконструйовані таким чином, щоб здійснити муV-ділянки Н-ланцюга, що міститься в плазміді тацію глутамінової кислоти в положенні 81 на HEF-RVHq-AHM-g 1, наведено у Послідовності ІД глутамін і серину в положенні 82 на ізолейцин, і №27. як матричну ДНК плазміду HEF-RVHh-AHM-g 1, Використовуючи праймер мутагенезу CS варіант І ампліфікують до одержання плазміди (Послідовність ІД №65) і СА (Послідовність ІД HEF-RVHl-АНМ-g 1. Амінокислотну послідовність №66) і як матричну ДНК плазміду HEF-RVHpі нуклеотидну послідовність V-ділянки Η-ланцюга, AHM-g 1, варіант г ампліфікують за допомогою що міститься у плазміді HEF-RVHl-AHM-g 1, наПЛР до одержання плазміди HEF-RVHr-AHM-g 1. ведені в Послідовності ІД №22. Амінокислотну послідовність і нуклеотидну посліВикористовуючи праймер мутагенезу MS довність V-ділянки Η-ланцюга, що міститься в (Послідовність ІД №90) і МА (Послідовність ІД плазміді HEF-RVHr-AHM-g 1, наведені в Послідо№91), сконструйовані таким чином, щоб здійснивності ІД №28. ти мутацію глутамінової кислоти в положенні 81 Використовуючи праймер мутагенезу SS (Пона глутамін, серину в положенні 82 на ізолейцин слідовність ІД №100) і SA (Послідовність ІД і. треоніну в положенні 87 на серин, і як матричну №101), сконструйований таким чином, щоб здійсДНК плазміду HEF-RVHh-AHM-g 1, варіант m нити мутацію метіоніну в положенні 69 на ізолайампліфікують до одержання плазміди HEFцин, і як матричну ДНК плазміду HEF-RVHr-AHMRVHm-AHM-g 1. Амінокислотну послідовність і g 1, варіант s ампліфікують до одержання плазнуклеотидну послідовність V-ділянки Η-ланцюга, міди HEF-RVHs-AHM-g 1. Амінокислотну посліщо міститься в плазміді HEF-RVHm-AHM-g 1, довність і нуклеотидну послідовність V-ділянки Ηподані в Послідовності ІД №23. ланцюга, що міститься у плазміді HEF-RVHsВикористовуючи праймер мутагенезу NS AHM-g 1, подано у Послідовності ІД №102. (Послідовність ІД №92) і NA (Послідовність ІД Сконструйовані амінокислотні послідовності №93), сконструйовані таким чином, щоб здійсниV-ділянки L-ланцюга наведені в таблиці 1, а аміти мутацію серину в положенні 82 на ізолейцин, і нокислотні послідовності V-ділянки Η-ланцюга як матричну ДНК плазміду HEF-RVHh-AHM-g 1, подано в таблицях 2-4. варіант n ампліфікують до одержання плазміди HEF-RVHn-AHM-g 1. Амінокислотну послідовність і нуклеотидну послідовність V-ділянки Ηланцюга, що міститься у плазміді HEF-RVHnAHM-g 1, наведені у Послідовності ІД №24. Використовуючи праймер мутагенезу OS (Послідовність ІД №94) і OA (Послідовність ІД 27 76934 28 29 3. Одержання химеричного антитіла та реконструйованого людського антитіла Для одержання химеричного антитіла або реконструйованого людського антитіла для кожного з них конструюють два експресувальні вектори, що включає експресувальний вектор, який вклю 76934 30 чає ДНК, що кодує V-ділянку мишачого Ηланцюга і С-ділянку людського Η-ланцюга під контролем ділянки, що регулює експресію, такої як енхансер/промоторна система, і ДНК, що кодує V-ділянку мишачого L-ланцюга і С-ділянку людського L-ланцюга під контролем ділянки, що регу 31 76934 32 лює експресію, такої як енхансер/промоторна титіла або реконструйованого людського антисистема, або експресувальний вектор, який НМ 1.24 антитіла відповідно до цього винаходу включає ДНК, що кодує V-ділянку гуманізованого можна використовувати будь-який спосіб експреΗ-ланцюга і С-ділянку людського Η-ланцюга під сії, який включає, наприклад, такі еукаріотичні контролем ділянки, що регулює експресію, такої клітини, як клітини тварин, систему стабілізованої як енхансер/промоторна система, і ДНК, що кодує клітинної лінії ссавця, систему клітин комах, сисV-ділянку гуманізованого L-ланцюга і С-ділянку тему грибкових клітин та систему дріжджових людського L-ланцюга під контролем ділянки, яка клітин, і такі прокаріотичні клітини, як бактеріальні регулює експресію, такої як енхансер/промоторна клітини, такі як клітини Escherichia coli, тощо. система. Більш прийнятним є те, щоб химерне антитіло Потім клітину-хазяїна, таку як клітина ссавця, або реконструйоване людське антитіло відповідпіддають котрансформації, використовуючи ці но до цього винаходу можна було експресувати в вектори, і трансформовані клітини культивують in клітини COS, клітини СНО, клітини Неіа, клітини vitro або in vivo для одержання химерного антитіVero, мієломні клітини або клітини ВНК. ла або реконструйованого людського антитіла У цих випадках можна використовувати зви[див., наприклад, публікацію міжнародної заявки чайні промотори, які застосовують для експресії WO 91-16928]. Більше того, ген антитіла вводять клітин ссавців. Так, наприклад, можна використоссавцю, такому як коза, для одержання трансгенвувати людський цитомегаловірусний негайноної тварини, з молока якої можна одержувати ранній промотор (HCMV). Приклади експресувахимерне антитіло або реконструйоване людське льних векторів, що містять HCMV промотор, антитіло. включають HCMV-VH-HC 1, HCMV-VL-НС і т.і. і Крім того, гени V-ділянки Η-ланцюга, Сті, які отримано з pSV2neo [публікація міжнародділянки Η-ланцюга, V-ділянки L-ланцюга і Сної заявки WO 92/19759]. ділянки L-ланцюга лігують в один вектор для траКрім того, як промотор для експресії гена в нсформації клітини підхожого хазяїна, і в резульклітинах ссавців для використання в цьому винататі одержують антитіла. Так, для експресії химеході можна застосувати вірусні промотори, такі, рних антитіл, ДНК, яка кодує мишачу лідерну як ретровірус, вірус поліоми, аденовірус, вірус послідовність та V-ділянку Η-ланцюга і С-ділянку мавп 40 (SV40), тощо, та промотори, отримані з людського Η-ланцюга, наявні у клонованій кДНК, і клітин ссавців, такі, як фактор подовження поліДНК, яка кодує мишачу лідерну послідовність та пептидного ланцюга 1 (HTF-1 ), тощо. Так, наV-ділянку L-ланцюга і С-ділянку людського Lприклад, якщо використовують промотор SV40, ланцюга, вводять в один експресувальний вектор експресію можна легко здійснити, використовую[публікація міжнародної заявки WO 94-11523]. чи метод Mulligan et al. [Nature 277, 108 (1979)], а Для експресії реконструйованого людського якщо використовують промотор HTF-1 , можна антитіла ДНК, що кодує V-ділянку гуманізованого застосувати метод Mizushima, S. et al. [Nucleic Η-ланцюга і С-ділянку людського Η-ланцюга, та Acids Research, 18, 5322, 1990]. ДНК, що кодує V-ділянку гуманізованого LЯк джерело реплікації можна використовуваланцюга і С-ділянку людського L-ланцюга ввоти джерело, отриманий з SV40, вірусу поліоми, дять в один експресувальний вектор [публікація аденовірусу, вірусу папіломи великої рогатої хуміжнародної заявки WO 94-11523]. Клітини-хазяї, доби (BPV) тощо, та для ампліфікації числа копій трансформують, використовуючи названий векгена в клітинній системі хазяїна, експресувальний тор, і трансформовані клітини-хазяї культивують вектор може включати, як селективний маркер, in vivo або in vitro, одержуючи бажане химерне ген аміноглікозидфосфот-рансферази (ΑΡΗ), ген антитіло або реконструйоване людське антитіло. тимідинкінази (ТК), ген ксантингуанінфоТрансформант, який було трансформовано, сфорибозилтрансферази Е. coli (Ecogpt), ген дияк зазначалось вище, геном, що кодує бажане гідрофолатредук-тази (DHRF), тощо. химерне антитіло або реконструйоване людське 4. Активність інгібування зв'язування химерантитіло, культивують, і одержане химерне антиного антитіла або реконструйованого людського тіло або реконструйоване людське антитіло можантитілана виділити зсередини або ззовні клітин і очисти(1) Вимірювання концентрації антитіл ти до гомогенності. Концентрацію очищених антитіл можна виміВиділення і очищення бажаного білка відпоряти за допомогою ELISA, або вимірюючи погливідно до цього винаходу химерного антитіла або нання. реконструйованого людського антитіла можна Планшети ELISA для визначення концентраздійснити, використовуючи афінну колонку. Як ції антитіл можна підготувати так. Кожну лунку 96колонку, в якій використовують протеїн А, наприлункового планшета для ELISA (наприклад, клад, можна назвати HyperD, POROS, Sepharose Maxisorp, виробник NUNC) іммобілізують 100мкл F. F, тощо. В іншому варіанті можна використовукозячого антитіла проти людського IgG у конценвати методики звичайного виділення та очищентрації 1мкг/мл. Після блокування 100мкг/мл розня, які застосовуються для білків, і вибір методу бавленого буферу (наприклад, 50мМ Трис-НСІ, ніщо не обмежує. Так, наприклад, поєднання різ1мм МgСl2, 0,15Μ NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% них хроматографічних методик, ультрафільтруNaN3, 1% бичачого сироваткового альбуміну вання, висолювання, діалізу тощо може дати змо(BSA), рН 8,1), в кожну комірку додають серійні гу виділити й очистити химерне антитіло або розведення надосадової культуральної рідини реконструйоване людське антитіло. клітин, в яких експресовано химерне антитіло, Для одержання химерного анти-НМ 1.24 ангібридне антитіло або реконструйоване людське 33 76934 34 антитіло, наприклад, культуральної надосадової НМ 1.24 антитіло, гібридне анти-НМ 1.24 антитіло рідини клітин COS чи клітин СНО, або очищеного або реконструйоване людське анти-НМ 1.24 анхимерного антитіла, гібридного антитіла чи рекотитіло експресовано, наприклад, культуральної нструйованого людського антитіла. Потім доданадосадовоі рідини клітин COS чи клітин СНО, ють 100мкл кон'югованого з лужною фосфатазою або очищеного химерного анти-НМ 1.24 антитіла, козячого антитіла проти людського IgG, додають гібридного анти-НМ 1.24 антитіла або реконстру1мг/мл субстратного розчину (Sigma 104, пйованого людського анти-НМ 1.24 антитіла, і однітрофенілфосфату, виробництва SIGMA), а поночасно додають 50мкг 2мкг/мл біотинільованого тім вимірюють абсорбцію на 405нм, використомишачого анти-НМ 1.24 антитіла, потім інкубують вуючи рідер планшетів для мікротитрування (Bio при кімнатній температурі протягом двох годин і, Rad). Як стандарт для вимірювання концентрації після промивання, додають мічений пероксидазою стрептавідин (виробництво DAKO). можна використовувати людський IgGl (виробПісля інкубування при кімнатній температурі ництво The Binding Site). Значення концентрації протягом 1 години і після промивання, додають очищених антитіл одержують, вимірюючи поглирозчин субстрату, а потім інкубують. Після цього нання при 280нм і беручи величину 1мг/мл за реакцію припиняють, додаючи 50мкл сірчаної 1,35ОП. кислоти, і потім вимірюють поглинання на 490нм, (2) Активність зв'язування використовуючи рідер MICROPLATE READER Активність зв'язування можна виміряти за Model 3550 (Bio-Rad). допомогою Cell-ELISA, використовуючи людську Вимірювання ADCC-активності амніотичну клітинну лінію WISH (АТСС CCL25). ADCC-активність химеричного антитіла або Планшети для клітинного ELISA можна одержати реконструйованого людського антитіла відповідтак. Підготовані клітини WISN у відповідній конно до цього винаходу можна виміряти так. Поцентрації в PRMI 1640 середовищі, доповненому перше, мононуклеарні клітини виділяють з пери10% навколоплідною сироваткою теляти, додаферійної людської крові або кісткового мозку меють в 96-лункові планшети, інкубують протягом тодом центрифугування у градієнті щільності, та ночі, і після дворазового промивання PBS(-), фікготують як ефекторні клітини. Мієломні клітини сують 0,1% глутаральдегідом (виробництво людини готують як клітини-мішені, здійснюючи Nakalai tesque). введення 51Сr мітки в RPMI 8226 клітини (АТСС Після блокування, додають 100мкл серійних CCL155). Потім химерне антитіло або реконструрозведень культурального надосадового середойоване людське антитіло, що підлягає визначенвища клітин, де химерне анти-НМ 1.24 антитіло, ню на ADCC-активність, додають до мічених клігібридне анти-НМ 1.24 антитіло або реконструйотин-мішеней інкубують, а потім додають ване людське анти-НМ 1.24 антитіло експресовавідповідну кількість ефекторних клітин до клітинно, наприклад, культуральної надосадової рідини мішеней та інкубують. клітин COS чи клітин СНО, або очищеного химеПісля інкубації надосадову рідину відбирають рного анти-НМ 1.24 антитіла, гібридного анти-НМ для вимірювання радіоактивності, використовую1.24 антитіла або реконструйованого людського чи лічильник гамма-випромінювання. У цей час анти-НМ 1.24 антитіла в кожну лунку, інкубують 1% NP-40 можна використовувати для вимірюпри кімнатній температурі протягом двох годин, а вання максимальної радіоактивності, що випуспотім додають мічене пероксидазою кроляче анкається. Цитотоксичність (%) можна розрахувати титіло проти людського IgG (виробництво DAKO). як (А-С)/(В-С) 100, де А являє собою випромінюПісля інкубування протягом 1 години прй кімнатній температурі додають розчин субстрату, і вану радіоактивність (імп/хвил) в присутності анзнову інкубують. Потім реакцію припиняють, дотитіла, В являє собою випромінювану радіоактидаючи 50мкл 6н сірчаної кислоти, а потім вимівність (імп/хвил), виділену за рахунок ΝΡ-40, і С рюють поглинання при 490нм, використовуючи являє собою радіоактивність (імп/хвил), що вирідер MICROPLATE READER Model 3550 (Bioпромінюється однією лише культуральною рідиRad). ною без антитіла. (3) Вимірювання активності інгібування зв'яЯкщо ADCC-активність або CDC-активність зування очікують зареєструвати в С-ділянці антитіла, як Активність інгібування зв'язування біотиніС-ділянку антитіла можна використовувати людльованим мишачим анти-НМ 1.24 антитілом виський С 1 або людський С 3. Більш того, додаюзначають за допомогою клітинного ELISA, викочи, змінюючи або модифікуючи частину амінокиристовуючи людську амніотичну клітинну лінію слот С-ділянки антитіла, можна індукувати більш WISH (АТСС CCL25). Планшет для клітинного високу активність ADCC або активність CDC. ELISA можна приготувати згідно з вищезазначеТак, наприклад, існує IgM-подібна полімериним (2). Клітини WISH, підготовані у відповідній зація IgG шляхом заміщення амінокислот [Smith, концентрації в PRMI 1640 середовищі, доповнеR. I. F. & Morrison, S. L, BIO/TECHNOLOGY (1994) ному 10% навколоплідною сироваткою теляти 12, 683-688], IgM-подібна полімеризація IgG шляприміщують в 96-лунковий планшет, інкубують хом додання амінокислот [Smith, R. I. F. et al., J. протягом ночі, і після дворазового промивання Immunol. (1995) 154, 2226-2236], експресія шляPBS(-) фіксують 0,1% глутаральдегідом (Nacalai хом тандемного зв'язування генів, які кодують Ltesque). ланцюг [Shuford, W. et al. , Science (1991) 252, Після блокування в кожну лунку додають 724-727], димеризація IgG шляхом заміщення 50мкл серійних розведень культурального надоамінокислот [Саrоn, Р. С et al., J. Exp. Med. (1992) садового середовища клітин, де химерне анти176, 1191-1195, Shopes, B. J. Immunology (1992) 35 76934 36 148 2918-2922], димеризація IgG внаслідок хімічреконструйоване людське анти-НМ 1.24 антитіло ної модифікації [Wolff, Ε. Α. et al., Cancer Res. відповідно до цього винаходу можна системно (1993) 53, 2560-2565], і введення ефекторної фуабо місцево вводити парентерально. Так, напринкції внаслідок модифікації амінокислот в шарніклад, можна вибрати внутрішньовенні ін'єкції, такі рній ділянці антитіл [Norderhaug, L. et al. , Eur. J. як крапельне введення, внутрішньом'язові ін'єкції, Immunol (1991) 21, 2379-2384]. Це можна здійснивнутрішньочеревні ін'єкції або підшкірні ін'єкції, і ти сайт-спрямованим мутагенезом олігомерів, вибрати відповідний дозовий режим залежно від використовуючи праймери, додаючи послідовновіку та стану здоров'я пацієнта. сті основ, використовуючи сайти розщеплення Ефективну дозу вибирають в інтервалі від ферментів рестрикції, і хімічні модифікатори, які 0,01мг до 1000мг/кг ваги тіла/на дозу. В іншому індукують ковалентне зв'язування. варіанті можна вибрати дозу 5мг/кг ваги тіла, In vivo діагностика мієломи більш прийнятно, від 50 до 100мг/кг ваги тіла. Химерне анти-НМ 1.24 антитіло або реконстФармацевтичні композиції або терапевтичні руйоване людське анти-НМ 1.24 антитіло відповіагенти для лікування мієломи, що містять як акдно до цього винаходу можна використовувати як тивний інгредієнт химерне анти-НМ 1.24 антитіло in vivo діагностичний засіб для мієломи шляхом або реконструйоване людське анти-НМ 1.24 анзв'язування його з міченою сполукою, такою, як титіло відповідно до цього винаходу, можуть місрадіоізотоп, тощо. тити фармацевтично прийнятні носії або добавки Крім того, фрагменти химерного анти-НМ залежно від вибраного способу введення. 1.24 антитіла або реконструйованого людського Як приклади таких носіїв або добавок можна анти-НМ 1.24 антитіла, такі, як Fab, F(ab')2, Fv, назвати воду, фармацевтично прийнятні органічні або одноланцюжковий Fv (scFv), дe Fv або Fv Ηрозчинники, колаген, полівініловий спирт, полівіланцюга і L-ланцюг зв'язані підхожим лінкером, нілпіролідон, карбоксивініловий полімер, натрійщо був зв'язаний з такою міченою сполукою, як карбоксиметилцелюлозу, натрійполіакрилат, альрадіоізотоп тощо, можуть застосовуватись як in гінат натрію, водорозчинний декстран, vivo діагностичні засоби для мієломи. натрійкарбоксиметилкрохмаль, пектин, метилцеКонкретно, ці фрагменти антитіл можна люлозу, етилцелюлозу, ксантангам, гуміарабік, отримати, конструюючи ген, що кодує ці фрагмеказеїн, желатин, агар, дигліцерин, гліцерин, пронти антитіл, вводячи їх в експресувальний векпіленгліколь, поліетиленгліколь, вазелін, парафін, тор, а потім експресуючи в клітинах підхожого стеариловий спирт, стеаринову кислоту, людсьхазяїна, або розщепляючи химерне анти-НМ 1.24 кий сироватковий альбумін (HSA), маніт, сорбіт, антитіло або реконструйоване людське анти-НМ лактозу, фармацевтично прийнятні поверхнево1.24 антитіло, підхожим ферментом. активні агенти тощо. Можливі для використання Вищезазначені in vivo діагностичні засоби добавки можна вибрати з названих вище чи їх для мієломи можна системно водити парентеракомбінацій (не обмежуючись наведеним вище). льно. Приклади Фармацевтична композиція і лікарський засіб Далі цей винахід буде пояснено більш докладля лікування мієломи дно. На підтвердження терапевтичної дії химерноПриклад 1. го анти-НМ 1.24 антитіла або гуманізованого анКлонування кДНК, що кодує V-ділянку мишати-НМ 1.24 антитіла відповідно до цього винахочого анти-НМ 1.24 антитіла ду, зазначені антитіла вводять тварині, якій 1. Виділення матричної РНК (мРНК) трансплантовано мієломні клітини, та оцінюють Використовуючи набір для виділення Fast протипухлинну дію. Track mRNA Isolation Kit Version 3.2 (виробник Як мієломні клітини, що їх треба транспланInvitrogen) згідно з інструкціями, що додаються, тувати тваринам, більш прийнятно використовумРНК виділяють з 2 10 гібридомних клітин вати людські мієломні клітини, і можна як приклад (FERM ВР-5233), що продукують мишаче антиназвати КРММ2 [публікація заявки на патент НМ 1.24 антитіло. Японії без експертизи (Кокаі) №7-236475], 2. Ампліфікація гена, який кодує варіабельну RPMI8226 (АТСС CCL 155), ARH-77 (АТСС CRL ділянку антитіла методом ПЛР 1621) і S6B45 [Suzuki, Η. et al., Eur. J. Immunol. ПЛР здійснюють, використовуючи термореак(1992) 22, 1989-1993]. Як тварини, яким можна тор Thermal Cycler (виробництво Perkin Elmer трансплантувати зазначені клітини, більш прийнCetus). ятними є тварини з послабленими імунними фун2-1. Ампліфікація і фрагментація гена, який кціями, або тварини без імунних функцій, і як прикодує V-ділянку мишачого L-ланцюга клад можна назвати мишей nude, SCID мишей, З виділеної таким чином мРНК синтезують мишей beige та щурів nude. одноланцюжкову кДНК, використовуючи набір Крім того, протипухлинну дію, яку треба оцідля синтезу AMV Reverse Transcriptase Firstнити, можна підтвердити по зміні кількості людсьstrand cDNA Synthesis Kit (виробник Life Science), ких імуноглобулінів у сироватці, шляхом зміни і використовують для ПЛР. Як праймери для ПЛР об'єму і/або ваги пухлини, за зміною ваги білків використовували MKV (Mouse Kappa Variable) Bence Jones в сечі, по тривалості виживання твапраймери [Jones, S. Т. et al. Bio/Technology, 9, 88рин тощо. 89 (1991)], наведені у Послідовностях ІД №29-39, Фармацевтичні композиції або лікарські засоякі гібридизуються з лідерною послідовністю миби для лікування мієломи, що містять як активний шачого L-ланцюга капа-типу. інгредієнт химерне анти-НМ 1.24 антитіло або 100мкл ПЛР розчину, що містить 10мМ Трис 37 76934 38 НСІ (рН 8,3), 50мм КСl, 0,1мМ дНТФ (дАТФ, [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook дГТФ, дЦТФ, дТТФ), 1,5мМ МgСl2, 5Од ДНКet al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)], полімерази Ampli Tag (виробництво Perkin Elmer що містить 50мкг/мл ампіциліну, а потім інкубуCetus), 0,25мМ праймерів MKV, наведених в Поють протягом ночі при 37°С, одержуючи в резульслідовностях ІД №29-39, 3мМ праймера МКС, таті Е. соЇі-трансформант. поданого в Послідовності ІД №40, і 100нг одноЦей трансформант культивують протягом ноланцюжкової кДНК покривають 50мкл мінеральчі прй 37°С в 10мл 2xYT середовища, що містить ного масла, а потім нагрівають спочатку при тем50мкг/мл ампіциліну, а потім з цієї культури одепературі 94°С протягом 3 хвилин, потім при 94°С ржують плазмідну ДНК, використовуючи лужний протягом 1хвил, і при 55°С протягом 1хвил, та метод [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, при 72°С протягом 1хвил в зазначеному порядку. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Після повторення цього циклу 30 разів реакційну Press, (1989)]. суміш інкубують при 72°С протягом 10 хвилин. Отриману таким чином плазміду, що містить Ампліфікований фрагмент ДНК виділяють за доген, який кодує V-ділянку мишачого L-ланцюга помогою агарозного гелю з низькою температукапа-типу, отриманого з гібридоми, що продукує рою плавлення (виробництво Sigma), і розщепанти-НМ 1.24 антитіло, називають pUCHMVL9. ляють Xmal (виробництво New England Biolabs) Одержану у зазначений вище спосіб плазміду, та Sail (виробництво Takara Shuzo) при 37°С. яка містить ген, що кодує V-ділянку мишачого Η2-2. Ампліфікація і фрагментація кДНК, що ланцюга, отриманого з гібридоми, яка продукує кодує V-ділянку мишачого Н-ланцюга анти-НМ 1.24 антитіло, називають Ген, який кодує V-ділянку мишачого ΗPUCHMVHR16. ланцюга, ампліфікують у спосіб 5'-RACE [Rapid Приклад 2. Amplification of cDNA ends; Forhman, Μ. Α. et al., Визначення нуклеотидної послідовності ДНК Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 8998-9002, (1988), Нуклеотидну послідовність кДНК, що кодує Edwards, J. B. D. M., et al., Nucleic Acids Res., 19, ділянку в зазначеній вище плазміді, визначають, 5227-5232, (1991)]. Після того, як синтезовано використовуючи автоматичний ДНК-секвенатор кДНК, з використанням праймера Р1 (Послідов(виробник Applied Biosystem Inc.) згідно з протоність ІД №41) , який специфічно гібридизується з колом, запропонованим виробником. константною ділянкою мишачого IgG2a, кДНК, яка Нуклеотидну послідовність гена, що кодує Vкодує V-ділянку мишачого Η-ланцюга, ампліфікуділянку L-ланцюга мишачого анти-НМ 1.24 антиють за допомогою набору 5'-AmpliFINDER RACE тіла, що міститься в плазміді pUCHMVL9, навеKIT (виробництво CLONTECH), використовуючи дено в Послідовності ІД №1. Нуклеотидну посліпраймер МНС2А (Послідовність ІД №42), який довність гена, що кодує V-ділянку Η-ланцюга специфічно гібридизується з константною ділянмишачого анти-НМ 1.24 антитіла, що міститься у кою мишачого IgG2a і якірним праймером (Посліплазміді PUCHMVHR16, подано в Послідовності довність ІД №77), що додається до набору. АмпІД №2. ліфікований ДНК фрагмент очищають за Приклад 3. Визначення CDR допомогою агарозного гелю з низькою темпераПовні структури V-ділянок L-ланцюга і Ηтурою плавлення (виробництво Sigma) і розщепланцюга подібні одна до одної у тому, що чотири ляють EcoRI (виробництво Takara Shuzo) та Xmal каркасні ділянки зв'язані трьома гіперваріабель(виробництво New England Biolabs) при 37°С. ними ділянками, тобто ділянками, що визначають 3. Літування й трансформація комплементарність (CDR). Амінокислотна посліФрагмент ДНК, який включає ген, шо кодує Vдовність каркасної ділянки відносно високо конділянку мишачого L-ланцюга капа-типу, отримасервативна, але варіація у послідовності аміноної, як зазначено вище, лігують з вектором кислот надзвичайно висока [Kabat, Ε. Α., et al., pUC19, одержаним внаслідок розщеплення Sail і "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Xmal, шляхом взаємодії в реакційній суміші, що US Dept. Health and Human Services, 1983]. містить 50мМ Трис-НСІ (рН 7,6), 10мМ МgСl2, На основі цих фактів амінокислотну послідо10мМ дитіотрейтолу, 1мМ АТФ, 50мг/мл поліетивність варіабельної ділянки анти-НМ 1.24 антитіленгліколю (8000) і одну Од. Т4-лігази (виробник ла порівнюють з амінокислотною послідовністю GIBCO-BRL) при 16°С протягом 2,5 годин. Аналоантитіл у базі даних для вивчення гомологічності, гічно, фрагмент ДНК, що включає ген, який кодує та ділянку CDR визначають, як подано в табV-ділянку мишачого Н-ланцюга, піддають взаєлиці 5. модії і лігують з вектором pUCl9, отриманим в результаті розщеплення EcoRI і Xmal при темпеТаблиця 5 ратурі 16°С протягом трьох годин. Потім 10мкл зазначеної вище суміші літуван№ послідов- CDR CDR CDR Плазміда ня додають до 50 мкл компетентних клітин ності (1) (2) (3) Escherichia coli DH5 , залишають на льоду на 30 PUCHMVL9 3-5 24-34 50-56 89-97 хвилин, витримують одну хвилину при 42°С, і PUCHMVHR16 6-8 31-35 50-66 99-109 знову на льоду протягом 1 хвилини. Потім додають 400мкл 2xYT середовища Приклад 4. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook Підтвердження експресії клонованої кДНК et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)], (Конструювання химерного анти-НМ 1.24 антитіінкубують при 37°С протягом І години, а потім Ε. ла) coli висівають на агарне 2xYT середовище 1. Конструюванням експресувального век 39 76934 40 тору Для спостереження часової експресії химерДля конструювання експресувального вектоного анти-НМ 1.24 антитіла, вищезазначені ексру, що експресує химерне анти-НМ 1.24 антитіло, пресувальні вектори тестували у клітинах COS-7 кДНК клони pUCHMVL9 і PUCHMVHR16, які ко(АТСС CRL-1651). HEF-1.24L-g і HEF-1.24Н-g 1 дують V-ділянки L-ланцюга і Η-ланцюга мишачого котрансформують в клітини COS-7 за допомогою анти-НМ 1.24 антитіла, відповідно, модифікують електропорації, використовуючи прилад Gene методом ПЛР, а потім вводять в експресувальний Pulser (виробник BioRad). Кожну ДНК (10мкг) довектор HEF [публікація міжнародної заявки WO дають до 0,8мл аліквот 1 107 клітин/мл в PBS, та 92-19759]. обробляють імпульсами при 1500Вольт і ємності Зворотний праймер ONS-L722S (Послідов25мкФарад. ність ІД №43) для V-ділянки L-ланцюга і зворотПісля періоду відновлення 10 хвил при . кімний праймер VHR16S (Послідовність ІД №44) для натній температурі, клітини, які піддали електроV-ділянки Η-ланцюга конструюють таким чином, порації, додають до 30мл DMEM культуральної щоб вони гібридизувались з ДНК, що кодує почарідини (GIBCO), що містить 10% навколоплідну ток лідерної послідовності V-ділянки кожної, і щоб сироватку теляти без гама-глобуліну. Після інкувони мали консенсусну послідовність Kozak бування протягом 72 годин в інкубаторі з СO2 [Kozak, M. et al., J. МоI. Biol., 196, 947-950, BNA120D (виробництва ТАВАІ), надосадову куль(1987)], і сайт розпізнавання для ферменту ресттуральну рідину збирають, і осколки клітин вилурикції Hindlll. Зворотний праймер VL9A (Послідочають центрифугуванням, що їх потім використовність ІД №45) для V-ділянки L-ланцюга і зворотвують в подальших експериментах. ний праймер VHR16A (Послідовність ІД №46) для 3. Протоковий цитометричний аналіз (FCM) V-ділянки Η-ланцюга конструюють таким чином, Активність зв'язування антигену химерним щоб вони гібридизувались з послідовністю ДНК, анти-НМ 1.24 антитілом досліджують за допомояка кодує кінець J-ділянки, і щоб вони мали гою FCM (протокова цитометрія), використовуючи сплайсингову донорну послідовність, і сайт розпіклітини КРММ2. Після того, як 4,7 105 клітин знання для ферменту рестрикції ВатНІ. КРММ2 [публікація заявки на патент Японії без 100мкл реакційної суміші ПЛІР, що містить експертизи (Кокаі) №7-236475] промивають PBS(10мМ Трис-НСІ (рН 8,3), 50мМ КСІ, 0,1мМ дНТФ, ), додають 50мкл культури клітин COS-7, які про1,5мМ МgСl2, 100пМ кожного з праймерів, 100нг дукують вищезазначене химерне анти-НМ 1.24 матричної ДНК (pUCHMVL9 або pUCHMVHR16), і антитіло, і 50 мкл FACS буферу (PBS(-), Що міс5Од. Ampli Taq ферменту покривають 50мкл мітить 2% навколоплідної сироватки теляти і 0,1% нерального масла, а потім, після початкового азиду натрію), або 5мкл 500мкг/мл очищеного денатурування при 94°С, нагрівають при 94°С мишачого анти-НМ 1.24 антитіла і 95мкл FACS протягом 1 хвил, при 55°С протягом 1 хвил, та буферу, та інкубують на льоду протягом однієї при 72°С протягом 1 хвил, і так 30 циклів, і в кінці години. інкубують при 72°С протягом 10 хвилин. Як контроль додають 50мкл 2мкг/мл химерПродукт ПЛР очищають в 1,5% агарозному ного SK2 [публікація міжнародної заявки WO 94гелі з низької температурою плавлення і розщеп28159] і 50мкл FACS буферу, або 5мкл 500мкг/мл ляють Hindlll та ВатНІ, а потім клонують в HEFочищеного мишачого IgG2aK (UPC10) (виробник VL-дк для V-ділянки L-ланцюга, і в HEF-VH-g 1 CAPPEL) замість очищеного мишачого анти-НМ для V-ділянки Н-ланцюга. Після визначення пос1.24 антитіла, і 95мкл FACS буферу, та інкубують лідовності ДНК, плазміди, які містять фрагмент у .аналогічний спосіб. Після промивання FACS ДНК, що містить правильну послідовність ДНК, буфером додають 100мкл 25мкг/мл кон'югованоназивають HEF-1.24L-g та HEF-1.24H-g 1, відго з ФИТЦ козячого антитіла проти людського повідно. антитіла(GAH) (виробник CAPPEL), або 10мкг/мл Ділянки, які кодують відповідну варіабельну кон'югованого з ФИТЦ козячого антитіла проти ділянку з вищезазначених плазмід HEF-1.24L-g і мишачого антитіла (GAM) (виробник Becton Dickinson), та інкубують при температурі льоду HEF-1.24H-g 1, розщепляють ферментами рестпротягом 30хвил. Після промивання FACS буферикції Hindlll і ВатНІ для створення рестрикційних ром, все це суспендують в 1мл FACS буферу, і фрагментів, які вбудовують в Hindlll сайт і у ВатНІ вимірюють інтенсивність флуоресценції кожної сайти плазмідного вектору pUC19, та їх називалунки за допомогою FACScan (виробник Becton ють pUC19-1-24L-g і pUC19-1.24H-g 1, відповіDickinson). дно. Як видно на Фіг.1, виявлене, що химерне анEscherichia coli, які містять відповідні плазміти-НМ 1.24 антитіло зв'язується з клітинами ди pUC19-1.24Д-д і pUC19-1.24H-g 1, називають КРММ2, оскільки пік інтенсивности флуоресценції Escherichia coli DH5 (pUC19-1.24L-g ) і зсувається праворуч для клітин, до яких додане Escherichia coli DH5 (pUC19-1.24H-g 1); вони химерне анти-НМ 1.24 антитіло, порівняно з конбули інтернаціонально депоновані 29 серпня тролем, аналогічно випадку, коли додають миша1996 року National Institute of Bioscience and че анти-НМ 1.24 антитіло. Це підтверджує той Human-Technology, Agency of Industrial Science факт, що клонована кДНК кодує варіабельну діand Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, лянку мишачого анти-НМ 1.24 антитіла. Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan) під реєстПриклад 5. раційними номерами FERM-5646 і FERM-5644, Створення клітинної лінії СНО, яка стабільно відповідно, згідно з Будапештською Угодою. продукує химерне анти-НМ 1.24 антитіло 2. Трансфекція клітин COS-7 1. Конструювання експресувального вектору 41 76934 42 для химерного Н-ланцюга химерне анти-НМ 1.24 антитіло афінно очищаПісля розщеплення зазначеної вище плазміють, використовуючи крупномасштабну систему збирання антитіла Afi-Prep System (виробництво ди HEF-1.24H-g 1 ферментами рестрикції Pvul та Nippon Gaishi) та колонку Super Protein А (об'єм ВатНІ, фрагмент близько 2,8т.п.н., що містить шару: 100мл, виробництво Nippon Gaishi), викоEF1 промотор і ДНК, що кодує V-ділянку Нристовуючи PBS як абсорбувальланцюга мишачого анти-НМ 1.24 антитіла, видіний/промивальний буфер і 0,1Μ натрійцитратний ляють, використовуючи 1,5% агарозний гель з буфер (рН 3) як елюювальний буфер згідно з низькою температурою плавлення, потім вищезаінструкцією, що додається. рН елюйованих фракзначений фрагмент ДНК вбудовують у фрагмент цій доводять до 7,4, негайно додаючи 1Μ Трисзавдовжки приблизно 6т.п.н., отриманий при роНСІ (рН 8,0) . Концентрацію антитіл вимірюють за зщепленні експресувального вектору, який викопоглинанням на 280нм, та розраховують, прийристовується для експресувального вектору маючи величину 1,35ОП, що відповідає 1мкг/мл. людського Η-ланцюга, DHFR- Ε-Rvh-PM1f [публіПриклад 7 кація міжнародної заявки WO 92/19759], що місВизначення активності химерного анти-НМ тить DHFR ген і ген, що кодує константну ділянку 1.24 антитіла. людського Н-ланцюга за допомогою Pvul та ВатВміст химерного анти-НМ 1.24 антитіла оціНІ, для конструювання експресувального вектору нюють за такою активністю інгібування зв'язуDHFR- E-HEF-1.24H-g 1 для Η-ланцюга химервання. ного анти-НМ 1.24 антитіла. 1. Вимірювання активності інгібування зв'язу2. Введення гена в клітини СНО вання Для створення системи, що стабільно проду1-1. Конструювання біотинільованого антикує химерне анти-НМ 1.24 антитіло, гени вищезаНМ 1.24 антитіла значених експресувальних векторів HEF-1.24L-g Після того, як мишаче анти-НМ 1.24 антитіло і DHFR- E-HEF-1.24H-g 1, що були лінеаризовані розбавляють 0,1Μ бікарбонатним буфером до за рахунок розщеплення Pvul, одночасно вводять 4мг/мл, 4мкл додають 50мг/мл біотин-Nв СНО клітину DXB11 (отриману з Medical гідроксисукциніміду (виробництво EY LABS Inc.), і Research Council Collaboration Center) методом реакцію ведуть при кімнатній температурі протяелектропорації в умовах, аналогічних вищезазнагом 3 годин. Після цього додають 1,5мл 0,2Μ роченим зазначена вище трансфекція в клітини зчину гліцину, інкубують при кімнатній темпераCOS-7. турі протягом 30хвил для припинення реакції, а 3. Ампліфікація гена за допомогою МТХ потім біотинільовані IgG фракції збирають, викоСеред клітин СНО з введеним геном, лише ті ристовуючи PD-10 колонку (виробництво клітини СНО, в які ввели як експресувальний векPharmacia Biotech). тор L-ланцюги, так і експресувальний вектор Η1-2. Вимірювання активності інгібування зв'яланцюга, можуть вижити в -MEM культуральній зування рідині, не що містить нуклеозиду (виробництво Активність інгібування зв'язування біотиніGIBCO-BRL), до якої додають 500мкг/мл G418 льованим мишачим анти-НМ 1.24 антитілом ви(виробництво GIBCO-BRL) та 10% навколоплідну мірюють за допомогою клітинного ELISA, викорисироватку теляти, і таким чином здійснюють відстовуючи людську амніотичну мембранну бір. Потім до цієї культуральної рідини додають клітинну лінію WISH клітин (АТСС CCL 25). 10нМ МТХ (виробництво Sigma). Серед клонів, Планшети для клітинного ELISA готують так. В що ростуть, відбирають ті, що продукують химер96-лунковий планшет додають 4 105 клітин/мл, не анти-НМ 1.24 антитіло у великій кількості. В приготованих в PRMI 1640 середовищі, доповнерезультаті одержують клони №8-13, які демонному 10% навколоплідною сироваткою теляти, струють ефективність продукування близько інкубують протягом ночі, і, після дворазового 20мкг/мл химерного антитіла, і називають клітинпромивання PBS(-), іммобілізують 0,1% глутараними лініями, які продукують химерне анти-НМ льдегідом (виробник Nakalai tesque). 1.24 антитіло. Після блокування, 50мкл серійних розведенні Приклад 6. химерного анти-НМ 1.24 антитіла або мишачого Конструювання химерного анти-НМ 1.24 ананти-НМ 1.24 антитіла, отриманого афінним очититіла щенням, додають в кожну лунку, і водночас доХимерне анти-НМ 1.24 антитіло конструюють дають 50мкл 2мкг/мл біотинільованого мишачого так. Названі вище клітини СНО, які продукують анти-НМ 1.24 антитіла, інкубують при кімнатній химерне анти-НМ 1.24 антитіло, безперервно температурі протягом 2 годин, а потім додають культивують протягом 30 діб, використовуючи мічений пероксидазою стрептавідин (виробник середовище Дюльбекко, модифіковане Ісковим DACO). Після інкубування при кімнатній темпера(виробництво GIBCO-BRL), що містить 5% сиротурі протягом 1 години з подальшим промиванватку новонародженого теляти, яка не містить ням, додають розчин субстрату. Після того, як гама - глобуліну (виробництво GIBCO-BRL), за реакцію припиняють, додаючи 50мкл 6н сірчаної допомогою приладу для клітинної культури високислоти, вимірюють поглинання на 490нм, викокої щільності Verax system 20 (виробництво ристовуючи рідер MICROPLATE READER Model CELLEX BIOSCIENCE Inc.). 3550 (виробництво Bio Rad). На 13, 20, 23, 26 і 30 добу після початку кульНаведений на Фіг.2 результат, свідчить, що тивування культуральну рідину вилучають, викохимерне анти-НМ 1.24 антитіло має активність ристовуючи фільтрувальний пристрій під тиском інгібування зв'язування з біотинільованим мишаSARTOBRAN (виробництво Sartorius), а потім 43 76934 44 чим анти-НМ 1.24 антитілом ідентичної активносЯк зображено на Фіг.3, якщо химерне антиті мишачого анти-НМ 1.24 антитіла. Це вказує на НМ 1.24 антитіло додають порівняно з контрольте, що химерне антитіло має ту саму V-ділянку, ним IgGl, цитотоксичність зростає з підвищенням що і мишаче анти-НМ 1.24 антитіло. відношення Е:Т, що вказує на те, що це химерне Приклад 8. анти-НМ 1.24 антитіло має ADCC-активність. Крім Вимірювання ADCC-активності химерного антого, оскільки цитотоксичність не спостерігається ти-НМ 1.24 антитіла навіть якщо додають мишаче анти-НМ 1.24 антиADCC (клітинна цитотоксичність, що залетіло, було показано, що Fc-частина людського жить від антитіла) активність вимірюють у спосіб, антитіла необхідна для досягнення ADCC- активвикладений у [Current Protocols in Immunology, ності, якщо ефекторними клітинами є клітини, Chapter 7. Immunologic Studies in humans, Editor. отримані від людини. John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., Приклад 9. 1993]. Конструювання реконструйованого людсько1. Одержання ефекторних клітин го анти-НМ 1.24 антитіла Моноцити виділяють з периферійної крові 1. Створення V-ділянки реконструйованого або кісткового мозку здорових людей і пацієнтів з людського анти-НМ 1.24 антитіла множинною мієломою шляхом центрифугування Для конструювання реконструйованого люду градієнті щільності. Так, рівні кількості PBS(-) ського антитіла, в яке було трансплантовано CDR додають до периферійної крові або кісткового мишачого моноклонального антитіла, більш примозку здорових людей і пацієнтів з множинною йнятним є те, щоб існувала висока гомологічність мієломою, які приміщені на Ficoll (виробник між FR мишачого антитіла і FR людського антитіPharmacia) Conrey (виробник Daiichi ла. Так, V-ділянки L-ланцюга і Η-ланцюга мишаPharmaceutical Co. Ltd.) (питома щільність 1,077), чого анти-НМ 1.24 антитіла порівнюють з Vі центрифугують при 400g протягом 30 хвилин. ділянками всіх відомих антитіл, структуру яких Шар моноцитів збирають, двічі промивають RPMI було встановлено, використовуючи банк даних 1640 (виробник Sigma), доповненою 10% навкоProtein Data Bank. лоплідною сироваткою теляти (виробник Witaker) V-ділянка L-ланцюга мишачого анти-НМ 1.24 антитіла найбільш близька до V-ділянки консен, та готують при щільності клітин 5 106/мл у тій сусної послідовності підгрупи IV (HSGIV) людсьсамій культуральній рідині. кого L-ланцюга з гомологічністю 66,4%. З іншого 2. Одержання клітин-мішеней боку, було показано, що вона гомологічна на В клітинну лінію мієломи людини RPMI 8226 56,9%, 55,8% і 61,5% з HSGI, HSGII та HSGIII, (АТСС CCL 155) вводять радіомітку, шляхом інвідповідно. кубування в RPMI 1640 (виробник Sigma), доповЯкщо V-ділянку L-ланцюга мишачого антиненій 10% навколоплідною сироваткою теляти НМ 1.24 антитіла порівнюють з V-ділянкою L(виробник Witaker), разом з 0,1мКи 51Сr-натрій ланцюга відомих людських антитіл, було показахроматом при 37°С протягом 60 хвилин. Після но, що існує гомологічність 67,0% з V-ділянкою введення радіомітки клітини тричі промивають REI людського L-ланцюга, одного з підгрупи І Vзбалансованим розчином Хенкса (Hanks) (HBSS), ділянки людського L-ланцюга. Тому FR REI викота доводять до концентрації 2 105/мл. ристовують як вихідний матеріал для конструюЗ. ADCC аналіз вання V-ділянки L-ланцюга реконструйованого В 96-лунковий планшет з U-подібним дном людського анти-НМ 1.24 антитіла. (виробник Corning) приміщують 50мкл 2 105 кліСтворюють варіант а V-ділянки L-ланцюга тин-мішеней/мл, 1мкг/мл афінно очищеного хиреконструйованого людського анти-НМ 1.24 анмерного анти-НМ 1.24 антитіла і мишачого антититіла. В цьому варіанті людський FR роблять НМ 1.24 антитіло, або контрольний людський IgG ідентичним до FR на основі REI, наявного у реко(виробник Serotec), та реакцію проводять при 4°С нструйованому людському САМРАТН-1Н антитілі протягом 15 хвилин. 6 [дивись Riechmann, L. et al., Nature 322, 21-25 Потім до цього додають 100мкл 5 10 ефек(19.88), FR що міститься у варіанті а реконструторних клітин/мл, та культивують в інкубаторі з йованого людського РМ-1, описаного в публікації СО2 протягом 4 годин, коли відношення (Е:Т) міжнародної заявки WO 92-19759], і мишачий ефекторних клітин (Е) до мішеневих клітин (Т) CDR роблять ідентичним CDR у V-ділянці Lвстановлюється на рівні 0:1, 5:1, 20:1, або 50:1. ланцюга мишачого анти-НМ 1.24 антитіла. 100мкл надосадової рідини відбирають, і раV-ділянка Η-ланцюга мишачого анти-НМ 1.24 діоактивність, що випромінюється культуральною антитіла найбільш близька до V-ділянки консеннадосадовою рідиною, вимірюють за допомогою сусної послідовності HSGI людського Η-ланцюга лічильника гама-випромінення (ARC3 61, виробз гомологічністю 54,7%. З іншого боку, було поканик Aloka). Для вимірювання максимальної разано, що вона гомологічна на 34,6%, і 48,1% з діоактивності використовують 1% NP-40 (виробHSGII і HSGIII, відповідно. Якщо V-ділянка Ηник BRL). Цитотоксичність (%) розраховують по ланцюга мишачого анти-НМ 1.24 антитіла порівформулі (А-С)/(В-С) 100, де А являє собою ранюють з V-ділянкою Н-ланцюга відомих людських діоактивність (імп/хвил), що випромінюється' в антитіл, то FR1-FR3 виявляються найбільш блиприсутності антитіла, В являє собою радіоактивзькими до V-ділянки Η-ланцюга людського антиність (імп/хвил), що випромінюється за рахунок тіла HG3, одного з підгрупи І V-ділянки людського NP-40, a C являє собою радіоактивність Η-ланцюга [Rechavi, G. et al. , Proc. Natl. Acad. (імп/хвил), що випромінюється культуральною Sci. USA, 80, 855-859] з гомологічністю 67,3%. рідиною без антитіла. 45 76934 46 Тому FR людського антитіла HG3 використорального масла. Потім після першої денатурації в вують як вихідний матеріал для конструювання результаті нагрівання при 94°С, проводять цикл V-ділянки Η-ланцюга реконструйованого людсьреакцій при 94°С 1хвил, при 55°С 1хвил та при кого анти-НМ 1.24 антитіла. Однак оскільки амі72°С 1хвил, а потім інкубують при 72°С протягом нокислотну послідовність FR4 людського HG3 не 10 хвилин. було описано, використовують амінокислотну Продукти ПЛР A-L1A (215п.н.), L1S-L2A послідовність FR4 людського антитіла JH6 (98п.н.), L2S-L3A (140п.н.) і L3S-H (151п.н.) очи[Ravetch, J. V. et al., Cell, 27, 583-591), яка демонщають, використовуючи 1,5% агарозний гель з струє найвищу гомологічність з FR4 Η-ланцюга низькою температурою плавлення, і здійснюють мишачого анти-НМ 1.24 антитіла. FR4 з JH6 має складання у другій ПЛР. У другій ПЛР 98мкл ПЛРту саму амінокислотну послідовність, що і FR4 Ηсуміші, що містить по 1мкг кожного з продуктів ланцюга мишачого анти-НМ 1.24 антитіла, за першої стадії ПЛР і 5Од. Ampli Taq, інкубують винятком однієї амінокислоти. протягом 2 циклів по 94°С 2 хвилини, 55°С 2 хвиУ першому варіанті а V-ділянки Η-ланцюга лини і 72°С 2 хвилини, а потім додають по реконструйованого людського анти-НМ 1.24 ан100пмоль кожного з зовнішніх праймерів (А та Н). титіла, FR1-FR3 роблять ідентиними FR1-FR3 ПЛР-ампули покривають 50мкл мінерального людського HG3, і CDR роблять ідентичним CDR масла і проводять 30 циклів ПЛР за тих самих V-ділянки Η-ланцюга мишачого анти-НМ 1.24 умов, що і раніше. антитіла, за винятком того, що амінокислоти в Фрагмент ДНК у 516п.н., отриманий у другій положенні 30 в людському FR1 і в положенні 71 в ПЛР, очищають, використовуючи 1,5% агарозний людському FR3 роблять ідентичними амінокисгель з низькою температурою плавлення, розщелотам у мишачому анти-НМ 1.24 антитілі. пляють ВатНІ і Hindlll, та отримані таким чином 2. Конструювання V-ділянки L-ланцюга рекофрагменти клонують в HEF експресувальний нструйованого людського анти-НМ 1.24 антитіла вектор HEF-VL-g . Після визначення послідовноL-ланцюг реконструйованого людського антисті ДНК плазміду, що містить фрагмент ДНК з НМ 1.24 антитіла конструюють трансплантацією правильною амінокислотною послідовністю VCDR у спосіб ПЛР. Цей спосіб подано на Фіг.4. ділянки L-ланцюга реконструйованого людського Вісім ПЛР-праймерів використовують для консанти-НМ 1.24 антитіла називають плазмідою труювання реконструйованого людського антиHEF-RVLa-AHM-g . Амінокислотну послідовність і НМ 1.24 антитіла (варіант а), що містить FR, нуклеотидну послідовність V-ділянки L-ланцюга, отриманий з людського антитіла REI. Зовнішні що міститься в цій плазміді HEF-RVLa-AHM-g , праймери А (Послідовність ІД №47) і Η (Послідонаведено в Послідовності ІД №9. вність ІД №48) конструюють для гібридизації з Варіант b V-ділянки L-ланцюга реконструйопослідовністю ДНК експресувального вектору ваного людського анти-НМ 1.24 антитіла консHEF-VL-g . труюють за допомогою мутагенезу, використовуПраймери трансплантації CDR L1S (Послідоючи ПЛР. Праймери мутагенезу FTY-1 вність ІД №49), L2S (Послідовність ІД №50) і L3S (Послідовність ІД №55) і FTY-2 (Послідовність ІД (Послідовність ІД №51) мають смислову послідо№56) сконструйовані таким чином, щоб піддати вність ДНК. Праймери трансплантації CDR L1A мутації фенілаланін в положенні 71, замінивши (Послідовність ІД №52), L2A (Послідовність ІД його на тирозин. №53), і L3A (Послідовність ІД №54) мають антисПісля того, як вищезазначені праймери ампмислову послідовність ДНК, причому кожен місліфікують, використовуючи плазміду HEF-RVLaтить послідовність ДНК (20-23п.н.) комплементаAHM-g як матрицю, кінцевий продукт очищають рну послідовності ДНК у 5'-кінця праймерів L1S, та розщепляють ВатНІ і Hindlll. Одержані таким L2S, і L3S, відповідно. чином фрагменти ДНК клонують в HEF експресуНа першій стадії ПЛР проводять чотири реавальний вектор HEF-VL-g , одержуючи плазміду кції A-L1A, L1S-L2A, L2S-L3A та L3S-H для очиHEF-RVLb-АНМ-g . Амінокислотну послідовність і щення продукту ПЛР. Чотирьом продуктам з нуклеотидну послідовність V-ділянки L-ланцюга, першої ПЛР дають можливість здійснити склащо міститься в цій плазміді HEF-RVLb-АНМ-g , дання один з одним за рахунок їх власної комнаведено у Послідовності ІД №10. плементарності [публікація міжнародної заявки 3. Конструювання V-ділянки Η-ланцюга рекоWO 92-19759]. Потім додають зовнішні праймери нструйованого людського анти-НМ 1.24 антитіла А та Η для ампліфікації повної довжини ДНК, яка 3-1. Конструювання варіантів а-е V-ділянки Ηкодує V-ділянку L-ланцюга реконструйованого ланцюга реконструйованого людського анти-НМ людського анти-НМ 1.24 антитіла, (друга ПЛР). У 1.24 антитіла вищезазначеній ПЛР плазміду HEF-RVL-M21a ДНК, що кодує V-ділянку Η-ланцюга реконст[публікація міжнародної заявки WO 95-14041], що руйованого людського анти-НМ 1.24 антитіла, кодує варіант а V-ділянки L-ланцюга реконструконструюють так. Зв'язуючи послідовність ДНК, йованого людського ONS-M21 антитіла на основі яка кодує FR1 до 3 людського антитіла HG3, і FR, одержаної з людського антитіла REI, викориFG4 людського антитіла JH6 з послідовністю стовують як матрицю. ДНК, що кодує CDR V-ділянки Η-ланцюга мишаНа першій стадії ПЛР використовують ПЛРчого анти-НМ 1.24 антитіла, конструюють повної суміш, що містить 10мМ Трис-НСІ (рН 8,3), 50мМ довжини ДНК, яка кодує V-ділянку Н-ланцюга КСI, 0,1мМ дНТФ, 1,5мМ МgСl2, 100нг матричної реконструйованого людського анти-НМ 1.24 анДНК, 100 пмоль кожного праймера і 5Од. Ampli титіла. Taq. Кожну ампулу ПЛР покривають 50мкл мінеПотім до 5'-кінця і 3'-кінця цієї послідовності 47 76934 48 ДНК приєднують Hindlll розпізнавальний треоніну в положенні 73 на лізин, а як матричну сайт/KOZAK консенсусну послідовність і ВатНІ ДНК плазміду HEF-RVHa-AHM-g 1, методом ПЛР розпізнавальний сайт/сплайсингову донорну посваріант с ампліфікують, одержуючи плазміду лідовність, відповідно, таким чином, щоб забезHEF-RVHc-AHM-g 1. печити вбудовування HEF експресувального векАмінокислотну послідовність і нуклеотидну. тору. послідовність V-ділянки Η-ланцюга, що міститься Сконструйовану таким чином послідовність в цій плазміді HEF-RVHc-AHM-g 1, наведено в ДНК поділяють на 4 олігонуклеотиди. Потім оліПослідовності ІД №13. гонуклеотиди, які потенційно ускладнюють склаВикористовуючи праймери мутагенезу DS дання цих олігонуклеотидів, піддають комп'ютер(Послідовність ІД №67) і DA (Послідовність ІД ному аналізу щодо вторинної структури. №68) сконструйовані для здійснення мутації аргіПослідовності чотирьох олігонуклеотидів RVH1ніну в положенні 66 на лізин і треоніну в полоRVH4 наведені в Послідовностях ІД №57-60. Ці женні 73 на лізин, а як матричну ДНК плазміду олігонуклеотиди мають довжину від 119 до 144 HEF-RVHa-AHM-g 1, методом ПЛР варіант d амоснов і містять 25-26п.н. ділянки, що перекривапліфікують, одержуючи плазміду HEF-RVHdються. Серед цих олігонуклеотидів, RVH2 (ПосліAHM-g 1. Амінокислотну послідовність та нуклеодовність ІД №58) і RVH4 (Послідовність ІД №60) тидну послідовність V-ділянки Η-ланцюга, що мають смислову послідовність ДНК, а RVH1 (Поміститься у цій плазміді HEF-RVHd-AHM-g 1, послідовність ІД №57) і RVH3 (Послідовність ІД дано в Послідовності ІД №14. №59) мають антисмислову послідовність. Спосіб Використовуючи праймери мутагенезу ES складання цих чотирьох олігонуклеотидів за до(Послідовність ІД №69) і ЕА (Послідовність ІД помогою ПЛР подано на Фіг.5. №70) сконструйовані для здійснення мутації ваПЛР-суміш (98мкл) , що містить 100нг кожноліну в положенні 67 на аланін і метіоніну в полого з чотирьох олігонуклеотидів і 5Од. Ampli Taq, женні 69 на лейцин, а як матричну ДНК плазміду спочатку денатурують, нагріваючи при 94°С проHEF-RVHa-AHM-g 1, варіант є ампліфікують, тягом 2 хвилин, а потім проводять 2 цикли інкуодержуючи плазміду HEF-RVHe-AHM-g 1. Амінобування, що включає 94°С протягом 2 хвилин, кислотну послідовність і нуклеотидну послідов55°С протягом 2 хвилин і 72°С протягом 2 хвиність V-ділянки Η-ланцюга, що міститься у цій лин. Після того, як 100пмоль кожного з RHP1 плазміді HEF-RVHe-AHM-g 1, наведено у Послі(Послідовність ІД №61) і RHP2 (Послідовність ІД довності ІД №15. №62) додають як зовнішні праймери, ПЛР ампулу 3-2. Конструювання гібридної V-ділянки Нпокривають 50мл мінерального масла. Потім ланцюга спочатку здійснюють денатурацію, нагріваючи Конструюють дві гібридні V-ділянки Ηпри 94°С протягом 1 хвилини, а потім проводять ланцюга. Одна є мишачим/людським гібридним 38 циклів, що складаються з 94°С протягом 1 анти-НМ 1.24 антитілом, в якому амінокислотні хвилини, 55°С протягом 1 хвилини і 72°С протяпослідовності FR1 і FR2 одержані з мишачого гом 1 хвилини, а потім інкубують при 72°С протяанти-НМ 1.24 антитіла, а послідовності FR3 і FR4 гом 10 хвилин. отримані з варіанту а V-ділянки Η-ланцюга рекоФрагмент ДНК 438п.н. очищають, використонструйованого людського анти-НМ 1.24 антитіла, вуючи 1,5% агарозний гель з низькою температуа інша є людським/мишачим гібридним анти-НМ рою плавлення, розщепляють ВатНІ і Hindlll, а 1.24 антитілом, в якому амінокислотні послідовпотім клонують в HEF експресувальний вектор ності FR1 і FR2 отримані з варіанту а V-ділянки HEF-VH-g 1. Після визначення нуклеотидної посΗ-ланцюга реконструйованого людського антилідовності плазміду, яка містить фрагмент ДНК, НМ 1.24 антитіла, а послідовності FR3 і FR4 що кодує амінокислотну послідовність правильної отримані з мишачого анти-НМ 1.24 антитіла. Всі V-ділянки Η-ланцюга, називають HEF-RVHaамінокислотні послідовності CDR ділянок отриAHM-g 1. Амінокислотну послідовність і нуклеомані з мишачого анти-НМ 1.24 антитіла. тидну послідовність V-ділянки Η-ланцюга, що Методом ПЛР конструюють дві гібридні Vміститься в цій плазміді HEF-RVHa-AHM-g 1l, ділянки Н-ланцюга. Цей метод схематично навенаведено у Послідовності ІД №11. дено на Фіг.6 і 7. Для конструювання двох гібридКожен з варіантів b, с, d, і e V-ділянки Ηних V-ділянок Η-ланцюга використовують чотири ланцюга реконструйованого людського анти-НМ праймери. Зовнішні праймери а (Послідовність ІД 1.24 антитіла конструюють так. №71) і h (Послідовність ІД №72) сконструйовані Використовуючи праймери мутагенезу BS таким чином, щоб вони гібридизувались з послі(Послідовність ІД №63) і ВА (Послідовність ІД довністю ДНК HEF експресувального вектору №64), сконструйовані для здійснення мутації арHEF-VH-g 1. Праймер HYS гібридної конструкції гініну в положенні 66 на лізин, а як матричну ДНК Н-ланцюга (Послідовність ІД №73) сконструйоваплазміду HEF-RVHa-AHM-g 1, методом ПЛР вано таким чином, що містить смислову послідовріант bампліфікують, одержуючи плазміду HEFність ДНК, а гібридний праймер Η-ланцюга HYA RVHb-AHM-g 1. Амінокислотну послідовність і (Послідовність ІД №74) має антисмислову послінуклеотидну послідовність V-ділянки Η-ланцюга, довність ДНК, так, що ці послідовності ДНК комщо містяться в цій плазміді HEF-RVHb-AHM-g 1, плементарні одна одній. наведено в Послідовності ІД №12. Для конструювання гібридної V-ділянки ΗВикористовуючи праймери мутагенезу CS ланцюга, де амінокислотні послідовності FR1 і (Послідовність ІД №65) і СА (Послідовність ІД FR2 отримані з мишачого анти-НМ 1.24 антитіла, №66), сконструйовані для здійснення мутації 49 76934 50 а послідовності FR3 і FR4 з варіанту а V-ділянки лотну послідовність гібридної V-ділянки ΗН-ланцюга реконструйованого людського антиланцюга, де амінокислотні послідовності FR1 і НМ 1.24 антитіла, здійснюють ПЛР, використовуFR2 отримані з варіанту а V-ділянки Н-ланцюга реконструйованого людського анти-НМ 1.24 анючи як матрицю плазміду HEP-1.24H-g 1, зовніштитіла, а послідовності FR3 і FR4 з мишачого анній праймер а, і гібридний праймер Н-ланцюга ти-НМ 1.24 антитіла, називають HEF-HM-RVHHYA, та ПЛР, використовуючи як матрицю плазAHM-g 1. Амінокислотну послідовність і нуклеоміду HEF-RVHa-AHM-g 1, та гібридний праймер тидну послідовність V-ділянки Н-ланцюга, що Η-ланцюга HYS (Послідовність ІД №73), і зовнішній праймер h (Послідовність ІД №72), здійснюміститься у цій плазміді HEF-MH-RVH-AHM-g 1, ють на першій стадії ПЛР, і кожний продукт ПЛР подано в Послідовності ІД №76. очищають. Двом продуктам першої ПЛР дають 3-3. Конструювання варіантів f-s V-ділянки Ηможливість здійснити складання за рахунок влаланцюга реконструйованого людського анти-НМ сної комплементарності [публікація міжнародної 1.24 антитіла заявки WO 92-197 59]. Кожен з варіантів f, g, h, і, j, k, 1, m, n, ο, p, q, Потім, додаючи зовнішні праймери а (Посліr, і s V-ділянки Η-ланцюга реконструйованого довність ІД №71) і h (Послідовність ІД №72) на людського анти-НМ 1.24 антитіла конструюють другій стадії ПЛР ампліфікують повної довжини так. ДНК, яка кодує гібридну V-ділянку Η-ланцюга, де Використовуючи праймери мутагенезу FS амінокислотні послідовності FR1 і FR2 отримані з (Послідовність ІД №78) і FA (Послідовність ІД мишачого анти-НМ 1.24 антитіла, а послідовності №79), сконструйовані для здійснення мутації FR3 і FR4 отримані з варіанту а V-ділянки Ηтреоніну в положенні 75 на серин і валіну в пололанцюга реконструйованого людського анти-НМ женні 78 на аланін, а як матричну ДНК плазміду 1.24 антитіла. HEF-RVHe-AHM-g 1, за допомогою ПЛР варіант f Для конструювання гібридної V-ділянки Ηампліфікують, одержуючи плазміду HEF-RVHfланцюга, де амінокислотні послідовності FR1 і AHM-g 1. Амінокислотну послідовність і нуклеоFR2 отримані з варіанту а V-ділянки Η-ланцюга тидну послідовність V-ділянки Н-ланцюга, що реконструйованого людського анти-НМ 1.24 анміститься у цій плазміді HEF-RVHf-AHM-g 1, титіла, а послідовності FR3 і FR4 з мишачого анyfdtltyj в Послідовності ІД №16. ти-НМ 1.24 антитіла, проводять ПЛР, використоВикористовуючи праймери мутагенезу GS вуючи як матрицю плазміду HEF-RVHa-AHM-g 1, (Послідовність ІД №80) і GA (Послідовність ІД зовнішній праймер а, і гібридний праймер HYA Η№81) сконструйовані для здійснення мутації алаланцюга, і ПЛР, використовуючи плазміду HEFніну в положенні 40 на аргінін, як матричну ДНК 1.24H-g 1 як матрицю, гібридний праймер HYS Hплазміду HEF-RVHa-AHM-g 1, варіант g ампліфіланцюга, та зовнішній праймер h, здійснюють на кують, одержуючи плазміду HEF-RVHg-AHM-g 1. першій стадії ПЛР, і кожний продукт ПЛР очищаАмінокислотну послідовність і нуклеотидну посліють. Двом очищеним продуктам першої ПЛР дадовність V-ділянки Η-ланцюга, що. міститься у цій ють можливість здійснити складання за рахунок плазміді HEF-RVHg-AHM-g 1, подано в Послідоввласної комплементарності [публікація міжнародності ІД №17. ної заявки WO 92-19759]. Використовуючи праймери мутагенезу FS Потім, додаючи зовнішні праймери а і h, пов(Послідовність ІД №78) і FA (Послідовність ІД ної довжини ДНК, що кодує гібридну V-ділянку Η№79), а як матричну ДНК плазміду HEF-RVHbланцюга, де амінокислотні послідовності FR1 і AHM-g 1, варіант h ампліфікують, одержуючи FR2 отримані з варіанту а V-ділянки Н-ланцюга плазміду HEF-RVHh-AHM-g 1. Амінокислотну реконструйованого людського анти-НМ 1.24 анпослідовність і нуклеотидну послідовність Vтитіла, а послідовності FR3 і FR4 з мишачого анділянки Η-ланцюга, що міститься у цій плазміді ти-НМ 1.24 антитіла, ампліфікують на другій стаHEF-RVHh-AHM-g 1, подано в Послідовності ІД дії ПЛР. №18. Способи проведення першої ПЛР, очищення Використовуючи праймери мутагенезу IS продуктів ПЛР, складання, здійснення другої ПЛР (Послідовність ІД №82) і ІА (Послідовність ІД та клонування в HEF вектор HEF-VH-g 1 здійс№83), сконструйовані для здійснення мутації арнюють згідно з способами, наведеними у "Прикгініну в положенні 83 на аланін і серину в пололад 9. Конструювання V-ділянки L-ланцюга рекоженні 84 на фенілаланін, а як матричну ДНК планструйованого людського анти-НМ 1.24 антитіла". зміду HEF-RVHh-AHM-g 1, варіант і Після визначення послідовності ДНК плазміампліфікують, одержуючи плазміду HEF-RVHiду, що містить фрагмент ДНК, що кодує правильAHM-g 1. Амінокислотну послідовність і нуклеону амінокислотну послідовність гібридної Vтидну послідовність V-ділянки Η-ланцюга, що ділянки Η-ланцюга, де амінокислотні послідовноміститься у .цій плазміді HEF-RVHi-AHM-g 1, насті FR1 і FR2 отримані з мишачого анти-НМ 1.24 ведено у Послідовності ІД №19. антитіла, а послідовності FR3 і FR4 отримані з Використовуючи праймери мутагенезу JS варіанту а V-ділянки Н-ланцюга реконструйова(Послідовність ІД №84) і JA (Послідовність ІД ного людського анти-НМ 1.24 антитіла, назива№85), сконструйовані для здійснення мутації арють HEF-MH-RVH-AHM-g 1. Амінокислотну посгініну в положенні 66 на лізин, а як матричну ДНК лідовність і нуклеотидну послідовність V-ділянки плазміду HEF-RVHf-AHM-g 1, варіант j ампліфіΗ-ланцюга, що міститься у цій плазміді HEF-MHкують, одержуючи плазміду HEF-RVHj-AHM-g 1. RVH-AHM-g 1, наведено в Послідовності ІД №75. Амінокислотну послідовність і нуклеотидну посліТакож плазміду, що містить правильну амінокис 51 76934 52 довність V-ділянки Н-ланцюга, що міститься у цій наведено в Послідовності ІД №26. Використовуючи праймери мутагенезу QS плазміді HEF-RVHj-AHM-g 1, подано в Послідов(Послідовність ІД №98) і QA (Послідовність ІД ності ІД №20. №99), сконструйовані для здійснення мутації Використовуючи праймери мутагенезу KS треоніну в положенні 75 на серин, а як матричну (Послідовність ІД №86) і КА (Послідовність ІД №87), сконструйовані для здійснення мутації глуДНК плазміду HEF-RVHa-AHM-g 1, варіант q амтамінової кислоти в положенні 81 на глутамін, а пліфікують методом ПЛР, одержуючи плазміду як матричну ДНК плазміду HEF-RVHh-AHM-g 1, HEF-RVHq-AHM-g 1. Амінокислотну послідовваріант k ампліфікують, одержуючи плазміду ність і нуклеотидну послідовність V-ділянки Нланцюга, що міститься у цій плазміді HEF-RVHqHEF-RVHk-AHM-g 1. Амінокислотну послідовність і нуклеотидну послідовність V-ділянки Η-ланцюга, AHM-g 1, наведено у Послідовності ІД №27. Використовуючи праймери мутагенезу CS що міститься у цій плазміді HEF-RVHk-AHM-g 1, (Послідовність ІД №65) і СА (Послідовність ІД подано у Послідовності ІД №21. №66), а як матричну ДНК плазміду HEF-RVHpВикористовуючи праймери мутагенезу LS (Послідовність ІД №88) і LA (Послідовність ІД AHM-g 1, варіант г ампліфікують методом ПЛР, №89), сконструйовані для здійснення мутації глуодержуючи плазміду HEF-RVHr-AHM-g 1. Амінотамінової кислоти в положенні 81 на глутамін і кислотну послідовність і нуклеотиднупослідовсерину в положенні 82В на ізолейцин, а. як матність V-ділянки Η-ланцюга, що міститься у цій ричну ДНК плазміду HEF-RVHh-AHM-g 1, варіант плазміді HEF-RVHr-AHM-g 1, наведено в Послі1 ампліфікують, одержуючи плазміду HEF-RVHlдовності ІД №28. AHM-g 1. Амінокислотну послідовність і нуклеоВаріант s V-ділянки Η-ланцюга реконструйотидну послідовність V-ділянки Н-ланцюга, що ваного людського анти-НМ 1.24 антитіла конструюють за допомогою мутагенезу, використовуміститься у цій плазміді HEF-RVHl-AHM-g 1, наючи ПЛР. Праймери мутагенезу SS ведено в Послідовності ІД №22. (Послідовність ІД №100) і SA (Послідовність ІД Використовуючи праймери мутагенезу MS №101) конструюють для здійснення мутації меті(Послідовність ІД №90) і МА (Послідовність ІД оніну в положенні 69 на ізолейцин. №91) сконструйовані для здійснення мутації глуПісля того, як вищезазначений праймер амптамінової кислоти в положенні 81 на глутамін, ліфікують, використовуючи як матрицю плазміду серину в положенні 82В на ізолейцин, і треоніну в HEF-RVHr-AHM-g 1, кінцевий продукт очищають, положенні 87 на серин, а як матричну ДНК плазрозщепляють ВатНІ і HindllІ, і одержаний фрагміду HEF-RVHh-AHM-g 1, варіант m ампліфікумент ДНК клонують в HEF експресувальний векють, одержуючи плазміду HEF-RVHm-АНМ- g 1. тор HEF-VH-g 1, одержуючи плазміду HEF-RVHsАмінокислотну послідовність і нуклеотидну послідовність V-ділянки Η-ланцюга, що міститься у цій AHM-g 1. Амінокислотну послідовність і нуклеотидну послідовність V-ділянки Η-ланцюга, що плазміді HEF-RVHm-АНМ-g 1, подано у Послідовності ІД №23. міститься у цій плазміді HEF-RVHs-AHM-g 1, наВикористовуючи праймери мутагенезу NS ведено в Послідовності ІД №102. (Послідовність ІД №92) і NA (Послідовність ІД Ділянки, що кодують варіабельну ділянку ко№93), сконструйовані для здійснення мутації сежної з зазначених вище плазмід HEF-RVLa-AHMрину в положенні 82В на ізолейцин, а як матричg і HEF-RVHr-AHM-g 1, розщепляють для одерну ДНК плазміду HEF-RVHh-AHM-g 1, варіант n жання рестрикційних фрагментів ферментами ампліфікують, одержуючи плазміду HEF-RVHnрестрикції Hindlll і ВатНІ. Їх вбудовують в Hindlll і ВатНІ сайти плазмідАНМ-g 1. Амінокислотну послідовність і нуклеоного вектора pUC19. Кожну плазміду називають тидну послідовність V-ділянки Н-ланцюга, що pUC19-RVLa-AHM-g і pUCl9-RVHr-AHM-g 1. міститься у цій плазміді HEF-RVHn-АНМ-g 1, поEschericia coli, які містять кожну з плазмід дано в Послідовності ІД №24. Використовуючи праймери мутагенезу OS pUC19-RVLa-AHM-g і pUC19-RVHr-AHM-g 1, (Послідовність ІД №94) і ОА (Послідовність ІД називають Eschericia coli DH5 (PUC19-RVLa№95), сконструйовані для здійснення мутації AHM-g ) і Eschericia coli DH5 (pUC19-RVHrтреоніну в положенні 87 на серин, а як матричну AHM-g 1), відповідно, та їх було інтернаціонально ДНК плазміду HEF-RVHh-AHM-g 1, варіант о амдепоновано 29 серпня 1996г. the National Institute пліфікують, одержуючи плазміду HEF-RVHoof Bioscience and Human-Technology, Agency of AHM-g 1. Амінокислотну послідовність і нуклеоIndustrial Science and Technology, MITI [Higashi 1тидну послідовність V-ділянки Н-ланцюга, що Chome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan] міститься у цій плазміді HEF-RVHo-AHM-g 1, напід реєстраційними номерами FERM BP-5645 і ведено в Послідовності ІД №25. FERM BP-5643, відповідно, згідно з БудапештсьВикористовуючи праймери мутагенезу PS кою угодою. (Послідовність ІД №96) і РА (Послідовність ІД Ділянки, що кодують варіабельну ділянку ви№97), сконструйовані для здійснення мутації ващезазначеної плазміди HEF-RVHs-AHM-g 1, роліну в положенні 78 на аланін, а як матричну ДНК зщепляють для одержання рестрикційних фрагплазміду HEF-RVHa-AHM-g 1, варіант ρ ампліфіментів ферментами рестрикції Hindlll і ВатНІ. Їх кують методом ПЛР, одержуючи плазміду HEFвбудовують в Hindlll і ВатНІ сайти плазмідного вектору pUC19. Отриману плазміду називають RVHp-AHM-g 1. Амінокислотну послідовність і нуклеотидну послідовність V-ділянки Н-ланцюга, pUC19-RVHs-AHM-g 1. Eschericia coli, яка містить плазміду pUC19що міститься в цій плазміді HEF-RVHp-AHM-g 1, 53 76934 54 COS-7 клітини за допомогою електропорації, виRVHs-AHM-g 1, називають Eschericia coli DH5 користовуючи прилад Gene Pulser (виробник (pUCl9-RVHs-AHM-g 1), і її було інтернаціонально BioRad). Кожну ДНК (10мкг) додають до 0,8мл депоновано 29 вересня 1997г, the National аліквот 1 107кл/мл в PBS, і обробляють імпульInstitute of Bioscience and Human-Technology, сами при 1500В і ємності 25мкФ. Agency of Industrial Science and Technology, MITI Після 10 хвилинного відновного періоду при [Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki кімнатній температурі, клітини, що піддалися prefecture, Japan] під реєстраційним номером електропорації, додають до 30мл DMEM культуFERM BP-6127, згідно з Будапештською угодою. рального середовища (виробник GIBCO), що міс4. Конструювання реконструйованого людсьтить 10% навколоплідну сироватку теляти без кого анти-НМ 1.24 антитіла, химерного анти-НМ гама-глобуліну. Після 72 годин інкубування в ін1.24 антитіла і антитіла з гібриднимΗ-ланцюгом кубаторі СО2 BNA120D (виробник ТАВАІ) в умоДля оцінки кожного з ланцюгів реконструйовах 37°С і 5% СО2, надосадову культуральну ріваного людського анти-НМ 1.24 антитіла, нададину збирають, осколки клітин вилучають ють можливість експресуватись реконструйовацентрифугуванням при 1000об/хвил протягом ному людському анти-НМ 1.24 антитілу і 5хвил в центрифузі 05PR-22 (виробник HITACHI), химерному анти-НМ 1.24 антитілу, як позитивнощо має центрифужний ротор 03 (виробник му контролю. При конструюванні кожного з варіаHITACHI), і мікроконцентратор (Centricon, виробнтів b і далі V-ділянки Н-ланцюга реконструйованик Amicon), та концентрують за допомогою ульного людського анти-НМ 1.24 антитіла, Ηтрафільтрування, використовуючи центрифугу ланцюгу гібридного антитіла надають можливість J2-21 (виробник BECKMAN), що має центрифугоекспресуватись для того, щоб визначити, яку амівий ротор JA-20.1 (виробник BECKMAN), і стеринокислотну послідовність в FR слід замістити. лізують фільтруванням, використовуючи фільтр Крім того, її експресують у поєднанні з химерним Millex GV13mm (виробник Міllіроre), і застосовуН-ланцюгом для того, щоб оцінити варіант a Lють для клітинного ELISA. ланцюга реконструйованого людського анти-НМ 4-2. Експресія химерного анти-НМ 1.24 анти1.24 антитіла. тіла 4-1. Експресія реконструйованого людського Використовуючи 10мкг кожного з експресуваанти-НМ 1.24 антитіла льних векторів HEF-1.24H-g 1 для Η-ланцюга 10мкг кожного з експресувальних векторів химерного анти-НМ 1.24 антитіла і експресуваль(HEF-RVHa-AHM-g 1 до HEF-RVHr-AHM-g 1) для Η-ланцюга реконструйованого людського антиний вектор HEF-1.24L-g для L-ланцюга химерноНМ 1.24 антитіла, і експресувального вектора го анти-НМ 1.24 антитіла, химерне анти-НМ 1.24 антитіло, яке треба використовувати для клітин(HEF-RVLa-AHM-g або HEF-RVLb-AHM-g ) для ного ELISA, готують згідно з вищезазначеним L-ланцюга реконструйованого людського антиспособом для експресії реконструйованого людНМ 1.24 антитіла котрансформують у COS-7 кліського анти-НМ 1.24 антитіла. тини за допомогою електропорації, використову4-3. Експресія анти-НМ 1.24 антитіла, що ючи прилад Gene Pulser (виробник BioRad). Кожвключає варіант а гуманізованого L-ланцюга і ну ДНК (10мкг) додають до 0,8мл аліквот химерний Η-ланцюг 1 107кл/мл в PBS, і обробляють імпульсами при Використовуючи 10мкг кожного з експресува1500В і ємності 25мкФарад. льних векторів HEF-1.24H-g 1 для Η-ланцюга Після 10 хвилинного відновного періоду при химерного анти-НМ 1.24 антитіла і експресувалькімнатній температурі, клітини, що піддалися електропорації, додають до 30мл DMEM культуний вектор HEF-RVLa-AHM-g для варіанту a Lрального середовища (виробник GIBCO), що місланцюга реконструйованого людського анти-НМ тить 10% навколоплідноу сироватку теляти без 1.24 антитіла, анти-НМ 1.24 антитіло, яке вклюгамаглобуліну. Після 72 годин інкубування в інкучає варіант а гуманізованого L-ланцюга і химербаторі СO2 BNA120D (виробник ТАВАІ) в умовах ний Η-ланцюг, що його треба використовувати 37°С і 5% СО2, надосадову культуральну рідину для клітинного ELISA, одержують згідно з назвазбирають, осколки клітин вилучають центрифугуним вище способом для експресії реконструйованням при 1000об/хвил протягом 5 хвил в ваного людського анти-НМ 1.24 антитіла. центрифузі 15PR-22 (виробник HITACHI), що має 4-4. Експресія антитіла з гібридним Ηцентрифужний ротор 03 (виробник HITACHI), і ланцюгом мікроконцентратор (Centricon, виробник Amicon), і Використовуючи 10мкг кожного з експресувапіддають ультрафільтруванню, використовуючи льних векторів HEF-MH-RVH-AHM-g 1 або HEFцентрифугу J2-21 (виробник BECKMAN), що має HM-RVH-AHM-g 1) для V-ділянки гібридного Ηцентрифужний ротором JA-20.1 (вирбник ланцюга і експресувальний вектор HEF-RVLaBECKMAN), і використовують для клітинного AHM-g для L-ланцюга реконструйованого людELISA. ського анти-НМ 1.24 антитіла, антитіло з гібридЕкспресія реконструйованого людського анним Η-ланцюгом, яке треба використовувати для ти-НМ 1.24 антитіла (2) клітинного ELISA, одержують згідно з названим 10мкг кожного з експресувальних векторів вище способом для експресії реконструйованого (HEF-RVHs-АНМ-g 1) для варіанту "s" Η-ланцюга людського анти-НМ 1.24 антитіла. реконструйованого людського анти-НМ 1.24 ан4-5. Визначення концентрації антитіл титіла, і експресувальний вектор (HEF-RVLaКонцентрацію отриманих антитіл визначають AHM-g ) для L-ланцюга реконструйованого людза допомогою ELISA. Кожну з лунок 96-лункового ського анти-НМ 1.24 антитіла котрансформують в 55 76934 56 планшета ELISA (Maxisorp, виробник NUNC) ім5-3. Ампліфікація генів за допомогою МТХ мобілізують, додаючи 100мкг козячого антиСеред клітин СНО з введеними генами лише людський IgG антитіла (виробник BIO SOURCE), ті клітини СНО, в які були введені експресувальні приготованого в концентрації 1мкг/мл у вкриваювектори як L-, так і Н-ланцюгів, можуть виживати чому буфері (0,1Μ NaHCO3, 0,02% NaN3, ρΗ 9,6) в -MEM культуральному середовищі без нуклета інкубують при кімнатній температурі протягом озиду (виробник GIBCO-BRL), до якого додано 1 години. Після блокування 100мкл буферу для 500мкг/мл G418 (виробник GIBCO-BRL) і 10% розведення (50мМ Трис-НСІ, 1мМ МgСl2, 0,15Μ навколоплідну сироватку теляти, і це дає змогу NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN3, 1% бичачого здійснити відбір. Потім 10нМ МТХ (виробник сироваткового альбуміну (BSA), рН 8,1), 100мкл Sigma) додають до вищезазначеного культуралькожного з розведень культуральної надосадовоі ного середовища. Серед клонів, що розростарідини клітин COS-7 секретуючих реконструйоваються, відбирають ті клони, які продукують реконе людське анти-НМ 1.24 антитіло, химерне антинструйоване людське анти-НМ 1.24 антитіло у НМ 1.24 антитіло, або антитіло з гібридним Ηбільшій кількості. В результаті одержують клон 1, ланцюгом, що їх було сконцентровано ультрафіщо демонструє ефективність продукування блильтруванням, додають в кожну лунку та інкубують зько 3мкг/мл реконструйованого людського антипри кімнатній температурі протягом однієї години. НМ 1.24 антитіла, і його називають клітинною Потім після промивання додають 100мкл козячолінією, що продукує реконструйоване людське го антитіла проти людського IgG, міченого лужанти-НМ 1.24 антитіло. ною фосфатазою (виробник DACO). 5-4. Конструювання реконструйованого людПісля інкубування при кімнатній температурі ського анти-НМ 1.24 антитіла протягом 1 години і промивання додають 100мкл Кеконструйоване анти-НМ 1.24 антитіло субстратного розчину в концентрації 1мкг/мл конструюють так. Названі вище клітини СНО, що (Sigma 104, п-нітрофенілфосфат, SIGMA), розчипродукують реконструйоване людське анти-НМ неного в субстратному буфері (50мМ NaHCO3, 1.24 антитіло, культивують протягом 10 днів, ви10мМ МgСl2, рН 9,8), а потім вимірюють погликористовуючи як середовище -MEM культуранання на 405нм, використовуючи рідер льне середовище без нуклеозиду (виробник MICROPLATE READER Model 3550 (виробник GIBCO-BRL), до якого додано 500мкг/мл G418 BioRad). Як стандарт для вимірювання концент(виробник GIBCO-BRL) і 10% навколоплідну сирації застосовують людський IgGlK (виробник The роватку теляти, використовуючи СО2 інкубатор Binding Site). BNAS120D (виробник ТАВАІ) за умов 37°С і 5% 5. Створення клітинної лінії СНО, яка стабіСО2. На 8 і 10 добу після початку культивування льно продукує реконструйоване людське антикультуральну рідину вилучають, клітинні осколки НМ 1.24 антитіло вилучають центрифугуванням протягом 10хвил 5-1. Конструювання експресувального вектопри 2000об/хвил, використовуючи центрифугу ру для Н-ланцюга реконструйованого людського RL-500SP (виробник Tomy Seico), що має ротор анти-НМ 1.24 антитіла TS-9, а потім стерилізують на фільтрі, використоРозщепляючи плазміду HEF-RVHr-AHM-g 1 вуючи фільтр, що закінчується колбою (виробник ферментами рестрикції Pvul і ВатНІ, фрагмент FALCON) з мембраною з діаметром отворів близько 2,8т.п.н., що містить ДНК, яка кодує про0,45мкм. мотор EFI і V-ділянку Н-ланцюга реконструйоваПісля того, як рівні кількості PBS(-) додають ного людського анти-НМ 1.24 антитіла, виділядо культуральноі рідини клітин СНО, що продують, використовуючи 1,5% агарозний гель з кують реконструйоване людське анти-НМ 1.24 низькою температурою плавлення. Потім вищеантитіло, реконструйоване людське анти-НМ 1.24 зазначений фрагмент ДНК вбудовують в приблиантитіло афінно очищують, використовуючи визно 6т.п.н. фрагмент, отриманий внаслідок розсокошвидкісну систему очищування антитіл щеплення експресувального вектору, який ConSep LC100 (виробник MILLIPORE) та колонку використовували для експресувального вектору Hyper D Protein А (виробник Nippon Gaishi), виколюдського Н-ланцюга, DHFR- E-RVh-PM1f [пубристовуючи PBS(-) як абсорбувальлікація міжнародної заявки WO 92-19759], що ний/промивальний буфер і 0,1Μ натрійцитратний містить ген DHFR та ген, який кодує константну буфер (рН 3) як елюювальний буфер згідно з ділянку людського Н-ланцюга, за допомогою Pvul інструкціями, що додаються. рН елюйованих і ВатНІ для конструювання експресувального фракцій доводять приблизно до 7,4, одразу ж додаючи 1Μ Трис-НСІ (рН 8,0), а потім здійснювектору DHFR- Ε-HEF-RVHr-AHM-g 1 для Нють, використовуючи ультрафільтрувальний конланцюга реконструйованого анти-НМ 1.24 антицентратор з центрифугою Centriprep-10 (виробтіла. ник MILLIPORE), концентрування та заміщення 5-2. Введення гена в клітини СНО на PBS(-), стерилізують на фільтрі, використовуДля створення системи, що стабільно продуючи мембранний фільтр MILLEX-GV (виробник кує реконструйоване людське анти-НМ 1.24 антиMILLIPORE) з розміром пор 0,22мкм, одержуючи тіло, гени зазначених вище експресувальних векочищене реконструйоване людське анти-НМ 1.24 торів, DHFR- E-HEF-RVHr-AHM-g 1 та HEFантитіло. Концентрацію антитіл вимірюють по RVLa-AHM-g , що їх було лінеаризовано внасліпоглинанню на 280нм, приймаючи концентрацію док розщеплення Pvul, одночасно вводять в клі1мг/мл такою, що відповідає 1,35ОП. тини СНО DXB-11 методом електропорації за Приклад 11. умов, аналогічних до зазначених вище (трансфеВизначення активності реконструйованого кція вищезазначених клітин COS-7). 57 76934 58 людського анти-НМ 1.24 антитіла активності інгібування зв'язування при об'єднанні Проводять оцінку активності зв'язування анз варіантами a, b, f, або h H-ланцюга. Як видно на тигену і активності інгібування зв'язування реконФіг.9, 10, 11 і 12 варіант а L-ланцюга має більш струйованого людського анти-НМ 1.2 4 антитіла. високу активність, ніж варіант b щодо обох актив1. Спосіб вимірювання активності зв'язування ностей для всіх варіантів a, b, f і h H-ланцюга. антигену і активності інгібування зв'язування Тому для подальших експериментів використову1-1. Вимірювання активності зв'язування анвали варіант а L-ланцюга реконструйованого тигену людського анти-НМ 1.24 антитіла. Активність зв'язування антигену вимірюють 2-2. Варіанти а-е Η-ланцюга за допомогою клітинного ELISA, використовуючи Варіанти а-е Η-ланцюга реконструйованого клітини WISH. Планшети клітинного ELISA готулюдського анти-НМ 1.24 антитіла оцінювали у ють, як зазначалось вище у прикладі 7.1-2. поєднанні з варіантом а L-ланцюга по даним виПісля блокування в кожну лунку додають мірювання активності зв'язування антигену і ак100мкл серійних розведень реконструйованого тивності інгібування зв'язування. Результати полюдського анти-НМ 1.24 антитіла, що його отриказують, як видно на Фіг.11, 13, 14 і 15, що всі мали з концентрату культуральної надосадової варіанти виявились слабкішими у термінах обох рідини клітин COS-7, або виділили з культуральактивностей порівняно з химерним анти-НМ 1.24 ної надосадової рідини клітин СНО. Після 2 годин антитілом, що припускає необхідність у подальінкубування при кімнатній температурі і промишому заміщенні амінокислот. вання, додають кроляче антитіло проти людсько2-3. Антитіло з гібридним Н-ланцюгом го IgG, мічене пероксидазою (виробник DAKO). Антитіло з гібридним Η-ланцюгом оцінюють, Після інкубування протягом 1 години при кімнатяк зазначалось для вимірювання активності зв'яній температурі і промивання, в кожну лунку дозування антигену. Результати, як видно на Фіг.16, дають 100мкл субстратного розчину. Після інкупоказують, що людське/мишаче гібридне антибування реакцію зупиняють 50мкл 6н сірчаної НМ 1.24 антитіло демонструє активність аналогікислоти, і поглинання при 490нм вимірюють, вичну активності химерного анти-НМ 1.24 антитіла користовуючи рідер MICROPLATE READER щодо активності зв'язування антигену, тоді як Model 3550 (виробник BioRad). мишаче/людське гібридне анти-НМ 1.24 антитіло 1-2. Вимірювання активності інгібування зв'ямає більш слабку активність, ніж химерне антизування НМ 1.24 антитіло. Це вказує на те, що для консАктивність інгібування зв'язування мишачим труювання реконструйованого людського антианти-НМ 1.24 антитілом, міченим біотином, виміНМ 1.24 антитіла, яке має активність зв'язування рюють за допомогою клітинного ELISA, викорисантигену аналогічну активності химерного антитовуючи клітини WISH. Клітинний ELISA готують НМ 1.24 антитіла, необхідно перетворити амінояк зазначалось вище в прикладі 7.1-2. Після блокислоти, включені в FR3 або FR4, серед тих, які кування в кожну лунку додають 50мкл серійних змістяться на V-ділянці Η-ланцюга. розведень реконструйованого людського анти2-4. Варіанти f-r Н-ланцюга НМ 1.24 антитіла, що його отримали з концентраВаріанти f Η-ланцюга реконструйованого ту культуральної надосадової рідини клітин COSлюдського анти-НМ 1.24 антитіла оцінюють, як 7, або виділили з культуральної надосадової різазначалось для вимірювання активности зв'язудини клітин СНО, і одночасно додають мишаче вання антигену. Результат, як подано на Фіг.17, анти-НМ 1.24 антитіло, мічене біотином. Після 2 показує, що його активність зв'язування антигену годин інкубування при кімнатній температурі і знижується порівняно з активністю химерного промивання, додають мічений пероксидазою анти-НМ, 1.24 антитіла, але підвищується порівстрептавідин (виробник DAKO). Після інкубування няно з вищезазначеними варіантами а-с, а це протягом 1 години при кімнатній температурі та свідчить про те, що будь-яка з чотирьох амінокипромивання, в кожну лунку додають 100мкл субслот в положенні 67, 69, 75 і 78, які було знову стратного розчину. Після інкубування реакцію перетворено у цій версії, відповідальна за активприпиняють 50мкл 6н сірчаної кислоти, і поглиність реконструйованого людського антитіла. нання на 490нм вимірюють, використовуючи ріВаріант g H-ланцюга реконструйованого дер MICROPLATE READER Model 3550 (виробник людського анти-НМ 1.24 антитіла оцінюють, як BioRad). зазначалось для вимірювання активности зв'язу2. Оцінка реконструйованого людського антивання антигену. Результат, як подано на Фіг.18 і НМ 1.24 антитіла 19, показує, що даний варіант демонструє рівень 2-1. L-ланцюг активності найбільш аналогічний рівню активності Варіант a L-ланцюга реконструйованого людвищезазначеного варіанту а, а це свідчить про ського анти-НМ 1.24 антитіла оцінюють, як зазнате, що як показано раніше для Η-ланцюга людсьчалось для вимірювання активності зв'язування кого/мишачого гібридного антитіла, амінокислота антигену. Як подано на Фіг.8, якщо варіант a Lв положенні 40, що її було перетворено у даному ланцюга експресується у поєднанні з химерним варіанті, не є відповідальною за активність рекоН-ланцюгом, він демонструє аналогічний рівень нструйованого людського антитіла. активності зв'язування антигену. Однак з урахуВаріанти h-j H-ланцюга реконструйованого ванням подальшого підвищення активності і сумілюдського анти-НМ 1.24 антитіла оцінюють, як сності з Η-ланцюгом було сконструйовано варіант зазначалось для вимірювання активності зв'язуb L-ланцюга. Варіанти а і b L-ланцюга оцінювали вання антигену і активності інгібування зв'язуванразом щодо активності зв'язування антигену і ня. Результат, як подано на Фіг.20, 21, 22 і 23, 59 76934 60 показує, що всі варіанти були слабкішими у відg + + ношенні обох активностей порівняно з активносh ++ ++ тями химерного анти-НМ 1.24 антитіла і були і ++ ++ аналогічними активностям вищезазначеного ваj ++ ++ ріанту f, а це свідчить про те, що амінокислоти в k ++ ++ положенні 67 і 69 серед чотирьох знову змінених 1 ++ ++ амінокислот у варіанті f, не відповідальні за підm ++ ++ вищення активності реконструйованого людськоn ++ ++ го антитіла. о ++ ++ Варіанти k-p H-ланцюга реконструйованого p ++ ++ людського анти-НМ 1.24 антитіла оцінюють, як q + + зазначалось для вимірювання активності зв'язуr +++ +++ вання антигену і активності інгібування зв'язування. Результат, як подано на Фіг.24, 25, 26 і 27 2-5. Варіант s Η-ланцюга вказує, що всі варіанти були слабкішими у відноВаріант s H-ланцюга реконструйованого людшенні обох активностей порівняно з активностяського анти-НМ 1.24 антитіла оцінюють у комбіми химерного анти-НМ 1.24 антитіла і були ананації з вищезазначеним варіантом a L-ланцюга, логічними активностям вищезазначеного варіанту як зазначалось для вимірювання активності зв'яh, а це свідчить про те, що амінокислоти в полозування антигену і активності інгібування зв'язуженні 80 і далі після тих, що були знову перетвовання. Результат, як наведено на Фіг.29 і 30, порені в цих шести варіантах, не відповідальні за казує, що варіант s має активність зв'язування підвищення активності реконструйованого людантигену і активність інгібування зв'язування, ського антитіла. аналогічну активностям варіанту r. Варіант q H-ланцюга реконструйованого Як говорилось вище, реконструйоване людлюдського анти-НМ 1.24 антитіла оцінюють, як ське анти-НМ 1.24 антитіло відповідно до цього зазначалось для вимірювання активності зв'язувинаходу зберігає здатність зв'язувати антиген вання антигену і активності інгібування зв'язуваннавіть після того, як один чи більше з амінокислоня. Результат, як подано на Фіг.25 і 27 вказує, що тних залишків було замінено іншими амінокислоданий варіант був слабкішим щодо обох активнотами. Відповідно, цей винахід включає реконстстей порівняно з активностями вищезазначеного руйоване людське анти-НМ 1.24 антитіло, де варіанту h або варіанту р, і був аналогічним актиамінокислотні залишки було замінено іншими вностям вищезазначеного варіанту а, а це свідамінокислотами на варіабельній ділянці Ηчить про те, що заміщення амінокислоти в пололанцюга або L-ланцюга, аж доки воно зберігає женні 78 і є істотним для підвищення активності початкові властивості. реконструйованого людського антитіла. 3. Оцінка очищеного реконструйованого людВаріант r Н-ланцюга реконструйованого людського анти-НМ 1.24 антитіла ського анти-НМ 1.24 антитіла оцінюють у назваОчищене реконструйоване людське анти-НМ ний вище спосіб. Результат, як подано на Фіг.15 і 1.24 антитіло оцінюють щодо вищезазначених 28 вказує, що варіант r має рівні активності зв'яактивностей зв'язування антигену і активності зування антигену і активності інгібування зв'язуінгібування зв'язування. Результат, як подано на вання, аналогічні активностям химерного антиФіг.31 і 32, показує, що реконструйоване людське НМ 1.24 антитіла. анти-НМ 1.24 антитіло має рівень активності зв'яНаведені вище результати вказують, що мізування антигену і активності інгібування зв'язунімальним перетворенням, необхідним для того, вання, аналогічний рівню для химерного анти-НМ щоб реконструйоване людське анти-НМ 1.24 ан1.24 антитіла. Цей факт показує, що реконструтитіло мало б рівень активності зв'язування антийоване людське анти-НМ 1.24 антитіло має рігену аналогічний рівню активності мишачого анвень активності зв'язування антигену, такий сати-НМ 1.24 антитіла або химерного анти-НМ 1.24 мий, як і мишаче анти-НМ 1.24 антитіло. антитіла, є перетворення амінокислот в полоПриклад 12. женнях 30, 71 і 78, і крім того 73. Протипухлинна дія химерного анти-НМ 1.24 Активність зв'язування антигену і активність антитіла проти мієломи людини у моделі на миінгібування зв'язування для варіантів а-r Ηшах ланцюга реконструйованого людського анти-НМ 1. Одержання антитіла, що підлягає введен1.24 антитіла підсумовано в таблиці 6. ню 1-1. Одержання химерного анти-НМ 1.24 анТаблиця 6 титіла Очищене химерне анти-НМ 1.24 антитіло, Варіант Η- Активність зв'язу- Активність інгібуотримане раніше в прикладі 6, концентрують, і ланцюга вання антитіла вання зв'язування буферний розчин замінюють PBS(-), використоа + + вуючи центрифужний ультрафільтраційний конb + + центратор Centriprep 10 (виробник Amicon). Його с + + стерилізують на фільтрі, використовуючи мемd + не вимірювали бранний фільтр MILLEX-GV (виробник e + не вимірювали MILLIPORE) з розміром пор 0,22мкм. Готують f ++ ++ концентрацію 200мкг/мл, використовуючи стери