Стабільна водна композиція наталізумабу та спосіб її отримання

1. Стабільна водна фармацевтична композиція, яка включає від 0,1мг/мл до 200мг/мл наталізумабу, від 0,001% до 2,0% (мас./об.) полісорбату 80, фосфатний буфер і хлорид натрію, і яка має рН від приблизно 5,5 до приблизно 6,5. 2. Композиція за п.1, в якій полісорбат 80 присутній у кількості приблизно 0,02% (мас/об.). 3. Композиція за п.1, в якій наталізумаб присутній у кількості від приблизно 0,1мг/мл до приблизно 150мг/мл. 4. Композиція за п.1, в якій наталізумаб присутній у кількості від приблизно 0,1мг/мл до приблизно 100мг/мл. 5. Композиція за п.4 , в якій наталізумаб присутній у кількості від приблизно 1,7мг/мл до приблизно 50мг/мл. 6. Композиція за п.4, в якій наталізумаб присутній у кількості приблизно 5 мг/мл. 7. Композиція за п. 4, в якій наталізумаб присутній у кількості приблизно 20мг/мл. 8. Композиція за п.1, де композиція знаходиться в фіксованому об'ємі, і наталізумаб присутній у кількості приблизно 50мг/мл. 9. Композиція за п.1, в якій полісорбат 80 присутній у кількості приблизно 0,02% (мас/об.), і де композиція стабільна при температурі від приблизно 2°С до приблизно 8°С протягом щонайменше 6 місяців. 10. Композиція за п.9, в якій наталізумаб присутній у кількості від приблизно 20мг/мл до приблизно 150. 2 (19) 1 3 82685 4 єнту терапевтично ефективної комбінації композиції за будь-яким з пп.1-13, 20-21 і сполуки або засобу для лікування цього стану. 24. Застосування стабільної композиції за будьяким з пп.1-13, 20-21 для одержання лікарського препарату для лікування патологічного стану, опосередкованого альфа-4 інтегрином у пацієнта, де лікарський препарат є ефективним для лікування вказаного стану. 25. Застосування стабільної композиції за будьяким з пп.1-13, 20-21 для одержання лікарського препарату для лікування патологічного стану, опосередкованого альфа-4 інтегрином у пацієнта, де лікарський препарат є комбінацією композиції за будь-яким з пп.1-13, 20-21 і сполуки або засобу для лікування, і де вказаний лікарський препарат є ефективним для лікування вказаного стану. Винахід відноситься до стабільних, концентрованих композицій білків або антитіл, таких як наталізумаб, у яких зберігається активність антитіла, і які також можуть вводитися в невеликому об'ємі суб'єкту з станами різної тяжкості, що потребує цього. Композиції антитіл і білків відомі в галузі техніки. Однак, отримання білкових композицій, таких як композиції антитіл, які є хімічно і біологічно стабільними, здатне викликати складності. Отримання композицій, які також не тільки стабільні, але можуть зберігати невеликий об'єм (тобто дозволяючи ін'єкцію невеликого об'єму) навіть з підвищеною концентрацією білка, такого як антитіло, також є проблематичним. Існує необхідність в таких композиціях. Наприклад, концентровані кількості білка в фіксованому об'ємі, який також є стабільним, будуть особливо корисними пацієнтам з мінливою масою. Введення рідин пацієнтам з мінливою масою може, наприклад, мати побічні реакції. Розробці таких композицій перешкоджають самі білки або антитіла, які мають високу схильність до агрегації і осадження. Отже, незважаючи на те, про що раніше повідомлялося в літературі, існує необхідність в поліпшених способах отримання композицій білків і/або антитіл. Також існує необхідність в стабільних композиціях з великими концентраціями антитіла або білка, у яких зберігається активність антитіла або білка. Також необхідні стабільні композиції концентрованого білка, які зберігають фіксований об'єм. Заявники описують в даному описі стабільні комп:°чції, які далі можуть бути використані для отримання композицій антитіл, особливо композицій з високими концентраціями антитіл, які не осаджуються і є стабільними при зберіганні при рекомендованій температурі. Висококонцентровані і стабільні композиції антитіл істотно допоможуть лікарям в лікуванні суб'єктів з масою, що змінюється. Один аспект винаходу забезпечує стабільну водну фармацевтичну композицію, що включає імуноглобулін (або інший білок), фосфатний буфер, полісорбат і хлорид натрію. Переважно полісорбатом є полісорбат 80, переважно в кількості від близько 0,001% до близько 2,0%(мас/об.). Найбільш переважно полісорбат присутній в кількості близько 0,02%. В іншому варіанті втілення винаходу, імуноглобулін або інший білок присутній в композиції в кількості від близько 0,1мг/мл до близько 200мг/мл. Переважно композиція забуферена до рН від близько 3,0 до близько 7,0 і найбільш переважно близько 6,0±0,5. Композиція є переважно ізотонічною. Композиція може додатково містити гістидин. Переважно, гістидином є Lгістидин. В іншому аспекті винаходу, імуноглобуліном у вищезгаданій композиції є антитіло до альфа-4 інтегрину, таке як наталізумаб або інше гуманізоване антитіло або моноклональне антитіло. Таке антитіло може бути присутнім в стандартній кількості або в концентрованій кількості, наприклад, близько 15мг/мл або більше. Переважно, наталізумаб присутній в кількості від близько 20мг/мл до близько 150мг/мл. У випадках, коли композиція присутня в концентрації від близько 15мг/мл або більше, така композиція зберігається в фіксованому об'ємі, наприклад, близько 125мл. Наступною метою винаходу є забезпечення способу лікування пацієнта із станами різної тяжкості, терапевтичною кількістю імуноглобуліну, що включає введення композиції, як описано вище в даному описі, де стан лікують введенням композиції. Наступним аспектом винаходу є те, що стан є таким, який опосередкований альфа-4 інтегрином, і в таких умовах імуноглобулін є таким, що розпізнає і зв'язується з альфа-4-інтегрином, таким як наталізумаб. Наступний аспект винаходу забезпечує композицію, що включає фосфат натрію, полісорбат, білок і NaCl з рН 6,0±0,5, де композиція є стабільною при зберіганні при 5°С-8°С протягом тривалого періоду часу. Інший аспект винаходу забезпечує спосіб отримання стабільної композиції, яка містить білок, що включає змішування фосфату натрію, хлориду натрію, полісорбату і білка і доведення рН суміші фосфорною кислотою до близько рН 6,0±0,5. Білок може бути ліо філізований в композиції за даним винаходом. Полісорбатом є переважно полісорбат 80к, присутній в кількості близько 0,02% (мас/об.), і білком є переважно наталізумаб. Композиція, крім того, може включати гістидин. Переважно, білок ліофілізований в розчині, що містить 5мМ гістидину, 20мг/мл сахарози і 0,02% полісорбату 80 при рН 6, і білком є наталізумаб в концентрації 20мг/мл. Наступною задачею винаходу є забезпечення виробу, що включає контейнер, що містить стабільну композицію, описану вище і в цьому документі. Інший аспект винаходу забезпечує спосіб лікування пацієнта з станами різної тяжкості, що включає одночасне або послідовне введення пацієнту 5 82685 терапевтично ефективної комбінації композиції, описаної вище і в цьому документі, і сполуки або лікування, ефективного відносно стану. Наступною задачею винаходу є забезпечення застосування будь-якої з стабільних композицій, описаних в даному описі, для отримання лікарського препарату для лікування стану, де лікарський препарат є ефективним для лікування вказаного стану. Цей лікарський препарат може, крім того, включати другу сполуку або терапію для лікування стану. 1. Визначення Під назвою «білок» розуміють, включаючи, але не обмежуючись, імуноглобуліни, ферменти, рецептори і їх фрагменти. Хоч обговорення композиції забезпечене переважно відносно антитіла або імуноглобуліну, інші білки розглядаються як взаємозамінні в описаних композиціях. Під назвою «імуноглобулін» розуміють включаючи, але не обмежуючись, антитіла або фрагменти антитіла (такі як scFv, Fab, Fc, F(ab')2), та інші, створені методами генної інженерії, частини антитіл. В залежності від амінокислотної послідовності постійного домену їх важких ланцюгів, імуноглобуліни можуть бути віднесені до різних класів. Існують п'ять основних класів імуноглобулінів: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. Деякі з них можуть бути далі поділені на підкласи (ізотипи), наприклад, IgGl, IgG2, IgG3, і IgG4; IgAl i IgA2. Постійні домени важких ланцюгів, які відповідають різним класам імуноглобулінів, називаються альфа (a), дельта (d), епсилон (e), гамма (g) і мю (m), відповідно. Структури субодиниць і тривимірні конфігурації різних класів імуноглобулінів добре відомі. Переважно, імуноглобулін розпізнає і зв'язується з альфа-4 інтегрином. Термін «антитіло» використовується в широкому значенні і зокрема охоплює моноклональні антитіла (включаючи антитіла агоністи і антагоністи), композиції антитіл з політипною специфічністю, і фрагменти антитіл (наприклад, Fab, F(ab')2, scFv і Fv), за умови, що вони проявляють бажану біологічну активність. «Антитіло» включає поліклональні антитіла, моноклональні антитіла, гуманізовані антитіла, людські антитіла, приматизовані® антитіла та інші антитіла, отримані за допомогою генно-інженерних те хнологій. Термін «моноклональне антитіло», як використовується в даному описі, відноситься до антитіла, отриманого з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, що складають популяцію, є ідентичними, за винятком можливих природних мутацій, які можуть бути присутніми в невеликих кількостях. Моноклональні антитіла є високоспецифічними, направленими відносно однієї антигенної ділянки. Більш того, в протилежність препаратам звичайних (поліклональних) антитіл, які звичайно включають різні антитіла, направлені відносно різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло направлене відносно окремої детермінанти на антигені. На додаток до їх специфічності, моноклональні антитіла є переваж ними в тому, що вони синтезуються системами експресії клітин ссавців або трансгенними способами, не забруднюючись іншими імуноглобуліна 6 ми. Наприклад, моноклональні антитіла для використання за даним винаходом можуть експресуватися у кіз, як [описано у Behboodi, et al. (2002) Transgenic cloned goats and the production of therapeutic proteins. In Principles of Cloning. Elsevier Science (USA); і Meade et al. (1999). Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals in Gene expression systems: using nature for the art of expression. J.M.Fernandez і J.P.Hoeffler ed., Academic Press.]. Визначення «моноклональний» вказує на характер антитіл0., як отриманого з переважно гомогенної популяції антитіл і не повинне тлумачитися як такий, що вимагає продукції антитіла будь-яким певним способом. Наприклад, моноклональні антитіла для використання згідно з даним винаходом можуть бути отримані способами, [описаними в Shepherd et al, Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (Oxford University Press, 2000)]. Термін «моноклональні антитіла» також включає «химерні» антитіла (імуноглобуліни) в яких частина важкого і/або легкого ланцюга є ідентичною або гомологічною відповідним послідовностям в антитілах, отриманих від певного виду або що належать до певного класу або підкласу антитіл, тоді як інша частина ланцюга(ів) є ідентичною або гомологічною відповідним послідовностям в антитілах, о триманих від інших видів або що належать до іншого класу або підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, за умови, що вони проявляють бажану біологічну активність. Наприклад, здатність зв'язуватися з альфа-4 інтегрином. «Моноклональні антитіла» також можуть бути виділені з бібліотек антитіл фагів з використанням методик, описаних, наприклад, [в Clackson et al, 1991 Nature 352: 624-628 і Marks et al, 1991 J. Мої. Biohf 222: 581-597]. «Гуманізовані» форми нелюдських (наприклад, мишачих, кролячих, бичачих, кінських, свинячих, і подібних) антитіл являють собою химерні імуноглобуліни, ланцюги імуноглобулінів або їх фрагменти (такі як Fv, Fab, Fab1, F(ab')2 або інші антиген-зв'язувальні послідовності антитіл), які містять мінімальну послідовність, отриману з нелюдського імуноглобуліну. У більшій частині гуманізовані антитіла являють собою людські імуноглобуліни (антитіла реципієнта) в яких залишки від ділянки, що визначає комплементарність (CDR) реципієнта замінені залишками з CDR нелюдських видів (донорські антитіла), таких як миша, щур або кролик, що мають бажану специфічність, афінність і ємність. У деяких випадках, залишки каркаса Fv людського імуноглобуліну заміщені відповідними нелюдськими залишками. Більш того, гуманізовані антитіла можуть включати залишки, які не виявляються ні в антитілі реципієнта, ні у CDR, що вноситься, або каркасній послідовності. Такі модифікації роблять для подальшого підвищення якості і оптимізації дії антитіла. Загалом, гуманізовані антитіла будуть включати по суті всі з щонайменше, одного і звичайно двох, доменів, що змінюються, в яких всі або по суті всі з ділянок CDR відповідають таким нелюдського імуноглобуліну і всі або по суті всі ділянки FR є такими узагальнюючої послідовності людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло оптимально 7 82685 також буде включати щонайменше, частину константної ділянки імуноглобуліну (Fc), звичайно людського імуноглобуліну. Вираз «лінійні антитіла» також включено в загальний термін «антитіло» і є парою тандему сегментів Fd (VH-CH1-VH-CH1), які утворюють пару антигензв'язувальних ділянок. Лінійні антитіла можуть бути біспецифічними або моноспецифічними. «Варіантне антитіло» (також включене в загальний термін «антитіло») являє собою молекулу, яка відрізняється в амінокислотній послідовності від амінокислотної послідовності «батьківського» антитіла шляхом додавання, видалення і/або заміщення одного або більше амінокислотних залишку(ів) в послідовності батьківського антитіла. У переважному варіанті втілення винаходу, варіант включає одне або більше заміщення(ень) амінокислот в одній або більше гіперваріабельній ділянці(ах) батьківського антитіла. Наприклад, варіант може включати, щонайменше, одне заміщення, наприклад, від близько одного до близько десяти, і переважно від близько двох до близько п'яти, в одній або більше гіперваріабельних ділянок батьківського антитіла. Звичайно, варіант буде мати амінокислотну послідовність, що має, щонайменше, 75%-ну ідентичність амінокислотної послідовності з послідовностями варіабельних доменів важких або легких ланцюгів батьківського антитіла, більше переважно, щонайменше, 80%-ну, більш переважно, щонайменше, 85%-ну, більш переважно, щонайменше, 90%-ну, і найбільш переважно, щонайменше, 95%-ну. Ідентичність або гомологія відносно цієї послідовності визначається в даному документі як процентне відношення амінокислотних залишків послідовності-кандидата, яке ідентичне залишкам батьківського антитіла, після розпрямлення послідовностей і вставки проміжків, якщо необхідно, для досягнення максимального процента ідентичності послідовності. Жодне з Nкінцевих, С-кінцевих, або внутрішніх подовжень, видалень або вставок в послідовність антитіла не повинне тлумачитися як таке, що впливає на ідентичність або гомологію послідовності. Для аналізу таких властивостей, необхідно порівняти Fab форму варіанту з Fab формою батьківського антитіла або форму антитіла повної довжини з формою повної ловжини батьківського антитіла, наприклад, оскільки було виявлено, що вид антитіла впливає на його активність в дослідженнях біологічної активності, описаних в цьому описі. Варіантним антитілом, що представляє цікавість, є таке, яке проявляє, щонайменше, близько 10 кратне, переважно, щонайменше, 20 кратне, і найбільш переважно, щонайменше, близько 50 кратне збільшення біологічної активності в порівнянні з батьківським антитілом. «Батьківським» є таке, яке закодоване амінокислотною послідовністю, що використовується для отримання варіанту. Переважно, батьківське антитіло має ділянку людської мережі і має постійну ділянку(ки) людського антитіла. Наприклад, батьківським антитілом може бути гуманізоване або людське антитіло. «Виділене антитіло» являє собою таке, яке було ідентифіковане і виділене і/або витягнуте з 8 компонента його природного навколишнього середовища. Забруднюючими компонентами його природного навколишнього середовища є речовини, які втручаються в діагностичне або лікувальне застосування антитіла, і можуть включати ферменти, гормони та інші білкові або небілкові розчини. У переважних варіантах втілення винаходу, антитіло очищене (1) до більш ніж 95% по масі антитіла, що визначають методом Лоурі, і найбільш переважно більш ніж до 99% по масі, (2) до ступеня, достатнього для отримання, щонайменше, 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності при використанні секвенатора з видавлювальною чашею, або (3) до гомогенності по SDS-PAGE в відновлювальних або не відновлювальних умовах з використанням блакитного Кумасі або, переважно, срібного барвника. Виділені антитіла включають антитіла in situ в рекомбінантній клітині, оскільки, щонайменше, один компонент природного навколишнього середовища антитіла не буде присутнім. Звичайно, однак, виділене антитіло отримують, щонайменше, однією стадією очищення. «Фрагменти антитіла» включають частину інтактного антитіла, звичайно антиген-зв'язувальну або варіабельну ділянку інтактного антитіла. Приклади фрагментів антитіл включають фрагменти Fab, Fab', F(ab')2, і Fv; діатіла; лінійні антитіла; одноланцюгові молекули антитіл; і мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. «Одноланцюгові Fv» або фрагменти антитіл «sFv» включають домени антитіл VH і VL, де ці домени присутні в одному поліпептидному ланцюжку. Звичайно, поліпептид Fv, крім того, включає поліпептидну зв'язувальну ланку між доменами VH і VH, яка дозволяє sFv утворювати бажану структуру для зв'язування антигену. Термін «діатіла» відноситься до невеликих фрагментів антитіл з двома антиген-специфічними ділянками, такі фрагменти включають варіабельний домен важкого ланцюга (VH), зв'язаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) в тому самому поліпептидному ланцюжку (VH-VL). При використанні зв'язувальної ланки, яка є дуже короткою, щоб дозволити утворити пару між двома доменами на одному ланцюгу, домени вимушені утворювати пару з комплементарними доменами іншого ланцюга і утворювати дві антигензв'язувальні ділянки. Шлях введення антитіл знаходиться відповідно до відомих методів і добре відомий і може включати, наприклад, ін'єкцію або інфузію внутрішньовенним, інтраперитонеальним, внутрішньомозковим, внутрішньом'язовим, внутрішньоочним, внутрішньоартеріальним шляхами або введенням в місце пошкодження або за допомогою систем з уповільненим вивільненням. Антитіла можуть вводитися безперервно інфузією або болюсною ін'єкцією. Терапевтичні композиції антитіл звичайно вміщують в контейнер, що має стерильний порт для експлуатації, наприклад, пакет або флакон з внутрішньовенним розчином, що має заглушку, яка проколюється підшкірною ін'єкційною голкою. «Фармацевтично прийнятні» ексципієнти (наприклад, розчинники, добавки) являють собою такі, які можуть прийнятно вводитися су 9 82685 б'єкту ссавцеві для отримання ефективної дози активного інгредієнта, що застосовується. «Стабільною» композицією є така, в якій білок переважно зберігає свою фізичну стабільність і/або хімічну стабільність і/або біологічну активність при зберіганні. Під «стабільною» також позначають композицію, яка проявляє невеликі або не виявляє ознак нестабільності, включаючи агрегацію і/або дезамідування. Наприклад, композиції, що забезпечуються даним винаходом, можуть залишатися стабільними протягом, щонайменше, двох років при зберіганні, як вказано, при температурі 5-8°С. Різні аналітичні методики для вимірювання стабільності білка доступні в галузі техніки і [описані в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301 (Vincent Lee ed., New York, N.Y., 1991) і Jones, 1993 Adv. Drug Delivery Re v. 10: 29-90], наприклад. Стабільність може бути виміряна при обраній температурі протягом обраного періоду часу, як показано представленими прикладами. Зберігання стабільних композицій, якщо це переважно, допустиме протягом, щонайменше, 6 місяців, більш переважно 12 місяців, більш переважно 12-18 місяців, і більш переважно протягом 2 або більше років. Білок, такий як антитіло або його фрагмент, «зберігає свою фізичну стабільність» в фармацевтичній композиції, якщо він не проявляє ознак агрегації, осадження, дезамідування і/або розкладання при візуальній оцінці кольору і/або прозорості, або оцінкою по розсіюванню УФ або хроматографією з витісненням по розміру. Білок «зберігає свою хімічну стабільність» в фармацевтичній композиції, якщо хімічна стабільність в заданий час є такою, що білок розцінюється як такий, що все ще зберігає свою біологічну активність. Хімічна активність може бути оцінена визначенням і кількісною оцінкою хімічно змінених форм білка. Хімічна зміна може включати модифікації розміру (наприклад, зрізання), яка може бути оцінена з використанням хроматографії з витісненням по розміру, SDS-PAGE і/або масспектрометрією з іонізацією лазерною десорбцією в матриці з часопролітним мас-аналізом (MALDI/TOF MS), наприклад. Інші типи хімічних змін включають зміни заряду (наприклад, що з'являються як результат дезамідування), які можуть бути оцінені, наприклад, іон-обмінною хроматографією. Антитіло «зберігає свою біологічну активність» в фармацевтичній композиції, якщо біологічна активність антитіла в заданий час знаходиться в межах 10% (з помилками аналізу) біологічної активності, що проявляється в момент часу, коли фармацевтичну композицію отримували, що визначали в аналізі зв'язування антигену, наприклад. Під «ізотонічним» мають на увазі, що композиція, що цікавить, має переважно такий самий осмотичний тиск, як і людська кров. Ізотонічні композиції звичайно мають осмотичний тиск від близько 250 до 350мОсм. Ізотонічність може бути виміряна з використанням осмометра типу тиску пари або заморожування льоду, наприклад. Як використовується в даному описі, «буфер» відноситься до буферного розчину, який протидіє 10 змінам рН дією його кислотно-основних зв'язаних компонентів. Буфер за даним винаходом має рН в діапазоні від близько 3,0 до близько 7,5; переважно від близько рН 4,0 до близько 7,0; більш переважно від близько рН 5,0 до близько 6,5; і найбільш переважно має рН близько 6,0±0,5. рН будь-якого значення між вищезгаданими діапазонами також розглядається. У фармакологічному значенні, в контексті даного винаходу, «терапевтично ефективна кількість» антитіла відноситься до кількості, ефективної для запобігання або лікування розладу, для лікування якого антитіло є ефективним. «Розладом» є будь-який стан, на який вплине позитивним чином лікування антитілом або білком. Воно включає гострі або хронічні розлади або захворювання, включаючи такі патологічні стани, які схиляють ссавця до розладу, що розглядається. «Лікування» відноситься і до терапевтичного лікування і до профілактичних або превентивних заходів. Ті, хто потребують лікування, включають тих, які вже мають розлад, а також тих, у яких розлад попереджають. «Консервант» являє собою сполуку, яка може бути включена в композицію, щоб істотно зменшувати в ній бактеріальну дію, таким чином сприяючи отриманню композиції для багатократного використання, наприклад. Приклади потенційних консервантів включають хлорид октадецилдиметилбензинамонію, хлорид гексаметонію, хлорид бензалконію (суміш хлоридів алкілбензилдиметиламонію, в яких алкільні групи є довголанцюговими сполуками), і хлорид бензетонію. Інші типи консервантів включають ароматичні спирти, такі як фенол, бутиловий і бензиловий спирт, алкілпарабени, такі як метил або пропілпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол і м-крезол. Під «пацієнтом» або «суб'єктом» мають на увазі включення будь-якого ссавця. «Ссавець», який зазнає лікування, відноситься до будь-якої тварини, класифікованої як ссавець, включаючи, але не обмежуючись, людей, домашніх і сільськогосподарських тварин і тварин із зоопарку, спортивних і кімнатних, таких як собаки, коні, кішки, корови і подібні. Переважно, ссавцем є людина. Під «Antegren®» позначають включення антитіла, також відомого як AN 100226 (кодовий номер антитіла) або наталізумаб (назва USAN). Наталізумаб являє собою рекомбінантне, гуманізоване антитіло до альфа-4 інтегрину. Переважно захворюванням або станом, що піддається лікуванню у ссавця, є таке, коли вводять терапевтично ефективну дозу наталізумабу. «Стабільною» позначають композицію, яка проявляє мало або не проявляє взагалі ознак нестабільності, включаючи агрегацію і/або дезамідування. Крім того, «стабільна» також може відноситися до композиції, яка не проявляє будь-яких ознак нестабільності протягом більш ніж або рівно двох років, при зберіганні як вказано. 2. Загальний опис В описі нижче і в наступних прикладах описані композиції для стабільних композицій антитіл. Певні описані стабільні композиції мають високі кон 11 82685 центрації антитіл, але зберігають фіксований об'єм, де антитіла в таких композиціях є стабільними і антитіла не осаджуються з розчину або не агрегують. Білки, інші, ніж антитіла, також розглядаються для композицій з високою концентрацією. Антитіла звичайно вводяться суб'єкту (наприклад, людині) в концентрації від близько 0,01мг/мл до близько 200мг/мл. Більш типово, антитіла варіюють в концентрації від близько 0,1мг/мл до близько 150мг/мл. Однак, існують обставини, при яких більш високі концентрації необхідно вводити пацієнту, наприклад, від близько 15 до близько 200мг/мл, більш переважно від близько 15мг/мл до 150мг/мл, більш переважно від близько 20 до близько 50мг/мл, і найбільш переважно від близько 20мг/мл і будь-яке ціле значення між цими показниками. Композиції антитіл можуть вводитися ссавцеві, що потребує лікування білком, відповідно до відомих методів. Такі методи включають, але не обмежуються, внутрішньовенне введення у вигляді болюсу або безперервної інфузії протягом періоду часу, вн утрішньом'язового, інтраперитонеального, внутрішньоспинномозкового, підшкірного, внутрішньосуглобового, інтрасиновіального, інтратекального, перорального, місцевого або інгаляційного шляхів. У переважних варіантах втілення винаходу, композицію антитіла вводять ссавцеві внутрішньовенним введенням. Відповідна доза білка буде залежати, наприклад, від стану, що піддається лікуванню, тяжкості і перебігу стану, того, чи вводиться білок з превентивною або терапевтичною метою, попередньої терапії, клінічної історії пацієнта і відповіді на білок, типу білка, що використовується, і вибору лікуючого лікаря. Білок відповідно вводять пацієнту в один момент або протягом ряду введень і може вводитися пацієнту в будь-який час після постановки діагнозу. Білок може вводитися у вигляді єдиного лікування або в поєднанні з іншими лікарськими засобами або лікуванням, застосовним в лікуванні стану, що розглядається. Як використовується в даному описі, два (або більше) агенти можна вводити в комбінації, коли два агенти вводять одночасно або вводять незалежно таким чином, що агенти діяли одночасно. У застосуванні способів за даним винаходом, сполуки за даним винаходом можуть використовуватися окремо або в комбінації, або в комбінації з іншими 12 терапевтичними агентами. У певних переважних варіантах втілення, сполуки за даним винаходом можуть вводитися спільно з іншими сполуками, що звичайно приписуються для таких станів відповідно до загальноприйнятої медичної практики. Наприклад, композиції за даним винаходом можуть вводитися в комбінації з іншими терапевтичними агентами або фізичними методами лікування для лікування ревматоїдного артриту, розсіяного склерозу і хвороби Крона. 2.1 Спосіб отримання композиції антитіл Спосіб може бути змінений, як відомо фахівцеві в галузі техніки, але звичайно слідує методиці, такій як наступна. Отримували ампулу з банку робочих клітин, яка містила клітини, які виробляли антитіло або білок, які представляють цікавість. Отримували інокулят. Культивували або ферментувати клітини з додатковим підживленням, як необхідно. Збирали/очищали клітини центрифугуванням і/або фільтрацією. Це можна було зробити, наприклад, концентруванням клітин в 10 разів через спірально-укладений фільтр. Фільтрували через 0,2мкм проміжний фільтр, після фільтрації слідувало очищення з допомогою Protein A Sepharose Fast Flow® (тобто, афінна хроматографія) і зворотна елюція. Композицію, що містить антитіло, потім обробляли при рН 3,6-3,7. Потім суміш піддавали вірусній фільтрації, потім виконували стадію концентрування/діафільтрації. Потім композиція могла бути очищена з допомогою DEAE Sepharose Fast Flow® (аніонообмін). Цю стадію можна повторювати декілька разів. З цього моменту композицію далі концентрували стадією очищення з використанням системи Sephacryl S300HR® (тобто, гель-хроматографія), де використовуваним буфером є фосфат/NaCl. Композицію, що містить антитіла, можна було далі концентрувати для отримання композицій з високою концентрацією (наприклад, 20мг/мл або більше), якщо бажано. Композицію, що містить антитіла, потім далі буфер ували і концентрацію доводили додаванням 0,02% (мас/об.) полісорбату 80. Цю композицію потім піддавали кінцевій фільтрації з використанням фільтра 0,2мкм, і її можна було розподілити на цій стадії в 100мл-10л поліпропіленові бутлі. Таким чином отримані антитіла або імуноглобуліни потім могли бути піддані контролю якості (КК) і реалізовані з гарантією якості (ГК). Вищезгадане може бути зроблено, наприклад, для наталізумабу, як схематично представлено нижче: 13 82685 2.2. Композиція антитіл В одному аспекті винаходу імуноглобулін рецептують в концентраціях близько 1,7, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 40,0 або 50,0мг/мл в 10мМ фосфа ту натрію, 140мМ NaCl (pH 6,0±0,5) і 0,02% Компонент Функція 14 полісорбату 80. Якщо необхідно, рівень рН доводять до 6,0±0,5 фосфорною кислотою. Один приклад різних композицій показаний нижче. Кількісна композиція: композиція фосфатного буфера Одиниця композиції (на мл) 1,7мг/мл Активний інгредієнт: Гуманізоване моноклональне анАктивний 1,7мг титіло анти-a4-інтегрин Інші інгредієнти Фосфат натрію, USP Буфер і тонічність 1,4мг Хлорид натрію, USP Буфер і тонічність 8,2мг Фосфорна кислота, NF Доведення рН до 6,0±0,5 QS Полісорбат 80, NF Інгібує агрегацію білка 0,2мг Вода для ін'єкцій, USP Розріджувач QS до 1мл Одиниця композиції (на мл) 5,0мг/мл Одиниця композиції (на мл) 20мг/мл 5,0мг 20мг 1,4мг 8,2мг QS 0,2мг QS до 1мл 1,4мг 8,2мг QS 0,2мг QS до 1мл 15 82685 16 Будь-яка з вищезгаданих композицій є оптимально розлитою в асептичний флакон. Такими флаконами можуть бути, наприклад, нейтральні скляні флакони типу І ЕР (наприклад, 5,0 або 20мл закупорювані флакони) з пробками з сірого бутил каучуку Helvoet Pharma V9145/FM 157/1 з алюмінієвими ковпачками. Однак, інші відповідні асептичні флакони також розглядаються. Наприклад, композиції можуть бути розлиті в бутлі як зазначено нижче: Точніше, наталізумаб отриманий, наприклад, методикою, що обговорюється вище, може бути бутильований, як зазначено нижче. Лікарський продукт наталізумаб 200л і 2000л може бути заповнений на повністю автоматизованій заповнювальній лінії, обладнаній каналом для миття, стерилізації і апірогенізації флаконів. Пробки, герметизуючий шар і заповнювальне обладнання промивають і стерилізують перед використанням. Цей спосіб дозволяє провести крупномасштабні оброблювальні операції, що погоджуються з об'ємами, що отримуються при ферментуванні 2000л. При необхідності, композиційний буфер, близько 10мМ фосфа ту, близько 140мМ NaCl, pH 6,0±0,57 близько 0,02% полісорбату 80, може бути введений в суміш набору класу 10000, і використовуватися для розведення партії лікарського продукту до кінцевої концентрації. Задані значення концентрації, рН і щільність в ході процесу переважно досягають до фільтрації. Наталізумаб або інший імуноглобулін в формі композиції може бути стерильно профільтрований через 0,2мкм фільтр Millipak в урівнювальний бак з нержавіючої сталі, стерильний всередині. Заповнення, закупорення пробкою і герметизація наталізумабу є повністю автоматизованими. Збирають зразки в ході процесу для контролю стерильності партії; дослідження заповненої маси і вільного простору перевіряють протягом всієї процедури заповнення. Заповнений лікарський продукт зберігають при охолодженні до близько 2-8°С. Заповнення проводять всередині ліцензованих стерильних боксів Класу 100. Заповнювальна лінія затверджена для забезпечення повного об'єму в рамках очікуваних допустимих відхилень для об'ємів заповнення 5,0мл і 20мл. Всебічний контроль навколишнього середовища проводять протягом всієї процедури запов нення і оцінюють для підтвердження безперервної відповідності цьому стандарту. Контроль середовища боксів проводять щоквартально для підтримки асептичних процедур заповнення. Альтернативно, 200л отриманої речовини лікарського засобу може бути бутильовано у відповідності з наступним прикладом. Флакони, заповнювальні голки, фільтрувальний пристрій і труби отримували і стерилізували перед використанням. Пробки можуть бути отримані від постачальника. Потім пробки стерилізували перед заповненням. Лікарський продукт наталізумабу або іншого білка фасували на напівавтоматичній лінії заповнення з приготованої партії компонентів, з автоматизованим заповненням, негайним закупоренням і подальшою процедурою герметизації. Ця процедура є відповідною для операцій з партією малого об'єму. Остаточний об'єм розчину потім стерильно фільтрували через 0,2мк фільтр Millipak в стерильну скляну приймальну посудину в умовах навколишнього середовища Класу 100. Поточна перевірка і оцінка в ході процесу гарантували, що допустиме відхилення наповнення залишається в межах ±2%. Флакони закупорювали і герметизували негайно. Заповнений лікарський продукт переважно зберігали охолодженим при 2-8°С. Скляна приймальна посудина може бути представлена будь-якою кількістю посудин, але може, наприклад, бути 5,0 або 20мл нейтральним скляним заповнюваним флаконом типу І (ЕР), наприклад, Epsom Glass або AMILCO, або 5,0мл або 20мл боросілікатним скляним заповнюваним флаконом USP типу І, наприклад, Kimble або Wheaton. Для таких флаконів можуть бути використані будьякі прийнятні засоби закупорювання. Закупорювальні засоби флаконів включають, але не обмежені, 13мм пробку з сірого бутилкаучуку Hel voet Pharma V9145/FM 157/1 або 13мм і 20мм пробку з сірого 17 82685 бутилкаучук у Helvoet Pharma V9145/FM 157/1 або 13мм або 20мм пробку з сірого бутилкаучук у West 4432/50. Закупорені каучуком бутлі потім герметизували, звичайно використовуючи алюмінієвий обтискний ковпачок, такий як виробляється West. Хоч даний винахід описаний детально з посиланнями на приклади нижче, зрозуміло, що різні модифікації можуть бути зроблені без відхилення від загальної тенденції винаходу, і вони легко зрозумілі фахівцеві в галузі техніки. Приклад 1 Вибір полісорбату 80 Звичайним способом введення наталізумабу є внутрішньовенний. Для внутрішньовенного введення потрібно, щоб остаточна композиція була ізотонічною. Початково вибрали композицію AN 100226 (наталізумаб), 5мг/мл в 50мМ L-гістидину, 150мМ NaCl pH 6,0 (Композиція #1). Під час дослідження II фази спостерігали осадження білка антитіла під час розведення і введення наталізумабу в клінічний дозувальний прилад. Полісорбат 80 вводили в композицію (Композиція #2) для усунення осадження білка, що спостерігалося. Переважно, полісорбат для використання в даному винаході містив мало перекису, тобто полісорбат від Sigma, номер продукту Р6479, номер серії 071К7283. Двома чинниками, про які було показано, що вони прискорюють осадження антитіл AN 100226, є присутність слідових рівнів силіконового масла і денатурація на межі повітря-рідина. Силіконове масло потрапляє в продукт при використанні стандартних змащених поліпропіленових шприців, забезпечених силіцованими каучуковими пробками. Введення силіконового масла є достатнім для того, щоб викликати явне осадження антитіл в композиції #1 при легкому перемішуванні і зберіганні при кімнатній температурі. Агрегація, дезамідування і подальше осадження, що викликаються денатурацією на межі розділу повітря-рідина, стають більш явно проблематичними, коли лікарський препарат відправляють в інші клінічні об'єкти. Обидві причини осадження білка усували додаванням полісорбату 80 в концентрації 0,02% (мас/об.). Композиція #2 показала стабільність, здатну до порівняння з композицією гістидин/NaCl (композиція #1) у всі х дослідженнях характеристик білка, забезпечивши при цьому збільшену стабільність при транспортуванні і перенесенні лікарського продукту в клінічних умовах. Додавання полісорбату 80 до композиції також долає проблему осадження або агрегації антитіл при отриманні композицій з більш високим вмістом білка. Початкові роботи були зосереджені на агрегації, індукованій перемішуванням при високих концентраціях білка, включаючи 50мг/мл. Піддаючи матеріал перемішуванню з використанням змішувача тип у вортекс, визначали агреговані зразки за допомогою високоефективної рідинної хроматографії з витісненням по розміру (SEC-ВЕРХ). Така модель показала, що полісорбат 80 є ефективним інгібітором агрегації, тоді як сахароза і інші буферні компоненти мали невеликий корисний ефект. 18 Ефективність додавання 0,02% (мас/об.) полісорбату 80 в запобіганні осадженню, індукованому агрегацією, при концентрації білка 5мг/мл оцінювали після додавання 10мкл 10% розчину полісорбату 80 у флакони наталізумабу (серія No. AN 100226-0003). Флакони струшували на боку разом з декількома флаконами наталізумабу в композиції #1 при 150 оборотах на хвилину в горизонтальній площині. Після 3 годин такої обробки при кімнатній температурі, флакони композиції #1 містили велику кількість частинок і здавалися мутними, тоді як флакони з 0,02% (мас/об.) полісорбату 80 залишалися прозорими і вільними від частинок. Припустили, що агрегація, що спостерігається, може бути викликана межею розділу повітряповерхня, оскільки флакони, повністю заповнені AN 100226 у відсутність полісорбату 80, струшували протягом більш тривалих періодів часу без індукції додаткового утворення частинок. Проводили оцінку здатності 0,02% (мас/об.) полісорбату 80 інгібувати осадження білка, якому сприяють слідові кількості силікону. Флакон наталізумабу (серія No. AN100226-0003) доводили до 0,02% (мас/об.) полісорбату 80 і втягували в комерційно доступний, змащений, 60 мл поліпропіленовий шприц. Речовині дозволяли постояти протягом декількох годин при кімнатній температурі. Візуальна оцінка підтвердила, що не з'являється осадження. Потім речовину фільтр ували через 0,2мкм фільтр в 5-мл флакон і оцінювали і виявляли практично вільним від частинок протягом декількох днів, тоді як флакони, оброблені подібним чином у відсутність полісорбату 80 (Композиція #1) містили велику кількість частинок. Приклад 2 Вибір фосфатного буфера При дослідженні вивільнення гістидинового плацебо (що містить 0,02% мас/об, полісорбату 80), були визначені нові слідові домішки. Ці домішки походили з розкладання полісорбату 80, очевидно за допомогою реакції окислення, що включає іони металу і гістидин. Для активного лікарського продукту наталізумабу, такі слідові домішки визначали тільки після зберігання при підвищеній температурі (наприклад, 25°С і 40°С). Отже, було прийняте рішення модифікувати плацебо і використати фосфат для заміщення гістидину в буфері. Партія гістидину, що використовувалась в продукті плацебо, була іншою, ніж та, що використовувалась для активного лікарського продукту наталізумабу серій AN100226-004 і AN100226-005. Внесок джерела гістидину в розкладання полісорбату 80 обговорюється більш детально нижче. Під час дослідження плацебо, слідові домішки були виявлені в плацебо гістидин/МаСl/0,02% (мас/об.) полісорбат 80 (Композиція #2). Такі домішки визначали за їх поглинанням в низьких довжинах хвиль ультрафіолетового спектра. Визначали профілі поглинання від 200 до 400 нм для плацебо, що зберігається при 5°С, 25°С і 40°С протягом одного місяця. Отримані дані показують, що домішки підвищуються як функція температури. 19 82685 Спосіб ВЕРХ з витісненням по розміру, що використовується для спостереження за агрегацією антитіл, модифікували для підвищення чутливості для визначення слідових домішок шляхом підвищення навантаження колонки в 5 разів до 100мкл, і зразок наносили нерозведеним, а не розведеним в 10 разів. Крім того, поглинання відстежували при 260нм для відображення максимуму поглинання домішок. Спосіб забезпечує засіб для оцінки присутності таких слідових домішок і в плацебо, і в продукті, оскільки антитіла з'являються набагато раніше в профілі елюції. Остаточні лікарські продукти плацебо і наталізумабу, рецептовані в композиції #1 і #2 аналізували методом SEC-BEPX, описаним вище. Аналіз плацебо в композиції #1, забезпеченій полісорбатом 80 до 0,02% (мас./об.) проводили безпосередньо перед хроматографією. Він показав поглинання УФ полісорбатом 80, гістидином і сіллю у відсутність слідових домішок. Широкий пік на 16 хвилинах асоційований з полісорбатом, тоді як піки на приблизно 26-27 хвилинах зумовлені гістидином і сіллю. Плацебо гістидин/№С1/0,02% (мас/об.) полісорбат 80 (Композиція #2) при зберіганні при 5°С протягом двох місяців показало значне збільшення пізніх піків елюції, які мали на увазі внесок полісорбату 80 в продукцію таких домішок. Крім того, елюювання на 16 хвилинах пропадало, показуючи, що полісорбат 80 руйнувався. AN 100226, що зберігається у вигляді партії лікарської речовини протягом приблизно 5 місяців при 5°С у вигляді композиції #1, аналізували після додавання полісорбату 80 до 0,02% (мас/об.) відразу перед хроматографією. Антитіла елюювали на 16-18 хвилинах з використанням цих умов надмірного навантаження. Залишок профілю походив на плацебо з піком полісорбату 80. Двомісячну стабільність зразків партії наталізумабу #AN 100226-0004 також аналізували таким способом. Профіль елюції для зразка наталізумабу 5°С показав відсутність будь-яких додаткових піків, і здатні до порівняння рівні піків гістидину/солі на 26-27 хвилинах. Слідові домішки визначали через два місяці для зразка 25°С, і підвищені рівні були присутніми для двомісячного зразка 40°С. Таким чином, такі забруднення не визначали в клінічних поставках, які зберігали при 5°С. Поява цих слідових забруднень виявляється набагато більш швидко в плацебо, ніж в наталізумабі. Щоб уникнути утворення таких домішок в плацебо, гістидин замінювали неорганічними буферними компонентами в композиції плацебо. Продукт плацебо для клінічних досліджень являє собою стерильний ізотонічний фосфатний буферний розчин 0,02% (мас/об.) полісорбату 80 при рН 6,0. Було продемонстровано, що заміщення гістидину фосфа том значно зменшує швидкість розкладання полісорбату 80. 100мкл композиції плацебо фосфат/NaC 1/0,02% (мас/об.) полісорбат 80 аналізували ВЕРХ з витісненням по розміру, контролюючи при 260 нм в момент часу нуль і через 3 дні при 60°С. Невеликі зміни спостерігали в профілі SECBEPX (ВЕРХ з витісненням по розміру), як результат такої інкубації. Профіль SEC-BEPX для композиції гістидин/NаСl/0,02% (мас/об.) полісорбат 80 20 тільки через два дні при 60°С показав значний рівень слідових домішок, що відносяться до розкладання полісорбату 80. Отримані дані демонструють, що розкладання полісорбату 80 значно утруднюється заміщенням гістидину фосфатом в композиції плацебо. Приклад 3 Композиція наталізумабу зі змішаними полісорбатом 80 і гістидином Вважають, що механізм, за допомогою якого ці слідові домішки утворюються, відбувається за допомогою окислення полісорбату, каталізованого металом [див. Donbrow et al., 1978 J. Pharmaceutical Sciences, 67(12):28]. Donbrow описує, що автоокислення при зберіганні з'являється у різних типів полісорбату (наприклад, полісорбат 20). Світло, температура і іони металів також впливають на автоокислення. Donbrow et al. (1978). Було підтверджено, що для цієї реакції, для протікання зі значною швидкістю, потрібні і гістидин і полісорбат 80. Ajinomoto є єдиним постачальником гістидину, що використовується для композицій. Однак спостерігали значну різницю в швидкості реакції між партіями, поставленими Ajinomoto. Додатковим чинником, який відіграє роль в прискоренні реакції, є присутність металу. Це було продемонстровано протіканням реакції при 60°С протягом п'яти днів в скляній посудині з 50мМ гістидину (Партія No. R016AOOS) і 2% (мас/об.) полісорбату 80. У таких умовах мінімальні рівні домішок утворювалися для цієї партії гістидину. Потім реакційну суміш розділяли на три посудини: (1) перша посудина залишалася як контроль; (2) до другої посудини додавали сіру бутилову кришку контейнера (пробку); і (3) до третьої посудини додавали голку з нержавіючої сталі. Ці реакції потім протікали протягом чотирьох днів при 60°С і їх аналізували УФ скануванням від 200 до 400нм. Реакція прогресувала далі протягом такого періоду часу в присутності голки. Приклад 4 Дослідження домішок - випробування на граничний вміст в одній дозі у мишей Потенційну токсичність цих домішок оцінювали у випробуванні на граничний вміст в одній дозі у мишей. Використовували зразки плацебо гістидину і наталізумабу в композиції #2, що зберігалися при 40°С протягом шести тижнів, оскільки ці зразки забезпечували найбільшу кількість домішок. Не було ознак токсичності через домішки. Попередні дані представлені в неклінічній частині заяви. Визначали профілі SEC-BEPX для 100мкл ін'єкцій зразків, що використовуються у випробуванні на граничний вміст в одній дозі у мишей. Зразок наталізумабу в композиції #1, доповнений полісорбатом 80 перед аналізом, мав невеликий рівень поглинання при 260нм в елюаті після 20 хвилин. Пік елюції на 34 хвилині виявляли в цій партії наталізумабу без додавання полісорбату 80 і, отже, це не вказує на розкладання полісорбату 80. Навпаки, плацебо в композиції #2, що зберігається при 40°С протягом шести тижнів, показав повне розкладання, оскільки загальна площа під кривою була 12,8 мільйон мВ-секунд. Зразок наталізумабу 21 82685 в композиції #2 і що зберігався при 40°С протягом шести тижнів мав менш повне розкладання. Аналіз підтвердив, що зразки, що зберігаються при 40°С і що тестуються у випробуванні на граничний вміст в одній дозі у мишей, містили велику кількість полісорбату 80, що розклався. Приклад 5 Встановлення специфікації домішок Для оцінки, чи здатний все ще полісорбат 80, що частково розклався, запобігати агрегації антитіл, композицію #2 нагрівали до 60°С протягом 3 днів в присутності голки для перетворення всього полісорбату 80 в максимальний рівень домішок. При допомозі SEC і ВЕРХ із оберненою фазою підтверджували, що в реакції весь полісорбат 80 розклався. Отриману речовину розводили один до одного 10мг/мл розчином AN100226 в композиції #2, приводячи до розчину, що містить 0,01% (мас/об.) полісорбату 80 і 50% максимального рівня полісорбату 80, що розклався. Такі розчини антитіл піддавали струшуванню і впливу силіцованих шприців протягом декількох годин; агрегація антитіл була відвернена. Контрольний зразок, підданий таким самим умовам, але без полісорбату 80, показав значне осадження. З цієї роботи зробили висновок, що оскільки не більш ніж п'ятдесят відсотків полісорбату 80 розклалося, ця речовина може забезпечувати відповідне оточення для запобігання агрегації антитіл. Хоч дуже невелике розкладання полісорбату спостерігалося в активному лікарському продукті, було проведене спостереження за структурою ізоелектрофокусування (IEF) для підтвердження, що ця композиція не піддає ризику антитіла. Визначали профілі IEF для тимчасових точок стабільності шести тижнів для 5°С, 25°С і 40°С умов зберігання. Зразки 5°С і 25°С були порівнювані з . еталонним стандартом, з відсутністю якої-небудь зміни в загальному заряді білка. Зразок 40°С показав зсув до більш кислих видів, типових для цього продукту в рідкій композиції, як в присутності, так і у відсутності полісорбату 80. Для встановлення взаємовідносин між ступенем деградації полісорбату 80 і площею піка з SEC-BEPX, оцінювали ряд розведень для шести концентрацій полісорбату 80, що розклався від 0 до 50%. Композицію #2 нагрівали до 60°С протягом 3 днів з голкою і підтверджували 100% розкладання по ВЕРХ SEC і з оберненою фазою. Потім реакційну суміш розводили очищеною партією AN 100226 в композиції # 1, знову додавали 0,02% (мас/об.) полісорбату 80 і аналізували SEC-ВЕРХ. Профілі SEC спостерігали при 260нм. Дані з цього ряду розведень наносили на графік по загальній площі піка, об'єднаній (мкВ секунд) для профілю поглинання після приблизно 24 хвилин як функцію співвідношення полісорбату 80, що розклався. Цей графік показує, що площа менш, ніж 5 мільйонів мкВ-секунд, являє собою близько 50% втрату полісорбату 80 до продуктів, що розклалися. Існує пряме взаємовідношення між кількістю окисленого доданого полісорбату 80 і площею піка для піків, що елюювали в пізній області хроматограми. 22 Попередня межа для цих слідових домішок в наталізумабі була встановлена на основі випробувань на граничний вміст однієї дози у мишей, даних розчинності антитіл з 50% полісорбатом 80, що розклався, і оцінок розкладання полісорбату 80. Спосіб був включений в поточну програму стабільності і межа була встановлена. Якщо додаткові партії виробляються з гістидином, ці межі будуть застосовуватися також під час вивільнення. Межа: загальна площа під піками після приблизно 24 хвилин не перевершує 4×106мкВсекунд. Приклад 6 1,7мг/мл композиція наталізумабу 1,7мг наталізумабу 1,4мг фосфа ту натрію, USP 8,2мг хлориду натрію, USP 0,2мг полісорбату 80, NF Доведення рН до 6,0±0,5 фосфорною кислотою (NF), QS до 1мл. Переважне зберігання при 5-8°С. Приклад 7 5,0мг/мл композиція наталізумабу 5,0мг наталізумабу 1,4мг фосфа ту натрію, USP 8,2мг хлориду натрію, USP 0,2мг полісорбату 80, NF Доведення рН до 6,0±0,5 фосфорною кислотою (NF), QS до 1мл. Переважне зберігання при 5-8°С. Приклад 8 20мг/мл композиція наталізумабу 20,0мг наталізумабу 1, мг фосфа ту натрію хлорида 8,2мг натрію, USP, USP 0,2мг полісорбату 80, NF Доведення рН до 6,0±0,5 фосфорною кислотою (NF). QS до 1мл. Переважне зберігання при 5-8°С. Приклад 9 50,0мг/мл композиція наталізумабу 50,0мг наталізумабу 1,4мг фосфа ту натрію, USP 8,2мг хлориду натрію, USP 0,2мг полісорбату 80, NF Доведення рН до 6,0±0,5 фосфорною кислотою (NF). QS до 1 мл. Переважне зберігання при 5-8°С. Приклад 10 5,0 мг/мл композиція наталізумабу 5,0мг/мл наталізумабу 140мМ NaCl 0,02%полісорбату 80(мас/об.) 10мМ фосфа ту натрію Доведення рН до 6,0±0,5 фосфорною кислотою. Оптимально зберігання композиції при близько 5°С до близько 8°С. Приклад 11 10мг/мл композиція наталізумабу 10,0мг наталізумабу 1,4мг фосфа ту натрію, USP 8,2мг хлориду натрію, USP 0,2мг полісорбату 80, NF Доведення рН до 6,0±0,5 фосфорною кислотою (NF). QS до 1мл. 23 82685 Переважне зберігання при 5-8°С. Приклад 12 10мг/мл композиція наталізумабу 10,0мг наталізумабу 1,4мг фосфа ту натрію, USP 8,2мг хлориду натрію, USP 0,1мг полісорбату 80, NF Доведення рН до 6,0±0,5 фосфорною кислотою (NF). QS до 1мл. Переважне зберігання при 5-8°С. Приклад 13 20мг/мл композиція наталізумабу 20,0мг/мл наталізумабу 140мМ NaCl 0,02% полісорбату 80 (мас/об.) 10мМ фосфа ту натрію Доведення рН до 6,0±0,5 фосфорною кислотою і доведення об'єму до 125мл. Оптимально зберігати композицію при від близько 5°С до близько 8°С. Приклад 15 Ліофілізована композиція наталізумабу Додаткові рідкі композиції антитіла у високій концентрації, від 20-200мг/мл можуть складатися з фосфа ту або іншого відповідного буфера (такого як гістидин, цитрат, ацетат або сукцинат) в діапазоні концентрацій від 2 до 50мМ, для отримання буферизації в діапазоні рН від 3,0 до 7,0. Найбільш переважно, рН складає 6,0±0,5. Додавання поліолів (таких як сорбіт і маніт), дисахаридів (таких як сахароза або трегалоза) і амінокислот (таких як гліцин) можуть бути додані в різних кількостях з хлоридом натрію для підтримки стабільності і забезпечення ізотонічного розчину. Використання поверхнево-активних речовин, таких як, але не обмежуючись, полісорбати, додає стабільності, коли використовуються в діапазоні від 0,001 до 2%. Для отримання рідкої композиції наталізумаб концентрували до 65мг/мл в 10мМ фосфату натрію, 140мМ хлориду натрію, рН 6, з близько 0,06% полісорбату 80. Отриманий розчин був злегка опалесцентним, але без частинок. Зразок містив більш ніж 99% мономера без високомолекулярних агрегатів або низькомолекулярних видів по SEC. Забезпечують стабільну ліофілізовану фармацевтичну композицію. Оскільки фосфатний буфер зазнає змін рН при заморожуванні, необхідно замінити фосфат іншим буфером. Цей буфер може складатися з гістидину, цитрату або сукцинату зі здатністю буферизувати в діапазоні рН від 3,0 до 7,0, найбільш переважно в діапазоні 6,0±0,5. Застосування поліолів (таких як маніт) і цукрів (таких як сахароза) є необхідним для забезпечення кріо- і ліо-захисту. Такі поліоли можуть бути використані окремо або в комбінації для забезпечення стабільності і встановлення тонічності. До Комп’ютерна в ерстка Н. Лисенко 24 датково, застосування амінокислот (таких як гліцин), на рівні 10-1000мМ може використовуватися для запобігання агрегації. Поверхнево-активні речовини, такі як полісорбати або полоксамери, можуть бути використані на рівні від 0,001% до 2,0% для забезпечення стабільності перед ліофілізацією і після відновлення і для забезпечення більш швидкого часу відновлення. Білок, після остаточної стадії очищення може бути оброблений з використанням ультрафільтрації для концентрування і діафільтрації для заміни буфера. Білок також може бути оброблений з використанням колонкової хроматографії для заміни буфера. Деякі комбінації цих методик також можуть бути використані. Крім того, кінцева бажана концентрація білка може бути отримана шляхом заповнення в концентрації білка і допоміжної речовини, меншої, ніж бажано, і відновлення в більш маленькому об'ємі. Наприклад, 2,5мл заповненого об'єму 40мг/мл розчину може бути використано з подальшим відновленням 1мл для отримання розчину 100мг/мл. Наприклад, наталізумаб, в концентрації 20мг/мл, ліофілізували в розчині що містить 5мМ гістидину, 20мг/мл сахарози і 0,02% полісорбату 80, рН 6. Розчин заповнювали по 5мл на флакон в 10мл флакони з боро-силікатного скла і закупорювали пробками з сірого бутилкаучук у для ліофілізації. Ліофілізацію проводили з використанням ліофілізатора моделі Virtis Gensis. Продукт заморожували при температурі зберігання -60°С протягом 10 годин і потім температуру зберігання підвищували до -40°С. Первинне сушіння проводили при температурі зберігання -10°С і тиску в камері 100мм рт.ст протягом 20 годин. Повторне сушіння досягали при температурі зберігання 25°С з тиском в камері 100мм рт.ст протягом 10 годин. Флакони закупорювали у вакуумі. Потім флакони відновлювали з використанням 1 мл стерильної WFI для отримання композиції, що містить 100мг/мл наталізумабу. Зразки аналізували відразу після ліофілізації і через 2 тижні зберігання в ліофілізованій формі при 40 градусах. В обох випадках час відновлення був негайним. Відновлені розчини були чистими і безбарвними з відсутністю частинок речовини. Зразки містили більш ніж 99% мономера по SEC, без високомолекулярних агрегатів або низькомолекулярних видів. Через 2 тижні зберігання при 40 градусах, зразок показав 94% ефективність відносно еталона (вимоги 80-125%). Всі патенти, що цитуються, і публікації, що відносяться до даної заявки, включені в даний опис у вигляді посилання повністю для будь-яких цілей. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601