Спосіб підвищення стійкості dнt-модифікованих рослин до ауксинових гербіцидів, що з’являється в результаті відмінностей у фрагментах в молекулярній структурі ауксинових гербіцидів

Реферат: Спосіб боротьби з небажаною рослинністю на полі, що містить стійку до ауксинового гербіциду сільськогосподарську культуру бавовнику, шляхом застосування до місця, де бажане знищення небажаної рослинності, ефективної кількості 2,4-ДБ. UA 112978 C2 (12) UA 112978 C2 UA 112978 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ДОМАГАННЯ НА ПРІОРИТЕТ Це заявка заявляє пріоритет попередньої патентної заявки США під номером 61/430693, зареєстрованої 7 січня 2011 року "Підвищена стійкість DHT-модифікованих рослин до ауксинових гербіцидів, що з'являється в результаті відмінностей у фрагментах в молекулярній структурі ауксинових гербіцидів". РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Даний винахід стосується способу боротьби з небажаною рослинністю на полі, що містить стійку до ауксинового гербіциду сільськогосподарську культуру бавовнику, що включає застосування до місця, де бажане знищення небажаної рослинності, ефективної кількості 2,4ДБ. ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Застосування ауксинових гербіцидів для боротьби з небажаною рослинністю на полі зі стійкою до ауксинового гербіциду сільськогосподарською культурою бавовнику може викликати тимчасове пошкодження у стійкої до ауксинового гербіциду сільськогосподарської культури бавовнику, що може приводити до затримки розвитку. Видиме тимчасове пошкодження може включати комбінацію опадання листя, завивання листя і ви кривлення черешка - які разом називаються епінастією. Інше тимчасове пошкодження, яке може бути видимим через 10-14 днів після застосування, включає стропування листя, потворність і епінастію на листі. Таке тимчасове пошкодження на початку сезону може приводити до небажаного збільшення періоду дозрівання сільськогосподарської культури бавовнику, змушуючи фермера до додаткових витрат і, можливо, зниження загального урожаю сільськогосподарської культури. Даний винахід спрямований на і вирішує проблеми, пов'язані з пошкодженням сільськогосподарської культури, що відбуваються в результаті застосування ауксинового гербіциду для боротьби з небажаною рослинністю на полі, що містить стійку до ауксинового гербіциду сільськогосподарську культуру, включаючи затримку раннього дозрівання, що відбувається в результаті пошкодження гербіциду на початку сезону. РОЗКРИТТЯ ДАНОГО ВИНАХОДУ Метою даного винаходу є спосіб боротьби з небажаною рослинністю на полі, що містить стійку до ауксинового гербіциду сільськогосподарську культуру бавовнику, що включає застосування до місця, де бажано знищення небажаної рослинності, ефективної кількості 2,4ДБ. Іншою метою даного винаходу є спосіб, в якому пошкодження стійкої до гербіциду сільськогосподарської культури бавовнику знижується відносно застосовуваної кількості еквівалента кислоти 2,4-Д. Додаткові цілі і переваги даного винаходу будуть з легкістю очевидні фахівцеві в цій галузі техніки з наступного докладного опису, в якому варіанти здійснення даного винаходу описані просто шляхом ілюстрування найкращого варіанту здійснення способу, розглянутого для здійснення даного винаходу. Як буде зрозуміло, даний винахід може мати інші і різні варіанти здійснення, і деякі його деталі можуть бути модифіковані в різних очевидних відношеннях, при цьому у всіх з них, не відступаючи від даного винаходу. Відповідно, опис повинний розглядатися як ілюстративний за природою, і необмежувальний. ВАРІАНТ(И) ЗДІЙСНЕННЯ ДАНОГО ВИНАХОДУ Дані винаходи далі будуть описані більш повно. Дійсно, ці винаходи можуть бути здійснені у множині різних форм і не повинні бути розглянуті як обмежені варіантами здійснення, сформульованими в даному описі; швидше ці варіанти здійснення наведені так і для того, щоб це розкриття задовольняло законні вимоги, що застосовуються. Схожі номери стосуються схожих елементів у всьому описі. Багато модифікацій і інших варіантів здійснення даних винаходів, сформульовані в даному описі, прийдуть на думку фахівцеві в галузі техніки, до якої належать ці винаходи, з перевагою вказівок, наведених в попередніх описах. Тому, необхідно розуміти, що дані винаходи не повинні бути обмежені певними розкритими варіантами здійснення, і що модифікації і інші варіанти здійснення маються на увазі включеними в об'єм прикладеної формули винаходу. Не дивлячись на те, що в даному описі застосовані специфічні терміни, вони застосовані тільки в загальному і описовому сенсах, а не з метою обмеження. Даний винахід зводиться до способу боротьби з небажаною рослинністю на полі, що містить стійку до ауксинового гербіциду сільськогосподарську культуру бавовнику, що включає застосування до місця, де бажане знищення небажаної рослинності, ефективної кількості 2,4ДБ. Як застосовано в цьому описі і якщо інакше не вказано, термін "гербіцид" стосується молекули або комбінації молекул, які сповільнюють або інакше знищують небажані, непотрібні 1 UA 112978 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 рослини; такі як, але не обмежуючи ними, шкідливі або заважаючі бур'яни, широколисті рослини, злаки і осоки; і може бути застосований таким чином для захисту сільськогосподарських культур. Фраза "ефективна кількість" означає кількість гербіциду, необхідну для надання видимого бажаного ефекту скорочення небажаного росту рослин, включаючи ефекти некрозу рослин, відмирання рослин, загальмування росту, інгібування розмноження, інгібування проліферації і видалення, деструкції або іншим чином зменшення появи і активності небажаних, непотрібних рослин. Небажані, непотрібні рослини включають стійкі до гербіцидів і резистентні до гербіцидів бур'яни, такі як стійкі до гліфосату бур'яни, і резистентні до гліфосату бур'яни. "Ауксиновий гербіцид" включає гербіциди, що містять арилоксіалканоатну хімічну структуру, таку як феноксіацетатні ауксини (наприклад, 2,4-Д і МЦПА), феноксибутаноатні ауксини (наприклад, 2,4-ДБ і МЦПБ) і піридилоацетатні ауксини (наприклад, флуроксипір і триклопір). До рослин за даним винаходом можуть бути застосовані численні гени стійкості до ауксинових гербіцидів. Сільськогосподарські культури бавовнику можуть бути модифіковані так, щоб вони містили будь-яке сімейство генів стійкості (що позначаються AAD), які кодують фермент арилоксіалканоат діоксигеназу (AAD), який потім інактивує ауксиновий гербіцид в рослині. Таку стійкість до гербіцидів можуть надавати гени AAD-1 (що отримуються з Sphingobium herbicidovorans), AAD-12 (що отримуються з Delftia acidovorans) і гени AAD-13, як розкрито в публікації РСТ WO 2005/107437, публікації РСТ WO 2007/053482 і публікаціях РСТ US 2010/0251432 ΑΙ. Ауксиновий гербіцид, такий як 2,4-ДБ, застосовують традиційним способом до місця, де бажане знищення бур'янів. "Місце" передбачає позначення, включаючи ґрунт, насіння і сіянці, так само як сталу рослинність. Гербіцидна дія 2,4-ДБ виявляється тоді, коли його застосовують безпосередньо до рослини або до місця розташування рослини в будь-якій стадії росту або до висадження або появи сходів. Ефект, що спостерігається, залежить від виду рослин, з якими необхідно боротися, стадії росту рослини, параметрів розведення при внесенні і розміру розбризкуваних, розміру частинок твердих компонентів, навколишніх умов під час застосування, конкретної сполуки, що застосовується, конкретних ад'ювантів і носіїв, що застосовуються, типу ґрунту і т. п., так само як від кількості хімікату, що застосовується. Ці і інші фактори можуть бути пристосовані, як відомо в галузі техніки, для посилення передбачуваної гербіцидної дії. Загалом, переважне застосування 2,4-ДБ на післясходовій стадії до відносно незрілої небажаної рослинності для досягнення максимальної боротьби з бур'янами. Бавовна (види Gossypium) є найважливішою в світі текстильною волоконною сільськогосподарською культурою і однією з найважливіших в світі сільськогосподарських культур для отримання олійного насіння. Бавовники забезпечують джерело їжі для людини, корма для худоби і сировини для промисловості. Насіння бавовнику віджимають для отримання харчової олії, а залишковий матеріал застосовують як корм для тварин. Промислові застосування бавовнику включають отримання ґнотів, шпагату, паперу і множин тканинних продуктів. Рід Gossypium є дуже великим, в цей час налічує 50 видів. Два тетраплоїдних види Gossypium мають придатні для прядіння волокна насіння, які називаються льоном. Цими двома видами є G. hirsutum (який називається бавовник американський) і G. barbadense ((який називається бавовною піма). Бавовник є дводольною рослиною з довершеними квітками, тобто бавовник має чоловічі, пилок-утворюючі органи, і окремо жіночі, органи, що запилюються на тій же самій квітці. Культурна квітка бавовнику оточена трьома трикутними приквітками, утворюючими, так звані квадрати. Квітка має відкритий віночок з п'ятьма пелюстками, тичинкову колонку зі зрощеними тичинками, утворюючу облямовуючу трубку. Синкарпний товкачик складається з трьох-п'яти плодолистиків з приймочками, що висовуються над пильовиками. Зав'язь розвивається в трип'ять-гніздову коробочку або насіннєву коробочку. Від семи до дев'яти насінин знаходяться всередині кожного відсіку або гнізда. За день до цвітіння з квадрата з'являється викривлений віночок. У день цвітіння віночок відкривається, і відбувається рознесення пилка. Віночок стає червоним на наступний день після цвітіння і пізніше відпадає від рослини. Запилення відбувається з відкриттям пильовиків і попаданням пилка на приймочку або з перенесенням пилка на приймочку комахами. Під "рослиною" розуміються рослини цілком, органи рослин (наприклад, листя, стеблини, коріння і т. д.), насіння, рослинні клітини, пропагули, ембріони і потомство рослин. Рослинні клітини можуть бути диференційованими або недиференційованими (наприклад, калюс, суспензія культури клітин, протопласти, клітини листя, клітини коріння, клітини флоеми і пилок). 2 UA 112978 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Трансгенні рослини" або "модифіковані рослини" або "стійко модифіковані" рослини, клітини або тканини стосуються рослин, що містять введені або інтегровані в рослинну клітину екзогенні послідовності нуклеїнових кислот або фрагменти DNA. Під "стійким модифікуванням" розуміється те, що нуклеотидний конструкт, введений в рослину, інтегрується в геном рослини і може успадковуватися її потомством. Гербіцидно активна сполука 4-(2,4-дихлорфенокси)масляна кислота або 2,4-ДБ описана, наприклад, в Tomlin, Clive (редактор) (2009) п'ятнадцятому виданні "Pesticide Manual", British Crop Protection Council (BCPC), сторінки 306-308. Прийнятні сільськогосподарські ад'юванти і носії, які корисні при отриманні гербіцидних сумішей за даним винаходом, відомі фахівцям в галузі техніки. Рідкі носії, які можуть бути застосовані, включають воду, толуол, ксилол, лігроїн, олію сільськогосподарської культури, ацетон, метилетилкетон, циклогексанон, трихлоретилен, тетрахлоретилен, етилацетат, амілацетат, бутилацетат, простий монометиловий ефір пропіленгліколю і простий монометиловий ефір діетиленгліколю, метанол, етанол, ізопропанол, аміловий спирт, етиленгліколь, пропіленгліколь, гліцерин і т. п. Загалом, вода є переважним носієм для розведення концентратів. Придатні тверді носії включають тальк, пірофілітову глину, кремнезем, атапульгітову глину, каолінітову глину, кізельгур, крейду, діатомову землю, вапно, карбонат кальцію, бентонітову глину, Фулерову землю, оболонки насіння бавовнику, пшеничне борошно, соєве борошно, пемзу, деревне борошно, борошно зі шкаралупи волоського горіха, лігніну і т. п. Звичайно в композиції за даним винаходом бажане включення одного або більше поверхнево-активних агентів. Такі поверхнево-активні агенти переважно застосовують і в твердих і в рідких композиціях, особливо такі, які розроблені для розбавлення носієм перед застосуванням. Поверхнево-активні агенти можуть бути аніонними, катіонними або неіонними за природою і можуть бути застосовані як емульгатори, змочувальні агенти, суспендуючі агенти або в інших цілях. Типові поверхнево-активні агенти включають солі алкілсульфатів, такі як лаурилсульфат діетаноламонію; алкіларилсульфонатні солі, такі як додецилбензолсульфонат кальцію; продукти приєднання алкілфенолу і алкіленоксиду, такі як нонілфенол-Сі8 етоксилат; продукти приєднання алкіленоксиду і спирту, такі як тридециловий спирт-Сіб етоксилат; мила, такі як стеарат натрію; алкілнафталінсульфонатні солі, такі як натрію дибутилнафталінсульфонат; діалкілові складні ефіри сульфосукцинатних солей, такі як натрію ди(2-етилгексил)-сульфосукцинат; складні ефіри сорбіту, такі як сорбітололеат; четвертинні аміни, такі як хлорид лаурилтриметиламонію; складні поліетиленгліколеві ефіри жирних кислот, такі як стеарат поліетиленгліколю; блок-співполімери етиленоксиду і пропіленоксиду; і солі моно- і діалкілфосфатних складних ефірів. Серед ад'ювантів, що традиційно застосовуються в сільськогосподарських композиціях, знаходяться агенти, що поліпшують сумісність, протиспінювальні агенти, пасиватори, нейтралізуючі агенти і буфери, інгібітори корозії, фарби, одоранти, агенти, що поліпшують розтікання, агенти, що поліпшують просочування, клейкі агенти, диспергуючі агенти, загусники, агенти, що знижують температуру замерзання, протимікробні агенти і т. п. Композиції можуть також містити інші сумісні компоненти, наприклад, інші гербіциди, регулятори росту рослини, фунгіциди, інсектициди і т. п., і можуть бути складені в композицію з рідкими або твердими добривами, твердими носіями для добрив, такими як нітрат амонію, сечовина і т. п. Концентрація активних інгредієнтів в гербіцидних композиціях за даним винаходом, загалом, складає від приблизно 0,001 до приблизно 98 відсотків по масі. Часто застосовують концентрації від приблизно 0,01 до приблизно 90 відсотків по масі. У композиціях, розроблених для застосування як концентрати, активний інгредієнт, загалом, присутній в концентрації від приблизно 5 до приблизно 98 відсотків по масі, переважно, від приблизно 10 до приблизно 90 відсотків по масі. Такі композиції перед застосуванням, як правило, розбавляють інертним носієм, таким як вода. Розбавлені композиції, які звичайно застосовують до бур'янів або місця знаходження бур'яна, загалом, містять від приблизно 0,0001 до приблизно 1 відсотка по масі активного інгредієнта і, переважно, містять від приблизно 0,001 до приблизно 0,05 відсотків по масі. У способах за даним винаходом застосування гербіциду 2,4-ДБ може бути виконане в рівній мірі в стадії до сіяння, до появи сходів і після появи сходів сільськогосподарської культури. Застосування на досходовій стадії і/або ранній післясходовій стадії є переважним. "Досходове" визначається як застосування гербіциду під час періоду до появи проростка сільськогосподарської культури над поверхнею землі. "Післясходове" визначається як застосування гербіциду під час періоду після появи проростка сільськогосподарської культури із землі, де в контакт з гербіцидом приводять листову поверхню сільськогосподарської культури. 3 UA 112978 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Переважно, 2,4-ДБ застосовують до сільськогосподарської культури бавовнику на післясходовій стадії і під час стадії вегетативного росту сільськогосподарської культури бавовнику. Гербіцидні сполуки за даним винаходом часто застосовують разом з одним або більше іншими гербіцидами для боротьби з ширшим спектром небажаної рослинності. При застосуванні разом з іншими гербіцидами, сполуки, що патентуються в даному, можуть бути складені в композицію з іншим гербіцидом або гербіцидами, змішані в резервуарі з іншим гербіцидом або гербіцидами або застосовані послідовно з іншим гербіцидом або гербіцидами. Деякі гербіциди, які можуть бути застосовані разом із сполуками за даним винаходом, включають гліфосат, глуфосинат, паракват, ALS-інгібітори (наприклад, сульфонілсечовини, імідазолінони, триазолопіримідин сульфонаніліди і т. д.), HPPD-інгібітори (наприклад, мезотрион, ізоксафлутол і т. д.), РРО-інгібітори (наприклад, парафлуфен, фомесафен і т. д.), дикамбу, бромоксиніл, арилоксіалканоати і інші, деякі з яких можуть зажадати генетичної модифікації для надання стійкості сільськогосподарській культурі до цих гербіцидів. Композиції за даним винаходом можна застосовувати до бур'янів або місця їх перебування за допомогою звичайних наземних або повітряних розпилювачів, розбризкувачів і пристроїв для внесення гранул, шляхом додавання в поливну воду і іншими традиційними засобами, відомими фахівцям в галузі техніки. В одному аспекті даного винаходу пошкодження стійкої до гербіциду сільськогосподарської культури бавовнику, що викликається застосуванням ефективної кількості 2,4-ДБ, знижується відносно застосовуваної ефективної кількості 2,4-Д. Зменшення впливу гербіцидів на сільськогосподарську культуру має сприятливий ефект в зменшенні пошкодження від гербіцидів, таким чином, може бути скорочений час, необхідний для дозрівання сільськогосподарської культури, або навіть привести до економії виробника шляхом зниження витрат і збільшення загального урожаю сільськогосподарської культури. Не бажаючи бути пов'язаними якою-небудь теорією, передбачається, що 2,4-ДБ не є стійким гербіцидом і піддається бета-окисненню всередині рослини. Ця додаткова метаболічна стадія і/або інші фактори приводять до збільшення здатності AAD-модифікованих рослин бути стійкими до застосування 2,4-ДБ в порівнянні з 2,4-Д. Це концепція може бути застосована до всіх DAA-модифікованих сільськогосподарських культур, але особливо корисна при застосуванні до DAA-модифікованих сільськогосподарських культур, що включають бавовник, які мають нижчу стійкість до 2,4-Д. Під "пошкодженням" мається на увазі листова поверхня, виражена у відсотках, яка є епінастичною (є опадання листя, закручення листя, викривлення черешка) при візуальній оцінці фахівцем в галузі техніки. Знижене пошкодження від 2,4-ДБ відносно 2,4-Д, що спостерігається протягом декількох хвилин після застосування цих гербіцидів, і яке продовжує залишатися спостережним після протягом тривалого інтервалу часу, такого як від 2 годин після застосування до 30 днів після застосування, включаючи від 3 годин після застосування до 19 днів після застосування і, додатково, включаючи від 6 годин після застосування до 24 годин після застосування. Винахід, що розглядається, також включає трансгенні стійкі до арилоксіалканоатних гербіцидів сільськогосподарські культури бавовнику, що включають один або більше додаткових генів стійкості до гербіциду, включаючи, але не обмежуючись ними, гени стійкості до гліфосату, АЬ8-(імідазолінон, сульфонілсечоивна), арилоксіалканоату, HPPD, РРО і глуфосинату, щоб, таким чином, забезпечити стійкі до гербіцидів рослини, сумісні з боротьбою з більш широким спектром більш стійких бур'янів і варіантами регулювання стійкості до гербіцидів. Норми внесення складають від приблизно 0,1 до приблизно 2240 грамів еквівалента кислоти/гектар (г-екв. кислоти/га), загалом, застосовуються на післясходовій стадії і, переважно, складають від 1 до приблизно 1120 г-екв. кислоти/га; для застосування на досходовій стадії, загалом, норми внесення складають від приблизно 1 до приблизно 2240 г-екв. кислоти/га. Вищі наведені норми внесення, загалом, приводять до невиборчої боротьби з широким спектром небажаної рослинності. Більш низькі норми внесення, як правило, приводять до виборчої боротьби і можуть бути застосовані до місця знаходження сільськогосподарських культур бавовнику. У варіантах здійснення даного винаходу, переважна норма внесення 2,4-ДБ для дії на післясходовій стадії становить щонайменше 280 г-екв. кислоти/га, переважно, від приблизно 280 г-екв. кислоти/га до приблизно 2240 г-екв. кислоти/га. ПРИКЛАДИ Наступні приклади включені для того, щоб продемонструвати конкретні переважні варіанти здійснення даного винаходу. Ці приклади не повинні бути розглянуті як обмеження до формули винаходу. Фахівцям в галузі техніки буде зрозуміло, що способи, розкриті в наступних прикладах, являють собою конкретні підходи, що застосовуються для ілюстрування переважних 4 UA 112978 C2 5 10 15 20 25 варіантів його практичного здійснення. Однак, фахівцям в галузі техніки буде зрозуміло в світлі даного розкриття, що в цих конкретних варіантах здійснення може бути зроблена множина змін, при цьому все ще отримуючи схожі або подібні результати, не відступаючи від суті і об'єму даного винаходу. Рослини бавовнику, модифіковані геном AAD-1 (AAD-1 бавовник), що кодує білок арилоксіалканоат діоксигеназу (AAD). Ці рослини застосовані в наступних прикладах для демонстрації стійкості до ауксинових гербіцидів, конкретно, 2,4-ДБ і 2,4-Д. AAD-1 може також бути застосований як селектований маркер в селекційних розплідниках. Сам ген AAD-1, уперше був розкритий в значенні надання стійкості рослин до гербіцидів в WO 2005/107437 (див. також патент США № 7838733). Приклад 1 2,4-ДБ і 2,4-Д забезпечують схожу боротьбу з бур'янами на майданчиках з AAD-1 бавовників. Експеримент для порівняння дій 2,4-ДБ і 2,4-Д при боротьбі з бур'янами в AAD-1 бавовнику проводили на дев'яти польових ділянках, розташованих біля Грінвілла, Міссісіпі (3 місці); Чула, Джорджія; Мейкон, Джорджія; Атапульгус, Джорджія; Мемфіс, Теннессі; Ньюпорт, Арканзас; і Фресно, Каліфорнія. Експериментальний план включав по чотири повторних випробування на кожній ділянці з обробками ділянок в рандомізованих повних блоках. Кожна ділянка містила рослини AAD-1 бавовнику в двох рядах, які мали довжину 6,1 метра. Бур'яни і бавовник обробляли при рості від 5,1 см до 15,2 см за одне застосування обробки. Обробки складалися з Butyrac 200 (2,4-ДБ) і Weedar 64 (2,4-Д), що застосовуються до ділянок в кількостях 560, 840 і 1120 г-екв. кислоти/га. Види бур'янів оцінювали візуально один раз на тиждень протягом трьох тижнів після застосування гербіциду у вигляді частки кількості рослин у відсотках (0-100 %, де 0 означає відсутність дії або контроль і 100 % означає повне відмирання цільової рослини), знищених, або, що виявляють важке пошкодження, викликане дією гербіциду. Результати боротьби з бур'янами шляхом застосування 2,4-ДБ і 2,4-Д на ділянках з AAD-1 бавовником показані в таблиці 1. Таблиця 1 Відсоткове вираження боротьби з цільовими бур'янами за допомогою 2,4-ДБ і 2,4-Д при 1120 г-екв. кислоти/га в AAD-1 бавовнику а Види 80 % 88 >90 % 80 % 90 99 b WAA >90 % 99 81 89 19 26 89 93 92 98 77 100 48 53 99 100 99 41 99 100 99 54 99 89 84 89 97 88 89 93 3 2 3 3 3 3 3 3 2 2 3 3 3 3 3 3 Абревіатури: AAD, арилоксіалканоат діоксигеназа; г-екв. кислоти/га , грам- еквівалент кислоти на гектар; 30 GLY-res, гліфосат-стійкий; WAA, тижнів після застосування Код різновидів підтриманий Європейською Організацією а Код виду, що підтримується Європейською організацією захисту рослин (http://eppt.eppo.org/index.php) b Тиждень після застосування для вимірювання максимальної боротьби; n=36 ділянок 5 UA 112978 C2 5 10 15 20 25 30 35 Майже для всіх цільових видів і в кожний тиждень вимірювань, із збільшенням норми внесення 2,4-ДБ або 2,4-Д отримували більший рівень боротьби, з найвищим рівнем боротьби з 1120 один/ха г. Тому, на цьому найбільшу дію спостерігали при 1120 г-екв. кислоти/га. Таким чином, ґрунтуючись на ефективності дії, 1120 г-екв. кислоти/га є переважною нормою внесення для боротьби з бур'янами в AAD-1 бавовнику з цих трьох протестованих норм. При 1120 г-екв. кислоти/га результат боротьби класифікували або як 80 % або >90 % знищення або важкого пошкодження бур'янів. По нормі внесення 1120 г-екв. кислоти/га 2,4-ДБ і 2,4-Д забезпечували еквівалентну боротьбу з кожним видом бур'яна, за винятком видів Amaranthus (AMASS), відносно якого дія 2,4-Д була помітна вище, ніж у 2,4-ДБ, на 92-77 % знищення. Більшість видів знищувалася на >80 % обома гербіцидами. Види, знищення яких складало менше 80 % обома гербіцидами, являли собою стійкі до гліфосату Amaranthus palmeri (ΑΜΑΡΑ GLY-res), Desmodium tortuosum (DEDTO) і Mollugo verticillata (MOLVE). Приклад 2 Рослини бавовнику, модифіковані AAD-1, мають підвищену стійкість до 2,4-ДБ в порівнянні з 2,4-Д. Для оцінки стійкості AAD-1-бавовнику до дій 2,4-ДБ і 2,4-Д гербіцидних сполук, гербіциди Butyrac 200 (2,4-ДБ) і Weedar 64 (2,4-Д) застосовували індивідуально шляхом розбризкування над AAD-1 -рослинами бавовнику в двох польових дослідах. Один експеримент проводили в чотирьох польових місцях поблизу Грінвіль, Міссісіпі; Бринсон, Джорджія; Мемфіс, Теннессі; і Фресно, Каліфорнія. Експериментальний план включав по чотири повторних випробування на кожному місці з ділянками обробки в рандомізованих повних блоках. Кожна ділянка містила AAD-1 -рослини бавовнику в двох рядах, які мали довжину 6,1 метра. Рослини бавовнику обробляли при рості від 5,1 см до 10,2 см у висоту за одну обробку. Обробки складалися з Butyrac 200 (2,4-ДБ), застосованого в кількостях 560, 840, 1120, 1680 і 2240 г-екв. кислоти/га; і Weedar 64 (2,4-Д), застосованого в кількостях 840 і 1120 гекв. кислоти/га. Через один день після застосування AAD-1-рослини бавовнику візуально оцінювали на відсоток листового покриття, що виявляє пошкодження, викликані гербіцидом. Результати пошкодження у AAD-1-рослин бавовнику від 2,4-ДБ або 2,4-Д показані в таблиці 2. При нормах внесення 840 г-екв. кислоти/га 2,4-ДБ приводив до меншого (але не статистично значуще) рівня пошкодження у AAD-1 -бавовнику, ніж рівень пошкодження, що спостерігається з 2,4-Д. Однак, при переважній нормі внесення 1120 г-екв. кислоти/га протягом першого дня після застосування 2,4-ДБ призводив до значуще меншої кількості пошкоджень у AAD-1-бавовнику, ніж рівень пошкодження, що спостерігається з 2,4-Д. Навіть при подвійній нормі внесення 2,4-ДБ (2240 г-екв. кислоти/га) в порівнянні з 2,4-Д (1120 г-екв. кислоти/га) AAD-1-бавовник мав значуще меншу кількість пошкоджень від 2,4-ДБ, ніж від 2,4-Д. Таблиця 2 Гербіцид 2,4-ДБ 2,4-ДБ 2,4-ДБ 2,4-ДБ 2,4-ДБ 2,4-Д 2,4-Д Середнє пошкодження 1 DAA від 2,4-ДБ або 2,4-Д, застосованих на післясходовій стадії до AAD-1 бавовнику 13 Довірчий інтервал Норма внесення Пошкодження нижнє верхнє c Значущі групи а (г-екв. кислоти/га) (%) середнє (%) средне (%) 560 2,3 0,2 4,1 а 840 4,1 2,1 7,9 ab 1120 2,8 1,5 5,3 ab 1680 4,5 2,4 8,2 ab 2240 6,3 4,6 8,6 b 840 7,4 4,5 12,0 be 1120 13,0 9,5 17,7 с Абревіатури: AAD, арилоксіалканоат діоксигеназа; DAA, днів після застосування; 40 Г-екв. кислоти/га, грам-еквівалент кислоти на гектар a Пошкодження оцінювали візуально у вигляді відсотка епінастичної листової поверхні бавовнику на ділянці; n=16 ділянок b довірчі інтервали, які не накладаються, вказують на значущі розбіжності (Р=0,05). c Iнтервали, відзначені однаковими буквами значуще не відрізняються. 6 UA 112978 C2 5 10 15 Інший експеримент проводили в одному місці в полі при Університеті Джорджії, на фермі Ponder Farm, поблизу Тіфтон, Джорджія. Експериментальний план включав по три повторних випробування на ділянках в рандомізованих повних блоках. Кожна ділянка містила AAD-1рослини бавовнику в одному ряду, який мав довжину 7,6 метра. Бавовники обробляли при рості 48,3 см у висоту (стадія 6-го листа) за одну обробку. Обробки складалися з Butyrac 200 (2,4-ДБ), застосованого в кількостях 280, 560, 1120 і 2240 г-екв. кислоти/га; і Weedar 64 (2,4-Д), застосованого в кількостях 560 і 1120 г-екв. кислоти/га. На 0, 1, 2, 19 і 45 дні після застосування AAD-1-рослини бавовнику оцінювали візуально на предмет відсотка листового покриття, що виявили пошкодження, викликане гербіцидом. Результати пошкодження у AAD-1 -рослин бавовнику з плином часу після застосування 2,4ДБ або 2,4-Д показані в таблиці 3. Найбільш високі рівні пошкодження у AAD-1-рослин бавовнику при всіх нормах внесення візуально спостерігали в день (день 0) застосування гербіциду, як для 2,4-ДБ, так і для 2,4-Д. У дні 0, 1, 2 і 19 після застосування в переважній нормі внесення 1120 г-екв.кислоти/га 2,4-ДБ призводив до значно меншої кількості пошкодження, ніж спостерігали для 2,4-Д. На 45 день після застосування пошкодження у AAD-1-рослин бавовнику не були достовірно різними для 2,4-ДБ і 2,4-Д, застосованими в кількості 1120 г-екв. кислоти/га. Навіть в подвійній нормі внесення 2,4-ДБ (2240 г-екв. кислоти/га) в порівнянні з 2,4-Д (1120 гекв. кислоти/га) AAD-1-рослини бавовнику мали значуще менше пошкодження від 2,4-ДБ, чим від 2,4-Д в дні 0, 1 і 19 після застосування. 20 Таблиця 3 Середнє пошкодження з плином часу від 2,4-ДБ і 2,4-Д, застосованих на післясходовій стадії до AAD-1-рослин бавовнику Гербіцид 2,4-ДБ 2,4-ДБ 2,4-ДБ 2,4-ДБ 2,4-Д 2,4-Д Мінімальна значуща розбіжність (Р=0,05) Норма внесення (г-екв. кислоти/га) 280 560 1120 2240 560 1120 Середнє пошкодження (%)ab 0 DAA 1 DAA 2 DAA 19 DAA 45 DAA 1,7 а 0,7 а 1,3 ab 0,0 а 0,0 а 2,7 а 0,0 а 0,7 а 0,7 а 0,0 а 5,0 ab 0,7 а 1,3 ab 0,0 а 1,7 а 9,3 b 2,0 а 3,3 abc 0,7 а 0,0 а 6,7 ab 6,7 b 4,0 be 1,7 а 3,3 а 23,3 с 14,0 с 4,7 с 5,0 b 2,3 а 6,2 4,2 3,3 2,4 4,5 Абревіатури: AAD, арилоксіалканоат діоксигеназа; DAA, днів після застосування; 25 30 35 40 г-екв. кислоти/га, грам-еквівалент кислоти на гектар а Пошкодження оцінене візуально у вигляді відсотка епінастичного листового покриття у бавовнику на ділянку; п-3 ділянки; b Середні, позначені однаковими буквами значуще не відрізняються Приклад 3 Рослини бавовнику, модифіковані AAD-12, мають помірно підвищену стійкість до 2,4-ДБ в порівнянні з 2,4-Д. Щоб оцінити стійкість AAD-12-рослин бавовнику до дій 2,4-ДБ і 2,4-Д гербіцидних сполук, гербіциди DB Straight (2,4-ДБ) і Weedar 64 (2,4-Д) застосовували індивідуально шляхом розбризкування над AAD-12-рослинами бавовнику в одному оранжерейному експерименті. Чотири обробки складалися з двох норм внесення 1120 і 2240 г-екв. кислоти/га для кожного з цих двох гербіцидів. Експериментальний план включав чотири повторних випробування окремих AAD-12-рослин бавовнику при кожній обробці. Рослини вирощували в горщиках. Обробки не були рандомізовані. Під час окропления рослини перебували в стадії 3-4 листа. AAD-12-рослини бавовнику, що окропляються, візуально оцінювали на предмет відсотка листового покриття, що виявляв викликане гербіцидом пошкодження, в дні 0, 1, 2, 4 і 12 після застосування. Результати середніх величин пошкоджень, що спостерігалися у AAD-12-рослин бавовнику від 2,4-ДБ або 2,4-Д, показані в таблиці 4. З дня 0 до дня 4 після застосування (DAA), рослини, оброблені 2,4-ДБ, виявляли більш низький відсоток видимого пошкодження листового покривала, ніж рослини, оброблені 2,4-Д; однак, відсоткові величини, що спостерігаються, були 7 UA 112978 C2 статистично значуще різними тільки при вищій нормі внесення, 2240 г-екв. кислоти/га, в день 2 і день 4 після застосування в цьому експерименті. Таблиця 4 Середнє і пошкодження з плином часу від 2,4-ДБ і 2,4-Д, застосованих на післясходовій стадії до AAD-12-рослин бавовнику Гербіцид 2,4-ДБ 2,4-ДБ 2,4-Д 2,4-Д Достовірно значуща відмінність за критерієм Тьюки (Р=0,05) Норма внесення (г-екв. кислоти/га) 1120 2240 1120 2240 Середнє пошкодження (%)ab 0 DAA 1 DAA 2 DAA 4 DAA 12 DAA 0,0 а 1,8 ab 0,0 а 1,0 b 1,0 а 0,0 а 0,0 b 0,0 а 0,5 b 3,3 а 0,5 а 2,3 ab 3,0 а 3,0 b 3,0 а 1,3 а 4,3 а 3,8 а 6,8 а 3,0 а 2,8 3,0 4,5 3,4 3,9 Абревіатури: AAD, арилоксіалканоат діоксигеназа; DAA, днів після 5 10 15 20 25 30 35 40 застосування; г-екв. кислоти/га, грам-еквівалент кислоти на гектар; HSD, достовірно значуща відмінність a Пошкодження оцінене візуально у вигляді відсотка епінастичного листового покриття у бавовнику на ділянку; n=4 ділянки; b Середні, відмічені однаковими буквам значуще не відрізняються. Приклад 4 Рослини бавовнику, модифіковані AAD-13 Клітина бавовнику може бути модифікована AAD-13 для отримання бавовнику з стійкістю до 2,4-ДБ і 2,4-Д, яка схожа з стійкістю, що надається генами AAD-1 або AAD-12. Бавовник, модифікований AAD-13, може бути застосований за допомогою тих же способів, описаних раніше в прикладі № 7 США 2010/0251432 [PCT/US08/63212 (Lira et al.)]. У попередніх описах приведена множина конкретних деталей, таких як конкретні матеріали, структури, хімікати, способи і т. д., для забезпечення кращого розуміння даного винаходу. Однак, даний винахід може бути застосований на практиці, не звертаючись до конкретно вказаних деталей. В інших випадках відомі структури обробки не були детально описані для того, щоб без необхідності не вносити неясність в даний винахід. У даному винаході показані і описані тільки переважний варіант здійснення даного винаходу і усього декілька прикладів його різнобічності. Необхідно розуміти, що даний винахід прийнятний до застосування в різних інших комбінаціях і середовищах і дозволяє вносити зміни або модифікації в межах об'єму винахідницької суті, як виражено в даному описі. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Спосіб боротьби з небажаною рослинністю на полі, що містить стійку до арилоксіалканоатного гербіциду рослину бавовнику, при цьому обмежуючи епінастичне пошкодження гербіцидами рослини бавовнику, який включає застосування до місця, де бажане знищення, гербіцидної обробки, яка складається з ефективної кількості 2,4-ДБ, і де стійка до арилоксіалканоатного гербіциду рослина бавовнику містить ген стійкості до гербіциду, який кодує арилоксіалканоатдіоксигеназу (AAD), вибрану з групи, яка складається з AAD-1 і AAD-12. 2. Спосіб за п. 1, в якому стійкою до арилоксіалканоатного гербіциду рослиною бавовнику є трансгенна рослина бавовнику. 3. Спосіб за п. 2, в якому трансгенна стійка до арилоксіалканоатного гербіциду рослина бавовнику додатково включає щонайменше один додатковий ген стійкості до гербіциду. 4. Спосіб за п. 1, в якому ефективна кількість 2,4-ДБ становить щонайменше 280 грамеквівалент кислоти/гектар. 5. Спосіб за п. 1, в якому ефективна кількість 2,4-ДБ складає від приблизно 280 грам-еквівалент кислоти/гектар до приблизно 2240 грам-еквівалент кислоти/гектар. 6. Спосіб за п. 1, в якому 2,4-ДБ застосовують до стійкої до арилоксіалканоатного гербіциду рослини бавовнику на післясходовій стадії. 8 UA 112978 C2 5 10 15 7. Спосіб за п. 1, в якому 2,4-ДБ застосовують до стійкої до арилоксіалканоатного гербіциду рослини бавовнику на післясходовій стадії під час вегетативної стадії росту стійкої до арилоксіалканоатного гербіциду рослини бавовнику. 8. Спосіб за п. 1, в якому небажана рослинність включає стійкий до гліфосату бур'ян. 9. Спосіб за п. 1, що включає застосування додаткового гербіциду до місця, де бажане знищення. 10. Спосіб за п. 1, де ефективна кількість 2,4-ДБ становить близько 1120 грам-еквівалент кислоти/гектар. 11. Спосіб за п. 1, де застосування гербіцидної обробки до місця, де бажане знищення, включає: застосування гербіцидної обробки, що складається з щонайменше близько 1120 грамеквівалент кислоти/гектар 2,4-ДБ, при цьому підтримуючи відсоток листя стійкої до арилоксіалканоатного гербіциду рослини бавовнику, яке є епінастичним наступного дня після застосування гербіцидної обробки, менше ніж приблизно 9,5 %. 12. Спосіб за п. 1, де застосування гербіцидної обробки до місця, де бажане знищення, проводиться шляхом одноразового застосування гербіцидної обробки, що складається з ефективної кількості 2,4-ДБ. 13. Спосіб за п. 1, де застосування гербіцидної обробки до місця, де бажане знищення, включає: приведення в контакт стійкої до арилоксіалканоатного гербіциду рослини бавовнику у вказаному місці з ефективною кількістю 2,4-ДБ. 20 Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 9