Спосіб поліпшення витривалості до нестачі азоту у рослини

Реферат: Даний винахід забезпечує спосіб поліпшення витривалості до нестачі азоту у рослин. Спосіб включає інгібування синтезу етилену в рослині шляхом стійкого трансформування рослини гетерологічним полінуклеотидом, що знижує експресію ACC-синтази при експресії зазначеного гетерологічного полінуклеотиду, та вирощування зазначеної рослини в умовах обмеження азоту, за допомогою чого експресується зазначений гетерологічний полінуклеотид, і зазначена рослина демонструє поліпшену витривалість до нестачі азоту в порівнянні з контрольною рослиною. Зазначений гетерологічний полінуклеотид включає нуклеїнову кислоту, що кодує транскрипт, який здатний утворювати дволанцюгову РНК і опосередковувати РНКінтерференцію нуклеїнової кислоти ACC-синтази. Зазначена нуклеїнова кислота включає першу нуклеотидну послідовність, яка включає щонайменше 21 суміжний нуклеотид нуклеїнової кислоти ACC-синтази і другу нуклеотидну послідовність, що включає комплементарну послідовність зазначеної першої нуклеотидної послідовності, де перший і другий нуклеотиди відокремлені нітроном. UA 108071 C2 (12) UA 108071 C2 UA 108071 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Офіційна копія переліку послідовностей представлена одночасно з описом у вигляді текстового файлу за допомогою EFS-Web відповідно до Американського стандартного коду для обміну інформацією (ASCII) з назвою файлу 388171SEQLIST.TXT, датою створення 13 квітня 2010 р. і розміром 200 Кбайт. Перелік послідовностей, поданий за допомогою EFS-Web, є частиною опису і, тим самим, включений у всій своїй повноті посиланням у даний документ. ОБЛАСТЬ ВИНАХОДУ Даний винахід у цілому стосується області молекулярної біології, особливо модуляції активності ACC-синтази для поліпшення врожайності рослин і витривалості до нестачі азоту. ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ Окультурення багатьох рослин корелювало з різкими підвищеннями врожайності. Найбільша фенотипова варіація, що зустрічається в природних популяціях, є безперервною і здійснюється впливом багатьох генів. Ідентифікація специфічних генів, що відповідають за різкі розходження у врожайності в окультурених рослин, стала важливою метою досліджень в області сільського господарства. Гени ефективності використання азоту (NUE) впливають на врожайність і корисні для поліпшення використання азоту у культурних рослин, особливо, маїсу. Підвищена ефективність використання азоту може бути отримана в результаті посиленого поглинання та асиміляції азотного добрива та/або наступної ремобілізації і повторного використання накопичених азотних резервів, а також підвищеної витривалості рослин до стресових ситуацій, таких як навколишні умови з низьким вмістом азоту. Гени можуть бути використані для зміни генетичного складу рослин, що зробить їх більш продуктивними з існуючими стандартами внесення добрив або підтримає їхні продуктивності при значно зменшеному добриві або зниженій доступності азоту. Поліпшення NUE у кукурудзи призведе до збільшення врожаю придатної для збирання кукурудзи на одиницю витрати азотного добрива, як у країнах, що розвиваються, де доступ до азотного добрива обмежений, так і в розвинених країнах, де рівень використання азоту залишається високим. Поліпшення використання азоту також дозволяє зниження виробничої собівартості у фермерських господарствах, зменшене застосування і залежність від непоновлюваних джерел енергії, необхідних для виготовлення азотних добрив, і знижує вплив на навколишнє середовище виробництва азотних добрив і використання в сільському господарстві. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Представлено способи і композиції для поліпшення врожайності рослин. У деяких варіантах здійснення врожайність рослин є поліпшеною при стресі, особливо абіотичному стресі, такому як умови обмеження азоту. Способи поліпшення врожайності рослин включають інгібування шляху синтезу етилену, таке як, наприклад, інгібування активності, щонайменше, однієї синтази 1-аміноциклопропан-1-карбонової кислоти (ACC). Активність ACC-синтази може бути інгібована з використанням будь-якого способу, відомого в даній галузі, включаючи, але без обмеження, руйнування гена ACC-синтази або зниження експресії гена за допомогою застосування косупресії, антисмислової послідовності, або РНК-сайленсингу, або РНК-інтерференції. Інгібування активності, щонайменше, однієї ACC-синтази у рослини може поліпшити витривалість рослини до нестачі азоту, і такі рослини можуть підтримувати свою продуктивність зі значно меншою витратою азотного добрива та/або виявляти поліпшене поглинання та асиміляцію азотного добрива та/або ремобілізацію і повторне використання резервів накопиченого азоту. Крім загального підвищення врожаю поліпшення витривалості до нестачі азоту шляхом інгібування ACC-синтази також може призводити в результаті до підвищеної маси та/або довжини коренів, збільшеного качана, листа, насіння та/або розміру ендосперму, та/або поліпшеної стійкості до полягання. Отже, у деяких варіантах здійснення способи, крім того, включають вирощування зазначених рослин в умовах обмеження азоту і факультативно добір таких рослин, що виявляють більшу витривалість до низьких рівнів азоту. Крім того, забезпечені способи і композиції для поліпшення врожайності при абіотичному стресі, що включають оцінювання умов навколишнього середовища зони культивування на абіотичні стресогенні фактори (наприклад, низькі рівні азоту в ґрунті) і висаджування насіння або рослин, що мають знижений синтез етилену, що у деяких варіантах здійснення обумовлений зменшеною активністю, щонайменше, однієї ACC-синтази у важких умовах навколишнього середовища. Також у даному документі забезпечені конструкти і касети експресії, що включають нуклеотидні послідовності, що можуть ефективно знижувати експресію ACC-синтази. ОПИС ФІГУР Фігура 1 являє собою схематичну ілюстрацію генів біосинтезу етилену і сигнальних генів в рослинах, наприклад, Arabidopsis. Етилен утвориться з метіоніну чітко визначеним шляхом, що 1 UA 108071 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включає перетворення S-аденозил-L-метіоніна (SAM або Ado Met) у циклічну амінокислоту 1аміноциклопропан-1-карбонову кислоту (ACC), якому сприяє ACC-синтаза. ACC-синтаза є амінотрансферазою, що каталізує обмежуючий швидкість етап в утворенні етилену шляхом перетворення S-аденозилметіоніна в ACC. Потім утвориться етилен при окислюванні ACC за допомогою дії ACC-оксидази (також відомої як фермент, що утворює етилен) з ціановоднем як вторинний продукт, що знешкоджується β-ціаноаланін-синтазою. Нарешті, етилен метаболізується шляхом окислювання до CO2 або до етиленоксиду і етиленгліколю. Фігура 2, панелі A-C, ілюструє ACS2 шпильковий конструкт. Панель A являє собою схематичне зображення PHP плазміди, що містить убіквітиновий промотор (UBI1ZM PRO), керуючий експресією ACS2 шпильки (термінальний повтор, що складається з TR1 і TR2). RB представляє праву граничну послідовність Agrobacterium. Зображений 4126 п.о. фрагмент 49682 п.о. касети. Панель B представляє послідовність ZM-ACS2 TR1 (SEQ ID NO: 12), а панель C представляє послідовність ZM-ACS2 TR2 (SEQ ID NO: 13). Фігура 3, панелі A-C, ілюструє ACS6 шпильковий конструкт. Панель A являє собою схематичне зображення PHP плазміди, що містить убіквітиновий промотор (UBI1ZM PRO), керуючий експресією ACS6 шпильки (термінальний повтор, що складається з TR1 і TR2). RB представляє праву граничну послідовність Agrobacterium. Зображений 3564 п.о. фрагмент 49108 п.о. касети. Панель B представляє послідовність ZM-ACS6 TR1 (SEQ ID NO: 14), а панель C представляє послідовність ZM-ACS6 TR2 (SEQ ID NO: 15). Фігура 4 являє собою схему поліпшеної ACS6 касетою експресії інгібування, що викладена в SEQ ID NO:57. Фігура 5 показує врожайність трансформованих рослин даного винаходу при стресі під час цвітіння в навколишнім середовищі 1. Кожен стовпчик представляє окрему подію трансформації. Показано середню врожайність трансген-негативних сегрегантів (139 бушелів/акр) як контроль (CN). Усього 74 % подій дали врожай, номінально більший, ніж контрольні рослини. Рослини що представляють 18 трансгенних подій дали більший врожай у порівнянні з контролем при P