Гуманізоване антитіло, що зв’язує людський cd20
Номер патенту: 89350
Опубліковано: 25.01.2010
Автори: Чен Ендрю С., Преста Леонард Г., Кроулі Крейг В., Лоуман Генрі Б., Адамз Камеллія В., Накамура Джеральд Р.
Формула / Реферат
1. Гуманізоване антитіло, що зв'язує людський CD20, яке має VH-послідовність, представлену в SEQ ID NO. 8, та VL-послідовність, представлену в SEQ IN NO. 2.
2. Гуманізоване антитіло за п. 1, яке має амінокислотні послідовності важкого та легкого ланцюга, представлені в SEQ ID NO. 39 та 40 відповідно.
3. Гуманізоване антитіло за п. 1, яке має амінокислотні послідовності важкого та легкого ланцюга, представлені в SEQ ID NO. 41 та 40 відповідно.
4. Гуманізоване антитіло за п. 1, яке має амінокислотні послідовності важкого та легкого ланцюга, представлені в SEQ ID NO. 39 та 40 відповідно, та додатково має принаймні одну амінокислотну заміну в Fc-фрагменті, яка підвищує ADCC- і/або CDC-активність.
5. Гуманізоване антитіло за п. 4, яке має амінокислотні заміни S298A/E333A/K334A.
6. Гуманізоване антитіло за п. 4, у якому амінокислотна заміна в Fc-фрагменті підвищує CDC-активність.
7. Гуманізоване антитіло за п. 6, яке має амінокислотну заміну K326A або K326W.
8. Гуманізоване антитіло за п. 5, у якому Fc-фрагмент додатково має амінокислотну заміну K326A.
9. Гуманізоване антитіло за п. 1, яке має амінокислотні послідовності важкого та легкого ланцюга, представлені в SEQ ID NO. 39 та 40 відповідно, та яке додатково має принаймні одну амінокислотну заміну в Fc-фрагменті, яка знижує CDC-активність.
10. Гуманізоване антитіло за п. 9, яке має амінокислотну заміну K322A.
11. Гуманізоване антитіло за будь-яким з пп. 1-10, кон’юговане із цитотоксичним агентом.
12. Гуманізоване антитіло за п. 11, де цитотоксичний агент являє собою радіоактивний ізотоп або токсин.
13. Антигензв’язувальний фрагмент гуманізованого антитіла за будь-яким з пп. 1-10.
14. Антигензв’язувальний фрагмент за п. 13, кон’югований із цитотоксичним агентом.
15. Антигензв’язувальний фрагмент п. 14, де цитотоксичний агент являє собою радіоактивний ізотоп або токсин.
16. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за будь-яким з пп. 1-12 або антигензв’язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 13-15 та фармацевтично прийнятний носій.
17. Рідка композиція, яка містить антитіло за будь-яким з пп. 1-12 або антигензв’язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 13-15 у концентрації 20 мг/мл, 10 мМ сульфат гістидину, рН 5,8, 60 мг/мл сахарози, 0,2 мг/мл полісорбату 20.
18. Виріб, який являє собою контейнер і композицію, яка міститься в ньому, де композиція включає антитіло за будь-яким з пп. 1-12 або антигензв’язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 13-15.
19. Виріб за п. 18, який додатково містить листівку-вкладку в упаковці, де вказано, що композицію можна застосовувати для лікування неходжкінської лімфоми і/або аутоімунного захворювання.
20. Виріб за п. 19, у якому аутоімунне захворювання вибирають із групи, яка включає ревматоїдний артрит, ювенільний ревматоїдний артрит, системний червоний вовчак (СЧВ), люпус-нефрит, неспецифічний виразковий коліт, хворобу Вегенера, запальне захворювання кишечнику, ідіопатичну тромпоцитопенічну пурпуру (ІТП), тромботичну тромбогемолітичну пурпуру (ТТП), аутоімунну тромбоцитопенію, розсіяний склероз, псоріаз, пов’язану з IgА нефропатію, пов’язані з IgМ поліневропатії, важку псевдопаралітичну міастенію, васкуліти, ANCA-васкуліти, відторгнення трансплантата паренхіматозних органів, реакцію «трансплантат проти хазяїна», цукровий діабет, синдром Рейно, синдром Шегрена й гломерулонефрит.
21. Нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло за будь-яким з пп. 1-10 або антигензв’язувальний фрагмент за п. 13.
22. Експресійний вектор, який містить нуклеїнову кислоту за 21.
23. Клітина-хазяїн, яка містить нуклеїнову кислоту за 21.
24. Клітина-хазяїн за п. 23, яка являє собою CHO-клітину.
25. Спосіб одержання гуманізованого антитіла, що зв'язує людський CD20, або антигензв’язувального фрагмента, який полягає в тому, що культивують клітину-хазяїна, яка продукує антитіло за будь-яким з пп. 1-10 або антигензв’язувальний фрагмент за п. 13, та виділяють антитіло або антигензв’язувальний фрагмент із клітинної культури.
26. Гуманізоване антитіло, що зв'язує людський CD20, де антитіло одержане способом, який полягає в тому, що експресують нуклеїнову кислоту, яка кодує антитіло, яке має амінокислотні послідовності важкого та легкого ланцюга, представлені в SEQ ID NO. 39 та 40 відповідно, в клітині-хазяїні та виділяють антитіло, експресоване в клітині-хазяїні.
27. Спосіб індукції апоптозу B-клітин in vivo, який полягає в тому, що B-клітини приводять у контакт із антитілом за будь-яким з пп. 1-12 або антигензв’язувальним фрагментом за будь-яким з пп. 13-15, що приводить до знищення B-клітин.
28. Спосіб лікування CD20-позитивного раку, який полягає в тому, що пацієнту, який страждає від раку, вводять терапевтично ефективну кількість антитіла за будь-яким з пп. 1-12 або антигензв’язувального фрагмента за будь-яким з пп. 13-15.
29. Спосіб за п. 28, у якому CD20-позитивний рак являє собою B-клітинну лімфому або лейкоз.
30. Спосіб за п. 29, у якому CD20-позитивний рак являє собою неходжкінську лімфому (НХЛ) або лімфоцитарну предомінантну хворобу Ходжкіна (ЛПХХ).
31. Спосіб за п. 28, у якому CD20-позитивний рак являє собою хронічний лімфоцитарний лейкоз (ХЛЛ) або дрібноклітинну лімфоцитарну лімфому (ДЛЛ).
32. Спосіб за п. 29, у якому антитіло або антигензв’язувальний фрагмент вводять у дозі від приблизно 250 мг/м2 до приблизно 500 мг/м2.
33. Спосіб за п. 29, у якому антитіло або антигензв’язувальний фрагмент вводять у дозі від приблизно 275 мг/м2 до приблизно 375 мг/м2.
34. Спосіб за п. 29, у якому пацієнту вводять принаймні дві дози антитіла або антигензв’язувального фрагмента, причому кожна доза становить 375 мг/м2.
35. Спосіб за п. 34, у якому дві дози вводять з 2-тижневим інтервалом.
36. Спосіб за п. 29, який полягає в тому, що пацієнту додатково вводять принаймні один хіміотерапевтичний агент.
37. Спосіб за п. 36, у якому рак являє собою неходжкінську лімфому (НХЛ) і хіміотерапевтичний агент вибирають із групи, яка включає доксорубіцин, циклофосфамід, вінкристин і преднізолон, та CHOP.
38. Спосіб лікування аутоімунного захворювання, який полягає в тому, що пацієнту, який страждає від аутоімунного захворювання, вводять терапевтично ефективну кількість антитіла за будь-яким з пп. 1-12 або антигензв’язувального фрагмента за будь-яким з пп. 13-15.
39. Спосіб за п. 38, у якому аутоімунне захворювання вибирають із групи, яка включає ревматоїдний артрит, ювенільний ревматоїдний артрит, системний червоний вовчак (СЧВ), люпус-нефрит, неспецифічний виразковий коліт, хворобу Вегенера, запальне захворювання кишечнику, ідіопатичну тромпоцитопенічну пурпуру (ІТП), тромботичну тромбогемолітичну пурпуру (ТТП), аутоімунну тромбоцитопенію, розсіяний склероз, псоріаз, пов’язану з IgА нефропатію, пов’язані з IgМ поліневропатії, важку псевдопаралітичну міастенію, васкуліти, ANCA-васкуліти, відторгнення трансплантата паренхіматозних органів, реакцію «трансплантат проти хазяїна», цукровий діабет, синдром Рейно, синдром Шегрена й гломерулонефрит.
40. Спосіб за п. 39, у якому аутоімунне захворювання являє собою ревматоїдний артрит.
41. Спосіб за п. 40, у якому пацієнт страждає від ревматоїдного артриту середнього - серйозного ступеня тяжкості та отримує лікування принаймні одним модифікуючим хворобу протиревматичним лікарським засобом, яке не приводить до бажаного результату.
42. Спосіб за п. 40, у якому пацієнту вводять додатково другий терапевтичний агент.
43. Спосіб за п. 42, у якому другий терапевтичний агент являє собою імуносупресор.
44. Спосіб за п. 43, у якому імуносупресор являє собою метотрексат.
45. Спосіб за п. 40, у якому антитіло підлягає введенню у дозі, вибраній з 2x10 мг, 2x50 мг, 2x200 мг та 2x500 мг.
46. Спосіб за п. 38, у якому антитіло підлягає введенню шляхом внутрішньовенного вливання.
47. Спосіб за п. 38, у якому антитіло підлягає підшкірному введенню.
48. Спосіб лікування ревматоїдного артриту (РА) у людини, який полягає у введенні антитіла за будь-яким з пп. 1-12 або антигензв’язувального фрагмента за будь-яким з пп. 13-15, причому антитіло або антигензв’язувальний фрагмент вводять у дозі, вибраній з групи, що складається з 2x10 мг, 2x50 мг, 2x200 мг, 2x500 мг та 2x1000 мг.
49. Спосіб за п. 48, у якому доза складає 2x50 мг.
50. Спосіб за п. 48, у якому доза складає 2x200 мг.
51. Спосіб за п. 48, у якому доза складає 2x500 мг.
52. Спосіб за п. 48, у якому доза складає 2x1000 мг.
53. Спосіб за п. 48, у якому ревматоїдний артрит має ступінь тяжкості від середнього до серйозного.
54. Спосіб лікування аутоімунного захворювання, вибраного із групи, яка включає дерматоміозит, грануломатоз Вегенера, ANCA-васкуліт, апластичну анемію, аутоімунну гемолітичну анемію (АІГА), дефіцит фактора VIII, гемофілію A, аутоімунну нейтропенію, синдром Кастельмана, синдром Гудпасчера, відторгнення трансплантата паренхіматозних органів, реакцію «трансплантат проти хазяїна» (РТПХ), опосередковуване IgМ захворювання, тромботичну тромбогемолітичну пурпуру (ТТП), тиреоїдит Хашимото, аутоімунний гепатит, лімфоїдний інтерстиціальний пневмоніт (ЛІП), бронхолітичні облітерації (не пов’язані із трансплантацією) проти NSIP, синдром Гійєна-Барре-Штроля, васкуліт великих судин, гігантоклітинний артеріїт (синдром Такаясу), васкуліт середніх судин, хвороба Кавасакі і нодозний поліартеріїт, який полягає в тому, що пацієнту, який страждає від вказаного захворювання, вводять терапевтично ефективну кількість антитіла за будь-яким з пп. 1-12 або антигензв’язувального фрагмента за будь-яким з пп. 13-15.
Текст
1. Гуманізоване антитіло, що зв'язує людський CD20, яке має VH-послідовність, представлену в SEQ ID NO. 8, та VL-послідовність, представлену в SEQ IN NO. 2. 2. Гуманізоване антитіло за п. 1, яке має амінокислотні послідовності важкого та легкого ланцюга, представлені в SEQ ID NO. 39 та 40 відповідно. 3. Гуманізоване антитіло за п. 1, яке має амінокислотні послідовності важкого та легкого ланцюга, представлені в SEQ ID NO. 41 та 40 відповідно. 4. Гуманізоване антитіло за п. 1, яке має амінокислотні послідовності важкого та легкого ланцюга, представлені в SEQ ID NO. 39 та 40 відповідно, та додатково має принаймні одну амінокислотну заміну в Fc-фрагменті, яка підвищує ADCC- і/або CDC-активність. 5. Гуманізоване антитіло за п. 4, яке має амінокислотні заміни S298A/E333A/K334A. 6. Гуманізоване антитіло за п. 4, у якому амінокислотна заміна в Fc-фрагменті підвищує CDCактивність. 7. Гуманізоване антитіло за п. 6, яке має амінокислотну заміну K326A або K326W. 8. Гуманізоване антитіло за п. 5, у якому Fcфрагмент додатково має амінокислотну заміну K326A. 9. Гуманізоване антитіло за п. 1, яке має амінокислотні послідовності важкого та легкого ланцюга, представлені в SEQ ID NO. 39 та 40 відповідно, та яке додатково має принаймні одну амінокислотну заміну в Fc-фрагменті, яка знижує CDC-активність. 10. Гуманізоване антитіло за п. 9, яке має амінокислотну заміну K322A. UA (21) a200507058 (22) 16.12.2003 (24) 25.01.2010 (86) PCT/US2003/040426, 16.12.2003 (31) 60/434,115 (32) 16.12.2002 (33) US (31) 60/526,163 (32) 01.12.2003 (33) US (46) 25.01.2010, Бюл.№ 2, 2010 р. (72) АДАМЗ КАМЕЛЛІЯ В., US, ЧЕН ЕНДРЮ С., US, КРОУЛІ КРЕЙГ В., US, ЛОУМАН ГЕНРІ Б., US, НАКАМУРА ДЖЕРАЛЬД Р., US, ПРЕСТА ЛЕОНАРД Г., US (73) ДЖЕНЕНТЕК, ІНК., US (56) US A1 20020128448, 12.09.2002. WO A2 03068821, 21.08.2003. US A 5576195, 19.11.1996. WO A1 0009160, 24.02.2000. WO A1 0076542, 21.12.2000. WO A2 0222212, 21.03.2002. Esohe E. Idusogie et al.:"Engineered antibodies with increased activity to recruit complement", Journal of immunology, vol. 166, no. 4, 15 February 2001 (200102-15), pages 2571-2575, XP002298345, ISSN:00221767. Tedder T. F. "Isolation and structure of a cDNA encoding the B1 (CD20) cell-surface antigen of human B lymphocytes", Proceedings of the national academy of sciences of USA, vol. 85, no. 1, January 1988 (1988-01), pages 208-212, XP002016361, ISSN: 0027-8424. Hong K. et al.:"Simple quatitative live cell and antiidiotypic antibody based ELISA for humanized antibody directed to cell surface protein CD20", Journal of immunological methods, vol. 294, no. 1-2, November 2004 (2004-11), pages 189-197, XP004679767, ISSN:0022-1759 (ABSTRACT). Edwards JC. et al.:"B-lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: targeting of CD20", Biochemical society transactions, vol. 30, no. 4, August 2002 (2002-08), pages 824-828, XP002306250, ISSN: 0300-5127 (ABSTRACT). 2 (19) 1 3 89350 4 11. Гуманізоване антитіло за будь-яким з пп. 1-10, SEQ ID NO. 39 та 40 відповідно, в клітині-хазяїні та кон’юговане із цитотоксичним агентом. виділяють антитіло, експресоване в клітині-хазяїні. 27. Спосіб індукції апоптозу B-клітин in vivo, який 12. Гуманізоване антитіло за п. 11, де цитотоксичний агент являє собою радіоактивний ізотоп або полягає в тому, що B-клітини приводять у контакт токсин. із антитілом за будь-яким з пп. 1-12 або анти13. Антигензв’язувальний фрагмент гуманізованогензв’язувальним фрагментом за будь-яким з пп. го антитіла за будь-яким з пп. 1-10. 13-15, що приводить до знищення B-клітин. 14. Антигензв’язувальний фрагмент за п. 13, 28. Спосіб лікування CD20-позитивного раку, який кон’югований із цитотоксичним агентом. полягає в тому, що пацієнту, який страждає від 15. Антигензв’язувальний фрагмент п. 14, де цитораку, вводять терапевтично ефективну кількість токсичний агент являє собою радіоактивний ізотоп антитіла за будь-яким з пп. 1-12 або антиабо токсин. гензв’язувального фрагмента за будь-яким з пп. 16. Фармацевтична композиція, яка містить анти13-15. тіло за будь-яким з пп. 1-12 або анти29. Спосіб за п. 28, у якому CD20-позитивний рак гензв’язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 13являє собою B-клітинну лімфому або лейкоз. 15 та фармацевтично прийнятний носій. 30. Спосіб за п. 29, у якому CD20-позитивний рак 17. Рідка композиція, яка містить антитіло за будьявляє собою неходжкінську лімфому (НХЛ) або яким з пп. 1-12 або антигензв’язувальний фраглімфоцитарну предомінантну хворобу Ходжкіна мент за будь-яким з пп. 13-15 у концентрації 20 (ЛПХХ). мг/мл, 10 мМ сульфат гістидину, рН 5,8, 60 мг/мл 31. Спосіб за п. 28, у якому CD20-позитивний рак сахарози, 0,2 мг/мл полісорбату 20. являє собою хронічний лімфоцитарний лейкоз 18. Виріб, який являє собою контейнер і компози(ХЛЛ) або дрібноклітинну лімфоцитарну лімфому цію, яка міститься в ньому, де композиція включає (ДЛЛ). антитіло за будь-яким з пп. 1-12 або анти32. Спосіб за п. 29, у якому антитіло або антигензв’язувальний фрагмент за будь-яким з пп. 13гензв’язувальний фрагмент вводять у дозі від при2 2 15. близно 250 мг/м до приблизно 500 мг/м . 19. Виріб за п. 18, який додатково містить листівку33. Спосіб за п. 29, у якому антитіло або антивкладку в упаковці, де вказано, що композицію гензв’язувальний фрагмент вводять у дозі від при2 2 можна застосовувати для лікування неходжкінсьблизно 275 мг/м до приблизно 375 мг/м . кої лімфоми і/або аутоімунного захворювання. 34. Спосіб за п. 29, у якому пацієнту вводять при20. Виріб за п. 19, у якому аутоімунне захворюваннаймні дві дози антитіла або антиня вибирають із групи, яка включає ревматоїдний гензв’язувального фрагмента, причому кожна доза 2 артрит, ювенільний ревматоїдний артрит, системстановить 375 мг/м . ний червоний вовчак (СЧВ), люпус-нефрит, неспе35. Спосіб за п. 34, у якому дві дози вводять з 2цифічний виразковий коліт, хворобу Вегенера, тижневим інтервалом. запальне захворювання кишечнику, ідіопатичну 36. Спосіб за п. 29, який полягає в тому, що пацієтромпоцитопенічну пурпуру (ІТП), тромботичну нту додатково вводять принаймні один хіміотератромбогемолітичну пурпуру (ТТП), аутоімунну певтичний агент. тромбоцитопенію, розсіяний склероз, псоріаз, 37. Спосіб за п. 36, у якому рак являє собою нехопов’язану з IgА нефропатію, пов’язані з IgМ поліджкінську лімфому (НХЛ) і хіміотерапевтичний невропатії, важку псевдопаралітичну міастенію, агент вибирають із групи, яка включає доксорубіваскуліти, ANCA-васкуліти, відторгнення транспцин, циклофосфамід, вінкристин і преднізолон, та лантата паренхіматозних органів, реакцію «трансCHOP. плантат проти хазяїна», цукровий діабет, синдром 38. Спосіб лікування аутоімунного захворювання, Рейно, синдром Шегрена й гломерулонефрит. який полягає в тому, що пацієнту, який страждає 21. Нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло за від аутоімунного захворювання, вводять терапевбудь-яким з пп. 1-10 або антигензв’язувальний тично ефективну кількість антитіла за будь-яким з фрагмент за п. 13. пп. 1-12 або антигензв’язувального фрагмента за 22. Експресійний вектор, який містить нуклеїнову будь-яким з пп. 13-15. кислоту за 21. 39. Спосіб за п. 38, у якому аутоімунне захворю23. Клітина-хазяїн, яка містить нуклеїнову кислоту вання вибирають із групи, яка включає ревматоїдза 21. ний артрит, ювенільний ревматоїдний артрит, сис24. Клітина-хазяїн за п. 23, яка являє собою CHOтемний червоний вовчак (СЧВ), люпус-нефрит, клітину. неспецифічний виразковий коліт, хворобу Вегене25. Спосіб одержання гуманізованого антитіла, що ра, запальне захворювання кишечнику, ідіопатичзв'язує людський CD20, або антигензв’язувального ну тромпоцитопенічну пурпуру (ІТП), тромботичну фрагмента, який полягає в тому, що культивують тромбогемолітичну пурпуру (ТТП), аутоімунну клітину-хазяїна, яка продукує антитіло за будьтромбоцитопенію, розсіяний склероз, псоріаз, яким з пп. 1-10 або антигензв’язувальний фрагпов’язану з IgА нефропатію, пов’язані з IgМ полімент за п. 13, та виділяють антитіло або антиневропатії, важку псевдопаралітичну міастенію, гензв’язувальний фрагмент із клітинної культури. васкуліти, ANCA-васкуліти, відторгнення трансп26. Гуманізоване антитіло, що зв'язує людський лантата паренхіматозних органів, реакцію «трансCD20, де антитіло одержане способом, який поляплантат проти хазяїна», цукровий діабет, синдром гає в тому, що експресують нуклеїнову кислоту, Рейно, синдром Шегрена й гломерулонефрит. яка кодує антитіло, яке має амінокислотні послідо40. Спосіб за п. 39, у якому аутоімунне захворювності важкого та легкого ланцюга, представлені в вання являє собою ревматоїдний артрит. 5 89350 6 41. Спосіб за п. 40, у якому пацієнт страждає від 51. Спосіб за п. 48, у якому доза складає 2x500 мг. ревматоїдного артриту середнього - серйозного 52. Спосіб за п. 48, у якому доза складає 2x1000 ступеня тяжкості та отримує лікування принаймні мг. одним модифікуючим хворобу протиревматичним 53. Спосіб за п. 48, у якому ревматоїдний артрит лікарським засобом, яке не приводить до бажаного має ступінь тяжкості від середнього до серйозного. результату. 54. Спосіб лікування аутоімунного захворювання, 42. Спосіб за п. 40, у якому пацієнту вводять додавибраного із групи, яка включає дерматоміозит, тково другий терапевтичний агент. грануломатоз Вегенера, ANCA-васкуліт, апластич43. Спосіб за п. 42, у якому другий терапевтичний ну анемію, аутоімунну гемолітичну анемію (АІГА), агент являє собою імуносупресор. дефіцит фактора VIII, гемофілію A, аутоімунну 44. Спосіб за п. 43, у якому імуносупресор являє нейтропенію, синдром Кастельмана, синдром Гудсобою метотрексат. пасчера, відторгнення трансплантата паренхіма45. Спосіб за п. 40, у якому антитіло підлягає вветозних органів, реакцію «трансплантат проти хазяденню у дозі, вибраній з 2x10 мг, 2x50 мг, 2x200 мг їна» (РТПХ), опосередковуване IgМ захворювання, та 2x500 мг. тромботичну тромбогемолітичну пурпуру (ТТП), 46. Спосіб за п. 38, у якому антитіло підлягає вветиреоїдит Хашимото, аутоімунний гепатит, лімфоденню шляхом внутрішньовенного вливання. їдний інтерстиціальний пневмоніт (ЛІП), бронхолі47. Спосіб за п. 38, у якому антитіло підлягає підштичні облітерації (не пов’язані із трансплантацією) кірному введенню. проти NSIP, синдром Гійєна-Барре-Штроля, васку48. Спосіб лікування ревматоїдного артриту (РА) у літ великих судин, гігантоклітинний артеріїт (синдлюдини, який полягає у введенні антитіла за будьром Такаясу), васкуліт середніх судин, хвороба яким з пп. 1-12 або антигензв’язувального фрагКавасакі і нодозний поліартеріїт, який полягає в мента за будь-яким з пп. 13-15, причому антитіло тому, що пацієнту, який страждає від вказаного або антигензв’язувальний фрагмент вводять у захворювання, вводять терапевтично ефективну дозі, вибраній з групи, що складається з 2x10 мг, кількість антитіла за будь-яким з пп. 1-12 або анти2x50 мг, 2x200 мг, 2x500 мг та 2x1000 мг. гензв’язувального фрагмента за будь-яким з пп. 49. Спосіб за п. 48, у якому доза складає 2x50 мг. 13-15. 50. Спосіб за п. 48, у якому доза складає 2x200 мг. Даний винахід стосується антитіл до CD20 й їх застосування для лікування зв'язаних з Вклітинами захворювань. Лімфоцити являють собою одну з декількох популяцій лейкоцитів; вони специфічно розпізнають і реагують на чужорідний антиген. Трьома основними класами лімфоцитів є В-лімфоцити (Вклітини), Т-лімфоцити (Т-клітини) і природні клітини-кілери (NK). В-лімфоцити являють собою клітини, які відповідають за виробництво антитіл і гуморальну імунну відповідь. В-клітини дозрівають у кістковому мозку й залишають його, експресуючи антигензв'язувальне антитіло на клітинній поверхні. Коли В-клітина, яка раніше не піддавалася ніякому впливу, вперше контактує з антигеном, для якого зв'язане з мембраною антитіло є специфічним, клітина починає швидко ділитися і її потомство диференціюється з утворенням В-клітин пам'яті й ефекторних клітин, які називаються «плазмацитами». В-клітини пам'яті мають більшу тривалість життя й продовжують експресувати зв'язане з мембраною антитіло з такою ж специфічністю, що й у вихідної батьківської клітини. Плазмацити не продукують зв'язане з мембраною антитіло, але замість цього продукують секретовану форму антитіла. Секретовані антитіла являють собою головні ефекторні молекули гуморальної імунної відповіді. Антиген CD20 (який називають також антигеном, диференціювання якого характерне тільки для людських В-лімфоцитів, Вр35) являє собою гідрофобний трансмембранний білок з молекулярною масою приблизно 35кДа, локалізований на пре-В- і зрілих В-лімфоцитах (Valentine й ін., J. Biol. Chem. 264(19), 1989, сс. 11282-11287; і Einfeld й ін., ЕМВО J. 7(3), 1988, сс. 711-717). Антиген експресується також на поверхні більш ніж 90% Вклітин при не-ходжкінських лімфомах (НХЛ) (Anderson й ін., Blood 63(6), 1984, сс. 1424-1433), але він не виявлений на гематопоетичних стовбурових клітинах, про-В-клітинах, здорових плазмацитах або в інших здорових тканинах (Tedder й ін., J. Immunol. 135(2), 1985, стор. 973-979). Імовірно CD20 регулює ранню(і) стадію(ії) процесу активації циклу клітинної ініціації й диференціювання (Tedder й ін., вище) і можливо функціонує як кальцієві іонні канали (Tedder й ін,. J. Cell. Biochem. 14D, 1990, с. 195). З урахуванням того, що експресія CD20 відбувається в В-клітинах при лімфомах, цей антиген може являти собою цінну терапевтичну мішень при лікуванні вказаних лімфом. Зараз понад 300000 людей у Сполучених Штатах страждають від В-клітинної НХЛ і щороку діагностується більше 56000 нових випадків захворювання. Наприклад антитіло ритуксимаб (RITUXAN ), який являє собою створене за допомогою генної інженерії химерне мишине/людське моноклональне антитіло до людського антигену CD20 (надходить у продаж від фірми Genentech, Inc., Південний СанФранциско, шт. Каліфорнія, США) застосовують для лікування пацієнтів, які страждають від Вклітинної не-ходжкінської лімфоми, яка характеризується наявністю рецидивів, або слабкої рефрактерної або фолікулярної CD20-позитивної неходжкінської лімфоми. Ритуксимаб являє собою 7 89350 8 антитіло, позначене як «С2В8» в US 5736137, виріанти 2Н7 включає такі варіанти, які несуть аміноданому 7 квітня 1998р. (на ім'я Anderson й ін.) і в кислотні заміни в FR (каркасна ділянка), і варіанти US 5776456. Вивчення механізму дії in vitro проз дозрілою афінністю, які мають заміни в трансплантованих CDR. Застосовувані для заміни в CDR демонструвало, що RITUXAN зв'язує людський або FR амінокислоти не обмежені кислотами, які комплемент і лізує лінії лімфоїдних В-клітин у реприсутні в антитілі-донорі або -реципієнті. В інших зультаті комплементзалежної цитотоксичності варіантах здійснення винаходу антитіла до CD20, (CDC) (Reff й ін., Blood 83(2), 1994, стор. 435-445). запропоновані у винаході, додатково містять заміКрім того, це антитіло має виражену активність ни в амінокислотних залишках Fc-фрагмента, що при аналізі антитіло-зумовленої клітиннозалежної приводить до поліпшення ефекторної функції, цитотоксичності (ADCC). У доклінічних випробувключаючи CDC- і/або ADCC-функцію, і до зниваннях in vivo встановлено, що RITUXAN зменщення В-клітин (у даному описі позначене як змешує кількість В-клітин у периферичній крові, лімншення кількості В-клітин або В-клітинне виснафатичних вузлах і кістковому мозку яванських ження). Інші антитіла до CD20, запропоновані у макак-крабоїдів (Масаса fascicularis) (циномолгус), винаході, включають антитіла, які несуть специфіімовірно через процеси, які опосередковуються чні заміни, що підвищують стабільність. Конкреткомплементом і клітиною (Reff й ін., Blood 83(2), ними варіантами здійснення винаходу є гуманізо1994, стор. 435-445). Інші антитіла до CD20, які вані варіанти 2Н7 з підвищеною стабільністю, які можна застосовувати для лікування НХЛ, являють описані нижче в прикладі 6. Також описані варіансобою мишине антитіло Zevalin , зв'язане з рати з дефіцитом фукози, у яких поліпшена ADCCдіоактивним ізотопом ітрієм-90 (фірма IDEC функція. Відповідно до одного з варіантів здійсPharmaceuticals, Сан-Дієго, шт. Каліфорнія), Вехнення винаходу химерне антитіло до CD20 несе хаг , яке являє собою інше повністю мишине анмишині V-ділянки й людську С-ділянку. Одним з титіло, кон'юговане з I-131 (фірма Corixa, шт. Ватаких специфічних химерних антитіл до CD20 є шингтон). Rituxan (Rituximab ; фірма Genentech, Inc.). Основним обмеженням, зв'язаним із застосуУ переважному варіанті здійснення винаходу у ванням мишиних антитіл для лікування людини, є всіх композиціях антитіл і способах застосування, утворення людських антимишиних антитіл (НАМА) запропонованих у винаході, гуманізоване CD20(див., наприклад Miller R.A. і ін. «Monoclonal зв'язувальне антитіло являє собою 2H7.v16, у якоantibody therapeutic trials in seven patients with Tго амінокислотні послідовності легкого й важкого cell lymphoma», Blood, 62, 1983, стор. 988-995; і ланцюга представлені в SEQ ID NO. 21 й 22 відпоSchroff R.W. і ін. «Human anti-murine відно, наведених на Фіг.6 і Фіг.7. Відносно поліпепimmunoglobulin response in patients receiving тидних послідовностей, представлених на Фіг.6, 7 monoclonal antibody therapy», Cancer Res., 45, й 8, то слід розуміти, що перші 19 або близька кі1985, стор. 879-885). Навіть химерні молекули, у лькість амінокислот, які утворюють секреторну яких варіабельні (V) ділянки антитіл гризунів злиті сигнальну послідовність, не присутні в зрілому з людськими константними (С) ділянками, ще збеполіпептиді, V-ділянка всіх інших варіантів, оснорігають здатність викликати сильну імунну відповою яких є версія 16, повинні мати амінокислотні відь (НАСА, людська відповідь на химерне антитіпослідовності v16 за винятком положень амінокисло) (Neuberger й ін., Nature (Лондон), 314, 1985, лотних замін, які вказані в описі. Якщо не вказано стор. 268-270). Ефективним підходом, який дозвоінше, то 2Н7-варіанти мають такий же L-ланцюг, ляє переборювати вказані обмеження при застощо й v16. суванні моноклональних антитіл у клінічних умоУ винаході описане гуманізоване антитіло, яке вах, є «гуманізація» мишиного антитіла або зв'язує людський CD20, або його антигензв'язуваантитіла, отриманого з видів крім людини (Jones й льний фрагмент, де антитіло має ефективність ін., Nature (Лондон), 321, 1986, стор. 522-525; відносно виснаження В-клітин приматів in vivo, Riechman й ін., Nature (Лондон), 332,1988, стор. антитіло, яке містить у варіабельній ділянці Н323-327). ланцюга (VH) принаймні CDR3-послідовність, Таким чином, представляється важливим представлену в SEQ ID NO. 12, з антитіла до людстворення терапевтичних антитіл до антигену ського CD20 і практично всі залишки людської конCD20, які при введенні пацієнтам мають мінімальсенсусної каркасної ділянки (FR) людського важкону антигенність або не мають її взагалі, призначего ланцюга підгрупи III (VHIII). В одному з варіантів них насамперед для тривалого лікування. У даноздійснення винаходу В-клітини приматів одержуму винаході вирішена ця та інші задачі. Даний ють із організму людини або яванських макаквинахід стосується антитіл до CD20, які дозволякрабоїдів. В іншому варіанті здійснення винаходу ють переборювати обмеження, зв'язані із застосуантитіло додатково містить CDR1-послідовність Нванням існуючих терапевтичних композицій, і маланцюга, яка представлена в SEQ ID NO. 10, ють також додаткові переваги, які стануть СDR2-послідовність Η-ланцюга, яка представлена очевидними після ознайомлення з наведеним нив SEQ ID NO. 11. У ще одному варіанті здійснення жче докладним описом. винаходу вказане вище антитіло містить CDR1Даний винахід стосується CD20-зв'язувальних послідовність L-ланцюга, яка представлена в SEQ антитіл або їх функціональних фрагментів і їх заID NO. 4, СDR2-послідовність L-ланцюга, яка стосування для лікування зв'язаних з В-клітинами представлена в SEQ ID NO. 5, СDR3-послідовність захворювань. Ці антитіла являють собою монокL-ланцюга, яка представлена в SEQ ID NO. 6, що лональні антитіла. У конкретних варіантах здійсмістить практично всі залишки людської консенсунення винаходу антитіла, які зв'язуються з CD20, є сної каркасної ділянки (FR) людської легкої гуманізованими або химерними. Гуманізовані ва 9 89350 10 бою повнорозмірні (зрілі) антитіла, у яких VHланцюга підгрупи І (V I). У переважному варіанті ділянка з'єднана з константною ділянкою важкого здійснення винаходу FR-ділянка в VL має залишок ланцюга людського IgG. У переважних варіантах донорського антитіла в положенні 46; у конкретноздійснення винаходу IgG являє собою людський му варіанті здійснення винаходу FR2 в VL має аміIgG1 або IgG3. нокислотну заміну leu46Рrо (залишок Leu в людсьВ одному з варіантів здійснення винаходу кій консенсусній послідовності I-ланцюга CD20-зв'язувальне антитіло кон'югують із цитотокзамінений на залишок Pro, який присутній у відпосичним агентом. У переважних варіантах здійсвідному положенні в m2Н7). нення винаходу цитотоксичний агент являє собою VH-ділянка додатково містить залишок донортоксин або радіоактивний ізотоп. ського антитіла принаймні в положеннях 49, 71 й В одному з варіантів здійснення винаходу ан73 амінокислотної послідовності каркасної ділянки. титіла, запропоновані у винаході для застосування В одному з варіантів здійснення винаходу VH несе в терапевтичних або діагностичних цілях, одержузаміни в наступних положеннях в FR людського ють в СНО-клітинах. важкого ланцюга підгрупи III: Ala49Gly в FR2; Винахід також стосується композиції, яка місArg71Val й Asn73Lys в FR3. В інших варіантах тить антитіло, описане в одному з попередніх ваздійснення винаходу CDR-ділянки в гуманізованоріантів здійснення винаходу, і носій. В одному з му антитілі додатково містять амінокислотні заміни варіантів здійснення винаходу носій являє собою на залишки, яких немає ні в антитілі-донорі, ні в фармацевтично прийнятний носій. Ці композиції антитілі-реципієнті. можуть являти собою індивідуальний продукт (виАнтитіло, описане в попередніх варіантах ріб) або набір. здійснення винаходу, може містити VHВинахід також стосується рідкої композиції, послідовність v16, яка представлена в SEQ ID яка містить гуманізоване антитіло 2Н7 у концентNO.8 на Фіг.1Б. В іншому варіанті здійснення винарації 20мг/мл, 10мМ сульфат гістидину, рН 5,8, ходу описане вище антитіло додатково містить VL60мг/мл сахарози (6%), 0,2мг/мл полісорбату 20 послідовність v16, яка представлена в SEQ ID (0,02%). NO.2 на Фіг.1А. Винахід також стосується виділеної нуклеїноВ інших варіантах здійснення винаходу гуманівої кислоті, яка кодує будь-яке антитіло, згадане в зоване антитіло являє собою 2H7.v31, амінокислоданому описі, включаючи експресійний вектор, тні послідовності легкого й важкого ланцюга якого призначений для експресії антитіла. представлені в SEQ ID NO. 2 й 23 відповідно на Наступним об'єктом винаходу є клітини-хазяї, Фіг.6 і Фіг.8; 2H7.v31, амінокислотна послідовність які містять вказані вище нуклеїнові кислоти, і кліважкого ланцюга якого представлена в SEQ ID тини-хазяї, які продукують антитіло. У переважноNO. 23 на Фіг.8; 2H7.v96, яке несе амінокислотні му варіанті здійснення винаходу клітина-хазяїн заміни D56A й N100A в Н-ланцюзі й S92A в Lявляє собою СНО-клітину. У винаході представлеланцюзі v16. ний також спосіб одержання цих антитіл, який поВ інших варіантах здійснення винаходу антитілягає в тому, що культивують клітини-хазяїни, які ло, вказане в попередніх варіантах здійснення продукують антитіло, і виділяють антитіло із клівинаходу, додатково містить принаймні одну амітинної культури. нокислотну заміну в Fc-фрагменті, яка поліпшує Ще одним об'єктом винаходу є виріб (продукт), ADCC- і/або CDC-активність у порівнянні з вихідякий представляє собою контейнер і композицію, ним або батьківським антитілом, з якого воно яка міститься в ньому, де композиція включає анотримано, v.16 являє собою батьківське антитіло, титіло за одним із вказаних вище варіантів здійсз яким проводять порівняння в більшості випадків, нення винаходу. Для застосування з метою лікуа в інших випадках для порівняння використовування НХЛ виріб додатково містить листівкують ритуксан (Rituxan). Одне з таких антитіл з повкладку в упаковці, де вказано, що композицію ліпшеною активністю містить в Fc-фрагменті три застосовують для лікування не-ходжкінської лімзаміни на аланін S298A/E333A/K334A. Одне з анфоми. титіл, яке містить заміну S298A/E333A/K334A, явЩе одним об'єктом винаходу є спосіб індукції ляє собою 2H7.v31, амінокислотна послідовність апоптозу в В- клітинах in vivo, який полягає в тому, важкого ланцюга якого представлена в SEQ ID що В-клітини приводять у контакт із будь-яким вкаNO. 23. Антитіла 2H7.v114 й 2H7.v115 мають призаним вище антитілом, знищуючи тим самим Внаймні в 10 разів більш високу ADCC-активність в клітини. Винахід також стосується способів лікупорівнянні з ритуксаном. вання вказаних у даному описі хвороб, які полягаВ іншому варіанті здійснення винаходу антитіють у тому, що вводять CD20-зв'язувальне антитіло додатково містить принаймні одну амінокислоло або його функціональний фрагмент ссавцеві, тну заміну в Fc-фрагменті, яке приводить до знитакому як хвора людина, яка страждає від такого ження CDC-активності в порівнянні з батьківським захворювання. Відповідно до будь-якого способу антитілом, з якого воно отримане, у більшості видля лікування аутоімунного захворювання або падків у порівнянні з v16. Одне з таких антитіл, яке CD20-позитивного раку в одному з варіантів здійсмає знижену CDC-активність в порівнянні з v16, нення винаходу використовують антитіло 2H7.v16, містить принаймні одну заміну K322А в Η-ланцюзі. амінокислотна послідовність легкого й важкого Порівняння ADCC- і CDC-активності можна здійсланцюга якого представлена в SEQ ID NO. 21 й 22 нювати відповідно до методу, який описаний у відповідно на Фіг.6 і Фіг.7. Таким чином, одним з прикладах. варіантів здійснення винаходу є спосіб лікування У переважному варіанті здійснення винаходу CD20-позитивного раку, який полягає в тому, що антитіла, запропоновані у винаході, являють со 11 89350 12 хворому на рак пацієнтові вводять терапевтично пневмоніт (ВІЛ), бронхолітичні облітерації (не зв'яефективну кількість гуманізованого CD20зані із трансплантацією) проти NSIP, синдром зв'язувального антитіла, запропонованого у винаПйєна-Барре-Штроля, васкуліт великих судин, гіході. У переважних варіантах здійснення винаходу гантоклітинний артеріїт (синдром Такаясу), васкуCD20-позитивний рак являє собою В-клітинну ліліт середніх судин, хворобу Кавасакі, нодозний мфому або лейкоз, включаючи не-ходжкінську ліполіартеріїт, який полягає в тому, що пацієнтові, мфому (НХЛ), або переважно лімфоцитарну хвоякий страждає від вказаного захворювання, ввороба Ходжкіна (ПЛБХ), хронічний лімфоцитарний дять терапевтично ефективну кількість CD20лейкоз (ХЛЛ) або дрібноклітинну лімфоцитарну зв'язувального антитіла. В одному з варіантів здійлімфому (МЛЛ). В одному з варіантів здійснення снення вказаного способу СD20-зв'язувальне анспособу лікування В-клітинної лімфоми або лейкотитіло являє собою Rituxan . 2 зу антитіло вводять у дозі приблизно 275-375мг/м . Винахід також стосується виділеної нуклеїноУ додаткових варіантах здійснення винаходу спової кислоті, яка містить нуклеотидну послідовність сіб лікування полягає також у тому, що пацієнтові CD20 яванських макак-крабоїдів, яка представлевводять принаймні один хіміотерапевтичний агент, на в SEQ ID NO. 24 (див. Фіг.19), або вироджений причому для лікування не-ходжкінської лімфоми варіант цієї послідовності. Одним з варіантів здій(НХЛ) хіміотерапевтичний агент вибирають із ряснення винаходу є виділена нуклеїнова кислота, ду, який включає доксорубіцин, циклофосфамід, яка містить послідовність, яка кодує поліпептид, вінкристин і преднізолон. амінокислотна послідовність якого представлена в У винаході запропонований також спосіб лікуSEQ ID NO. 25 (див. Фіг.20) або SEQ ID NO. 25 вання аутоімунного захворювання, який полягає в (див. Фіг.20) з консервативними амінокислотними тому, що пацієнтові, який страждає від аутоімуннозамінами. Іншим варіантом здійснення винаходу є го захворювання, вводять терапевтично ефективвектор, який містить вказану вище нуклеїнову кисну кількість гуманізованого CD20-зв'язувального лоту, у тому числі експресійний вектор, призначеантитіла за одним із вказаних вище пунктів. Аутоіний для експресії в клітині-хазяїні. Винахід також мунне захворювання вибирають із ряду, який стосується клітини-хазяїна, яка містить вектор. включає ревматоїдний артрит, ювенільний ревмаВинахід також стосується виділеного поліпептиду, тоїдний артрит (хвороба Стілла), системний черякий містить амінокислотну послідовність [SEQ ID воний вовчок (ВКВ), хворобу Вегенера, запальне NO. 25; Фіг.20] CD20 яванських макак-крабоїдів. захворювання кишечнику, ідіопатичну тромпоциНа кресленнях показано: топенічну пурпуру (ІТП), тромботичну тромбогемона Фіг.1А - порівняльний аналіз первинної літичну пурпуру (ТТП), аутоімунну тромбоцитопеструктури амінокислотних послідовностей варіанію, розсіяний склероз, псоріаз, зв'язану з IgA бельної ділянки легкого ланцюга (VL) трьох настунефропатію, зв'язані з IgM полінефропатії, важку пних антитіл: мишиного 2Н7 (SEQ ID NO. 1), гумапсевдопаралітичну міастенію, васкуліт, цукровий нізованого варіанта 2Н7. v16 (SEQ ID NO. 2) і діабет, синдром Рейно, синдром Шегрена й глоділянки людської легкої каппа-ланцюга підгрупи І мерулонефрит. Якщо аутоімунне захворювання (SEQ ID NO. 3). Представлено послідовності CDR являє собою ревматоїдний артрит, то антитіло VL антитіл 2Н7 й hu2H7.v16: CDR1 (SEQ ID NO.4), можна вводити в сполученні із другим терапевтичCDR2 (SEQ ID NO.5) і CDR3 (SEQ ID NO.6); ним агентом, переважно з метотрексатом. на Фіг.1Б - порівняльний аналіз первинної При вказаних способах лікування CD20структури послідовностей VH мишиного антитіла зв'язувальні антитіла можна вводити індивідуаль2Н7 (SEQ ID NO. 7), гуманізованого варіанта но або в сполученні із другим терапевтичним аген2H7.v16 (SEQ ID NO. 8) і ділянки людської консентом, таким як друге антитіло, або з хіміотерапевсусної послідовності важкого ланцюга підгрупи III тичним агентом, або з імунодепресантом. Друге (SEQ ID NO. 9). Представлено послідовності CDR антитіло може являти собою антитіло, яке зв'язує VH антитіл 2Н7 й hu2H7.v16 : CDR1 (SEQ ID CD20 або інший В-клітинний антиген, або NK- або NO.10), CDR2 (SEQ ID NO.11) і CDR3 (SEQ ID Т-клітинний антиген. В одному з варіантів здійсNO.12); нення винаходу друге антитіло представляє мічеНа Фіг.1Α та 1Б CDR1, CDR2 й CDR3 у кожноне за допомогою радіоактивного ізотопу антитіло му ланцюзі позначені дужками, як видно на кресдо CD20. В інших варіантах здійснення винаходу леннях, їх фланкують каркасні ділянки FR1CD20-зв'язувальне антитіло кон'югують із цитотокFR4.2H7 позначає мишине антитіло 2Н7. Зірочки сичним агентом, який представляє собою токсин між двома рядами послідовностей служать для або радіоактивний ізотоп. позначення положень, які є різними у двох посліІншим об'єктом винаходу є спосіб лікування довностях. Залишки позначені відповідно до нуаутоімунного захворювання, вибраного з ряду, мерації Кебота (Kabat й ін., Sequences of який включає дерматоміозит, грануломатоз ВегеImmunological Interest. 5-е вид., вид-во Public нера, ANCA, гіпопластичну анемію, аутоімунну Health Service, National Institutes of Health, гемолітичну анемію (АIГА), дефіцит фактора VIII, Bethesda, Maryland, (1991), де вставки позначені a, гемофілію А, аутоімунну нейтропенію, синдром b, с, d й e; Кастлемана, синдром Гудпасчера, відторгнення на Фіг.2 - послідовність фагміди pVX4 (SEQ ID трансплантата паренхіматозних органів, реакцію NO.13), яка застосовується для конструювання «трансплантат проти хазяїна» (РТПХ), опосередплазмід, які несуть Fab-фрагменти 2Н7 (див. прикковуване IgM захворювання, тромботичну тромболад 1), а також амінокислотні послідовності Lгемолітичну пурпуру (ТТП), тиреодит Хашимото, ланцюга (SEQ ID NO.14) і Н-ланцюга (SEQ ID аутоімунний гепатит, лімфоїдний інтерстиціальний 13 89350 14 NO.15) Fab-фрагмента гуманізованого антитіла до у вигляді lgG1 (Herceptin ; кола), ритуксимабом IFN- із трансплантованими CDR; (квадрати) або rhuMAb 2H7.v16 (трикутники) у прина Фіг.3 - послідовність експресійної плазміди, сутності перехреснозшиваючого вторинного антияка кодує Fab-фрагмент химерного антитіла тіла й аналізували за допомогою FACS. Креслення 2H7.v6.8 (SEQ ID NO.16). Показано амінокислотні 13-15 описані в прикладі 13; послідовності L-ланцюга (SEQ ID NO.17) і Ηна Фіг.14 - результати подвійного фарбування ланцюга (SEQ ID NO.18); за допомогою анексину V і йодиду пропідію, вирана Фіг.4 - послідовність плазміди pDRl (SEQ ID жені у вигляді залежності від концентрації антитіNO.19; 5391 пара основ), призначеної для експрела. Клітини лінії Ramos обробляли контрольним сії легких ланцюгів імуноглобуліну відповідно до антитілом, яке не стосується суті винаходу, у виметоду, описаному в прикладі 1. Плазміда pDRl гляді lgG1 (Herceptin ; кола), ритуксимабом (квадмістить послідовності, які кодують антитіло, яке не рати) або rhuMAb 2H7.v16 (трикутники) у присутстосується суті винаходу, легкий ланцюг гуманізоності перехреснозшиваючого вторинного антитіла ваного антитіла до CD3 (Shalaby й ін., J. Exp. Med. й аналізували за допомогою FACS; 175, 1992, стор. 217-225), стартовий кодон і стопна Фіг.15 - результати підрахунку (протягом кодон, які виділені жирним шрифтом і підкреслені; 10с) живих непофарбованих клітин, виражені у на Фіг.5 - послідовність плазміди pDR2 (SEQ вигляді залежності від концентрації антитіла. КліID NO.20; 6135 пар основ), призначеної для екстини лінії Ramos обробляли контрольним антитіпресії важких ланцюгів імуноглобуліну, відповідно лом, яке не стосується суті винаходу, у вигляді до методу, описаному в прикладі 1. Плазміда lgG1 (Herceptin ; кола ), ритуксимабом (квадрати) pDR2, яка містить послідовності, які кодують антиабо rhuMAb 2H7.v16 (трикутники) у присутності тіло, яке не стосується суті винаходу, важкий ланперехреснозшиваючого вторинного антитіла й цюг гуманізованого антитіла до CD3 (Shalaby й ін., аналізували за допомогою FACS; вище), стартовий кодон і стоп-кодон, які виділені на Фіг.16, 17, 18 -дані про інгібування рісту пужирним шрифтом і підкреслені; хлинних клітин лінії Rajі у безтимусних мишах, на Фіг.6 - амінокислотна послідовність повного отримані відповідно до методу, описаному в прикL-ланцюга 2H7.v16 (SEQ ID NO.21). Перші 19 аміладі 14. Тварин обробляли щотижня (моменти нокислот, розташовані перед DIQ, являють собою обробки позначені вертикальними стрілками; n=8 секреторну сигнальну послідовність, яка відсутня у мишей у групі) протягом 6 тижнів ЗФР (контроль) зрілому поліпептидному ланцюзі; або Rituxan або rhuMAb 2H7.v16 у дозі 5мг/кг на Фіг.7 - амінокислотна послідовність повного (Фіг.16), 0,5мг/кг (Фіг.17) або 0,05мг/кг (Фіг.18); Η-ланцюга 2H7.v16 (SEQ ID NO.22). Перші 19 аміна Фіг.19 - нуклеотидна (SEQ ID NO. 24) і амінокислот, розташовані перед EVQ, являють собою нокислотна (SEQ ID NO. 25) послідовності CD20 секреторну сигнальну послідовність, яка відсутня у яванських макак-крабоїдів, описані в прикладі 15; зрілому поліпептидному ланцюзі. Лінеаризована на Фіг.20 - амінокислотна послідовність CD20 послідовність VH на Фіг.1Б (SEQ ID NO. 8) з повяванських макак-крабоїдів (SEQ ID NO. 25). Залиною послідовністю Н-ланцюга, людською констаншки, які відрізняються від людського CD20, підкретною ділянкою 1-ланцюга відповідає амінокислослені, а відповідні амінокислотні залишки людської там 114-471 в SEQ ID NO. 22; послідовності (SEQ ID NO. 26) представлені безна Фіг.8 - амінокислотна послідовність повного посередньо під амінокислотним залишком мавпяН-ланцюга 2H7.v31 (SEQ ID NO.23). Перші 19 амічої послідовності. Передбачуваний позаклітинний нокислот, розташовані перед EVQ, являють собою домен мавпячого CD20 виділений жирним шрифсекреторну сигнальну послідовність, яка відсутня у том; зрілому поліпептидному ланцюзі. L-ланцюг такий ж на Фіг.21 - результати аналізу зв'язування в як в 2H7.v16 (див. Фіг.6); клітинах яванських макак-крабоїдів, які експресуна Фіг.9 - дані про відносну стабільність варіають CD20, з hu2H7.v16, .v31 і ритуксаном, провентів 2H7.v16 й 2H7.v73 IgG. Результати аналізів деного відповідно до методу, описаному в прикластандартизовані відносно даних до інкубації й ді 15. Аналізували здатність антитіл зв'язуватися й представлені у вигляді відсотка, який зберігся пісзаміщати кон'юговане з ФІТЦ мишине антитіло ля інкубації; 2Н7, яке зв'язується з мавпячим CD20; на Фіг.10 - схематичне зображення, яке узана Фіг.22 - схема збільшення доз, які застосогальнює амінокислотні заміни щодо мишиного вуються для лікування ревматоїдного артриту у 2Н7, які приводять до одержання піднабору гумафазі І/ІІ клінічного досліду; нізованих версій аж до v75; на Фіг.23 - вектор, призначений для експресії на Фіг.11 - узагальнені дані про середні абсо2H7.v16 в СНО-клітинах. лютні кількості В-клітин [CD3-/CD40+] у всіх групах Антиген «CD20» являє собою неглікозилова(досліди з використанням 2Н7 і ритуксану (Rituxan) ний трансмембранний фосфопротеїн з молекуляоб'єднані), отримані відповідно до методу, описарною масою приблизно 35кДа, який виявлений на ному в прикладі 10; поверхні більше ніж 90% В-клітин периферичної на Фіг.12 - результати репрезентативного крові або лімфоїдних органів. Експресія CD20 відADCC-аналізу варіантів 2Н7 з дефіцитом фукози, бувається на ранній стадії розвитку пре-В-клітин, і які описані в прикладі 11; зберігається до диференціювання з утворенням на Фіг.13 - результати фарбування за допомоплазмацитів; він не виявлений на поверхні людсьгою анексину V, виражені залежно від концентрації ких стовбурових клітин, лімфоїдних клітинантитіла. Клітини лінії Ramos обробляли контропопередників або здорових плазмацитів. CD20 льним антитілом, яке не стосується суті винаходу, присутній як на здорових В-клітинах, так і на ура 15 89350 16 жених злоякісним захворюванням В-клітинах. У ляції індивідуальних антитіл, які ідентичні за винялітературі CD20 згадується під іншими назвами, тком можливих мутацій, що зустрічаються в притакими як «еволюційно стабільний (консервативродних умовах, які можуть бути присутні у невелиний) диференціювальний антиген В-лімфоцитів» й ких кількостях. Моноклональні антитіла є високо «Вр35». Антиген CD20 описаний, наприклад, в специфічними і являють собою антитіла до індивіClark й Ledbetter, Adv. Can. Res. 52,1989, стор. 81дуального антигенного сайту. Крім того, на відміну 149 й в Valentine й ін., J. Biol. Chem. 264(19), 1989, від препаратів звичайних (поліклональних) антистор. 11282-11287. тіл, які, як правило, включають різні антитіла до Поняття «антитіло» у даному описі використорізних детермінантів (епітопів), кожне моноклонавується в найбільш широкому розумінні й, зокрельне антитіло спрямоване до однієї детермінанти ма, стосується моноклональних антитіл (включаюантигену. Прикметник «моноклональне» свідчить чи повнорозмірні (зрілі) моноклональні антитіла), про те, що антитіло отримане із практично гомомультиспецифічних антитіл (наприклад біспецифігенної популяції антитіл, при цьому не передбачачних антитіл) і фрагментів антитіл, у тому випадку, ється, що воно повинне бути створене за допомоякщо вони мають необхідну біологічну активність гою якого-небудь конкретного методу, необхідного або функцію. для створення антитіл. Наприклад, моноклональні Біологічна активність CD20-зв'язувальних і гуантитіла, які можна застосовувати згідно із даним манізованих CD20-зв'язувальних антитіл, запроповинаходом, можна одержувати за допомогою менованих у винаході, повинна включати принаймні тоду на основі гібридом, вперше описаного Kohler зв'язування антитіла з людським CD20, більш пей ін., Nature, 256, 1975, с. 495, або їх можна консреважно зв'язування з людським CD20 і з CD20 труювати методами рекомбінатної ДНК (див., US інших приматів (включаючи яванських макак4816567). «Моноклональні антитіла» можуть бути крабоїдів, макак резус і шимпанзе). Зв'язування виділені також з фагових бібліотек антитіл за доантитіл з CD20 повинне характеризуватися знапомогою методик, описаних, наприклад в Clackson -8 й ін., Nature, 352,1991, стор. 624-628 й в Marks й ченням Kd не перевищуючим 1 10 , переважно -9 ін., J. Mol. Biol., 222, 1991, стор. 581-597. значенням Kd, що не перевищує приблизно 1 10 , «Функціональні фрагменти» CD20і повинне привести до знищення або виснаження зв'язувальних антитіл, запропонованих у винаході, В-клітин in vivo, переважно принаймні на 20% у являють собою фрагменти, які зберігають здатпорівнянні з відповідним негативним контролем, ність зв'язуватися з CD20 практично з такою ж не обробленим таким антитілом. В-клітинне виафінністю, що й інтактна повнорозмірна молекула, снаження може бути результатом одного або декіз якої вони отримані, і мають біологічну активність, лькох наступних механізмів: ADCC, CDC, апоптоз яка включає виснаження В-клітин, при оцінці in або інший механізм. У деяких варіантах способу vitro або in vivo за допомогою аналізів, представлікування хвороби, запропонованої у винаході, лених у даному описі. можуть бути потрібні інші специфічні ефекторні Поняття «варіабельний» стосується ситуації, функції або механізми, і для досягнення цих біолоколи певні частини варіабельних ділянок різних гічних функцій, наприклад, ADCC, переважними є антитіл у значній мірі відрізняються за їх послідовпевні варіанти гуманізованого 2Н7. ністю. V-ділянка опосередковує зв'язування антиПонятие «фрагмент антитіла» включає частигену й визначає специфічність конкретного антитіна інтактного антитіла, переважно включає його ла щодо конкретного антигену. Однак антигензв'язувальну або варіабельну ділянки. варіабельність розподілена нерівномірно по посліПриклади фрагментів антитіла включають Fab-, довності варіабельних ділянок, яка складається з Fab-', F(ab')2- і Fv-фрагменти; подвійні антитіла, 110 амінокислот. Так, V-ділянки складаються з лінійні антитіла; молекули одноланцюгових антивідносно інваріантних ділянок, що складаються з тіл; і мультиспецифічні антитіла, отримані із фраг15-30 амінокислот, які називають каркасні ділянки мента(ів) антитіл. «Fv» являє собою мінімальний (FR), розділених більш короткими ділянками, кожфрагмент антитіла, який містить повний сайт впізна довжиною 9-10 амінокислот, які називають «гінавання антигену й антигензв'язувальний центр перваріабельні ділянки». Варіабельні ділянки наантитіла. Цей фрагмент складається з димеру, тивних важких і легких ланцюгів містять чотири FR, який включає одну варіабельну ділянку важкого добре адаптованих до -складчастої конформації, ланцюга й одну варіабельну ділянку легкого ланякі з'єднані трьома гіперваріабельними ділянками, цюга, які зв'язані тісним нековалентним зв'язком. що утворюють петлю, яка зв'язує й у деяких випаУкладання цих двох доментів приводить до утводках утворює частину -складчастої структури. рення шести гіперваріабельних петель (по 3 петлі з Н- і L-ланцюга), які беруть участь у зв'язуванні Гіперваріабельні ділянки в кожному ланцюзі підтамінокислотних залишків з антигеном і надають римуються в тісному зв'язку одна з одною за доантитілу специфічність відносно зв'язування з анпомогою FR і разом з гіперваріабельними ділянкатигеном. Однак навіть одна варіабельна ділянка ми іншого ланцюга беруть участь в утворенні (або половина Fv, яка включає тільки три гіперваантигензв'язувального центра антитіла (див. Kabat ріабельні ділянки (CDR), специфічних для антигей ін., Sequences of Proteins of Immunological ну) має здатність розпізнавати антиген і зв'язуваInterest, 5-е вид., вид-во Public Health Service, тися з ним, хоча й з більш низькою афінністю в National Institutes of Health, Бетесда, шт. Мерипорівнянні з повним сайтом зв'язування. ленд, 1991). Константні ділянки не беруть участь Поняття «моноклональне антитіло» у контексті безпосередньо у зв'язуванні антитіла з антигеном, даного опису означає антитіло, отримане з попуале вони мають різні ефекторні функції, такі як ляції практично гомогенних антитіл, тобто з попу 17 89350 18 участь антитіла в антитіло-зумовленої клітиннозанізоване антитіло повинне містити практично повлежної цитотоксичності (ADCC). ну принаймні одну, а як правило, дві варіабельні Поняття «гіперваріабельна ділянка» у контексділянки, у яких всі або практично всі гіперваріабеті даного опису означає амінокислотні залишки льні петлі відповідають петлям вказаних імуноглоантитіла, які відповідальні за зв'язування з антигебулінів інших тварин крім людини, а всі або пракном. Гіперваріабельна ділянка, як правило, вклютично всі FR відповідають послідовності людського чає амінокислотні залишки антитіла з «гіперваріаімуноглобуліну, хоча FR-ділянки можуть нести одбельної ділянки» або «CDR» (наприклад залишки ну або декілька амінокислотних замін, які підви24-34 (L1), 50-56 (L2) і 89-97(L3) в VL й, наприклад щують афінність до зв'язування. Кількість цих та31-35 (Н1), 50-65 (Н2) і 95-102 (Н3) в VH (Kabat й ких амінокислотних замін в FR, як правило, не ін., Sequences of Proteins of Immunological Interest, перевищує 6 у Η-ланцюзі й не перевищує 3 в L5-е вид., вид-во Public Health Service, National ланцюзі. Гуманізоване антитіло необов'язково моInstitutes of Health, Bethesda, Maryland, 1991) і/або же містити також принаймні частину константної амінокислотні залишки з «гіперваріабельної петлі» ділянки імуноглобуліну (Fc), як правило, людського (наприклад, залишки 26-32 (L1), 50-52 (L2) і 91-96 імуноглобуліну. Додаткові більш докладні дані див. (L3) в VL й 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) і 96-101 (Н3) в VH в Jones й ін., Nature, 321, 1988, стор. 522-525 (Chothia й Lesk, J. Mol. Biol., 196, 1987, стор. 901(1986); Reichmann й ін., Nature, 332, 1988, стор. 917). 323-329 й Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, 1992, У контексті даного опису поняття «консенсусна стор. 593-596. послідовність» або консенсусна послідовність VПоняття «ефекторна функція» антитіла стосуділянки означає штучну послідовність, виявлену в ється видів біологічної активності, зв'язаних з Fcрезультаті порівняння амінокислотних послідовноділянкою (нативною послідовністю Fc-ділянки або стей відомих послідовностей варіабельних ділянок з варіантами амінокислотної послідовності Fcлюдських імуноглобулінів. На основі цих порівняділянки) антитіла, і змінюються залежно від ізотипу льних аналізів визначають рекомбінантні нуклеоантитіла. Прикладами ефекторних функцій антитітидні послідовності, які кодують амінокислоти Vла є: C1q-зв'язування; комплементзалежна цитотоділянки, які є консенсусними для послідовностей, ксичність; зв'язування Fc-рецептора; антитілозумовлена клітиннозалежна цитотоксичність виведених з людської -ланцюга й підгрупи III V(ADCC); фагоцитоз; понижуюча регуляція рецепділянок людського Η-ланцюга. Для консенсусних торів клітинної поверхні (наприклад, В-клітинного послідовностей V-ділянок немає ніяких даних про рецептора, BCR) і В-клітинна активація. специфічність зв'язування або афінність. Поняття «антитіло-зумовлена клітиннозалеж«Химерні» антитіла (імуноглобуліни) несуть на цитотоксичність» або «ADCC» стосується форчастину важкого й/або легкого ланцюга, ідентичну ми цитотоксичності, при якій секретований Ig, зв'яабо гомологічну до відповідних послідовностей заний з Fc-рецепторами (FcR), присутній на антитіл, отриманих з конкретних видів, або які наповерхні певних цитотоксичних клітин (наприклад лежать до конкретних класів або підкласів антитіл, природних клітин-кілерів (NK-клітин), нейтрофілів, у той час як інша ділянка ланцюга(ів) ідентична макрофагів), надаючи здатність цим цитотоксичабо гомологічна до відповідних послідовностей ним ефекторним клітинам специфічно зв'язуватиантитіл, отриманих з інших видів, або які належать ся з клітиною-мішенню, яка несе антиген, й знидо інших класів або підкласів антитіл, включаючи щуючи в результаті клітину-мішень фрагменти таких антитіл, у випадку, якщо вони цитотоксинами. Антитіла є «зброєю» цитотоксичмають необхідну біологічну активність (US них клітин й абсолютно необхідні для такого зни4816567; і Morrison й ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, щення. Основні клітини, які опосередковують 81, 1984, стор. 6851-6855). У контексті даного опиADCC, тобто NK-клітини, експресують тільки су гуманізовані антитіла є підгрупою химерних антитіл. Fc RIII, у той час як моноцити експресують Fc RI, «Гуманізовані» форми антитіл тварин крім люFc RII й Fc RIII. Дані про експресію FcR гематоподини (наприклад, миші) являють собою химерні етичними клітинами узагальнені в таблиці 3 на с. антитіла, які включають мінімальну послідовність, 464 статті Ravetch й Kinet, Annu. Rev. Immunol 9, отриману з імуноглобуліну тварини крім людини. 1991, стор. 457-492. Для оцінки ADCC-активності Основна частина гуманізованих антитіл являє сомолекули, що представляє інтерес, можна здійсбою людські імуноглобуліни (антитіло-реципієнт нювати аналіз ADCC in vitro, наприклад, описаний або -акцептор), у яких залишки з гіперваріабельної в US 5821337 або 5821337. Ефекторні клітини, які ділянки реципієнта замінені залишками з гіперваможна застосовувати для таких аналізів, включаріабельної ділянки інших видів крім людини (антиють мононуклеарні клітини периферичної крові тіло-донор), таких як миші, щури, кролики або (РВМС) і природні кілери (NK-клітини). В іншому примати крім людини, які мають необхідну специабо додатковому варіанті для оцінки ADCCфічність, афінність й потенціал. У деяких випадках активності молекули, що представляє інтерес, залишки каркасної ділянки (FR) людського імуногможна застосовувати аналіз in vivo, наприклад, з лобуліну заміняють відповідними залишками імувикористанням як моделей тварин відповідно до ноглобуліну інших видів крім людини. Крім того, методу, описаному в Clynes й ін., PNAS (USA), 95, гуманізовані антитіла можуть містити залишки, які 1998,стор. 652-656. не присутні в антитілі-реципієнті або в антитіліПоняття «Fc-рецептор» або «FcR» стосується донорі. Ці модифікації здійснюють із метою додатрецептора, який зв'язується з Fc-ділянкою антитікового вдосконалення характеристик антитіла, ла. Переважний FcR має нативну послідовність таких як афінність до зв'язування. У цілому, гумалюдського FcR. Крім того, переважний FcR являє 19 89350 20 собою FcR, що зв'язується з антитілом у вигляді гуманізоване антитіло, яке несе Fc-фрагмент, причому, у композиції приблизно 80-100% (і переважIgG (гамма-рецептор) і включає підкласи Fc RI-, но приблизно 90-99%) антитіл мають зрілу корову Fc RII- і Fc RIII-рецепторів, у тому числі алельні вуглеводну структуру, яка не містить фукози, що варіанти й отримані в результаті альтернативного зв'язана з Fc-фрагментом глікопротеїну. При ствосплайсингу форми цих рецепторів. Fc RIIренні даного винаходу несподівано було встановрецептори включають Fc RIIA («активуючий рецелено, що такі композиції мають поліпшену здатптор,») і Fc RIIB («інгібуючий рецептор»), які маність до зв'язування з Fc RIIIA(F158), який не ють подібні амінокислотні послідовності, що відрінастільки ефективний, як Fc RIIIA (VI58), щодо зняються в основному своїми цитоплазматичними взаємодії з людським IgG. Таким чином, можна доменами. Активуючий рецептор Fc RIIA містить у очікувати, що композиції, запропоновані у винахосвоєму цитоплазматичному домені імунорецептоді, будуть перевершувати раніше описані компорний тирозинвмісний активуючий мотив (ІТАМ). зиції, які містять антитіло до CD20, насамперед, Інгібуючий рецептор Fc RIIB містить у своєму ципри лікуванні хворих людей, у яких відбувається топлазматичному домені імунорецепторний тироекспресія Fc RIIIA (F158). У нормі Fc RIIIA (F158) є зинвмісний інгібуючий мотив (ITIМ) (огляд даних більш розповсюдженим рецептором, ніж Fc RIIIA див. в М. Daeron, Ann. Rev. Immunol., 15, 1997, (VI58), у здорових американців африканського стор. 203-243). Дані про FcR узагальнені в Ravetch походження й у кавказької раси (див. Lehrnbecher й Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9, 1991, стор. 457-492; й ін., Blood 94, 1999, с. 4220). У даному описі проCapel й ін., Immunomethods, 4, 1994, стор. 25-34 й демонстровано також, що синергетичне підвищенde Haas й ін., J. Lab. Clin. Med., 126, 1995, стор. ня здатності зв'язуватися з Fc RIII й/або ADCC330-341. Інші FcR, включаючи FcR, які будуть вифункції є результатом об'єднання глікозилованих явлені в майбутньому, підпадають під вказане поваріантів, представлених у даному описі, з модиняття «FcR». Поняття також включає неонатальфікованою(ими) амінокислотною(ими) послідовнісний рецептор, FcRn, який відповідальний за тю(ями) в Fc-фрагменті глікопротеїну. перенесення материнських IgG в ембріон (Guyer й «Виділене» антитіло являє собою антитіло, ін., J. Immunol., 117, 1976, с. 587 й Kim й ін., J. яке ідентифіковане й відділене від й/або отримане Immunol., 24, 1994, с. 249). з компонента його природного оточення. ЗабрудВ WO 00/42072 (на ім'я Presta) описані варіаннювачами в його природному оточенні є речовини, ти антитіл, які мають підвищену або знижену здатякі можуть впливати при діагностичному або тераність зв'язуватися з FcR. Зміст цього опублікованопевтичному застосуванні антитіла, і вони можуть го патенту спеціально включений в даний опис як являти собою ферменти, гормони й інші білкові посилання (див. також Shields й ін., J. Biol. Chem. або небілкові розчинені речовини. У переважних 9(2), 2001, стор. 6591-6604). варіантах здійснення винаходу антитіло повинне «Людські ефекторні клітини» являють собою бути очищене (1) до більш ніж 95% у перерахунку лейкоцити, які експресують один або декілька FcR на масу антитіла, яке визначають методом Лоурі, і і мають ефекторні функції. Переважно клітини екснайбільш переважно до більш ніж 99мас.%, (2) до пресують принаймні Fc RIII і мають ADCCступеня, достатнього для одержання принаймні 15 ефекторні функції. Приклади людських лейкоцитів, N-кінцевих залишків або внутрішньої амінокислотякі опосередковують ADCC, включають мононукної послідовності за допомогою секвенатора з леарні клітини периферичної крові (РВМС), прирообертовою чашкою, або (3) до гомогенного стану дні кілери (NK-клітини), моноцити, цитотоксичні Тза даними ДСН-ПААГ у відновлювальних або не клітини й нейтрофіли; переважними є РВМС і NKвідновлювальних умовах при фарбуванні кумасі клітини. Ефекторні клітини можна виділяти із прибрильянтовим блакитним або переважно при фародного джерела, наприклад, із крові. рбуванні сріблом. Виділені антитіла включають Поняття «комплементзалежна цитотоксичантитіла, які знаходяться in situ у рекомбінантних ність» або «CDC» означає здатність молекули виклітинах, якщо в них не є присутній жоден компокликати лізис клітини-мішені в присутності комнент природного оточення антитіла. Однак звиплементу. Класичний шлях активації комплементу чайно виділене антитіло одержують із використанініціюється зв'язуванням першого компонента сисням принаймні однієї стадії очищення. теми комплементу (C1q) з антитілами (відповідних «Виділена» молекула нуклеїнової кислоти явпідкласів), які зв'язуються з спорідненим антигеляє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка іденном. Для оцінки активації комплементу можна затифікована й відділена від принаймні однієї молестосовувати CDc-аналіз, наприклад, описаний в кули нуклеїнової кислоти-домішки, з якою вона Gazzano-Santoro й ін., J. Immunol. Methods, звичайно зв'язана в природному джерелі нуклеї202,1996, с. 163. нової кислоти антитіла. Виділена молекула нуклеПоліпептидні варіанти зі зміненими амінокисїнової кислоти відрізняється від тієї форми або лотними послідовностями Fc-фрагмента й з піднабору, у яких вона знаходиться в природних умовищеною або зниженою здатністю зв'язувати C1q вах. Таким чином, виділена молекула нуклеїнової описані в US 619455 IB 1 й WO 99/51642. Зміст цих кислоти відрізняється від молекули нуклеїнової опублікованих патентів спеціально включений в кислоти, яка існує в клітинах у природних умовах. даний опис як посилання (див. також Idusogie й ін., Однак виділена молекула нуклеїнової кислоти J. Immunol. 164, 2000, стор. 4178-4184). включає молекулу нуклеїнової кислоти, яка знахоСайт N-глікозилування в IgG являє собою диться в клітинах, у яких у нормі відбувається ексAsn297 в СН2-домені. Даний винахід також стосупресія антитіла, наприклад, у випадку, якщо молеється композицій, які містять CD20-зв'язувальне кула нуклеїнової кислоти має локалізацію в 21 89350 22 хромосомі, відмінну від її локалізації в клітинах у проти власних (ауто) антигенів й/або тканин індиприродних умовах. відуума. Вираз «контролюючі послідовності» стосуєтьУ контексті даного опису поняття «В-клітинне ся послідовностей ДНК, необхідних для експресії виснаження (виснаження В-клітин)» стосується функціонально зв'язаної кодувальної послідовносзниження рівнів В-клітин у тварини або людини ті у певному організмі-хазяїні. Придатні для прокапісля лікування лікарським засобом або антитілом ріот контролюючі послідовності являють собою, у порівнянні з рівнем В-клітин до лікування. Рівні наприклад, промотор, необов'язково оператор і В-клітин оцінюють за допомогою добре відомих сайт зв'язування рибосоми. Як відомо, в еукаріометодик, таких як описані в експериментальних тичних клітинах присутні промотори, сигнали поліприкладах. В-клітинне виснаження може бути поваденілування й енхансери. ним або частковим. В одному з варіантів здійсненНуклеїнова кислота «функціонально зв'язана», ня винаходу виснаження В-клітин, які експресують якщо вона знаходиться у функціональному зв'язку CD20, становить принаймні 25%. Не обмежуючись з іншою нуклеотидною послідовністю. Наприкладяким-небудь одним конкретним механізмом, можДНК передпослідовності або секреторної лідерної на припустити, що механізми В-клітинного виснапослідовності функціонально зв'язують із ДНК поження включають ADCC, CDC, апоптоз, модуляцію ліпептиду, якщо він експресується у вигляді пекальцієвого потоку або комбінацію двох або більредпротеїну, який бере участь у секреції поліпепшої кількості вказаних механізмів. тиду; промотор або енхансер функціонально Поняття «цитотоксичний агент» у контексті дазв'язують з кодувальною послідовністю якщо він ного опису стосується субстанції, яка інгібує або впливає на транскрипцію послідовності; сайт зв'язапобігає функції клітин й/або викликає деструкцію зування рибосоми функціонально зв'язують з коклітин. Мається на увазі, що під поняття підпада131 125 90 дувальною послідовністю, якщо він розташований ють радіоактивні ізотопи (наприклад, І ,1 , Y й 186 так, що може полегшувати трансляцію. Як правиRe ), хіміотерапевтичні агенти й токсини, такі як ло, «функціонально зв'язаний» означає, що зв'яті, що мають ферментативну активність токсини зані послідовності ДНК є суміжними, а у випадку бактеріального, грибного, рослинного або тваринсекреторної лідерної послідовності є суміжними й ного походження або їх фрагменти. знаходяться у фазі зчитування. Однак енхансери «Хіміотерапевтичний агент» являє собою хіміне обов'язково повинні бути суміжними. Зв'язуванчну сполуку, які застосовують для лікування раку. ня здійснюється шляхом вбудовування літуванням Приклади хіміотерапевтичних агентів включають в існуючі сайти рестрикції. Якщо такі сайти не ісалкілувальні агенти, такі як тіотепа й циклофоснують, то відповідно до відомої практики застософамід (CYTOXAN ); алкіл сульфонати, такі як вують синтетичні олігонуклеотидні адаптори або бусульфан, імпросульфан і піпосульфан; азиридилінкери. ни, такі як бензодопа, карбохуон, метуредопа й Поняття «вектор» включає біфункціональні й уредопа; етиленіміни й метиламеламіни, включаекспресійні вектори. Як правило, плазмідна консючи алтретамін, триетиленмеламін, триетиленфотрукція може містити також сайт ініціації реплікації сфорамід, триетилентіофосфорамід, триметило(наприклад сайт ініціації реплікації Co1E1) і селекломеламін; азотні аналоги гірчичного газу, такі як тований маркер (який, наприклад, зумовлює стійхлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамід, есткість до ампіциліну або тетрацикліну) для реплікарамустин, іфосфамід, мехлоретамін, гідрохлорид ції й відбору відповідно плазмід у бактеріях. оксиду мехлорметаміну, мелфалан, новембіхін, Поняття «експресійний вектор» стосується вектофенестерин, преднімустин, трофосфамід, урацира, який містить необхідні контролюючі послідовловий аналог гірчичного газу; нітрозсечовини, такі ності або регуляторні елементи для експресії аняк кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломуститіл, включаючи фрагмент антитіла, тин, німустин, ранімустин; антибіотики, такі як запропонованого у винаході, у бактеріальних або аклациномізини, актиноміцин, аутраміцин, азасееукаріотичних клітинах. Прийнятні вектори описані рин, блеоміцини, кактиноміцин, каліхеамінцин, нижче. карабіцин, карминоміцин, карзинофелін, хромоміКлітина, яка продукує гуманізоване CD20цини, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, 6зв'язувальне антитіло, запропоноване у винаході, діаза-5-оксо-L-норлейцин, доксорубіцин (адріаміповинна являти собою бактеріальні й еукаріотичні цин), епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марцелоклітини-хазяї, у які повинна бути інтродукована міцин, мітоміцини, мікофенольна кислота, ногалануклеїнова кислота, яка кодує антитіла. Прийнятні міцин, олівоміцини, пепломіцин, потфіроміцин, клітини-хазяї описані нижче. пуроміцин, хеломіцин, родарубіцин, стрептонігрин, Поняття «мітка» у контексті даного опису стострептозоцин, туберцидин, убенімекс, зиностатин, сується сполуки або композиції, що виявляють, які зорубіцин; антиметаболіти, такі як метотрексат й безпосередньо або опосередковано кон'юговані з 5-фторурацил (5-ФУ); аналоги фолієвої кислоти, антитілом. Мітка може сама являти собою мітку, такі як деноптерин, метотрексат, птероптерин, яку виявляють (наприклад радіоізотопні мітки або триметрексат; пуринові аналоги, такі як флударафлуоресцентні мітки), або у випадку ферментатибін, 6-меркаптопурин, тіаміприн, тіогуанін; піримивних міток може каталізувати хімічну зміну субдинові аналоги, такі як анцитабін, азацитидин, 6страту або композиції, яку можна виявляти. азауридин, кармофур, цитарабін, дидезоксіуредин, Поняття «аутоімуннезахворювання» у кондоксифлуридин, еноцитабин, флоксуридин, 5-ФУ; тексті даного опису означає не злоякісне захворюандрогени, такі як калустерон, дромостанолонпровання або порушення, яке виникає й спрямоване піонат, епітіостанол, мепітіостан, тестолактон; антиадренергетики, такі як аміноглутетімід, мітотан, 23 89350 24 трилостан; замінник фолієвої кислоти, такий як оцінюватися самим пацієнтом. Лікування може фролінова кислота; ацеглатон; альдофосфамідгліприводити до досягнення повної відповіді, яка розкозид; амінолевулінову кислоту; амсакрин; бестглядається як зникнення всіх ознак раку, або до рабуцил; бісантрен; едатраксат; дефофамін; дечасткової відповіді, при якій розмір пухлини знижумеколцин; діазіхон; елформітин; ацетат еліптинію; ється, переважно більш ніж на 50%, більш переетоглюцид; нітрат галію; гідроксисечовину; лентиважно на 75%. Пацієнт також вважається таким, нан; лонідамін; мітогуазон; мітоксантрон; мопідащо піддається лікуванню, якщо в пацієнта відбувамол; нітракрин; пентостатин; фенамед; пірарубіється стабілізація захворювання. У переважному цин; подафілінову кислоту; 2-етилгідразид; варіанті здійснення винаходу в пацієнтів, які страждають від раку, не спостерігається прогресування прокарбазин; PSK ; разоксан; сизофиран; спірозахворювання навіть через 1 рік, переважно через германій; тенуазонову кислоту; триазихон; 2,2',2"15 місяців. Ці параметри оцінки ефективності лікутрихлортриетиламін; уретан; віндесин; дакарбавання й поліпшення стану захворювання легко зин; маномустин; митобронітол; мітолактол; піпобвизначати за допомогою загальноприйнятих пророман; гацитозин; арабінозид; («Аrа-С»"); тіотепа; цедур, добре відомих практикуючим у відповідній таксоїди, наприклад, паклітаксел (TAXOL , Bristolгалузі лікарям. Myers Squibb Oncology, Принстон, шт. Нью-Джерсі) Поняття «терапевтично ефективна кількість» і доцетаксел (TAXOTERE , Rhone-Poulenc Rorer, стосується кількості антитіла або лікарського заЕнтоні, Франція); хлорамбуцил; гемцитабін; 6собу, ефективного для «лікування» захворювання тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; аналоги або стану в пацієнта. У випадку раку терапевтично платини, такі як цисплатин і карбоплатин; вінбласефективна кількість лікарського засобу може знитин; платину; етопозид (VP-16); іфосфамід; мітоміжувати кількість пухлинних клітин; знижувати розцин С; мітоксантрон; вінкристин; вінбластин; віномір пухлини, інгібувати (тобто до деякої міри спорелбін; навелбін; новантрон; теніпозид; вільнювати або припиняти) метастазування дауноміцин; аміноптерин; кселоду; ібандронат; пухлини; інгібувати певною мірою ріст пухлини; СРТ-11; інгібітор топоізомерази RFS-2000; дифтоі/або полегшувати певною мірою один або декільрметилорнітин (ДМПО); ретиноєву кислоту; еспека симптомів, зв'язаних з раком (див. вище визнараміцини; капецитабин й їх фармацевтично причення поняття «лікувати»). йнятні солі, кислоти або похідні будь-якої із Поняття «хронічне» застосування стосується вказаних вище сполук. Під обсяг цього визначення безперервного (тривалого) застосуванню агенпідпадають також антигормональні агенти, які рета(ів) на противагу гострому (короткочасному) гулюють або інгібують дію гормону на пухлині, такі шляху введення, так щоб підтримувати первісну як антиестрогени, включаючи, наприклад, тамоктерапевтичну дію (активність) протягом тривалого сифен, ралоксифен, інгібуючі ароматазу 4(5)періоду часу. «Переривчасте» застосування ознаімідазоли, 4-гідрокситамоксифен, триоксифен, чає лікування, яке не здійснюють послідовно без кеоксифен, LY117018, онапристон, ітореміфен перерв, але яке скоріше за своєю природі є періо(фарестон) і антиандрогени, такі як флутамід, нідичним. лутамід, бікалутамід, леупролід і госерелін; інші Композиції й способи, запропоновані у винахіміотерапевтичні агенти, такі як преднізолон. Під ході обсяг винаходу підпадають також фармацевтично Даний винахід стосується гуманізованих антиприйнятні солі, кислоти й похідні будь-якої із вкатіл, які зв'язують людський CD20, і переважно тазаних вище сполук. кож CD20 інших приматів, які несуть Η-ланцюг, що Поняття «лікувати» або «лікування» або «помістить принаймні один, переважно два або всі легшення» стосуються як терапевтичного лікуванCDR Η-ланцюги отриманого із джерела крім людиня, так і профілактичних або превентивних захони антитіла до людського CD20 (донорське антитідів, метою яких є запобігання або сповільнення ло), і практично всі залишки консенсусної каркас(зменшення) цільового патологічного стану або ної ділянки людського антитіла як антитілопорушення. Вважається, що «лікування» пацієнта, реципієнт. Донорське антитіло можна одержувати який страждає від CD20-позитивного раку або ауз різних видів крім людини, включаючи мишей, тоімунного захворювання, є успішним, якщо після щурів, морських свинок, кіз, кроликів, коней, приприйому терапевтичної кількості CD20матів, але найбільш часто воно являє собою мизв'язувального антитіла, запропонованого у винашине антитіло. У цьому контексті поняття «практиході, з використанням способів, запропонованих у чно всі» означає, що FR-ділянки реципієнта в даному винаході, у пацієнта виявлені помітне гуманізованому антитілі можуть включати одну й/або значне зниження або відсутність одного або або декілька амінокислотних замін, які відсутні в декількох ознак або симптомів конкретного захволюдській консенсусній FR- послідовності у вихідрювання. Наприклад у випадку раку, зниження ному стані. Ці заміни в FR можуть включати заликількості пухлинних клітин або відсутність пухлиншки, які відсутні в антитілі-реципієнті або в донорних клітин; зниження розміру пухлини, інгібування ському антитілі. (тобто сповільнення певною мірою й переважно В одному з варіантів здійснення винаходу доприпинення) метастазування пухлини; інгібування норське антитіло являє собою мишине антитіло певною мірою росту пухлини; підвищення трива2Н7, V-ділянка якого, включаючи послідовності лості стадії ремісії й/або ослаблення певною міCDR й FR кожної Н- і L-ланцюгів, представлені на рою одного або декількох симптомів, зв'язаних з Фіг.1А и 1Б. У конкретному варіанті здійснення конкретним видом раку; зниження захворюваності винаходу залишки каркасної ділянки людського й смертності, поліпшення якості життя. Зниження Fab-фрагмента відповідають консенсусній посліознак або симптомів захворювання може також 25 89350 26 часу стану ремісії принаймні протягом 6 місяців, довності людської V підгрупи І й VH підгрупи III, ці більш переважно 9 місяців, ще більш переважно консенсусні послідовності представлені на Фіг.1А і одного року, ще більш переважно 2 років, ще Фіг.1Б відповідно. Гуманізоване антитіло 2Н7, забільш переважно 3 років і ще більш переважно 5 пропоноване у винаході, повинне містити принайабо більше років. У найбільш переважному варіанмні один з CDR Н-ланцюга мишиного донорського ті здійснення винаходу В-клітинне виснаження є антитіла. В одному з варіантів здійснення винаходостатнім для вилікування захворювання. У переду гуманізоване антитіло 2Н7, яке зв'язує людсьважних варіантах здійснення винаходу В-клітинне кий CD20, містить CDR й Н-, і L-ланцюга донорсьвиснаження в пацієнта, який страждає від раку, кого антитіла. становить принаймні приблизно 75% і більш переУ повнорозмірному антитілі гуманізоване важно 80, 85, 90, 95, 99 і навіть 100% у порівнянні CD20-зв'язувальне антитіло, запропоноване у виз вихідним рівнем до початку лікування. наході, повинне містити гуманізовану V-ділянку, Для лікування аутоімунного захворювання мозв'язану з С-ділянкою людського імуноглобуліну. У же знадобитися модуляція рівня В-клітинного випереважному варіанті здійснення винаходу Сснаження залежно від захворювання й/або серйоділянку Н-ланцюга одержують із людського IgG, зності стану в конкретного пацієнта шляхом переважно IgG1 або IgG3. С-ділянку L-ланцюга регуляції дози CD20-зв'язувального антитіла. Так, переважно одержують із людського -ланцюга. В-клітинне виснаження може бути, але може й не Якщо не вказано інше, то версія гуманізованобути повним. В іншому варіанті загальне Вго антитіла 2Н7 у контексті даного опису повинна клітинне виснаження може бути потрібним на помати послідовності V- і С-ділянки L-ланцюга чатковій стадії лікування, але при наступному ліку2H7.v16 (Фіг.6, SEQ ID NO. 21) і Η-ланцюга ванні дози можна регулювати так, щоб досягати 2H7.v16 (Фіг.7., SEQ ID NO. 22) за винятком полотільки часткового виснаження. В одному з варіанжень амінокислотних замін або змін, вказаних нитів здійснення винаходу В-клітинне виснаження жче в експериментальних прикладах. становить принаймні 20%, тобто зберігається 80% Гуманізовані CD20-зв'язувальні антитіла поабо менша кількість CD20-позитивних В клітин у винні зв'язувати принаймні людський CD20 і перепорівнянні з вихідним рівнем до початку лікування. важно зв'язувати CD20 інших приматів, такі як В інших варіантах здійснення винаходу В-клітинне CD20 мавп, включаючи яванських макак-крабоїдів, виснаження становить 25, 30, 40, 50, 60, 70% або макак резус і шимпанзе. Послідовність CD20 яванбільше. Переважно В-клітинне виснаження є досських макак-крабоїдів описана в прикладі 15 і на татнім для припинення розвитку захворювання, Фіг.19. більш переважно для полегшення ознак і симптоБіологічна активність CD20-зв'язувальних анмів конкретного захворювання, яке підлягає лікутитіл і гуманізованих CD20-зв'язувальних антитіл, ванню, ще більш переважно для вилікування зазапропонованих у винаході, повинна включати хворювання. принаймні зв'язування антитіла з людським CD20, Винахід також стосується біспецифічних більш переважно зв'язування з людським CD20 й CD20-зв'язувальних антитіл, у яких одне плече CD20 приматів (включаючи яванських макакантитіла несе гуманізований Н- і L-ланцюг гуманікрабоїдів, макак резус, шимпанзе), що характери-8 зованого CD20-зв'язувального антитіла, запропозується значенням Kd, яке не перевищує 1 10 , нованого у винаході, а інше плече несе V-ділянку, переважно значенням Kd, яке не перевищує приб-9 яка специфічно зв'язується із другим антигеном. У лизно 1 10 , ще більш переважно значенням Kd, -10 конкретних варіантах здійснення винаходу другий яке не перевищує приблизно 1 10 , і здатність антиген вибирають із ряду, який включає CD3, знищувати або виснажувати В- клітини in vitro або CD64, CD32A, CD16, NKG2D або інші ліганди, які in vivo, переважно принаймні на 20% у порівнянні з активують NK. вихідним рівнем або відповідним негативним контПри порівнянні з ритуксаном (ритуксимаб) ролем, що не обробляють вказаним антитілом. встановлено, що варіант v16 має приблизно в 2-5 Потрібний рівень В-клітинного виснаження поразів більш високу ADCC-активністю, приблизно в винен залежати від захворювання. Для лікування 3-4 рази більш низьку CDC-активністю в порівнянні CD20-позитивного раку може вимагатися максиз ритуксаном. мальне виснаження В-клітин, які є мішенню антиОдержання антитіл тіл до CD20, запропонованих у винаході. Так, для Моноклональні антитіла лікування CD20-позитивної В-клітинної неоплазії Моноклональні антитіла можна створювати, потрібно, щоб В-клітинне виснаження було достанаприклад, за допомогою методу на основі гібритнім принаймні для запобігання розвитку захворюдом, який вперше описаний в Kohler й ін., Nature, вання, яке може оцінювати лікар, який практикує в 256, 1975, с. 495, або за допомогою методів рекоданій галузі, наприклад, здійснюючи моніторинг мбінантної ДІЖ (US 4816567). росту пухлини (розмір), проліферації канцерогенПри використанні методу на основі гібридом них типів клітин, метастазів, інших ознак і симптомишу або іншу придатну тварину-хазяїн, таку як мів конкретного виду раку. Переважно В-клітинне хом'ячок, імунізують відповідно до описаної вище виснаження є достатнім для запобігання розвитку методики, для того, щоб викликати утворення лізахворювання принаймні протягом 2 місяців, більш мфоцитів, які продукують або можуть продукувати переважно 3 місяців, ще більш переважно 4 місяантитіла, які мають здатність специфічно зв'язуваців, ще більш переважно 5 місяців, ще більш перетися з білком, який застосовують для імунізації. важно 6 або більшої кількості місяців. У ще більш Відповідно до іншого варіанта лімфоцити можна переважних варіантах здійснення винаходу Водержувати в результаті імунізації in vitro. Після клітинне виснаження є достатнім для подовження 27 89350 28 імунізації лімфоцити виділяють і потім зливають із Моноклональні антитіла, секретовані субклоклітинною лінією мієломи за допомогою прийнятнами, можна відокремлювати від культурального ного зв'язувального агента, такого як поліетиленгсередовища, асцитної рідини або сироватки за ліколь, з одержанням клітини гібридоми (Goding, допомогою звичайних методів очищення антитіл, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, виднаприклад, афінною хроматографією (наприклад, во Academic Press, 1986, стор. 59-103). з використанням протеїн А- або протеїн QОтримані в такий спосіб клітини гібридоми висефарози), або іонообмінної хроматографії, хросівають і вирощують у придатному культуральноматографії на гідроксилапатитах, гельму середовищі, яке переважно містить одну або електрофорезу, діалізу й т.д. декілька речовин, які інгібують ріст або виживання ДHК, яка кодує моноклональні антитіла, можна незлитих батьківських клітин мієломи. Наприклад, легко виділяти й секвенувати за допомогою загаякщо батьківські клітини мієломи не містять ферльноприйнятих процедур (наприклад з викорисменту гіпоксантингуанінфосфорибозитанням олігонуклеотидних зондів, які мають здатлтрансферази (HGPRT або HPRT), то культуральність специфічно зв'язуватися з генами, які не середовище для гібридом, як правило, повинно кодують важкі й легкі ланцюги мишиних антитіл). включати гіпоксантин, аміноптерин і тимідин (НАТЯк переважне джерело такої ДНК служать клітини середовище), тобторечовини, які перешкоджають гібридоми. Після виділення ДНК можна включати в росту клітин з дефіцитом HGPRT. експресійні вектори, якими потім трансфектують Як компонент для злиття клітинами мієломи, клітини-хазяї, такі як клітини Е. coli, мавпячі COSщо переважно застосовуються, є клітини, які легко клітини, клітини яєчника китайського хом'ячка піддаються злиттю, підтримують стабільний висо(СНО) або клітини мієломи, які без трансфекції не кий рівень виробництва антитіл вибраними продупродукують білок антитіла, що приводить до синкуючими антитіла клітинами й чутливі до вибірного тезу моноклональних антитіл у рекомбінантних середовища, на якому відбувається відбір незв'яклітинах-хазяїнах. Огляд статей про рекомбінантну заних батьківських клітин. Переважними лініями експресію в бактеріях ДНК, яка кодує антитіло, клітин мієлом є лінії мишиної мієломи, такі як див. в Skerra й ін., Curr. Opinion in Imunol., 5, 1993, створені на основі мишиних ліній пухлинних клітин стор. 256-262 й Pluckthun, Immunol. Revs. лінії МОРС-21 й МРС-11, які можна одержувати з 130,1992, стор. 151-188. Salk Institite Cell Distribution Center, Сан-Дієго, шт. Згідно із ще одним варіантом здійснення винаКаліфорнія, США, і лінії SP-2 або X63-Ag8-653, які ходу моноклональні антитіла або фрагменти антиможна одержувати з Американської колекції типотіл можна виділяти з фагових бібліотек антитіл, вих культур, Роквіл, шт. Мериленд, США. Описане створених за допомогою методів, описаних в також застосування ліній клітин людської мієломи McCafferty й ін., Nature, 348, 1990, стор. 552-554 . В й гетеромієломи типу «миша-людина» для виробClackson й ін., Nature, 352, 1991, стор. 624-628 й ництва моноклональних антитіл (Kozbor, J. Marks й ін., J. Mol. Biol., 222, 1991, стор. 581-597 Immunol., 133, 1984, с. 3001; і Brodeur й ін., описане виділення мишиних і людських антитіл Monoclonal Antibody Production Techniques and відповідно за допомогою фагових бібліотек. У наApplications, вид-во Marcel Dekker Inc., Нью-Йорк, ступних публікаціях було описане виробництво 1987, стор. 51-63). високоафінних (нМ-діапазон) людських антитіл за Культуральне середовище, у якій вирощують допомогою перестановки ланцюга (Marks й ін., клітини гібридоми, аналізують відносно виробницBio/Technology, 10, 1992, стор. 779-783), а також тва моноклональних антитіл до антигену. Перевакомбінаторна інфекція й рекомбінація in vivo як жно специфічність зв'язування моноклональних стратегія конструювання дуже великих фагових антитіл, отриманих з використанням клітин гібрибібліотек (Waterhouse й ін., Nucl. Acids. Res., 21, доми, визначають методом імунопреципітації або 1991, стор. 2265-2266). Таким чином, ці методи за допомогою аналізу зв'язування in vitro, такого як являють собою реальну альтернативу традиційрадіоімунний аналіз (РІА) або твердофазний імуним методам виділення моноклональних антитіл ноферментний аналіз (ELISA). на основі гібридом моноклональних антитіл. Афінність зв'язування моноклонального антиДНК, яка кодує антитіло, можна також модифітіла можна, наприклад, визначати за допомогою кувати, наприклад таким чином, щоб одержувати Скетчард-аналізу, описаного в Munson й ін., Anal. химерні або злиті поліпептиди антитіл, наприклад, Biochem., 107, 1980, с. 220. шляхом заміни послідовностей константних діляПісля виявлення клітин гібридоми, які продунок важкого й легкого ланцюга (СН й CL) на гомолокують антитіла необхідної специфічності, афінносгічні мишині послідовності (US 4816567 й Morrison ті й/або активності, клони можна субклонувати за й ін., Ргос. Natl. Acad. Sci. USA: 81, 1984, с. 6851) допомогою процесів обмежуючого розведення й або за допомогою ковалентного зв'язування кодувирощувати стандартними методами (Goding, вальної послідовності імуноглобуліну з усією або із Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, видчастиною кодувальної послідовності поліпептиду, во Academic Press, 1986, стор. 59-103). Придатні яка не належить до імуноглобулінів (гетерологічдля цієї мети середовища включають, наприклад, ного поліпептиду). Поліпептидні послідовності, які середовище D-MEM або RPMI-1640. Крім того, не належать до імуноглобулінів можна замінювати клітини гібридоми можна вирощувати in vivo у вина константні ділянки антитіла або замінювати на гляді асцитних пухлин в організмі тварин, наприваріабельні ділянки антигензв'язувального центру клад, шляхом внутріошньочеревинної (і.р.) ін'єкції антитіла, створюючи химерне бівалентне антитіло, клітин мишам. яке містить один антигензв'язувальний центр, який має специфічність відносно антигену, і інший анти 29 89350 30 гензв'язувальний центр, який має специфічність лінів. Вивчення цих зображень дозволяє здійснювідносно іншого антигену. вати аналіз можливої ролі залишків у функції перГуманізовані антитіла спективної послідовності імуноглобуліну, тобто Методи створення «гуманізованих» антитіл аналіз залишків, які впливають на здатність перстварин крім людини відомі в даній галузі. Перевапективного імуноглобуліну зв'язуватися з антигежно гуманізоване антитіло має один або декілька ном. Таким шляхом можна вибирати залишки в FR вбудованих у нього амінокислотних залишків, і об'єднувати з реципієнтними й імпортними посліотриманих із джерела, відмінного від людини. Ці довностями для досягнення необхідних характеотримані із джерела, відмінного від людини, амінористик антитіла, таких як підвищена афінність до кислотні залишки часто називають «імпортними» антигену(ів)-мішені(ням). Як правило, залишки залишками, оскільки їх звичайно одержують із «імгіперваріабельної ділянки виявляють безпосередпортної» варіабельної ділянки. Гуманізацію в ціній й найбільш істотний вплив на зв'язування антилому можна здійснювати відповідно до методу гену. Winter зі співавторами (Jones й ін., Nature, 321, Гуманізоване антитіло може являти собою 1986, стор. 522-525; Riechmann й ін., Nature, 332, фрагмент антитіла, такий як Fab-фрагмент, необо1988, стор. 323-327; Verhoeyen й ін., Science, 239, в'язково кон'югований з одним або декількома ци1988, стор. 1534-1536) шляхом заміни послідовнототоксичним(ними) агентом(ами) для створення стей гіперваріабельної ділянки на відповідні посліімунокон'югату. В альтернативному варіанті гумадовності людського антитіла. Таким чином, «гуманізоване антитіло може являти собою повнорозмінізовані» антитіла являють собою химерні рне антитіло, наприклад, повнорозмірне антитіло у антитіла (US 4816567), у яких ділянка, істотно мевигляді lgG1. нша, ніж інтактна людська варіабельна ділянка, Людські антитіла й методика, заснована на зазамінена відповідною послідовністю, отриманою з стосуванні фагової дисплейної бібліотеки видів крім людини. На практиці гуманізовані антиЯк альтернатива гуманізації можна одержуватіла являють собою, як правило, людські антитіла, ти людські антитіла. Наприклад, зараз можна одеу яких частина залишків гіперваріабельної ділянки ржувати трансгенних тварин (наприклад мишей), й можливо частина залишків FR замінені залишякі після імунізації можуть продукувати повний ками з аналогічних ділянок антитіл гризунів. спектр людських антитіл без виробництва ендоВибір людських варіабельних ділянок як легкогенного імуноглобуліну. Наприклад, було описано, го, так і важкого ланцюга, призначених для одерщо гомозиготна делеція ділянок стику гена важкожання гуманізованих антитіл, дуже важливий для го ланцюга антитіла (JН-сегмента) в організмі хизниження антигенності й НАМА-відповіді (людське мерних мишей і мишей з мутацією в зародковій антимишине антитіло), коли антитіло призначене лінії приводить до повного інгібування виробництдля лікування людини. Згідно із так званим метова ендогенного антитіла. Перенесення набору дом «найбільш переважного підбору» послідовзародкової лінії гена людського імуноглобуліну в ність варіабельної ділянки антитіла гризунів підтаку мутантну зародкову лінію мишей приводить дають скринінгу щодо повної бібліотеки відомих до виробництва людських антитіл після контрольпослідовностей людських варіабельних ділянок. ного зараження антигеном (див., наприклад, Людську послідовність V-ділянки, яка найбільш Jakobovis й ін., Ргос. Natl. Acad. Sci. USA: 90, 1993, близька до послідовності з організму гризунів, ідес. 2551; Jakobovis й ін., Nature, 362, 1993, стор. 25нтифікують й всередині неї вибирають людську 258; Bruggermann й ін., Year in Immuno., 7, 1993, с. каркасну ділянку (FR), придатну для застосування 33; і US 5545806, 5569825, 5591669 (усе на ім'я в гуманізованому антитілі (Sims й ін., J. Immunol., фірми GenPharm); 5545807; і W0 97/17852). 151,1993, с. 2296); Chothia й ін., J. Mol. Biol., 196, В альтернативному варіанті для одержання 1987, с. 901). В іншому методі використовують людських антитіл і фрагментів антитіл in vitro зі певну каркасну ділянку, отриману з консенсусної спектра генів варіабельної ділянки (V) імуноглобупослідовності певної підгрупи легких або важких ліну з організму імунізованих донорів можна виколанцюгів всіх людських антитіл. Ту саму каркасну ристовувати фагову дисплейну технологію ділянку можна застосовувати для декількох різних (McCafferty й ін., Nature, 348, 1990, стор. 552-553). гуманізованих антитіл (Carter й ін., Ргос. Natl. Acad. Відповідно до цієї методики гени V-ділянки антитіSci. USA: 89, 1992, с. 4285; Presta й ін., J. Immunol., ла клонують у рамці зчитування або з основним, 151, 1993, с. 2623). або з мінорним геном оболонкового білка нитчасТакож важливо, щоб антитіла були гуманізотого бактеріофага, такого як М13 або fd, і презенвані зі збереженням високої зв'язувальної здатнотують у вигляді функціональних фрагментів антисті до антигену й інших важливих біологічних властіла на поверхні фагової частинки. Оскільки тивостей. Для вирішення цієї задачі відповідно до нитчаста частинка містить копію одноланцюгової переважного способу гуманізовані антитіла одерДНК фагового геному, селекції за ознакою функціжують за допомогою аналізу батьківських послідоональних властивостей антитіла, також приводять вностей і різних гуманізованих продуктів з викоридо відбору гена, що кодує антитіло, яке має вказастанням умоглядних тривимірних моделей ні властивості. Таким чином, фаг імітує деякі власбатьківських і гуманізованих послідовностей. Тритивості В-клітини. Фагову презентацію можна здійвимірні моделі імуноглобулінів загальнодоступні й снювати в різних форматах (огляд яких див., добре відомі фахівцям у даній галузі. Відомі комнаприклад Johnson Kevin S. і Chiswell David J., п'ютерні програми, які ілюструють і відображають Current Opinion in Structural Biology, 3, 1993, стор. можливі тривимірні конформаційні структури виб564-571). Для фагової презентації можна викорисраних перспективних послідовностей імуноглобутовувати різні джерела сегментів V-генів. Clackson 31 89350 32 й ін., Nature, 352, 1991, стор. 624-628 виділили ні антитіла можуть нести сайт зв'язування з CD20 різні набори антитіл до оксазолону з невеликої у сполученні зі стайтом зв'язування іншого білка. В довільної комбінаторної бібліотеки V-генів, отриальтернативному варіанті плече антитіла до CD20 маної із селезінки імунізованих мишей. Можна можна об'єднувати із плечем, яке зв'язується зі конструювати спектр V-генів, отриманих з організстимулюючою молекулою на поверхні лейкоцита, му імунізованих людей-донорів, і антитіла до різтакий як молекула Т-клітинного рецептора (наприного набору антигенів (включаючи аутоантигени) клад CD3), або з Fc-рецептором для IgG (Fc R), можна виділяти в цілому відповідно до методів, таким як Fc RI (CD64), Fc RII (CD32) і Fc RIII (CD описаних в Marks й ін., J. Mol. Biol., 222, 1991, стор. 16), або NKG2D або іншим активуючим лігандом 581-597 або в Griffith й ін., ЕМВО J., 12, 1993, стор. NK-клітини, у результаті чого відбувається фоку725-734) (див. також US 5565323 й 5537905). сування захисних механізмів клітини на експресуЯк описано вище, людські антитіла можуть ючійCD20 клітині. Біспецифічні антитіла можна продукуватися також in vitro активованими Взастосовувати також для локалізації цитотоксичклітинами (див. US 5567610 й 5229275). них агентів у клітинах, які експресують CD20. Ці Фрагменти антитіл антитіла несуть CD20-зв'язувальне плече й плече, У певних обставинах доцільно застосовувати яке зв'язується із цитотоксичним агентом (наприфрагменти антитіл, а не повні антитіла. Менший клад із сапорином, антиінтерфероном-а, алкалоїрозмір фрагментів сприяє їх швидкому кліренсу й дом вінка, ланцюгом рицину А, метотрексатом або може сприяти переважному проникненню в щільні міченим за допомогою радіоактивного ізотопу гаппухлини. теном). Біспецифічні антитіла можна одержувати у Для одержання фрагментів антитіл розроблені вигляді повнорозмірних антитіл або фрагментів різні методи. Традиційно ці фрагменти одержуваантитіл (наприклад, F(аb')2-фрагментів біспецифіли шляхом протеолітного розщеплення інтактних чних антитіл). антитіл (див., наприклад, Morimoto й ін., Journal of В WO 96/16673 описане біспецифічне антитіло Biochemical and Biophysical Methods, 24, 1992, до ErbB2/Fc RIII, а в US 5837234 описане біспестор. 107-117 й Brennan й ін., Science, 229, 1985, с. цифічне антитіло до ErbB2/Fc RII. Біспецифічне 81). Однак зараз ці фрагменти можна одержувати антитіло до ErbB2/Fc описане в WO 96/16673. В безпосередньо за допомогою рекомбінантних кліUS 5821337 описане біспецифічне антитіло до тин-хазяїв. Fab-, Fv- і scFv-фрагменти антитіл моErbB2/CD3. жна експресувати і секретувати із Е. coli, що доМетоди створення біспецифічних антитіл візволяє полегшувати виробництво більших домі в даній галузі. Загальноприйняте одержання кількостей вказаних фрагментів. Фрагменти антиповнорозмірних біспецифічних антитіл засновано тіл можна виділяти з описаних вище фагових бібна спільній експресії двох пар важких і легких ланліотек антитіл. Відповідно до іншого варіанта Fab'цюгів імуноглобуліну, де обидва ланцюги мають SH-фрагменти можна безпосередньо виділяти з Е. різну специфічність (Millstein й ін., Nature, 305, coli і хімічно зшивати з одержанням F(аb')21983, стор. 537-539). Через випадковий набір важфрагментів (Carter й ін., Bio/Technology, 10, 1992, ких і легких ланцюгів імуноглобуліну, ці гібридоми стор. 163-167). Відповідно до іншого підходу (квадроми) потенційно можуть продукувати суміш F(аb')2-фрагменти можна виділяти безпосередньо із 10 різних молекул антитіл, з яких тільки одна з культури рекомбінантних клітин-хазяїв. Fab- і має правильну біспецифічну структуру. Очищення F(аb')2-фрагмент із підвищеним часом напівжиття правильної молекули, яке звичайно здійснюють у in vivo, у яких збережені залишки епітопзв'язувадекілька стадій за допомогою афінної хроматогльного рецептора, описані в US 5869046. Фахіврафії, є досить трудомістким, а вихід продукту цям у даній галузі повинні бути очевидні інші менизьким. Аналогічні процеси описані в WO тодики одержання фрагментів антитіл. В інших 93/08829 й в Traunecker й ін., ЕМВО J., 10,1991, варіантах здійснення винаходу вибране антитіло стор. 3655-3659. являє собою одноланцюговий Fv-фрагмент (scFv) Відповідно до іншого підходу варіабельні діля(див. WO 93/16185; US 5571894 й US США нки антитіла з необхідною специфічністю зв'язу5587458). Fv й sFv являють собою єдині види з вання (антигензв'язувальні центри антитіла) злиінтактними зв'язувальними сайтами, позбавлені вають із послідовностями константної ділянки константних ділянок; у результаті їх можна застоімуноглобуліну. Злиття переважно здійснюють із совувати для зниженого неспецифічного зв'язуконстантною ділянкою важкого ланцюга Ig, що вання при застосуванні in vivo. Злиті білки, які невключає принаймні частину шарнірних СН2- і СН3 суть sFv, можна конструювати для одержання ділянок. Переважно, щоб принаймні в одному зі злиття ефекторного білка або на N-, або на С-кінці злиттів була присутня перша константна ділянка sFv (див. Antibody Engineering, під ред. Borrebaeck, важкого ланцюга (СН1), яка містить сайт, необхідвище). Фрагмент антитіла може являти собою таний для зв'язування легкого ланцюга. ДНК, які кокож «лінійне антитіло», наприклад описане в US дують злиття важкого ланцюга імуноглобуліну й 5641870. Такі фрагменти лінійного антитіла мопри необхідності легкого ланцюга імуноглобуліну, жуть бути моноспецифічними або біспецифічними. вбудовують у різні експресійні вектори й ними спіБіспецифічні антитіла льно трансфектують прийнятний організм-хазяїн. Біспецифічні антитіла являють собою антитіЦе забезпечує більшу гнучкість у підборі загальних ла, які мають специфічність до зв'язування припропорцій трьох поліпептидних фрагментів у варінаймні із двома різними епітопами. Наприклад, антах, коли в конструкції використовують нерівні біспецифічні антитіла можуть зв'язуватися із двоспіввідношення трьох поліпептидних ланцюгів з ма різними епітопами білка CD20. Інші біспецифічметою оптимізації виходів. Однак можна також 33 89350 34 вбудовувати кодувальні послідовності у дві або в ності агента, який утворює комплекси з дитіолом, усі три поліпептидні ланцюги в одному експресійтакого як арсеніт натрію, для стабілізації сусідніх ному векторі, коли експресія принаймні двох полідитіолів і запобігання утворенню міжмолекулярних пептидних ланцюгів у рівних пропорціях забезпедисульфідних зв'язків. Отримані Fab'-фрагменти чує високі виходи або коли співвідношення не потім перетворюють у тіонитробензоатне (TNB) мають вирішального значення. похідне. Одне з Fab'-TNB-похідних потім повторно В переважному варіанті здійснення вказаного перетворюють в Fab'-тіол шляхом відновлення підходу біспецифічні антитіла являють собою гібмеркаптоетиламіном і змішують із еквімолярною рид важкого ланцюга імуноглобуліну, що забезпекількістю іншого Fab'-TNB-похідного, одержуючи чує першу специфічність зв'язування в першому біспецифічне антитіло. Отримані біспецифічні анплечі, і гібрид пари важкий ланцюг - легкий ланцюг титіла можна застосовувати як агенти для селекімуноглобуліну (що забезпечує другу специфічтивної іммобілізації ферментів. ність зв'язування) у другому плечі. Було виявлено, Досягнутий зараз прогрес дозволяє полегшущо ця асиметрична структура полегшує відділення вати безпосереднє виділення з Е. coli Fab'-SHнеобхідної біспецифічної молекули від небажаних фрагментов, які можна хімічно зшивати з утворенкомбінацій ланцюгів імуноглобулінів, оскільки приням біспецифічних антитіл. Shalaby й ін., J. Exp. сутність легкого ланцюга імуноглобуліну тільки в Med., 175, 1992, стор. 217-225 описали одержання одній половині біспецифічної молекули полегшує F(аb')2-фрагмента молекули повністю гуманізоварозділення. Цей підхід описаний в WO 94/04690. ного біспецифічного антитіла. Кожен Fab'Додатковий докладний опис одержання біспецифіфрагмент окремо секретувався з Е. coli і його підчних антитіл див., наприклад в Suresh й ін., давали безпосередньому хімічному зв'язуванню in Methods in Enzymology, 121, 1986, с. 210. vitro з одержанням біспецифічного антитіла. ОтриВідповідно до наступного підходу, описаному в мане в такий спосіб біспецифічне антитіло мало патенті US 5731168, можна сконструювати ділянку здатність зв'язуватися із клітинами, для яких хараконтакту між парою молекул антитіл з метою підктерна понадекспресія рецептора ЕrbВ2, і зі звивищення до максимального рівня процентного чайними людськими Т-клітинами, а також стимувмісту гетеродимерів, які одержують із культури лювати літичну активність людських рекомбінантних клітин. Переважна ділянка контакцитотоксичних лімфоцитів, мішенню яких є пухлиту включає принаймні частину СН3-ділянки. Відпона молочної залози людини. відно до цього методу одну або декілька невелиОписані також різні методи одержання й видіких амінокислот з бічними ланцюгами з ділянки лення фрагментів біспецифічних антитіл безпосеконтакту першої молекули антитіла заміняють на редньо з культури рекомбінантних клітин. Напримолекули з більшими бічними ланцюгами (наприклад біспецифічні антитіла одержували за клад на тирозин або триптофан). Урівноважуючі допомогою лейцинових «застібок-блискавок» «порожнини», ідентичні або близькі за розміром (Kostelny й ін., J. Immunol., 148(5), 1992, стор. великому(им) боковому(им) ланцюзі(гам) створю1547-1553). Пептиди лейцинових «застібокють в ділянці контакту другої молекули антитіла блискавок» з білків Fos й Jun зв'язували з Fab'шляхом заміни амінокислот з великими боковими фрагментами двох різних антитіл шляхом генного ланцюгами на амінокислоти з більш дрібними бозлиття. Гомодимери антитіл відновлювали в шарковими ланцюгами (наприклад на аланін або треонірній ділянці з одержанням мономерів, а потім нін). Це забезпечує механізм, що сприяє підвишляхом повторного окислення одержували гетещенню виходу гетеродимеру щодо інших родимери антитіл. Цей метод можна застосовуванебажаних кінцевих продуктів, таких як гомодимети також для одержання гомодимерів антитіл. Тери. хнологія на основі «подвійних антитіл», описана Біспецифічні антитіла включають перехресноHollinger й ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, зшиті антитіла або «гетерокон'югати». Наприклад, стор. 6444-6448, являє собою інший механізм одеодне з антитіл у гетерокон'югаті може бути зшите з ржання фрагментів біспецифічних антитіл. Фрагавідином, а інше з біотином. Такі антитіла можна менти містять VH-ділянку, зв'язану з VL-ділянкою використовувати, наприклад, для спрямованого лінкером, який є занадто коротким, для того щоб перенесення клітин імунної системи до небажаних дозволити відбутися спарюванню двох доменів клітин (US 4676980) і для лікування Віл-інфекції одного й того ж ланцюга. Таким чином, VH- і VL(WO 91/00360, WO 92/200373 й ЕР 03089). Антитіділянки одного фрагмента повинні спарюватися з ла-гетерокон'югати можна створювати за допомокомплементарними VL- і VH-ділянками іншого фрагою будь-якого зі звичайних методів введення пегмента, утворюючи тим самим два антигензв'язурехресних зшивок. Прийнятні крос-лінкери добре вальних центри. Описана також інша стратегія відомі в даній галузі й описані в US 4676980 разом одержання фрагментів біспецифічних антитіл, заз різними методами введення перехресних зшиснована на застосуванні одноланцюгових (Fv)вок. (sFv) димерів (див. Gruber й ін., J. Immunol., 152, Методи одержання біспецифічних антитіл із 1994, с. 5368). фрагментів антитіл також описані в літературі. Під обсяг винаходу підпадають також антитіла, Наприклад біспецифічні антитіла можна одержуяке мають більше двох валентностей. Наприклад вати за допомогою хімічного зв'язування. Вгешіап можна одержувати триспецифічні антитіла (Tutt й й ін., Science, 229, 1985, с. 81 описали методику, ін., J. Immunol., 147, 1991, с. 60). відповідно до якої інтактні антитіла піддають проПолівалентні антитіла теолітичному розщепленню, одержуючи F(аb')2Полівалентне антитіло може інтерналізуватися фрагменти. Ці фрагменти відновлюють у присут(і/або дисимілюватися) клітиною, яка експресує 35 89350 36 антиген, з яким зв'язується антитіло, швидше, ніж кінцева конструкція буде мати необхідні характебівалентне антитіло. Антитіла, запропоновані в ристики. Амінокислотні заміни можуть змінювати даному винаході, можуть являти собою полівалентакож посттрансляційні процеси антитіла до CD20, тні антитіла (відмінні від класу IgM) із трьома або такі як зміна кількості або положення сайтів глікобільшою кількістю антигензв'язувальних центрів зилування. (наприклад тетравалентні антитіла), які можна Придатний метод для ідентифікації певних залегко одержувати шляхом рекомбінантної експрелишків або ділянок антитіла до CD20, які мають сії нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептидні лапереважні місця розташування для мутагенезу, нцюги антитіла. Полівалентне антитіло може місякий називається «мутагенез на основі сканування тити димеризований домен і три або більшу аланіну» описаний Cunningham й Wells, Sciente, кількість антигензв'язувальних центрів. Переваж244, 1989, стор. 1081-1085. Відповідно до цього ний димеризованний домен містить (або складаметоду ідентифікують залишок або групу залишється з) Fc-фрагмент або шарнірну ділянку. У таків-мішеней (наприклад заряджених залишків, такому випадку антитіло повинне містити Fcких як arg, asp, his, lys й glu) і заміняють на нейтфрагмент і три або більшу кількість антигензв'язуральну або негативно заряджену амінокислоту вальних центрів, розташованих на N-кінці щодо (найбільш переважно на аланін або поліаланін), Fc-фрагмента. Згідно із даним описом переважне здійснюючи тим самим вплив на взаємозв'язок полівалентне антитіло містить (або складається з) амінокислот з антигеном CD20. Ті локалізації амівід 3 до приблизно 8, але переважно 4, антигензнокислот, для яких встановлена функціональна в'язувальних центрів. Полівалентне антитіло місчутливість до замін, потім піддають удосконалентить принаймні один поліпептидний ланцюг (і пеню шляхом введення додаткових або інших варіареважно два поліпептидні ланцюги), при цьому нтів сайтів, у яких роблять заміну. Таким чином, у поліпептидна(і) ланцюг(и) містить(ять) дві або бітой час як сайт, у який вводять варіант амінокисльшу кількості варіабельних ділянок. Наприклад лотної послідовності, є заздалегідь визначеним, не поліпептидна(і) ланцюг(и) може(уть) містити VD1потрібно, щоб природа самої мутації була зазда(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc, де VD1 означає першу варіабелегідь визначена. Наприклад для аналізу характельну ділянку, VD2 означає другу варіабельну діляристики мутації даного сайту здійснюють мутагенку, Fc означає один поліпептидний ланцюг Fcнез на основі сканування аланіну або фрагмента, X1 й Х2 означають амінокислоту або неспецифічний мутагенез кодону- або ділянкиполіпептид й n означає 0 або 1. Наприклад поліпемішені й проводять скринінг експресованого варіаптидна(і) ланцюг(і) може(уть) містити наступний нта антитіла до CD20 відносно необхідної активланцюг: VH-CH1-гнучкий лінкер-VH-CH1-Fcності. фрагмент; або VH-CH1-VH-CH1-Fc-фрагмент. ПоВставки амінокислотних послідовностей вклюлівалентне антитіло, запропоноване в даному вичають N- і/або С-кінцеві злиття, розмір яких змінюнаході, переважно додатково містить принаймні 2 ється за довжиною від одного залишку до поліпеп(і переважно 4) поліпептиди варіабельної ділянки тидів, які містять сто або більше залишків, а також легкого ланцюга. Полівалентне антитіло, запроповставки всередину послідовності одного або декіноване в даному винаході, може, наприклад містилькох амінокислотних залишків. Приклади кінцевих ти від приблизно 2 до приблизно 8 поліпептидів вставок включають антитіло до CD20 з N-кінцевим варіабельної ділянки легкого ланцюга. У контексті метіонільним залишком або антитіло, злите із циданого опису мається на увазі, що поліпептиди тотоксичним поліпептидом. Інші варіанти вставок варіабельної ділянки легкого ланцюга містять вамолекули антитіла до CD20 включають злиття Nріабельну ділянку легкого ланцюга й необов'язкоабо С-кінця антитіла до ЕrbВ2 з ферментом (наво додатково містять CL-ділянку. приклад ADEPT) або поліпептидом, який підвищує Інші модифікації амінокислотних послідовностривалість напівжиття антитіла в сироватці. тей Іншим типом варіанта є амінокислотна заміна. Під обсяг винаходу підпадає(ють) наведена(і) Ці варіанти включають заміну принаймні одного в описі модифікація(ї) амінокислотних послідовноамінокислотного залишку в молекулі антитіла до стей CD20-зв'язувальних антитіл. Наприклад, моCD20 на інший залишок. Сайта, які представляють же виявитися бажаним поліпшення афінності зв'ясобою найбільший інтерес для мутагенезу шляхом зування й/або інших біологічних властивостей заміни, включають гіперваріабельні ділянки, а таантитіла. Варіанти амінокислотних послідовностей кож і заміни в FR. Консервативні заміни наведені в антитіла до CD20 одержували шляхом введення таблиці, під заголовком «Переважні заміни». Якщо відповідних нуклеотидних замін у нуклеїнову кистакі заміни приводять до зміни біологічної активлоту антитіла до CD20 або шляхом пептидного ності, то можна робити більш істотні заміни, позсинтезу. Такі модифікації являють собою, наприначені як «Приклади замін» у таблиці, або інші клад делеції й/або інсерції й/або заміни залишків в заміни, описані нижче при посиланні на клас аміамінокислотних послідовностях антитіла до CD20. нокислот, і потім продукти можна піддавати скриУ кінцевій конструкції можна здійснювати будь-яку нінгу. комбінацію делецій, інсерційі замін, за умови, що 37 89350 38 антитіла). Як правило, отриманий(і) у результаті Таблиця варіанти), відібрані для подальшого вдосконалення, повинні мати поліпшені біологічні властивості Амінокислотні заміни щодо батьківського антитіла, з якого воно(вони) отримане(і). Прийнятний шлях одержання таких варіантів на основі заміни включає «дозрівання Вихідний Переважні Приклади замін афінності» з використанням фагової презентації. залишок заміни Загалом, метод полягає в наступному: декілька Ala (А) val; leu; ile val сайтів гіперваріабельної ділянки (наприклад, 6-7 Arg (R) lys; gln; asn lys сайтів) піддають мутації, одержуючи всі можливі Asn (N) gln; his; asp; lys; arg gln амінокислотні заміни в кожному сайті. Отримані в Asp (D) glu; glu такий спосіб варіанти антитіла презентуються в Cys (С) ser; ala ser одновалентій формі на поверхні частинок нитчасGin (Q) asn; glu asn того фага у вигляді злиттів із продуктом гена III Glu (E) asp; gln asp фага М13, який присутній у кожній частинці. ВаріаGly (G) ala ala нти, які презентуються фагом, потім піддають His (H) asn; gln; lys; arg arg скринінгу у відношенні їх біологічної активності leu; val; met; ala; phe; нор(наприклад, афінності до зв'язування) відповідно Ile (I) leu лейцин до методик, наведених у даному описі. Для того норлейцин; ile; val; met; ala; щоб виявляти перспективні з погляду модифікації Leu (L) ile phe сайти гіперваріабельної ділянки, можна здійснюLys (K) arg; phe; ile arg вати мутагенез на основі сканування аланіну з Met (M) leu; phe; ile leu метою ідентифікації залишків гіперваріабельної ділянки, які найбільш важливі для зв'язування анPhe(F) leu; val; ile; ala; tyr tyr тигену. В альтернативному або додатковому варіPro (P) ala ala анті може виявитися доцільним аналізувати крисSer (S) thr thr талічну структуру комплексу антиген-антитіло з Thr (T) ser ser метою виявлення точок дотику між антитілом і Trp (W) tyr; phe tyr людським CD20. Такі залишки в точках дотику й Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe сусідні залишки є кандидатами для заміни за доile; leu; met; phe; ala; норVal(V) leu помогою способів, розроблених при створенні далейцин ного винаходу. Після одержання таких варіантів панель варіантів піддають скринінгу відповідно до Істотних модифікацій біологічних властивостей представленого в даному описі методу, і антитіла антитіла досягають шляхом відбору замін, які в з поліпшеними властивостями за даними одного значній мірі відрізняються за їх впливом на підтабо декількох відповідних аналізів відбирають для римання (а) структури каркасу поліпептиду в діляподальшої розробки. нці заміни, наприклад -складчастої або спіральІнший тип амінокислотних варіантів антитіла ної конформації, (б) заряду або гідрофобності змінює вихідну схему глікозилування антитіла. Під молекули в сайті-мішені або (в) розміру бокового зміною розуміють делецію одного або декількох ланцюга. Залишки, які зустрічаються в природних вуглеводних фрагментів, які присутні в антитілі, умовах, поділяють на групи на основі загальних і/або додавання одного або декількох сайтів гліковластивостей бокових ланцюгів: зилування, які в нормі не присутні в антитілі. (1) гідрофобні: норлейцин, met, ala, val, leu, ile; Глікозилування антитіл звичайно відбувається (2) нейтральні гідрофільні: cys, ser, thr; за допомогою або N-зв'язування, або О(3) кислі: asp, glu; зв'язування. N-зв'язування передбачає приєднан(4) основні: asn, gln, his, lys, arg; ня вуглеводного фрагмента до бокового ланцюга (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланзалишку аспарагіну. Трипептидні послідовності цюга: gly, pro; і аспарагін-Х-серин й аспарагін-Х-треонин, де X (6) ароматичні: trp, tyr, phe. позначає будь-яку амінокислоту крім проліну, явНеконсервативні заміни передбачають заміну ляють собою розпізнавані послідовності, признапредставника одного із цих класів на представника чені для ферментативного приєднання вуглеводіншого класу. ного фрагмента до бокового ланцюга залишку Будь-який із залишків цистеїну, які не беруть аспарагіну. Так, присутність будь-якої з цих трипеучасті у підтриманні відповідної конформації антиптидних послідовностей у поліпептиді створює тіла до CD20, можна також заміняти, як правило, потенційний сайт глікозилування. О-зв'язане глікона серин, з метою підвищення стійкості молекули зилування передбачає приєднання одного із цукдо окислення й попередження аномального перерів, таких як N-ацетилгалактозамін, галактоза або хресного зшивання. І навпаки, цистеїновий(і) зв'яксилоза, до гідроксиамінокислоти, найбільш часто зок(и) можна вводити в антитіло для підвищення до серину або треонину, хоча можна застосовувайого стабільності (особливо якщо антитіло являє ти також 5-гідроксипролін або 5-гідроксилизин. собою фрагмент антитіла, такий як Fv-фрагмент). Введення додаткових сайтів глікозилування в Особливо переважний тип варіантів на основі антитіло можна здійснювати шляхом такої зміни заміни являє собою заміну одного або декількох амінокислотної послідовності, щоб вона містила залишків гіперваріабельної ділянки батьківського одну або декілька описаних вище трипептидних антитіла (наприклад гуманізованого або людського послідовностей (для сайту N-глікозилування). Змі 39 89350 40 на може також являти собою додавання або замівації або міжфазної полімеризації (наприклад у ну одного або декількох залишків серину або трегідроксиметилцелюлозні або желатинові й пооніну в послідовності вихідного антитіла (для сайлі(метилметакрилатні) мікрокапсули відповідно), у тів О-глікозилування). колоїдні системи введення лікарських засобів (наМолекули нуклеїнових кислот, які кодують ваприклад ліпосоми, альбумінові мікросфери, мікроріанти амінокислотних послідовностей антитіла до емульсії, наночастинки й нанокапсули) або в мікCD20, одержують різними відомими в даній галузі роемульсії. Такі методи описані в Remington's методами. Ці методи включають (але не обмежуPharmaceutical Sciences, 16-е вид., під ред. Oslo ючись ними) виділення із природного джерела (у Α., 1980. випадку варіантів, які зустрічаються в природних Скринінг антитіл з необхідними властивостями умовах, амінокислотних послідовностей) або одеАнтитіла з необхідними біологічними характержання за допомогою сайтнаправленого мутагенеристиками можна відбирати за допомогою методів, зу з використанням олігонуклеотидів (або сайтнаякі описані в експериментальних прикладах. правленого мутагенезу), ПЛР-мутагенез і Рістінгібуючу дію антитіла до CD20, запропомутагенез із використанням касети раніше отринованого у винаході, можна оцінювати за допомоманого варіанта або не включеної в вказані варіагою методів, які відомі в даній галузі, наприклад з нти версії антитіла до CD20. використанням клітин, які експресують CD20 або Може виявитися бажаним модифікувати антиендогенно, або після трансфекції геном CD20. Натіло, запропоноване у винаході, у відношенні його приклад лінії пухлинних клітин і трансфектованих з ефекторної функції, наприклад, для того, щоб підвикористанням CD20 клітин можна обробляти різвищувати антитіло-зумовлену клітиннозалежну ними концентраціями моноклонального антитіла цитотоксичність (ADCC) і/або комплементзалежну до CD20, запропонованого в винаході, протягом цитотоксичність (CDC) антитіла. Для досягнення декількох днів (наприклад, 2-7 днів) і фарбувати цього можна інтродукувати одну або декількох кристалічним фіолетовим або МТТ (бромід 3-(4,5амінокислотних замін у Fc-ділянку антитіла. В альдиметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразолію) або тернативному або додатковому варіанті залианалізувати за допомогою якого-небудь іншого шок(и) цистеїну можна інтродукувати у Fc-ділянку, колориметричного аналізу. Інший метод оцінки що приводить до утворення в цій ділянки дисульпроліферації можна здійснювати шляхом порів3 фідного зв'язку між ланцюгами. Отримане в такий няння поглинання Н-тимідина обробленими кліспосіб гомодимерне антитіло може мати поліпшетинами в присутності антитіла CD20, запропонону здатність до інтерналізації й/або підвищену ваного у винаході, або без нього. Після обробки комплементзалежну цитотоксичність й антитілоантитілом клітини збирають й оцінюють кількість зумовлену клітиннозалежну цитотоксичність радіоактивної мітки, включеної в ДНК, за допомо(ADCC) (див. Саrоn й ін., J. Exp. Med., 176, 1992, гою сцинтиляційного лічильника. Як прийнятний стор. 1191-1195 й Shopes, J. Immunol., 148, 1992, позитивний контроль використовують обробку вістор. 2918-2922). Гомодимерні антитіла з підвидібраної клітинної лінії рістінгібуючим антитілом, щеної протипухлинною активністю можна одержудля якого відомо, що воно інгібує ріст цієї клітинної вати також з використанням гетеробіфункціональлінії. них крос-лінкерів, відповідно до методики, Для відбору антитіл, які індукують загибель описаної в Wolff й ін., Cancer Research, 53, 1993, клітин, можна здійснювати оцінку втрати цілісності стор. 2560-2565. В іншому варіанті можна консмембрани, наприклад за поглинанням йодиду протруювати антитіло, яке має подвоєну кількість Fcпідію (ПЙ), трипанового синього або 7AAD у порівділянок, яке внаслідок цього може мати підвищену нянні з контролем. Аналіз поглинання ПЙ можна здатність до комплементзлежному лізису й ADCC здійснювати у відсутності комплементу й імуноко(див. Stevenson й ін., Anti-Cancer Drug Design, 3, мпетентних ефекторних клітин. Пухлинні клітини, 1989, стор. 219-230). які експресують CD20, інкубують або в середовищі Для збільшення часу напівжиття антитіла в без антитіл, або в середовищі, яке містить відповісироватці в антитіло можна включати епітопдне моноклональне антитіло в концентрації, на«рятувальник», який зв'язується з рецептором приклад приблизно 10мкг/мл. Клітини інкубують (насамперед у фрагмент антитіла), наприклад відпротягом 3 днів. Після кожної обробки клітини повідно до методу, описаному в US 5739277. У промивають й аліквоти вносять в 35-міліметрові контексті даного опису поняття «епітоппробірки розміром 12775, закриті фільтром (1мл на «рятувальник», який зв'язується з рецептором» пробірку, по 3 пробірки на кожну оброблювану грустосується епітопу Fc-ділянки молекули IgG (напу), для видалення скупчень клітин. Потім у пробіприклад IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4), який відповідарки вносять ПЙ (10мкг/мл). Зразки можна аналізульний за збільшення часу напівжиття в сироватці вати за допомогою проточного цитометра типу in vivo молекули IgG. FACSCAN і програмного забезпечення Інші модифікації антитіл FACSCONVERT CellQuest (фірма Becton Під обсяг даного винаходу підпадають також Dickinson). Як антитіла, які індукують загибель кліінші модифікації антитіл. Наприклад антитіло можтин, відбирають антитіла, які індукують статистична зв'язувати з одним із багатьма небілкових поліно значимі рівні загибелі клітин при оцінці за стумерів, наприклад з поліетиленгліколем, поліпропіпенем поглинання ПЙ. ленгліколем, поліоксіалкіленами або Для відбору антитіл, які зв'язуються з епітопом співполімерами поліетиленгліколю й поліпропіленна CD20, що зв'язаний з антитілом, що представгліколю. Антитіло можна також включати в мікроляє інтерес, можна здійснювати загальноприйнякапсули, наприклад за допомогою методів коацертий аналіз перехресного блокування, наприклад 41 89350 42 описаний в Antibodies, A Laboratory Manual, під фактора (включаючи лідерні послідовності ред. Harlow й David Lane, вид-во Cold Spring фактора Saccharomyces й Kluyveromyces) або ліHarbor Laboratory, 1988. Цей аналіз можна викоридерною послідовністю кислої фосфатази, лідерстовувати для визначення, чи зв'язується тестованою послідовністю глюкоамілази С. albicans або не антитіло з тим же сайтом або епітопом, що й сигнальною послідовністю, описаною в WO антитіло до CD20, запропоноване у винаході. В 90/13646. Для експресії в клітинах ссавців можна альтернативному або додатковому варіанті можна застосовувати сигнальні послідовності ссавців, а здійснювати картування епітопу з використанням також вірусні секреторні лідерні послідовності, методів, добре відомих у даній галузі. Наприклад, наприклад сигнальну послідовність вірусу герпесу послідовність антитіла можна змінювати за допопростого gD. могою мутації, наприклад скануванням аланіну, ДНК такої ділянки-попередника вбудовують для ідентифікації прилеглих залишків. Мутантне шляхом лігування в рамку зчитування ДНК, яка антитіло спочатку тестують відносно зв'язування з кодує CD20-зв'язувальне антитіло. поліклональним антитілом для того, щоб гаранту(II) Компонент, який представляє собою сайт вати правильне укладання. Відповідно до іншого ініціації реплікації методу пептиди, які відповідають різним ділянкам Як експресійні, так і клонувальні вектори місCD20, можна застосовувати для конкурентних тять нуклеотидну послідовність, яка ініціює репліаналізів з тестованими антитілами або з тестовакацію вектора в одній або декількох вибраних кліним антитілом й антитілом з охарактеризованим тинах-хазяїнах. Як правило, у клонувальних або відомим епітопом. векторах ця послідовність являє собою послідовВектори, клітини-хазяї й методи рекомбінації ність, яка ініціює реплікацію вектора незалежно від Винахід також стосується виділеної нуклеїнохромосомної ДНК хазяїна й включає сайти ініціації вої кислоті, яка кодує гуманізоване антитіло до реплікації або послідовності, які автономно репліCD20, векторам і клітинам-хазяям, які містять нуккуються. Такі послідовності добре відомі для різлеїнову кислоту, і методів рекомбінації для одерних бактерій, дріжджів і вірусів. Сайт ініціації репжання антитіла. лікації із плазміди pBR322 придатний для Для рекомбінантного одержання антитіла нукбільшості грамнегативних бактерій, сайт ініціації леїнову кислоту, яка його кодує, виділяють і вбуплазміди 2μ придатний для дріжджів, а різні вірусні довують у здатний до реплікації вектор для подасайти ініціації (ОВ-40 (вакуолізуючий мавпячий льшого клонування (ампліфікація ДНК) або для вірус), вірус поліоми, аденовірус, VSV (вірус везиекспресії. ДНК, яка кодує моноклональне антитіло, кулярного стоматиту) або BPV (вірус папіломи можна легко виділяти й секвенувати із викорисвеликої рогатої худоби)) придатні для клонувальтанням загальноприйнятих методик (наприклад за них векторів у клітинах ссавців. Як правило, комдопомогою олігонуклеотидних зондів, які мають понент, який представляє собою сайт ініціації репздатність специфічно зв'язуватися з генами, які лікації, не потрібен для експресійних векторів для кодують важкі й легкі ланцюги антитіла). Можна клітин ссавців (сайт ініціації ОВ-40, як правило, застосовувати численні вектори. Вектори звичайно застосовують тільки через те, що він містить ранмістять (але не обмежуючись ними) один або декіній промотор). лька з наступних компонентів: сигнальну послідов(III) Компонент, який представляє собою селеність, сайт ініціації реплікації, один або декілька ктуючий ген маркерних генів, енхансер, промотор і термінатор Експресійні й клонувальні вектори можуть містранскрипції. тити селектуючий ген, який також позначається як (І) Компонент, який представляє собою сигнаселектований маркер. Як правило, селектуючі гени льну послідовність кодують білки, які (а) обумовлюють стійкість до CD20-зв'язувальне антитіло, запропоноване у антибіотиків або інших токсинів, таким як ампіцивинаході, можна одержувати за допомогою рекомлін, неоміцин, метотрексат або тетрациклін, (б) бінації не тільки індивідуально, але також у вигляді доповнюють дефіцит ауксотрофності або (в) пополіпептиду, злитого з гетерологічним поліпептиповнюють поживні речовини, які мають вирішальдом, який переважно являє собою сигнальну посне значення, які не надходять із комплексних селідовність або інший поліпептид, що несе специредовищ, наприклад ген, який кодує Dфічний сайт розщеплення на N-кінці зрілого білка аланінрацемазу для Bacilli. або поліпептиду. Вибрана гетерологічна сигнальна Один із прикладів схеми селекції заснований послідовність переважно являє собою послідовна використанні лікарського засобу для припиненність, яка розпізнається клітиною-хазяїном і проня росту клітин-хазяїв. Ті клітини, які успішно транцесується в ній (тобто розщеплюється сигнальної сформовані гетерологічним геном, продукують пептидазою). Для прокаріотичних клітин-хазяїв, які білок, який надає стійкості до лікарського засобу, і не розпізнають й у яких не процесується сигнальв результаті цього виживають у вказаному режимі на послідовність нативного CD20-зв'язувального селекції. Приклади таких агентів для домінантної антитіла, сигнальну послідовність заміняють на селекції, заснованої на застосуванні лікарських прокаріотичну сигнальну послідовність, вибрану, засобів, включають неоміцин, мікофенольну киснаприклад, із групи, яка включає лужну фосфаталоту й гігроміцин. зу, пеніциліназу, Ірр або лідерні послідовності Прикладами інших прийнятних селектованих термостабільного ентеротоксину II. Для секреції із маркерів для клітин ссавців є маркери, які дозводріжджів нативну сигнальну послідовність можна ляють ідентифікувати клітини, які мають здатність заміняти, наприклад лідерною послідовністю інпоглинати нуклеїнову кислоту, яка кодує CD20вертази дріжджів, лідерною послідовністю зв'язувальні антитіла, такі як DHFR (дигідрофолат 43 89350 44 редуктаза), тимідинкіназа, металотіонеїн-І й -II, (S.D.), функціонально зв'язану із ДНК, яка кодує переважно гени металотіонеїну приматів, аденоCD20-зв'язувальне антитіло. зиндеаміназа, орнітиндекарбоксилаза й т.д. Відомі також промоторні послідовності, придаНаприклад клітини, трансформовані селектутні для еукаріот. Практично всі гени еукаріот маючим геном DHFR, спочатку ідентифікують шляють ділянку із високим вмістом AT, розташовану хом культивування всіх трансформантів у культуна відстані приблизно від 25 до 30 пар основ проти ральному середовищі, яке містить метотрексат ходу транскрипції від сайту ініціації транскрипції. (Mtx), конкурентний антагоніст DHFR. Придатною Інша послідовність, яка розташована на відстані клітиною-хазяїном при застосуванні DHFR дикого 70-80 основ від сайту ініціації транскрипції проти типу є лінія клітин яєчника китайського хом'ячка ходу транскрипції багатьох генів, являє собою (СНО) з дефіцитом DHFR-активності (наприклад CNCAAT-ділянку, у якій N позначає будь-який нукАТСС CRL-9096). леотид. На 3'-кінці більшості еукаріотичних генів В альтернативному варіанті клітини-хазяї (назнаходиться послідовність ААТААА, яка може бути самперед хазяї дикого типу, які містять ендогенний сигналом для додавання полі-А-хвоста на 3'-кінець DHFR), трансформовані або спільно трансформокодувальної послідовності. Всі ці послідовності вані послідовностями ДНК, які кодуютьCD20можна вбудовувати в еукаріотичні експресійні векзв'язувальне антитіло, білок DHFR дикого типу й тори. інший селектований маркер, такий як аміноглікоПриклади промоторних послідовностей, які зид-3'-фосфотрансфераза (АФТ), можна відбирати можна застосовувати в дріжджових клітинахшляхом вирощування клітин у середовищі, яке хазяїнах, включають промотори 3містить селектуючий агент для селектованого мафосфогліцераткінази або інших гліколітичних феркера, такий як аміноглікозидний антибіотик, нарментів, таких як енолаза, гліцеральдегід-3приклад канаміцин, неоміцин або G418 (див. US фосфатдегідрогеназа, гексокіназа, піруватдекар4965199). боксилаза, фосфофруктокіназа, глюкозо-6Прийнятний селектуючий ген для застосуванфосфатізомераза, 3-фосфогліцератмутаза, піруня в дріжджах являє собою ген trpl, який присутній ваткіназа, триозофосфатізомераза, фосфоглюков отриманій із дріжджів плазміді YRp7 (Stinchcomb зоізомераза й глюкокіназа. й ін., Nature, 282, 1979, с. 39). Ген trpl є селектуюІнші промотори дріжджів, які являють собою чим маркером для мутантного штаму дріжджів, індуцибельні промотори, що мають додаткову пепозбавленого здатності рости в середовищі з доревагу, зв'язану із транскрипцією, яка контролюдаванням триптофану, наприклад штаму АТСС ється умовами росту, є промоторні ділянки алко№44076 або РЕР4-1 (Jones, Genetics, 85, 1977, с. гольдегідрогенази 2, ізоцитохрому С, кислої 12). Наявність ушкодження trp1 у геномі дріжджофосфатази, які розщеплюють ферментів, зв'язавої клітини-хазяїна створює сприятливі умови для них з метаболізмом азоту, металлтіонеїну, гліцевиявлення трансформації шляхом вирощування за ральдегід-3-фосфатдегідрогенази й ферментів, відсутності триптофану. Аналогічно до цього штавідповідальних за утилізацію мальтози й галактоми дріжджів з дефіцитом Leu-2 (АТСС 20622 або зи. Прийнятні вектори й промотори, які можна за38626) доповнюються за допомогою відомих пластосовувати при експресії в дріжджах, додатково змід, які несуть ген Leu-2. описані в ЕР 73657. Із промоторами дріжджів таКрім того, вектори, отримані з кільцевої плазкож доцільно застосовувати енхансери дріжджів. міди pKDI розміром 1,6мкм, можна застосовувати Транскрипцію CD20-зв'язувального антитіла з для трансформації дріжджів Kluyveromyces. Інша векторів у клітинах ссавцях-хазяїнах контролює, експресійна система для промислового виробницнаприклад за допомогою промоторів, отриманих з тва рекомбінантного телячого хімосину описана геномів вірусів, таких як вірус поліоми, вірус віспи для K. lactis (Van den Berg, Bio/Technology, 8, 1990, птахів, аденовірус (такий як аденовірус 2), вірус с. 135). Описані також стабільні експресійні вектопапіломи великої рогатої худоби, вірус саркоми ри з великою кількістю копій, призначені для заптахів, цитомегаловірус, ретровірус, вірус гепатиту безпечення секреції зрілого рекомбінантного людВ і найбільш переважно мавпячий вірус 40 (ОВського сироваткового альбуміну промисловими 40), з гетерологічних промоторів ссавців, наприштамами Klicyveromyces (Fleer й ін., клад промотору актину або промотору імуноглобуBio/Technology, 9, 1991, стор. 968-975). ліну, з промоторів теплового шоку за умови, що (IV) Компонент, який представляє собою протакі промотори сумісні із системами клітинимотор хазяїна. Експресійні й клонувальні вектори, як правило, Ранній і пізній промотори вірусу ОВ-40 зручно містять промотор, який розпізнається організмомодержувати у вигляді рестрикційного фрагмента хазяїном і функціонально зв'язаний з нуклеїновою ОВ-40, який містить також сайт ініціації реплікації кислотою, яка кодує CD20-зв'язувальне антитіло. ОВ-40. Негайно-ранній промотор людського цитоПромотори, які придатні для застосування в промегаловірусу можна одержувати у вигляді Hindlll каріотичних клітинах-хазяїнах, являють собою Е-рестрикційного фрагмента. Система для експресії ДНК у хазяїв-ссавців за допомогою вірусу папіпромотор phoA, промоторні системи -лактамази й ломи великої рогатої худоби описана в US лактози, промоторні системи лужної фосфатази, 4419446. Модифікація цієї системи описана в US триптофану (trp) і гібридні промотори, такі як про4601978 (дані, що стосуються експресії кДНК людмотор tac. Однак можна застосовувати й інші віського -інтерферону в мишиних клітинах під контдомі бактеріальні промотори. Промотори, призначені для застосування в бактеріальних системах, ролем промотору тимідинкінази вірусу герпесу містять також послідовність Шайна-Дальгарно простого див. також в Reyes й ін., Nature, 297, 45 89350 46 1982, стор. 598-601). В іншому варіанті як промо(АТСС 27325). Ці приклади наведені з метою ілюстор можна застосовувати довгий кінцевий повтор трації, але не спрямовані на обмеження обсягу вірусу саркоми Рауса. винаходу. (V) Компонент, який представляє собою енхаПовнорозмірне антитіло, фрагменти антитіла й нсер злитих білків, які включають антитіло, можна проТранскрипцію ДНК, який кодує CD20дукувати у бактеріях, насамперед, коли глікозилузв'язувальне антитіло, запропоноване у винаході, вання й ефекторна функція Fc не є обов'язковими, у вищих еукаріотичних організмах часто підвищунаприклад, коли терапевтичне антитіло кон'югують ють шляхом вбудовування у вектор енхансерної із цитотоксичним агентом (наприклад токсином), і послідовності. Відомі багато енхансерних послідоімунокон'югат сам має здатність руйнувати пухвностей генів ссавців (генів глобіну, еластази, линних клітин. Повнорозмірні антитіла мають більш тривалий час напівжиття в кровотоці. Вироальбуміну, -фетопротеїну й інсуліну). Однак, як бництво антитіл в Е. coli є більш швидким і більш правило, застосовують енхансер вірусу еукаріотиефективним за вартістю. Методи експресії фрагчної клітини. Прикладами є енхансер ОВ-40, розментів антитіл і поліпептидів у бактеріях предстаташований на віддаленій стороні сайту ініціації влені, наприклад, в US 5648237 (на ім'я Carter й реплікації (пари основ 100-270), енхансер ранньоін.), US 5789199 (на ім'я Joly й ін.) і US 5840523 (на го промотору цитомегаловірусу, енхансер поліоми, ім'я Simmons й ін.), у яких описані ділянка ініціації розташований на вилученій стороні сайту ініціації трансляції (TIR) і сигнальні послідовності для опреплікації, і енхансери аденовірусів. Елементи, що тимізації експресії й секреції, вказані патенти підсилюють активацію еукаріотичних промоторів, включені в даний опис як посилання. Після ексописані також в Yaniv, Nature, 297, 1982, стор. 17пресії антитіло виділяють із клітинної маси Е. coli у 18. Енхансер можна вбудовувати шляхом сплайвигляді пасти в розчинній фракції і її можна очисингу у вектор у положенні 5' або 3' відносно посщати, наприклад на завантаженій протеїном А або лідовності, яка кодує CD20-зв'язувальне антитіло, G колонці залежно від ізотипу. Кінцеве очищення але переважно його поміщають у сайт, розташоможна здійснювати аналогічно до процесу, запрований в 5'-напрямку щодо промотору. понованого для очищення антитіл, які експресу(VI) Компонент, який представляє собою терються, наприклад в СНО-клітинах. мінатор транскрипції Крім прокаріотичних організмів як хазяїв для Експресійні вектори, що використовуються в клонування або експресії векторів, які кодують еукаріотичних клітинах-хазяїнах (клітини дріжджів, CD20-зв'язувальне антитіло, можна використовугрибів, комах, рослин, тварин, людей або клітини вати еукаріотичні мікроорганізми, такі як нитчасті інших багатоклітинних організмів, які містять ядгриби або дріжджі. Найбільш часто застосовуваро), повинні містити також послідовності, необхідні ним нижчим еукаріотичним мікроорганізмомдля термінали транскрипції й стабілізації мРНК. хазяїном є Saccharomyces cerevisiae або звичайні Такі послідовності звичайно одержують із 5'- і іноді пекарські дріжджі. Однак широко відомо велика з 3'-нетрансльованих ділянок еукаріотичних або кількість інших родів, видів і штамів, які можна завірусних ДНК або кДНК. Ці ділянки містять нуклеостосовувати як хазяїни, запропоновані у винаході, тидні сегменти, транскрибовані у вигляді поліадетакі як Schizosaccharomyces pombe; нілованих фрагментів у нетрансльованій ділянки Kluyveromyces, наприклад K. lactis, K. fragilis мРНК, яка кодує CD20-зв'язувальне антитіло. Од(АТСС 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. ним із придатних компонентів, які забезпечують wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. термінацію транскрипції, є ділянка поліаденілуdrosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans й K. вання бичачого гормону росту (див. WO 94/11026 і marxianus; yarrowia (ЕР 402226); Pichia pastoris (ЕР наведений в цьому документі опис експресійного 183070); Candida; Trichderma reesia (EP 244234); вектора). Neurospora crassa; Schwanniomyces, наприклад (VII) Відбір і трансформація клітин-хазяїв Schwanniomyces occidentalis; і нитчасті гриби, такі, Клітини-хазяї, які можна використовувати для наприклад, як Neurospora, Penicillinum, клонування або експресії ДНК у векторах, являють Tolypocladium й Aspergillus, такі як А. nidulans й A. собою описані вище прокаріотичні клітини, клітини niger. дріжджів або клітини вищих еукаріотичних органіКлітини-хазяї, які можна використовувати для змів. Прокаріотичні організми, які можна застосоекспресії глікозилованого CD20-зв'язувального вувати для цієї мети, включають еубактерії, такі як антитіла, одержують із багатоклітинних організмів. грамнегативні або грампозитивні організми, наприПрикладами клітин безхребетних є клітини рослин клад представників Enterobacteriaceae, таких як ікомах. Були виявлені численні бакуловірусні Esherichia, наприклад Е. coli, Enterobacter, Erwinia, штами й варіанти й відповідні придатні для них як Klebsiella, Proteus, Salmonella, наприклад хазяї клітини комах, таких як Spodoptera frugiperda Salmonella typhimurium, Serratia, наприклад (гусениця), Aedes aegipti (комар), Aedes albopictus Serratia marcescans, і Shigella, а також Bacilli, таких (комар), Drosophila melanogaster (плодова муха) і як В. subtilis й В. lichenformis (наприклад штам В. Bombyx mori (шовковик). Широко відомі різноманіlichenformis 41P, описаний в DD 266710, опублікотні штами вірусів, які можна використовувати для ваної 12 квітня 1989p.), Pseudomonas, таких як P. трансфекції, наприклад варіант Autographa aeruginosa, і Streptomyces. Одним із переважних californica NPV і штам Bombyx mori Bm-5 NPV, і хазяїв для клонування з використанням Е.coli є такі віруси можна застосовувати відповідно до штам Е.coli W3110 (АТСС 31446), хоча можна завинаходу як віруси, насамперед для трансфекції стосовувати також й інші штами, такі як штами клітин Spodoptera frugiperda. Е.coli В, Е.coli Х1776 (АТСС 31573) і Е.coli W3110 47 89350 48 Як хазяї можна також використовувати культуабо еквівалентним джерелом енергії. Фахівцеві в ри клітин рослин, таких як бавовник, кукурудза, даній галузі повинно бути очевидно, що можна картопля, соя, петунія, томат і тютюн. включати також будь-які інші необхідні добавки у Однак найбільший інтерес представляють клівідповідних концентраціях. Умови культивування, тини хребетних й зараз розмноження клітин хретакі як температура, значення рН і т.п., являють бетних у культурі (культура тканини) стало стансобою умови, які використовувалися раніше для дартною процедурою. Прикладами придатних як клітин-хазяїв, відібраних для експресії, і вони похазяїв ліній клітин ссавців є лінія клітин нирки маввинні бути очевидні фахівцеві в даній галузі. пи CV1, трансформована за допомогою ОВ-40 (IX) Очищення антитіла (COS-7, ATCC CRL 1651); лінія клітин нирки ембріПри використанні методів рекомбінації антитіона людини (293 або клітини лінії 293, субклоноло може продукуватися всередину клітини, у перивані з метою вирощування в суспензійній культурі, плазматичному просторі або безпосередньо видіGraham й ін., J. Gen. Virol, 36, 1977, с. 59); клітини лятися в середовище. Якщо антитіло продукується нирки дитинчати хом'ячка (ВНК, АТСС CCL 10); всередині клітини, то на першій стадії видаляють, клітини яєчника китайського хом'ячка/-DHFR (СНО, наприклад за допомогою центрифугування або Urlaub й ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, с. ультрафільтрації, дебрис, що складається з окре4216); клітини Сертолі миші (ТМ4, Mather, Biol. мих частинок, або із клітин-хазяїв, або з лізованих Reprod., 23, 1980, стор. 243-251); клітини нирки фрагментів. В Carter й ін., Bio/Technology, 10, 1992, мавпи (CV1, АТСС CCL 70); клітини нирки афристор. 163-167 описаний метод виділення антитіл, канської зеленої мавпи (VERO-76, АТСС CRLякі секретуються у периплазматичний простір Е. 1587); клітини карциноми шийки матки людини coli. У цілому, метод полягає в наступному: клітин(HELA, АТСС CCL 2); клітини нирки собаки (MDCK, ну масу у вигляді пасти піддають розморожуванню АТСС CCL 34); клітини печінки бичачого щура приблизно протягом 30хв у присутності ацетату (BRL 3А, АТСС CRL 1442); клітини легкої людини натрію (рН 3,5), ЕДТК і фенілметилсульфонілфто(W138, АТСС CCL 75); клітини печінки людини риду (ФМСФ). Клітинний дебрис можна видаляти (Hep G2, НВ 8065); клітини пухлини молочної зацентрифугуванням. Якщо антитіло секретується в лози миші (ММТ 060562, АТСС CCL51); клітини середовище, супернатанти таких експресійних TRI (Mather й ін., Ann als Ν. Υ. Acad. Sci., 383, систем, як правило, спочатку концентрують за до1982, стор. 44-68); клітини MRC 5; клітини FS4 і помогою наявного в продажі фільтра для концентлінія клітин гепатоми людини (Hep G2). рування білків, наприклад пристрою для ультраКлітини-хазяї трансформують за допомогою фільтрації типу Amicon або Millipore Pellicon. На описаних вище експресійних або клонувальних будь-якій з попередніх стадій для інгібування провекторів з метою виробництва CD20теолізу можна додавати інгібітор протеази, такий зв'язувального антитіла й культивують у придатяк ФМСФ, а для попередження збільшення небаних живильних середовищах, які відповідним чижаних домішок можна додавати антибіотики. ном модифіковані для індукції промоторів, відбору Композицію антитіла, отриману із клітин, можтрансформантів або ампліфікації генів, які кодують на очищати, наприклад хроматографією на гідрокнеобхідні послідовності. силапатиті, гель-електрофорезом, діалізом й (VIII) Культивування клітин-хазяїв афінною хроматографією, при цьому переважним Клітини-хазяї, які використовують для одерметодом очищення є афінна хроматографія. Можжання CD20-зв'язувального антитіла, запропоноливість застосування протеїну А як афінного лігаваного в даному винаході, можна культивувати в нду залежить від виду й ізотипу будь-якого Fcрізних середовищах. Для культивування клітиндомену імуноглобуліну, який присутній в антитілі. хазяїв можна використовувати наявні в продажі Протеїн А можна використовувати для очищення середовища, такі як середовище Хама F10 (фірма антитіл, основою яких є людські важкі 1-, 2- або Sigma), мінімальне підтримуюче середовище 4-ланцюга (Lindmark й ін., J. Immunol. Meth., 62, (MEM, фірма Sigma), RPMI-1640 (фірма Sigma) і 1983, стор. 1-13). Протеїн G рекомендується для модифіковане за способом Дульбеко середовище застосування для всіх мишиних ізотипів і для людІгла (DMEM, фірма Sigma). Крім того, як середоської 3-ланцюга (Guss й ін., ЕМВО J., 5, 1986, вища для культивування клітин-хазяїв можна вистор. 1567-1575). Як матриця, з якою зв'язується користовувати будь-які із середовищ, які описані в афінний ліганд, найбільш часто застосовують агаHam й ін., Meth. Enz., 58, 1979, с. 44; Barnes й ін., розу, однак можна використовувати й інші матриці. Anal. Biochem., 102, 1980, с. 255; в US Стійкі до механічних впливів матриці, такі як скло 4767704,4657866, 4927762, 4560655 або 5122468; або полі(стиролдивініл)бензол з певним розміром в WO 90/03430, WO 87/00195; або в US Re. 30985. пор, дозволяють досягати більш високих швидкосБудь-яке із цих середовищ при необхідності можна тей потоку й більш короткого часу процесу в порідоповнювати гормонами й/або іншими факторами внянні з характеристиками, які досягають при виросту (такими як інсулін, трансферин або епідеркористанні агарози. Якщо антитіло містить СH3мальний фактор росту), солями (такими як хлорид домен, то для очищення можна використовувати і фосфат натрію, кальцію, магнію), буферами (тасмолу типу Bakerbond АВХ (J.T. Baker, Філіпскими як HEPES), нуклеотидами (такими як аденобург, шт. Нью-Джерсі). Залежно від антитіла, яке зин і тимідин), антибіотиками (такими як лікарський підлягає виділенню, можна застосовувати також засіб гентаміцин (GENTAMYCIN )), мікроелеменінші методи очищення білка, такі як фракціонувантами (тобто неорганічними сполуками, які звичайня на іонообмінній колонці, осадження етанолом, но присутні в кінцевих концентраціях, що знахоРХВР із оберненою фазою, хроматографія на сидяться у мікромолярному діапазоні) і глюкозою лікагелі, хроматографія на гепарин 49 89350 50 одолостатин 10, долостатин 11, долостатин 12, SEPHAROSE , хроматографії на аніоно- або катідолостатин 13, долостатин 14, долостатин 15, доонообмінній смолі (наприклад на колонці з поліаслостатин 16, долостатин 17 і долостатин 18; цепартамовою кислотою), хроматофокусування, фалостатини, такі як цефалостатин 1, цефалостаДСН-ПААГ й осадження сульфатом амонію. тин 2, цефалостатин 3, цефалостатин 4, Після будь-якої з попередніх стадій очищення цефалостатин 5, цефалостатин 6, цефалостатин суміш, яка містить антитіло, яке представляє інте7, 25'-епіцефалостатин 7, 20-епіцефалостатин 7, рес, і домішки, можна піддавати хроматографії, цефалостатин 8, цефалостатин 9, цефалостатин заснованій на гідрофобній взаємодії, при низькому 10, цефалостатин 11, цефалостатин 12, цефалосзначенні рН із використанням буфера для елюції, татин 13, цефалостатин 14, цефалостатин 15, цеякий має значення рН приблизно від 2,5 до 4,5, фалостатин 16, цефалостатин 17, цефалостатин хроматографію переважно здійснюють при низьких 18 і цефалостатин 19. концентраціях солей (наприклад з використанням Майтансиноїди являють собою інгібітори мітоприблизно 0-0,25М солей). зу, які проявляють дію за допомогою інгібування Кон'югати антитіл полімеризації тубуліну. Майтансин вперше був Антитіло можна коньюгувати із цитотоксичним виділений зі східно-африканського чагарнику агентом, таким як токсин або радіоактивний ізотоп. Maytenus serrata (US 3896111). Далі було встановУ конкретних варіантах здійснення винаходу токлено, що певні мікроорганізми також продукують син переважно являє собою каліхеамінцин, майтамайтансиноїди, такі як майтансинол і складні С-3нсиноїд, доластатин, ауристатин Ε й їх аналоги ефіри майтансинолу (US 4151042). Синтетичний або похідні. майтансинол і його похідні й аналоги описані, наПереважні лікарські засоби/токсини являють приклад в US 4137230; 4248870; 4256746; собою агенти, які руйнують ДНК, інгібітори поліме4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; ризації або деполимеризації мікротрубок й анти4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; метаболіти. Переважні класи цитотоксичних аген4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; тів, включають, наприклад, інгібітори ферментів, 4450254; 4362663; і 4371533, зміст яких включений такі як інгібітори дигідрофолат-редуктази, і інгібів даний опис як посилання. тори тимідилат-синтази, ДНК-інтеркалятори, агенМайтансин і майтансиноїди кон'югували з анти, які розщеплюють ДНК, інгібітори топоізомератитілами, які специфічно зв'язуються з антигенами зи, лікарські засоби із сімейства антрацикліну, пухлинних клітин. Імунокон'югати, які містять майлікарські засоби на основі алкалоїдів вінку, мітомітансиноїди, і їх терапевтичне застосування описацини, блеміцини, цитотоксичні нуклеозиди, лікарні, наприклад в US 5208020, 5416064 й ЕР ські засоби із сімейства птеридину, діїнени, подо0425235В1, зміст яких спеціально включений в філотоксини й індуктори диференціювання. даний опис як посилання. В Liu й ін., Proc. Natl. Найбільш важливими представниками цих класів Acad. Sci. USA 93, 1996, стор. 8618-8623 описані є, наприклад метотрексат, метоптерин, дихлормеімунокон'югати, які містять майтансиноїд, позначетотрексат, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, цитоний DM1, зв'язаний з моноклональним антитілом зину арабінозид, мелфалан, леурозин, леуросидеС242 до людського колоректального раку. Встаноїн, актиноміцин, даунорубіцин, доксорубіцин, Nвлено, що кон'югат має високу цитотоксичність (5,5-диацетоксипентил)доксорубіцин, морфоліно відносно клітин раку ободової кишки в культурі й доксорубіцин, 1-(2-хлоретил)-1,28 протипухлинною активністю in vivo при аналізі росдиметансульфонілгидразид, N -ацетилспермідин, ту пухлини. Chari й ін., Cancer Research 52, 1992, аміноптерину метоптерин, еспераміцин, мітоміцин стор. 127-131 описали імунокон'югати, у яких майС, мітоміцин А, актиноміцин, блеоміцин, кармінотансиноїд кон'югований через дисульфідний місток міцин, аміноптерин, талісоміцин, подофілотоксин і з мишиним антитілом А7, що зв'язується з антигепохідні подофілотоксину, такі як етопозид або етоном, який знаходиться на клітинах людської лінії позиду фосфат, вінбластин, вінкристин, віндезин, раку ободової кишки, або з іншим мишиним монотаксол, таксотер, ретиноєва кислота, масляна ки8 клональним антитілом ТА.1, яке зв'язується з онслота, N -ацетилспермідин, камптотецин, каліхеакогеном HER-2/neu. міцин, бріостатини, цефалостатити, ансамітоцин, В даній галузі відомо багато лінкерних груп, актозин, майтансиноїди, такі як DM-1, майтансин, призначених для створення кон'югатів антитіломайтансинол, N-десметил-4,5майтансиноїд, у тому числі, наприклад описані в десепоксимайтансинол, С-19-дехлормайтансинол, US 5208020 або ЕР 0425235В1 й в Chari й ін., С-20-гідроксимайтансинол, С-20Cancer Research 52, 1992, стор. 127-131. Лінкерні деметоксимайтансинол, С-9-SН-майтансинол, Сгрупи являють собою дисульфідні групи, тіоефірні 14-алкосиметилмайтансинол, С-14-гідрокси- або групи, нестійкі в кислому середовищі групи, фотоацетилоксигідрокси- або ацетилоксиметилмайтанлабільні групи, чутливі до дії пептидаз групи або синол, С-15-гідрокси/ацетилоксимайтансинол, Сскладноефірні лабільні групи, які описані в пере15-метоксимайтансинол, C-18-Nрахованих вище патентах, переважними є дисудеметилмайтансинол й 4,5-дезоксимайтансинол, льфідні й тіоефірні групи. ауристатини, такі як ауристатин Е, М, РНЕ й РЕ; Кон'югати антитіла й майтансиноїду можна долостатини, такі як долостатин А, долостатин В, створювати за допомогою різноманітних біфункцідолостатин С, долостатин D, долостатин Ε (20-епіональних речовин, які зв'язують білки, таких як Nі 11-епі), долостатин G, долостатин Н, долостатин сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонат (SPDP), І, долостатин 1, долостатин 2, долостатин 3, долосукцинімідил-4-(N-малеїмідометил)циклогексан-1статин 4, долостатин 5, долостатин 6, долостатин карбоксилат, імінотіолан (IT), біфункціональні по7, долостатин 8, долостатин 9, долостатин 10, де 51 89350 52 хідні складних імідоефірів (такі як диметиладипіміЯМР-томографія), таку як знову йод-123, йод-131, дат·НСI), активні складні ефіри (такі як дисукцинііндій-111, фтор-19, вуглець-13, азот-15, кисень-17, мідилсуберат), альдегіди (такі як глутаровий альгадоліній, марганець або залізо. дегід, бісазидопохідні (такі як біс(параРадіоактивні або інші мітки можна включати в азидобензоїл)гександіамін), похідні бісдіазонію кон'югат з використанням відомих методів. Напри(такі як біс(пара-діазонійбензоїл)етилендіамін), клад пептид можна одержувати шляхом біосинтедіізоціанати (такі як толуол-2,6-діізоціант), і активні зу або синтезувати за допомогою хімічного амінобіссполуки фтору (такі як 1,5-дифтор-2,4кислотного синтезу з використанням прийнятних динітробензол). Особливо переважними зв'язуваамінокислотних попередників, які, наприклад, місльними речовинами, які беруть участь в утворенні тять фтор-19 у положенні водню. Такі мітки як 99m 123 186 188 111 дисульфідного містка, є N-сукцинімідил-3-(2Тс або І , Re , Re й In можна приєднувапіридилдитіо)пропіонат (SPDP) (Carlsson й ін., ти до пептиду через залишок цистеїну. Ітрій-90 Biochem. J. 173, 1978, сс.723-737) і N-сукцинімідилможна приєднувати через залишок лізину. Для 4-(2-піридилтіо)пентаноат (SPP). включення йоду-123 можна застосовувати Лінкер можна приєднувати до молекули майIODOGEN-метод (Fraker й ін., Biochem. Biophys. тансиноїду в різних положеннях залежно від типу Res. Commun. 80, 1978, стор. 49-57). У керівництві зв'язку. Наприклад, складноефірний зв'язок можна «Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy» утворювати взаємодією з гідроксильною групою з (Chatal, вид-во CRC Press, 1989) докладно описані використанням загальноприйнятих методів сполуінші методи. чення. Реакція може мати місце в положенні С-3, Кон'югати, які містять антитіло й цитотоксичщо несе гідроксильну групу, у положенні С-14, моний агент, можна створювати за допомогою багадифікованому гідроксиметилом, положенні С-15, тьох біфункціональних речовин, які зв'язують білмодифікованому гідроксильною групою, і полоки, таких як N-сукцинімідил-3-(2женні С-20, що несе гідроксильну групу. У перевапіридилдитіо)пропіонат (SPDP), сукцинімідил-4-(Nжному варіанті здійснення винаходу зв'язок утвомалеїмідометил)циклогексан-1-карбоксилат, імінорять у положенні С-3 майтансинолу або аналога тіолан (IT), біфункціональні похідні складних імідомайтансинолу. ефірів (такі як диметиладипімидат·НСI), активні Каліхеаміцин складні ефіри (такі як дисукцинімідилсуберат), Інший імунокон'югат, що представляє інтерес, альдегіди (такі як глутаровий альдегід, бісазидомістить CD20-зв'язувальне антитіло, кон'юговане з похідні (такі як біс(параоднією або декількома молекулами каліхеаміцину. азидобензоїл)гександіамін), похідні бісдіазонію Представники сімейства каліхеаміцинових антибі(такі як біс(пара-діазонійбензоїл)етилендіамін), отиків у субпікомолярних концентраціях мають діізоціанати (такі як толуол-2,6-діізоціант), і активні здатність викликати розриви дволанцюгових ДЕК. біссполуки фтору (такі як 1,5-дифтор-2,4Одержання кон'югатів каліхеаміцину описане в US динітробензол). Наприклад імунотоксин рицин 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, можна одержувати відповідно до методу, описа5770710, 5773001, 5877296 (усі на ім'я фірми ному в Vitetta й ін., Science 238, 1987, с. 1098). American Cyanamid Company). Структурні аналоги Мічена за допомогою С-14 1-ізотіоціанатобензилкаліхеаміцину, які можна застосовувати, включа3-метилдіетилентриамінопентаоцтова кислота 1 1 1 (MX-DTPA) являє приклад хелатувального агента, ють (але не обмежуючись ними) 1 , 2 , 3 , N1 1 який можна застосовувати для кон'югації радіоакацетил- 1 , PSAG й 1 (Hinman й ін., Cancer тивного нуклеотиду з антитілом (див. WO Research 53, 1993, стор. 3336-3342; Lode й ін., 94/11026). Лінкер може являти собою «лінкер, який Cancer Research 58, 1998, стор. 2925-2928 і перерозщеплюється», що полегшує вивільнення цитораховані вище патенти США на ім'я фірми токсичного лікарського засобу в клітині. Наприклад American Cyanamid). Іншим протипухлинним лікарможна застосовувати нестійкий у кислому середоським засобом, який можна включати в кон'югати, вищі лінкер, лінкер, чутливий до дії пептидаз, фоє QFA, що представляє собою антифолат. Як калітолабільний лінкер, диметильний лінкер або лінхеаміцин, так й QFA мають внутрішньоклітинні кер, який містить дисульфідний зв'язок (Chari й ін., місця дії й погано проникають через плазматичну Cancer Research, 52, 1992, стор. 127-131; US мембрану. Таким чином, проникнення в клітину 5208020). цих агентів у результаті опосередковуваної антитіТерапевтичне застосування лом інтерналізації значно підвищує їх цитотоксичCD20-зв'язувальні антитіла, запропоновані у ну дію. винаході, можна застосовувати для лікування баРадіоактивні ізотопи гатьох злоякісних і доброякісних захворювань, Для вибірного руйнування пухлини антитіло включаючи аутоімунні захворювання й споріднені може містити атом з високим рівнем радіоактивностани, і CD20-позитивні види раку, включаючи Всті. Для створення радіокон'югованих антитіл до клітинні лімфоми й лейкози. У стовбурових клітин CD20 можна застосовувати багато радіоактивних 211 131 125 90 (попередники В-клітин) у кістковому мозку відсутізотопів. їх приклади включають At , I , I , Y , 186 188 153 212 32 212 ній антиген CD20, що уможливлює регенерацію Re , Re , Sm , Ві , Ρ , Pb і радіоактивні здорових В-клітин після лікування і їх повернення ізотопи Lu. Коли кон'югат застосовують для діагдо нормальних рівнів протягом декількох місяців. ностики, він може містити радіоактивний атом, Аутоімунні захворювання або аутоімунні споякий застосовується для сцинтиграфічних дослі99m 123 ріднені стани являють собою артрит (ревматоїдджень, наприклад, Тс або І , або спінову мітку ний артрит, ювенільний ревматоїдний артрит, для візуалізації з використанням ядерного магнітостеоартрит, псоріатичний артрит), псоріаз, дерного резонансу (ЯМР) (який називають також 53 89350 54 матит, включаючи атопічний дерматит; хронічну синдром Гійєна-Барре-Штроля, васкуліт великих аутоімунну кропивницю, поліміозит/дерматоміозит, судин (включаючи ревматичну поліміалгію й гігантоксичний епідермальний некроліз, системну токлітинний артеріїт (хвороба Такаясу)), васкуліт склеродерму й склероз, реакції, зв'язані із запальсередніх судин, хвороба Кавасакі й нодозний поліним захворюванням кишечнику (ЗЗК) (хвороба артеріїт), анкілозуючий спондиліт, хворобу БергеКрона, неспецифічний виразковий коліт), респірара (IgA-нефропатія), швидко прогресуючий глометорний дистрес-синдром, респіраторний дистресрулонефрит, первинний біліарний цироз, спру, що синдром дорослих (РДСВ), менінгіт, алергійний стосується черевної порожнини (глютенова ентериніт, енцефаліт, увеїт, коліт, гломерулонефрит, ропатія), кріоглобулінемію, амінотрофичний бічний алергічні стани, екзему, астму, стани, які включасклероз, захворювання коронарних артерій. ють Т-клітинну інфільтрацію, і хронічні запальні CD20-позитивні види раку являють собою виреакції, атеросклероз, аутоімунний міокардит, деди раку, при яких відбувається аномальна проліфіцит адгезії лейкоцитів, системний червоний вовферація клітин, які експресують CD20 на клітинній чок (ВКВ), вовчок (включаючи нефротичний вовповерхні. CD20-позитивні В-клітинні неоплазми чок, вовчок не зв'язаний із нирками, дискоїдний включають CD20-позитивне захворювання Ходжкічервоний вовчок, алопецію), ювенільний діабет, на, у тому числі переважно лімфоцитарну хвороба розсіяний склероз, алергійний енцефаломієліт, Ходжкіна (ПЛБХ), не-ходжкінську лімфому (НХЛ), імунні відповіді, зв'язані з гострою й сповільненою лімфоми клітин центрального фолікула (FCC); гіперчутливістю, зумовленою цитокінами й Тгострий лімфоцитарний лейкоз (ОЛЛ); хронічний лімфоцитами, туберкульоз, саркоїдоз, грануломалімфоцитарний лейкоз (ХЛЛ), ретикулоендотеліоз. тоз, включаючи грануломатоз Вегенера, агранулоНе-ходжкінська лімфома включає низькодиференцитоз, васкуліт (включаючи ANCA), апластичну ційовану/нодулярну не-ходжкінську лімфому анемію, позитивну анемію Кумбса, анемію (НХЛ), дрібноклітинну лімфоцитарну лімфому Diamond Blackfan, імунну гемолітичну анемію, (МЛЛ), середньодиференціййовану/нодулярну включаючи аутоімунну гемолітичну анемію (ΑΙΓΑ), НХЛ, середньодиференційовану дифузійну НХЛ, перніціозну анемію, есенціальну апластичну аневисокодиференційовану імунобластну НХЛ, висомію (PRCA), дефіцит фактора VIII, гемофілію А, кодиференційовану лімфобластну НХЛ, високоаутоімунну нейтропенію, панцитопенію, лейкопедиференційовану дрібноклітинну з нерозсіченими нію, хвороби, зв'язані з діапедезом лейкоцитів, ядрами НХЛ, недиференційовану НХЛ, плазмацизапальні захворювання ЦНС, сидром, зв'язаний із тоїдну лімфоцитарну лімфому, лімфому клітин множинним пошкодженням органів, важку псевдомантії, зв'язану зі СHIДом лімфому й макроглобупаралітичну міастенію, хвороби, опосередковані лінемію Вальденстрема. Мається на увазі також комплексом антиген-антитіло, хворобу, зв'язану з лікування на стадії рецидивів. ПЛБХ являє собою антитілами до клубочкової базальної мембрани, один з типів хвороби Ходжкіна, яка часто характесиндром, зв'язаний з антитілами до фосфоліпідів, ризується тенденцією до рецидивів, незважаючи алергічний неврит, хвороба Бехчета, синдром Касна радіо- або хіміотерапію, і характеризується натлемана, синдром Гудпастчера, міастенічний синявністю CD20-позитивних злоякісних клітин. ХЛЛ дром Ламберта-Ітона, синдром Рейно, синдром являє собою один із чотирьох основних типів лейШегрена, синдром Стівенса-Джонсона, реакцію козу. ХЛЛ, що представляє собою рак зрілих Ввідторгнення трансплантата паренхіматозних орклітин, які називаються лімфоцитами, характериганів (включаючи попередню обробку для одерзується прогресивним нагромадженням клітин у жання панелі високих титрів реактивних антитіл, крові, кістковому мозку й лімфатичних тканинах. відкладення IgA у тканинах і т.д.), реакцію «трансУ конкретних варіантах здійснення винаходу плантат проти хазяїна» (РТПХ), бульозний пімфигуманізовані CD20-зв'язувальні антитіла і їх функгоїд, пухирчатку (включаючи всі види вульгарної ціональні фрагменти застосовують для лікування пухирчатки, листоподібної пухирчатки), аутоімунні не-ходжкінської лімфоми (НХЛ), переважно лімполіендокринопатії, хворобу Рейтера, синдром фоцитарної хвороби Ходжкіна (ПЛБХ), дрібноклізадерев'янілої людини, гігантоклітинний артеріїт, тинної лімфоцитарної лімфоми (МЛЛ), хронічного зв'язаний з імунним комплексом нефрит, IgAлімфоцитарного лейкозу, ревматоїдного артриту і нефропатію, IgM-поліневропатії або опосередкоювенільного ревматоїдного артриту, системного вану IgM невропатію, ідіопатичну тромпоцитопенічервоного вовчаку (ВКВ), включаючи нефротичний чну пурпуру (ІТП), тромботичну тромбогемолітичну вовчок, хворобу Вегенера, запальне захворювання пурпуру (ТТП), аутоімунну тромбоцитопенію, аутокишечнику, ідіопатичну тромпоцитопенічну пурпуімунне захворювання яєчок й яєчників, включаючи ру (ІТП), тромботичну тромбогемолітичну пурпуру аутоімунний орхіт й оофорит, первинний гіпоти(ТТП), аутоімунну тромбоцитопенію, розсіяний реоїдизм; аутоімунні ендокринні захворювання, склероз, псоріаз, зв'язану з IgA нефропатію, зв'явключаючи аутоімунний тиреодит, хронічний тирезану з IgM полінефропатію, важку псевдопаралітиоїдит (тиреоїдит Хашимото), підгострий тиреоїдит, чну міастенію, васкуліт, цукровий діабет, синдром ідіопатичний гіпотиреоїдизм, хворобу Адісона, Рейно, синдром Шегрена й гломерулонефрит. хворобу Грейвса, аутоімунні поліграндулярні синГуманізовані CD20-зв'язувальні антитіла або їх дроми (або поліграндулярні ендокринопатичні сифункціональні фрагменти можна застосовувати як ндроми), діабет типу І, який називається також єдиний компонент лікування, наприклад для лікуінсулинзалежний цукровий діабет (ІЗД), і синдром вання низькодиференційованої або нодулярної Шихана; аутоімунний гепатит, лімфоїдний інтерсCD20-позитивної В-клітинної НХЛ, що знаходиться тиціальний пневмоніт (ВІЛ), бронхолітичні облітев стані рецидиву або не піддається лікуванню, або рації (не зв'язані із трансплантацією) проти NSIP, їх можна вводити пацієнтам у сполученні з іншими 55 89350 56 лікарськими засобами в схемі лікарського лікувантіла застосовують для запобігання й контролю ня з використанням декількох препаратів. ураження суглоба, сповільнення структурного поБезболісна лімфома являє собою невиліковне шкодження, зниження болю, зв'язаного із запалензахворювання, яке повільно розвивається, при ням при РА, і, як правило, для зниження ознак і якому пацієнти живуть у середньому 6-10 років, що симптомів при РА помірної тяжкості або серйознохарактеризується наявністю численних періодів го РА. Пацієнта, який страждає від РА, можна лікуремісії й рецидивів. В одному з варіантів здійсненвати за допомогою гуманізованого антитіла до ня винаходу гуманізовані CD20-зв'язувальні антиCD20 до, після або разом з лікуванням РА іншими тіла або їх функціональні фрагменти застосовують лікарськими засобами (див. нижче розділ «Спільна для лікування безболісної НХЛ. терапія»). В одному з варіантів здійснення винахоПараметри, застосовувані для оцінки ефектиду пацієнтів, попереднє лікування яких з викорисвності або успіху лікування неоплазми, добре вітанням антиревматичних лікарських засобів, які домі лікарям, які практикують в галузі лікування змінюють захворювання, виявилося невдалим, відповідного захворювання. Як правило, практиі/або в яких спостерігалася неадекватна реакція на куючий лікар може бачити зниження ознак і симплікування тільки метотрексатом, лікують гуманізотомів конкретного захворювання. Параметри мованим CD20-зв'язувальним антитілом, запропоножуть являти собою середню тривалість часу до ваним у винаході. В одному з варіантів такого лікурозвитку захворювання, тривалість стадії ремісії, вання пацієнти при схемі лікування, що включає стабілізацію захворювання. 17-денний період, одержують тільки гуманізоване У наведені нижче посиланнях описані лімфоми CD20-зв'язувальне антитіло (1г внутрішньовенної й ХЛЛ, їх діагностика, лікування й стандартні ме(iv) інфузії в дні 1 й 15); CD20-зв'язувальне антитідичні процедури для оцінки ефективності лікуванло плюс циклофосфамід (750мг iv-інфузії в дні 3 й ня (див. Canellos GP, Lister ТА, Sklar JL: The 17); або CD20-зв'язувальне антитіло плюс метотLymphomas, вид-во W.B.Saunders Company, рексат. Philadelphia, 1998; van Besien K. і Cabanillas F: Один з методів оцінки ефективності лікування Clinical Manifestations, Staging and Treatment of РА заснований на критеріях Американського колеNon-Hodgkin's Lymphoma, глава 70, стор. 1293джу ревматології (ACR), згідно із яким серед іншо1338, в: Hematology, Basic Principles and Practice, го оцінюють відсоток ослаблення хворобливості під ред. Hoffman й ін., вид-во Churchill Livingstone, при доторкуванні або тиску й припухлість суглобів. Philadelphia, 3-е вид., 2000; і Rai K. і Pate DrChronic Поліпшенню стану пацієнта, який страждає від РА, Lymphocytic Leukemia, глава 72, cc. 1350-1362, в: може відповідати, наприклад, бал ACR 20 (20%-не Hematology, Basic Principles and Practice, під ред. поліпшення), у порівнянні з варіантом без обробки Hoffman й ін., вид-во Churchill Livingstone, антитілом (наприклад у порівнянні з вихідним рівPhiladelphia, 3-е вид., 2000). нем до початку лікування) або в порівнянні з оброПараметри, які застосовують для оцінки ефекбкою плацебо. Інші методи оцінки ефективності тивності або успіху лікування аутоімунного або лікування антитілом включають оцінку за допомоспорідненого аутоімунному захворювання, добре гою рентгенівського випромінювання, наприклад відомі лікарям, які практикують в галузі лікування оцінку з використанням рентгенівського випромівідповідного захворювання. Як правило, практинювання за допомогою Sharp-балів, які застосовукуючий лікар може бачити зниження ознак і симпють для оцінки структурного пошкодження, такого томів конкретного захворювання. Нижче наведені як ерозія кісткової тканини й звуження щілини сугвідповідні приклади. лоба. Пацієнтів можна оцінювати також відносно В одному з варіантів здійснення винаходу анзапобігання втрати працездатності або поліпшентитіла, запропоновані у винаході, можна застосоня працездатності на основі HAQ-балів опитуванвувати для лікування ревматоїдного артриту (PA). ня з оцінки стану здоров'я (Health Assessment PA характеризується наявністю запалення декільQuestionnaire [HAQ]), AIMS-балів, SF-36 під час кох суглобів, втратою хрящової тканини й ерозією або після лікування. Критерії ACR 20 можуть кісткової тканини, що приводить до руйнування включати 20%-не зниження бала, який характерисуглоба й зрештою до обмеження функції суглоба. зує болючість при доторкуванні або тиску (біль) Крім того, оскільки РА являє собою системне засуглоба, і бала, який характеризує припухлість хворювання, воно може впливати на інші тканини, суглоба, плюс 20%-не поліпшення принаймні такі як легені, очі й кістковий мозок. Менше 50% трьох з п'яти наступних додаткових параметрів: пацієнтів, які страждають від РА протягом більше 1. оцінка самим пацієнтом болю за допомогою 10 років, можуть продовжувати працювати або візуальної аналогової шкали (ВАШ), зберігають нормальні повсякденні функції. 2. загальна оцінка самим пацієнтом активності Антитіла можна застосовувати як первинну захворювання (ВАШ), терапію для лікування пацієнтів на ранній стадії 3. загальна оцінка лікарем активності захвоРА (тобто пацієнтів, яких ще не піддавали лікуванрювання (ВАШ), ню метотрексатом (МТТ)) і як мототерапію або в 4. оцінка самим пацієнтом працездатності на сполученні, наприклад із МТТ або циклофосфаміоснові опитування з оцінки стану здоров'я й дом. В іншому варіанті антитіла можна застосову5. оцінка характерних для гострої фази реаквати як вторинну терапію для лікування пацієнтів, тантів, СРБ (С-реактивний білок) або ШОЕ (швидстійких до DMARD (ХМПРЗ) (протиревматичні лікість осідання еритроцитів). карські засоби, які модифікують хворобу) і/або ACR 50 й 70 оцінюють аналогічно. Переважно МТТ, і як монотерапію або в сполученні, наприпацієнтові вводять таку кількість CD20клад із МТТ. Гуманізовані CD20-зв'язувальні антизв'язувального антитіла, запропонованого у вина 57 89350 58 ході, яка є ефективною для досягнення принаймні вання нирок і шлунково-кишкового тракту. Крім бала ACR 20, переважно принаймні ACR 30, більш того, застосування фототерапії може підвищувати переважно принаймні ACR 50, ще більш переважвипадки виникнення раку шкіри. Крім незручності й но принаймні ACR 70, найбільш переважно придискомфорту, які зв'язані із застосуванням місценаймні ACR 75 і вище. вого лікування, при фототерапії й системному ліПсоріатичний артрит характеризується унікакуванні потрібно, щоб пацієнти періодично (циклільними й чіткими радіографічними характеристично) починали й припиняли лікування, а також ками. При псоріатичному артриті ерозію суглоба й проводили оцінку побічних дій протягом всього звуження щілини суглоба можна оцінювати також з життя. використанням Sharp-балів. Гуманізовані CD20Оцінку ефективності лікування псоріазу прозв'язувальні антитіла, запропоновані у винаході, водять, здійснюючи моніторинг змін клінічних можна застосовувати для запобігання пошкодженознак і симптомів захворювання, які включають ня суглоба, а також зниження ознак і симптомів загальну оцінку змін лікарем (PGA) і бальну оцінку захворювання. площі, ураженої псоріазом, і ступеня серйозності Ще одним об'єктом винаходу є спосіб лікуван(PASI), оцінку симптомів псоріазу (PSA), у порівня вовчаку або (ВКВ), який полягає в тому, що панянні зі станом до початку лікування. Стан пацієнцієнтові, який страждає від ВКВ, вводять терапевта можна оцінювати періодично в процесі лікувантично ефективну кількість гуманізованого CD20ня за допомогою візуальної аналогової шкали, яку зв'язувального антитіла, запропонованого у виназастосовують для визначення в конкретні моменти ході. SLEDAI-бали являють собою чисельну кількіступеня корости. сну оцінку активності захворювання. SLEDAI явПацієнти можуть давати реакцію на інфузію ляють собою зважений індекс 24 клінічних і або відчувати зв'язані з інфузією симптоми при лабораторних параметрів, для яких відомо, що першому введенні терапевтичного антитіла. Ці вони корелюють із активністю захворювання, що симптоми змінюються за ступенем серйозності й, знаходяться у діапазоні 0-103 (див. Bryan Gescuk й як правило, припиняються після припинення меJohn Davis, «Novel therapeutic agent for systemic дичного втручання. Ці симптоми включають (але lupus erythematosus» в: Current Opinion in не обмежуючись ними) лихоманку, яка нагадує Rheumatology, 14, 2002, стор. 515-521). Антитіла грип, озноб/тремтіння, нудоту, кропивницю, головдо дволанцюгової ДНК, імовірно, викликають приний біль, бронхоспазм, ангіоневротичний набряк. плив крові в нирках й інші прояви вовчаку. У пацієПри лікуванні захворювання за допомогою спосонтів, які піддаються лікуванню антитілами, можна бів, запропонованих у даному винаході, бажано оцінювати час до припливу крові в нирках, що мінімізувати реакції на інфузію. Таким чином, навважається важливим відтвореним критерієм підступним об'єктом винаходу є спосіб лікування вкавищення креатиніну в сироватці, білка в сечі або заних вище захворювань, який полягає в тому, що крові в сечі. В іншому або додатковому варіанті в вводять гуманізоване CD20-зв'язувальне антитіло, пацієнтів можна визначати рівні антитіл до ядер й де антитіло має знижену комплементзалежну циантитіл до дволанцюгової ДНК. Лікування ВКВ тотоксичність або не має її зовсім, що приводить включає застосування високих доз кортикостероїдо зменшення зв'язаних з інфузією симптомів у дів й/або циклофосфаміду (HDCC). порівнянні з обробкою Rituxan . В одному з варіаСпондилоартрити включають групу захворюнтів здійснення винаходу гуманізоване CD20вань суглобів, у тому числі анкілозуючий спондизв'язувальне антитіло являє собою 2H7.v116. літ, псоріатичний артрит і хворобу Крона. Успіх Дози лікування можна оцінювати на основі думки пацієЗалежно від показання, яке підлягає лікуваннта й за результатами загальної оцінки, проведеню, і інших факторів, які впливають на вибір дози, ної лікарем. які відомі лікареві, що практикує в даній галузі, Для лікування псоріазу застосовують різні меантитіла, запропоновані у винаході, слід вводити в дикаментозні засоби; лікування безпосередньо дозі, яка є ефективною для лікування вказаного залежить від серйозності захворювання. Пацієнти показання, мінімізуючи при цьому токсичність і з більш слабкою формою псоріазу, як правило, побічні дії. Для лікування CD20-позитивного раку для лікування захворювання використовують місабо аутоімунного захворювання терапевтично цеві обробки, наприклад, місцеве застосування ефективна доза повинна становити від приблизно 2 стероїдів, антраліну, кальципотриєну, клобетасолу 250 до приблизно 400 або 500мг/м , переважно 2 й тазаротену, у той час як пацієнти, які страждаприблизно 250-375мг/м . В одному з варіантів 2 ють від псоріазу середньої тяжкості й важкого псоздійснення винаходу доза становить 275-375мг/м . ріазу, більш часто використовують системну тераУ наступному варіанті здійснення винаходу для пію (метотрексат, ретиноїди, циклоспорин, PUVA й лікування CD20-позитивної В-клітинної неоплазії 2 UVB). Можна застосовувати також смоли. Для вкаантитіло вводять у дозі 300-375мг/м . Для лікуванзаних варіантів лікування характерний ряд недоліня пацієнтів, які страждають від В-клітинної лімків, які стосуються безпеки, тривалості лікування фоми, такої як не-ходжкінська лімфома, у конкретабо незручностей у процесі лікування. Крім того, ному варіанті здійснення винаходу, антитіла до для здійснення деяких з них потрібне дороге обCD20 і гуманізовані антитіла до CD20, запропоноладнання й спеціалізоване приміщення в медичній вані у винаході, слід вводити людині в дозі 10мг/кг 2 установі. При системному медикаментозному лікуабо 375мг/м . Для лікування НХЛ одна зі схем ліванні можуть виникати серйозні побічні впливи, у карського лікування передбачає введення однієї тому числі гіпертензія, гіперліпідемія, пригнічення дози композиції антитіла, що становить 10мг/кг, у кісткового мозку, захворювання печінки, захворюперший тиждень лікування з наступним 2 59 89350 60 тижневим інтервалом, потім введення другої дози, зв'язувальне антитіло можна вводити одночасно, яка містить таку ж кількість антитіла. Як правило, послідовно або почергово з хіміотерапевтичним пацієнтів, які страждають від НХЛ, піддають такоагентом або після прояву стійкості до іншої терапії. му лікуванню один раз протягом року, але при реСтандартна хіміотерапія при лікуванні лімфоми цидиві лімфоми таке лікування можна повторюваможе включати циклофосфамід, цитарабін, мелти. При використанні іншої схеми лікарського фалан і мітоксантрон плюс мелфалан. Програма лікування, пацієнти, які страждають від низькодиCHOP являє собою одну з найбільш загальнопференційованої НХЛ, одержують протягом 4 тижрийнятих схем хіміотерапевтичного лікування ненів версію гуманізованого 2Н7, переважно ν16, ходжкінської лімфоми. При CHOP використовують 2 (375мг/м щотижня) з наступним початком на 5 наступну схему: циклофосфамід тижні трьох додаткових курсів, які включають за(cyclophosphamide) (товарні знаки цитоксан, нестосування антитіла плюс стандартну програму осар); адриміцин (доксорубіхіміотерапії CHOP (циклофосфамід, доксорубіцин, цин/гідроксидоксорубіцин (hydroxydoxorubicin)); вінкристин і преднізолон) або CVP (циклофосфавінкристин (Oncovin); і преднізолон (prednisolone) мід, вінкристин, преднізолон) кожні 3 тижні протя(який іноді називається делтазон або оразон). У гом 3 циклів. конкретних варіантах здійснення винаходу CD20Для лікування ревматоїдного артриту в однозв'язувальне антитіло вводять пацієнтові, який має му з варіантів здійснення винаходу доза гуманізопотребу в такому лікуванні, у сполученні з одним 2 ваного антитіла становить від 125мг/м (що еквіабо декількома з наступних хіміотерапевтичних 2 валентно приблизно 200мг/дозу) до 600мг/м , яку агентів: доксорубіцин, циклофосфамід, вінкристин застосовують у вигляді двох доз, першу дозу і преднізолон. У конкретному варіанті здійснення 200мг вводять у перший день, а потім на 15 день винаходу пацієнта, що страждає від лімфоми (навводять другу дозу 200мг. У різних варіантах здійприклад не-ходжкінської лімфоми), обробляють снення винаходу кожна доза може включати 250, антитілом до CD20, запропонованим у даному 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, винаході, у сполученні з СНОР-терапією (цикло525, 550, 575, 600мг. фосфамід, доксорубіцин, вінкристин і преднізон). Для лікування захворювання CD20Відповідно до іншого варіанта здійснення винахозв'язувальні антитіла, запропоновані у винаході, ду ракового хворого можна лікувати за допомогою можна вводити пацієнтові постійно або з перервагуманізованого CD20-зв'язувального антитіла, зами, що визначає лікар, який є фахівцем в галузі пропонованого у винаході, у сполученні з CVPцього захворювання. хіміотерапією (циклофосфамід, вінкристин і предПацієнт, якому вводять лікарський засіб шлянізон). Відповідно до конкретного варіанта здійсхом внутрішньовенної інфузії або підшкірно, може нення винаходу пацієнта, який страждає від CD20відчувати побічні дії, такі як лихоманка, озноб, відпозитивної НХЛ, лікують за допомогою гуманізочуття жару, слабість і головний біль. Для полегваного 2H7.v16 у сполученні з CVP. Відповідно до шення або мінімізації таких побічних дій пацієнтові іншого конкретного варіанта лікування ХЛЛ CD20можна вводити початкову(і) дозу(и) антитіла для зв'язувальне антитіло використовують у сполученвироблення умовного рефлексу, а потім терапевні з хіміотерапією, заснованою на застосуванні тичну дозу. Доза(и) для вироблення умовного реодного або обох таких лікарських засобів, як флуфлексу повинна(и) бути нижчою за терапевтичну дарабін і цитоксан. дозу для розвитку в пацієнта толерантності до Для лікування вказаних вище аутоімунних забільш високих доз. хворювань або споріднених аутоімунних станів Шлях введення пацієнтові можна вводити CD20-зв'язувальні антиCD20-зв'язувальні антитіла вводять хворій тіла, запропоновані в даному винаході, у сполулюдині з використанням відомих шляхів введення, ченні з іншим терапевтичним агентом, таким як таких як внутрішньовенне введення, наприклад за імуносупресор, використовуючи схему лікарського допомогою болюсу або шляхом безперервної інлікування на основі декількох засобів. CD20фузії протягом певного періоду часу, підшкірно, зв'язувальне антитіло можна вводити одночасно, внутрішньом'язово, внутрішньоочеревинно, у послідовно або почергово з імуносупресором або спинний мозок, внутрішньосуглобово, у синовіальпісля прояву стійкості до іншої терапії. Імуносупрену рідину (внутрішньосуглобово), внутрішньоболосор можна вводити в таких же або більш низьких нково або шляхом інгаляції, як правило, внутрішдозах у порівнянні із застосовуваними в даній ганьовенно або підшкірно. лузі. Вибір переважного імуносупресору повинен В одному з варіантів здійснення винаходу гузалежати від багатьох факторів, у тому числі від манізоване антитіло 2Н7 вводять шляхом внутрітипу захворювання, яке підлягає лікуванню, а ташньовенної інфузії, використовуючи як наповнюкож від історії хвороби пацієнта. вач розчину для інфузії 0,9%-ний розчин хлориду У контексті даного опису поняття «імуносупренатрію. сор», що застосовується для додаткової терапії, Спільна терапія стосується субстанцій, дія яких полягає в пригніДля лікування вказаних вище В-клітинних неоченні або маскуванні імунної системи пацієнта. плазм пацієнтові можна вводити CD20Такі агенти можуть являти собою субстанції, які зв'язувальні антитіла, запропоновані в даному пригнічують виробництво цитокінів, здійснюють винаході, у сполученні з одним або декількома понижуючу регуляцію або пригнічують експресію терапевтичними агентами, такими як хіміотерапеаутоантигенів або маскують антигени головного втичний агент, використовуючи схему лікарського комплексу гістосумісності (ГКГ). Прикладами таких лікування на основі декількох засобів. CD20агентів є стероїди, такі як глюкокортикостероїди,
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюHumanized antibody that specifically binds human cd20
Автори англійськоюAdams Camellia W., Chan Andrew C., Crowley Craig W., Lowman Henry B., Nakamura Gerald R., Presta Leonard G.
Назва патенту російськоюГуманизированое антитело, которое связывает человеческий cd20
Автори російськоюАдамз Камеллия В., Чен Эндрю С., Кроули Крейг В., Лоуман Генри Б., Накамура Джеральд Р., Преста Леонард Г.
МПК / Мітки
МПК: C07K 16/28, A61K 39/395, A61P 35/00, A61P 37/00
Мітки: зв'язує, людський, антитіло, гуманізоване
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/119-89350-gumanizovane-antitilo-shho-zvyazueh-lyudskijj-cd20.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Гуманізоване антитіло, що зв’язує людський cd20</a>
Моноклональне антитіло, химерне антитіло, повністю гуманізоване антитіло, антитіло до антиідіотипічного антитіла або його фрагмент до рецептора ліпопротеїнів низької щільності (лпнщ) людини, спосіб їх одержання
Номер патенту: 78489
Опубліковано: 10.04.2007
Автори: Суісса Дані, Смоларскі Моше, Дреано Мішель, Бельзер Ілана, Йонах Начум, Антонетті Франческо
МПК: C07K 16/28, C12N 5/20, G01N 33/68, C12P 21/08, G01N 33/577
Мітки: людини, спосіб, рецептора, химерне, повністю, фрагмент, гуманізоване, одержання, ліпопротеїнів, щільності, антиідіотипічного, лпнщ, антитіло, моноклональне, антитіла, низької
Формула / Реферат:
1. Моноклональне антитіло, химерне антитіло, повністю гуманізоване антитіло, антитіло до антиідіотипічного антитіла або його фрагмент, що специфічно розпізнає і зв'язує розчинний рецептор ліпопротеїнів низької щільності (ЛПНЩ)людини і його фрагменти, а також здатне інгібувати реплікацію вірусу гепатиту С, і яке одержують шляхом імунізації тварин формою +291 розчинного рецептора ЛПНЩ людини, тобто формою розчинного рецептора людини, що містить...
Моноклональне антитіло, яке спричиняє апоптоз кров’яних клітин, що містять ядро та інтегрин-пов’язаний протеїн людини (іпп), фрагмент моноклонального антитіла, гібридома, яка продукує моноклональне антитіло (ва
Номер патенту: 72192
Опубліковано: 15.02.2005
Автори: Фукушіма Наоші, Уно Шінсуке
МПК: C07K 16/28, C12N 5/20, C12P 21/08
Мітки: моноклональне, кров'яних, гібридома, антитіла, іпп, людини, ядро, яке, апоптоз, спричиняє, продукує, моноклонального, протеїн, клітин, яка, ва, фрагмент, антитіло, інтегрин-пов'язаний, містять
Формула / Реферат:
1. Моноклональне антитіло, яке зв’язується із інтегрин-пов’язаним протеїном людини (ІПП) і спричиняє апоптоз кров'яних клітин, що містять ядро та ІПП.2. Моноклональне антитіло за п.1, яке відрізняється тим, що антитіло отримують способом, що включає:а) імунізацію тварин з використанням ІПП людини як сенсибілізуючого антигена,б) одержання гібридом;в) відбір антитіл, що розпізнають ІПП людини та спричиняють апоптоз...
Химерне антитіло проти cd40 людини, молекула нуклеїнової кислоти, вектор експресії, фармацевтична композиція для лікування захворювань, опосередкованих т-клітинами, яка містить химерне антитіло
Номер патенту: 71909
Опубліковано: 17.01.2005
Автори: Сайдек Ентоні В., Беррі Карен К., Торн Барбара А., Херріс Лінда Дж., Бейорет Юрген, Холленбау Даєн, Ву Херрен, Аруффо Аледжандро А., Уоткінс Джеффрі Д., Хьюз Уільям Д.
МПК: C07K 14/725, A61P 37/02, A61P 37/06, A61P 19/02, C12N 15/13, A61P 29/00, A61P 43/00, C07K 14/46, C12N 1/21, A61K 39/395, C12N 15/09, C07K 16/28
Мітки: експресії, опосередкованих, нуклеїнової, яка, захворювань, химерне, молекула, антитіло, композиція, кислоти, т-клітинами, лікування, фармацевтична, вектор, людини, містить
Формула / Реферат:
1. Варіабельна ділянка легкого ланцюга химерного антитіла, що зв’язується з CD40 людини, яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID NО:1 (Фіг. 4а).2. Варіабельна ділянка важкого ланцюга химерного антитіла, що зв’язується з CD40 людини, яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID NО:2 (Фіг. 4b).3. Химерне антитіло, що зв'язується з CD40 людини, яке містить легкий і важкий ланцюг, причому зазначений легкий ланцюг містить ...
Гуманізоване антитіло, яке специфічно зв’язується з протеїном альфа активації фібробластів (fapa)
Номер патенту: 73276
Опубліковано: 15.07.2005
Автори: Реттіг Вольфганг Й., Парк Джон Едвард, Сальданха Жосье, Лєжер Олів'є, Гарін-Хеса Пілар, Бамбергер Уве
МПК: C12N 15/13, C12N 5/10, C12N 15/09, C12Q 1/02, A61K 49/00, C07K 16/40, G01N 33/574, C07K 16/18, C07K 16/46, A61P 35/00, C07K 19/00, A61K 47/48, C12P 21/02, A61K 39/395, G01N 33/577
Мітки: гуманізоване, активації, яке, специфічно, зв'язується, протеїном, антитіло, альфа, фібробластів, fapa
Формула / Реферат:
Гуманізоване антитіло, яке специфічно зв’язується з протеїном альфа активації фібробластів (FAPα), у якому варіабельна та константна ділянки важкого ланцюга мають амінокислотну послідовність SEQ ID NO:12 та SEQ ID NO:22 відповідно, а варіабельна та константна ділянки легкого ланцюга мають амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2 та SEQ ID NO:20 відповідно або його модифіковані варіанти, які мають таку ж саму біологічну активність.
Гуманізоване антитіло, що зв’язується з бета-амілоїдним пептидом (ab), полінуклеїнова кислота, що його кодує, фармацевтична композиція, що його містить, та застосування даного гуманізованого антитіла для вигото
Номер патенту: 75881
Опубліковано: 15.06.2006
Автори: Дематтос Роналд, Васкес Максіміліано, Пол Стівен М., Холцмен Дейвід М., Бейлз Келлі Р., Цурушіта Нойа
МПК: A61P 25/28, A61K 39/395, C12N 15/13, C12N 5/10, C07K 16/18
Мітки: пептидом, композиція, фармацевтична, даного, застосування, містить, полінуклеїнова, бета-амілоїдним, гуманізоване, вигото, кодує, ab, кислота, гуманізованого, зв'язується, антитіла, антитіло
Формула / Реферат:
1. Гуманізоване антитіло або його фрагмент, до складу якого входять:а) легкий ланцюг, який включає три гіперваріабельні ділянки (CDR) легкого ланцюга, що мають такі амінокислотні послідовності:CDR-1 легкого ланцюга:(Послідовність № 1) або(Послідовність № 15)CDR-2 легкого ланцюга:(Послідовність № 2)та CDR-3 легкого ланцюга:(Послідовність № 3);і каркасну...
Попередній патент: Таблетка без покриття, яка містить оланзапін, та спосіб її одержання
Наступний патент: Спосіб вимірювання реактивної складової повного струму в фазі трифазної електричної мережі змінної напруги
Випадковий патент: Застосування системи швидкого розчинення з виділенням газу як компонента засобу захисту рослин