Розчин фториду бензалконію для ін’єкцій

1. Раствор для интраваскулярного введения, отличающийся тем, что он содержит массовую долю порядка или по меньшей мере 0,23% по меньшей мере бензалконийфторида общей формулы: C2 (54) РОЗЧИН ФТОРИДУ БЕНЗАЛКОНІЮ ДЛЯ ІН'ЄКЦІЙ 39970 19. Раствор по любому из пп. 11-18, отличающийся тем, что по меньшей мере бензалконийфторид растворен в физиологическом растворе. 20. Раствор по любому из пп. 11-19, отличающийся тем, что он дополнительно содержит по меньшей мере металлическое производное фтора. 21. Раствор по п. 20, отличающийся тем, что он дополнительно содержит фторид лития. Изобретение относится к раствору для интраваскулярного введения, содержащий по меньшей мере бензалконийфторид. Известно (ЕР-А-0308564) использование бензалконийфторида для получения состава, назначенного для приема внутрь или парентерального введения с содержанием по массе от 0,05 до 7%, в частности порядка 1% бензалконийфторида и предназначенного для лечения от вирусных и ретровирусных заболеваний, в частности герпеса или ВИЧ, приводящих к СПИДу. Однако предполагается, что бензалконийфторид, как все соли бензалкония, тензоактивны, сохраняют значительную гемолитическую способность, что не позволяет их интраваскулярное введение. Следовательно, хотя ЕР-А-0308564 содержит указание на прием внутрь или парентеральное введение бензалконийфторида, на практике встречаются с препятствием, до сих пор считающимся непреодолимым по двум причинам: активная концентрация бензалконийфторида в крови сама по себе создает опасность гемолиза; все более активно практикуемые инъекции предполагают локальную повышенную концентрацию, а, следовательно, способность вызвать гемолиз, бензалконийфторида. В частности, доказано, что инъекция этой соли, массовая доля которой составляет порядка 1% -невозможна. Однако, именно эта концентрация считается необходимой для получения достаточного эффекта. Поэтому, соли бензалкония, и особенно бензалконийфторид, прекратили использовать для интраваскулярных инъекций, полагая, что снижение концентраций вводимых растворов не позволит полностью проявиться антивирусной и бактерицидной активности с учетом минимальной ингибирующей концентрации, определенной in vitro, и, что даже при таких слабых концентрациях существует большой риск гемолиза и, следовательно, немедленная смерть. Исключительно и только поэтому интраваскулярное введение человеку и животному солей бензалкония и, особенно, бензалконийфторида, прекращено. Между тем, постоянно ощущается потребность в шоковой терапии при инфекционных и заразных заболеваниях, в частности заболевания, вызванных иммунологической недостаточностью, и особенно при лечении пациентов от СПИДа на стадии выявления или прогрессирования, тяжелых заболеваний, которые относятся к таким, что вызваны условнопатогенными микроорганизмами и быстро приводят к дегидратации и смерти. Однако такая шоковая терапия сопряжена с рядом явно противоречивых проблем: необходимо бороться не только с патогенными микроорганиз-мами, которые обуславливают ухудшающееся клиническое состояние пациента, но и с вирусом, вызывающим иммунодефицит (в случае СПИДа); необходимо располагать очень большим арсеналом средств с учетом множества различных заболеваний, которые могут быть причастны в случае иммунологической недостаточности, необходимо также исключить побочные действия, в частности не причинять раздражение или поражение здоровых органов или клеток организма, и без того значительно ослабленного. Таким образом, в основу изобретения положена задача создать раствор, имея в виду общую задачу, которая до сих пор не решена. Согласно изобретению предложено средство лечения больных тяжелыми инфекционными или заразными заболеваниями, в частности одновременно несколькими, такими, которые вызваны иммунологической недостаточностью. Более конкретно, было неожиданно выявлено, что среди четвертичных соединений аммония бензалконийфторид можно эффективно вводить с помощью интраваскулярных инъекций без риска гемолиза в точных пределах концентраций, при которых зарегистрировано эффективное действие. Более конкретно, согласно изобретению предложен раствор для инъекций, содержащий противовирусное или дезинфицирующее вещество, такое как соль бензалкония. Согласно изобретению предложен раствор для интраваскулярного введения, отличающийся тем, что он содержит массовую долю порядка или по меньшей мере 0,23% по меньшей мере бензалконий фторида общей формулы: где R - алкил, который может изменяться от С 8Н17 до С18Н37, растворенного в наполнителе, пригодном для интраваскулярных инъекций. Можно утверждать, что при использовании массовой доли порядка ниже 0,23% и, в частности, порядка 0,20% вообще не возникает гемолиз, вопреки общему положению уровня техники. Наоборот, наступает клиническое улучшение при использовании массовых долей бензалконийфторида выше 0,05%. Следовательно, согласно изобретению, можно брать от 0,05 до 2,3 г/л, в частности, порядка 2,1 г/л, бензалконийфторида, предпочтительно бензалконийфторид, где R-С14Н29. Более конкретно, раствор согласно изобретению содержит концентрацию бензалконийфторида, определяемую возможностью замедленной инъекции дозами порядка от 0,5 до 23 мг, в частности порядка 21 мг, бензалконийфторида на литр 2 39970 крови пациента. Следовательно, если пациент имеет 5 л крови, используют дозу для инъекции, составляющую от 2,5 до 130 мг, в частности, порядка 105 мг бензалконийфторида. Далее, согласно изобретению необходимо соблюдение двух условий, позволяющих интраваскулярное введение бензалконийфторида: массовая доля бензалконийфторида в вводимом растворе должна быть ниже 0,23% и общее количество вводимого раствора на литр крови пациента сохранять ниже 23 мг. Чтобы определить концентрацию бензалконийфторида в растворе для инъекции, берут кровь пациента непосредственно перед инъекцией, проводят гемолитическое исследование крови in vitro с растворами, содержащими первоначально 0,23% бензалконийфторида со снижением концентрации до получения раствора, не приводящего к гемолизу. Предварительно проверяют путем инъекции негемолитический характер раствора при определении гемолитической концентрации на крови пациента. Раствор согласно изобретению может быть заключен в ампулы по 5...15 мл, в частности, 10 мл, и содержит от 0,5 до 23 мг, в частности порядка 21 мг, бензалконийфторида с учетом максимального значения 0,23%. Этот раствор вводят в объемах от 5 до 15 мл, в частности 10 мл, на литр крови пациента и, более конкретно, 50 мл в случае лечения человека. Согласно изобретению раствор, бензалконийфторида целесообразно получать на базе физиологического раствора, при этом R преимущественно находится в пределах С12Н25, и С 14Н29. Согласно изобретению, раствор может дополнительно содержать по меньшей мере металлическое производное фтора, в частности, фторид лития. Изобретение также относится к применению по меньшей мере бензалконийфторида указанной формулы, растворенного при его массовой доле порядка или ниже 0,23% в наполнителе, пригодном для интраваскулярных инъекций, для получения раствора, пригодного для интраваскулярного введения при лечении от инфекционных или заразных болезней, в частности болезней, вызванных иммунологической недостаточностью. Более конкретно, изобретение относится к применению по меньшей мере бензалконийфторида указанной формулы, растворенного при его массовой доле порядка или ниже 0,23% в наполнителе, пригодном для интраваскулярных инъекций, для получения раствора, пригодного для интраваскулярного введения при лечении от СПИДа на стадии выявления или прогрессирования. Следовательно, изобретение касается способа лечения больных заразными и инфекционными болезнями, в частности, вызванными иммунологической недостаточностью, такими, как СПИД на стадии выявления или прогрессирования, согласно которому вводят интраваскулярно раствор согласно изобретению. При лечении способом согласно изобретению раствор вводят после определения ех vi vo гемолитической способности бензалконийфторида при непосредственном контакте с кровью пациента, причем вводимый раствор имеет ниже гемоли тической концентрации и с помощью замедленной инъекции с количеством бензалконийфторида от 0,5 до 23 мг/л крови пациента, в частности и предпочтительно от 20 до 23 мг. Следовательно, согласно изобретению, используют от 0,5 до 2 3 мл, в частности порядка 21 мл, бензалконийфторида в 10 мл раствора. Изобретение особенно полезно при лечении от заразных заболеваний, которые разрушают иммунную защиту, в частности, при применении шоковой терапии. Изобретение позволяет эффективно лечить пациентов в случае болезни Карре и СПИДа в прогрессирующей фазе, т.е. заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. Другие характеристики и преимущества изобретения станут понятны из следующих примеров. На прилагаемых фиг.1-4 представлены кривые анализа in vitro противовирусной активности в отношении вируса ВИЧ-1 бензалконийфторида согласно описанному далее примеру 2. Пример 1 Антивир усную активность фторида тетрадецилдиметилбензиламмония (БКФ) непосредственно против вируса позвоночных проводили в соответствии с французским стандартом AFNOR T72180 от декабря 1989 г. Этот бензалконийфторид растворяли в стерильной дистиллированной воде до получения его массовой доли 0,02; 0,01; 0,005%. Анализ проводили на следующих группах препаратах вирусов: пикорнавирусы: энтеровирус полио 1, препарат SABIN, выращенный на клетке VERO, аденовирусы: аденовирус тип 5, выращенный на клетке KB, герпетовирусы: вирус герпеса тип 1(HSV 1) и вирус герпеса тип 2 (HSV 2), предоставленные институтом Пастера и выращенные на клетке MCR-5. Вода, культуральная среда и реактивы соответствовали условиям стандарта AFNOR Т72-180. Титрование вирусов проводили по результатам цитопатического исследования способом по стандарту AFNOR T72-180. Титр инфекционности определяли методом Фишера и Йейтса с помощью таблиц Вишака и Детре. Результаты представлены в единицах инфекционности на миллиметр или колониеобразующи х единицах на миллиметр (КОЕ/мл). Сначала исследовали порог токсичности (DLо) бензалконийфторида. Перед фильтрацией порог токсичности составлял 0,05% (в мг/мл). После фильтрации он составлял 0,01%. Определяли также способность клеток, обрабатываемых бензалконийфторидом, вызывать вирусную инфекцию, что отражено в табл. 1. Противовирусную активность затем определяли приемом, называемым фильтрацией на молекулярных ситах, и заключающемся в фильтровании на геле сефадекс LH 20 и использовании субцитотоксичных концентраций бензалконийфторида. Противовирусную активность определяли в зависимости от времени контакта бензалконийфторида с вирусным препаратом. Различные пробы брали через заданные промежутки времени и затем центрифугировали в течение 8 мин при 3 39970 1000 g, затем титровали на планшетах. Вирусную суспензию без бензалконийфторида обрабатывали по той же методике. В табл. 2-5 представлены результаты анализа, выраженные через кинетику инактивации вирусов в зависимости от времени контакта с бензалконийфторидом и от его концентрации. Противовирусную активность бензалконийфторида (БКФ) определяли по минимальной концентрации и минимальному времени контакта с вирусом, которые вызывают снижение титра инфекционности вирусов на логарифмический показатель, по меньшей мере равный 4. Опыт проводили при 32°С. тив вир уса герпеса тип 2 при 32°С в соответствии со стандартом AFNOR T72-180. Таблица 4 Противовирусная активность БКФ в отношении вируса герпеса тип 1 Титр вируса (КОЕ/мл) Массовая доля БКФ (%) (масса/объем) 0,02 0,01 0,005 Таблица 1 Способность клеток, обрабатываемых БКФ, вызывать вирусную инфекцию Титр вирусны х суспензий (КОЕ/мл) 107,68 108,61 108,00 107,02 108,50 Вирусный препарат Энтеровирус полио 1 Аденовирус тип 5 Вирус герпеса тип 1 (HSV 1) Вирус герпеса тип 2 (HSV 2) 107,84 Массовая доля БКФ (%) (масса/объем) 0,02 0,01 0,005 Время контакта вирус/БКФ (минуты) 3,28 10 101,28 104,38 30 2,02 10 0 103,62 60 1,40 10 0 103,02 120 0 0 102,26 Таблица 3 Противовирусная активность БКФ в отношении аденовируса тип 5 Титр вируса (КОЕ/мл) Массовая доля БКФ (%) (масса/объем) 0,02 0,01 0,005 60 120 0 102,68 105,14 0 101,41 104,65 0 0 103,84 0 0 102,26 Время контакта вирус/БКФ (минуты) 15 30 60 120 0 0 0 0 102,68 101,41 0 0 105,14 104,65 103,84 102,26 Пример 2 Противовирусную активность бензалконийфторида проверяли на вирусе ВИЧ-1 (препарат LAI) вызывающем СПИД (препарат предоставлен Институтом Пастера). Проверку проводили с помощью теста инфективности на первичной культуре активированных лимфоцитов человека. Исследование проводили в два этапа: сначала вирус обработали раствором с концентрацией бензалконийфторида (БКФ) 20 мкг/мл; затем исследовали остаточную инфективность вируса, обработанного на первичной культуре активированных лимфоцитов человека. На обработку вируса время контакта при температуре окружающей среды составляло: 30 мин и 60 мин. В 0,9 мл вируса добавляли 100 мкл БКФ и оставляли на 30 мин при комнатной температуре, затем разбавляли в 10 мл буфера NTE. Образец REV 8, соответствующую 0,9 мл вируса с добавлением 100 мкл БКФ оставляли на 60 мин при комнатной температуре, затем разбавляли в 10 мл буфера NTE. После разбавления в буфере образцы центрифугировали в течение 35 мин при 40000 об/мин с целью удаления продуктов, токсичных для клеток, участвующи х в тесте инфективности и с целью повышения концентрации остаточных инфекционных вирусов. После центрифугирования остаток ресуспендировали в 1 мл культуральной среды, выделили аликвоту и оставили на хранение при -80°С. Образцы REV 1, REV 2 и REV 3.1 характеризуют положительные показатели опыта. REV 1 соответствует 0,9 мл вирусной суспензии, замороженной при -80°С. REV 2 - это 0,9 мл вирусной суспензии, разбавленной и центрифугированной при таких же условиях, как и образцы REV 7 и Противовирусная активность БКФ в отношении энтеровируса полио 1 Титр вируса (КОЕ/мл) 15 30 Противовирусная активность БКФ в отношении вируса герпеса тип 2 Титр вируса (КОЕ/мл) Таблица 2 Массовая доля БКФ (%) (масса/объем) 0,02 0,01 0,005 15 Таблица 5 После контакта с бензалконийфторидом 106,98 107,56 Контроль Время контакта вирус/БКФ (минуты) Время контакта вирус/БКФ (минуты) 15 30 60 120 105,88 105,02 104,16 102,68 105,04 104,38 103,86 103,02 6,00 5,65 5,10 10 10 10 104,60 Эти исследования подтвердили противовирусную активность бензалконийфторида при следующи х концентрациях (масса/объем) и времени контакта: 0,01% в течение 30 мин против энтеровируса полио 1; 0,02% в течение 120 мин против аденовируса тип 5; 0,01% в течение 5 мин против вируса герпеса тип 1; 0,01% в течение 15 мин про 4 39970 REV 8, с целью определения утраты инфективности во время центрифугирования REV 3.1 соответствуе т 0,9 мл вир усной суспензии, оставленной при комнатной температуре на 60 мин (максимальная продолжительность исследования), затем разбавленной в буфере NTE и центрифугированной аналогичным образом с целью определения утраты инфективности в экспериментальных условиях использования БКФ. Образец REV 4, содержащую 1 мл раствора, БКФ с концентрацией 20 мкг/мл, разбавленного в 10 мл буфера NTE и центрифугированного в таких же условиях, как и другие вирусы, используют для контроля возможной токсичности на клетках тестов инфективности в результате того, что при центрифугировании могут оставаться следы продукта. Поэтому этот образец использован как отрицательный показатель, у которого клетки теста инфективности - не инфицированы. Более точно, исследования преследовали цель - определить остаточную инфекционную способность образцов вируса, обработанных на активированных РВМС лимфоцитах человека. Для этого предварительно стимулированные лимфоциты инкубировали с 1 мл каждого образца обработанного или необработанного вируса, разбавленного в отношении 10:10 (10-4-10-7 для положительных показателей и 10-1-10-5 для образцов об работанных вирусов). Клетки центрифугировали и ресуспендировали в 106 клетках на миллиметр в питательной среде полного состава. Каждые три или четыре дня клетки считали, пересевали и уцелевшие оставляли хранить при -80°С. После анализа результатов осуществляли второй этап подобным образом, причем клетки инокулировали половиной растворов образцов вирусов, обработанных БКФ. Впоследствии измеряли активность обратной транскриптозы (07) на сохраненной уцелевшей клеточной культуре. Уцелевшую к ультур у на каждом этапе (дни 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24 на первом этапе и дни 3, 6, 9, 13, 16 и 20 на втором) испытали и активность обратной транскриптозы распределили по концентрациям в результате центрифугирования. С помощью метода Elisa "Sandwich" на ту же культур у дней 3, 10, 17 и 24 первого этапа и дней З, 9, 16 и 20 второго этапа после инокулирования клеток дозировано применили антиген Р25 вируса ВИЧ-1. Для этого использовали комплект ELAVTA Аg1, выпускаемый фирмой Societe Diagnostics Pasteur. Было отмечено, что контрольные образцы REV 4 не токсичны для клеток теста токсичности. В табл. 6 представлены показатели активности обратной транскриптoзы для соответствующих образцов. Таблица 6 Испытание противовирусной активности БКФ на первичной культуре активированных лимфоцитов человека Титрование при разбавлении образцов вирусов по видам обработки Образец Разбавление 10-4 10-5 10-6 10-7 REV 2 показатель 10-4 центрифугирова10-5 ния 10-6 REV 3 экспери10-4 ментальный пока10-5 затель 60 мин, 10-6 Неинфицированные клетки REV 1 положительный показатель 3 391 1354 335 490 285 713 308 203 572 440 247 7 4304 1786 652 1121 590 294 351 582 505 339 258 Активность ОТ по дням (кл/мл*) 10 14 17 21 26311 47192 5529 888 5417 36738 8450 7157 2459 38850 23062 5611 6521 5940 2313 1014 1345 9772 4075 1888 296 555 9348 12302 414 326 3509 1568 569 8425 3703 3778 577 1395 3155 12243 1165 1250 714 653 363 291 630 568 24 712 3854 3368 1370 2083 5043 653 4559 4607 994 366 Примечание: * - кл/мл: активность обратной транскриптазы (ОТ) в 1 мл уцелевшей культуры. Вирусная продуктивность считается положительной при активности ОТ выше 5000 (показатель приблизительный). Из табл. 6 следуе т, что через 14 дней клетки, инокулированные растворами с разбавлением меньше или равным 10-7 образца REV 1 или 10-4 образцов REV 2 и REV 3.1, имеют заразные частицы на уцелевших клетках культуры. В условиях эксперимента титр вируса определяли как величину обратную величине последнего разбавления, полностью инфекционного (100%). Титры показательных образцов соответственно были такие: 107 МЕ/мл для REV 1 и 104 МЕ/мл для REV 2 и REV 3.1. Снижение инфекционного титра показано в экспериментальных показателях. Это снижение есть логарифмический коэффициент порядка 3 для показателя центрифугирования и для показательного вируса, оставленного на один час при температуре окружающей среды и подвергнутого центрифугированию. На фиг.1 показано, что активность обратной транскриптазы не обнаружена на уцелевших клетках культур, инокулированных образцами вируса, обработанного БКФ в течение 30 мин или 60 мин с разбавлением 1/10. Эти результаты сравнимы с результатами, полученными для REV 3.1, где инфекционный титр составлял 104 МЕ/мл. С уче том этих результатов на втором этапе РВМС лимфоциты инокулировали разбавленными в отношении 1/2 образцами вируса, обработанными БКФ с целью подтверждения отсутствия инфекционного вируса в образцах. Результаты дозирования активности ОТ уцелевших клеток куль 5 39970 туры представлены в табл. 2. При том, что образец вируса REV 3.1 подтвержден как положительный при разбавлении 10-5 активность ОТ не была выявлена. На фиг. 3 приведены результаты дозирования антигена Р25 в образцах показательных вирусов. Количество антигена Р25 выражено через пг/мл и оценено с помощью эталонной кривой, полученной по контрольному раствору антигенов, поставляемому производителем. Титры, проверенные через 16 дней после инфицирования, показали для REV 1·10 7 МЕ/мл, для REV 2·10 5 МЕ/мл и для REV 3.1·104 МЕ/мл. На фиг. 4 представлено дозирование антигенов Р25 на уцелевших клетках лимфоцитов, инкулированных разбавленными 1/2 образцами вируса, обработанного БКФ. Образцы REV 7 и REV 8 реагируют на антиген Р25 отрицательно. Следовательно, эти результаты подтверждают и уточняют результаты, полученные в результате вирусного проявления при дозировании активности обратной транскриптазы на уцелевших клетках культур, инфицированных обработанным или необработанным вирусом. Поэтому эти исследования свидетельствуют о том, что концентрация 20 мкг/мл бензалконийфторида вызывает утрату инфекционной способности вирусом ВИЧ-1 in vitro на логарифмический коэффициент, равный 5, для активированных лимфоцитов человека. Следовательно, бензалконийфторид в концентрации 20 мкг/мл проявляет противовирусн ую активность в отношении СПИДа in vitro. Пример 3 Местн ую или общую толерантность к внутривенному введению бензалконийфторида испытали на собаках. Двух гончих, самца и самку, зарегистрированной массой тела около 10 кг, в возрасте 6 мес., здоровых, очищенных от паразитов и вакцинированных поместили в виварий. Они получали вн утривенно 2 мг в день на килограмм массы тела бензалконийфторид, разбавленный до концентрации 2,10 г/л в изотоническом растворе стерильного апирогенного хлористого натрия. Раствор расфасован в ампулах по 10 мл и его вводят в виде инъекций по 0,95 мл на килограмм в день поочередно в вену каждой конечности. Инъекции выполняли пластмассовыми шприцами, снабженными микроапликационными насадками, путем замедленного введения приблизительно в течение одной минуты и тридцати секунд. Эксперимент длился 28 дней. Анализ мочи брали в начале эксперимента, в средине (через 24 дня) и в конце. Таким же образом, в начале, через 14 дней и через 28 дней эксперимента брали кровь в области шеи. Кровь подвергали гематологическим исследованиям и полным биохимическим исследованиям. После завершения эксперимента животных умертвили и провели анатомопатологические исследования и взвешивание таких органов: печени, почек, селезенки, яичек, яичников тимуса, щитовидных желез. Были также проведены гистологические исследования большинства жизненно важных органов. После введения бензалконийфторида не были обнаружены какие-либо симптоматические отклонения. В течение первых двух недель инъекции проводили без осложнений. Затем появился отек. Масса тела животных оставалась неизменной в течение эксперимента. Ректальная температура у самца оставалась неизменной, а у самки повысилась на 1°C. Не наблюдали каких-либо заметных отклонений в кровяном давлении и частоте пульса. Различные электрокардиографические параметры оставались неизменными в течение всего эксперимента. Анализ мочи самки не выявил каких-либо следов гемолиза ни в начале, ни в средине, ни в конце эксперимента. У самца в начале эксперимента в моче присутствовало значительное количество крови. Собаку поместили в клетку для исследования диуреза, где она была 48 часов. В конце 48часового периода анализ мочи не показал присутствия крови, следов кетонных частиц, глюкозы и следов белков. Содержания натрия и калия показали изменения у самца, но оставались почти неизменными у самки. В конце эксперимента кровь в моче, взятой из мочевого пузыря самца в момент вскрытия, не обнаружена. Среди гематологических параметров только количество лейкоцитов увеличилось через две недели у самки и через четыре недели у самца. Это увеличение совпадает с появлением отеков на лапе. Из биохимических параметров можно отметить повышение кислой фосфатазы и лактатдегидрогеназы. Другие значительные изменения не были отмечены. Гистологические исследования различных органов не выявили изменений в результате эксперимента, если не принимать во внимание местную реакцию на уколы. Следовательно, несмотря на жесткие условия эксперимента, не было проявлений заметной токсичности бензалконийфторида при внутривенных инъекциях. Пример 4 Остр ую токсичность бензалконийфторида при одноразовом введении мыши и морской свинке определили методом Беренса и Карбера, причем вводили интракардиально, внутривенно и внутрибрюшинно. В группу подопытных животных входили мыши-альбиносы и морские свинки-альбиносы подросткового возраста. Для одной вводимой дозы использовали десять животных: пять самок и пять самцов. Бензалконийфторид использовали в растворе с концентрацией 3 г/л в изотоническом растворе стерильного апирогенного хлористого натрия. Животных наблюдали в течение 7 дней после одноразового введения с помощью стерильной иглы со шприцом, градуированным в десятых долях миллиметра для того, чтобы каждому животному ввести точную дозу. Животны х взвешивали каждый день в период наблюдения. В эксперименте определили DL 50 (летальную дозу 50%). Результаты приведены в табл. 7. Из этого примера следует, что бензалконийфторид, вводимый внутривенно, внутрибрюшинно или интракардиально, - приемлемо малотоксичный, поэтому его можно назначать для интраваскулярного введения дозами, при которых он ак 6 39970 тивен, в частности, порядка от 20 до 23 мг на литр крови пациента. 2 месяца и 6 кг), больных острым прогрессирующим гастроэнтеритом также лечили замедленным введением двух инъекций с 12-часовым перерывом. У этих койотов гастроэнтерит сопровождался профузной транссудацией серозной жидкости. Смерть зафиксирована через два дня. За исключением трех неудачных опытов с очень молодыми животными, проявляющими острые симптомы заболевания, раствор согласно изобретению позволяет лечить собак от заболеваний, вызванных парвовирусом. Пример 6 Раствор согласно изобретению использовали для лечения собак от болезни Карре. Эта болезнь на сегодня считается смертельной и неизлечимой и вызывает ее вирус. Двенадцать собак лечили с использованием ампул по 10 мл раствора бензалконийфторида, вводя по 2,1 г/л на 20 кг массы животных. Инъекции делали 1 раз в день в течение 3 дней. Собакам также давали сопутствующее лечение (витамины, антибиотики, вакцины...). Лечение оказалось эффективным 7 животных, которые оказались здоровыми и полное выздоровление наступило через 18 дней. Среди 7 выздоровевших собак 5 были из своры, в которой 2 собаки сдохли к этому моменту и их состояние было очень серьезным. Они уже получили предварительное лечение, которое оказалось неэффективным. Заболевание выражалось следующими симптомами: гнойное выделение из ноздрей, кашель, понос, конъюнктивит, температура тела в среднем от 40 до 40,5°С. Лечение оказалась особо высокоэффективным. Пять других собак после лечения проявляли все симптомы нервного расстройства (общая дрожь) и лечение прекратили. Следовательно раствор согласно изобретению позволяет лечить случаи заболевания Карре, не сопровождаемые проявлениями нервного расстройства. Пример 7 Гемолитическую концентрацию бензалконийфторида определили in vitro на крови человека, морской свинки и кролика. Эксперимент провели в клинических усло виях при исследовании периферической анемии. При этом использовали разбавление растворов бензалконийфторида в отношении 3:1000, получив 300 мг/л, 150 мг/л и 75 мг/л в стерильном апирогенном изотоническом растворе хлористого натрия. Каждое из трех разбавлений смешивали в равных объемах с кровью 3-х образцов (человек, морская свинка и кролик). Смесь медленно перемешивали в течение 5 мин. затем центрифугировали в течение 3 мин. при 3500 об/мин. Гемолиз определили по красной окраске, а также по меньшей мере по всплывшей наверх плазматической массе темного цвета. Исследованные концентрации фактически содержали 150 млн -1 1,75 млн -1 и 3,5 млн -1. Каждое исследование продублировали. Без учета гемолиза с 37,5 мг/л новые опыты провели на 6 образцах крови человека в тех же условиях при содержании бензалконийфторида 20 мг/л и 35 мг/л. В табл. 8 представлены полученные результаты. Таблица 7 DL 50 (мг/кг) Самец мыши Самка мыши Самец морской свинки Самка морской свинки Внутривенное введение 33,24 36,6 Внутрибрюшинное введение 33,1 34,6 Интракордиальное введение 28,5 15,5 20,5 16,5 Пример 5 Испытания in vivo были проведены на собаках, зараженных парвовирусом. Этим собакам вводили замедленной перфузией бензалконийфторид С 14, растворенный с концентрацией 2,1 г/л в изотоническом растворе стерильного апирогенного хлористого натрия. Самцу немецкой овчарки массой 20 кг в возрасте восьми месяцев, зараженному парвовирусом (гастроэнтерит с дегидратацией, энтерит с профузной транссудацией серозной жидкости с большим содержанием мочевины) сделали две инъекции с интервалом 12 ч по две ампулы объемом 10 мл. Через 6 ч с начала лечения сразу была отмечена отличная переносимость лекарства и выздоровление собаки. Самка немецкой овчарки в возрасте 7 месяцев и массой тела порядка 10 кг, страдающей от парвовирусного заболевания около 4 дней (гастроэнтерит с дегидратацией, субкоматозное состояние, гемоконцентрация, значительные выделения мочевины, геморрагическая соль) сделали две инъекции с промежутком 12 ч. раствора согласно изобретению. Первая инъекция содержала 10 мл, вторая 20 мл. Соответствующий общий курс лечения длился 8 дней. Переносимость лечения оказалась отличной. Поскольку собака в начале лечения находилась в очень серьезном состоянии, полное выздоровление наступило только через 20 дней. Самца породы новый терьер в возрасте 6 месяцев и массой тела около 28 кг, зараженного парвовирусом, также лечили с помощью двух инъекций по 10 мл через 12 часов замедленным введением. Под конец второго дня кровь в моче не наблюдали, у собаки больше не было рвот. Под конец четвертого дня животное стало принимать пищу. На 18-й день было отмечено полное выздоровление. Самку породы роттвейлер в возрасте 4 месяца и массой тела 15 кг, зараженную парвовирусом, лечили так же. Полное выздоровление было отмечено к исходу 18-го дня. Такой же курс лечения применили к самке породы немецкий пойнтер в возрасте 2 месяцев и массой тела около 12 кг. Было отмечено такое же выздоровление (возобновление приема пищи на 4-й день и полное выздоровление подтверждено на 18-й день). Трех койотов (самца возраста 4 месяцев и массой тела 12 кг; самца, 4 месяца и 7 кг; самку, 7 39970 Таблица 8 Морская свинка Кролик Человек поносов, повышение массы тела (59,6 кг). Больной мог вставать с постели и ходить. Мужчина в возрасте 44 лет, массой тела 78 кг имел следующие симптомы: астения, анарексия, бессонница, температура 39,7°С, анализы ELISA и WESTERN BLOT положительные, число CD4 650. Пациента лечили с помощью замедленных внутривенных инъекций 50 мл бензалконийфторида С14 по 2,1 г/л, повторяя через 8 ч, в течение 3 дней с сопутствующим лечением с помощью антибиотиков (на базе Doxycycline) по 2 желейные капсулы каждый вечер. На шестой день после начала лечения температура спала. Через 2 месяца после начала лечения было отмечено прогрессирующее исчезновение астении. На 4-м месяце общее состояние пациента пришло в норму и он возвратился к службе в армии. Мужчина в возрасте 42 лет, массой тела 52 кг имел следующие симптомы: астения, анарексия, усиленное потоотделение, прикорневой лимфаденит, поносы, сильные головные боли, кандидозный стоматит, температура 39°С, анализы ELISA и WESTERN BLOT положительные, число CD4 200. Пациента лечили одноэтапно в течение 3 дней замедленным введением внутривенно бензалконийфторида С14 по 2,1 г/л все 12 ч. К 3-му дню отмечено нетто падение температуры. Через 3,5 месяца после начала лечения общее состояние пациента удовлетворительное, масса тела 56 кг, число CD4 поднялось до 700, клинические симптомы не выявлены. Пример 9 Активность in vitro бензалконийфторида определили на mycobacterium tuberculosis (естественный препарат). Этот эксперимент провели путем пропитки поверхности среды BOWEINSTEIN JENSEN. Количество активного вещества, погло щенного средой, выражено в см 2. Объем использованного раствора бензалконийфторида составлял 0,25 мл на пробирку среды для достижения массовой доли бензалконийфторида 0,1, 0,2 и 0,3 % на поверхность в см 2 среды BOWEINSTSIN JENSEN. Контрольную пробирку без бензалконийфторида использовали в каждой серии эксперимента. Три серии опытов были проведены с разбавлениями 0,1, 0,01 и 0,001 маточного раствора препарата Bacterium Tuberculosis с концентрацией 1 мг/мл. Все опыты были продублированы. Через 4 недели инкубационного периода при 37°С было выявлено подавление культуры бензалконийфторидом, массовая доля которого на поверхность в см 2 среды BOWEINSTEIN JENSEN составляла 0,1, 0,2 и 0,3 %. Эти результаты были подтверждены в трех разбавлениях (0,1, 0,01 и 0,001) маточной культуры Bacterium Tuberculosis. В табл. 9 приведены полученные результаты. Концентрации бензалконийфторида (млн.-1 или мг/л) 6 образцов 150 75 37,5 35 20 **** * 0 *** * 0 ** * 0 0 0 Примечание: от * до **** - степень красной окраски в результате гемолиза Следовательно, бензалконийфторид при концентрации равной или ниже 20 мг/л не вызывает гемолиза крови человека/ причем с большим запасом. Согласно изобретению, можно легко проверить до инъекции гемолитическую концентрацию бензалконийфторида на крови пациента. Пример 8 Болезни типа СПИДа в стадии прогрессирования или в терминальной стадии лечили с помощью раствора, содержащего 2,1 г/л бензалконийфторида. До инъекции определяли гемолитическую концентрацию бензалконийфторида и уточняли насколько она выше используемого раствора. Мужчина в возрасте 37 лет, масса тела 70 кг проявлял следующие симптомы: астению, общее ослабление организма, кандидозный стоматит, температура 39,7°С, показатели анализов ELISA (иммуносорбентный анализ ферментной меткой) и WESTERN BLOT (вестернблотирование для идентификации) положительные, число CD 4 (рецепторы на поверхности Т-лимфоцитов, ответственные за регулирование иммунного ответа) ниже 200 (нормальный показатель порядка 1000). Пациента лечили с помощью замедленных вн утривенных инъекций 50 мл бензалконийфторида С 14 по 2,1 г/л, повторяя через 12 ч, в 2 этапа по 3 дня с перерывами 5 дней на обследование. Несмотря на боль в месте введения шприца, появившуюся в конце 2-го этапа, наблюдения через месяц и 7 месяцев после лечения показали общее хорошее состояние пациента, который приступил к работе. Число CD4 поднялось до 600. Мужчина в возрасте 28 лет, массой тела 57 кг имел следующие симптомы: астения, общее ослабление организма, рвоты, понос, кандидозный стоматит, температура 39,5°С, общее состояние крайне неудовлетворительное, анализы ELISA и WESTERN BLOT положительные, число CD 20. Пациента лечили в 2 этапа по 3 дня, как указано выше. На 10-й день после начала лечения было отмечено нетто улучшение общего состояния, снижение температуры, исчезновение рвоты и 8 39970 Таблица 9 Контроль БКФ 0,1 %/см 2 БКФ -0,2 %/см 2 БКФ -0,3 %/см 2 БК 0, 1 (+++) (-) (-) (-) БК 0,1 (+++) (-) (-) (-) БК 0,01 (+++) (-) (-) (-) БК 0,01 (+++) (-) (-) (-) БК 0,001 (+++) (-) (-) (-) Примечание: (+++) - культура с наличием роста, (-) - культура без наличия роста. Фиг. 1 9 БК 0,001 (+++) (-) (-) (-) 39970 Фиг. 2 10 39970 Фиг. 3 11 39970 Фиг. 4 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 12