Спосіб боротьби з фітопатогенними нематодами за допомогою спор pasteuria в покриттях для насіння

Реферат: Винахід належить до способу боротьби з фітопатогенними нематодами та/або нематодами, що живуть у землі, який включає закріплення композиції Pasteuria, яка містить ефективну кількість 6 12 спор Pasteuria, у кількості від 10 до 10 на насінину бобової культури, та висівання насінини. UA 108065 C2 (12) UA 108065 C2 UA 108065 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Посилання на попередню заявку Дана заявка заявляє пріоритет тимчасової заявки No. 61/139,304, поданої до Патентного Відомства США 19 грудня 2008 р., включеної шляхом посилання на її зміст, включаючи всі фігури, таблиці чи малюнки. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Втрати урожаю через паразитів – нематод за оцінками перевищують 100 мільярдів доларів США. Запобігання цим збиткам являє собою значну проблему. Беручи до уваги нестачу фуміганту – метилброміду, в майбутньому залишається небагато часу для розробки та реєстрації нових синтетичних сполук для контролю за нематодами. Таким чином, необхідні інші підходи. З фітопатогенними нематодами боротись особливо важко, тому, що вони вкриті товстою, непроникною оболонкою або зовнішнім покриттям і вони мають дуже мало сенсорних нейронів. Оскільки багато сполук для боротьби зі шкідниками діють як нейротоксини, мала кількість нейронів, спрямованих назовні фітопатогенними нематодами, зменшує ефективну зону ураження для нематоцидних сполук і це викликає потребу в розробці нематоцидних сполук з особливо високими нейротоксичними властивостями. Більш того, оскільки фітопатогенних нематод знаходять в землі або корінні рослин, впливати на фітопатогенні нематоди контролюючими сполуками важко і ставить під загрозу забруднення ґрунтових вод цими токсичними сполуками. Показано, що застосування нематоцидів на основі нейротоксинів забруднює як землю так і ґрунтові води. Тому багато з цих сполук вилучено з ринку через причини, пов’язані з охороною здоров’я. Фумігація землі перед висіванням є розповсюдженим методом боротьби з нематодами. Один з найбільш розповсюджених фумігантів – метилбромід внесений до списку для вилучення з використання через його здатність руйнувати озон. Окрім того, практика фумігації землі вбиває організми в землі без розбору і призводить до ризику знищення корисних мікробів а також організмів, які викликають хвороби. Отже є нагальна потреба в ефективному нематоциді з корисними для навколишнього середовища ефектами. Pasteuria була вперше описана в 1888 році Мечніковим (Metchnikoff) (Annales de l’Institut Pasteur 2:165-170) як паразит водяних блох. Згодом Кобб (Cobb) описав зараження Pasteuria nd нематоди Dorylaimus bulbiferous (2 ed. Hawaiian Sugar Planters Assoc., Expt. Sta. Div. Path. Physiol. Bull. 5:163-195, 1906). Життєвий цикл бактерій включає стадію, коли ендоспори прилипають до оболонки нематод в землі. P. penetrans потім розмножуються в тілі нематоди і проходять кілька морфологічних фаз, включаючи міцеліальні структури і талії, а кульмінацією є розвиток нових ендоспор. Ендоспори вивільнюються, коли тіло нематоди розпадається. Ріст бактерій всередині нематоди зменшує або виключає продукування яєць нематодою, що суттєво обмежує швидкість репродукції нематод. Економічний збиток для урожаю зазвичай завдається першим потомством нематод і попереджається завдяки Pasteuria через зниження концентрації потомства нематод в зоні кореневої системи рослини. Хоча застосування Pasteuria для боротьби з нематодами було запропоновано раніше, ряд факторів, включаючи субоптимальні шляхи доставки обмежували застосування цієї стратегії для боротьби з нематодами. Звичайні способи боротьби з нематодами із застосуванням штамів Pasteuria включають нанесення бактерій на рослину та землю у вільній формі (наприклад, Stirling G. R. 1984. “Biological control of Meloidogyne javanica with Bacillus penetrans”, Phytopathology, 74:55-60) або у твердих чи рідких композиціях (наприклад, патент США № 5,248,500). Однак, не дивлячись на високоселективну ефективність бактерій на фітопатогенні нематоди, вони потребують перебування в контакті з нематодами для нематоцидного ефекту. Якщо наносити на землю, необхідна велика кількість бактерій і їх треба добре перемішувати із землею, що значно збільшує вартість застосування бактерій. Хоча відомі різні методи біологічного контролю із застосуванням бактерій Pasteuria, є потреба в розробці покращеного способу застосування цих бактерій для ефективної боротьби з нематодами. Таким чином, даний винахід пропонує нові способи боротьби з фітопатогенними нематодами, які атакують рослини. КОРОТКИЙ ВИКЛАД СУТІ ВИНАХОДУ Даний винахід пропонує нові та поліпшені матеріали і способи боротьби з фітопатогенними нематодами і/або іншими нематодами, які живуть у землі, шляхом доставки у землю композиції, яка містить ефективну кількість спор Pasteuria, і прикріплених до насінини. Після висадки насіння згідно з даним винаходом спори Pasteuria переходять в землю, яка оточує насінину. Встановлено, що при реалізації способу даного винаходу, спори прикріплюються до, заражують, вростають, повторно утворюють спори, що знижує плідність 1 UA 108065 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 і/або знищують фітопатогенні нематоди і/або інші нематоди, що живуть коло насіння та, зрештою, коло будь-якої рослини, яка розвинулася з насінини. Спосіб даного винаходу може бути застосований для боротьби або зменшення збитків, які завдає зараження нематодами, в кращому варіанті втілення, може збільшити пророщування насінини, сприяти росту рослин та здоров’ю рослин. В одному аспекті даний винахід пропонує спосіб боротьби з нематодами шляхом доставки в місце зараження нематодами ефективної кількості спор Pasteuria, прикріплених до насіння рослини. Спори Pasteuria spores згідно з даним винаходом можна наносити на насіння у вигляді спор не у формі композиції, або як сформовану рідку або тверду композицію, суспензію частинок або емульсію. В одному варіанті втілення спори Pasteuria формулюють в рідку композицію. В іншому варіанті втілення спори Pasteuria формулюють в тверду композицію. Придатні тверді носії включають, але не обмежуючись цим, тверді полімерні матриці, частинки, гранули та порошки. В одному варіанті втілення твердий носій може складатись з гранул. В кращому варіанті втілення композицію Pasteuria сполучають з насінинами шляхом покриття, напилювання, або сполучення іншим шляхом, контактування чи перемішування насіння з композицією, яка включає Pasteuria. В одному варіанті втілення композицію, яка включає Pasteuria, наносять шляхом покриття принаймні частини площі поверхні насінини композицією, яка включає Pasteuria. В одному варіанті втілення насінину спершу піддають обробці клейкою речовиною, яка може прилипати до спор Pasteuria і/або композиції, яка містить спори. Клейка речовина може бути, наприклад, клеєм і/або одним чи більше полімерами або співполімерами. Приклади клейких ™ речовин включають, але не обмежуючись цим, клеї (такі як клей ELMERS ); полівінілацетати; силіконові матеріали; та природні неорганічні матеріали, такі як силікагель та глина. В іншому аспекті даний винахід пропонує насінину, принаймні частина поверхні якої покрита композицією, яка включає Pasteuria, де композиція Pasteuria містить ефективну кількість спор Pasteuria для боротьби з нематодами. КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ Фіг. 1 показує стан здоров’я рослин, вирощених з насіння, вкритого Pasteuria для боротьби з нематодами. Фіг. 2 показує прикріплення спор Pasteuria до нематод у землі. Фіг. 3 показує висоту рослин, вирощених з насіння, вкритого Pasteuria для боротьби з нематодами. ДОКЛАДНИЙ ОПИС Даний винахід пропонує матеріали та способи для ефективного контролю за фітопатогенними нематодами і/або іншими нематодами, які живуть в землі шляхом застосування насіння рослин, покритого спорами Pasteuria. Краще, коли Pasteuria продукує ендоспори, які мають унікальну та корисну здатність прикріплюватись до, заражати, вростати, повторно утворювати спори, чим знижується плідність і/або знищуються фітопатогенні нематоди та інші нематоди, які живуть в землі. В одному аспекті даний винахід пропонує способи боротьби з нематодами шляхом доставки в місце зараження нематодами ефективної кількості композиції Pasteuria як покриття для насіння рослин. Pasteuria, доставлена як покриття для насіння, згідно з даним винаходом, може знижувати здатність нематод заражувати рослини. В результаті в кращих варіантах втілення спосіб обробки, згідно з винаходом, здатний контролювати або зменшувати втрати від зараження нематодами, чим підвищується пророщування насіння, ріст рослин і/або здоров’я рослин. Спори Pasteuria, згідно з даним винаходом, можна вирощувати in vivo в живих хазяях (наприклад, Verdeho, S., and R. Mankau, 1986, Journal of Nematology, 18:635), або in vitro без застосування живих тканин-хазяїв (наприклад, Патент США № 5,094,954). В конкретному варіанті втілення спори Pasteuria, згідно з даним винаходом, можна продукувати, використовуючи методики ферментації, описані, наприклад, в Патентах США №№ 7,067,299 та 6,919,197. Для застосування для боротьби з нематодами придатні різноманітні види спор Pasteuria (Pasteuria spp.). В одному варіанті втілення активний інгредієнт включає ефективну кількість спор Pasteuria penetrans для боротьби з нематодами кореневих вузликів. В інших варіантах втілення активний інгредієнт включає ефективну кількість спор Pasteuria, вибраних з Pasteuria ramose, Pasteuria thornea, Pasteuria usage, Pasteuria nishizawae, будь-яку їх комбінацію, а також нові нематоцидні види, які будуть ідентифіковані. Нематоцидна активна кількість спор Pasteuria буде варіювати в залежності від факторів, які 2 UA 108065 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включають, але не обмежуючись цим, види рослин, площа поверхні насінини, тип носія, присутність або відсутність інших активних інгредієнтів, спосіб одержання композиції, спосіб доставки, види Pasteuria, цільові види нематод та серйозність зараження або пошкодження нематодами рослини(н). “Нематоцидна ефективна кількість”, як використано тут, стосується кількості спор Pasteuria, здатних знищувати, контролювати або заражувати нематоди; затримувати ріст або репродукцію нематод; зменшувати популяцію нематод; і/або зменшувати втрати стосовно рослин, 5 викликаних нематодами. Загалом ефективна кількість спор варіює від приблизно 1×10 до 12 1×10 (або більше) спор/насінина. Краще, коли концентрація спор становить від приблизно 6 9 1×10 до приблизно 1×10 спор/насінина. “Активний інгредієнт", як використано тут, стосується речовини, яка є корисною для знищення, контролювання або зараження нематод або інших шкідників; і/або затримування росту або репродукції нематод або інших шкідників; зменшення популяцій нематод або інших шкідників; і/або зменшення втрат рослин, викликаних нематодами або іншим шкідником(ами). “Сільськогосподарський корисний інгредієнт”, як використано тут, стосується речовини, яка є корисною або продуктивною в різних сільськогосподарських застосуваннях, наприклад, корисною для боротьби з хворобами, шкідниками (включаючи, наприклад, комаху, паразита, вірус, грибок, бактерію) і/або бур’ян; корисною в сприянні якості та кількості росту рослини, здоров’ю рослини, проростанню насінини, репродукції рослини і/або росту плодів. Сільськогосподарські корисні інгредієнти включають, але не обмежуючись цим, пестициди, гербіциди, фунгіциди, добрива та агенти біологічного контролю. “Інертний або неактивний інгредієнт”, як його тут використано, стосується речовини, яка допомагає в дії або підвищує ефективність сільськогосподарського складу або композиції. Інертні або неактивні інгредієнти включають, але не обмежуючись цим, носій, клейку речовини, диспергатор, поверхнево-активну речовину, рідкий розріджувач, зв’язувальну речовину, наповнювач, розбавлювач, зволожувальний агент, прилипач, емульгатор, поживну речовину, поверхнево-активну речовину, пенетрант, піноутворювач, розчинник, розподілювач та буферний агент. В деяких варіантах втілення композицію Pasteuria наносять на насіння шляхом покриття, нанесення, контактування, або перемішування насіння з композицією Pasteuria. В одному варіанті втілення композицію Pasteuria наносять на насінину шляхом покриття принаймні частини площі поверхні насінини композицією Pasteuria. В конкретному варіанті втілення композицію Pasteuria наносять на насінину шляхом: a) просочування твердого носія композицією Pasteuria для одержування суміші Pasteuria-носій; та b) контактування насінини з сумішшю Pasteuria-носій. В іншому аспекті винахід пропонує насіння, оброблене даною композицією Pasteuria. В іншому варіанті втілення пропонується насіння, принаймні частина площі поверхні якого покрита композицією Pasteuria. В конкретному варіанті втілення насіння, покрите Pasteuria, має 6 9 концентрацію спор від приблизно 10 до приблизно 10 спор на насінину. Насіння може мати і 10 11 12 більше спор на насінину, наприклад, 1×10 , 1×10 або 1×10 спор на насінину. Склади композиції Pasteuria Pasteuria згідно з винаходом можна доставляти на насіння у вигляді спор не в складі композиції, або у складі рідкої чи твердої композиції суспензії частинок або емульсії. В одному варіанті втілення спори Pasteuria формулюють в рідку композицію. Ендоспори суспендують в середовищі з буфером для підтримання бажаної величини рН. Краще, коли величина рН становить менше ніж приблизно 6,0, краще – рН становить менше ніж приблизно 5,5, а ще краще, коли величина рН знаходиться в межах між приблизно 3,0 та приблизно 5,0. Буферні системи, які можна використовувати, включають, але не обмежуючись цим, гідрофталат калію, оцтову кислоту, бурштинову кислоту та лимонну кислоту. Агенти, які можуть бути використані для підкислення культурального середовища включають, але не обмежуючись цим, соляну кислоту, сірчану кислоту, оцтову кислоту та інші органічні кислоти. В іншому варіанті втілення композиція Pasteuria може необов’язково містити одну чи більше амінокислот, солі, карбогідрати, вітаміни та інші додаткові поживні речовини. В конкретному варіанті втілення суспензія Pasteuria може містити один чи більше наступних компонентів: глюкозу, NaCl, екстракт дріжджів, NH4H2PO4, (NH4)2SO4, гліцерин, валін, L-лейцин, L-глутамін, Lаланін, L-валін, L-tтирозин, L-триптофан, молочну кислоту, пропіонову кислоту, бурштинову кислоту, яблучну кислоту, тартрат KH, вітамінний розчин, мінеральний розчин, ксилозу, ликсозу та лецитин. В іншому варіанті втілення суспензія може містити один чи більше наступних компонентів: молочну кислоту, пропіонову кислоту, бурштинову кислоту, яблучну кислоту, лимонну кислоту, винну кислоту та екстракт дріжджів. 3 UA 108065 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому варіанті втілення спори Pasteuria формулюють у формі твердої композиції. Тверду композицію можна приготувати шляхом перемішування спор Pasteuria spores або рідкої суспензії Pasteuria з твердим носієм. В одному варіанті втілення тверду композицію одержують шляхом просочування твердого носія суспензією спор і наступного висушування твердої композиції. Придатні тверді носії включають, але не обмежуючись цим, тверді полімерні матриці, частинки, гранули та порошки. В одному варіанті втілення твердий носій складається з гранул. В іншому варіанті втілення дану композицію формулюють як емульсію; суспензію частинок у водному середовищі (наприклад, воді); здатні до змочування порошки; здатні до змочування гранули (сухі текучі гранули); або сухі гранули. В конкретному варіанті втілення твердий носій ○,R являє собою гранули діатомової землі від AXIS і/або гранули глини ґатунку «greens grade» від ○,R PROFILE . Композицію Pasteuria, згідно з винаходом, можна формулювати як, наприклад, рідку суспензію, тверду композицію або рідку суспензію. Концентрація активного інгредієнта може варіювати від приблизно 0,5% до приблизно 99% мас. (мас./мас.), від приблизно 5% до приблизно 80%, від приблизно 10% до приблизно 75%, від приблизно 15% до приблизно 70%, від приблизно 20% до приблизно 65%, від приблизно 25% до приблизно 60%, від приблизно 30% до приблизно 55%, від приблизно 35% до приблизно 50%. В іншому варіанті втілення дану композицію формулюють як суміш Pasteuria-гранул. 6 8 Кількість спор Pasteuria до гранул може варіювати від приблизно 1×10 до приблизно 7×10 6 8 7 спор/г гранул, від приблизно 5×10 до приблизно 5×10 спор/г гранул, від приблизно 1×10 до 8 7 7 приблизно 1×10 спор/г гранул або від приблизно 3×10 до приблизно 5×10 спор/г гранул. В конкретному варіанті втілення композицію гранул одержують шляхом перемішування 7 приблизно 3-5 мл суспензії 2×10 спор/мл Pasteuria з приблизно 2 г гранул. В ще іншому конкретному варіанті втілення композицію гранул одержують шляхом перемішування приблизно ® 5 мл суспензії спор з приблизно 2 г гранул AXIS . В ще одному конкретному варіанті втілення композицію гранул одержують шляхом перемішування приблизно 3 мл суспензії спор з ® приблизно 2 г гранул PROFILE . Частинки твердої композиції можуть бути будь-якого розміру, здатного до закріплення спор Pasteuria на насінині рослини. В ще одному варіанті втілення композиція Pasteuria додатково включає один чи більше звичайних неактивних або інертних інгредієнтів, включаючи, наприклад, клейкі речовини, диспергатори, поверхнево-активні речовини, рідкі розріджувачі, зв’язувальні речовини, наповнювачі, розчинники, зволожувальні агенти, прилипачі, емульгатори, поживні речовини та буферні агенти. Звичайні неактивні або інертні інгредієнти включають, але не обмежуючись цим: звичайні ™ агенти для прилипання; диспергуючі агенти, такі як метилцелюлоза (Methocel A15LV або ™ Methocel A15C, яка, наприклад, слугує як комбіновані диспергуючі агенти/агенти для ™ прилипання при застосуванні в обробці насіння); полівініловий спирт (наприклад, Elvanol 51™ 05); лецитин (наприклад, Yelkinol P), полімерні диспергуючі агенти (наприклад, полівінілпіролідон/вінілацетат PVPIVA S-630); згущувачі (наприклад, згущувачі на основі глини, такі як Van Gel B для покращення в’язкості та зниження осадження суспензій частинок); стабілізатори емульсії; поверхнево-активні речовини; сполуки проти замороження (наприклад, сечовини), барвники, пігменти, тощо. Додаткові інертні інгредієнти, які можна використати у даному винаході можна знайти в McCutcheon's, vol. 1, "Emulsifiers and Detergents," MC Publishing Company, Glen Rock, N.J., U.S.A., 1996. Додаткові інертні інгредієнти, які можна використати у даному винаході можна знайти в McCutcheon's, vol. 2, "Functional Materials," MC Publishing Company, Glen Rock, N.J., U.S.A., 1996. В одному варіанті втілення використовують клейку речовину для прискорення прикріплення спор до насіння. Клейка речовина закріплює композицію, яка містить спори Pasteuria, на поверхні насінини, що попереджує, або принаймні зменшує небажане стікання спор. Краще, коли клейка речовина є нетоксичною, розпадається біологічним шляхом і адгезивною. Придатні клейкі речовини включають, але не обмежуючись клеї; полівінілацетати; співполімери полівінілацетату; полівінілові спирти; співполімери полівінілового спирту; целюлози, такі як метилцелюлози, гідроксиметилцелюлози та гідроксиметилпропілцелюлози; декстрини; альгінати; цукри; меляси; полівінілпіролідони; полісахариди; протеїни; жири; олії; гуміарабіки; желатини; сиропи; та крохмалі. Додаткові клейкі речовини описані, наприклад, в Патенті США № 7,213,367. В конкретному варіанті втілення клейка речовина являє собою полівінілацетат. В іншому варіанті втілення дана композиція додатково містить один чи більше полімерів, здатних змішувати або прикріплювати активний інгредієнт до твердого носія. Придатні полімери 4 UA 108065 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можуть бути природними або синтетичними і краще, коли вони не мають або мають невеликий фітотоксичний ефект на насінину, яку покривають. Полімер можна вибрати, наприклад, з полівінілацетатів; співполімерів полівінілацетату; співполімерів етиленвінілацетату (EVA); полівінілових спиртів; співполімерів полівінілового спирту; целюлоз, включаючи етилцелюлози, метилцелюлози, гідроксиметилцелюлози, гідроксипропілцелюлози та карбоксиметилцелюлози; полівінілпіролідонів; полісахаридів, включаючи крохмаль, модифікований крохмаль, декстрини, мальтодекстрини, альгінат та хітозани; жирів; олій; протеїнів, включаючи желатин та зеїни; гуміарабіку; шелаків; вініліденхлориду та співполімерів вініліденхлориду; лігносульфонатів кальцію; акрилових співполімерів; полівінілакрилатів; оксиду поліетилену; полімерів та співполімерів акриламіду; полігідроксиетилакрилату, мономерів метилакриаміду; та поліхлорпрену. В іншому варіанті втілення дана композиція може додатково включати наповнювач для захисту насіння під час стресових умов. Крім того дана композиція може додатково включати пластифікатор для покращення текучості рідкої або напіврідкої композиції, пружності суміші або полімерної композиції, і/або прилипання композиції до насінини. Крім того, в композицію можна за бажанням додавати агент для висушування, такий як карбонат кальцію, каолінову чи бентонітову глину, перліт, діатомову землю або будь-який інший адсорбент, як описано, наприклад в Патенті США № 5,876,739. Фахівець у даній галузі, володіючи перевагами даного опису, може легко вибрати бажані компоненти для застосування в композиції. В ще одному варіанті втілення дана композиція Pasteuria містить другий сільськогосподарський корисний інгредієнт. Другий сільськогосподарський корисний інгредієнт може бути, наприклад, вибраний з пестицидів та фунгіцидів, таких як каптан, тірам, металаксил, флюдіоксоніл, оксадіксил та ізомерів цих матеріалів, тощо; гербіцидів, включаючи такі сполуки як карбамати, тіокарбамати, ацетаміди, тіазини, динітроаніліни, етери гліцерину, піридазинони, урацили, фенокси, сечовини та бензойні кислоти; гербіцидні антидоти, такі як бензоксазин, похідні бензгідрилу, N,N-диаліл дихлорацетамід, різні сполуки дигалоацилу, оксазолідинілу та тіазолідинілу, етанон, сполуки нафталільного ангідриду та похідні оксиму. Другий сільськогосподарський корисний інгредієнт може додатково включати добрива і/або інгредієнти, які сприяють проростанню насіння і/або росту рослин і/або здоров’ю рослин. Крім того, він може включати різні агенти біологічного контролю, такі як інші природні або рекомбінантні бактерії та грибки з роду Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Trichodenna, Glomus, Gliocladium та мікоризні грибки. Ці хімічні або біологічні агенти можуть бути корисні для боротьби з нематодами і/або іншими шкідниками. Беручи до уваги вищенаведені дані, фахівець у даній галузі включить різноманітні інгредієнти, такі як інертні або неактивні інгредієнти, пестициди або добрива в композицію і/або спосіб обробки згідно з винаходом. Крім того, фахівець у даній галузі звичайно не буде включати ті інгредієнти, які завдали б значної шкоди виживанню, росту і/або репродукції спор Pasteuria, знизили б здатність спор Pasteuria до прикріплення, зараження, вростання і/або знищення нематод, і/або б інгібували проростання насіння, ріст рослин, ріст плодів і/або репродукції рослин. Види рослин Матеріали і способи даного винаходу можна використовувати для зменшення втрат таких видів рослин, які включають, але не обмежуючись цим, зеленостручкова квасоля, дернові злаки, томати, бавовник, кукурудза, соєві боби, овочі, пшениця, ячмінь, рис та канолу. Види нематод Матеріали і способи згідно з даним винаходом корисні для знищення, боротьби з і/або зараження нематод, затримання росту або репродукції нематод; зменшення популяції нематод; і/або зменшення або перешкоджання нанесенню шкоди рослинам від фітопатогенних нематод, нематод, які паразитують на рослинах або інших нематод, які живуть у землі, включаючи, але не обмежуючись цим, Meloidogyne arenaria, Pratylenchus brachyurus, Rotylenchulus reniformis та Belonolaimus longicaudatus, Heterodera glycines і Hoplolaimus galeatus. Способи закріплення та доставки Даний винахід також пропонує способи закріплення композиції Pasteuria на насінні рослин та доставки насіння в місце зараження нематодами. Краще, коли спосіб закріплення не робить значної шкоди виживанню, росту і/або репродукції спор Pasteuria, не знижує здатність спор Pasteuria прикріплюватись, заражати, вростати і/або знищувати нематоди. Краще, коли способи закріплення та доставки викликають незначну фітотоксичність, таку яка впливає на проростання насінини, васкуляризацію рослин, ріст рослин, репродукцію рослин і/або ріст плодів. В деяких варіантах втілення композицію Pasteuria закріплюють шляхом покриття, 5 UA 108065 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розпилення, контактування або перемішування насіння з композицією Pasteuria. В одному варіанті втілення композицію Pasteuria закріплюють шляхом покриття принаймні частини площі поверхні насінини композицією Pasteuria. Дану композицію можна закріплювати на насінні, використовуючи будь-які з розмаїття методик, таких як, наприклад, технології псевдозрідженого шару, методи з використанням вальцьового млина та методики фонтануючого шару. Крім того, дану композицію можна закріплювати на насінні, використовуючи пристрій, такий як ротостатична машина для обробки насіння або барабанна машина для покриття насіння. Перед покриттям насіння можна піддавати сортуванню за розміром. Після покриття насіння зазвичай висушують, а потім переводять до сортувальної машини за розміром, як відомо у даній галузі. В одному варіанті втілення композицію Pasteuria, згідно з винаходом, спершу змішують з різними сільськогосподарськими корисними інгредієнтами, такими як пестициди, гербіциди, фунгіциди, добрива і/або агенти біологічного контролю; і потім суміш доставляють на насінини. В іншому варіанті втілення композицію Pasteuria, згідно з винаходом, доставляють на насінини послідовно з різними сільськогосподарськими корисними інгредієнтами. В іншому варіанті втілення композицію Pasteuria, доставляють на насінини одночасно з різними сільськогосподарськими корисними інгредієнтами, але на різні ділянки площі поверхні насінини. Як використано тут, покриття насінини включає будь-який спосіб, який передбачає додавання матеріалів до насінини, включаючи, але не обмежуючись цим, покриття плівкою, осадження одного шару або шарів матеріалів на всю або частину площі поверхні насінини, нанесення матеріалів на насінину одночасно або послідовно для покриття всієї або частини площі поверхні насінини. В конкретному варіанті втілення даною композицією можна покривати насіння, використовуючи різні способи, включаючи, але не обмежуючись цим, покриття плівкою, перемішування насіння з даною композицією у контейнері (наприклад, у пляшці або мішку), механічне нанесення, струшування, розпилення та занурення. Для покриття можуть бути використані різні активні або інертні матеріали, такі як, наприклад, звичайні плівко-утворюючі матеріали включаючи, але не обмежуючись цим, плівкові покриття на водній основі, такі як SEPIRET (Seppic, Inc., Fairfield, N.J.) та Opacoat (Berwind Pharm. Services, Westpoint, Pa.). Різні способи одержання покритого насіння, включають також ті, які описані, наприклад, в Патентах США №№ 5,918,413; 5,891,246; 5,554,445; 5,389,399; 5,107,787; 5,080,925; 4,759,945; 4,465,017; 5,939,356; 5,882,713; 5,876,739; 5,849,320; 5,834,447; 5,791,084; 5,661,103; 5,622,003; 5,580,544; 5,328,942; 5,300,127; 4,735,015; 4,634,587; 4,383,391; 4,372,080; 4,339,456; 4,272,417; і 4,245,432. В іншому конкретному варіанті втілення композицію Pasteuria доставляють на насіння шляхом первинної обробки твердою матрицею. Якщо проілюструвати це стисло, спори Pasteuria, рівномірно розподілені в полімерній матриці, вводять в контакт з насінинами протягом достатнього періоду часу, доки вся поверхня насінин не буде покрита спорами Pasteuria. Оброблене насіння можна відділити від твердої матриці для подальшого зберігання або застосування; або альтернативно оброблене насіння можна зберігати або висівати разом з твердою матрицею. Матеріали, придатні для застосування як тверда матриця включають поліакриламід, крохмаль, глину, кремнезем, глинозем, землю, пісок, полісечовину, поліакрилат або будь-який інший матеріал, здатний абсорбувати та вивільнювати дану композицію на насіння у контрольований спосіб. Краще, коли тверда матриця здатна вивільнювати дану композицію у контрольований спосіб. Бажана швидкість вивільнення може варіювати в залежності від виду рослин, виду Pasteuria, виду нематод та інших факторів. Краще, коли дана композиція може вивільнюватись з обробленого насіння при малій швидкості, такій як шляхом дифузії або переміщення крізь матрицю в оточуюче середовище або землю. Насіння, покрите композицією Pasteuria можна додатково покрити додатковою тонкою плівкою зовнішнього покриття для захисту покриття, яке містить Pasteuria. Приклади методик нанесення зовнішнього покриття включають, але не обмежуючись цим, технологію псевдо зрідженого шару та технологію барабанного плівкоутворення. В додатковому варіанті втілення способи доставки включають додаткову стадію теплової обробки. Стадія теплової обробки підсилює нематоцидний ефект композиції Pasteuria. В одному варіанті втілення суспензію спор Pasteuria нагрівають перед змішуванням з твердим носієм, таким як гранули. В іншому варіанті втілення нагрівають суміш Pasteuria- гранули. Крім того, даний спосіб може додатково включати стадію нанесення на насіння клейкої речовини перед або одночасно з обробкою Pasteuria. В іншому варіанті втілення насіння спершу покривають шаром клейкої речовини, а потім оброблюють композицією Pasteuria. 6 UA 108065 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Придатні клейкі речовини включають, але не обмежуючись цим, полівінілацетат, співполімери полівінілацетату, полівініловий спирт, співполімер полівінілового спирту, метилцелюлозу, гідроксиметилцелюлозу, гідроксиметилпропілцелюлозу, декстрин, альгінат, мелясу, полівінілпіролідон, полісахариди, протеїн, жир, олію, полісахарид, гуміарабік, желатин, сиропи та будь-яку їх комбінацію. В конкретному варіанті втілення даний спосіб включає: a) змішування суспензії спор Pasteuria з порошкоподібним носієм; і висушування суміші протягом достатнього часу, доки не сформуються частинки спор/гранул; b) покриття насіння клейкою речовиною; і c) контактування насіння з частинками спор/гранул, доки насіння не буде покрите нематоцидно ефективною кількістю спор Pasteuria. В ще одному варіанті втілення насіння, оброблене даною композицією Pasteuria може бути піддано додатковим стадіям обробки, таким як висушування. Краще, коли спорам Pasteuria не буде завдана шкоди в результаті висушування. Таким чином, насіння оброблене даною композицією може зберігатись протягом тривалого періоду часу при кімнатній температурі. Довгий час зберігання обробленого насіння також дозволяє різні варіації у графіках висаджування. Краще, коли ступінь виживання спор Pasteuria значно перевищує ступінь виживання вегетативної форми бактерій при транспортуванні, засіванні або при розміщенні в землю разом з насінням. Хоча обробку насінини можна проводити в будь-якому фізіологічному стані насіння, краще, коли насінина перебуває в достатньо міцному стані, щоб процес обробки завдав невелику, або зовсім не завдав шкоди насінині. Зазвичай, коли збирають урожай рослин з поля; насінину вилучають з рослини; і відділяють від будь-якого рослинного матеріалу який не відноситься до насіння. Краще, коли насінина є біологічно стабільною до такого ступеня, що обробка не завдасть шкоди насінині. В одному варіанті втілення, наприклад, обробку можна застосовувати до насіння кукурудзи, яке було зібрано, очищено і висушено до вмісту вологи нижче 15% мас. В альтернативному варіанті втілення насінина може бути насіниною, яка була висушена і потім піддана попередній обробці водою і/або іншими матеріалами і потім знову висушена до або під час обробки композицією Pasteuria. Обробку можна застосовувати до насіння у будьякий час від збору урожаю до висівання. Як використано тут, термін „не висаджена насінина” відноситься до будь-якої насінини в будь-який період від збору урожаю до висівання. Далі наводяться Приклади, які ілюструють методики практичного застосування винаходу. Ці Приклади не можна розглядати як обмежуючі. Всі відсоткові співвідношення даються за вагою і всі пропорції суміші розчинників даються за об’ємом, якщо не вказано інше. ПРИКЛАД 1 - ОДЕРЖАННЯ ПОКРИТТЯ НА НАСІННІ З PASTEURIA Даний Приклад ілюструє способи покриття насіння спорами Pasteuria penetrans. Спори Pasteuria суспендують в 10 ммоль /л фосфатного буферу і встановлюють концентрацію 7 приблизно 2 x 10 спор/мл. Суміш Pasteuria-гранули одержують шляхом змішування 5 мл ® суспензії спор з 2 г гранул діатомової землі AXIS в чашці Петрі; або, альтернативно, шляхом ® змішування 3 мл суспензії спор з 2 г PROFILE гранул глини ґатунку „greens grade” в чашці Петрі.Суміш висушують під лампою. Потім насіння зеленостручкової квасолі оброблюють полівінілацетатом і висушують протягом 5 хвилин в пласкій посудині. Насіння ретельно покривають сумішшю Pasteuria-гранули. Насіння, оброблене Pasteuria, придатне для негайного застосування або для тривалого зберігання. ПРИКЛАД 2 - ЕФЕКТИВНІСТЬ ПОКРИТТЯ PASTEURIA НА НАСІННІ ДЛЯ БОРОТЬБИ З НЕМАТОДАМИ Для визначення ефекту насіння, покритого Pasteuria, на нематоди проводять тест в горщиках у теплиці. 2,2 г кожної з добавок «Axis turf» та «Profile turf» помістили в окремі чашки Петрі. Спори 7 Pasteuria penetrans в концентрації 1,8 x 10 сп./мл вводили піпеткою в кожну чашку до насичення матеріалів. Добавка „Axis” стала насиченою при 5 мл, а добавка „Profile” стала насиченою при 4 мл. Чашки помістили під галогенову лампу для висушування. Насіння зеленостручкової квасолі (Ferry-Morse Blue Lake 274) зважили і визначили середню вагу 413,3 мг. Насіння покрили прилипачем на основі вінілацетату шляхом виливання клею Elmer’s Clear School Glue в лабораторний стакан та занурення індивідуальних насінин вручну за допомогою щипчиків в клей. Насіння висушували протягом 5 хвилин в чашці Петрі, а потім викочували в гранулах „Axis” та „Profile”, оброблених спорами, доки насіння не покрилось гранулами. Контрольне насіння покривали необробленими гранулами „Axis” та „Profile”. Покрите насіння піддали дії, яка описано нижче, зібраними у полі нематодами кореневих 7 UA 108065 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 вузликів протягом 21 дня. Для контролю необроблене насіння зеленостручкової квасолі піддавали дії нематод у тих же умовах. Горщики з матеріалу Styrofoam заповнили 1 кг землі. Кожний горщик заражали ювенільними нематодами кореневих вузликів у кількості 1500-2000 (Meloidogyne arenaria) шляхом введення суспензії нематод за допомогою піпетки в землю на глибину 2 дюйми від поверхні землі. Утворену лунку закрили, а потім висаджували насінину зеленостручкової квасолі, одну на горщик, на глибину 0,5 дюйма нижче поверхні. Висадили 5 контрольних (зі спорами) та 5 контрольних насінин. Горщики поливали 50 мл водопровідної води кожного дня та витримували у теплиці, доки температурні показники не показали, що нематоди досягли 500 градусоднів. Потім відбирали зразки землі для підрахунку нематод, а рослини і кореневі системи вилучали із землі. Здоров’я рослин і живучість розраховували за шкалою 1-10, 1 – найменш здорова, а 10 - найбільш здорова рослина. Прикріплення у відсотках визначали шляхом реєстрації кількості ювенільних нематод у зразку землі з 1 чи більше прикріпленими спорами Pasteuria та розраховуючи відсотки. Яйця нематод рахували шляхом збирання маси яєць з кореневої системи і підрахунку яєць під мікроскопом. Результати, показані на Фіг. 1 – 3 показують, що покриття з Pasteuria сприяє проростанню насіння, висоті рослин та росту рослин у порівнянні з контрольними рослинами. Всі посилання, включаючи патенти, заявки на видачу патентів, тимчасові заявки та публікації включені в опис або цитовані у ньому включені шляхом посилання на їх зміст, включаючи всі фігури та таблиці, у межах, коли вони не суперечать чітко викладеним ідеям цього опису. Артиклі “a” та “an” і “the” та подібні символи в тексті на англійській мові, як вони використані в контексті, описуючи винахід, охоплюють як однину, так і множину, якщо не вказано інше, або чітко спростовується контекстом. Викладення меж значень використано як скорочений спосіб викладення і індивідуально стосується кожної окремої величини, що знаходиться в цих межах, якщо не вказано інше і кожна індивідуальна величина введена в опис так, якби б вона була індивідуальна приведена. Застосування будь-якого і всіх прикладів, або мови прикладів (наприклад, “такий як”) призначено для кращої ілюстрації винаходу і не призначено для обмеження обсягу винаходу, якщо не вказано інше. Жоден з термінів в описі не може розглядатись як описуючий будь-яку з ознак як суттєву в практиці винаходу, якщо це не вказано чітко. Опис в цілому або будь-якого з аспектів або варіантів втілення винаходу, де використані такі терміни як “містить”, “має”, “включає” або “що включає” з посиланням на ознаку або ознаки призначений для підтвердження подібного аспекту або варіанту втілення винаходу, який “складається з”, “в основному складається з”, або “в основному містить” цю конкретну ознаку або ознаки, якщо не вказано інше, або чітко спростовується контекстом (наприклад, композицію, яка описана як така, що містить певну ознаку, слід розуміти як композицію, що складається з цієї ознаки, якщо не вказано інше, або чітко спростовується контекстом). Слід розуміти, що всі описані Приклади та варіанти втілення призначені лише для ілюстративних цілей і фахівцям у даній галузі будуть запропоновані різні модифікації або зміни в їх ракурсі, які знаходяться в обсязі та межах даної заявки. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 45 50 55 60 1. Спосіб боротьби з фітопатогенними нематодами та/або нематодами, що живуть у землі, який включає закріплення композиції Pasteuria, яка містить ефективну кількість спор Pasteuria, у 6 12 кількості від 10 до 10 на насінину бобової рослини, та висівання насінини. 2. Спосіб за п. 1, де композиція Pasteuria, при нанесенні на насінину присутня в концентрації від 6 9 приблизно 10 до приблизно 10 спор на насінину. 3. Спосіб за п. 1, де композиція Pasteuria додатково містить рідкий або твердий носій. 4. Спосіб за п. 3, де твердий носій вибирають з групи, яка включає сухі порошки, здатні до змочування порошки, здатні до змочування гранули, сухі гранули, частинки, полімерні матриці та суспензії. 5. Спосіб за п. 4, де твердий носій включає гранули. 6. Спосіб за п. 4, де твердий носій являє собою полімерну матрицю, вибрану з групи, яка включає поліакриламід, крохмаль, глину, кремнезем, глинозем, землю, пісок, полісечовину, поліакрилат та будь-яку з їх комбінацій. 7. Спосіб за п. 1, де на насінину нанесена клейка речовина і клейку речовину вибирають з групи, яка включає полівінілацетат, співполімери полівінілацетату, полівініловий спирт, співполімер полівінілового спирту, метилцелюлозу, гідроксиметилцелюлозу, гідроксиметилпропілцелюлозу, 8 UA 108065 C2 5 10 декстрин, альгінат, мелясу, полівінілпіролідон, полісахариди, протеїн, жир, олію, полісахарид, гуміарабік, желатин, сиропи та будь-яку їх комбінацію. 8. Спосіб за п. 1, де спори Pasteuria вибирають з групи, яка включає Pasteuria penetrans, Pasteuria ramose, Pasteuria thornei, Pasteuria nishizawae та будь-яку їх комбінацію. 9. Спосіб за п. 1, де фітопатогенні нематоди і/або нематоди, які живуть у землі, вибирають з групи, яка включає Meloidogyne arenaria, Pratylenchus brachyurus, Rotylenchulus reniformis, Belonolaimus longicaudatus та будь-яку їх комбінацію. 10. Спосіб за п. 1, де насінина являє собою насінину зеленої стручкової квасолі. 11. Спосіб за п. 1, де насінина додатково містить другий сільськогосподарський інгредієнт, вибраний з групи, яка включає пестициди, гербіциди, фунгіциди, добрива та агенти біологічного контролю. 12. Насінина бобової рослини, принаймні частина площі поверхні якої покрита композицією 6 Pasteuria, де композиція Pasteuria містить ефективну кількість спор Pasteuria, у кількості від 10 12 до 10 на насінину бобової рослини, для боротьби з нематодами. 9 UA 108065 C2 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 10