Антитіло проти c-met

Формула / Реферат | Подібні патенти | МПК / Мітки | Додаткова інформація | Код посилання

Номер патенту: 108466

Опубліковано: 12.05.2015

Автори: Гьотш Ліліан, Вюрш Тьєррі, Бес Седрік

Є ще 119 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Химерне або гуманізоване моноклональне антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент, що включає константну область IgG1 людини, здатне інгібувати димеризацію с-Мet, де дане антитіло включає важкий ланцюг, що включає CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3 з відповідними амінокислотними послідовностями SEQ ID NO: 1, 2 і 3; і легкий ланцюг, що включає CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3 з відповідними амінокислотними послідовностями SEQ ID NO: 5, 6 і 7, де дане антитіло додатково характеризується тим, що воно також включає шарнірну область, яка включає амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 22-24, 26, 28, 59-63 та 65-71.

2. Антитіло за п. 1 або його бівалентний функціональний фрагмент, яке характеризується тим, що воно включає варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4; і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8, 9 або 10.

3. Антитіло за п. 2 або його бівалентний функціональний фрагмент, яке характеризується тим, що воно включає варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4; варіабельний домен легкого ланцюга послідовності, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8; і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 22.

4. Антитіло за п. 2 або його бівалентний функціональний фрагмент, яке характеризується тим, що воно включає варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4; варіабельний домен легкого ланцюга послідовності, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 9; і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 22.

5. Антитіло за п. 2 або його бівалентний функціональний фрагмент, яке характеризується тим, що воно включає варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4; варіабельний домен легкого ланцюга послідовності, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 10; і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 22.

6. Антитіло за п. 2 або його бівалентний функціональний фрагмент, яке характеризується тим, що воно включає варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4; варіабельний домен легкого ланцюга послідовності, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8; і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 28.

7. Антитіло за п. 2 або його бівалентний функціональний фрагмент, яке характеризується тим, що воно включає варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4; варіабельний домен легкого ланцюга послідовності, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 9; і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 28.

8. Антитіло за п. 2 або його бівалентний функціоншіьний фрагмент, яке характеризується тим, що воно включає варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4; варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 10; і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 28.

9. Ізольована нуклеїнова кислота, яка характеризується тим, що вона вибрана з наведених нижче амінокислот:

a) нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, що кодує антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент за будь-яким з пп. 1-8;

b) нуклеїнової кислоти, яка включає послідовність ДНК, що включає послідовності SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 та послідовності SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 і SEQ ID NO: 17;

c) нуклеїнової кислоти, яка включає послідовність ДНК, що включає послідовності SEQ ID NO: 14 і SEQ ID NO: 18, 19 або 20;

d) відповідних PНК-нуклеїнових кислот з нуклеїнових кислот, що визначені в b) або с); і

e) нуклеїнових кислот, комплементарних нуклеїновим кислотам за пп. а), b) і с).

10. Ізольована нуклеїнова кислота, яка характеризується тим, що вона вибрана з наведених нижче нуклеїнових кислот:

- нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, що кодує антитіло або один з його функціональних фрагментів за п.1, де нуклеїнова послідовність, що кодує шарнірну область даного антитіла, включає або має послідовність, вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID NO: 29-31, 33, 35 і SEQ ID NO: 74-78 та 80-86.

11. Вектор, який включає нуклеїнову кислоту за п. 9 або 10.

12. Клітина-хазяїн, що включає вектор за п. 11.

13. Трансгенна тварина за винятком людини, що включає щонайменше одну клітину, трансформовану вектором за п. 11.

14. Спосіб одержання антитіла або його бівалентного функціонального фрагмента за будь-яким з пп. 1-8, який характеризується тим, що він включає наведені нижче стадії:

a) культивування клітини за п. 12 у середовищі в придатних умовах культивування; і

b) виділення антитіла або його бівалентного функціонального фрагмента, одержаного таким

шляхом, з культурального середовища або з зазначених культивованих клітин.

15. Антитіло за пп. 1-8 або отримане способом за п. 14 як лікарський засіб.

16 Композиція, що включає як активну речовину сполуку, що є антитілом або його бівалентним функціональним фрагментом, за будь-яким з пп. 1-8 або отриманим способом за п. 14.

17. Композиція за п. 16, яка характеризується тим, що вона включає, крім того, у вигляді комбінованого препарату для одночасного, окремого або послідовного застосування, протипухлинне антитіло.

18. Композиція за п. 16, яка характеризується тим, що вона включає, крім того, у вигляді комбінованого препарату для одночасного, окремого або послідовного застосування, цитотоксичний/цитостатичний агент.

19. Композиція за п. 18, де зазначений цитотоксичний/цитостатичний агент сполучають хімічним шляхом із зазначеним антитілом або зазначеним його дивалентним функціональним фрагментом для одночасного застосування.

20. Композиція за п. 19, де зазначений цитотоксичний/цигостатичний агент вибраний з групи, яка складається з алкілувальних агентів, антиметаболітів, протипухлинних антибіотиків, мітотичних інгібіторів, інгібіторів функції хроматину, антиангіогенних агентів, антиестрогенів, антиандрогенів або імуномодуляторів.

21. Композиція за п. 20, де зазначений цитотоксичний/цитостатичний агент є мітотичним інгібітором.

22. Композиція за п. 16, яка характеризується тим, що щонайменше одне з зазначених антитіл або їх бівалентних функціональних фрагментів кон'юговане з клітинним токсином та/або з радіоактивним елементом.

23. Композиція за п. 19, яка характеризується тим, що зазначений токсин та/або радіоактивний елемент піддають сполученню хімічним шляхом щонайменше з одним з елементів композиції для одночасного застосування.

24. Композиція за будь-яким з пп. 16-23 як ліки.

25. Застосування антитіла або його бівалентного функціонального фрагмента за пп. 1-8, або отриманого способом за п. 14, або композиції за пп. 16-24 для отримання ліків, призначених для інгібування росту та/або проліферації пухлинних клітин.

26. Застосування антитіла або його бівалентного функціонального фрагмента за пп. 1-8, або отриманого способом за п. 14, або композиції за пп. 16-24, або застосування за п. 25 для одержання ліків, призначених для попередження або для лікування раку.

27. Застосування за п. 26, яке характеризується тим, що зазначений рак є раком, вибраним з раку простати, остеосарком, раку легені, раку молочної залози, раку ендометрія, гліобластоми або раку ободової кишки.

28. Застосування за п. 26 або 27, яке характеризується тим, що зазначений рак є раком, пов'язаним з HGF-залежною та незалежною активацією Met.

29. Спосіб діагностики in vitro захворювань, індукованих гіперекспресією або зниженою експресією рецептора c-Met, виходячи з біологічного зразка, у якому підозрюють аномальну присутність рецептора c-Met, де цей спосіб характеризується тим, що він включає стадію, де біологічний зразок приводять у контакт з антитілом за пп. 1-8, або отриманим способом за п. 14.

30. Спосіб за п. 29, який відрізняється тим, що зазначене антитіло є міченим.

Текст

Реферат: Винахід стосується химерного або гуманізованого моноклонального антитіла, здатного інгібувати димеризацію с-Мet, де дане антитіло включає важкий ланцюг, що включає CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3 з відповідними амінокислотними послідовностями SEQ ID NO: 1, 2 і 3; і легкий ланцюг, що включає CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3 з відповідними амінокислотними послідовностями SEQ ID NO: 5, 6 і 7, де дане антитіло додатково характеризується тим, що воно також включає шарнірну область, яка включає амінокислотну послідовність вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 22-24, 26, 28, 59-63 та 65-71. Винахід стосується також композиції, яка включає таке антитіло, та її застосування як ліків для лікування раку. UA 108466 C2 (12) UA 108466 C2 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується нового бівалентного антитіла, яке здатне специфічно зв'язуватися з рецептором c-Met людини, та/або здатне специфічно інгібувати тирозинкіназну активність даного рецептора, а також амінокислотної та нуклеїново-кислотної послідовності, що кодує дане антитіло. Конкретніше, антитіло за винаходом є здатним інгібувати димеризацію c-Met. Винахід також включає застосування даного антитіла як ліків для профілактичного та/або терапевтичного лікування раків, або будь-якої патології, пов'язаної з гіперекспресією даного рецептора, а також способи та набори для діагностики захворювання, пов'язаного з гіперекспресією c-Met. Винахід, нарешті, включає препарати та/або композиції, що містять таке антитіло в комбінації з іншими антитілами та/або хімічними сполуками, націленими проти інших факторів росту, задіяних у прогресуванні або метастазі пухлини, й/або сполуками та/або протираковими агентами чи агентами, кон’югованими з токсинами, та їх застосування для попередження та/або лікування певних раків. Агенти, націлені на рецепторні тирозинкінази (RTK), такі як інгібітори трастузумаб, цетуксимаб, бевацизумаб, іматиніб та гефітиніб, показали інтерес до націленості даного класу білків на лікування певних раків. c-Met є прототипним членом підродини RTK, яка також включає RON і SEA. Родина c-Met RTK структурно відрізняється від інших родин RTK, та є єдиним відомим високоафінним рецептором для фактора росту гепатоцитів (HGF), також називаного розсіювальним фактором (SF) [D.P. Bottaro et al., Science 1991, 251:802-804; L. Naldini et al., Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991, 10:2867-2878]. c-Met і HGF поширено експресуються в ряді тканин, але їх експресія у нормі обмежена клітинами епітеліального та мезенхімального походження, відповідно [M.F. Di Renzo et al., Oncogene 1991, 6:1997-2003; E. Sonnenberg et al., J. Cell. Biol. 1993, 123:223-235]. Обидва вони потрібні для нормального розвитку ссавців, і показано, що вони особливо важливі при міграції клітин, морфогенетичній диференціації та організації тривимірних тубулярних структур, а також при рості та ангіогенезі [F. Baldt et al., Nature 1995, 376:768-771; C. Schmidt et al., Nature. 1995:373:699-702; Tsarfaty et al., Science 1994, 263:98-101]. Хоча показано, що контрольована регуляція c-Met і HGF важлива при розвитку ссавців, підтриманні та репарації тканин [Nagayama T., Nagayama M., Kohara S., Kamiguchi H., Shibuya M., Katoh Y., Itoh J., Shinohara Y., Brain Res. 2004, 5;999(2): 155-66; Tahara Y., Ido A., Yamamoto S., Miyata Y., Uto H., Hori T., Hayashi K., Tsubouchi H., J Pharmacol Exp Ther. 2003, 307(1): 146-51], порушення їх регуляції вважають причиною прогресування раків. Аберантна передача сигналу, що викликається неправильною активацією c-Met, є однією з найчастіших аберацій, спостережуваних при раках людини, і відіграє критичну роль у канцерогенезі та метастазах [Birchmeier et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4:915-925; L. Trusolino and Comoglio P. M., Nat Rev. Cancer. 2002, 2(4):289-300]. Неправильна активація c-Met може виникати внаслідок ліганд-залежних та незалежних механізмів, що включають гіперекспресію c-Met та/або паракринну або автокринну активацію, або шляхом приросту функціональних мутацій [J.G. Christensen, Burrows J. and Salgia R., Cancer Latters. 2005, 226:1-26]. Однак олігомеризація рецептора c-Met у присутності, або за відсутності ліганду необхідна для регуляції зв’язувальної спорідненості та кінетики зв'язування кінази з АТФ та пептидними субстратами, що містять тирозин [Hays JL, Watowich SJ, Biochemistry, 2004 Aug 17, 43:10570-8]. Активований c-Met рекрутує сигнальні ефектори до свого сайта множинного стикування, розташованого в цитоплазматичному домені, приводячи в результаті до активації декількох ключових шляхів передачі сигналу, включаючи Ras-MAPK, PI3K, Src і Stat3 [Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005, 15(1):49-51; Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene. 2000, 19(49):5582-9]. Ці шляхи необхідні для проліферації пухлинних клітин, інвазії та ангіогенезу, та для уникнення апоптозу [Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene, 2000, 19(49):5582-9; Gu H., Neel BG, Trends Cell Biol. 2003 Mar, 13(3): 122-30; Fan S., Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q., Cao Y., Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM, Oncogene. 2000 Apr 27, 19(18):2212-23]. Крім того, унікальним аспектом передачі сигналу c-Met, порівняно з іншими RTK, є його описана взаємодія з фокальними адгезіонними комплексами та не-кіназними партнерами зв'язування, такими як інтегрини α6β4 [Trusolino L., Bertotti A., Comoglio PM, Cell. 2001, 107:643-54], CD44v6 [Van der Voort R., Taher TE, Wielenga VJ, Spaargaren M., Prevo R., Smit L., David G., Hartmann G., Gherardi E., Pals ST, J. Biol. Chem. 1999, 274(10):6499-506], плексин B1 або семафорини [Giordano S., Corso S., Conrotto P., Artigiani S., Gilestro G., Barberis D., Tamagnone L., Comoglio PM, Nat Cell Biol. 2002, 4(9):720-4; Conrotto P., Valdembri D., Corso S., Serini G., Tamagnone L., Comoglio PM, Bussolino F., Giordano S., Blood. 2005, 105(11):4321-9; Conrotto P., Corso S., Gamberini S., Comoglio PM, Giordano S., Oncogene. 2004, 23:5131-7], що може додатково сприяти комплексності регуляції клітинної функції цим рецептором. Нарешті, останні дані демонструють, що c-Met може бути задіяний у надбанні пухлиною стійкості до 1 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гефітинібу або ерлотинібу, що дозволяє припустити, що комбінація сполуки, націлена як на EGFR, так і на c-Met, могла б становити значний інтерес [Engelman JA et al., Science, 2007, 316:1039-43]. В останні кілька років велика кількість різних стратегій була розроблена для атенуації передачі сигналу c-Met у ракових клітинних лініях. Ці стратегії включають i) нейтралізуючі антитіла проти c-Met або HGF/SF [Cao B., Su Y., Oskarsson M., Zhao P., Kort EJ, Fisher RJ, Wang LM, Vande Woude GF, Proc Natl Acad Sci USA. 2001, 98(13):7443-8; Martens T., Schmidt NO, Eckerich C, Fillbrandt R., Merchant M., Schwall R., Westphal M., Lamszus K., Clin Cancer Res. 2006, 12(20):6144-52] або застосування антагоніста HGF/SF NK4 для запобігання зв'язування ліганду з c-Met [Kuba K., Matsumoto K., Date K., Shimura H., Tanaka M., Nakamura T., Cancer Res., 2000, 60:6737-43], ii) низькомолекулярні інгібітори сайта зв'язування АТФ із c-Met, що блокують кіназну активність [Christensen JG, Schreck R., Burrows J., Kuruganti P., Chan E, Le P., Chen J., Wang X., Ruslim L., Blake R., Lipson KE, Ramphal J., Do S., Cui JJ, Cherrington JM, Mendel DB, Cancer Res. 2003, 63:7345-55], iii) сконструйований поліпептид домену SH2, що перешкоджає доступу до множинного докінг-сайта та РНК або рібозим, що знижують експресію рецептора або ліганду. Більшість цих підходів виявляють селективне інгібування c-Met, що приводить в результаті до інгібування пухлини, та показують, що c-Met може становити інтерес для терапевтичного втручання в рак. З молекул, створених для націлення на c-Met, деякі є антитілами. Найбільш широко описаним є антитіло проти c-Met 5D5, отримане фірмою Genentech [WO 96/38557], яке поводиться як сильний агоніст при окремому додаванні в різних моделях, та як антагоніст при використанні у вигляді Fab фрагмента. Моновалентна сконструйована форма цього антитіла, описана як 5D5 з одним плечем (OA5D5), і продукована у вигляді рекомбінантного білка в E. coli, також є об'єктом заявки на патент [WO 2006/015371] фірми Genentech. Однак дана молекула, яку не можна розглядати як антитіло у зв'язку з її особливим каркасом, також виявляє мутації, що могли б бути імуногенними у людей. Щодо активності, ця не глікозильована молекула не має ефекторних функцій, і, нарешті, немає чітких даних, які демонструють, що OA5D5 інгібує димеризацію c-Met. Крім того, при тестуванні в моделі G55 in vivo на клітинній лінії гліобластоми, яка експресує c-Met, але не експресує мРНК та білок HGF, і яка росте незалежно від ліганду, анти-c-Met з одним плечем не має значимого ефекту на ріст пухлини G55, дозволяючи припустити, що OA5D5 діє, насамперед, через блокування зв'язування HGF і нездатний до націленності на пухлини, активовані незалежно від HGF [Martens T. et al., Clin. Cancer Res., 2006, 12(20):6144-6152]. Інше антитіло, націлене на c-Met, описане фірмою Pfizer як антитіло, що діє "більше як антагоніст c-Met, і в деяких випадках як агоніст c-Met" [WO 2005/016382]. Ніяких даних, що показували б будь-який ефект антитіл Pfizer на димеризацію c-Met, у даній заявці не наведено. Одним з новаторських аспектів даного винаходу є створення химерного та/або гуманізованого моноклонального антитіла без власної агоністичної активності, що інгібує димеризацію c-Met. Конкретніше, новаторським аспектом даного винаходу є створення химерного та/або гуманізованого моноклонального антитіла з антагоністичною активністю та інгібуванням димеризації c-Met. На додаток до націленості на ліганд-залежні пухлини, даний підхід буде також порушувати ліганд-незалежні активації c-Met внаслідок його гіперекспресії або мутацій внутрішньоклітинних доменів, які лишаються залежними від олігомеризації для передачі сигналу. Іншим аспектом активності цього антитіла могло б бути стеричне ускладнення взаємодії c-Met з його партнерами, що призведе в результаті до порушення функцій c-Met. Це антитіло є гуманізованим і сконструйоване, у кращому випадку, але не обмежуючись цим, як IgG1 людини із надбанням ефекторних функцій, таких як АЗКЦ і КЗЦ, на додаток до функцій, пов'язаних зі специфічною блокадою рецептора c-Met. Автори винаходу несподівано вперше змогли створити химерне та/або гуманізоване моноклональне антагоністичне антитіло, здатне до зв'язування з c-Met, але також здатне до інгібування димеризації c-Met, де дане моноклональне антитіло є бівалентним, на противагу існуючим антагоністичним антитілам, націленим проти c-Met. Якщо вірно те, що, як іноді припускали на попередньому рівні техніки, антитіло, здатне до інгібування димеризації c-Met його партнерами, може становити інтерес, антитіло, здатне здійснювати це, ніколи не було ні описане, ані чітко запропоноване. Крім того, стосовно специфічності антитіла, було зовсім неочевидне досягнення успіху в створенні такого активного бівалентного антитіла. Як було пояснено вище, інгібування димеризації c-Met є головним аспектом винаходу, оскільки такі антитіла становлять дійсний інтерес для ширшого кола пацієнтів. Не лише лігандзалежний, c-Met-активований рак, як це було до даного винаходу, але також ліганд-незалежний, 2 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 c-Met-активований рак можна лікувати антитілами, отриманими способом за даним винаходом. Антитіла оцінювали за допомогою аналізу BRET на клітинах, що експресують обидва гени cMet-RLuc/c-Met-YPF, та відбирали за їх здатністю інгібувати щонайменше 40%, краще 45%, 50%, 55%, і найкраще 60% сигналу BRET. Технологія BRET відома як репрезентативна для димеризації білків [Angers et al., PNAS, 2000, 97:3684-89]. Технологія BRET добре відома фахівцям у даній галузі техніки, та докладно описана у наведених нижче прикладах. Конкретніше, BRET (резонансне перенесення енергії біолюмінесценції, Bioluminescence Resonance Energy Transfer) є нерадіоактивним перенесенням енергії, що відбувається між біолюмінесцентним донором (люциферазою Renilla (RLuc)) і флуоресцентним акцептором, мутантом GFP (зеленим флуоресцентним білком), або YPF (жовтим флуоресцентним білком). У даному випадку використовували EYPF (посилений жовтий флуоресцентний білок). Ефективність перенесення залежить від орієнтації та відстані між донором і акцептором. Тому перенесення енергії може відбуватися тільки тоді, коли дві молекули знаходяться у тісній наближеності (1-10 нм). Цю властивість використовують для створення аналізів взаємодії між білками. Дійсно, щоб досліджувати взаємодію між двома партнерами, перший генетичним шляхом зливають із люциферазою Renilla, а другий з жовтим мутантом GFP. Злиті білки звичайно, але не обов'язково, експресують у клітинах ссавців. У присутності його субстрату, що проникає крізь мембрану (целентеразину) RLuc випромінює синє світло. Якщо мутант GFP знаходиться ближче, ніж за 10 нм від RLuc, може відбуватися перенесення енергії, і можна виявити додатковий жовтий сигнал. Сигнал BRET вимірюють як співвідношення між світлом, що випускається акцептором, та світлом, що випускається донором. Таким чином, сигнал BRET зростає, коли два злиті білки приводять у близький контакт, або якщо конформаційна зміна приводить RLuc і мутант GFP у ближчий контакт. Якщо аналіз BRET є кращою формою здійснення, будь-який спосіб, відомий фахівцям у даній галузі техніки, можна використовувати для вимірювання димеризації c-Met. Не обмежуючись, можна згадати такі технології: FRET (резонансне перенесення енергії флуоресценції), HTRF (гомогенна часпролітна флуоресценція), FLIM (мікроскопія на основі вимірювання часу життя флуоресценції) або SW-FCCS (однохвильова спектроскопія кроскореляції флуоресценції). Можна також використовувати інші класичні технології, такі як спільна імунопреципітація, альфа-скринінг, хімічне зшивання, подвійна гібридизація, афінна хроматографія, ELISA або Far вестерн-блотинг. Терміни "антитіло", "антитіла" або "імуноглобулін" використовують взаємозамінно у найширшому значенні, і вони включають моноклональні антитіла (наприклад, повнорозмірні або інтактні моноклональні антитіла), поліклональні антитіла, полівалентні антитіла або мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла, якщо вони виявляють бажану біологічну активність). Конкретніше, така молекула складається з глікопротеїну, що включає щонайменше два важких (H) ланцюга та два легких (L) ланцюга, взаємно зв’язані дисульфідними зв'язками. Кожний важкий ланцюг складається з варіабельної області (або домену) важкого ланцюга (в даній заявці скорочено HCVR або VH) і константної області важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга складається з трьох доменів, CH1, CH2 і CH3. Кожен легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (у даній заявці скорочено LCVR або VL) і константної області легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга складається з двох доменів CL. Області VH і VL можна додатково розділити на гіперваріабельні ділянки, називані ділянками визначення комплементарності (CDR), що чергуються з консервативнішими ділянками, називаними каркасними ділянками (FR). Кожна VH і VL складається з трьох CDR і чотирьох FR, розташованих від аміно-кінця до карбокси-кінця в такому порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Варіабельні області важких і легких ланцюгів включають зв’язувальний домен, який зв'язується з антигеном. Константні області антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну із тканинами або факторами хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) і перший компонент (Clq) класичної системи комплементу. Важкі ланцюги імуноглобулінів можна розділити на три функціональні області: область Fd, шарнірну область, і область Fc (фрагмент, що піддається кристалізації). Область Fd включає домени VH і CH1, і в комбінації з легким ланцюгом утворює Fab - антигензв’язувальний фрагмент. Фрагмент Fc відповідає за ефекторні функції імуноглобуліну, які включають, наприклад, фіксацію комплементу та зв'язування з розпізнавальними рецепторами Fc ефекторних клітин. Шарнірна область, знайдена в імуноглобулінах класів IgG, IgA та IgD, діє як 3 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гнучкий спейсер, який дає можливість ділянці Fab вільно переміщатися в просторі відносно області Fc. Шарнірні домени є структурно різними, варіюючи як за послідовністю, так і за довжиною серед класів та підкласів імуноглобулінів. Згідно з кристалографічними дослідженнями, шарнірну область імуноглобуліну можна додатково підрозділити структурно та функціонально на три області: верхню шарнірну, серцевину та нижню шарнірну (Shin et al., Immunological Reviews 130:87, 1992). Верхня шарнірна область включає амінокислоти від карбокси-кінця CH1 до першого залишку в шарнірній області, що обмежує рух, звичайно до першого залишку цистеїну, який утворює міжланцюговий дисульфідний зв'язок між двома важкими ланцюгами. Довжина верхньої шарнірної області корелює із сегментною гнучкістю антитіла. Серцевинна шарнірна область включає дисульфідні містки між важкими ланцюгами. Нижня шарнірна область з'єднує амінокінець домену CH2 і включає його залишки. Серцевинна шарнірна область IgG1 людини включає послідовність Cys-Pro-Pro-Cys, яка при димеризації внаслідок утворення дисульфідного зв'язку приводить в результаті до циклічного октапептиду, який вважають діючим як поворотна точка, таким чином, надаючи гнучкість. Конформаційні зміни, припустимі структурою, і гнучкість поліпептидної послідовності шарнірної області імуноглобуліну можуть впливати на ефекторні функції ділянки Fc антитіла. Термін “моноклональне антитіло” використовують відповідно до його звичайного значення для позначення антитіла, отриманого з популяції по суті однорідних антитіл, тобто, окремі антитіла, що складають цю популяцію, ідентичні за винятком можливих мутацій, що зустрічаються в природі, які можуть бути присутніми у мінорних кількостях. Іншими словами, моноклональне антитіло складається з однорідного антитіла, отриманого в результаті проліферації єдиного клону клітин (наприклад, клітин гібридоми, еукаріотичних клітин-хазяїв, трансфекованих ДНК, що кодує однорідне антитіло, прокаріотичних клітин-хазяїв, трансфекованих ДНК, що кодує однорідне антитіло, і т.д.), яке, як правило, характеризується важкими ланцюгами одного класу та підкласу, та легкими ланцюгами одного типу. Моноклональні антитіла високоспецифічні, оскільки націлені проти одного антигену. Крім того, на противагу препаратам поліклональних антитіл, які типово включають різні антитіла, націлені проти різних детермінантів або епітопів, кожне моноклональне антитіло націлене проти одного детермінанта на антигені. У даному описі терміни поліпептиди, поліпептидні послідовності, амінокислотні послідовності, пептиди та білки, приєднані до сполук антитіла або до їх послідовностей, є взаємозамінними. Винахід стосується моноклонального антитіла або бівалентного функціонального фрагмента чи його похідного, здатного інгібувати димеризацію c-Met, що включає важкий ланцюг, який містить CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3 з відповідними амінокислотними послідовностями SEQ ID No. 1, 2 і 3, або послідовністю, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No. 1, 2 і 3; і легкий ланцюг, який містить CDR-L1, CDRL2 і CDR-L3 з відповідними амінокислотними послідовностями SEQ ID No. 5, 6 і 7, або послідовністю, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No. 5, 6 або 7, де дане антитіло додатково характеризується тим, що воно також включає шарнірну область, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 56. Конкретніше, винахід стосується моноклонального антитіла або бівалентного функціонального фрагмента чи його похідного, як описано вище, яке характеризується тим, що воно також включає шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 57. Іншими словами, винахід стосується моноклонального антитіла або бівалентного функціонального фрагмента чи його похідного, здатного інгібувати димеризацію c-Met, що включає важкий ланцюг, який включає CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3 з відповідними амінокислотними послідовностями SEQ ID No. 1, 2 і 3 або послідовністю, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No. 1, 2 і 3; і легкий ланцюг, що включає CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3 з відповідними амінокислотними послідовностями SEQ ID No. 5, 6 і 7 або послідовністю, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No. 5, 6 або 7, де дане антитіло додатково характеризується тим, що воно також включає шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 57. Конкретніше, винахід стосується моноклонального антитіла або бівалентного функціонального фрагмента чи його похідного, як описано вище, яке характеризується тим, що воно також включає шарнірну область, яка включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 21. Іншими словами, винахід стосується моноклонального антитіла або бівалентного функціонального фрагмента чи його похідного, здатного інгібувати димеризацію c-Met, яке 4 UA 108466 C2 5 10 включає важкий ланцюг, що включає CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3 з відповідними амінокислотними послідовностями SEQ ID No. 1, 2 і 3 або послідовністю, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No. 1, 2 і 3; і легкий ланцюг, що включає CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3 з відповідними амінокислотними послідовностями SEQ ID No. 5, 6 і 7 або послідовністю, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No. 5, 6 або 7, де дане антитіло додатково характеризується тим, що воно також включає шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 21. Як буде очевидно фахівцеві в даній галузі техніки, консенсус-послідовності SEQ ID No. 57 і 21 включені до консенсус-послідовності SEQ ID No. 56. Таблиця 1 SEQ ID NO 56 SEQ ID NO 57 SEQ ID NO 21 15 20 25 30 35 40 45 50 #01 XI XI XI #02 #03 #04 #05 #06 #07 #08 X2 X3 C X5 X6 X7 X8 X2 X3 C X5 X6 X7 X8 X2 X3 C X5 C X8 #09 X9 X9 X9 #10 C C C #11 X11 P X11 #12 X12 P X12 #13 C C C #14 X14 P X14 Для SEQ ID No. 56: X1: P, R, C, - X5: D, C, G, - X8: H, V, K, - X12 : P, X2: K, C, R, - X6: K, C, - X9: T, C, E, P, - X14: P, T X3: S, C, D, - X7: T, C, - X11: P, I Вислів "функціональні фрагменти та похідні" докладно визначений нижче у даному описі. Під ділянками CDR або CDR(s) мають на увазі вказання на гіперваріабельні ділянки важких і легких ланцюгів імуноглобулінів, які визначені за допомогою IMGT. Унікальна нумерація IMGT визначена для порівняння варіабельних доменів будь-яких рецепторів антигенів, типів ланцюга або видів [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]. В унікальній нумерації IMGT консервативні амінокислоти завжди мають одне й те саме положення, наприклад, цистеїн 23 (1st-CYS), триптофан 41 (CONSERVED-TRP), гідрофобна амінокислота 89, цистеїн 104 (2nd-CYS), фенілаланін або триптофан 118 (J-PHE або J-TRP). Унікальна нумерація IMGT забезпечує стандартизоване визначення границь каркасних ділянок (FR1-IMGT: положення 1 - 26, FR2-IMGT: 39 - 55, FR3-IMGT: 66 - 104 і FR4-IMGT: 118 - 128) та ділянок визначення комплементарності: CDR1-IMGT: 27 - 38, CDR2-IMGT: 56 - 65 і CDR3-IMGT: 105 - 117. Оскільки гепи є незайнятими положеннями, довжини CDR-IMGT (показані між дужками та визначені крапками, наприклад, [8.8.13]) стають критичною інформацією. Унікальну нумерацію IMGT використовують в 2D графічних зображеннях, позначених як IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc, M.P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], і в 3D структурах в IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208D210 (2004)]. Існують три CDR важкого ланцюга і 3 CDR легкого ланцюга. Термін CDR використовують у даній заявці з метою зазначення, залежно від ситуації, однієї з трьох ділянок, або декількох, або навіть усіх цих ділянок, які включають більшість амінокислотних залишків, відповідальних за зв'язування по спорідненості антитіла з антигеном або з епітопом, який воно розпізнає. Під "відсотком ідентичності" між двома нуклеїново-кислотними або амінокислотними послідовностями в даному винаході мають на увазі вказання відсотка нуклеотидів або ідентичних амінокислотних залишків між двома порівнюваними послідовностями, отриманого після найкращого вирівнювання (оптимального вирівнювання), де цей відсоток є винятково статистичним, і відмінності між двома послідовностями розподілені випадково та по всій їх довжині. Порівняння послідовностей між двома нуклеїново-кислотними або амінокислотними послідовностями традиційно здійснюють шляхом порівняння цих послідовностей після того, як вони оптимально вирівняні, де дане порівняння можна проводити по сегментах або за допомогою "вікна порівняння". Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння можна здійснювати, на додаток до ручного способу, за допомогою алгоритму локальної гомології Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], за допомогою алгоритму локальної гомології Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], за допомогою методу пошуку подібностей Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444), за допомогою комп'ютерного програмного забезпечення, що використовує ці алгоритми (GAP, BESTFIT, FASTA і TFASTA у 5 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, або також за допомогою програмного забезпечення BLAST N чи BLAST P). Відсоток ідентичності між двома нуклеїново-кислотними або амінокислотними послідовностями підраховують шляхом порівняння цих двох послідовностей, вирівняних оптимально, і коли в них порівнювана нуклеїново-кислотна або амінокислотна послідовність може включати додання або делеції порівняно з референсною послідовністю для оптимального вирівнювання між двома послідовностями. Відсоток ідентичності підраховують шляхом визначення числа ідентичних положень, у яких нуклеотид або амінокислотний залишок є ідентичним для двох послідовностей, ділення цього числа ідентичних положень на загальне число положень у вікні порівняння, та множення отриманого результату на 100, щоб отримати відсоток ідентичності між двома послідовностями. Наприклад, можна використовувати програму BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), доступну на сайті http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.http, де використовуваними параметрами є параметри за замовчуванням (зокрема, параметри "штраф на відкриття розриву": 5 і "штраф на подовження розриву": 2; де вибрана матриця є, наприклад, матрицею "BLOSUM 62", запропонованою програмою), де відсоток ідентичності між двома порівнюваними послідовностями обчислюється безпосередньо програмою. Як амінокислотні послідовності, що мають щонайменше 80%, краще 85%, 90%, 95% і 98% ідентичність відносно референсної амінокислотної послідовності, кращими є такі, що мають порівняно з референсною послідовністю певні модифікації, зокрема, делецію, додання або заміну щонайменше однієї амінокислоти, укорочення або подовження. У випадку заміни однієї, або більше ніж однієї послідовної, або не послідовної амінокислоти кращими є заміни, при яких замінені амінокислоти заміняються "еквівалентними" амінокислотами. Вислів "еквівалентні амінокислоти" у даній заявці призначений для зазначення будь-якої амінокислоти, яка може бути замінена будь-якою з амінокислот базової структури, але без істотного модифікування біологічних активностей відповідних антитіл, і як буде визначено нижче, зокрема, у прикладах. Ці еквівалентні амінокислоти можуть бути визначені, ґрунтуючись або на їх структурній гомології з амінокислотами, які вони заміняють, або на результатах порівняльних досліджень біологічної активності між різними антитілами, які можна здійснити. Як приклад, можна згадати можливості заміни, яку можна здійснити, не призводячи в результаті до значного модифікування біологічної активності відповідного модифікованого антитіла. Як необмежувальний приклад у наведеній нижче таблиці 2 показані можливості заміни, погодженої зі збереженням біологічної активності модифікованого антитіла. Зворотні заміни, звичайно, також можливі за тих самих умов. Таблиця 2 Вихідний залишок Ala (A) Arg (R) Заміна(и) Val, Gly, Pro Lys, His Gln Lin Glu Ser Asn Asp Ala Arg Leu Ile, Val, Met Arg Leu Tyr Ala Thr, CYS Ser Asn (N) Asp (D) CYS (C) Gln(Q) Glu (G) Gly (G) His (H) He (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser(S) Thr (T) 6 UA 108466 C2 Продовження таблиці 2 Trp(W) Tyr(Y) Val (V) 5 10 15 20 25 Tyr Phe, Trp Leu, Ala У даній заявці повинно бути зрозуміло, що винахід не стосується антитіл у природній формі, тобто, що вони не перебувають у їх природному середовищі, але що вони можуть бути виділені чи отримані шляхом очищення з природних джерел, або, крім того, отримані шляхом генетичної рекомбінації чи шляхом хімічного синтезу, і що вони внаслідок того можуть включати неприродні амінокислоти, як описано далі. Повинно бути також зрозуміло, як згадано вище, що винахід відноситься конкретніше до химерного та/або до гуманізованого бівалентного антитіла, або до будь-якого бівалентного функціонального фрагмента або похідного з антагоністичною активністю. Бівалентні антитіла з попереднього рівня техніки є агоністами або частковими агоністами. Моноклональне антитіло за винаходом, що включає модифіковану шарнірну область, як описано вище, тобто, яке включає шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 56, 57 або 21, є новим і відрізняється такою особливістю, що воно має покращену антагоністичну активність у порівнянні з химерним або гуманізованим антитілом 224G11 без такої модифікованої шарнірної області, як буде очевидно з наведених нижче прикладів. На противагу попередньому рівню техніки, автори винаходу отримали покращену антагоністичну активність без модифікації формату антитіла. Дійсно, на найближчому рівні техніки, представленому антитілом 5D5, було необхідно розробити моновалентний фрагмент антитіла, щоб отримати антагоністичну активність. У даній заявці за рахунок використання шарнірної області за винаходом можливо вперше отримати повнорозмірне бівалентне антитіло з підвищеною антагоністичною активністю, і це суперечить загальним знанням. У кращій формі здійснення антитіло за винаходом включає каркасну область, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID No. 22-28 і 58-72, або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No. 22-28 і 58-72. Для кращої ясності в наведених нижче таблицях 3 і 4 перегруповані амінокислотні послідовності та нуклеотидні послідовності різних кращих шарнірних областей за винаходом. Таблиця 3 SEQ ID SEQ ID Амінокислоти No. No. 22 RKCCVECPPCP 29 23 PRDCGCKPCICT 30 24 PKSCGCKPCICT 31 25 PKSCGCKPCICP 32 26 PRDCGCKPCPPCP 33 27 PRDCGCHTCPPCP 34 28 PKSCDCHCPPCP 35 Нуклеотиди AGGAAGTGCTGTGTGGAGTGCCCCCCCTGCCCA CCCCGGGACTGTGGGTGCAAGCCTTGCATTTGTACC CCCAAGAGCTGTGGGTGCAAGCCTTGCATTTGTACC CCAAAGAGCTGCGGCTGCAAGCCTTGTATCTGTCCC CCACGGGACTGTGGCTGCAAGCCCTGCCCTCCGTGTCCA CCCAGAGACTGTGGGTGTCACACCTGCCCTCCTTGTCCT CCCAAAAGCTGCGATTGCCACTGTCCTCCATGTCCA 30 Таблиця 4 SEQ ID No. 58 59 60 61 62 63 64 Амінокислоти CKSCDKTHTCPPCP PCSCDKTHTCPPCP PKCCDKTHTCPPCP PKSCCKTHTCPPCP PKSCDCTHTCPPCP PKSCDKCHTCPPCP PKSCDKTHCCPPCP SEQ ID No. 73 74 75 76 77 78 79 Нуклеотиди TGCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT CCCTGCAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT CCCAAGTGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT CCTAAGAGCTGTTGCAAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT CCCAAGAGCTGCGACTGCACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT CCCAAGAGCTGCGACAAGTGCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT CCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACTGCTGTCCCCCCTGCCCT 7 UA 108466 C2 Продовження таблиці 4 65 KCDKTHTCPPCP 66 PKSCDCHTCPPCP 67 PKSCDCTHCPPCP 68 PCSCKHTCPPCP 69 PSCCTHTCPPCP 70 PSCDKHCCPPCP 71 PKSCTCPPCP 72 PKSCDKCVECPPCP 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 80 81 82 83 84 85 86 87 AAGTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT CCCAAGAGCTGCGACTGCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT CCCAAGAGCTGCGACTGCACCCACTGCCCCCCCTGCCCT CCCTGCAGCTGCAAGCACACCTGTCCCCCCTGCCCT CCTAGCTGCTGCACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCT CCCAGCTGCGACAAGCACTGCTGCCCCCCCTGCCCT CCCAAGAGCTGCACCTGTCCCCCTTGTCCT CCCAAGAGCTGCGATAAGTGCGTGGAGTGCCCCCCTTGTCCT Відповідно до першого підходу, антитіло буде визначено послідовністю його важкого ланцюга. Конкретніше, антитіло за винаходом або кожен з його функціональних фрагментів чи похідних характеризується тим, що воно має важкий ланцюг, який включає щонайменше одну CDR, вибрану з CDR, що включає амінокислотні послідовності SEQ ID No. 1-3. Згадані послідовності наведені нижче: SEQ ID No. 1: GYIFTAYT SEQ ID No. 2: IKPNNGLA SEQ ID No. 3: ARSEITTEFDY Відповідно до кращого аспекту, антитіло за винаходом або кожен з його функціональних фрагментів чи похідних має важкий ланцюг, який включає щонайменше одну, краще дві, та ще краще три CDR, вибраних з CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, де: - CDR-H1 включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 1, - CDR-H2 включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 2, - CDR-H3 включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 3. При другому підході антитіло буде визначено послідовністю його легкого ланцюга. Конкретніше, відповідно до другого конкретного аспекту винаходу, антитіло за винаходом, або кожен з його функціональних фрагментів чи похідних характеризується тим, що воно має легкий ланцюг, який включає щонайменше одну CDR, вибрану з CDR, що включають амінокислотну послідовність SEQ ID No. 5-7. Згадані послідовності є такими: SEQ ID No. 5: ESVDSYANSF SEQ ID No. 6: RAS SEQ ID No. 7: QQSKEDPLT Відповідно до іншого кращого аспекту, антитіло за винаходом, або кожен з його функціональних фрагментів чи похідних має важкий ланцюг, який включає щонайменше один, краще два, та ще краще три CDR, вибраних з CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, де: - CDR-L1 включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 5, - CDR-L2 включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 6, - CDR-L3 включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 7. Гібридома миші, здатна секретувати моноклональні антитіла відповідно до даного винаходу, зокрема, гібридома мишачого походження, була депонована в CNCM (Інститут Пастера, Париж, Франція) 03/14/2007 за номером CNCM 1-3731. У даному винаході IgG1 є кращим для отримання ефекторних функцій, і найкраще АЗКЦ та КЗЦ. Фахівцеві в даній галузі техніки відомо, що ефекторні функції включають, наприклад, зв'язування Clq; комплементозалежну цитотоксичність (КЗЦ); зв'язування рецептора Fc; антитілозалежну клітинну цитотоксичність (ADCC); фагоцитоз; і знижувальну регуляцію рецепторів клітинної поверхні (наприклад, рецептора B-клітин; BCR). Антитіла відповідно до даного винаходу краще є специфічними моноклональними антитілами, зокрема, мишачого, химерного або гуманізованого походження, які можуть бути отримані відповідно до стандартних способів, добре відомих фахівцям у даній галузі техніки. Як правило, для отримання моноклональних антитіл або їх функціональних фрагментів чи похідних, зокрема, мишачого походження, можна зробити посилання на методи, які описані, зокрема, у керівництві "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988), або на метод отримання з гібридом, описаний Kohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975). Моноклональні антитіла за винаходом можуть бути отримані, наприклад, із тваринної клітини, імунізованої проти c-Met або одного з його фрагментів, які містять епітоп, специфічно 8 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розпізнаваний моноклональними антитілами відповідно до винаходу. c-Met, або один з його фрагментів можна, зокрема, продукувати відповідно до звичайних робочих способів, шляхом генетичної рекомбінації, починаючи з нуклеїново-кислотної послідовності, яка міститься у послідовності кДНК, що кодує c-Met, або шляхом пептидного синтезу, починаючи з послідовності амінокислот, що входить до пептидної послідовності c-Met. Моноклональні антитіла за винаходом можуть бути очищені, наприклад, на афінній колонці, на якій попередньо іммобілізований c-Met, або один з його фрагментів, що включає епітоп, специфічно розпізнаваний моноклональними антитілами за винаходом. Конкретніше, моноклональні антитіла можуть бути очищені за допомогою хроматографії на білку A та/або G, за якою проводять чи не проводять іонообмінну хроматографію з метою видалення залишкових білкових забруднень, а також ДНК і ЛПС, за якою проводять чи не проводять ексклюзійну хроматографію на гелі Сефароза™ з метою видалення потенційних агрегатів внаслідок присутності димерів або інших мультимерів. У ще кращому способі можна навіть використовувати всі ці методи одночасно або послідовно. Антитіло за винаходом, або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне краще є химерним антитілом. Під химерним антитілом мають на увазі вказівку на антитіло, що включає природну варіабельну область (легкого ланцюга та важкого ланцюга), яка походить від антитіла даного виду, у комбінації з константними областями важкого ланцюга та легкого ланцюга антитіла виду, гетерологічного по відношенню до даного виду (наприклад, миші, коня, кролика, собаки, корови, курки і т.д.). Антитіла або їх фрагменти химерного типу за винаходом можуть бути отримані шляхом використання методів генетичної рекомбінації. Наприклад, химерне антитіло можна продукувати шляхом клонування рекомбінантної ДНК, яка включає промотор і послідовність, що кодує варіабельну область виду, відмінного від людини, зокрема, миші, моноклональне антитіло за винаходом та послідовність, що кодує константну область антитіла людини. Химерне антитіло за винаходом, кодоване таким рекомбінантним геном, буде, наприклад, химерою миша-людина, де специфічність цього антитіла визначається варіабельною областю, що має походження від ДНК миші, а його ізотип визначається константною областю, що має походження від ДНК людини. Для способів отримання химерних антитіл можна, наприклад, послатися на документи Verhoeyn et al. (Bioessays, 8:74, 1988), Morrison et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6851-6855, 1984) або US 4816567. Конкретніше, антитіло або його функціональний фрагмент чи похідне включає химерний варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 46. SEQ ID No. 46: EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYIFTAYTMHWVRQSLGESLDWIGGIKPNNGLANYNQKFKGK ATLTVDKSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCARSEITTEFDYWGQGTALTVSS Конкретніше, антитіло або його функціональний фрагмент чи похідне включає химерний варіабельний домен легкого ланцюга послідовності, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 47. SEQ ID No. 47: DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSG SGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSKEDPLTFGSGTKLEMKR Конкретніше, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, називане [224G11] [IgG2chim], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 22. У даній заявці використання квадратних дужок не є необхідним, і, наприклад, посилання [224G11] [IgG2chim] має розглядатися як ідентичне 224G11IgG2chim. У такий же спосіб, щоб вказати, що антитіло є мишачим антитілом, можна додати вислів murine або літеру m; щоб вказати, що антитіло є химерним антитілом, можна додати вислів chim або літеру c; і, щоб вказати, що антитіло є гуманізованим антитілом, можна додати вислів hum, hz, Hz або літеру h. Наприклад, химерне антитіло 224G11gG2 може бути позначене як c224G11IgG2, c224G11[IgG2], c[224G11]IgG2, c[224G11][IgG2], 224G11IgG2chim, 224G11[IgG2chim], [224G11]IgG2chim або [224G11][IgG2chim]. В іншому аспекті краще антитіло за винаходом, або його бівалентний функціональний 9 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фрагмент чи похідне, назване [224G11] [TH7chim], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 28. У даній заявці посилання TH7 повинно розглядатися як ідентичне до C7Δ6-9 або TH7C7Δ69. Символ Δ означає делецію. В іншому аспекті краще антитіло за винаходом, або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне, назване [224G11] [MHchim], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 23. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [MUP9Hchim], включає варіабельний домен важкого ланцюга, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, яка включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 26. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [MMCHchim], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 24. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [C1], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 58. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [C2], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 59. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [C3], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 60. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [C5], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 61. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [C6], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 62. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [C7], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 63. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [C9], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 64. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [Δ1-3], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає 10 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотну послідовність SEQ ID No. 65. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [C7Δ6], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 66. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [C6Δ9], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 67. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [C2Δ5-7], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 68. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [C5Δ2-6], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 69. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [C9Δ2-7], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 70. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [Δ5-6-7-8], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 71. В іншому аспекті, краще антитіло або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне за винаходом, назване [224G11] [IgG1/IgG2], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 46, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 47, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 72. Антитіло за винаходом, або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне, краще є антитілом людини. Термін "антитіло людини" включає всі антитіла, які мають одну чи більш ніж одну варіабельну та константну область, що має походження від послідовностей імуноглобулінів людини. У кращій формі здійснення всі варіабельні та константні домени (або області) мають походження від послідовності імуноглобуліну людини (повнорозмірного антитіла людини). Іншими словами, воно включає будь-яке антитіло, яке має варіабельні та константні області (якщо вони присутні), що походять від імуноглобуліну зародкової лінії людини, тобто, які мають амінокислотну послідовність, що відповідає послідовності антитіла, продукованого людиною, та/або отримані з використанням будь-яких методів отримання антитіл людини, відомих фахівцеві в даній галузі техніки. В одній формі здійснення моноклональні антитіла людини отримують за допомогою гібридоми, яка включає B клітину, отриману від трансгенної тварини, що не є людиною, наприклад, трансгенної миші, яка має геном, що включає трансген важкого ланцюга та трансген легкого ланцюга людини, де B клітину зливають із іморталізованою клітиною. Як приклад такої трансгенної миші можна згадати XENOMOUSE™, яка є сконструйованою лінією миші, що включає великі фрагменти локусів імуноглобуліну людини та дефіцитна по продукуванню мишачих антитіл (Green at al., 1994, Nature Genetics, 7:13-21). Лінія XENOMOUSE™ продукує спектр, подібний до спектру дорослої людини, повнорозмірних антитіл і продукує антиген-специфічні моноклональні антитіла людини. Друге покоління лінії XENOMOUSE™ включає приблизно 80% спектра антитіл людини (Green & Jakobovits, 1998, J. Exp. Med., 188:483-495). Будь-який інший метод, відомий фахівцеві в даній галузі техніки, такий як метод фагового дисплея, можна також використовувати для створення антитіла людини за винаходом. 11 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антитіло за винаходом, або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне, краще є гуманізованим антитілом. Під висловом "гуманізоване антитіло" мають на увазі вказівку на антитіло, яке включає ділянки CDR, що мають походження від антитіла не-людського походження, де інші частини молекули антитіла мають походження від одного (або від декількох) антитіл людини. Крім того, деякі з залишків сегментів каркаса (називаних FR) можуть бути модифіковані з метою збереження спорідненості зв'язування (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988). Гуманізовані антитіла за винаходом або їх фрагменти можуть бути отримані методами, відомими фахівцеві в даній галузі техніки (такими як, наприклад, описані в документах Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; або Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992). Фахівцеві в даній галузі техніки відомий інший спосіб гуманізації, такий як, наприклад, спосіб "щеплення CDR", описаний Protein Design Lab (PDL) у заявках на патенти EP 0451261, EP 0682040, EP 09127, EP 0566647 або US 5530101, US 6180370, US 5585089 і US 5693761. Можна також згадати зазначені нижче заявки на патенти: US 5639641; US 6054297; US 5886152 і US 5877293. Конкретніше, антитіло або його функціональний фрагмент чи похідне включає гуманізованний варіабельний домен важкого ланцюга послідовності, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 4 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 4. SEQ ID No. 4: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQ GRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDYWGQGTLVTVSS Конкретніше, антитіло або його функціональний фрагмент чи похідне включає гуманізований варіабельний домен легкого ланцюга, вибраний із групи послідовностей, що включають амінокислотну послідовність SEQ ID No. 8, 9 або 10 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 8, 9 або 10. SEQ ID No. 8: DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFS GSGSRTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKR SEQ ID No. 9: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKR SEQ ID No. 10: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKR Конкретніше, краще антитіло за винаходом, або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне, називане [224G11] [IgG2Hz1], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 4, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 8, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 22. В іншому аспекті краще антитіло за винаходом, або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне, називане [224G11] [IgG2Hz2], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 4, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 9, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 22. В іншому аспекті краще антитіло за винаходом, або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне, називане [224G11] [IgG2Hz3], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 4, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 10, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 22. В іншому аспекті краще антитіло за винаходом, або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне, називане [224G11] [TH7Hz1], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 4, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 8, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 28. В іншому аспекті краще антитіло за винаходом, або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне, називане [224G11] [TH7z2], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 4, варіабельний домен легкого 12 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 4550 55 60 ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 9, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 28. В іншому аспекті краще антитіло за винаходом, або його бівалентний функціональний фрагмент чи похідне, називане [224G11] [TH7Hz3], включає варіабельний домен важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 4, варіабельний домен легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 10, і шарнірну область, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 28. В іншому аспекті антитіла за винаходом можуть бути описані, базуючись на їх сумарних важких і легких ланцюгах, відповідно. Як приклад, антитіло [224G11] [IgG2chim] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 50 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 50, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [TH7chim] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 51 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 51, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [C1] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 88 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 88, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [C2] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 89 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 89, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [C3] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 90 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 90, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [C5] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 91 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 91, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [C6] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 92 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 92, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [C7] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 93 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 93, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [C9] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 94 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 13 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 94, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ IDNo. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [Δ1-3] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 95 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 95, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [C7Δ6] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 96 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 96, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [C6Δ9] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 97 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 97, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [C2Δ5-7] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 98 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 98, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [C5Δ2-6] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 99 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 99, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [C9Δ2-7] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 100 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 100, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [Δ5-6-7-8] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 101 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 101, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [IgG1/IgG2] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 102 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 102, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 52 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 52. Як інший приклад, антитіло [224G11] [IgG2Hz1] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 36 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 36, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 38 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 38. Як інший приклад, антитіло [224G11] [IgG2Hz2] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 36 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID 14 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 No. 36, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 39 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 39. Як інший приклад, антитіло [224G11] [IgG2Hz3] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 36 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 36, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 40 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 40. Як інший приклад, антитіло [224G11] [TH7Hz1] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 37 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 37, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 38 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 38. Як інший приклад, антитіло [224G11] [TH7Hz2] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 37 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 37, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 39 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 39. Як інший приклад, антитіло [224G11] [TH7Hz3] за винаходом включає повнорозмірний важкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 37 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 37, і повнорозмірний легкий ланцюг, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 40 або послідовність, що має щонайменше 80% ідентичність після оптимального вирівнювання з послідовністю SEQ ID No. 40. Інші приклади антитіл за винаходом, або їх похідних, включають повнорозмірні важкі ланцюги, що включають амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID No. 88-102 (відповідними нуклеотидними послідовностями є SEQ ID No. 103-117). Під "функціональним фрагментом" антитіла за винаходом мають на увазі, зокрема, фрагмент антитіла, такий як фрагменти або діатіла Fv, scFv (sc позначає один ланцюг), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc, або будь-який фрагмент, час напіввиведення якого був би збільшений в результаті хімічної модифікації, такої як приєднання полі(алкілен)гліколю, такого як полі(етилен)гліколь ("ПЕГилювання") (ПЕГильовані фрагменти, називані Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG або Fab'-PEG) ("PEG" означає полі(етилен)гліколь), або в результаті включення в ліпосому, де ці фрагменти мають щонайменше один з характеристичних CDR послідовності SEQ ID No. 1-3 та 5-7 за винаходом, і, зокрема, здатні в цілому виявляти навіть часткову активність антитіла, від якого вони отримані, таку як, зокрема, здатність розпізнавати та зв'язувати c-Met, і, якщо необхідно, інгібувати активність c-Met. Краще, якщо ці функціональні фрагменти будуть складатися із часткової послідовності, або включати часткову послідовність варіабельної області важкого або легкого ланцюга антитіла, з якого вони утворені, де ця часткова послідовність достатня для збереження тієї ж специфічності зв'язування, що й у антитіла, з якого вона утворена, і достатньої спорідненості, яка краще дорівнює щонайменше 1/100, ще краще - щонайменше 1/10, від спорідненості антитіла, з якого вона утворена, по відношенню до c-Met. Такий функціональний фрагмент буде включати як мінімум 5 амінокислот, краще 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 50 і 100 послідовних амінокислот послідовності антитіла, з якого вона походить. Краще, якщо ці функціональні фрагменти будуть фрагментами типу Fv, scFv, Fab, F(ab') 2, F(ab'), scFv-Fc або діатілами, які, як правило, мають ту ж специфічність зв'язування, що й антитіло, з якого вони утворені. У ще кращій формі здійснення винаходу ці фрагменти вибрані з бівалентних фрагментів, таких як фрагменти F(ab')2. Згідно до даного винаходу, фрагменти антитіл за винаходом можуть бути отримані, починаючи з антитіл, таких як описано вище, способами, такими як розщеплення ферментами, такими як пепсин або папаїн, та/або розщеплення дисульфідних містків шляхом хімічного відновлення. Іншим способом фрагменти антитіл, включені в даний винахід, можуть бути отримані методами генетичної рекомбінації, такими як відомі фахівцям у даній галузі техніки, або, крім того, шляхом пептидного синтезу за допомогою, наприклад, автоматичних синтезаторів пептидів, таких як ті, що поставляються фірмою Applied Biosystems тощо. Під "бівалентним фрагментом" повинні матися на увазі будь-які фрагменти антитіл, що 15 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включають два плеча, і конкретніше фрагменти F(ab')2. Під "похідними" антитіла за винаходом мають на увазі зв’язувальний білок, що включає білковий каркас і щонайменше одну з CDR, вибрану з вихідного антитіла, з метою збереження зв’язувальної здатності. Такі сполуки добре відомі фахівцям у даній галузі техніки, та докладніше описані в подальшому описі. Конкретніше, антитіло або один з його функціональних фрагментів чи похідних за винаходом характеризується тим, що це похідне складається зі зв’язувального білка, що включає каркас, до якого прищеплена щонайменше одна CDR для збереження властивостей паратопного розпізнавання вихідного антитіла. Одна або кілька послідовностей з усіх 6 послідовностей CDR, описаних у винаході, може бути представлена на білковому каркасі. У цьому випадку білковий каркас відтворює білкову структуру з відповідним укладанням прищепленої (прищеплених) CDR, таким чином, дозволяючи їй (або їм) зберігати їх властивості паратопного розпізнавання антигену. Фахівцеві в даній галузі техніки відомо, як вибрати білковий каркас, до якого може бути прищеплена щонайменше одна CDR, вибрана з вихідного антитіла. Конкретніше, відомо, що такий каркас для вибору повинен мати кілька ознак, що описані нижче (Skerra A., J. Mol. Recogn., 13, 2000, 167-187): - гарну філогенетичну консервативність, - міцну структуру з добре відомою тривимірною молекулярною організацією (наприклад, на основі кристалографії або ЯМР), - малий розмір, - відсутність або тільки низький рівень посттрансляційних модифікацій, - простоту продукування, експресії та очищення. Такий білковий каркас може, без обмеження, бути структурою, вибраною з групи, що складається з фібронектину, краще - десятого домену фібронектину типу III (Fnfn10), ліпокаліну, антикаліну (Skerra A., J. Biotechnol, 2001, 74(4):257-75), похідного білка Z з домену B стафілококкового білка A, тіоредоксину A або будь-якого білка з повторюваним доменом, таким як "анкіриновий повтор" (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No.4, 1700-1705), "повтор армаділо", "лейцин-багатий повтор" або "тетратрікопептидний повтор". Можна також згадати каркасне похідне від токсинів (таких як, наприклад, токсини скорпіонів, комах, рослин або молюсків) або білкових інгібіторів нейрональної синтази оксиду азоту (PIN). Як не обмежувальний приклад таких гібридних конструкцій можна згадати інсерцію CDR-H1 (важкого ланцюга) антитіла анти-CD4, тобто антитіла 13B8.2, в одну з доступних петель PIN. Зв’язувальні властивості отриманого зв’язувального білка залишаються подібними до вихідного антитіла (Bes et al., BBRC 343, 2006, 334-344). Можна також згадати прищеплення CDR-H3 (важкого ланцюга) антитіла VHH проти лізоциму на петлю неокарциностатіну (Nicaise et al., 2004). Як згадано вище, такий білковий каркас може включати від 1 до 6 CDR з вихідного антитіла. У кращій формі здійснення, але без будь-якого обмеження, фахівець у даній галузі техніки вибере щонайменше одну CDR з важкого ланцюга, де відомо, що цей важкий ланцюг особливо задіяний у специфічності антитіла. Вибір CDR, що становить інтерес, відомим способом очевидний фахівцеві в даній галузі техніки (BES et al., FEBS letters 508, 2001, 67-74). Очевидно, що ці приклади не є обмежувальними, і будь-який інший каркас, відомий або описаний, повинен бути включений до даного опису. Згідно з новим аспектом, даний винахід стосується ізольованої нуклеїнової кислоти, яка характеризується тим, що вона вибрана з нижченаведених нуклеїнових кислот: a) нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, що кодує антитіло або один з його функціональних фрагментів чи похідних за винаходом; b) нуклеїново-кислотної послідовності, що включає послідовності SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13 і послідовності SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16 і SEQ ID No. 17; c) нуклеїново-кислотної послідовності, що включає послідовності SEQ ID No. 14 і SEQ ID No. 18, 19 або 20; d) відповідних РНК-нуклеїнових кислот з нуклеїнових кислот, визначених в b) або c); e) нуклеїнових кислот, комплементарних нуклеїновим кислотам, визначеним в a), b) та c); і f) нуклеїнової кислоти щонайменше з 18 нуклеотидів, здатної до гібридизації в умовах високої жорсткості щонайменше з однією з CDR послідовності SEQ ID No. 11-13 і 15-17. Відповідно до ще одного іншого аспекту, даний винахід стосується ізольованої нуклеїнової кислоти, яка характеризується тим, що вона вибрана з нижченаведених нуклеїнових кислот: - нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, що кодує антитіло або один з його функціональних фрагментів чи похідних відповідно до даного винаходу, де нуклеїнова послідовність, що кодує 16 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 каркасну область даного антитіла, включає або має послідовність, вибрану з групи, що складається з послідовностей SEQ ID No. 29-35 і SEQ ID No. 73-87. Під нуклеїновою кислотою, нуклеїновою або нуклеїново-кислотною послідовністю, полінуклеотидом, олігонуклеотидом, полінуклеотидною послідовністю, нуклеотидною послідовністю, термінами, що будуть використовуватися в даному винаході рівнозначно, мають на увазі вказівку на точний зв'язок нуклеотидів, які є модифікованими або немодифікованими, що дозволяє визначити фрагмент або ділянку нуклеїнової кислоти, яка включає або не включає неприродні нуклеотиди, і здатну відповідати як двонитковій ДНК, так і однонитковій ДНК, а також продуктам транскрипції цих ДНК. У даній заявці також повинно бути зрозуміло, що даний винахід не стосується нуклеотидних послідовностей в їх природному хромосомному оточенні, тобто в природному стані. Він стосується послідовностей, які ізольовані та/або очищені, тобто вони вибрані прямо або опосередковано, наприклад, шляхом копіювання, з їх оточення, будучи щонайменше частково модифікованими. Таким чином, вони призначені в даній заявці для вказівки на ізольовані нуклеїнові кислоти, отримані шляхом генетичної рекомбінації за допомогою, наприклад, клітинхазяїв, або отримані шляхом хімічного синтезу. Гібридизація в умовах високої жорсткості означає, що температурні умови та умови іонної сили вибрані таким чином, що дають можливість підтримувати гібридизацію між двома фрагментами комплементарної ДНК. Для ілюстрації, умови високої жорсткості стадії гібридизації з метою визначення полінуклеотидних фрагментів, описаних вище, краще є такими, як описано нижче. Гібридизацію ДНК-ДНК або ДНК-РНК здійснюють у дві стадії: (1) прегібридизація при 42 °C протягом 3 годин у фосфатному буфері (20 мМ, pH 7,5), що містить 5×SSC (1×SSC відповідає розчину 0,15 M NaСl + 0,015 M цитрату натрію), 50% формаміду, 7% додецилсульфату натрію (ДСН), 10× розчин Денхардта, 5% декстрансульфату та 1% ДНК сперми лосося; (2) власне гібридизація протягом 20 годин при температурі залежно від розміру зонда (тобто: 42 °C для розміру зонда >100 нуклеотидів) з подальшими 2 відмиваннями по 20 хвилин при 20 °C в 2× SSC + 2% ДСН, 1 відмиванням протягом 20 хвилин при 20 °C в 0,1× SSC + 0,1% ДСН. Останнє відмивання проводять в 0,1× SSC + 0,1% ДСН протягом 30 хвилин при 60 °C для розміру зонда >100 нуклеотидів. Умови гібридизації високої жорсткості, описані вище для полінуклеотиду визначеного розміру, можуть бути адаптовані фахівцем у даній галузі техніки для олігонуклеотидів більшого або меншого розміру, відповідно до теорії Sambrook et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor). Подібним чином, винахід стосується вектора, що включає нуклеїнову кислоту за даним винаходом. Винахід спрямований, зокрема, на клонуючі та/або експресійні вектори, які включають нуклеотидну послідовність за винаходом. Вектори за винаходом краще включають елементи, які дають можливість експресії та/або секреції трансльованих нуклеотидних послідовностей у визначеній клітині-хазяїні. Вектор повинен, таким чином, включати промотор, сигнали ініціації та термінації трансляції, а також відповідні ділянки регуляції транскрипції. Він повинен мати здатність стабільно підтримуватися в клітині-хазяїні та може необов'язково мати конкретні сигнали, які позначають секрецію трансльованого білка. Ці різні елементи вибирає та оптимізує фахівець у даній галузі техніки залежно від використовуваної клітини-хазяїна. З цією метою нуклеотидні послідовності за винаходом можуть бути вбудовані в автономно репліковані вектори у вибраному хазяїні, або бути інтегративними векторами вибраного хазяїна. Такі вектори отримують способами, використовуваними на цей час фахівцями в даній галузі техніки, і отримані в результаті клони можна вводити до відповідного хазяїна стандартними способами, такими як ліпофекція, електропорація, термошок або хімічні методи. Вектори за винаходом є, наприклад, векторами плазмідного або вірусного походження. Вони корисні для трансформації клітин-хазяїв з метою клонування або експресії нуклеотидних послідовностей за винаходом. Винахід, таким чином, включає клітини-хазяєва, трансформовані вектором за винаходом або таким, що містять його. Клітина-хазяїн може бути вибрана з прокаріотичних або еукаріотичних систем, наприклад, бактеріальних клітин, але також із дріжджових клітин або тваринних клітин, зокрема, клітин ссавців. У подібний спосіб можна використовувати клітини комах або клітини рослин. Винахід, таким чином, стосується тварин, за винятком людини, які містять щонайменше одну клітину, трансформовану за винаходом. Згідно з іншим аспектом, об'єктом винаходу є спосіб отримання антитіла або одного з його 17 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 функціональних фрагментів за винаходом, який характеризується тим, що він включає наведені нижче стадії: a) культивування у середовищі та у відповідних умовах культивування клітини-хазяїна за винаходом; і b) виділення антитіл або одного з їх функціональних фрагментів, продукованих таким шляхом, починаючи з культурального середовища або культивованих клітин. Клітини, трансформовані за винаходом, можна використовувати в способах отримання рекомбінантних поліпептидів за винаходом. Самі способи отримання поліпептиду за винаходом в рекомбінантній формі, які характеризуються тим, що вони використовують вектор та/або клітину, трансформовану вектором за винаходом, включені в даний винахід. Краще, коли клітину, трансформовану вектором за винаходом, культивують в умовах, що дають можливість експресії цього поліпептиду, і виділяють рекомбінантний пептид. Як зазначено, клітина-хазяїн може бути вибрана з прокаріотичних або еукаріотичних систем. Зокрема, можна ідентифікувати нуклеотидні послідовності за винаходом, що сприяють секреції в такій прокаріотичній або еукаріотичній системі. Вектор за винаходом, що несе таку послідовність, можна, отже, краще використовувати для продукування рекомбінантних білків, призначених для секреції. В результаті очищення цих рекомбінантних білків, що становлять інтерес, буде полегшене завдяки тому факту, що вони присутні в супернатанті клітинної культури ймовірніше, ніж усередині клітин-хазяїв. У подібний спосіб можна отримати поліпептиди за винаходом шляхом хімічного синтезу. Такий спосіб отримання також є об'єктом винаходу. Фахівцеві в даній галузі техніки відомі способи хімічного синтезу, наприклад, методи, у яких використовують тверді фази [Steward et al., 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed., (1984)], або методи, що використовують часткові тверді фази, шляхом конденсації фрагментів або шляхом класичного синтезу в розчині. Поліпептиди, отримані шляхом хімічного синтезу та здатні включати відповідні неприродні амінокислоти, також включені у винахід. Антитіла, або один з їх функціональних фрагментів чи похідних, які можуть бути отримані способом за винаходом, також включені в даний винахід. Винахід також стосується антитіла за винаходом як ліків. Винахід також стосується фармацевтичної композиції, що включає як активну речовину сполуку, що складається з антитіла або одного з його функціональних фрагментів за винаходом, краще змішану з ексципієнтом та/або фармацевтично прийнятним носієм. Іншою додатковою формою здійснення винаходу є композиція, як описано вище, яка включає, крім того, у вигляді комбінованого препарату для одночасного, окремого або послідовного застосування, протипухлинне антитіло. У найкращому випадку, друге протипухлинне антитіло може бути вибране з антитіл проти IGF-IR, проти EGFR, проти HER2/neu, проти VEGFR, проти VEGF і т.д., або з будь-яких інших протипухлинних антитіл, відомих фахівцеві в даній галузі техніки. Очевидно, що застосування як другого антитіла функціональних фрагментів чи похідних вищезгаданих антитіл є частиною винаходу. Як найкраще антитіло, вибрані антитіла проти EGFR, такі як, наприклад, антитіло C225 (Ербітукс). "Одночасне застосування" розуміють як таке, що означає введення двох сполук композиції за винаходом в одній або в ідентичній фармацевтичній формі. "Окреме застосування" розуміють як таке, що означає введення одночасно двох сполук композиції за винаходом в окремих фармацевтичних формах. "Послідовне застосування" розуміють як таке, що означає послідовне введення двох сполук композиції за винаходом, кожне в окремій фармацевтичній формі. Як правило, композиція за винаходом значно підвищує ефективність лікування раку. Іншими словами, терапевтичний ефект антитіл проти c-Met за винаходом несподівано потенціюється введенням цитотоксичного агента. Інша основна наступна перевага, яку дає композиція за винаходом, стосується можливості застосування нижчих ефективних доз активної речовини, що дозволяє уникнути або зменшити ризик виникнення вторинних ефектів, зокрема, ефектів цитотоксичного агента. Крім того, дана композиція за винаходом дала б можливість отримати бажаний терапевтичний ефект швидше. Композиція за винаходом може також характеризуватися тим, що вона включає, крім того, у вигляді комбінованого препарату для одночасного, окремого або послідовного застосування цитотоксичний/цитостатичний агент. Під "протираковими терапевтичними агентами" або "цитотоксичними/цитостатичними 18 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 агентами" мають на увазі речовину, яка при введенні суб'єктові лікує або попереджає розвиток раку в організмі суб'єкта. Як необмежувальний приклад таких агентів, можна згадати алкілувальні агенти, антиметаболіти, протипухлинні антибіотики, мітотичні інгібітори, інгібітори функції хроматину, антиангіогенні агенти, антиестрогени, антиандрогени або імуномодулятори. Такі агенти, наприклад, зазначені в 2001 виданні VIDAL на сторінці, присвяченій сполукам, що відносяться до колонки канцерології та гематології "Цитотоксичні агенти", де ці цитотоксичні сполуки, вказані з посиланням на цей документ, зазначені в даній заявці як кращі цитотоксичні агенти. Конкретніше, наведені нижче агенти є кращими відповідно до винаходу. "Алкілювальний агент" стосується будь-якої речовини, яка може зшивати або алкілувати будь-яку молекулу, краще нуклеїнову кислоту (наприклад, ДНК), усередині клітини. Приклади алкілувальних агентів включають азотистий іприт, такий як меклоретамін, хлорамбукол, мелфален, хлоридрат, піпобромен, преднімустин, динатрію фосфат або естрамустин; оксазофорини, такі як циклофосфамід, алтретамін, трофосфамід, сульфофосфамід або іфосфамід; азиридини або імінетилени, такі як тіотепа, триетиленамін або алтретамін; нітрозосечовини, такі як кармустин, стрептозоцин, фотемустин або ломустин; алкілсульфонати, такі як бусульфан, треосульфан або імпросульфан; триазени, такі як дакарбазин; або комплекси платини, такі як цисплатин, оксаліплатин і карбоплатин. "Антиметаболіти" відносяться до речовин, які блокують клітинний ріст та/або метаболізм за допомогою втручання в деякі активності, звичайно, в синтез ДНК. Приклади антиметаболітів включають метотрексат, 5-фторурацил, флоксуридин, 5-фтордезоксиуридин, капецитабін, цитарабін, флударабін, цитозин арабінозид, 6-меркаптопурин (6-MP), 6-тіогуанін (6-TG), хлордезоксиаденозин, 5-азацитидин, гемцитабін, кладрибін, дезоксикоформіцин та пентостатин. "Протипухлинні антибіотики" відносяться до сполук, що можуть попереджати або інгібувати синтез ДНК, РНК та/або білка. Приклади протипухлинних антибіотиків включають доксорубіцин, даунорубіцин, ідарубіцин, валрубіцин, мітоксантрон, дактиноміцин, мітраміцин, плікаміцин, мітоміцин C, блеоміцин і прокарбазин. "Мітотичні інгібітори" запобігають нормальному проходженню клітинного циклу та мітозу. Як правило, інгібітори мікротрубочок або таксоїди, такі як паклітаксел і доцетаксел, здатні інгібувати мітоз. Вінка-алкалоїди, такі як вінбластин, вінкристин, віндезин і вінорельбін, також здатні інгібувати мітоз. "Інгібітори функції хроматину" або "інгібітори топоізомераз" відносяться до речовин, які інгібують нормальну функцію білків моделювання хроматину, таких як топоізомераза I або топоізомераза II. Приклади інгібіторів функції хроматину включають для топоізомерази I камптотецин та його похідні, такі як топотекан або іринотекан, і для топоізомерази II етопозид, етопозид фосфат і теніпозид. "Антиангіогенний агент" стосується будь-яких ліків, сполуки, речовини або агента, що інгібують ріст кровоносних судин. Приклади антиангіогенних агентів включають, але жодним чином не обмежуючись ними, разоксин, маримастат, батимастат, приномастат, таномастат, іломастат, CGS-27023A, галофунгінон, COL-3, неовастат, BMS-275291, талідомід, CDC 501, DMXAA, L-651582, скваламін, ендостатин, SU5416, SU6668, інтерферон-альфа, EMD121974, інтерлейкін-12, IM862, ангіостатин і вітаксин. "Антиестроген" або "антиестрогенний агент" стосується будь-якої речовини, яка знижує, антагонізує або інгібує дію естрогену. Прикладами антиестрогенних агентів є тамоксифен, тореміфен, ралоксифен, дролоксифен, йодоксифен, анастрозол, летрозол і екземестан. "Антиандрогени" або "антиандрогенні агенти" відносяться до будь-якої речовини, яка знижує, антагонізує або інгібує дію андрогену. Прикладами антиандрогенів є флутамід, нілутамід, бікалутамід, спіронолактон, ципротерон ацетат, фінастерид та цимітидин. "Імуномодулятори" є речовинами, які стимулюють імунну систему. Приклади імуномодуляторів включають інтерферон, інтерлейкін, такий як альдеслейкін, OCT-43, дерилейкін дифлітокс та інтерлейкін-2, фактори некрозу пухлини, такі як тазонермін, або інші імуномодулятори, такі як лентинан, сизофіран, роквінімекс, підотимод, пегадемазу, тимопентин, полі I:C або левамізол у комбінації з 5-фторурацилом. Для додаткових подробиць фахівець у даній галузі техніки може послатися на посібник, виданий "Association Francaise des Enseignants de Chimie Therapeutique" та озаглавлений "Traite de chimie therapeutique", т. 6, Medicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, видавництво TEC & DOC, 2003. Як хімічні агенти або цитотоксичні агенти, можна також згадати всі інгібітори кіназ, такі як, наприклад, гефітиніб або ерлотиніб. 19 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В особливо кращій формі здійснення композиція у вигляді комбінованого препарату за винаходом характеризується тим, що цитотоксичний агент поєднують хімічним шляхом з антитілом для одночасного застосування. Щоб сприяти зв’язуванню цитотоксичного агента і антитіла за винаходом, зокрема, можна ввести спейсерні молекули між двома сполуками, які потрібно піддавати зв’язуванню, такі як полі(алкілен)гліколі, такі як поліетиленгліколь, або, крім того, амінокислоти, або в іншій формі здійснення використовувати активні похідні цитотоксичних агентів, до яких були б введені функціональні групи, здатні взаємодіяти з антитілом за винаходом. Ці методи комбінації добре відомі фахівцям у даній галузі техніки і не будуть широко описані в даному описі. Винахід відноситься, в іншому аспекті, до композиції, яка характеризується тим, що щонайменше одне з антитіл, або один з їх функціональних фрагментів чи похідних кон’югують із клітинним токсином та/або з радіоактивним елементом. Краще, якщо токсин або радіоактивний елемент є здатним до інгібування щонайменше однієї клітинної активності клітин, що експресують c-Met, ще краще - здатний запобігати росту або проліферації цієї клітини, зокрема, до повної інактивації цієї клітини. Також краще, якщо токсин є ентеробактеріальним токсином, зокрема, екзотоксином A. pseudomonas. Радіоактивні елементи (або радіоізотопи), краще, кон’юговані з антитілами, застосовуваними для терапії, є радіоізотопами, що випромінюють гамма-промені, краще, 131 90 199 100 67 217 211 такими як йод , ітрій , золото , паладій , мідь , вісмут і сурма . Радіоізотопи, які випускають бета- і альфа-проміння, можна також використовувати для терапії. Під токсином або радіоактивним елементом, кон’югованим щонайменше з одним антитілом за винаходом, або з одним з його функціональних фрагментів, мають на увазі будь-які засоби, що дають можливість токсину або радіоактивному елементу зв'язатися щонайменше з одним антитілом, зокрема, за допомогою ковалентної комбінації між двома сполуками, із введенням або без введення лінкерної молекули. З агентів, що дають можливість хімічного (ковалентного), електростатичного або нековалентного зв'язування всіх або частини компонентів кон’югату можна, зокрема, згадати бензохінон, карбодіїмід, і конкретніше ЕДК (1-етил-3-[3-диметиламінопропіл]-карбодіїміду гідрохлорид), дималеімід, дитіобіс-нітробензойну кислоту (ДТНВ), N-сукцинімідил-Sацетилтіоацетат (САТА), агенти, що утворюють місточковий зв'язок, які мають одну чи декілька фенілазидних груп, взаємодіючих з ультрафіолетовим світлом (УФ), і краще N-[-4(азидосаліциламіно)бутил]-3'-(2'-піридилдитіо)пропіонамід (АПДП), N-сукцинімідил-3-(2піридилдитіо)пропіонат (СПДП), 6-гідразинонікотинамід (HYNIC). Іншою формою сполучення, особливо для радіоактивних елементів, може бути використання біфункціонального іонного хелатуючого агента. З цих хелатуючих агентів можливо згадати хелатуючі агенти, утворені з ЕДТА (етилендіамінтетраоцтової кислоти) або з ДТПА (діетилентриамінпентаоцтової кислоти), які розроблені для зв'язування металів, зокрема, радіоактивних металів, та імуноглобулінів. Так, ДПТА та її похідні можуть бути заміщені різними групами на вуглецевому ланцюзі з метою підвищення стабільності та міцності комплексу ліганд-метал (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991); патент США 4831175). Наприклад, діетилентриамінпентаоцтова кислота (ДТПА) та її похідні, що широко використовувалися в медицині та у біології протягом тривалого часу або в їх вільній формі, або у формі комплексу з іоном металу, мають примітну характерну властивість утворення стабільних хелатів з іонами металів та можливості зв’язування з білками, що становлять терапевтичний або діагностичний інтерес, такими як антитіла, для розроблення радіоімунокон’югатів у терапії раку (Meases et al., 1984; Gansow et al., 1990). Також краще, якщо щонайменше одне антитіло, що утворює кон’югат за винаходом, вибране з його функціональних фрагментів, зокрема, фрагментів, скорочених по їх Fc компоненту, таких як фрагменти scFv. Як вже було згадано, у кращій формі здійснення винаходу цитотоксичний/цитостатичний агент токсину та/або радіоактивного елемента піддають сполученню хімічним шляхом щонайменше з одним з елементів композиції для одночасного застосування. Даний винахід включає описану композицію як ліки. Даний винахід, крім того, включає застосування композиції за винаходом для отримання ліків. В іншому аспекті винахід стосується застосування антитіла, або одного з його функціональних фрагментів чи похідних та/або композиції, як описано вище, для отримання ліків, призначених для інгібування росту та/або проліферації пухлинних клітин. 20 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Інший аспект винаходу полягає в застосуванні антитіла, або одного з його функціональних фрагментів чи похідних та/або композиції, як описано вище, або у вищезгаданому застосуванні, для отримання ліків, призначених для попередження або для лікування раку. До даного винаходу також включений спосіб, призначений для інгібування росту та/або проліферації пухлинних клітин у пацієнта, що включає введення пацієнтові, який потребує цього, антитіла або одного з його функціональних фрагментів чи похідних за винаходом, антитіла, продукованого гібридомою за винаходом, або композиції за винаходом. Даний винахід, крім того, включає спосіб попередження або лікування раку у пацієнта, який потребує цього, що включає введення пацієнтові антитіла або одного з його функціональних фрагментів чи похідних за винаходом, антитіла, продукованого гібридомою за винаходом, або композиції за винаходом. В особливо кращому аспекті рак є раком, вибраним з раку простати, остеосаркоми, раку легені, раку молочної залози, раку ендометрія, гліобластоми або раку ободової кишки. Як пояснено вище, перевага винаходу полягає в тому, що він дає можливість лікування HGF-залежних і незалежних раків, пов'язаних з активацією Met. Винахід, ще в одному іншому аспекті, охоплює спосіб діагностики in vitro захворювання, індукованого гіперекспресією або зниженою експресією рецептора c-Met, починаючи з біологічного зразка, у якому підозрюють аномальну присутність рецептора c-Met, де цей спосіб характеризується тим, що він включає стадію, на якій біологічний зразок приводять у контакт із антитілом за винаходом, де для даного антитіла існує можливість, якщо необхідно, мічення. Краще, коли захворювання, пов'язані з аномальною присутністю рецептора c-Met при даному способі діагностики, є раками. Антитіло або один з його функціональних фрагментів може бути присутнім у формі імунокон’югату або міченого антитіла, так щоб отримати сигнал, який можна спостерігати, та/або який є кількісно визначуваним. Антитіла, мічені за винаходом, або їх функціональні фрагменти включають, наприклад, антитіла, називані імунокон’югатами, які можуть бути кон’юговані, наприклад, з ферментами, такими як пероксидаза, лужна фосфатаза, бета-D-галактозидаза, глюкозооксидаза, глюкозоамілаза, карбонова ангідраза, ацетилхолінестераза, лізоцим, малатдегідрогеназа або глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа, або з молекулою, такою як біотин, дигоксигенін або 5бромдезоксиуридин. Флуоресцентні мітки можна у подібний спосіб кон’югувати із антитілами або з їх функціональними фрагментами за винаходом, і вони, зокрема, включають флуоресцеїн та його похідні, флуорохром, родамін та його похідні, GFP (GFP означає "зелений флуоресцентний білок"), дансил, умбеліферон і т.д. У таких кон’югатах антитіла за винаходом, або їх функціональні фрагменти можуть бути отримані способами, відомими фахівцям у даній галузі техніки. Їх можна піддавати сполученню з ферментами або з флуоресцентними мітками безпосередньо, або за допомогою спейсерної групи або зв’язувальної групи, наприклад, поліальдегіду, такого як глутаральдегід, етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА), діетилентриамінпентаоцтової кислоти (ДПТА), або у присутності агентів сполучення, таких як згадані вище для терапевтичних кон’югатів. Кон’югати, що включають мітки флуоресцеїнового типу, можуть бути отримані шляхом взаємодії з ізотіоціанатом. Інші кон’югати можуть, у подібний спосіб, включати хемілюмінесцентні мітки, такі як люмінол і діоксетани, біолюмінесцентні мітки, такі як люцифераза та люциферин, або, крім того, 123 125 126 133 77 99m 111 113m радіоактивні мітки, такі як йод , йод , йод , йод , бром , технецій , індій , індій , 67 68 95 97 103 105 107 203 99m 101 галій , галій , рутеній , рутеній , рутеній , рутеній , ртуть , ртуть , реній , реній , 105 47 121m 122m 125m 165 167 168 18 199 реній , скандій , телур , телур , телур , тулій , тулій , тулій , фтор , ітрій , 131 йод . Способи, відомі фахівцям у даній галузі техніки, що існують для сполучення терапевтичних радіоактивних ізотопів з антитілами, безпосередньо або за допомогою хелатуючого агента, такого як ЕДТА, ДТПА, згадані вище, можна використовувати для радіоактивних елементів, що можна застосовувати при діагностиці. У подібний спосіб, можа 125 згадати мічення Na[I ] методом хлораміну T [Hunter W.M. and Greenwood F.C. (1962) Nature 99m 194:495] або, крім того, технецієм методом Crockford et al. (патент США 4424200) або приєднаним через ДТПА, як описано Hnatowich (патент США 4479930). Таким чином, антитіло або його функціональний фрагмент чи похідне за винаходом можна застосовувати в способі виявлення та/або кількісного визначення гіперекспресії, або зниженої експресії, краще гіперекспресії, рецептора c-Met у біологічному зразку, який характеризується тим, що він включає наведені нижче стадії: a) приведення біологічного зразка в контакт із антитілом або його функціональним фрагментом чи похідним за винаходом; і b) демонстрація можливо утворюваного комплексу c-Met/антитіло. 21 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У конкретній формі здійснення антитіло, або його функціональний фрагмент чи похідне за винаходом можна застосовувати в способі виявлення та/або кількісного визначення рецептора c-Met у біологічному зразку для моніторингу ефективності профілактичного та/або терапевтичного лікування c-Met-залежного раку. Більш узагальнено, антитіло або його функціональний фрагмент чи похідне за винаходом можна у кращому випадку застосовувати в будь-якій ситуації, де експресію рецептора c-Met необхідно спостерігати якісно та/або кількісно. Краще, коли біологічний зразок утворений біологічною рідиною, такою як сироватка, цільна кров, клітини, зразок тканини або біопсія людського походження. Будь-яку методику або загальноприйнятий тест можна використовувати з метою проведення такого виявлення та/або дозування. Цей тест може бути конкурентним, або сендвіч-тестом, або будь-яким тестом, відомим фахівцеві в даній галузі техніки, залежно від утворення імунного комплексу типу антитіло-антиген. Згідно із застосуванням за винаходом, антитіло або його функціональний фрагмент чи похідне може бути іммобілізованим або міченим. Цю іммобілізацію можна здійснювати на різних підкладках, відомих фахівцеві в даній галузі техніки. Ці основи можуть, зокрема, включати скло, полістирол, поліпропілен, поліетилен, декстран, нейлон, або природні чи модифіковані клітини. Ці основи можуть бути або розчинними, або нерозчинними. Як приклад, у кращому способі задіяні імуноферментні способи відповідно до методу ELISA, способи імунофлуоресценції або методи радиоімунологічного аналізу (РІА), або еквівалентні. Таким чином, даний винахід також включає набори або комплекти, необхідні для здійснення способу діагностики захворювань, індукованих гіперекспресією або зниженою експресією рецептора c-Met, або для здійснення способу виявлення та/або кількісного визначення гіперекспресії або зниженої експресії рецептора c-Met у біологічному зразку, краще гіперекспресії цього рецептора, які характеризуються тим, що дані набори або комплекти включають наведені нижче елементи: a) антитіло або його функціональний фрагмент чи похідне за винаходом; b) необов'язково, реагенти для утворення середовища, сприятливого для імунологічної реакції; c) необов'язково, реагенти, що дають можливість демонстрації комплексів c-Met/антитіло, отриманих в результаті імунологічної реакції. Об'єктом винаходу також є застосування антитіла або композиції за винаходом для отримання ліків, призначених для специфічної націленості біологічно активної сполуки на клітини, що експресують або гіперекспресують рецептор c-Met. Під біологічно активною сполукою у даній заявці мають на увазі зазначення будь-якої сполуки, здатної модулювати, зокрема, інгібувати активність клітин, зокрема, їх ріст, проліферацію, транскрипцію або трансляцію генів. Об'єктом винаходу також є реагент для діагностики in vivo, який включає антитіло за винаходом або його функціональний фрагмент чи похідне, краще мічене, зокрема, радіоактивно мічене, та його застосування в медичній візуалізації, зокрема, для виявлення раку, пов'язаного з експресією або гіперекспресією клітиною рецептора c-Met. Винахід також стосується композиції у вигляді комбінованого препарату або кон’югату антитіла проти c-Met/токсину чи радіоактивного елемента за винаходом як ліків. Краще, якщо композицію у вигляді комбінованого препарату або кон’югату за винаходом будуть змішувати з ексципієнтом та/або з фармацевтично прийнятним носієм. У даному описі фармацевтично прийнятний носій призначений для зазначення сполуки або комбінації сполук, що входять до фармацевтичної композиції, що не викликає вторинних реакцій, які дають можливість, наприклад, полегшення введення активної сполуки (сполук), підвищення її часу життя та/або її ефективності в організмі, підвищення її розчинності у розчині або, крім того, покращення її консервації. Ці фармацевтично прийнятні носії добре відомі та будуть адаптовані фахівцем у даній галузі техніки залежно від природи та від вибраного режиму введення активної сполуки (сполук). Краще, якщо ці сполуки будуть вводити системним шляхом, зокрема, внутрішньовенним шляхом, внутрішньом'язовим, внутрішньошкірним, внутрішньочеревинним або підшкірним шляхом, або пероральним шляхом. Ще краще, композицію, що включає антитіла за винаходом, будуть вводити кілька разів послідовно. Режими їх введення, дозування та оптимальні фармацевтичні форми можуть бути визначені відповідно до критеріїв, що звичайно враховуються при призначанні терапії, адаптованої для пацієнта, такими як, наприклад, вік або маса тіла пацієнта, серйозність його/її загального стану, переносність лікування та помічені вторинні ефекти. 22 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 Інші характеристики та переваги винаходу розкриваються у подальшому описі за допомогою прикладів та графічних матеріалів, де: Фіг. 1: Ефект нерелевантних IgG1 Mab мишачого та людського походження та ФСБ на фосфорилування рецептора c-Met на клітинах A549. Фіг. 2A і 2B: Ефект мишачого та гуманізованого 224G11 Mab, продукованого як IgG1 людини/ізотип каппа, на фосфорилування рецептора c-Met на клітинах A549. Фіг. 2A: агоністичний ефект, обчислений як відсоток максимальної стимуляції фосфорилування c-Met за допомогою HGF [100 нг/мл]. Фіг. 2B: антагоністичний ефект, обчислений як відсоток інгібування максимальної стимуляції фосфорилування c-Met за допомогою HGF [100 нг/мл]. Фіг. 3A і 3B: Порівняння мишачого 224G11 Mab і химерних 224G11 Mab, що включають різні сконструйовані шарнірні області, на фосфорилування рецептора c-Met на клітинах A549. Фіг. 3A: агоністичний ефект, підрахований у вигляді відсотка проти максимальної стимуляції фосфорилування c-Met за допомогою HGF [100 нг/мл]. Фіг. 3B: антагоністичний ефект, обчислений як відсоток інгібування максимальної стимуляції фосфорилування c-Met за допомогою HGF [100 нг/мл]. Фіг. 4A і 4B: Порівняння мишачого 224G11 Mab і химерного та гуманізованого 224G11 Mab, продукованих як IgG2 людини/ізотип каппа, на фосфорилування рецептора c-Met на клітинах A549. Фіг. 4A: агоністичний ефект, обчислений як відсоток від максимальної стимуляції фосфорилування c-Met за допомогою HGF [100 нг/мл]. Фіг. 4B: антагоністичний ефект, обчислений як відсоток інгібування максимальної стимуляції фосфорилування c-Met за допомогою HGF [100 нг/мл]. Фіг. 5A і 5B: Порівняння мишачого 224G11 Mab і химерного та гуманізованого 224G11 Mab, отриманих як сконструйований мутант шарнірної області TH7IgG1/каппа, на фосфорилування рецептора c-Met на клітинах A549. Фіг. 5A: агоністичний ефект, обчислений як відсоток від максимальної стимуляції фосфорилування c-Met за допомогою HGF [100 нг/мл]. Фіг. 5B: антагоністичний ефект, обчислений як відсоток інгібування максимальної стимуляції фосфорилування c-Met за допомогою HGF [100 нг/мл]. Фіг. 6A і 6B, Фіг. 7A і 7B, Фіг. 8A і 8B, Фіг. 9A і 9B, Фіг. 10A і 10B: моделі BRET, де Фіг. A: модель димеризації c-Met; і Фіг. B: модель активації c-Met. Фіг. 11: розпізнавання c-Met химерною і гуманізованою формою 224G11. Фіг. 12: Ефект мишачих і химерних антитіл на індуковану HGF проліферацію клітин NCIH441 in vitro. Клітини NCI-H441 висівали в середовище без сироватки. Через 24 години після висівання додавали m224G11 і [224G11]chim або за відсутності, або у присутності HGF. Чорними стрілками зазначені лунки, засіяні одними клітинами або за відсутності 40 45 50 55 , або у присутності HGF. IgG1 (mlgG1) вводили як контроль ізотипу. Фіг. 13: Порівняння in vivo мишачого та химерного IgG1 224G11 Mab на моделі ксенотрансплантата NCI-H441. Фіг. 14A і 14B: Ефект мишачого 224G11 Mab та різних химерних і гуманізованих варіантів цього антитіла на індуковану HGF проліферацію клітин NCI-H441 in vitro. Клітини NCI-H441 висівали у середовище без сироватки. Через двадцять чотири години після висівання додавали тестоване антитіло або за відсутності, або у присутності HGF. На панелі (Фіг. 14A) показані мишачий m224G11, химерний IgG1 [224G11]chim, гуманізовані IgG1 [224G11] [Hz1], [224G11] [Hz2], [224G11] [Hz3] варіанти. На панелі (Фіг. 14B) показані мишача m224G11 та різні химерні форми IgG1 ([224G11] chim, [224G11] [MH chim], [224G11] [MUP9H chim], [224G11] [MMCH chim], [224G11] [TH7 chim]. Чорними стрілками зазначені лунки, засіяні тільки клітинами, або за відсутності , або у присутності HGF. Мишачий IgG1 вводили як негативний контроль агоністичної активності. m5D5 використовували як дозазалежний повний агоністичний контроль. Фіг. 15: Ефект мишачого 224G11 Mab та різних химерних і гуманізованих варіантів цього антитіла на індуковану HGF проліферацію клітин NCI-H441 in vitro. Клітини NCI-H441 висівали у середовище без сироватки. Через двадцять чотири години після висівання додавали тестоване антитіло або за відсутності, або у присутності HGF. Показані мишача m224G11, химерні [224G11] chim, [224G11] [TH7 chim]) форми IgG1 і [224G11] [TH7 Hz1], [224G11] [TH7 Hz3]. Чорними стрілками вказані лунки, засіяні тільки клітинами, або за відсутності , або у присутності HGF. Мишачий IgG1 вводили як негативний контроль агоністичної активності. m5D5 використовували як дозазалежний повний агоністичний контроль. 23 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 16: Порівняння in vivo мишачих, химерних і гуманізованих 224G11 Mab на моделі ксенотрансплантата NCI-H441. Фіг. 17A: агоністичний ефект, обчислений як відсоток від максимальної стимуляції фосфорилування c-Met за допомогою HGF [100 нг/мл]. Фіг. 17B: антагоністичний ефект, обчислений як відсоток інгібування максимальної стимуляції фосфорилування c-Met за допомогою HGF [100 нг/мл]. Фіг. 18: Моделі BRET з моделлю активації c-Met. Фіг. 19: Ефект m224G11 і h224G11 на розпад c-Met на клітинах A549. A) Середнє 4 незалежних експериментів ± СКП (середня квадратична помилка). B) зображення вестернблотингу 4 незалежних проведених експериментів. Фіг. 20: Ефект m224G11 і h224G11 на розпад c-Met на клітинах NCI-H441. A) Середнє 4 незалежних експериментів ± СКП. B) зображення вестерн-блотингу 4 незалежних проведених експериментів. Фіг. 21: Постановка ELISA для оцінювання шедінгу c-Met. Фіг. 22: Оцінювання in vitro шедінгу c-Met на клітинах NCI-H441, оброблених протягом 5 діб m224G11. mlgG1 є нерелевантним антитілом, використовуваним як контроль ізотипу. Фіг. 23: Оцінювання in vitro шедінгу c-Met на ампліфікованих клітинних лініях Hs746T, MKN45 і EBC-1, оброблених протягом 5 діб m224G11. mlgG1 є нерелевантним антитілом, використовуваним як контроль ізотипу. PMA є індуктором шедінгу, використовуваним як позитивний контроль. Фіг. 24: Оцінювання in vitro шедінгу c-Met на NCI-H441 і ампліфікованих клітинних лініях Hs746T, MKN45 і EBC-1, оброблених протягом 5 діб m224G11. mlgG1 є нерелевантним антитілом, використовуваним як контроль ізотипу. PMA є індуктором шедінгу, використовуваним як позитивний контроль. Фіг. 25: Дослідження власного фосфорилування h224G11 на клітинній лінії Hs746T. Фіг. 26: Дослідження власного фосфорилування h224G11 на клітинній лінії NCI-H441. A) фосфо-ELISA та B) аналіз за допомогою вестерн-блотингу. Фіг. 27: Дослідження власного фосфорилування h224G11 на клітинній лінії Hs578T. A) фосфо-ELISA і B) аналіз за допомогою вестерн-блотингу. Фіг. 28: Дослідження власного фосфорилування h224G11 на клітинній лінії NCI-H125. A) фосфо-ELISA та B) аналіз за допомогою вестерн-блотингу. Фіг. 29: Дослідження власного фосфорилування h224G11 на клітинній лінії T98G. A) фосфоELISA і B) аналіз за допомогою вестерн-блотингу. Фіг. 30: Дослідження власного фосфорилування h224G11 на клітинній лінії MDA-MB-231. A) фосфо-ELISA та B) аналіз за допомогою вестерн-блотингу. Фіг. 31: Дослідження власного фосфорилування h224G11 на клітинній лінії PC3. A) фосфоELISA та B) аналіз за допомогою вестерн-блотингу. Фіг. 32: Дослідження власного фосфорилування h224G11 на клітинах HUVEC. Фіг. 33: Порівняння in vivo мишачого антитіла 224G11 дикого типу з 224G11[C2D5-7] Mab зі сконструйованою шарнірною областю на моделі ксенотрансплантата NCI-H441. 51 Фіг. 34: Індукція АЗКЦ h224G11 як на клітинах Hs746T, так і на клітинах NCI-H441. Cr-мічені клітини Hs746T (A) або клітини NCI-H441 (B), з нанесеним (зафарбовані квадрати) або не нанесеним (порожні квадрати) h224G11 змішували в різному співвідношенні з клітинами людини 51 NK та інкубували протягом 4 год. Клітини збирали та рахували імп/хв Cr, вивільненого в результаті лізису. Результати наносили на графік у вигляді відсотка лізису проти співвідношення ефекторних клітин/клітин-мішеней. NL для клітин без антитіла. Фіг. 35: Забарвлення h224G11 у ксенотрансплантаті пухлини, який експресував різні рівні cMet (A: Hs746T ампліфікована клітинна лінія для c-Met, B: NCI-H441 високий рівень експресії cMet і C: MCF-7 низький рівень c-Met). Приклад 1: Створення антитіл проти c-Met Для створення антитіл проти c-Met 8-тижневих мишей BALB/c імунізували або від 3 до 5 разів підшкірно трансфекованою клітинною лінією CHO, яка експресує c-Met на плазматичній 6 мембрані клітин (20x10 клітин/доза/мишу), або від 2 до 3 разів злитим білком позаклітинного домену c-Met (10-15 мкг/доза/мишу) (R&D Systems, № за каталогом 358MT), або фрагментами цього рекомбінантного білка, змішуючи з повним ад’ювантом Фрейнда для першої імунізації та з неповним ад’ювантом Фрейнда для наступних. Також здійснювали змішані протоколи, за яких миші отримували і клітини CHO-cMet, і рекомбінантні білки. За три доби до злиття клітин мишам проводили бустер-ін'єкцію i.p. або i.v. рекомбінантним білком або фрагментами. Потім селезінки мишей збирали та зливали із клітинами мієломи SP2/0-Ag14 (ATCC) і піддавали селекції на середовищі HAT (гіпоксантин, аміноптерин та тимідин). Були проведені чотири злиття. В цілому 24 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для отримання моноклональних антитіл або їх функціональних фрагментів, зокрема, мишачого походження, можна посилатися на методи, які описані, зокрема, у посібнику "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988), або на метод отримання гібридом, описаний Kofiler and Milstein (Nature, 256:495497, 1975). Отримані гібридоми спочатку піддавали скринінгу за допомогою ELISA на рекомбінантному білку c-Met, а потім за допомогою аналізу FACS на клітинних лініях A549 NSCLC, BxPC3 підшлункової залози та U87-MG гліобластоми, щоб переконатися, що продуковані антитіла будуть здатні також розпізнавати нативний рецептор на пухлинних клітинах. Позитивні реакції на цих 2 тестах ампліфікували, клонували, і серія гібридом була виділена, очищена та піддана скринінгу на їх здатність інгібувати in vitro клітинну проліферацію в моделі BxPC3. З цією метою 50000 клітин BxPC3 висівали в 96-лункові планшети в середовищі RPMI, 2 мМ L-глутаміну, без SVF. Через 24 години після висівання тестовані антитіла додавали з кінцевою концентрацією в діапазоні від 0,0097 до 40 мкг/мл за 60 хв до додання 100 нг/мл hHGF. Після 3 діб клітини мітили 3 3 імпульсною міткою 0,5 мкКі [ H]тимідин протягом 16 годин. Кількість [ H]тимідину, включеного в ДНК, нерозчинну в трихлороцтовій кислоті, визначали кількісно за допомогою рідинного сцинтиляційного підрахунку. Результати виражали у вигляді необроблених даних, щоб дійсно виявити власний агоністичний ефект кожного Mab. Потім антитіла, що інгібують щонайменше 50% клітинної проліферації, оцінювали на їх активність щодо димеризації c-Met і активації аналізу BRET на трансфекованих клітинах. Активність рецептора c-Met визначали кількісно шляхом вимірювання рекрутменту сигнальної молекули Gab1 на активованому c-Met. З цією метою були створені стабільні клітинні лінії CHO, що експресують C-Met-RLuc або C-Met-RLuc і C-Met-K1100A-YPF для димеризації c-Met або CMet-RLuc і мутовану форму Gab1 [Maroun et al., Mol. Cell. Biol, 1999, 19:1784-1799], злитого з YPF, для активації c-Met. Клітини розподіляли по білих 96-лункових мікропланшетах в культуральному середовищі DMEM-F12/ФСТ 5% за одну або за дві доби до експериментів BRET. Спочатку клітини культивували при 37 °C з CO2 5%, щоб дати можливість прикріплення клітин до планшета. Потім клітини піддавали голодуванню у 200 мкл DMEM/лунку протягом ночі. Безпосередньо перед експериментом DMEM видаляли, і клітини швидко промивали ФСБ. Клітини інкубували у ФСБ у присутності та за відсутності тестованих антитіл або референсних сполук протягом 10 хв при 37 °C перед доданням целентеразину з HGF і без нього в кінцевому об’ємі 50 мкл. Після інкубації протягом ще 10 хвилин при 37 °C починали зняття даних випромінення світла при 485 нм і 530 нм, використовуючи люмінометр Mithras (Berthold) (1 с/довжина хвилі/лунку, повторювали 15 разів). Відношення BRET визначено раніше [Angers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:36843689] як: [(випромінення при 530 нм) - (випромінення при 485 нм) × Cf] / (випромінення при 485 нм), де Cf відповідає (випромінення при 530 нм) / (випромінення при 485 нм) для клітин, що експресують тільки злитий білок RLuc за таких саме умов експерименту. Спрощення цього рівняння показує, що відношення BRET відповідає відношенню 530/485 нм, отриманому у присутності двох партнерів, скоректованому по відношенню 530/485 нм, отриманому за тих же умов експерименту, коли в аналізі присутній тільки один партнер, злитий з люциферазою R. reniformis. З метою читаності результати виражали в одиницях міліBRET (mBU); mBU відповідає відношенню BRET, помноженому на 1000. Після цього другого тесту in vitro було відібране антитіло 224G11 i) без власної активності у вигляді цілої молекули у функціональному тесті проліферації, ii) яке значно інгібує проліферацію BxPC3 та iii) яке інгібує димеризацію c-Met. В експериментах 5D5 Mab, отримане фірмою Genentech і доступне з ATCC, додавали як контроль власної агоністичної активності. Приклад 2: Спосіб гуманізації мишачого 224G11 Mab шляхом прищеплення CDR 1) Гуманізація варіабельного домену легкого ланцюга (VL) Як попередню стадію, нуклеотидну послідовність 224G11 VL порівнювали з послідовностями генів зародкової лінії миші, включеними в базу даних IMGT (http://imgt.cines.fr). Ідентифіковані гени зародкової лінії миші IGKV3-5*01 і IGKJ4*01, що виявляють ідентичність послідовності 99,31% для V області та 94,28% для J області відповідно. Враховуючи ці високі гомології, нуклеотидна послідовність 224G11VL використана безпосередньо для пошуку гомологій людини замість відповідних зародкових генів миші. На другій стадії проведений пошук гена зародкової лінії людини, що виявляє найкращу ідентичність із 224G11VL, щоб ідентифікувати кращий людський кандидат на прищеплення CDR. Для оптимізації селекції провели вирівнювання між амінокислотними послідовностями. Ген зародкової лінії людини IGKV4-1*01 дав ідентичність послідовності 67,30%, але показав відмінну довжину для CDR1 (10 амінокислот в 224G11 VL і 12 амінокислот в IGKV4-1*01). Для J 25 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 області був відібраний ген зародкової лінії людини IGKJ4*02 (ідентичність послідовності 77,14%). На наступній стадії ділянки CDR 224G11 VL були прищеплені на відібрані вище каркасні послідовності людини. Кожне положення амінокислоти аналізували на кілька критеріїв, таких як участь у пограничній поверхні VH/VL, у зв'язуванні антигену або в структурі CDR, локалізація залишку в 3D структурі варіабельного домену, якоря CDR, залишки, що належать до зони Верн’єра. Було сконструйовано три гуманізованих варіанта, що відповідають SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9 і SEQ ID No. 10, і вони включали відповідно чотири (4, 39, 40, 84), два (39, 40) або один (40) мишачий залишок в їх FR областях і CDR ділянки, що відповідають 224G11 VL миші. 2) Гуманізація варіабельного домену важкого ланцюга (VH) Як попередня стадія, нуклеотидну послідовність 224G11 VH порівнювали з послідовностями генів зародкової лінії миші, включеними в базу даних IMGT (http://imgt.cines.fr). Ідентифіковані гени зародкової лінії миші IGHV1-18*01, IGHD2-4*01 і IGHJ2*01 з ідентичністю послідовності 92,70% для V області, 75,00% для D області та 89,36% для J області відповідно. Враховуючи ці високі гомології, нуклеотидна послідовність 224G11VH використана безпосередньо для пошуку гомологій людини замість відповідних зародкових генів миші. На другій стадії проведений пошук гена зародкової лінії людини, що виявляє найкращу ідентичність із 224G11VH, щоб ідентифікувати кращий людський кандидат на прищеплення CDR. З цією метою проведене вирівнювання нуклеотидної послідовності 224G11 VH з послідовностями генів зародкової лінії людини, що належать до бази даних IMGT. Послідовність гена людини IGHV1-2*02 V виявляла ідентичність послідовності 75,00% на нуклеотидному рівні та 64,30% на амінокислотному рівні. Пошук гомології для J області привів до ідентифікації гена зародкової лінії людини IGHJ4*04 з ідентичністю послідовності 78,72%. На наступній стадії ділянки CDR 224G11 VH були прищеплені на відібрані вище каркасні послідовності людини. Кожне положення амінокислоти аналізували на кілька критеріїв, таких як участь у пограничній поверхні VH/VL, у зв'язуванні антигену або в структурі CDR, локалізація залишку в 3D структурі варіабельного домену, якоря CDR, залишки, що належать до зони Верн’єра. Була сконструйована одна повністю гуманізована форма, що відповідає SEQ ID 4; вона включає винятково людські залишки в її FR областях і CDR, що відповідають 224G11 VH миші. Приклад 3: Конструювання поліпшених мутантів шарнірної області Фахівцеві в даній галузі техніки добре відомо, що шарнірна область бере велику участь у гнучкості варіабельного домену імуноглобулінів (див. Brekke et al., 1995; Roux et al., 1997). У процесі химеризації 224G11 Mab константний домен миші IGHG1 був заміщений еквівалентною ділянкою IGHG1 людського походження. Оскільки амінокислотна послідовність шарнірної області була на високому ступені дивергентною, "муринізацію" шарнірної області здійснювали з метою збереження її довжини та міцності. Оскільки шарнірна область IGHG2 людини відповідає найближчому гомологові шарнірної області миші IGHG1, ця послідовність була також розглянута. Була сконструйована серія з 7 різних шарнірних послідовностей (SEQ ID No. 22-28) шляхом включення ділянок шарнірних областей IGHG1 миші та IGHG2 людини до ділянки шарнірної області IGHG1 людини. Інша серія мутантів шарнірної області була розроблена та сконструйована (SEQ ID No. 5872) для оцінювання впливу додаткового цистеїну і його положення по довжині шарнірного домену, делеції 1, 2, 3 або 4 амінокислот по довжині шарнірного домену та комбінації цих двох параметрів (додання цистеїну та делеції амінокислоти). Приклад 4: Продукування гуманізованних 224G11 Mab і форматів Mab зі сконструйованою шарнірною областю Усі вищеописані форми Mab, які включають або химерні, або гуманізовані та/або отримані генно-інженерним шляхом шарнірні області, продукували при транзитній трансфекції шляхом використання системи HEK293/EBNA з експресійним вектором pCEP4 (InVitrogen, US). Повнорозмірні нуклеотидні послідовності, що відповідають гуманізованим варіантам легкого (SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 19 і SEQ ID No. 20) і важкого (SEQ ID No. 14) ланцюга варіабельного домену 224G11 Mab синтезували шляхом глобального синтезу генів (Genecust, Luxembourg). Їх субклонировали у векторі pCEP4 (Invitrogen, US), що несе повнорозмірну кодуючу послідовність константного домену [CH1-Hinge-Ch2-CH3] імуноглобуліну IgG1 або IgG2 людини. Модифікацію шарнірної області здійснювали шляхом обміну фрагмента рестрикції {Nhell-Bcll} на еквівалентну ділянку, що несе бажані модифікації, де кожен відповідний фрагмент {Nhel-Bcll} синтезували шляхом глобального синтезу генів (Genecust, LU). Усі стадії клонування здійснювали відповідно до загальноприйнятих методів молекулярної біології, як описано в лабораторному посібнику (Sambrook and Russel, 2001), або відповідно до інструкцій постачальника. Кожна генетична 26 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 конструкція була повністю підтверджена секвенуванням нуклеотидів з використанням набору Big Dye для термінаторного циклу секвенування (Applied Biosystems, US) і проаналізована з використанням генетичного аналізатора 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, US). Адаптовані до росту в суспензії клітини HEK293 EBNA (Invitrogen, US) вирощували звичайним шляхом у флаконах на 250 мл в 50 мл середовища без сироватки Excell 293 (SAFC Biosciences) з доданням 6 мМ глутаміну на орбітальному струшувачі (швидкість обертання 110 6 об/хв). Транзитну трансфекцію здійснювали з використанням 2×10 клітин/мл, використовуючи лінійний 25 кДа поліетиленімін (ПЕІ) (Polysciences), виготовлений у воді з кінцевою концентрацією 1 мг/мл, змішаний із плазмідною ДНК (кінцева концентрація 1,25 мкг/мл для співвідношення плазмід важкого та легкого ланцюга 1:1). Через 4 години після трансфекції культуру розводили одним об’ємом свіжого культурального середовища до досягнення кінцевої 6 щільності клітин 10 клітин/мл. Моніторинг процесу культивування здійснювали на основі життєздатності клітин та продукування Mab. Типово, культури підтримували протягом часу від 4 до 5 діб. Mab очищали, використовуючи загальноприйнятий хроматографічний метод, на смолі з білком A (GE Healthcare, US). Усі різні форми Mab продукувалися на рівнях, придатних для функціонального оцінювання. Рівні продуктивності типово знаходяться в інтервалі від 15 до 30 мг/л очищених Mab. Приклад 5: Оцінювання стану фосфорилування c-Met за допомогою фосфо-c-Metспецифічного аналізу ELISA Даний функціональний аналіз дає можливість моніторингу модулювання стану фосфорилування c-Met або одними Mab, або при одночасній присутності HGF. Клітини A549 висівали на планшет 12MW у повне середовище для росту [F12K + 10% ФСТ (фетальної сироватки теляти)]. Клітини піддавали голодуванню протягом 16 годин перед стимуляцією HGF [100 мг/мл], і кожне тестоване Mab додавали при його кінцевій концентрації 30 мкг/мл за 15 хвилин до стимуляції ліганду. Охолоджений у льоді буфер для лізису додавали через 15 хвилин після додання HGF, щоб зупинити реакцію фосфорилування. Клітини зскрібали механічним шляхом, і клітинні лізати збирали центрифугуванням при 13000 об/хв протягом 10 хв при 4 °C, що відповідає фазі супернатанта. Вміст білка кількісно визначали, використовуючи набір BCA (Pierce), і зберігали при -20 °C до використання. Стан фосфорилування c-Met кількісно визначали за допомогою ELISA. Mab кози проти c-Met (R&D, № за каталогом AF276) використовували як іммобілізоване антитіло (покриття протягом ночі при 4 °C), і після стадії насичення з буфером TBS-BSA 5% (1 година при кімнатній температурі (КТ)) до кожної лунки покритого планшета 96MW додавали 25 мкг білкових лізатів. Після 90 хвилин інкубації при КТ планшети промивали чотири рази та додавали ідентифікуюче антитіло (Mab проти фосфо-cMet, націлене проти фосфорилованих залишків Tyr у положенні 1230, 1234 і 1235). Після додаткової інкубації протягом 1 години та 4 відмивань антитіло проти кролика, кон’юговане з HRP (Biosource), додавали на 1 годину при КТ, і виявлення люмінесценції здійснювали шляхом додання люмінолу. Зчитування люмінесценції здійснювали на багаторежимному зчитувальному пристрої для планшетів Mithras LB920 (Berthold). Рівень як базового, так і індукованого HGF [100 мг/мл] фосфорилування рецептора c-Met не підпадав під вплив ані в результаті оброблення ФСБ, ані в результаті додавання мишачих або людських Mab, які не націлені на рецептор c-Met людини (Фіг. 1). З іншого боку, мишаче (m) 224G11 Mab сильно інгібувало індуковане HGF [100 нг/мл] фосфорилування c-Met (Фіг. 2B) без зміни власного фосфорилування рецептора (Фіг. 2A). Дивно, що химерна форма 224G11 Mab (224G11chim/IgG1), що означає варіабельний домен (VH+VL) від m224G11, об'єднаний з константним доменом людини IgG1/каппа, давала сильну (17% від максимального ефекту HGF, Фіг. 2A) агоністичну активність, асоційовану зі зниженою антагоністичною ефективністю (54% інгібування максимального ефекту HGF у порівнянні з m224G11, яке дає 75% інгібування максимального ефекту HGF, Фіг. 2B). Три гуманізовані форми 224G11 Mab, [224G11]Hz1/IgG1, [224G11]Hz2/IgG1 і [224G11]Hz3/IgG1, також сконструйовані на каркасі IgG1/каппа людини, давали також знижену антагоністичну активність і значну агоністичну активність (від 11 до 24% від максимального рівня HGF) у порівнянні з мишачим 224G11 (Фіг. 2A і 2B). Була сконструйована серія отриманих генно-інженерним шляхом варіантів шарнірного домену важкого ланцюга та проаналізована в аналізі фосфорилування рецептора c-Met. Як показано на Фіг. 3A, важливе зниження агоністичного ефекту, пов'язане з ізотипом hlgG1/каппа, спостерігали як для конструкції на основі IgG2, так і для отриманих генно-інженерним шляхом конструкцій IgG1/каппа [MH, MUP9H і TH7]. Супутнє підвищення антагоністичної ефективності було також отримане. Мутант шарнірної області TH7 на основі hlgG1/каппа з найбільшою частиною людської послідовності був відібраний для здійснення процесу гуманізації. На наступній стадії було отримано три гуманізованих варіанти варіабельного домену 224G11 Mab шляхом 27 UA 108466 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 комбінування або з IgG2/каппа людини, або зі сконструйованим шарнірним константним доменом TH7 на основі IgG1/каппа. Для гуманізованих конструкцій hIgG2/каппа гуманізований варіант Hz3 давав сильний агонізм (Фіг. 4A), та для всіх трьох гуманізованих варіантів антагоністична ефективність була нижчою, ніж та, яку спостерігали з мишачим 224G11 Mab, і порівнянною з химерним Mab на основі hlgG1 (56-57% інгібування ефекту HGF, Фіг. 4B). З іншого боку, комбінування трьох гуманізованих варіантів Hz1, Hz2 або Hz3 зі сконструйованим мутантом IgG1/TH7 найбільш повно відновлювало властивості мишачого 224G11 Mab щодо слабкої агоністичної активності (5-6% ефекту HGF) і сильної антагоністичної ефективності (6872% інгібування ефекту HGF) фосфорилування рецептора c-Met (Фіг. 5A і 5B). Ці варіанти були у високому ступені поліпшені порівняно як з химерним 224G11 Mab на основі IgG1, так і з гуманізованими формами на основі IgG2. Друга серія отриманих генно-інженерним шляхом варіантів шарнірного домену важкого ланцюга була сконструйована та проаналізована в аналізі фосфорилування рецептора c-Met. Як показано на фіг. 17A, усі ці нові варіанти (c224G11[C2], c224G11[C3], c224G11[C5], c224G11[C6], c224G11[C7], c224G11[Δ1-3], c224G11[C7Δ6], c224G11[C6Δ9], c224G11[C2Δ5-7], c224G11[C5Δ2-6], c224G11[C9Δ2-7] і c224G11[Δ5-6-7-8]) виявляли слабкіший агоністичний ефект, ніж c224G11, оскільки їх агоністичні активності становлять від 6 до 14% від ефекту HGF у порівнянні з 23% для c224G11. Як і c224G11[TH7], усі ці нові варіанти виявляли супутнє підвищення антагоністичної ефективності [фіг. 17B]. Ці результати показали, що конструювання домену важкого ланцюга генно-інженерним шляхом за рахунок точкової мутації та/або делеції може модифікувати агоністичні/антагоністичні властивості антитіла. Приклад 6: Аналіз BRET У першій серії експериментів був поставлений контроль, що нерелевантний IgG1 миші, IgG1 людини та IgG2 людини не виявляють ефекту індукованого HGF сигналу BRET в обох моделях BRET (репрезентативний експеримент із 12 незалежних експериментів; Фіг. 6). Ці Mab далі зазначені як контролі. Оцінювали ефект химерної форми IgG1 мишачого 224G11 Mab ([224G11]chim) на моделі BRET як димеризації c-Met, так і активації c-Met. Якщо мишаче 224G11 Mab інгібувало 59,4% індукованого HGF сигналу BRET на моделі димеризації c-Met, [224G11]chim Mab інгібувало тільки 28,9% (Фіг. 7A). Антитіло [224G11]chim було також менш ефективним при інгібуванні індукованої HGF активації c-Met, тому що антитіла [224G11]chim і m224G11 інгібували відповідно 34,5% і 56,4% індукованого HGF сигналу BRET (Фіг. 7B). Крім того, одне m224G11 не мало ефекту на активацію c-Met, тоді як [224G11]chim мало частковий агоністичний ефект на активацію c-Met, що відповідає 32,9% індукованого HGF сигналу. Цей частковий агоністичний ефект [224G11]chim також спостерігали відносно моделі BRET димеризації c-Met, оскільки одне [224G11]chim індукувало підвищення BRET, що відповідає 46,6% індукованого HGF сигналу, порівняно з 21,3% для m224G11 (Фіг. 7A). На Фіг. 8A і 8B химерні форми антитіла 224G11 з мутованою шарнірною областю виявляли вищий інгібувальний ефект відносно індукованого HGF сигналу BRET, ніж [224G11]chim, оскільки вони показали 59,7%, 64,4%, 53,2% і 73,8% інгібування індукованого HGF сигналу активації BRET (Фіг. 8B) та 61,8%, 64,4% 52,5% і 64,4% інгібування індукованого HGF сигналу BRET димеризації c-Met (Фіг. 8A) для [224G11][MH chim], [224G11][MUP9H chim], [224G11][MMCH chim] і [224G11][TH7 chim] відповідно. На противагу [224G11]chim, яке мало частковий агоністичний ефект на активацію c-Met, одні химерні форми антитіла 224G11 з мутованою шарнірною областю не виявляли значного ефекту на активацію c-Met (5,1%, 7,6%, 2,0% і -6,9% відповідно), як спостерігали для m224G11. На Фіг. 9B, подібно до [224G11] [TH7 chim], 3 гуманізованих варіанти антитіла 224G11 IgG1 із шарнірною областю TH7 не індукували значного підвищення сигналу BRET на моделі активації при тестуванні їх одних, і виявляли сильне інгібування індукованого HGF сигналу BRET: 59,9%, 41,8% та 57,9% для форм Hz1, Hz2 та Hz3 відповідно. Крім того, [224G11] [TH7 Hz1], [224G11] [TH7 Hz2] і [224G11] [TH7 Hz3] інгібували індукований HGF сигнал BRET на моделі димеризації на 52,2%, 35,8% і 49,4% відповідно (фіг. 9A). На противагу [224G11]chim, одна химерна форма антитіла 224G11 IgG2 ([224G11] [IgG2 chim]) не виявляла часткового агоністичного ефекту та інгібувала 66,3% ефекту HGF на моделі активації c-Met (Фіг. 10B). На моделі димеризації c-Met [224G11] [IgG2 chim] інгібувало 62,4% індукованого HGF сигналу BRET (Фіг. 10A). Агоністичну ефективність другої серії сконструйованих варіантів шарнірного домену важкого ланцюга оцінювали в моделі BRET активації c-Met (Фіг. 18). На противагу c224G11, яке мало частковий агоністичний ефект на активацію c-Met, одні химерні форми антитіла 224G11 з мутованою шарнірною областю c224G11[C2], c224G11[C3], c224G11[C5], c224G11[C6], 28

Дивитися

Додаткова інформація

Автори російською

Goetsch, Liliane, Wurch, Thierry, Bes, Cedric

МПК / Мітки

МПК: C07K 16/28, A61K 39/395, C07K 16/00, A61P 35/00, C07K 16/46

Мітки: c-met, антитіло

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/127-108466-antitilo-proti-c-met.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Антитіло проти c-met</a>

Подібні патенти