Вектори для генної терапії і цитозиндезамінази

Реферат: UA 104298 C2 (12) UA 104298 C2 Винахід належить до модифікованих цитозиндезаміназ (CD), до клітин і вектору, які експресують або містять модифіковані CD, і способів використання модифікованих CD при лікуванні захворювань або порушень. UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресне посилання на споріднені заявки По даній заявці вимагається пріоритет попередньої заявки США із серійним номером 61/100666, поданої 26 вересня 2008 року, попередньої заявки США із серійним номером 61/120618, поданої 8 грудня 2008 року, і попередньої заявки США із серійним номером 61/186823, поданої 13 червня 2009 року, описи яких включені в даний опис шляхом посилання. Галузь техніки Даний винахід належить до модифікованих цитозиндезаміназ (CD). Даний винахід додатково належить до клітин, які експресують такі модифіковані CD, і способів використання таких модифікованих CD при лікуванні захворювань і порушень. Передумови до створення винаходу Дріжджова, або бактеріальна, цитозиндезаміназа перетворює нетоксичні антибіотичні проліки 5-FC у цитотоксичний хіміотерапевтичний засіб 5-фторурацил (5-FU). У людей (і ссавців узагалі) не відома наявність природного гена, який кодує фермент зі значною цитозиндезаміназною активністю. Цитозиндезаміназа дріжджів або бактерій одержала визнання в лікуванні злоякісних захворювань шляхом використання доставки гена і вірусних векторів для доставки цього ферменту, з наступною обробкою 5-FC, який потім перетворювався під дією цього ферменту в цитотоксичний лікарський засіб (Miller et al., Can Res 62:773-780 2002; Kievit et al., Can Res 59:1417-1421 1999). Короткий виклад суті винаходу Даний винахід належить до поліпептидів, які перетворюють 5-FC у 5-FU. Також представлені молекули нуклеїнової кислоти, які кодують такі поліпептиди, клітини, які експресують такі поліпептиди, вектори, що містять такий полінуклеотид і поліпептиди і способи синтезу 5-FU або його похідних з відповідного, з використанням таких поліпептидів. Відповідно, у різних варіантах здійснення представлені виділені або рекомбінантні поліпептиди, які містять цитозиндезаміназу, що мають послідовність SEQ ID NO:2. В інших варіантах здійснення поліпептид містить послідовність SEQ ID NO:2 з мутацією, вибраною з групи, яка складається з A23L, V108I, I140L і будь-якого їхнього поєднання. Ще в одному варіанті здійснення, поліпептид містить послідовність SEQ ID NO:4 і включає аж до 50, 25, 10 або 5 консервативних амінокислотних замін, за винятком залишків: (a) 23, 108 і 140. В основному, поліпептиди, представлені в даній заявці виявляють цитозиндезаміназну активність, яка використовується для перетворення 5-FC у 5-FU. Даний винахід також належить до поліпептиду, що містить послідовність, яка щонайменше на 80%, 90%, 95%, 98% або 99% ідентична послідовності SEQ ID NO:4, де у вказаному поліпептиді лейцин знаходиться в положенні 23, ізолейцин знаходиться в положенні 108 і лейцин знаходиться в положенні 140, і де вказаний поліпептид має цитозиндезаміназну активність. Ще в одному варіанті здійснення, поліпептид містить послідовність SEQ ID NO:4. Даний винахід додатково належить до злитих конструкцій, які містять будь-який з вказаних вище поліпептидів, оперативно зв'язаних з урацилфосфорибозилтрансферазою (UPRT) або оротатфосфорибозилтрансферазою (OPRT). В одному варіанті здійснення, злита конструкція містить перший поліпептид, що містить SEQ ID NO:2 з мутацією, вибраною з групи, яка складається з A23L, V108I, I140L і будь-якого їхнього поєднання, зв'язаний із другим поліпептидом, який має UPRT або OPRT активність. Ще у одному варіанті здійснення, злита конструкція містить перший поліпептид, що має послідовність SEQ ID NO:4 і включає аж до 50, 25, 10 або 5 консервативних амінокислотних замін, за винятком залишків: 23, 108 і 140, де перший поліпептид зв'язаний з другим поліпептидом, який має UPRT або OPRT активність. Даний винахід також належить до злитої конструкції, що містить перший поліпептид, який має цитозиндезаміназну активність, і який містить послідовність, яка щонайменше на 80%, 90%, 95%, 98% або 99% ідентична послідовності SEQ ID NO:4, де у вказаному поліпептиді лейцин знаходиться у положенні 23, ізолейцин знаходиться у положенні 108 і лейцин знаходиться у положенні 140, і де перший поліпептид зв’язаний з другим поліпептидом, який має UPRT або OPRT активність. В одному варіанті здійснення, поліпептид, який має UPRT або OPRT активність, містить послідовність SEQ ID NO:8 і 10, відповідно, або її варіанти. Ще в одному варіанті здійснення, перший поліпептид, який має цитозиндезаміназну активність, зв'язаний з поліпептидом, який має UPRT або OPRT активність, де вказані поліпептиди розділяються пептидним лінкером. В іншому варіанті здійснення, злита конструкція містить послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:12, 14, 16 або 18. Даний винахід додатково належить до полінуклеотидів, які кодують будь-який з вказаних вище поліпептидів. Наприклад, даний винахід належить до полінуклеотиду, який кодує поліпептид, що містить SEQ ID NO:2 з мутацією, вибраною з групи, яка складається з A23L, V108I, I140L і будь-якого їхнього поєднання. Ще в одному варіанті здійснення, вказаний 1 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 полінуклеотид кодує поліпептид, що містить послідовність SEQ ID NO:4 і включає аж до 50, 25, 10 або 5 консервативних амінокислотних замін, за винятком залишків: (a) 23, 108 і 140. У додатковому варіанті здійснення, даний винахід належить до полінуклеотиду, який кодує поліпептид, що містить послідовність, яка щонайменше на 80%, 90%, 95%, 98% або 99% ідентична послідовності SEQ ID NO:4, де у вказаному поліпептиді лейцин знаходиться в положенні 23, ізолейцин знаходиться в положенні 108 і лейцин знаходиться в положенні 140, і де вказаний поліпептид має цитозиндезаміназну активність. Ще в одному варіанті здійснення, вказаний полінуклеотид кодує поліпептид, що містить послідовність SEQ ID NO:4. У додатковому варіанті здійснення, вказаний полінуклеотид кодує поліпептид, що містить послідовність SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 11, 12 або 13. Даний винахід належить до полінуклеотиду з кодонами, оптимізованими для людини, що кодує цитозиндезаміназу. В одному варіанті здійснення, полінуклеотид з кодонами, оптимізованими для людини, містить послідовність SEQ ID NO:3. Ще в одному варіанті здійснення, вказаний полінуклеотид містить послідовність SEQ ID NO:5, 7 або 9. В інших варіантах здійснення, цитозиндезаміназу або злиту конструкцію за даним винаходом доставляють з використанням системи для доставки генів (GDS). В іншому аспекті, полінуклеотид, який кодує цитозиндезаміназу, доставляють за допомогою GDS, яка являє собою вірусний вектор або вектор, похідний вірусу. Вірусний вектор може бути таким, що реплікується або не реплікується, і може являти собою аденовірусний вектор, коревий вектор, вектор вірусу герпесу, ретровірусний вектор (у тому числі лентивірусний вектор), рабдовірусний вектор, такий як вектор вірусу везикулярного стоматиту, реовірусний вектор, вектор вірусу Сенеки Валлі, поксовірусний вектор (у тому числі вектори, отримані з вірусу віспи тварин або коров'ячої віспи), парвовірусний вектор (у тому числі AAV вектор), альфавірусний вектор або інший вірусний вектор, відомий фахівцю в даній галузі. В одному варіанті здійснення, вірусний вектор може являти собою реплікативно-компетентний ретровірусний вектор, здатний інфікувати клітини ссавців, які реплікуються. Реплікативно-компетентний ретровірусний вектор може містити орторетровірус або, більш характерно, гамма ретровірусний вектор. В одному аспекті, реплікаційно-компетентний ретровірусний вектор містить внутрішній сайт зв'язування рибосоми (IRES) 5' з полінуклеотидом, який кодує цитозиндезаміназу за даним винаходом. В одному варіанті здійснення, полінуклеотид, який кодує цитозиндезаміназу, знаходиться в положенні 3' відносно ENV полінуклеотиду ретровірусного вектора. В інших варіантах здійснення, представлені клітини-хазяї, трансфіковані цитозиндезаміназою або злитою конструкцією за даним винаходом або вектор, що включає полінуклеотид або злиту конструкцію за даним винаходом. Клітини-хазяї включають еукаріотичні клітини, такі як клітини дріжджів, клітини комах або клітини тварин. Клітини-хазяї також включають прокаріотичні клітини, такі як клітини бактерій. Даний опис також належить до способів лікування клітинно-проліферативних захворювань, у тому числі злоякісних захворювань, які передбачають уведення пацієнту полінуклеотиду або поліпептиду за даним винаходом, і контактування пацієнта з цитотоксичним лікарським засобом, що містить 5-фторцитозин (5-FC). Даний винахід належить до рекомбінантного реплікаційно-компетентного ретровірусу (RCR), що містить: ретровірусний білок GAG; ретровірусний білок POL; оболонку ретровірусу; ретровірусний полінуклетид, що містить послідовності довгих кінцевих повторів (LTR) на 3' кінці полінуклеотидної послідовності ретровірусу, промоторну послідовність на 5' кінці ретровірусного полінуклеотиду, вказаний промотор підходить для експресії в клітинах ссавців, домен нуклеїнової кислоти gag, домен нуклеїнової кислоти pol і домен нуклеїнової кислоти env; касету, що містить внутрішній сайт зв'язування рибосоми (IRES) оперативно зв'язаний з гетерологічним полінуклеотидом, де вказана касета розташована від 5' до 3' LTR і 3' до домену нуклеїнової кислоти env, що кодує оболонку ретровірусу; і послідовності, які діють у цис-положенні, необхідні для зворотної транскрипції, упакування й інтеграції в клітину-мішень, де RCR зберігає більш високу реплікативну компетентність після 6 пасажів у порівнянні з вектором pACE (SEQ ID NO:21). В одному варіанті здійснення, полінуклеотидна послідовність ретровірусу отримана з вірусу лейкозу мишей (MLV), вірусу мишачого лейкозу Молоні (MoMLV), вірусу лейкозу котячих або вірусу лейкозу гібонів (GALV). В іншому варіанті здійснення, MLV являє собою амфотропний MLV. Ще в одному варіанті здійснення, ретровірус являє собою онкоретровірус. Ще в одному варіанті здійснення клітина-мішень являє собою клітину, що має порушення клітинної проліферації. Порушення клітинної проліферації може бути вибране з групи, яка складається, але не обмежується цим, з раку легень, раку товстої і прямої кишки, раку грудей, раку передміхурової залози, раку сечовивідних шляхів, раку матки, раку головного мозку, раку тканин голови і шиї, раку підшлункової залози, меланоми, раку шлунка і раку яєчників, ревматоїдного 2 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 артриту й інших аутоімунних захворювань. В одному варіанті здійснення, промотор містить CMV промотор, що має послідовність SEQ ID NO:19, 20 або 22 від нуклеотиду 1 приблизно до нуклеотиду 582 і може включати модифікацію однієї або декількох основ нуклеїнових кислот, і який здатний направляти й ініціювати транскрипцію. Ще в одному варіанті здійснення, промотор містить послідовність SEQ ID NO:19, 20 або 22 від нуклеотиду 1 приблизно до нуклеотиду 582. У додатковому варіанті здійснення, промотор містить полінуклеотид з доменом CMV-R-U5. В одному варіанті здійснення, домен CMV-R-U5 містить ранній промотор з цитомегаловірусу людини, зв'язаний з областю MLV R-U5. Ще в одному варіанті здійснення, полінуклеотид з доменом CMV-R-U5 містить послідовність SEQ ID NO:19, 20 або 22 приблизно від нуклеотиду 1 приблизно до нуклеотиду 1202 або послідовності, які щонайменше на 95% ідентичні послідовності SEQ ID NO:19, 20 або 22, де вказаний полінуклеотид активізує транскрипцію молекули нуклеїнової кислоти, оперативно зв'язаної з ним. В іншому варіанті здійснення, gag і pol полінуклеотиду отримані з онкоретровірусу. Домен gag нуклеїнової кислоти може містити послідовність приблизно від нуклеотиду номер 1203 приблизно до нуклеотиду 2819 послідовності SEQ ID NO:19 або послідовність, щонайменше на 95%, 98%, 99% або 99,8% ідентичну їй. Домен pol може містити послідовність приблизно від нуклеотиду номер 2820 приблизно до нуклеотиду 6358 послідовності SEQ ID NO:19 або послідовність, щонайменше на 95%, 98%, 99% або 99,9% ідентичну їй. В одному варіанті здійснення, домен env кодує амфотерний білок env. Домен env може містити послідовність приблизно від нуклеотиду номер 6359 приблизно до нуклеотиду 8323 послідовності SEQ ID NO:19 або послідовність, щонайменше на 95%, 98%, 99% або 99,8% ідентичну їй. Домен IRES може являти собою будьякий IRES, однак, в одному варіанті здійснення IRES одержують з вірусу енцефаломіокардиту. У додатковому варіанті здійснення, IRES містить послідовність приблизно від нуклеотиду номер 8327 приблизно до нуклеотиду 8876 послідовності SEQ ID NO:19 або послідовність, щонайменше на 95%, 98% або 99% ідентичну їй. Ще в одному варіанті здійснення, гетерологічний полінуклеотид містить полінуклеотид, що має послідовність SEQ ID NO:3, 5, 11, 13, 15 або 17. У додатковому варіанті здійснення, гетерологічна послідовність кодує поліпептид, що містить послідовність SEQ ID NO:4. Гетерологічна нуклеїнова кислота є оптимізованою для кодонів людини і кодує поліпептид послідовності SEQ ID NO:4. У додатковому варіанті здійснення, гетерологічна нуклеїнова кислота містить послідовність SEQ ID NO: 19 приблизно від нуклеотиду номер 8877 приблизно до 9353. В одному варіанті здійснення 3' LTR отриманий з онкоретровірусу. У додатковому варіанті здійснення 3' LTR містить домен U3-R-U5. Ще в одному варіанті здійснення 3' LTR містить послідовність SEQ ID NO:19 приблизно від нуклеотиду 9405 приблизно до 9998 або послідовність, що щонайменше на 95%, 98% або 99,5% ідентична їй. Даний винахід належить до полінуклеотиду, що містить послідовність SEQ ID NO:19, 20 або 22. Даний винахід належить до виділеного полінуклеотиду, що містить від 5' до 3': CMV-R-U5 злиття раннього промотору з цитомегаловірусу людини з областю MLV R-U5; PBS, ділянка зв'язування праймера для зворотної транскриптази; 5' сайт сплайсингу; ψ сигнал упаковки; кодуючу послідовність, gag для групо-специфічного антигену MLV; pol кодуючу послідовність, для поліпротеїну MLV полімерази; 3' сайт сплайсингу; 4070A env кодуючу послідовність, для білка оболонки MLV штаму 4070A; внутрішній сайт зв'язування рибосоми (IRES) з вірусу енцефаломіокардиту; модифіковану кодуючу послідовність цитозиндезаміназу; поліпуринову ділянку; і довгий кінцевий повтор U3-R-U5 MLV. Даний винахід належить до способу лікування пацієнта, що страждає на порушення клітинної проліферації, що передбачає контактування пацієнта з полінуклеотидом (або) поліпептидом за даним винаходом, який має цитозиндезаміназну активність в таких умовах, щоб експресувався вказаний полінуклеотид і контактування пацієнта з 5-фторцитозином. Даний винахід також належить до способу лікування клітинно-проліферативного порушення в пацієнта, що передбачає контактування пацієнта з ретровірусом за даним винаходом, де гетерологічна послідовність нуклеїнової кислоти кодує терапевтичний білок, який інгібує проліферацію неопластичних клітин. В одному варіанті здійснення, ретровірус містить полінуклеотид, який кодує поліпептид, що має послідовність SEQ ID NO:4, 12, 14, 16 або 18. Докладні описи одного або декількох варіантів здійснення даного винаходу викладені в супровіджуючих кресленнях і в описі, приведеному нижче. Інші особливості, задачі і переваги будуть очевидні з опису і креслень і формули винаходу. Короткий опис креслень 3 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 На Фігурі 1A-D представлене (a) схематичне зображення рекомбінантного ретровірусного вектора за даним винаходом; (b) плазмідна карта полінуклеотиду за даним винаходом; (c і d) послідовність полінуклеотиду за даним винаходом (SEQ ID NO:19). На Фігурі 2A-D представлені схеми відтворення різних варіантів здійснення за даним винаходом, включаючи поліпептиди з CD, OPRT і UPRT активністю. На Фігурі 3 показано, що спостерігаються більш високі рівні білка yCD2 у порівнянні з білком yCD дикого типу в інфікованих клітинах U-87. На Фігурі 4 показана стабільність вектора, що містить поліпептид CD за даним винаходом, і порівняння з іншими векторами за даним винаходом. На Фігурі 5A-B показано, що цитозиндезаміназна активність і вектор за даним винаходом забезпечують порівнянну або кращу експресію, і, отже, знищення інфікованих клітин щура RG2(5A) або U87 (5B) у порівнянні з yCD активністю дикого типу (T5.0007), коли інфіковані клітини піддаються впливу підвищених рівнів 5-FC. На Фігурі 6 показано, що специфічна активність в інфікованих клітинах U87 T5.0002 (yCD2) вища, ніж T5.0001 (частково оптимізована yCD), яка вища, ніж T5.0007 (wt yCD). Однакові позначення на різних кресленнях означають однакові елементи. Докладний опис Використовувані в контексті даного винаходу й у прикладеній формулі винаходу форми однини включають позначення множини, якщо з контексту явно не випливає інше. Таким чином, наприклад, посилання на «клітину» означають множину таких клітин, а посилання на «засіб» включають посилання на один або декілька засобів, відомих фахівцям у даній галузі, і так далі. Також, використання «або» означає «і/або», якщо не вказане інше. Аналогічним чином, «містять», «містить», «який містить», «включають», «включає» і «який включає» є взаємозамінними і не призначені для обмеження. Далі повинно бути зрозуміло, що в тих випадках, коли в описах різних варіантів здійснення використовується термін «який включає», фахівцю в даній галузі було б зрозуміло, що в деяких особливих випадках варіант здійснення альтернативно може бути описаний з використанням формулювання «по суті складається з» або «складається з». Якщо не визначене інше, усі технічні і наукові терміни, використовувані в даному описі, мають ті ж значення, які звичайно зрозумілі фахівцю в галузі, до якої належить даний винахід. Хоча способи і матеріали, подібні або еквівалентні описаним у даній заявці, можуть бути використані при здійсненні описаних способів і композицій, у даній заявці описуються способи, що приводяться як приклад, пристрій і матеріал. Публікації, розглянуті вище і по всьому тексту представлені тільки для їхнього розкриття до дати подачі даної заявки. Ніщо в даному описі не повинно розглядатися як визнання того, що автори винаходу не мають права відносити до більш ранньої дати такий опис відповідно до попереднього опису. Цитозиндезаміназа (EC 3.5.4.1) являє собою фермент, який каталізує хімічну реакцію Цитозин + H2O  урацил + NH3 Отже, два субстрати цього ферменту являють собою цитозин і H 2O, тоді як двома продуктами цього ферменту є урацил і NH3. Цей фермент належить до сімейства гідролаз, які діють на вуглець-азотні зв'язки, відмінні від пептидних зв'язків, зокрема, у циклічних амідинах. Систематичною назвою цього класу ферментів є цитозинаміногідролаза. Цей фермент також називають ізоцитозиндезаміназа. Цей фермент бере участь у метаболізмі піримідину. Більш конкретно, цитозиндезаміназа являє собою фермент, втягнений у метаболічний шлях піримідинів, через який трансформується екзогенний цитозин, за допомогою гідролітичного дезамінування, в урацил. Активності цитозиндезамінази (CDази або CD) були продемонстровані в прокаріотів і нижчих еукаріот, але вони відсутні у ссавців (Koechlin et al., 1966, Biochem. Pharmacol. 15, 435-446; Polak et al., 1976, Chemotherapy 22, 137-153). Ген FCY1 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) і ген coda E. coli, які кодують, відповідно, CDазу цих двох організмів, відомі і їхні послідовності опубліковані (EP 402 108; Erbs et al., 1997, Curr. Genet. 31, 1-6; WO 93/01281). CDаза також дезамінує аналог цитозину, 5-фторцитозин (5-FC) у 5-фторурацил (5FU), який є високотоксичною сполукою, зокрема, коли він перетворюється в 5-фтор-UMP (5FUMP). Клітини, позбавлені CDазної активності, або внаслідок інактивуючої мутації гена, що кодує цей фермент, або внаслідок природної недостатності цього ферменту (наприклад, клітини ссавців) є резистентними до 5-FC (Jund and Lacroute, 1970, J. Bacteriol. 102, 607-615; Kilstrup et al., 1989, J. Bacteriol., 171, 2124-2127). З іншого боку, було показано, що можливо передати 5-FC чутливість клітинам ссавців, у які була перенесена послідовність, яка кодує CDазну активність (Huber et al., 1993, Cancer Res. 53, 4619-4626; Mullen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 33-37; WO 93/01281). Відповідно, використання CD є переважним застосовно до генної терапії, зокрема, генної терапії злоякісних пухлин. Однак, чутливість до 5-FC сильно варіює в залежності від клітинних ліній. Низька чутливість спостерігається, наприклад, у лініях пухлин людини PANC-1 (карцинома підшлункової залози) і SK-BR-3 (аденокарцинома молочної залози), трансдукованих ретровірусом, який експресує ген coda E. coli (Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175). Цей феномен пояснюється відсутністю або слабкою ендогенною конверсією 5-FU, утвореного ферментативною дією СDази, у цитотоксичний 5-FUMP. Ця стадія, яка звичайно відбувається в клітинах ссавців під дією оротатфосфорибозилтрансферази (ОРRTази), може бути відсутньою у деяких пухлинах, і, отже, робити неефективною генну терапію на основі СDази. У прокаріот і нижчих еукаріот, урацил трансформується в UMP через дію урацилфосфорибозилтрансферази (UРRTазної активності). Цей фермент також перетворює 5-FU у 5-FUMP. Важливо те, що бактеріальна урацилфосфорибозилтрансфераза (UPRT) є функціонально еквівалентною оротатфосфорибозилтрансферазі (OPRT) або уридин-5'-монофосфатсинтазі клітин ссавців. Ці ферменти опосередковують перетворення 5-фторурацилу (5-FU) (фторованого аналога урацилу) у 5-фторуридин 5'-монофосфат (5-FUMP). 5-фторуридин 5'-монофосфат згодом перетворюється в 5-FdUDP і FdUTP за допомогою de novo піримідинового шляху ссавців. Кожна 5-FdUTP є необоротним інгібітором тимідилатсинтази (Thy-A) і в результаті приводить до виснаження dTTP. Прийнято вважати, що це перетворення є одним з необхідних шляхів для досягнення цитотоксичних ефектів 5-фторурацилу і що бактеріальна урацилфосфорибозилтрансфераза бактеріального походження здатна перетворювати 5фторурацил у такий же активний метаболіт, як оротатфосфорибозилтрансфераза ссавців. Під час відсутності UРRTазної активності або ОРRTазної активності, 5-FU, що виникає в результаті дезамінування 5-FC під дією СDази, не трансформується в цитотоксичний 5-FUMP (Jund and Lacroute, 1970, J. Bacteriol. 102, 607-615). Як описано в даній заявці, винахід належить до полінуклеотидів, які кодують поліпептиди, і поліпептидів, які містять злиття першого поліпептиду, який має цитозиндезаміназну активність, і другого поліпептиду, який має UPRT або OPRT активність. Такі злиті конструкції застосовні для перетворення урацилу або його похідного, у монофосфатний аналог, і, зокрема, 5-FU у 5-FUMP. Як буде описано більш докладно нижче, даний винахід оснований, щонайменше частково, на продукції й експресії нових поліпептидів, які каталізують перетворення 5-FC у 5-FU. В одному варіанті здійснення, представлені нові поліпептиди, які були сконструйовані таким чином, щоб вони мали поліпшені каталітичні властивості для перетворення 5-FC у 5-FU. Такі поліпептиди включають варіанти, що були змінені для включення амінокислотних замін у певних залишках. Хоча ці варіанти будуть описані більш докладно нижче, зрозуміло, що поліпептиди за даним винаходом можуть містити одну або декілька модифікованих амінокислот. Присутність модифікованих амінокислот може бути переважним, наприклад, при (a) збільшенні періоду напівжиття поліпептиду in vivo, (b) зменшенні або збільшенні антигенності поліпептиду, і (c) підвищенні стабільності поліпептиду при зберіганні. Амінокислота (амінокислоти) є модифікованою, наприклад, ко-трансляційно або пост-трансляційно під час рекомбінантної продукції (наприклад, N-зв'язане глікозилування в мотивах N--X--S/T під час експресії в клітинах ссавців) або модифікованою синтетичними способами. Відповідно до цього, «мутантний», «варіантний» або «модифікований» білок, фермент, полінуклеотид, ген або клітина означає білок, фермент, полінуклеотид, ген або клітину, яка була змінена або була отримана або деяким чином відрізняється або була видозмінена, щодо батьківського білка, ферменту, полінуклеотиду, гена або клітини. Мутантний або модифікований білок або фермент звичайно, хоча необов'язково, експресувався з мутантного полінуклеотиду або гена. «Мутація» означає будь-який процес або механізм, який у результаті приводить до одержання мутантного білка, ферменту, полінуклеотиду, гена або клітини. Мутація містить у собі будь-яку мутацію, у якій білок, фермент, полінуклеотид або генна послідовність змінена, будь-яка зумовлена зміна в клітині, що виникає в результаті такої мутації. Звичайно, мутація відбувається в полінуклеотидній або геннії послідовності, шляхом точкових мутацій, делецій або вставок одиничного або множинних нуклеотидних залишків. Мутація включає полінуклеотидні зміни, що виникають в області гена, що кодує білок, а також зміни в областях поза послідовністю, що кодує білок, такий як, але не тільки, регуляторних або промоторних послідовностях. Мутація в гені може бути такою, «що мовчить», тобто не відбивається в зміні амінокислот при експресії, приводячи до варіанта гена з «консервативною послідовністю». В основному це відбувається, коли одна амінокислота відповідає більше ніж одному кодону. Необмежувальні приклади модифікованої амінокислоти включають глікозиловану амінокислоту, сульфатовану амінокислоту, преніловану (наприклад, фарнезиловану, 5 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 геранілгераніловану) амінокислоту, ацетиловану амінокислоту, ациловану кислоту, пегильовану амінокислоту, біотинільовану амінокислоту, карбоксиловану амінокислоту, фосфориловану амінокислоту, і подібне. Посилання, достатні для інструктування фахівця відносно модифікації амінокислот, у великій кількості зустрічаються всюди в літературі. Приклади протоколів знаходяться в Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM (Humana Press, Towata, N.J.). Рекомбінантні способи одержання, виділення і використання модифікованих поліпептидів і полінуклеотидів CD за даним винаходом, описані в даній заявці. Крім рекомбінантної продукції, поліпептиди можуть бути продуковані за допомогою прямого пептидного синтезу з використанням твердофазних методик (наприклад, Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis (WH Freeman Co, San Francisco); і Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154). Пептидний синтез можна проводити вручну або автоматично. Автоматичний синтез можна проводити, наприклад, використовуючи синтезатор пептидів Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Foster City, Calif.) відповідно до інструкцій, представлених виробником. Для ілюстрації, послідовності нуклеїнової кислоти, які кодують UPRTази E. coli (Anderson et al., 1992, Eur. J. Biochem 204, 51-56), Lactococcus lactis (Martinussen and Hammer, 1994, J. Bacteriol. 176, 6457-6463), Mycobacterium bovis (Kim et al., 1997, Biochem Mol. Biol. Int 41, 11171124) і Bacillus subtilis (Martinussen et al., 1995, J. Bacteriol. 177, 271-274) можуть бути використані в контексті даного винаходу. Однак, використання UPRTази дріжджів, і, зокрема, кодованої геном FUR1 S. cerevisiae, послідовність якого описана в Kern et al. (1990, Gene 88, 149-157), включене в даний опис для посилання. Щоб звернути увагу, послідовності генів і послідовності відповідних UРRTаз можуть бути знайдені в літературі і спеціалізованих базах даних (SWISSPROT, EMBL, Genbank Medline, etc.). «Білок» або «поліпептид», терміни, які використовуються в даному описі взаємозамінно, містить один або декілька ланцюгів хімічних структурних елементів, які називаються амінокислотами, що зв'язані разом хімічними зв'язками, які називаються пептидними зв'язками. «Фермент» означає будь-яку речовину, що переважно складається повністю або у значній мірі з білка, яка каталізує або активізує, більш-менш специфічно, одну або декілька хімічних або біохімічних реакцій. Термін «фермент» також може належати до каталітичного полінуклеотиду (наприклад, РНК або ДНК). «Нативний» білок, фермент, полінуклеотид, ген або клітина, або білок, фермент, полінуклеотид, ген або клітина «дикого типу», означає білок, фермент, полінуклеотид, ген або клітину, які зустрічаються в природі. Відповідно, у різних варіантах здійснення представлені виділені або рекомбінантні поліпептиди, що містять послідовність SEQ ID NO:2 з мутацією, вибраною з групи, яка складається з A23L, V108I, I140L і будь-якого їхнього поєднання. Ще в одному варіанті здійснення, поліпептид містить послідовність SEQ ID NO:4 і включає аж до 50, 25, 10 або 5 консервативних амінокислотних замін, за винятком залишків: (a) 23, 108 і 140. В основному поліпептиди, представлені в даній заявці, демонструють цитозиндезаміназну активність, яка використовується для перетворення 5-FC у 5-FU. Даний винахід також належить до поліпептиду, що містить послідовність, що щонайменше на 80%, 90%, 95%, 98% або 99% ідентична послідовності SEQ ID NO:4, де у вказаному поліпептиді лейцин знаходиться в положенні 23, ізолейцин знаходиться в положенні 108 і лейцин знаходиться в положенні 140, і де вказаний поліпептид має цитозиндезаміназну активність. Ще в одному варіанті здійснення, поліпептид містить послідовність SEQ ID NO:4. Даний винахід додатково належить до злитих конструкцій, що містять будь-який з вказаних вище поліпептидів, оперативно зв'язаних з урацилфосфорибозилтрансферазою (UPRT) або орататфосфорибозилтрансферазою (OPRT). В одному варіанті здійснення, злита конструкція містить перший поліпептид, що містить SEQ ID NO:2 з мутацією, вибраною з групи, яка складається з A23L, V108I, I140L і будь-якого їхнього поєднання, зв'язаний із другим поліпептидом, який має UPRT або OPRT активність. Ще у одному варіанті здійснення, злита конструкція містить перший поліпептид, що має послідовність SEQ ID NO:4 і включає аж до 50, 25, 10 або 5 консервативних амінокислотних замін, за винятком залишків: 23, 108 і 140 де перший поліпептид зв’язаний з другим поліпептидом, який має UPRT або OPRT активність. Даний винахід також належить до злитої конструкції, що містить перший поліпептид, який має цитозиндезаміназну активність, і який містить послідовність, яка щонайменше на 80%, 90%, 95%, 98% або 99% ідентична послідовності SEQ ID NO:4, де у вказаному поліпептиді лейцин знаходиться у положенні 23, ізолейцин знаходиться у положенні 108 і лейцин знаходиться у положенні 140, і де перший поліпептид зв’язаний з другим поліпептидом, який має UPRT або OPRT активність. В одному варіанті здійснення, поліпептиди, які мають UPRT або OPRT активність, містять послідовність SEQ ID NO:8 і 10, відповідно, або її варіанти. Ще в одному 6 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіанті здійснення, перший поліпептид, який має цитозиндезаміназну активність, зв'язаний з поліпептидом, який має UPRT або OPRT активність, де поліпептиди розділені пептидним лінкером. В іншому варіанті здійснення, злита конструкція містить послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:11, 12 або 13. Термін «оперативно зв'язаний» або «оперативно асоційований» належить до функціонального зв'язку або асоціації між регуляторною послідовністю і полінуклеотидом, який регулюється цією регуляторною послідовністю, або між двома різними поліпептидами, або полінуклеотидами, що кодують такі поліпептиди. Злита конструкція, що містить поліпептид, який має CD активність, і поліпептид, який має UPRT або OPRT активність, може бути сконструйована таким чином, щоб вона містила сайт розщеплення, щоб допомогти у виділенні білка або іншої лінкерної групи. Звичайно лінкер буде являти собою пептидну лінкерну групу. Довжину лінкерної групи вибирають для оптимізації біологічної активності поліпептиду CD і UPRT або поліпептиду OPRT і вона може бути визначена емпірично без проведення зайвих експериментів. Лінкерна група повинна бути досить довгою і досить гнучкою, щоб дати можливість субстрату взаємодіяти з поліпептидом CD і поліпептидом UPRT або OPRT. Лінкерна група являє собою пептид довжиною приблизно від одного до 30 амінокислотних залишків, звичайно приблизно від двох до 15 амінокислотних залишків. Прикладами лінкерних груп є --Gly--Gly--, GGGGS (SEQ ID NO:22), (GGGGS)N (SEQ ID NO:23), (SGGGG)N (SEQ ID NO:23), GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO:25), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO:26), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEQ ID NO:27), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:28) або EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO:29). Лінкерні групи описані, наприклад, у Huston et al., Proc. Nat'l Acad. Sci 85:5879, 1988; Whitlow et al., Protein Engineering 6:989, 1993; і Newton et al., Biochemistry 35:545, 1996. Іншими прийнятними пептидними лінкерами є лінкери, описані в патентах США №№ 4751180 і 4935233, які таким чином включені за допомогою посилання. Послідовність ДНК, що кодує бажаний пептидний лінкер, може бути вбудована між, і в тій же рамці зчитування, що і полінуклеотид, який кодує поліпептид CD, за яким йде поліпептид UPRT або OPRT, з використанням будь-якої прийнятної загальноприйнятої методики. Наприклад, хімічно синтезований олігонуклеотид, що кодує лінкер, може бути лігований між двома кодуючими полінуклеотидами. У конкретних варіантах здійснення, злитий поліпептид містить від двох до чотирьох окремих доменів (наприклад, домен CD і UPRT або OPRT) відділених пептидними лінкерами. «Консервативна амінокислотна заміна» або просто «консервативні варіанти» конкретної послідовності належать до заміни однієї амінокислоти або ряду амінокислот, по суті на ідентичні амінокислотні послідовності. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що індивідуальні заміни, делеції або додавання, які змінюють, додають або видаляють одиничну амінокислоту або процентний вміст амінокислот в кодованій послідовності, приводять до «консервативних варіантів», у яких зміни приводять до делеції амінокислоти, додавання амінокислоти або заміни амінокислоти хімічно подібною амінокислотою. Таблиці консервативних замін, які представляють функціонально подібні амінокислоти, добре відомі з рівня техніки. Наприклад, одна група консервативних замін включає аланін (A), серин (S) і треонін (T). Інша група консервативних замін включає аспарагінову кислоту (D) і глутамінову кислоту (E). Інша група консервативних замін включає аспарагін (N) і глутамін (Q). Ще одна група консервативних замін включає аргінін (R) і лізин (K). Інша група консервативних замін включає ізолейцин (I), лейцин (L), метіонін (M) і валін (V). Інша група консервативних замін включає фенілаланін (F), тирозин (Y) і триптофан (W). Таким чином, «консервативні амінокислотні заміни» перерахованих поліпептидних послідовностей (наприклад, SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13 і т. д.) включають заміни процентного вмісту, звичайно менше 10%, амінокислот поліпептидної послідовності, консервативно вибраною амінокислотою тієї ж групи консервативних замін. Відповідно, консервативно заміщений варіант поліпептиду за даним винаходом може містити 100, 75, 50, 25 або 10 замін консервативно заміщених варіантом тієї ж групи консервативних замін. «Активність» ферменту являє собою критерій його здатності каталізувати реакцію, тобто, «функціонувати», і може бути виражена як швидкість, з якою утворюється продукт реакції. Наприклад, активність ферменту може бути представлена як кількість продукту, утвореного за одиницю часу або на одиницю ферменту (наприклад, концентрація або маса) або в значеннях афінності або констант дисоціації. Використовувана взаємозамінно в контексті даного винаходу «цитозиндезаміназна активність», «біологічна активність цитозиндезамінази» або «функціональна активність цитозиндезамінази», належить до активності, яка виявляється білком або поліпептидом цитозиндезамінази за даним винаходом, відносно субстрату цитозиндезамінази, як визначено in vivo або in vitro, відповідно до стандартних методик. Аналізи 7 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для вимірювання цитозиндезаміназної активності відомі з рівня техніки. Наприклад, цитозиндезаміназну активність можна вимірювати шляхом визначення швидкості перетворення 5-FC у 5-FU або цитозину в урацил. Визначення 5-FC, 5-FU, цитозину й урацилу може бути виконане за допомогою хроматографії й інших способів, відомих з рівня техніки. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що багато консервативних варіантів конструкцій нуклеїнової кислоти, які описані, дають на виході функціонально ідентичну конструкцію. Наприклад, як розглянуто вище, внаслідок виродженості генетичного коду, «заміни, що мовчать» (тобто, заміни в послідовності нуклеїнової кислоти, яка у результаті не приводить до зміни в кодованому поліпептиді) означали властивість кожної послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує амінокислоту. Фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що внаслідок виродженості генетичного коду, може бути отримана велика кількість нуклеотидних послідовностей, що кодують модифіковані цитозиндезаміназні поліпептиди, деякі з яких несуть істотну ідентичність з послідовностями нуклеїнових кислот, явно описаних у даному винаході. Наприклад, кодони AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, і CGU усі кодують амінокислоту аргінін. Таким чином, у кожному положенні в нуклеїнових кислотах за даним винаходом, де аргінін визначений кодоном, цей кодон може бути змінений у будь-який з відповідних кодонів, описаних вище, без зміни кодованого поліпептиду. Зрозуміло, що U у послідовності РНК відповідає T у послідовності ДНК. Аналогічно, «консервативні амінокислотні заміни», в одній або декількох амінокислотах в амінокислотній послідовності, заміщені іншими амінокислотами з дуже схожими властивостями, також легко ідентифікуються як у високому ступені подібні до описаної конструкції. Такі консервативні варіанти кожної описаної послідовності є особливістю поліпептидів, представлених у даному описі. «Консервативні варіанти» являють собою білки або ферменти, у яких заданий амінокислотний залишок був замінений без зміни в цілому конформації і функції білка або ферменту, включаючи, але не обмежуючи цим, заміну амінокислоти амінокислотою, яка має схожі властивості, включаючи полярний або неполярний характер, розмір, форму і заряд. Амінокислоти, відмінні від амінокислот, вказаних як консервативні, можуть відрізнятися в білку або ферменті, так, щоб подібність процентного складу білка або амінокислотної послідовності між будь-якими двома білками аналогічної функції могли варіювати і могли складати, наприклад, щонайменше 30%, щонайменше 50%, щонайменше 70%, щонайменше 80% або щонайменше 90%, як визначено відповідно до схеми вирівнювання. Як викладено в даній заявці, «подібність послідовностей» означає ступінь, до якого нуклеотидні або білкові послідовності є спорідненими. Ступінь подібності між двома послідовностями може бути основана на відсотку ідентичності послідовностей і/або консервативності. «Ідентичність послідовностей» у даній заявці означає ступінь, до якого дві нуклеотидні або амінокислотні послідовності є інваріантними. «Вирівнювання послідовностей» означає процес вибудовування в одну лінію двох або більше послідовностей для досягнення максимальних рівнів ідентичності (і, у випадку амінокислотних послідовностей, консервативності) для цілей визначення ступеня подібності. Численні способи вирівнювання послідовностей і визначення подібності/ідентичності відомі з рівня техніки, наприклад, такі як кластерний метод, у якому подібність основана на алгоритмі MEGALIGN, а також BLASTN, BLASTP, і FASTA (Lipman and Pearson, 1985; Pearson and Lipman, 1988). При використанні всіх цих програм, переважними параметрами настроювання є ті, які в результаті приводять до найбільшої подібності послідовностей. Наприклад, «ідентичність» або «відсоток ідентичності» відносно конкретної пари вирівнюваних амінокислотних послідовностей може належати до відсотка ідентичності амінокислотних послідовностей, отриманому за допомогою аналізу ClustalW (версія W 1.8, доступна від Європейського інституту біоінформатики, Cambridge, UK), підрахунку числа ідентичних відповідностей у вирівнюванні і розподілу цього числа ідентичних відповідностей на найбільше з наступних показників (i) довжину вирівнюваних послідовностей, і (ii) 96, і використовуючи наступні параметри по умовчанню ClustalW для досягнення повільних/точних попарних вирівнювань-штраф за відкритий розрив: 10; штраф за подовження розриву: 0,10; матриця маси білка: Gonnet series; матриця маси ДНК: IUB; Toggle Slow/Fast попарні вирівнювання=SLOW або FULL Alignment. Дві послідовності є «оптимально вирівняними», коли вони вирівняні по балах подібності з використанням визначеної матриці амінокислотних замін (наприклад, BLOSUM62), штрафу за розрив і штрафу за подовження розриву, щоб одержати найбільш високий бал, можливий для цієї пари послідовностей. Матриці амінокислотних замін і їхнє використання в кількісному визначенні подібності між двома послідовностями добре відомі з рівня техніки й описані, наприклад, у Dayhoff et al. (1978) «A model of evolutionary change in proteins» у «Atlas of Protein Sequence і Structure», Vol. 5, Suppl. 3 (ed. M. O. Dayhoff), pp. 345-352. Natl. Biomed. Res. Found., 8 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Washington, D.C. і Henikoffet al. (1992) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919. Матрицю BLOSUM62 (Фіг. 10) найчастіше використовують як підстановлювальної матриці по умовчанню для підрахунку балів у протоколах вирівнювання послідовностей, таких як Gapped BLAST 2.0. Штраф за розрив, що накладається на введення одного амінокислотного розриву в одній з вирівняних послідовностей, і штраф за подовження розриву, що накладається на кожне додаткове порожнє положення амінокислоти, включене у вже відкритий розрив. Вирівнювання визначається положеннями амінокислот кожної послідовності, у якій вирівнювання починається і закінчується, і необов'язково вставкою або розриву численних разивов в одній або обох послідовностях, для досягнення найбільш можливого бала. Хоча оптимальне вирівнювання і підрахунок балів може проводитися вручну, цей процес полегшується використанням комп'ютерного алгоритму вирівнювання, наприклад, що містить розриви BLAST 2.0, описаний у Altschul et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402, і зроблений загальнодоступним на National Center for Biotechnology Information (NCBI) Website (www.ncbi.nlm.nih.gov). Оптимальні вирівнювання, у тому числі множинні вирівнювання, можуть бути отримані з використанням, наприклад, PSI-BLAST, доступного через вебсайт NCB1 і описаний Altschul et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. Відносно амінокислотної послідовності, яка є оптимально вирівняною з еталонною послідовністю, амінокислотний залишок «відповідає» положенню в еталонній послідовності, з якою цей залишок утворює пари при вирівнюванні. «Положення» позначається числом, яке послідовно визначає кожну амінокислоту в еталонній послідовності на підставі її положення щодо N-кінця. Внаслідок делецій, вставок, зрізань, злиттів, і так далі, які повинні бути прийняті до уваги при визначенні оптимального вирівнювання, узагалі, номер амінокислотного залишку в тестованій послідовності, який визначається простим підрахунком від N-кінця, не обов'язково буде таким же, як номер його відповідного положення в еталонній послідовності. Наприклад, у тому випадку, коли має місце делеція у вирівнюваній тестованій послідовності, там не буде амінокислоти, що відповідає положенню в еталонній послідовності в місці делеції. У тому випадку, коли має місце вставка у вирванюваній еталонній послідовності, ця вставка не буде відповідати якому-небудь положенню амінокислот в еталонній послідовності. У випадку зрізань або злиттів, можуть бути ділянки амінокислот або в еталонній, або вирівнюваній послідовності, які не відповідають якій-небудь амінокислоті у відповідній послідовності. Неконсервативними модифікаціями конкретного поліпептиду є модифікації, які заміняють будь-яку амінокислоту, не охарактеризовані як консервативна заміна. Наприклад, будь-яка заміна, яка перетинає зв'язки шести груп, викладених вище. Ці заміни включають заміни основних або кислих амінокислот нейтральними амінокислотами (наприклад, Asp, Glu, Asn або Gln на Val, Ile, Leu або Met), ароматичної амінокислоти основними або кислими амінокислотами (наприклад, Phe, Tyr або Trp на Asp, Asn, Glu або Gln) або будь-яку іншу заміну, яка не заміняє амінокислоту подібною амінокислотою. Основні бічні ланцюги включають лізин (K), аргінін (R), гістидин (H); кислі бічні ланцюги включають аспарагінову кислоту (D), глутамінову кислоту (E); незаряджені полярні бічні ланцюги включають гліцин (G), аспарагін (N), глутамін (Q), серин (S), треонін (T), тирозин (Y), цистеїн (C); неполярні бічні ланцюги включають аланін (A), валін (V), лейцин (L), ізолейцин (I), пролін (P), фенілаланін (F), метіонін (M), триптофан (W); бетарозгалужені бічні ланцюги включають треонін (T), валін (V), ізолейцин (I); ароматичні бічні ланцюги включають тирозин (Y), фенілаланін (F), триптофан (W), гістидин (H). Відповідно до цього, деякі амінокислотні залишки у визначених положеннях у поліпептиді «виключені» з консервативних амінокислотних замін. Наприклад, у даному описі представлений поліпептид, що містить послідовність SEQ ID NO:4. У деяких варіантах здійснення, поліпептид може бути змінений консервативними амінокислотними замінами, як описано вище, однак, деякі залишки бажано залишати незаміщеними, наприклад, залишки в положеннях 23, 108, і 140. «Батьківський» білок, фермент, полінуклеотид, ген або клітина, являє собою будь-який білок, фермент, полінуклеотид, ген або клітину, з якої будь-який інший білок, фермент, полінуклеотид, ген або клітина, походить або отриманий, за допомогою будь-яких способів, інструментів або методик, а сам батьківський варіант може бути або може не бути природним або мутантним. Батьківський полінуклеотид або ген кодує батьківський білок або фермент. Полінуклеотид, поліпептид або інший компонент є «виділеним», коли він частково або повністю відділений від компонентів, з якими він звичайно зв'язаний (інших білків, нуклеїнових кислот, клітин, синтетичних реагентів і так далі). Нуклеїнова кислота або поліпептид є «рекомбінантними», коли вони є штучними або сконструйованими або отримані зі штучного або сконструйованого білка або нуклеїнової кислоти. Наприклад, полінуклеотид, який вбудований у вектор або будь-яке інше гетерологічне положення, наприклад, у геном рекомбінантного організму, так, щоб він не був зв'язаний з нуклеотидними послідовностями, які звичайно 9 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фланкують полінуклеотид, у тому вигляді, як він знаходиться в природі, являє собою рекомбінантний полінуклеотид. Білок, який експресується in vitro або in vivo з рекомбінантного полінуклеотиду являє приклад рекомбінантного поліпептиду. Аналогічно цьому, полінуклеотидна послідовність, яка не зустрічається в природі, наприклад, варіант природного гена, є рекомбінантною. В інших варіантах здійснення представлені виділені полінуклеотиди, які кодують поліпептид цитозиндезамінази або злиту конструкцію за даним винаходом. В одному аспекті, даний винахід належить до виділених або рекомбінантних полінуклеотидів, які називаються у даній заявці «CD оптимізованими полінуклеотидами», «CD полінуклеотидами» або «CD-злитими полінуклеотидами». Використовувані терміни «полінуклеотид», «нуклеотидна послідовність» і «молекула нуклеїнової кислоти» належать до полімеру нуклеотидів (A, C, T, U, G і т. д. або природних або штучних аналогів нуклеотидів), наприклад, ДНК або РНК або їх копійності, наприклад, послідовності символів і т. д. у залежності від розглянутої ситуації. Заданий полінуклеотид або комплементарний полінуклеотид може бути визначений по будь-якій встановленій нуклеотидній послідовності. Один з варіантів здійснення даного винаходу належить до виділених полінуклеотидів, які кодують поліпептид цитозиндезамінази або мутантної цитозиндезамінази, або їх біологічно активних частин. Використовуваний у даному описі термін «молекула нуклеїнової кислоти» або «полінуклеотид» включає молекули ДНК (наприклад, кДНК або геномну ДНК) і молекули РНК (наприклад, мРНК) і аналоги ДНК або РНК, отримані з використанням нуклеотидних аналогів. Молекула нуклеїнової кислоти може бути односпіральною або двоспіральною. В одному варіанті здійснення, CD оптимізований полінуклеотид або CD полінуклеотид містить рекомбінантні, сконструйовані або виділені форми природних нуклеїнових кислот, виділених з організму, наприклад, штаму бактерій або дріжджів. Полінуклеотиди CD, які приводяться як приклад, включають ті, які кодують поліпептиди дикого типу SEQ ID NO: 2. В іншому варіанті здійснення даного винаходу, CD полінуклеотиди одержують шляхом диверсифікованості, наприклад, рекомбінації і/або мутації одного або декількох природних, виділених або рекомбінантних CD полінуклеотидів. Як описано більш докладно в інших місцях даного опису, можливо одержати диверсифіковані CD полінуклеотиди, які кодують CD поліпептиди з чудовими функціональними властивостями, наприклад, підвищеною каталітичною функцією, підвищеною стабільністю або більш високим рівнем експресії, ніж CD полінуклеотид, який використовується як субстрат або вихідний у процесі диверсифікованості. Полінуклеотиди, які приводяться як приклад, включають SEQ ID NO:3 і 5 і ті, які кодують CD варіантні поліпептиди за даним винаходом. Полінуклеотиди за даним винаходом мають цілий ряд застосувань, наприклад, у рекомбінантному одержанні (тобто експресії) CD поліпептидів за даним винаходом і як субстрати для подальшого відтворення розмаїтості, наприклад, реакцій рекомбінації або реакцій мутації для одержання нових і/або поліпшених гомологів CD, і подібного. Важливо відзначити, що деякі специфічні, важливі і достовірні застосування CD полінуклеотидів не вимагають, щоб цей полінуклеотид кодував поліпептид зі значною CD активністю або навіть активністю варіанта CD. Наприклад, CD полінуклеотиди, які не кодують активні ферменти, можуть бути цінними джерелами батьківських полінуклеотидів для застосування в методиках диверсифікованості для одержання варіантів CD полінуклеотиду або не-CD полінуклеотидів, з бажаними функціональними властивостями (наприклад, високою k cat або kcat/Km, низькою Km, високою стабільністю відносно нагрівання або інших факторів навколишнього середовища, високою швидкістю транскрипції або трансляції, стійкості до протеолітичного розщеплення і т. д.). CD полінуклеотиди, у тому числі нуклеотидні послідовності, які кодують CD поліпептиди і їхні варіанти, фрагменти поліпептидів CD, споріднені злиті білки або їхні функціональні еквіваленти, використовують у рекомбінантних молекулах ДНК, що направляють експресію поліпептидів CD у відповідних клітинах-хазяях, таких як бактеріальні клітини. Унаслідок властивої генетичному коду виродженості, інші послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують по суті таку ж або функціонально еквівалентну амінокислотну послідовність, також можуть бути використані для клонування й експресії полінуклеотидів CD. Використовуваний у даному описі термін «клітина-хазяїн» включає клітину будь-якого типу, яка піддана трансформації конструкцією нуклеїнової кислоти. Термін «трансформація» означає введення чужорідного (наприклад, стороннього або позаклітинного) гена, послідовності ДНК або РНК у клітину-хазяя, так, щоб клітина-хазяїн експресувала введений ген або послідовність для продукції бажаної речовини, звичайно, білка або ферменту, кодованого введеним геном або послідовністю. Уведений ген або послідовність може включати регуляторні або контрольні послідовності, 10 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 наприклад, стартову, стоп, промоторну, сигнальну, секретовану або інші послідовності, які використовуються генетичним апаратом клітини. Клітина-хазяїн, яка одержує і експресує уведену ДНК або РНК, була «трансформована» і є «трансформантом» або «клоном». ДНК або РНК, введена в клітину-хазяя може бути отримана з будь-якого джерела, у тому числі клітина того ж роду або виду як хазяїн або клітина іншого роду або виду. Як буде зрозуміло фахівцю в даній галузі, може бути переважним модифікувати кодуючу послідовність, для посилення її експресії в конкретній клітині-хазяїні. Генетичний код дублюється 64 можливими кодонами, але більшість організмів переважно використовують підгрупу цих кодонів. Кодони, що використовуються найбільш часто у видах, називають оптимальними кодонами, а ті, які не використовуються дуже часто, класифікують як рідкі або рідко використовувані кодони (дивися, наприклад, Zhang et al. (1991) Gene 105:61-72). Кодони можуть бути замінені для відображення переважної частоти використання кодонів клітинихазяя, процес іноді називається «оптимізацією кодону» або «контролем за відхиленням різновиду кодонів». Оптимізовані кодуючи послідовності, які містять кодони, переважні у конкретної прокаріотичної або еукаріотичної клітини-хазяя (дивися, також Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:477-508) можуть бути отримані, наприклад, для збільшення швидкості трансляції або для одержання рекомбінантних РНК транскриптів, які мають бажані властивості, такі як більш довгий період напівжиття, у порівнянні з транскриптами, які продукуються з неоптимізованої послідовності. Стоп-кодони трансляції також можуть бути модифіковані для відображення переваги клітини-хазяя. Наприклад, переважними стоп-кодонами для S. cerevisiae і ссавців є UAA і UGA, відповідно. Переважним стоп-кодоном для однодольних рослин є UGA, тоді як комахи і E. coli воліють використовувати UAA як стоп-кодон (Dalphin et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24: 216-218). Відхилення в частоті використання кодонів належать до розходжень серед організмів у частоті появи кодонів у послідовностях ДНК (генах), які кодують білок. Кодон являє собою серію трьох нуклеотидів (триплетів), який кодує визначений амінокислотний залишок у поліпептидному ланцюзі. Оскільки в ДНК існує чотири нуклеотиди, аденін (A), гуанін (G), цитозин (C) і тимін (T), існує 64 можливих триплети, що кодують 20 амінокислот, і три кодони термінації трансляції (нонсенс). Внаслідок цієї надмірності, усі крім двох амінокислот кодуються більше ніж одним триплетом. Різні організми найчастіше демонструють конкретні переваги одного з декількох кодонів, що кодують ту саму амінокислоту. Те, як ця перевага виникає, є дуже обговорюваною областю молекулярного розвитку. В основному є загальновизнаним те, що переваги кодонів відбивають баланс між мутаційними відхиленнями і природним добором оптимізації трансляції. Оптимальні кодони в швидкорослих мікроорганізмах, на зразок Escherichia coli або Saccharomyces cerevisiae (пекарських дріжджах), відбивають склад їх відповідного геномного пулу тРНК. Вважається, що оптимальні кодони допомагають досягати більш високих швидкостей трансляції і високої точності. У результаті цих факторів, очікується, що трансляційна селекція є сильнішою у високоекспресованих генах, яка необхідна у випадку вказаних вище мікроорганізмів. В інших організмах, що не демонструють високі швидкості росту або які представляють невеликі геноми, оптимізація частоти використання кодонів звичайно відсутня, і переваги кодонів визначається характерними мутаційними відхиленнями, що спостерігаються в цьому конкретному геномі. Прикладами цього є Homo sapiens (людина) і Helicobacter pylori. Організми, що демонструють проміжний рівень оптимізації використання кодонів, включають Drosophila melanogaster (плодова мушка), Caenorhabditis elegans (нематодні хробаки) або Arabidopsis thaliana (гусимець). Термін «послідовності з оптимізованими кодонами» в основному належить до нуклеотидних послідовностей, що були оптимізовані для конкретних видів клітин-хазяїв шляхом заміни будьяких кодонів, що мають частоту використання приблизно менше 20%. Нуклеотидні послідовності, що були оптимізовані для експресії в заданих видах клітин-хазяїв шляхом елімінації випадкових послідовностей поліаденілування, елімінації екзон/інтронних сигналів сплайсингу, елімінації транспозонподібних повторів і/або оптимізації вмісту GC на додаток до оптимізації кодонів, називається в даному описі «послідовностями посиленої експресії». 55 11 UA 104298 C2 Таблиця 1 Частота використання кодонів людини і перевага кодонів. Для кожного кодону в таблиці показана частота використання кожного кодону (на тисячу) в кодуючих областях людини (перший стовпчик) і відносна частота кожного кодону серед синонімічних кодонів (другий стовпчик). Gly Gly Gly Gly Glu Glu Asp Asp Val Val Val Val Ala Ala Ala Ala 5 10 15 20 25 30 35 GGG GGA GGT GGC GAG GAA GAT GAC GTG GTA GTT GTC GCG GCA GCT GCC 17,08 19,31 13,66 24,94 38,82 27,51 21,45 27,06 28,60 6,09 10,30 15,01 7,27 15,50 20,23 28,43 0,23 0,26 0,18 0,33 0,59 0,41 0,44 0,56 0,48 0,10 0,17 0,25 0,10 0,22 0,28 0,40 Таблиця частоти використання кодонів людини Arg AGG 12,09 0,22 Trp TGG 14,74 1,00 Arg AGA 11,73 0,21 End TGA 2,64 0,61 Ser AGT 10,18 0,14 Cys TGT 9,99 0,42 Ser AGC 18,54 0,25 Cys TGC 13,86 0,58 Lys AAG 33,79 0,60 End TAG 0,73 0,17 Lys AAA 22,32 0,40 End TAA 0,95 0,22 Asn AAT 16,43 0,44 Tyr TAT 11,80 0,42 Asn AAC 21,30 0,56 Tyr TAC 16,48 0,58 Met ATG 21,86 1,00 Leu TTG 11,43 0,12 Ile ATA 6,05 0,14 Leu TTA 5,55 0,06 Ile ATT 15,03 0,35 Phe TTT 15,36 0,43 Ile ATC 22,47 0,52 Phe TTC 20,72 0,57 Thr ACG 6,80 0,12 Ser TCG 4,38 0,06 Thr ACA 15,04 0,27 Ser TCA 10,96 0,15 Thr ACT 13,24 0,23 Ser TCT 13,51 0,18 Thr ACC 21,52 0,38 Ser TCC 17,37 0,23 Arg Arg Arg Arg Gln Gln His His Leu Leu Leu Leu Pro Pro Pro Pro CGG CGA CGT CGC CAG CAA CAT CAC CTG CTA CTT CTC CCG CCA CCT CCC 10,40 5,63 5,16 10,82 32,95 11,94 9,56 14,00 39,93 6,42 11,24 19,14 7,02 17,11 18,03 20,51 0,19 0,10 0,09 0,19 0,73 0,27 0,41 0,59 0,43 0,07 0,12 0,20 0,11 0,27 0,29 0,33 Відповідно до цього, у деяких варіантах здійснення даного винаходу полінуклеотид містить молекулярний кодон, оптимізований для трансляції в клітинах людини. Наприклад, послідовності SEQ ID NO:3 і 5 містять послідовності, які були оптимізовані для продукції цитозиндезамінази в клітині-хазяїні людини. Даний винахід, таким чином, належить до полінуклеотиду з кодонами, оптимізованими для трансляції в клітинах людини, що кодує поліпептид, який має цитозиндезаміназну активність. Полінуклеотид, який містить кодони, оптимізовані для трансляції в клітинах людини, за даним винаходом (наприклад, SEQ ID NO:5) додатково може включати додаткові мутації, що у результаті приводять до консервативної амінокислотної заміни і або поліпшеної активності або стабільності кодованого поліпептиду. Наприклад, мутації в положеннях 23, 108 і 140 поліпептиду, що містить SEQ ID NO:6 забезпечують підвищену термостабільність. Відповідно, даний винахід належить до полінуклеотиду, що містить оптимізовані кодони для трансляції в клітинах людини, що кодує поліпептид, який має цитозиндезаміназну активність і підвищену термостабільність. В одному варіанті здійснення, полінуклеотид, який містить кодони, оптимізовані для трансляції в клітинах людини, що кодує поліпептид послідовності SEQ ID NO:4, де кодони, що кодують амінокислоти вказаного поліпептиду були оптимізовані для експресії в клітинах людини. В іншому варіанті здійснення, полінуклеотид за даним винаходом містить послідовність SEQ ID NO:3 або 5. В одному варіанті здійснення, даний винахід належить до полінуклеотиду, що містить полінуклеотид цитозиндезамінази або полінуклеотид з оптимізованими кодонами, або мутантну форму, зв'язаного з гетерологічним полінуклеотидом, що кодує поліпептид, який має UPRT або OPRT активність. Полінуклеотид за даним винаходом, що містить наприклад, послідовність, яка кодує поліпептид послідовності SEQ ID NO:4, 8, 10, 12, 14, 16 або 18; або має будь-яку нуклеотидну послідовність з SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 або 17 або їх частина, може бути виділений і продукований з використанням стандартних методик молекулярної біології й інформації про послідовність, представлену в даному описі. Полінуклеотид за даним винаходом може бути ампліфікований з використанням кДНК, мРНК або, альтернативно, геномної ДНК, як матриці і відповідними олігонулеотидними праймерами, відповідно до стандартних методик ПЛР ампліфікації. Нуклеїнова кислота, ампліфікована таким чином, може бути клонована у відповідний вектор і охарактеризована за допомогою аналізу послідовності ДНК. Більш того, олігонуклеотиди, що відповідають нуклеотидним послідовностям, можуть бути отримані за допомогою стандартних методик синтезу, наприклад, використовуючи автоматичний синтезатор ДНК. У деяких варіантах здійснення, виділена 12 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка комплементарна нуклеотидній послідовності, яка кодує будь-який поліпептид послідовностей SEQ NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 або 18 або що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 або 17. В іншому варіанті здійснення, виділений полінуклеотид за даним винаходом містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка гібридизується в жорстких умовах з молекулою нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, викладений у будь-якій з послідовностей SEQ NO:4, 12, 14, 16 або 18 або складається з нуклеотидної послідовності SEQ ID NO:3, 5, 11, 13, 15 або 17. В інших варіантах здійснення, довжина нуклеїнової кислоти складає щонайменше 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 або 600 нуклеотидів. Молекули нуклеїнової кислоти є «гібридизованими» одна з одною, коли щонайменше один ланцюг одного полінуклеотиду може піддаватися відпалу з іншим полінуклеотидом у певних умовах твердості. Твердість гібридизації визначається, наприклад, (a) температурою, при якій проводиться гібридизація і/або промивання, і (b) іонною силою і полярністю (наприклад, формаміду) розчинів для гібридизації і промивання, а також іншими параметрами. Для гібридизації потрібно, щоб два полінуклеотиди містили по суті комплементарні послідовності; у залежності від твердості гібридизації, однак, може допускатися помилкове спарювання. Звичайно гібридизація двох послідовностей при високій твердості (наприклад, такій як у водному розчині 0,5 X SSC при 65ºC) вимагає, щоб послідовності виявляли дещо вищий ступінь комплементарності в порівнянні з їх повною послідовністю. Умови проміжної твердості (такі як, наприклад, водний розчин 2 X SSC при 65ºC) і низької твердості (такі як, наприклад, водний розчин 2 X SSC при 55ºC), вимагають відповідно меншої сумарної комплементарності між послідовностями, які гібридизуються (1 X SSC являє собою 0,15 M NaCl, 0,015 M цитрат Na). Молекули нуклеїнової кислоти, які гібридизуються, включають ті, які відпалюються в прийнятних умовах твердості, і які кодують поліпептиди або ферменти, які мають таку ж функцію, наприклад, здатність каталізувати перетворення 5-фторцитозину (5-FC) у 5-фторурацил (5-FU), за даним винаходом. Далі, термін «гібридизується в жорстких умовах» призначений для опису умов гібридизації і промивання, у яких нуклеотидні послідовності щонайменше на 30%, 40%, 50% або 60% гомологічні одна одній, звичайно залишаються гібридизованими одна з одною. Переважно, ці умови є такими, щоб послідовності щонайменше приблизно на 70%, більш переважно, щонайменше приблизно на 80%, ще більш переважно, щонайменше приблизно на 85% або на 90% гомологічні одна одній залишалися гібридизованими одна з одною. У деяких випадках, виділена молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом гібридизується в жорстких умовах з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, викладений у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO:4, 12, 14, 16 або 18 або що має нуклеотидну послідовність, викладену у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO:3, 5, 11, 13, 15 або 17. Використовувана в контексті даного опису молекула «природної» нуклеїнової кислоти належить до молекули РНК або ДНК, що має нуклеотидну послідовність, яка зустрічається в природі (наприклад, кодує природний білок). Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що зміни можуть бути введені шляхом мутації в нуклеотидні послідовності будь-яких полінуклеотидів, що кодують поліпептид, викладений у будь-якій з послідовностей SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 або 18 або що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 або 17, приводячи, тим самим, до змін в амінокислотній послідовності кодованих білків. У деяких випадках зміна приведе до зміненої функції цього поліпептиду. В інших випадках ця зміна не буде змінювати функціональну здатність кодованого поліпептиду. В основному, заміни, що не змінюють функцію поліпептиду, включають нуклеотидні заміни, що приводять до амінокислотних замін у «несуттєвих» амінокислотних залишках. «Несуттєвим» амінокислотним залишком є залишок, що може бути змінений з батьківської послідовності без зміни біологічної активності отриманого в результаті поліпептиду, наприклад, каталізуючого перетворення 5-FC у 5-FU. Також розглядаються ті ситуації, у яких бажано змінити активність батьківського полінуклеотиду, так, щоб цей поліпептид мав нову або підвищену активність відносно конкретного субстрату або підвищену стабільність або знижене руйнування. Зрозуміло, що ці амінокислотні заміни в основному не складають «консервативні» заміни. Замість цього, ці заміни складають неконсервативні заміни, введені в послідовність для одержання нової або поліпшеної активності. Наприклад, послідовність SEQ ID NO:1 надає батьківську послідовність нуклеїнової кислоти для цитозиндезамінази S. cervisae (SEQ ID NO:2 представляє відповідний поліпептид). Послідовність SEQ ID NO:3 представляє послідовність нуклеїнової кислоти мутантної послідовності, яка включає амінокислотні заміни, що додають підвищеної стабільності цьому поліпептиду. Відповідно, молекула нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислотну 13 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовність SEQ ID NO:2, представляє «батьківську» молекулу нуклеїнової кислоти, що може бути мутована для одержання молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує модифікований поліпептид, що включає амінокислотні заміни. Також повинно бути зрозуміло, що модифікований поліпептид може складати «батьківський» поліпептид з якого можуть бути отримані додаткові заміни. Відповідно, батьківський поліпептид і молекула нуклеїнової кислоти, що кодує батьківський поліпептид, включає модифіковані поліпептиди і не тільки послідовність «дикого типу». Наприклад, полінуклеотид послідовності SEQ ID NO:5 являє собою модифікований полінуклеотид щодо послідовності SEQ ID NO:1 (тобто «батьківський» полінуклеотид). Аналогічно, полінуклеотид послідовності SEQ ID NO:3 являє собою модифікований полінуклеотид відносно SEQ ID NO:5. Відповідно, послідовність SEQ ID NO:5 являє собою батьківську послідовність SEQ ID NO:3. Мутаційні способи урізноманітнення включають, наприклад, сайт-направлений мутагенез (Ling et al. (1997) «Approaches to DNA mutagenesis: an overview» Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al. (1996) «Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method» Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) «In vitro mutagenesis» Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle (1985) «Strategies and applications of in vitro mutagenesis» Science 229:1193-1201; Carter (1986) «Site-directed mutagenesis» Biochem. J. 237:1-7; і Kunkel (1987) «The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis» у Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin)); мутагенез з використанням матриць, що містять урацил (Kunkel (1985) «Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection» Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) «Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection» Methods у Enzymol. 154, 367-382; і Bass et al. (1988) «Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities» Science 242:240-245); олігонуклеотиднаправлений мутагенез (Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329350 (1987); Zoller & Smith (1982) «Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment» Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith (1983) «Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors» Methods in Enzymol. 100:468-500; і Zoller & Smith (1987) «Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template» Methods у Enzymol. 154:329-350); фосфоротіоат-модифікований ДНК мутагенез (Taylor et al. (1985) «The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA» Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor et al. (1985) «The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioatemodified DNA» Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787; Nakamaye & Eckstein (1986) «Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotidedirected mutagenesis» Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers et al. (1988) «Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis» Nucl. Acids Res. 16:791-802; і Sayers et al. (1988) «Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide» Nucl. Acids Res. 16: 803-814); мутагенез з використанням двоспіральної ДНК, що містить розриви (Kramer et al. (1984) «The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction» Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. «Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA» 154:350-367; Kramer et al. (1988) «Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations» Nucl. Acids Res. 16: 7207; і Fritz et al. (1988) «Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro» Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999). Додаткові прийнятні способи включають точкове виправлення помилок спарювання (Kramer et al. (1984) «Point Mismatch Repair» Cell 38:879-887), мутагенез з використанням штамів-хазяїв з недостатністю системи репарації (Carter et al. (1985) «Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors» Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; і Carter (1987) «Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors» Methods у Enzymol. 154: 382-403), делеційний мутагенез (Eghtedarzadeh & Henikoff (1986) «Use of oligonucleotides to generate large deletions» Nucl. Acids Res. 14: 5115), рестрикцію-селекцію і рестрикцію-очищення (Wells et al. (1986) «Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin» Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423), мутагенез за допомогою сумарного синтезу генів (Nambiar et al. (1984) «Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein» Science 223: 1299-1301; Sakamar і Khorana (1988) «Total synthesis and expression of a gene for the asubunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)» Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) «Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites» Gene 34:315-323; і Grundstrom et al. (1985) «Oligonucleotide 14 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis» Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316); репарацію двоспіральних розривів (Mandecki (1986); Arnold (1993) «Protein engineering for unusual environments» Current Opinion у Biotechnology 4:450-455; і «Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis» Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181). Додаткові подробиці, що стосуються багатьох із вказаних вище способів, можна знайти в Methods in Enzymology Volume 154, що також описують корисні способи контролю для рішення проблем пошуку несправностей з використанням різних способів мутагенезу. Додаткові подробиці, що стосуються різних способів урізноманітнення, можна знайти в наступних патентах США, публікаціях PCT і публікаціях EPO: патент США № 5605793 на ім'я Stemmer (25 лютого 1997 року), «Methods for In vitro Recombination;» патент США № 5811238 на ім'я Stemmer et al. (22 вересня 1998 року) «Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination;» патент США № 5830721 на ім'я Stemmer et al. (3 листопада 1998), «DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;» патент США № 5834252 на ім'я Stemmer, et al. (10 листопада 1998 року) «End-Complementary Polymerase Reaction;» патент США № 5837458 на ім'я Minshull, et al. (17 листопада 1998 року), «Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering;» WO 95/22625, Stemmer і Crameri, «Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;» WO 96/33207, поданої Stemmer і Lipschutz «End Complementary Polymerase Chain Reaction;» WO 97/20078, поданої Stemmer і Crameri «Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination;» WO 97/35966, поданої Minshull і Stemmer, «Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering;» WO 99/41402, поданої Punnonen et al. «Targeting of Genetic Vaccine Vectors;» WO 99/41383, поданої Punnonen et al. «Antigen Library Immunization;» WO 99/41369, поданої Punnonen et al. «Genetic Vaccine Vector Engineering;» WO 99/41368, поданої Punnonen et al. «Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines;» EP 752008 поданої Stemmer і Crameri, «DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;» EP 0932670, поданої Stemmer «Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination;» WO 99/23107, поданої Stemmer et al., «Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling;» WO 99/21979, поданої Apt et al., «Human Papillomavirus Vectors;» WO 98/31837, поданої del Cardayre et al. «Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination;» WO 98/27230, поданої Patten і Stemmer, «Methods and Compositions for Polypeptide Engineering;» WO 98/13487, поданої Stemmer et al., «Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection;» WO 00/00632, «Methods for Generating Highly Diverse Libraries;» WO 00/09679, «Methods for Obtaining in vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences;» WO 98/42832, поданої Arnold et al., «Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers;» WO 99/29902, поданої Arnold et al., «Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences;» WO 98/41653, поданої Vind, «An in vitro Method for Construction of a DNA Library;» WO 98/41622, поданої Borchert et al., «Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling;» WO 98/42727, поданої Pati and Zarling, «Sequence Alterations using Homologous Recombination;» WO 00/18906, поданої Patten et al., «Shuffling of Codon-Altered Genes;» WO 00/04190, поданої del Cardayre et al. «Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Recombination;» WO 00/42561, поданої Crameri et al., «Oligonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination;» WO 00/42559, поданої Selifonov і Stemmer «Methods of Populating Data Structures for Use in Evolutionary Simulations;» WO 00/42560, поданої Selifonov et al., «Methods for Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics;» WO 01/23401, поданої Welch et al., «Use of Codon-Varied Oligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuffling;» і WO 01/64864 «Single-Stranded Nucleic Acid Template-Mediated Recombination and Nucleic Acid Fragment Isolation», поданої Affholter. Також представлені рекомбінантні конструкції, які містять одну або декілька послідовностей нуклеїнової кислоти, як широко описано вище. Ці конструкції містять вектор, такий як плазміда, косміда, фаг, вірус, бактеріальна штучна хромосома (BAC), дріжджова штучна хромосома (YAC), вірусний вектор або подібне, у яку полінуклеотид за даним винаходом був убудований, у прямій або зворотній орієнтації. Велике число прийнятних векторів і промоторів відомо фахівцям у даній галузі, і є комерційно доступним. В одному варіанті здійснення, вірусний вектор являє собою ретровірусний вектор. Терміни «вектор», «векторна конструкція» і «вектор експресії» означають носій, за допомогою якого послідовність ДНК або РНК (наприклад, чужорідний ген) може бути убудована в клітину-хазяя, так, щоб трансформувати клітину-хазяя й активізувати експресію (наприклад, транскрипцію і трансляцію) убудованої послідовності. Вектори звичайно містять ДНК 15 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 трансмісивного агента, у який чужорідну ДНК, яка кодує білок, вбудовують за допомогою технології ферментів рестрикції. Звичайним типом вектора є «плазміда», що в основному являє собою замкнуту молекулу двоспіральної ДНК, що легко може приймати додаткову (чужорідну) ДНК, і яку легко можна вбудовувати в прийнятну клітину-хазяя. Велике число векторів, у тому числі плазмід і грибних векторів, було описано для реплікації і/або експресії в різноманітних еукаріотичних і прокаріотичних клітинах-хазяях. Необмежувальні приклади включають pKK плазміди (Clonetech), pUC плазміди, pET плазміди (Novagen, Inc., Madison, Wis.), pRSET або pREP плазміди (Invitrogen, San Diego, Calif.) або pMAL плазміди (New England Biolabs, Beverly, Mass.), і багато які відповідні клітини-хазяї, використовуючи способи, описані або процитовані в даному описі або іншим способом відомі фахівцям у даній галузі. Рекомбінантні клонуючі вектори найчастіше будуть включати одну або декілька систем реплікації для клонування або експресії, один або декілька маркерів для селекції в клітині-хазяїні, наприклад, резистентність до антибіотиків, і одну або декілька експресійних касет. Терміни «експресують» і «експресія» означають надання можливості або здійснення реалізації інформації в гені або послідовності ДНК, наприклад, продукцію білка шляхом активації клітинних функцій, втягнених у транскрипцію і трансляцію відповідного гена або послідовності ДНК. Послідовність ДНК експресується в клітині або клітиною для утворення «продукту експресії», такого як білок. Також можна сказати, що сам продукт експресії, наприклад, отриманий у результаті білок, «експресований» клітиною. Полінуклеотид або поліпептид експресується рекомбінантно, наприклад, коли він експресується або продукується в чужорідної клітині-хазяїні під контролем чужорідного або нативного або промотору в нативній клітині-хазяїні під контролем чужорідного промотору. Полінуклеотиди, представлені в даному описі, можуть бути вбудовані в будь-який з цілого ряду векторів експресії, що підходять для експресії поліпептиду. Прийнятні вектори включають хромосомні, нехромосомні і синтетичні ДНК послідовності, наприклад, похідні SV40; бактеріальні плазміди; фагову ДНК; бакуловірус; дріжджові плазміди; вектори, отримані з комбінацій плазмід і фагової ДНК, вірусної ДНК, наприклад, коров'ячої віспи, аденовірусу, вірусу віспи птахів, псевдосказу, аденовірусу, адено-асоційованих вірусів, ретровірусів і багатьох інших. Може бути використаний будь-який вектор, що трансдукує генетичний матеріал у клітину, і, якщо реплікація є бажаною, який є реплікованим і життєздатним у релевантному хазяїні. Ці вектори нуклеїнової кислоти можуть бути доставлені з використанням невірусної системи доставки, такої як описано в P.Midoux et al. Brit J Pharm 157: 166-178 2009 або Kamimura & Liu J AAPS 10:589-595 (2008) або вірусної системи, як описано нижче. В іншому аспекті, полінуклеотид, який кодує цитозиндезаміназу або його мутантну форму, доставляється за допомогою системи доставки генів, що являє собою вірусний вектор, або вектор, похідний вірусу. Вірусний вектор може бути таким, що реплікується або не реплікується і може являти собою аденовірусний вектор, коревий вектор, вектор вірусу герпесу, ретровірусний вектор (у тому числі лентивірусний вектор), рабдовірусний вектор, такий як вектор вірусу везикулярного стоматиту, реовірусний вектор, вектор вірусу сенека Валлі, вектор вірусу віспи (у тому числі вектори, похідні віспи тварин або коров'ячої віспи), парвовірусний вектор (у тому числі AAV вектор), альфавірусний вектор або інший вірусний вектор, відомий фахівцю в даній галузі (дивися також, наприклад, Concepts in Genetic Medicine, ed. Boro Dropulic and Barrie Carter, Wiley, 2008, Hoboken, NJ.; The Development of Human Gene Therapy, ed. Theodore Friedmann, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold springs Harbor, New York, 1999; Gene and Cell Therapy, ed. Nancy Smyth Templeton, Marcel Dekker Inc., New York, New York, 2000 і Gene Therapy: Therapeutic Mechanism і Strategies, ed. Nancy Smyth Templetone і Danilo D Lasic, Marcel Dekker, Inc., New York, New York, 2000; описи яких включені в даний опис за допомогою посилання). В одному варіанті здійснення, вірусний вектор може бути реплікаційно-компетентним ретровірусним вектором, здатним інфікувати тільки клітини ссавців, які реплікуються. Ретровіруси були класифіковані різними шляхами, але номенклатура була стандартизована в останнє десятиліття (дивися ICTVd - The Universal Virus Database, v 4 на World Wide Web (www) ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVd/ і посібник “Retroviruses” Eds Coffin, Hughs and Varmus, Cold Spring Harbor Press 1997; опис яких включений в дану заявку шляхом посилання). Реплікаційнокомпетентний ретровірусний вектор може включати орторетровірусний або більш характерно гамма ретровірусний вектор. В одному аспекті, реплікаційно-компетентний ретровірусний вектор містить внутрішній сайт зв'язування рибосоми (IRES) 5' з полінуклеотидом, що кодує цитозиндезаміназу. В одному варіанті здійснення, полінуклеотид, який кодує цитозиндезаміназу, знаходиться 3' відносно ENV полінуклеотиду ретровірусного вектора. 16 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Відповідно до цього, в інших варіантах здійснення представлені вектори, що містять полінуклеотид за даним винаходом. В інших варіантах здійснення представлені клітини-хазяї, трансфіковані молекулою нуклеїнової кислоти за даним винаходом або вектором, що містить полінуклеотид за даним винаходом. Клітини-хазяї включають еукаріотичні клітини, такі як клітини дріжджів, клітини комах або клітини тварин. Клітини-хазяї також включають прокаріотичні клітини, такі як клітини бактерій. Як розглянуто раніше, загальні дані, у яких описуються методики молекулярної біології, використовувані в даній заявці, у тому числі використання векторів, промоторів і багато інших актуальних тем, включають Berger і Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology Volume 152, (Academic Press, Inc., San Diego, Calif.) («Berger»); Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 2d ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 («Sambrook») і Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, спільне підприємство Greene Publishing Associates, Inc. і John Wiley & Sons, Inc., (доповнено протягом 1999 року) («Ausubel»). Приклади протоколів, достатні, щоб проінструктувати фахівців у даній галузі по in vitro методах ампліфікації, у тому числі полімеразної ланцюгової реакції (PCR), лігазної ланцюгової реакції (LCR), Qβ-репліказної ампліфікації й інших методик, опосередкованих РНК полімеразою (наприклад, NASBA), наприклад, для продукції гомологічних нуклеїнових кислот за даним винаходом, можна знайти в Berger, Sambrook, і Ausubel, а також у Mullis et al. (1987) у патенті США № 4683202; Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press Inc. San Diego, Calif.) («Innis»); Arnheim & Levinson (Oct. 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94; Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87: 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem 35: 1826; Landegren et al. (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu і Wallace (1989) Gene 4:560; Barringer et al. (1990) Gene 89:117; і Sooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13: 563564. Удосконалені способи клонування in vitro ампліфікованих нуклеїнових кислот описані в Wallace et al., у патенті США № 5426039. Удосконалені способи ампліфікації великих нуклеїнових кислот за допомогою ПЛР коротко викладені в Cheng et al. (1994) Nature 369: 684685 і в посиланнях, процитованих у цих публікаціях, у яких одержують ПЛР амплікони аж до 40 тис. пара основ. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що по суті будь-яка РНК може бути перетворена в двоспіральну ДНК, що підходить для рестрикційного розщеплення, ПЛР подовження і секвенування з використанням зворотної транскриптази і полімерази. Дивися, наприклад, Ausubel, Sambrook і Berger, усе вказано вище. Також представлені сконструйовані клітини-хазяї, які трансдуковані (трансформовані або трансфіковані) вектором, представленим у даному описі (наприклад, клонуючим вектором або вектором експресії), а також одержання поліпептидів за даним винаходом за допомогою рекомбінантних технологій. Вектором може бути, наприклад, плазміда, вірусна частинка, фаг і так далі. Сконструйовані клітини-хазяї можуть бути культивовані в звичайному поживному середовищі, модифікованому відповідним чином для активації промоторів, добору трансформантів або ампліфікації кодуючого полінуклеотиду. Умовами культивування, такими як температура, рН і подібні є умови, використані раніше з клітинами-хазяїнами, вибраними для експресії, і будуть очевидні фахівцям у даній галузі й у посиланнях, процитованих у даному описі, у тому числі, наприклад, Sambrook, Ausubel і Berger, а також, наприклад, Freshney (1994) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3rd ed. (Wiley-Liss, New York) і процитованих там посиланнях. Вектори можуть бути використані для трансформації відповідного хазяя, щоб забезпечити експресію білка або поліпептиду клітиною-хазяїном. Приклади відповідних експресійних клітинхазяїв включають: клітини бактерій, такі як E. coli, B. subtilis, Streptomyces, і Salmonella typhimurium; клітини грибів, такі як Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, і Neurospora crassa; клітини комах, такі як Drosophila і Spodoptera frugiperda; клітини ссавців, такі як CHO, COS, BHK, HEK 293 або Bowes меланоми; або клітини рослин або експланту, і так далі. У бактеріальних системах, ряд векторів експресії може бути вибраний у залежності від використання, призначеного для поліпептиду цитозиндезамінази. Наприклад, у тих випадках, коли великі кількості поліпептиду CD або його фрагментів необхідно для комерційної продукції або для індукції антитіл, можуть бути бажаними вектори, що направляють високий рівень експресії злитих білків, які легко очистити. Такі вектори включають, але не тільки, багатофункціональні E. coli клонуючі вектори і вектори експресії, такі як BLUESCRIPT (Stratagene), у яких послідовність, яка кодує поліпептид CD, може бути лігована у вектор у рамці зчитування з послідовностями для аміноконцевого Met і наступними 7 залишками бета 17 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 галактозидази, так, щоб продукувався гібридний білок; pIN вектори (Van Heeke & Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509); pET вектори (Novagen, Madison Wis.); і подібні. Аналогічно, у дріжджів Saccharomyces cerevisiae ряд векторів, що містять конститутивні або індуцибельні промотори, такі як альфа фактор, алкоголь-оксидаза і PGH, можуть бути використані для продукції поліпептидів CD за даним винаходом. Огляди дивися в Ausubel (supra) і Grant et al. (1987) Methods in Enzymology 153:516-544. Даний винахід також належить до реплікаційно-компетентних ретровірусних векторів, що мають підвищену стабільність щодо попередніх ретровірусних векторів. Така підвищена стабільність під час інфікування і реплікації є важливою для лікування порушень клітинної проліферації. Поєднання ефективності трансдукції, трансгенної стабільності і специфічності до мішені забезпечується реплікаційно-компетентними ретровірусами. Композиції і способи забезпечують стабільність вставки і підтримують транскрипційну активність трансгена і трансляційну ефективність кодованого поліпептиду. Ретровіруси можуть передаватися горизонтально і вертикально. Ефективна інфекційна трансмісія ретровірусів вимагає експресії на клітині-мішені рецепторів, які специфічно розпізнають білки оболонки вірусу, хоча віруси можуть використовувати рецептор-незалежні, неспецифічні шляхи входження з низькою ефективністю. Крім того, тип клітини-мішені повинен бути здатний підтримувати всі стадії циклу реплікації після зв'язування і пенетрації вірусу. Вертикальна трансмісія відбувається, коли вірусний геном стає інтегрованим у зародкову лінію хазяя. Потім провірус буде передаватися від покоління до покоління начебто клітинний ген. Отже, ендогенні провіруси укореняються, які найчастіше лежать латентно, але які можуть активуватися, коли хазяїн піддається впливу відповідних агентів. Як вказано вище, інтегрований посередник ДНК називається провірусом. У попередній генній терапії і системах доставки генів використовуються способи і ретровіруси, що вимагають транскрипції провірусу і зборки у інфікуючий вірус, або в присутності відповідного вірусапомічника, або в клітинній лінії, що містить відповідні послідовності, що сприяють інкапсулюванню без співпадаючої продукції віруса-помічника вірусу-помічника. Як описано нижче, вірус-помічник не потрібен для продукції рекомбінантного ретровірусу за даним винаходом, оскільки послідовності для інкапсулювання забезпечуються в геномі, таким чином, надаючи реплікаційно-компетентний ретровірусний вектор для доставки генів або генної терапії. Ретровірусний геном, застосовний у способах і композиціях за даним винаходом, містить провірусну ДНК, що містить щонайменше три гени: gag, pol, і env, ці гени можуть бути фланковані одним або двома довгими кінцевими повторами (LTR) або в провірусі фланковані двома довгими кінцевими повторами (LTR) і послідовностями, що містять діючі в цис-положенні послідовності, такі як psi. Ген gag кодує внутрішні структурні білки (матрикс, капсид і нуклеокапсид); ген pol кодує РНК-направлену ДНК полімеразу (зворотну транскриптазу), протеазу і інтегразу; і ген env кодує глікопротеїни вірусної оболонки. 5' і/або 3' LTR служать для активації транскрипції і поліаденілування РНК віріону. LTR містить всі інші послідовності, що діють у цис-положенні, необхідні для реплікації вірусу. Лентивіруси мають додаткові гени, у тому числі vif, vpr, tat, rev, vpu, nef, і vpx (у HIV-1, HIV-2 і/або SIV). Розташовані поруч з 5' LTR послідовності необхідні для зворотної транскрипції геному (ділянка зв'язування праймера тРНК) і для ефективного інкапсулювання вірусної РНК у частинки (ділянка Psi). Якщо послідовності, необхідні для інкапсулювання (або упакування ретровірусної РНК в інфекційний віріон) відсутні у вірусному геномі, результатом є цис-дефект, який запобігає інкапсулюванню геномної вірусної РНК. Цей тип модифікованого вектора являє собою те, що звичайно використовувалося в попередніх системах доставки гена (тобто системи, позбавлені елементів, які необхідні для інкапсулювання віріону). В одному варіанті здійснення, даний винахід належить до рекомбінантного ретровірусу, здатному інфікувати клітину, яка не ділиться, клітину, яка ділиться, або клітину, у якої є порушення клітинної проліферації. Рекомбінантні реплікаційно-компетентні ретровіруси за даним винаходом містять полінуклеотидну послідовність, яка кодує вірусний GAG, вірусний POL, вірусний ENV, гетерологічний полінуклеотид, з попереднім внутрішнім сайтом зв'язування рибосоми (IRES), інкапсульованим у віріоні. Гетерологічна послідовність нуклеїнової кислоти оперативно зв'язана з IRES. Використовуваний у даному описі термін «гетерологічна» послідовність нуклеїнової кислоти або трансген належить до (і) до послідовності, яка звичайно не існує в ретровірусах дикого типу, (ii) до послідовності, яка походить з чужорідних видів, або (iii) якщо з того ж виду, вона може бути по суті модифікована від її початкової форми. Альтернативно, незмінена послідовність нуклеїнової кислоти, що звичайно не експресується в клітині, є гетерологічною послідовністю 18 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеїнової кислоти. У конкретному варіанті здійснення, гетерологічний полінуклеотид являє собою поліпептид за даним винаходом, який має цитозиндезаміназну активність. Вираз «клітина, яка не ділиться» належить до клітини, що не проходить стадію мітозу. Клітини, які не діляться, можуть бути блоковані в будь-який момент клітинного циклу (наприклад, G0/G1, G1/S, G2/M), за умови, що ця клітина не є такою, що активно ділиться. Для інфікування ex vivo, клітина, яка ділиться, може бути оброблена для блокування клітинного розподілу з використанням стандартних методик, використовуваних фахівцями в даній галузі, у тому числі, випромінюванням, обробкою афідоколіном, виснаженням сироватки, і контактним інгібуванням. Однак, повинно бути зрозумілим, що інфікування ex vivo найчастіше проводять без блокування клітини, оскільки багато клітин уже зупинені (наприклад, стовбурові клітини). Наприклад, рекомбінантний лентивірусний вектор здатний інфікувати будь-яку клітину, яка не ділиться, незалежно від механізму, який використовується для блокування клітинного розподілу або моменту в клітинному циклі, у якому блокована клітина. Приклади вже існуючих клітин, які не діляться, в організмі включають нейрональні, м'язові клітини, клітини печінки, шкіри, серця, легень і клітини кісткового мозку і їхні похідні. Для клітин, які діляться, можуть бути використані онкоретровірусні вектори. Під «клітиною, яка ділиться» мається на увазі клітина, що піддається активному мітозу або мейозу. Такі клітини, які діляться, включають стовбурові клітини, клітини шкіри (наприклад, фібробласти і кератиноцити), гамети й інші клітини, які діляться, відомі з рівня техніки. Клітини, які діляться, що становлять особливий інтерес і охоплюються цим терміном, є клітини, що мають порушення клітинної проліферації, такі як неопластичні клітини. Термін «порушення клітинної проліферації» належить до стану, який характеризується аномальним числом клітин. Цей стан може включати як гіпертрофічний (безупинне множення клітин, у результаті, що приводить до розростання клітинної популяції в межах тканини) і гіпотрофічний (відсутність або недостатність клітин у тканині) клітинний ріст або надмірний приплив або міграцію клітин в область організму. Клітинні популяції не є обов'язково трансформованими, утворюючими пухлина або злоякісними клітинами, а можуть включати нормальні клітини теж. Порушення клітинної проліферації включають порушення, пов'язані з розростанням сполучних тканин, наприклад, різні фіброзні стани, у тому числі, склеродермію, артрит і цироз печінки. Порушення клітинної проліферації включають неопластичні порушення, такі як карциноми тканин голови і шиї. Карциноми тканин голови і шиї включали б, наприклад, карциному ротової порожнини, стравоходу, горла, гортані, щитовидної залози, мови, губ, слинних залоз, носа, навколоносових пазух, носоглотки, верхнього склепіння носа і пухлини пазухи, нюхову естезіонейроепітеліому, сквамозноклітинний рак, злоякісну меланому, синоназальну недиференційовану карциному (SNUC), неоплазію головного мозку (у тому числі гліобластоми) або крові. Також включені карциноми регіональних лімфатичних вузлів, у тому числі шийних лімфатичних вузлів, передгортанних лімфатичних вузлів, легеневих юкстастравоходних лімфатичних вузлів і піднижньощелепних лімфатичних вузлів (Harrison's Principles of Internal Medicine (eds., Isselbacher, et al., McGraw-Hill, Inc., 13th Edition, ppl850-1853, 1994). Інші типи злоякісних пухлин включають, але цим не обмежуються, рак легень, рак товстої і прямої кишки, рак грудей, рак передміхурової залози, рак сечовивідних шляхів, рак матки, лімфому, рак ротової порожнини, рак підшлункової залози, лейкоз, меланому, рак шлунка, рак шкіри і рак яєчників. В одному варіанті здійснення, гетерологічний полінуклеотид у векторі містить цитозиндезаміназу, яка була оптимізована для експресії в клітинах людини. У додатковому варіанті здійснення, цитозиндезаміназа містить послідовність, яка була оптимізована відносно кодонів людини, і містить мутації, які підвищують стабільність цитозиндезамінази (наприклад, зменшене руйнування або підвищену термостабільність) у порівнянні з цитозиндезаміназою дикого типу. Ще в одному варіанті здійснення, гетерологічний полінуклеотид кодує злиту конструкцію, що містить цитозиндезаміназу (або кодон-оптимізовану для експресії в клітинах людини, або неоптимізовану, або мутовану, або немутовану) оперативно зв'язану з полінуклеотидом, що кодує поліпептид, який має UPRT або OPRT активність. В іншому варіанті здійснення, гетерологічний полінуклеотид містить CD полінуклеотид або злиту конструкцію за даним винаходом (наприклад, SEQ ID NO:3, 5, 11, 13, 15 або 17). В іншому варіанті здійснення, реплікаційно-компетентний ретровірусний вектор може містити гетерологічний полінуклеотид, який кодує поліпептид, що містить цитозиндезаміназу (як описано вище), і додатково може містити полінуклеотид, який містить молекулу miРНК або siРНК, зв'язану з промотором, специфічним до клітинного типу або до типу тканини. Термін «регуляторна послідовність нуклеїнової кислоти» належить узагальнено до промоторних послідовностей, сигналів поліаденілування, послідовностей термінації транскрипції, регуляторних доменів, розташованих проти ходу транскрипції, точок початку 19 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 реплікації, енхансерів і подібного, які спільно забезпечують реплікацію, транскрипцію і трансляцію кодуючої послідовності у клітині-реципієнті. Не завжди необхідна присутність усіх цих контрольних послідовностей, за умови, що вибрана кодуюча послідовність здатна реплікуватися, транскрибуватися і транслюватися у відповідній клітині-хазяїні. Фахівець у даній галузі без особливих зусиль може ідентифікувати регуляторну послідовність нуклеїнової кислоти з загальнодоступних баз даних і матеріалів. Більше того, фахівець у даній галузі може ідентифікувати регуляторну послідовність, яка застосовна для призначеного використання, наприклад, in vivo, ex vivo або in vitro. Термін «промоторна область» використовується в даному описі в його початковому змісті, що належить до нуклеотидної області, яка містить регуляторну послідовність ДНК, де регуляторна послідовність отримана з гена, який здатний зв'язуватися з РНК полімеразою і ініціювати транскрипцію кодуючої послідовності, розташованої по ходу транскрипції (у 3'напрямку). Регуляторна послідовність може бути гомологічною або гетерологічною бажаної генної послідовності. Наприклад, може бути використаний широкий ряд промоторів, у тому числі вірусний промотор або промотор ссавців, як описано вище. Внутрішні сайти зв'язування рибосоми («IRES») належать до сегмента нуклеїнової кислоти, які сприяють зв'язуванню або утримуванню рибосоми під час трансляції кодуючої послідовності звичайно в положенні 3' по відношенню IRES. У деяких варіантах здійснення IRES може містити акцепторний сайт сплайсингу/донорний сайт, однак, переважні IRES позбавлені акцепторного сайта сплайсингу/донорного сайта. Звичайно, зв'язування рибосом з матричною РНК має місце через кеп, розташований на 5' кінці всіх еукаріотичних мРНК. Однак існують виключення з цього універсального правила. Відсутність кепа в деяких вірусних мРНК припускає існування альтернативних структур, що дозволяють здійснювати зв'язування рибосом на внутрішньому сайті цих РНК. На сьогоднішній день ряд таких структур, позначених IRES на підставі їхньої функції, був ідентифікований у 5' некодуючій області некепованих вірусних мРНК, наприклад, зокрема, у пікорнавірусів, наприклад, вірусу поліомієліту (Pelletier et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8, 1103-1112) і вірусу EMCV (вірус енцефаломіокардиту (Jang et al., J. Virol., 1988, 62, 2636-2643). Даний винахід належить до використання IRES застосовно до реплікативно-компетентного ретровірусного вектора. Гетерологічна послідовність нуклеїнової кислоти звичайно знаходиться під контролем або вірусних сигналів LTR промотор-енхансер, або внутрішнього промотору, і синалів утримування в ретровірусному LTR може усе ще приводити до ефективної інтеграції вектора в геном клітинихазяя. Відповідно до цього, рекомбінантні ретровірусні вектори за даним винаходом, бажані послідовності, гени і/або генні фрагменти можуть бути убудовані в декількох сайтах і під контролем різних регуляторних послідовностей. Наприклад, сайтом для вбудовування може бути вірусний проксимальний сайт енхансер/промотор (тобто 5' LTR-контрольований генний локус). Альтернативно, бажані послідовності можуть бути убудовані в дистальний сайт (наприклад, IRES послідовність 3' до гена env) або де присутні дві або більше гетерологічних послідовностей, одна гетерологічна послідовність може бути під контролем першої регуляторної області, а друга гетерологічна послідовність може бути під контролем другої регуляторної області. Інші дистальні сайти включають вірусні промоторні послідовності, де експресія бажаної послідовності або послідовностей відбувається за допомогою сплайсингу цистрону проксимального промотору, може бути використаний внутрішній гетерологічний промотор, такий як SV40 або CMV або внутрішній сайт зв'язування рибосоми (IRES). В одному варіанті здійснення, ретровірусний геном за даним винаходом містить IRES, що містить клонуючий сайт для вбудовування бажаної полінуклеотидної послідовності. В одному варіанті здійснення, IRES розташований 3' відносно гена env у ретровірусному векторі, але 5' відносно бажаної гетерологічної нуклеїнової кислоти. Відповідно до цього, гетерологічна полінуклеотидна послідовність, яка кодує бажаний поліпептид може бути оперативно зв'язана з IRES. В іншому варіанті здійснення напрямна полінуклеотидна послідовність включена як частина рекомбінатного ретровірусного вектора за даним винаходом. Напрямна полінуклеотидна послідовність являє собою спрямований ліганд (наприклад, пептидні гормони, такі як герегулін, одноланцюжкові антитіла, рецептор або ліганд для рецептора), тканиноспецифічний регуляторний елемент або регуляторний елемент, специфічний до клітинного типу (наприклад, тканиноспецифічний промотор або енхансер, або промотор або енхансер, специфічний до клітинного типу) або поєднання спрямованого ліганду і тканиноспецифічного/специфічного до клітинного типу регуляторного елемента. Переважно, спрямований ліганд оперативно зв'язаний з білком env ретровірусу, створюючи химерний ретровірусний білок env. Вірусні білки GAG, POL і ENV можуть бути отримані з будь-яких прийнятних ретровірусів (наприклад, MLV або похідних 20 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лентивірусів). В іншому варіанті здійснення, вірусний білок ENV не є похідним ретровірусу (наприклад, CMV або VSV). Рекомбінантний ретровірус за даним винаходом, отже, є генетично модифікованим, таким чином, щоб цей вірус був націлений на конкретний тип клітин (наприклад, гладком’язові клітини, клітини печінки, клітини нирок, фібробласти, кератиноцити, мезенхімальні стовбурові клітини, клітини кісткового мозку, хондроцити, епітеліальні клітини, інтестинальні клітини, неопластичні клітини, клітини гліоми, нейрональні клітини й інші, відомі з рівня техніки), так, щоб полінуклеотидний геном доставлявся в клітину-мішень, яка не ділиться, клітину-мішень, яка ділиться, або мішень, що має порушення клітинної проліферації. Націлювання може досягатися двома шляхами. Перший шлях направляє ретровірус до клітини-мішені шляхом зв'язування з клітинами, що мають молекулу на зовнішній поверхні клітини. У цьому способі націлювання ретровірусу використовується експресія спрямованого ліганду на оболонці ретровірусу, щоб полегшити націлювання вірусу на клітини або тканини, що мають рецептор або молекулу зв'язування, яка взаємодіє зі спрямованим лігандом на поверхні ретровірусу. Після інфікування клітини вірусом, вірус уводить свою нуклеїнову кислоту в клітину і ретровірусний генетичний матеріал може інтегруватися в геном клітини-хазяя. В другому способі націлювання використовуються регуляторні елементи, специфічні до клітин або тканин для активації експресії і транскрипції вірусного геному в клітині-мішені, яка активно використовує регуляторні елементи, як описано нижче більш повно. Перенесений ретровірусний генетичний матеріал потім транскрибується і транслюється в білки в клітині-хазяїні. Напрямний регуляторний елемент звичайно зв'язаний з 5' і/або 3' LTR, створюючи химерний LTR. Шляхом вбудовування гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у вірусний вектор за даним винаходом, поряд з іншим геном, який кодує, наприклад, ліганд для рецептора на специфічній клітині-мішені, вектор тепер є специфічним до мішені. Вірусні вектори можуть бути отримані специфічними до мішені шляхом приєднання, наприклад, цукру, гліколіпіду або білка. Націлювання може здійснюватися шляхом використання антитіла для націлювання на вірусний вектор. Фахівцям у даній галузі буде відомо, або вони без зусиль можуть визначити специфічні полінуклеотидні послідовності, які можуть бути убудовані у вірусний геном або білки, які можуть бути приєднані до оболонки вірусу, щоб дозволити здійснювати націлену специфічну доставку вірусного вектора, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка представляє інтерес. Таким чином, даний винахід включає в одному з варіантів здійснення, химерний білок env, що містить ретровірусний білок env, оперативно зв'язаний з напрямним поліпептидом. Напрямний поліпептид може являти собою специфічну рецепторну молекулу, ліганд для клітинно-специфічного рецептора, антитіло або фрагмент антитіла до клітинно-специфічного антигенного епітопу або будь-якого іншого ліганду, який легко ідентифікується в даній галузі, що здатний зв'язуватися або взаємодіяти з клітиною-мішенню. Приклади напрямних поліпептидів або молекул включають бівалентні антитіла з використанням біотин-стрептавідину як лінкерів (Etienne-Julan et al., J. Of General Virol., 73, 3251-3255 (1992); Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86, 9079-9083 (1989)), рекомбінантний вірус, що містить у своїй оболонці послідовність, яка кодує варіабельну область одноланцюжкового антитіла проти гаптену (Russell et al., Nucleic Acids Research, 21, 1081-1085 (1993)), клонування лігандів пептидних гормонів в оболонку ретровірусу (Kasahara et al., Science, 266, 1373-1376 (1994)), химерні EPO/env конструкції (Kasahara et al., 1994), одноланцюжкове антитіло проти рецептора ліпопротеїну низької густини (LDL) в оболонці ектопічного MLV, що в результаті приводить до специфічного інфікування клітин HeLa, які експресують рецептор LDL (Somia et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92, 7570-7574 (1995)), аналогічно ряд хазяїв ALV може бути змінений шляхом включення ліганду інтегрину, надаючи вірусу можливість здійснювати міжвидове специфічне інфікування клітин гліобластоми щурів (Valsesia-Wittmann et al., J. Virol. 68, 4609-4619 (1994)), і Dornberg зі співавторами (Chu and Dornburg, J. Virol 69, 2659-2663 (1995)) повідомляли про тканиноспецифічне націлювання вірусу некрозу селезінки (SNV), ретровірусу птахів, використовуючи оболонки, які містять одноланцюжкові антитіла, спрямовані проти пухлинних маркерів. Даний опис належить до способу одержання рекомбінантних ретровірусів, здатних інфікувати клітину-мішень, що передбачає трансфікування прийнятної клітини-хазяя наступним: вектором, що містить полінуклеотидну послідовність, яка кодує вірусний gag, вірусний pol і вірусний env, де вектор містить клонуючий сайт для вбудовування гетерологічного гена, оперативно зв'язаного з регуляторною послідовністю нуклеїнової кислоти, і виділення рекомбінантного вірусу. Ретровірус і способи за даним винаходом надають реплікаційно-компетентний ретровірус, для якого не потрібний вірус-помічник або додаткова послідовність нуклеїнової кислоти або 21 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 білки для розмноження і продукції віріону. Наприклад, послідовності нуклеїнової кислоти ретровірусу за даним винаходом кодують, наприклад, група-специфічний антиген і зворотну транскриптазу (і інтегразу і протеазні ферменти, необхідні для дозрівання і зворотної транскрипції), відповідно, як описано вище. Вірусні gag і pol можуть бути отримані з лентивірусу, такого як HIV або онковірус, такий як MoMLV. Крім того, полінуклеотидний геном ретровірусу за даним винаходом включає послідовність, яка кодуєу білок оболонки вірусу (ENV). Ген env може бути отриманий з будь-яких ретровірусів. Білок env може являти собою амфотропний оболонковий білок, який дозволяє здійснювати трансдукцію клітин людини або інших видів, або може являти собою екотрофний оболонковий білок, який здатний трансдукувати будь-які клітини миші і щура. Далі, може бути бажаним націлити рекомбінантний вірус шляхом зв'язування оболонкового білка з антитілом або конкретним лігандом для націлювання на рецептор конкретного клітинного типу. Як вказано вище, ретровірусні вектори можуть бути отримані специфічними до мішені шляхом убудовування, наприклад, гліколіпіду або білка. Націлювання найчастіше здійснюють шляхом використання антитіла для націлювання ретровірусного вектора на антиген на конкретному клітинному типі (наприклад, клітинний тип, виявлений у певній тканині або типі злоякісних клітин). Фахівцям у даній галузі будуть відомі або можуть бути легко встановлені без проведення зайвих експериментів, специфічні способи для досягнення доставки ретровірусного вектора до специфічної мішені. В одному варіанті здійснення, ген env доставляється не з ретровірусу (наприклад, CMV або VSV). Приклади ретровірусних env генів включають, але цим не обмежуються: вірус мишачого лейкозу Молоні (MoMuLV), вірус саркоми мишей Харві (HaMuSV), вірус пухлини молочної залози мишей (MuMTV), вірус лейкозу гібонів (GaLV), вірус імунодефіциту людини (HIV) і вірус саркоми Рауса (RSV). Також можуть бути використані інші env гени, наприклад, вірусу везикулярного стоматиту (VSV) (білок G), оболонки цитомегаловірусу (CMV) або гемаглютинін вірусу грипу (HA). В одному варіанті здійснення, ретровірусний геном є похідним онкоретровірусу або гаммаретровірусу, і, більш конкретно, онкоретровірусу або гамма ретровірусу ссавців. Під «похідним» мається на увазі, що батьківська полінуклеотидна послідовність являє собою онковірус дикого типу, що був модифікований шляхом вбудовування або видалення природних послідовностей (наприклад, вставки IRES, вставки гетерологічного полінуклеотиду, що кодує, наприклад, поліпептид, який має цитозиндезаміназну активність за даним винаходом і подібного). В іншому варіанті здійснення, даний винахід належить до ретровірусних векторів, які направляються з використанням регуляторних послідовностей. Клітиноспецифічні або тканиноспецифічні регуляторні послідовності (наприклад, промотори) можуть бути використані для спрямування експресії генних послідовностей у конкретних популяціях клітин. Прийнятні промотори ссавців і вірусні промотори для даного винаходу описані в інших місцях даної заявки. Відповідно до цього, в одному варіанті здійснення, даний винахід належить до ретровірусу, що має тканиноспецифічні промоторні елементи на 5' кінці ретровірусного геному. Переважно, тканиноспецифічні регуляторні елементи/послідовності знаходяться в області U3 LTR ретровірусного геному, включаючи, наприклад, клітиноспецифічні або тканиноспецифічні промотори і енхансери для неопластичних клітин (наприклад, енхансери і промотори, специфічні для пухлинних клітин), і індуцибельні промотори (наприклад, тетрациклін). У деяких обставинах, може бути бажаним регулювати експресію. Наприклад, різні вірусні промотори з різною силою активності, можуть бути використані в залежності від бажаного рівня експресії. У клітинах ссавців ранній промотор CMV, найчастіше використовують для забезпечення сильної транскрипційної активації. Модифіковані варіанти промотору CMV, що є менш сильними, також були використані, коли були потрібні знижені рівні експресії трансгену. У тих випадках, коли бажана експресія трансгену в гематопоетичних клітинах, можуть бути використані ретровірусні промотори, такі як LTR з MLV або MMTV. Інші вірусні промотори, що можуть бути використані, включають SV40, RSV LTR, HIV-1 і HIV-2 LTR, аденовірусні промотори, наприклад, з області E1A, E2A або MLP, AAV LTR, вірусу мозаїки цвітної капусти, HSV-TK, і вірусу саркоми птахів. Аналогічно, тканиноспецифічні або селективні промотори можуть бути використані для здійснення транскрипції в специфічних тканинах або клітинах, щоб знизити можливу токсичність або небажані ефекти на тканині, що не є мішенями. Наприклад, промотори, такі як PSA, пробазин, простатична кисла фосфатаза або простат-специфічний гландулярний калікреїн (hK2) можуть бути використані для спрямування генної експресії в передміхуровій залозі. Інші промотори/регуляторні домени, що можуть бути використані, викладені в Таблиці 1. При деяких показаннях, може бути бажаним активувати транскрипцію в конкретний час після уведення вектора для генної терапії. Це може бути зроблене з такими промоторами, які 22 UA 104298 C2 5 10 15 20 регулюються гормонами або цитокінами. Наприклад, у терапевтичних застосуваннях, при яких показанням є тканина статевих залоз, у якій продукуються або поширюються специфічні стероїдні гормони, переважним може бути використання андроген- або естрогенрегульованих промоторів. Такі промотори, які є гормональнорегульованими, включають MMTV, MT-1, екдизон і RuBisco. Можуть бути використані інші гормонорегульовані промотори, наприклад, чутливі до гормонів щитовидної залози, гіпофіза і надниркових залоз. Промотори, чутливі до цитокінів і білків запалення, які могли бути використані, включають кініноген K і T (Kageyama et al., 1987), c-fos, TNF-альфа, C-реактивний білок (Arcone et al., 1988), гаптоглобін (Oliviero et al., 1987), сироватковий амілоїд A2, C/EBP альфа, IL-1, IL-6 (Poli і Cortese, 1989), комплемент C3 (Wilson et al., 1990), IL-8, альфа-1 кислий глікопротеїн (Prowse і Baumann, 1988), альфа-1 антитрипсин, ліпопротеїнліпазу (Zechner et al., 1988), ангіотензиноген (Ron et al., 1990), фібриноген, c-jun (індукований складними ефірами форболу, TNF-альфа, УФ випромінюванням, ретиноєвою кислотою і перекисом водню), колагеназу (індуковану складними ефірами форболу і ретиноєвою кислотою), металотіонеїн (індукований важким металом і глюкокортикоїдом), стромелізин (індукований складним ефіром форболу, інтерлейкіном-1 і EGF), альфа-2 макроглобулін і альфа-1 антихімотрипсин. Пухлиноспецифічні промотори, такі як остеокальцин, фактор, чутливий до гіпоксії (HRE), MAGE-4, CEA, альфа-фетопротеїн, GRP78/BiP і тирозиназа також можуть бути використані для регуляції генної експресії в пухлинних клітинах. Крім того, цей перелік промоторів не слід розглядати як вичерпний або обмежуючий, фахівцям у даній галузі будуть відомі інші промотори, що можуть бути використані в поєднаннями з промоторами і способами, описаними в даній заявці. Таблиця 1 Тканиноспецифічні промотори Тканина Підшлункова залоза Печінка Скелетні м'язи Шкіра Легені Гладка мускулатура Ендотелій Жирова тканина Молочна залоза Кров 25 30 35 Промотор Інсулінеластинамілаза pdr-1 pdx-1 глюкокіназа Альбумін PEPCK HBV енхансер α фетопротеїн аполіпопротеїн C α-1 антитрипсин вітелогенін, NF-AB транстиретин Н ланцюг міозину м'язова креатинкіназа дистрофін калпаїн p94 скелетний альфа-актин швидкий тропонін 1 Кератин K6 Кератин K1 CFTR цитокератин людини 18 (K18) білки сурфактанта легень A, B і C CC-10 P1 sm22 α SM-альфа-актин Ендотелін-1 E-селектин фактор фон Вілебранда TIE, KDR/flk-1 тирозиназа меланоцитів ліпопротеїнліпаза (Zechner et al., 1988) адипсин (Spiegelman et al., 1989) ацетил-CoA карбоксилаза (Pape і Kim, 1989) гліцерофосфатдегідрогенезу (Dani et al., 1989) адипоцит P2 (Hunt et al., 1986) кислий білок молочної сироватки (WAP) (Andres et. al. PNAS 84:1299-1303 1987 β-глобін Тканиноспецифічні регуляторні елементи» являють собою регуляторні елементи (наприклад, промотори), які здатні направляти транскрипцію гена в одній тканині, залишаючись в основному такими «що мовчать» у тканинах інших типів. Однак, буде зрозуміло, що тканиноспецифічні промотори можуть мати визначувану кількість «фонової» або «базової» активності в тих тканинах, у яких вони є такими, що мовчать. Ступінь, у якому промотор селективно активується в тканині-мішені, може бути виражений як індекс селективності (активність у тканині-мішені/активність у контрольній тканині). У цьому відношенні, тканиноспецифічний промотор, використовуваний при здійсненні даного винаходу, звичайно має індекс селективності приблизно більший 5. Переважно, індекс селективності складає приблизно більше 15. Далі буде зрозуміло, що деякі промотори, хоча не обмежені в активності відносно одного типу тканини, можуть, проте, демонструвати селективність у тому, що вони можуть бути активними в одній групі тканин, і менш активними або які мовчать в іншій групі. Такі промотори також називають «тканиноспецифічними», і їхнє використання передбачається даним 23 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходом. Відповідно до цього, тканиноспецифічні регуляторні елементи, використовувані в даному винаході, застосовні для регуляції гетерологічних білків, таких як поліпептиди, що мають цитозиндезаміназну активність за даним винаходом, а також застосовні як напрямна полінуклеотидна послідовність в ретровірусних векторах. Ретровірусні вектори і полінуклеотиди CD і поліпептиди за даним винаходом можуть бути використані для лікування широкого ряду захворювань і порушень, що включають ряд клітинопроліферативних захворювань і порушень (дивися, наприклад, патенти США №№ 4405712 і 4650764; Friedmann, 1989, Science, 244:1275-1281; Mulligan, 1993, Science, 260:926932, R. Crystal, 1995, Science 270:404-410, кожний з який включений у даний опис за допомогою посилання в повному обсязі, дивися також публікацію The Development of Human Gene Therapy, Theodore Friedmann, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999. ISBN 0-87969-528-5, що включена в даний опис шляхом посилання в повному обсязі). Даний винахід також належить до генної терапії для лікування порушень клітинної проліферації. Терапевтична дія такого лікування досягається шляхом уведення відповідної терапевтичної полінуклеотидної послідовності (наприклад, поліпептиду за даним винаходом, який має цитозиндезаміназну активність), у клітини пацієнта, що має порушення проліферації. Доставка полінуклеотидних конструкцій може здійснюватися з використанням рекомбінантного ретровірусного вектора за даним винаходом. Крім того, терапевтичні способи (наприклад, генна терапія або способи доставки генів), як описано в даній заявці, можуть бути виконані in vivo або ex vivo. Наприклад, у способах лікування клітинопроліферативних захворювань або порушень може бути корисним видаляти більшість пухлин перед генною терапією, наприклад, хірургічним шляхом або випромінюванням. У деяких варіантах здійснення, хіміотерапія може передувати ретровірусній терапії або йти після неї. Таким чином, даний винахід належить до рекомбінантного ретровірусу, здатному інфікувати клітини, які не діляться, клітини, які діляться, або неопластичні клітини, де рекомбінантний ретровірус містить вірусний GAG; вірусний POL; вірусний ENV; гетерологічну нуклеїнову кислоту (наприклад, що містить поліпептид за даним винаходом, який має цитозиндезаміназну активність), оперативно зв'язану з IRES; і діючі в цис-положенні послідовності нуклеїнової кислоти, необхідні для упакування, зворотної транскрипції й інтеграції. Рекомбінантний ретровірус може являти собою лентивірус, такий як HIV, або може являти собою онковірус. Як описано вище для способу одержання рекомбінантного ретровірусу, рекомбінантний ретровірус за даним винаходом додатково може містити щонайменше один з білків VPR, VIF, NEF, VPX, TAT, REV, і VPU. Не бажаючи зв'язуватися конкретною теорією, вважається, що один або декілька з цих генних/білкових продуктів є важливими для підвищення титру вірусу продукованого рекомбінантного ретровірусу (наприклад, NEF) або можуть бути необхідними для інфікування й упакування віріону. Даний винахід також належить до способу перенесення нуклеїнової кислоти в клітинумішень для забезпечення експресії конкретної нуклеїнової кислоти (наприклад, гетерологічної послідовності, такої як полінуклеотид, який кодує поліпептид, який має цитозиндезаміназну активність). Отже, в іншому варіанті здійснення, даний винахід належить до способу введення й експресії гетерологічної нуклеїнової кислоти в клітину-мішень, що передбачає інфікування клітини-мішені рекомбінантним вірусом за даним винаходом й експресію гетерологічної нуклеїнової кислоти в клітини-мішені. Як згадано вище, клітина-мішень може бути клітиною будь-якого типу, у тому числі яка ділиться, яка не ділиться, неопластичною, імморталізованою, модифікованою або інших типів клітин, відомих фахівцям у даній галузі, за умови, що вони здатні інфікуватися ретровірусом. Даний винахід також належить до генної терапії для лікування клітинопроліферативних або імунологічних порушень. В одному варіанті здійснення, клітинопроліферативне порушення лікують шляхом уведення полінуклеотиду CD за даним винаходом, експресії полінуклеотиду для одержання поліпептиду, який має цитозиндезаміназну активність, і контактування клітини з 5-фторцитозином у кількості і протягом періоду часу для продукції цитотоксичної кількості 5-FU. Крім того, даний винахід належить до полінуклеотидної послідовності, що кодує рекомбінантний ретровірусний вектор за даним винаходом. Полінуклеотидна послідовність може бути вбудована в різні вірусні частинки. Наприклад, різні вірусні вектори, що можуть бути використані для генної терапії, включають аденовіруси, віруси герпесу, коров'ячої віспи або, переважно, РНК вірус, такий як ретровірус, і, більш конкретно, онковірус ссавців. Ретровірусний вектор може бути похідним ретровірусів мишей, мавп або людей. Приклади ретровірусних векторів, у які чужорідний ген (наприклад, гетерологічна полінуклеотидна послідовність) може бути убудований, включають, але не обмежуються цим: похідні вірусу мишачого лейкозу Молоні 24 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (MoMuLV), вірусу саркоми мишей Харві (HaMuSV), вірусу пухлини молочної залози мишей (MuMTV), і вірусу саркоми Рауса (RSV). Усі ці вектори можуть переносити або вбудовувати ген селективного маркера, так, щоб трансдуковані клітини могли бути ідентифіковані і продуковані. Ще в одному варіанті здійснення, даний винахід належить до плазмід, які містять рекомбінантну ретровірусну конструкцію. Плазміда може бути безпосередньо введена в клітину-мішень або клітинну культуру, наприклад, NIH 3T3, HT1080 (людини), CF2 (собаки) або інші клітини тканинної культури. Отримані в результаті клітини виділяють ретровірусний вектор у культуральне середовище. Даний винахід належить до полінуклеотидної конструкції, що містить від 5’ до 3’: промоторну або регуляторну область, яка використовується для ініціації транскрипції; сигнал упаковки psi; кодуючу послідовність нуклеїнової кислоти gag, кодуючу послідовність нуклеїнової кислоти pol; кодуючу послідовність нуклеїнової кислоти env; послідовність нуклеїнової кислоти внутрішнього сайту зв'язування рибосоми; гетерологічний полінуклеотид, який кодує маркерний, терапевтичний (наприклад, поліпептид, який має цитозиндезаміназну активність) або діагностичний поліпептид; і послідовність нуклеїнової кислоти LTR. У конкретних варіантах здійснення, гетерологічний полінуклеотид, який кодує поліпептид, який має цитозиндезаміназну активність, може додатково містити домен, що кодує поліпептид, який має UPRT або OPRT активність. Як описано де-небудь у даній заявці, або як вказано далі, різні сегменти полінуклеотидної конструкції за даним винаходом (наприклад, рекомбінантного реплікаційно-компетентного ретровірусного полінуклеотиду) конструюють у залежності, частково від бажаної клітини-хазяя, певного часу або величини експресії, і гетерологічного полінуклеотиду. Реплікаційнокомпетентна ретровірусна конструкція за даним винаходом може бути розділена на ряд доменів, що можуть бути індивідуально модифіковані фахівцями в даній галузі. Наприклад, промотор може містити CMV промотор, що має послідовність SEQ ID NO:19, 20 або 22 від нуклеотиду 1 приблизно до нуклеотиду 582 і може включати модифікацію одного або декількох (наприклад, 2-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-50, 50-100 або більше основ нуклеїнової кислоти), за умови, що модифікований промотор здатний направляти й ініціювати транскрипцію. В одному варіанті здійснення, промотор або регуляторна область містить полінуклеотидний домен CMV-R-U5. Домен CMV-R-U5 містить ранній промотор цитомегаловірусу людини для області MLV R-U5. В одному варіанті здійснення, полінуклеотидний домен CMV-R-U5 містить послідовність SEQ ID NO:19, 20 або 22 приблизно від нуклеотиду 1 приблизно до нуклеотиду 1202 або послідовності, що щонайменше на 95% ідентична послідовності SEQ ID NO:19, 20 або 22, де вказаний полінуклеотид активізує транскрипцію молекули нуклеїнової кислоти, оперативно зв'язаної з ним. Домен gag цього полінуклеотиду може бути отриманий з будь-якого числа ретровірусів, але звичайно його одержують з онкоретровірусу і більш конкретно, з онкоретровірусу ссавців. В одному варіанті здійснення домен gag містить послідовність, приблизно від нуклеотиду номер 1203 приблизно до нуклеотиду 2819 або послідовність, щонайменше на 95%, 98%, 99% або 99,8% (округлено до найближчого 10-го) ідентичну їй. Домен pol цього полінуклеотиду може бути отриманий з будь-якого числа ретровірусів, але звичайно його одержують з онкоретровірусу і більш конкретно, з онкоретровірусу ссавців. В одному варіанті здійснення домен pol містить послідовність приблизно від нуклеотиду номер 2820 приблизно до нуклеотиду 6358 або послідовність, щонайменше на 95%, 98%, 99% або 99,9% (округлено до найближчого 10-го) ідентичну їй. Домен env цього полінуклеотиду може бути отриманий з будь-якого числа ретровірусів, але звичайно його одержують з онкоретровірусу і більш конкретно, з онкоретровірусу ссавців. У деяких варіантах здійснення кодуючий домен env містить амфотропний домен env. В одному варіанті здійснення домен env містить послідовність приблизно від нуклеотиду номер 6359 приблизно до нуклеотиду 8323 або послідовність, щонайменше на 95%, 98%, 99% або 99,8% (округлено до найближчого 10-го) ідентичну їй. Домен IRES домен цього полінуклеотиду може бути отриманий з будь-якого числа внутрішніх сайтів зв'язування рибосоми. В одному варіанті здійснення, IRES отриманий з вірусу енцефаломіокардиту. В одному варіанті здійснення домен IRES містить послідовність приблизно від нуклеотиду номер 8327 приблизно до нуклеотиду 8876 або послідовність, щонайменше на 95%, 98% або 99% (округлено до найближчого 10-го) ідентичну їй, за умови, що цей домен дозволяє здійснювати зв'язування рибосоми. Гетерологічний домен може містити цитозиндезаміназу за даним винаходом. В одному варіанті здійснення, полінуклеотид CD містить послідовність кодонів, оптимізованих для експресії в клітинах людини. Ще в одному варіанті здійснення, полінуклеотид CD кодує мутантний поліпептид, який має цитозиндезаміназну активність, якому мутації додають підвищеної термостабільності, що підвищує температуру плавлення (Tm) на 10 °C, дозволяючи затримувати кінетичну активність у 25 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 широкому температурному інтервалі і підвищувати накопичені рівні білка. В одному варіанті здійснення, цитозиндезаміназа містить послідовність SEQ ID NO:19 приблизно від нуклеотиду номер 8877 приблизно до 9353. За гетерологічним доменом може йти домен, збагачений пурином. 3' LTR може бути отриманий з будь-якого числа ретровірусів, звичайно онкоретровірусу і, переважно, онкоретровірусу ссавців. В одному варіанті здійснення, 3' LTR містить домен U3-R-U5. Ще в одному варіанті здійснення LTR містить послідовність SEQ ID NO:19 приблизно від нуклеотиду 9405 приблизно до 9998 або послідовність, що щонайменше на 95%, 98% або 99,5% (округлено до найближчого 10-го) ідентичну їй. Даний винахід також належить до рекомбінантного ретровірусного вектора, що містить від 5' до 3' CMV-R-U5, злиття раннього промотору цитомегаловірусу людини з областю MLV R-U5; PBS, сайт зв'язування праймера зі зворотною транскриптазою; 5' сайт сплайсингу; сигнал упаковки ψ; gag, ORF для MLV групоспецифічного антигену; pol, ORF для поліпротеїну MLV полімерази; 3' сайт сплайсингу; 4070A env, ORF для білка оболонки MLV штаму 4070A; IRES, внутрішній сайт зв'язування рибосоми цитомегаловірусу; модифіковану цитозиндезаміназу (термостабільну з оптимізованими кодонами); PPT, поліпуриновий тракт; і U3-R-U5, MLV довгий кінцевий повтор. Ця структура додатково представлена на Фігурі 1. Даний винахід також належить до ретровірусного вектора, що містить послідовність SEQ ID NO:19, 20 або 22. В іншому варіанті здійснення, даний винахід належить до способу лікування пацієнта з порушенням клітинної проліферації. Цим пацієнтом може бути будь-як ссавець, і, переважно, людина. Пацієнт контактує з рекомбінатним реплікаційно-компетентним ретровірусним вектором за даним винаходом. Контактування може бути in vivo або ex vivo. Способи введення ретровірусного вектора за даним винаходом відомі з рівня техніки і включають, наприклад, системне введення, місцеве введення, внутрішньоочеревинне введення, внутрішньом'язове введення, внутрішньочерепне введення, цереброспінальне введення, а також уведення безпосереднє в місце пухлини або порушення клітинної проліферації. Інші шляхи уведення відомі з рівня техніки. Таким чином, даний винахід включає різні фармацевтичні композиції, застосовні для лікування порушення клітинної проліферації. Фармацевтичні композиції за даним винаходом одержують шляхом приведення ретровірусного вектора, що містить гетерологічну полінуклеотидну послідовність, застосовну для лікування або модуляції порушення клітинної проліферації за даним винаходом, у форму, що підходить для введення пацієнту з використанням носіїв, ексципієнтів або додаткових або допоміжних речовин. Часто використовувані носії або допоміжні речовини включають карбонат магнію, діоксид титану, лактозу, манітол і інші цукри, тальк, молочний білок, желатин, крохмаль, вітаміни, целюлозу і їхні похідні, тваринні і рослинні жири, поліетиленгліколі і розчинники, такі як стерильна вода, спирти, гліцерин і багатоатомні спирти. Внутрішньовенні носії включають компенсатори рідких і поживних речовин. Консерванти включають протимікробні засоби, антиоксиданти, хелатуючі агенти й інертні гази. Інші фармацевтичні прийнятні носії включають водні розчини, нетоксичні ексципієнти, у тому числі солі, консерванти, буфери і подібне, як описано, наприклад, у Rеміngtоn's Pharmaceutical Sciences, 15th ed. Easton: Mack Publishing Co., 1405-1412, 1461-1487 (1975) і The National Formulary XIV., 14th ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975), змісти яких за допомогою цього включені як посилання. pН і точну концентрацію різних компонентів цієї фармацевтичної композиції установлюють відповідно до загальноприйнятої в даній галузі практики. Дивися Goodman and Gіlмаn's The Pharmacological Basis for Therapeutics (7th ed.). Для приклада, а не для обмеження, ретровірусний вектор, використовуваний при лікуванні порушення клітинної проліферації, буде включати амфотропний білок ENV, GAG, і POL білки, промоторну послідовність в області U3 ретровірусного геному і будь-яку послідовність, що діє в цис-положенні, необхідну для реплікації, упакування й інтеграції ретровірусного геному в клітину-мішень. Наступні приклади призначені для ілюстрації, а не для обмеження цього винаходу. Хоча такі Приклади є характерними з тих, які могли бути використані, інші процедури, відомі фахівцям у даній галузі, можуть бути використані альтернативно. Приклади Приклад 1 Конструювання модифікованих генів CD і вбудовування в плазмідні вектори. Була проведена генетична оптимізація гена дикого типу цитозиндезамінази дріжджів, щоб він уключав: (1) три позиційні мутації, що змінюють три амінокислоти (A23L, I140L і V108I) для підвищення термостабільності білка цитозиндезамінази дріжджів і (2) додаткові модифікації генної послідовності для підвищення частоти використання кодонів людини для підвищення 26 UA 104298 C2 5 10 15 20 ефективності трансляції білка в клітинах людини без додаткових змін амінокислотної послідовності. Конструкція послідовності для CD, уключала CD оптимізовану, CD-UPRT (+/- лінкер) і CDOPRTазу (+/- лінкер). Кінцева послідовність, яка кодує цитозиндезаміназу може містити на 5' кінці сайт PSI1 (повноразмірний) і на 3' кінці сайт Not1 плюс поли A хвіст для методики на основі касети PSI1/Not1. Наступна послідовність, що містить цитозиндезаміназу дріжджів була використана для клонування, оптимізації і мутації (нуклеїнові кислоти в рамці містять сайти рестрикції, які використовуються в наступних способах клонування: AACACGATTATAAATGGTGACAGGGGGAATGGCAAGCAAGTGGGATCAGAAGGGTATGGAC ATTGCCTATGAGGAGGCGGCCTTAGGTTACAAAGAGGGTGGTGTTCCTATTGGCGGATGTCTTA TCAATAACAAAGACGGAAGTGTTCTCGGTCGTGGTCACAACATGAGATTTCAAAAGGGATCCGCC ACACTACATGGTGAGATCTCCACTTTGGAAAACTGTGGGAGATTAGAGGGCAAAGTGTACAAAGA TACCACTTTGTATACGACGCTGTCTCCATGCGACATGTGTACAGGTGCCATCATCATGTATGGTA TTCCACGCTGTGTTGTCGGTGAGAACGTTAATTTCAAAAGTAAGGGCGAGAAATATTTACAAACTA GAGGTCACGAGGTTGTTGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAAAAGATCATGAAACAATTTATCGAT GAAAGACCTCAGGATTGGTTTGAAGATATTGGTGAGTAGGCGGCCGCGCCATAGATAAAATAAAA GATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG (SEQ ID NO:30) У наступній Таблиці коротко викладені гени й отримані в результаті плазмідні вектори, що були отримані, і їхні назви. Таблиця Векторні конструкції і назви Tocagen Код Найменування Початкова назва pACE-CD T5.0000 pACE-yCD (Tai et al. 2005) T5.0001 pAC3-yCD1 5'LTR пром оболонка Вектор IRES CMV Ampho (4070A) pACE EMCV CDopt CMV послідовність Ampho (4070A) pAC3 EMCV Ampho (4070A) pAC3 EMCV pAC3 EMCV pAC3 EMCV pAC3 EMCV T5.0002 pAC3-yCD2 CDopt+3pt CMV pAC3yCD2-U pAC3T5.0004 yCD2-O pAC3T5.0005 yCD2-LO Cdopt+3ptUPRT CDopt+3ptOPRT CDopt+3ptLINK-OPRT T5.0006 pAC3-eGFP pAC3-emd, pAC3GFP CMV Ampho (4070A) pAC3 EMCV T5.0007 pAC3-yCD pAC3-yCD CMV Ampho (4070A) pAC3 EMCV T5.0003 25 30 CMV CMV CMV Ampho (4070A) Ampho (4070A) Ampho (4070A) Трансген CD дріжджів дикого типу Модифікована CD Модифікована CD CD2UPRT CD2OPRT CD2-LOPRT Смарагдовий GFP CD дріжджів дикого типу 3'LTR MLV U3 MLV U3 MLV U3 MLV U3 MLV U3 MLV U3 MLV U3 MLV U3 Реплікаційно-компетентний ретровірусний вектор, описаний Kasahara et al. pACE-CD (патент США № 6899871, опис якого включене в даний опис) був використаний як основа для додаткових модифікацій. Вектор (pAC3-yCD) був модифікований для експресії модифікованого гена цитозиндезамінази дріжджів, як описано в даній заявці, і був використаний у цих конструкціях. Дивися 1A нижче для діаграми векторної конструкції для вихідного трансфікованого реплікаційно-компетентного ретровірусу. CMV являє собою ранній промотор CMV людини, U3, R і U5 являють собою відповідні області вірусного довгого кінцевого повтору (LTR). Gag, pol і env являють собою області, які кодують вірусні білки. 1B і 1D демонструють 27 UA 104298 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 плазмідну структуру і послідовність за даним винаходом. Після синтезу генів у контракторі (Bio Basic Inc., Markham, Ontario, Canada) їх вбудовували в сайт Psi1–Not1 основи вектора pAC3 (Фігура 1). Основу плазміди звичайно одержують шляхом розрізування плазміди pAC3-eGFP з використанням Psi1 і Not1 і очищення великого (близько 11 тис. пар основ) фрагмента, що кодує плазміду й основу ретровірусу. A. Гуманізований кодон-оптимізований ген CD (CD-opt, aka CD1, T5.0001). Порівняння цитозиндезамінази з кодонами, оптимізованими для експресії в клітинах людини по Conrad et al. і PCT WO 99/60008 указує на 91 сумарний кодон, оптимізований в обох, 36 кодонів ідентичних, 47 кодонів мали зміни в третій парі основ (усі кодують ту саму амінокислоту) і 9 кодонів були різними (однак вони кодували ту саму амінокислоту). З 9 кодонів, що були різними: AGC (Ser) на TCC (Ser) CGT (Arg) на AGG (Arg) CCA (Pro) на CCT (Pro). Усі мали еквівалентний зміст GC і кодують ту саму амінокислоту. Нативна послідовність гена дріжджів була окремо кодон-оптимізована для одержання наступного гена CD (CD1) і була названа T5.0001 при вбудовуванні в плазмідний вектор pAC3, що кодує реплікаційнокомпетентний ретровірус (RCR) з IRES. TTATAAATGGTGACCGGCGGCATGGCCTCCAAGTGGGATCAAAAGGGCATGGATATCGCTTA CGAGGAGGCCGCCCTGGGCTACAAGGAGGGCGGCGTGCCTATCGGCGGCTGTCTGATCAACAA CAAGGACGGCAGTGTGCTGGGCAGGGGCCACAACATGAGGTTCCAGAAGGGCTCCGCCACCCT GCACGGCGAGATCTCCACCCTGGAGAACTGTGGCAGGCTGGAGGGCAAGGTGTACAAGGACAC CACCCTGTACACCACCCTGTCCCCTTGTGACATGTGTACCGGCGCTATCATCATGTACGGCATCC CTAGGTGTGTGGTGGGCGAGAACGTGAACTTCAAGTCCAAGGGCGAGAAGTACCTGCAAACCA GGGGCCACGAGGTGGTGGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAGAAGATCATGAAGCAGTTCATCGA CGAGAGGCCTCAGGACTGGTTCGAGGATATCGGCGAGTGATAAGCGGCCGCAGATAAAATAAAA GATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGG. (SEQ ID NO:31) B. Термостабілізований ген CD Були проведені додаткові модифікації для підвищення стабільності цитозиндезамінази. Генетичні модифікації гена дикого типу цитозиндезамінази дріжджів були проведені таким чином, щоб цей ген містив три позиційні мутації, що змінюють три амінокислоти (A23L, I140L і V108I) для підвищення термостабільності білка цитозиндезамінази дріжджів. Наступні пари праймерів використовували в одержанні гена для поліпептиду цитозиндезамінази за даним винаходом: смисловий: 5'-tcgaggatatcggcgagtgaaacccgttattctttttggc-3' (SEQ ID NO:32) антисмисловий: 5'-gccaaaaagaataacgggtttcactcgccgatatcctcga-3'(SEQ ID NO:33) смисловий: 5'tcggcgagtgatccggcggcggcgcctccggcggcggcgcctccggcggcggcgcc tccggcggcggcgccaacccgttatt-3'(SEQ ID NO:34) антисмисловий:5'-aataacgggttggcgccgccgccggaggcgccgccgccggaggcgccgccgc cggaggcgccgccgccggatcactcgccga-3'(SEQ ID NO:35). Для підвищення стабільності нативної CD дріжджів, три амінокислотні заміни були убудовані в цей білок. Ці заміни були окремими або в поєднанні з оптимізацією кодонів для експресії в клітинах людини. Три амінокислотні заміни являли собою: A23L, V108I, I140L. Послідовність, яка кодує ці заміни, показана нижче. ATGGTGACAGGGGGAATGGCAAGCAAGTGGGATCAGAAGGGTATGGACATTGCCTATGAGG AGGCGTTATTAGGTTACAAAGAGGGTGGTGTTCCTATTGGCGGATGTCTTATCAATAACAAAGAC GGAAGTGTTCTCGGTCGTGGTCACAACATGAGATTTCAAAAGGGATCCGCCACACTACATGGTG AGATCTCCACTTTGGAAAACTGTGGGAGATTAGAGGGCAAAGTGTACAAAGATACCACTTTGTAT ACGACGCTGTCTCCATGCGACATGTGTACAGGTGCCATCATCATGTATGGTATTCCACGCTGTGT CATCGGTGAGAACGTTAATTTCAAAAGTAAGGGCGAGAAATATTTACAAACTAGAGGTCACGAGG TTGTTGTTGTTGACGATGAGAGGTGTAAAAAGTTAATGAAACAATTTATCGATGAAAGACCTCAGG ATTGGTTTGAAGATATTGGTGAGTAGGCGGCCGCGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTC TCCAGAAAAAGGGGGG (SEQ ID NO:36) Кодований поліпептид містить наступну послідовність (заміщені амінокислоти виділені жирним шрифтом і підкреслені): 1 MVTGGMASKWDQKGMDIAYEEALLGYKEGGVPIGGCLINNKDGSVLGRGHNMRFQKGSAT 61 LHGEISTLENCGRLEGKVYKDTTLYTTLSPCDMCTGAIIMYGIPRCVIGENVNFKSKGEK 121 YLQTRGHEVVVVDDERCKKLMKQFIDERPQDWFEDIGEСтворення кінцевої конструкції, що включає 3 амінокислотні заміни A23L/V108I/I140L, використовуючи переважні кодони, і використовує переважну частоту використання кодонів 28