Воднодисперсна композиція для забезпечення біологічного контролю грибків з метою зменшення рівнів афлатоксину

Реферат: Винахід належить до воднодисперсної композиції для біологічного контролю у гранулах, що включає засіб біологічного контролю з метою зменшення зараження афлатоксином продуктів харчування і кормів, зв'язуючий засіб, засіб, що має осмозахисні та адгезивні властивості, засібносій і джерело поживних речовин, в якому засіб для біологічного контролю знаходиться у вигляді суспензії. Кількість осмозахисного адгезивного засобу знаходиться в інтервалі приблизно 5-20 % в перерахунку на суху масу загальної композиції, у якій вказані засоби і джерело поживних речовин існують у вказаній композиції як змішана суміш, а вказаний засіб біологічного контролю включений в матрицю вказаної суміші і при диспергуванні у воді вивільняється для здійснення відповідної функції. Винахід належить також способу одержання засобу біологічного контролю у вигляді воднодисперсної композиції у гранулах. UA 101164 C2 (12) UA 101164 C2 UA 101164 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід стосується воднодисперсної композиції у формі гранул, яка містить засоби біологічного контролю з метою зменшення зараження афлатоксином продуктів харчування і кормів, зокрема кукурудзи, і способу одержання даної композиції. Воднодисперсна композиція у формі гранул включає засоби біологічного контролю, інкорпоровані в матрицю гранули, що вивільняються при диспергуванні у водному розчиннику. Засоби біологічного контролю являють собою штами Aspergillus flavus, що не утворюють токсинів або афлатоксину, і які здатні інгібувати ріст колоній грибків, що продукують афлатоксин, а також додатково пригнічувати продукування афлатоксину грибками, що утворюють токсини. Воднодисперсна композиція у формі гранул за даним винаходом демонструє високий ступінь стабільності при зберіганні і в польових умовах. КОРОТКИЙ ОПИС РІВНЯ ТЕХНІКИ Численні грибки утворюють вторинні метаболіти, які не є необхідними для їх росту або розмноження. Якщо вказані метаболіти є отруйними для людини або худоби, то їх класифікують як мікотоксини. Чотирма з найважливіших видів грибків, що продукують мікотоксин, є Aspergillus, Fusarium, Penicillium, і Alternaria (Council for Agricultural Science and Technology [CAST], 2003. Task Force Report 139, Ames, IA). Вказані грибки продукують мікотоксини, які можуть несприятливо впливати на якість і зберігання різноманітних продуктів харчування і кормів, в тому числі кукурудзи, бавовни, злакових, арахісу і горіхів. Оцінено, що через мікотоксини харчова промисловість і тваринництво США і Канади втрачають до п'яти мільярдів щорічно; причому найбільшу проблему становить афлатоксин, клас мікотоксинів, який продукують види Aspergillus (Robbens and Cardwell. 2005. In: Aflatoxin and Food Safety, Abbas, H. K. (Ed.), CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 1-12). Два основні мікотоксини, що переважають як забруднювачі у продуктах харчування і кормах, які продукує А. flavus, являють собою афлатоксини B1 і B2 (Payne, G. S. 1992. Critical Rev. Plant Sci. 10: 423440). Афлатоксин B1 (AFB1) вважається найбільш потужним і розповсюдженим (International Agency for Research on Cancer-World Health Organization [IRAC-WHO]. 1993. In: IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Lyon, France, pp. 56, 467-488). Частота зараження більш за все пов'язана з А. flavus (Diener et al. 1987. Ann. Rev. Phytopath. 25: 249-270). Вказаний грибок здатен до росту в широкому інтервалі температури, а саме 10-43° C, а також у широкому інтервалі активності води (0,82-0,998) (Food and Agriculture Organization of the United Nations / International Atomic Energy Agency [FAO/IAEA]. 2001. In: FAO Food and Nutrition Paper, FAO, Rome, Italy, pp. 73, 75-93). Однак, умови засухи, механічне пошкодження, або пошкодження паразитами загалом підсилюють зараження кукурудзи афлатоксином до збирання врожаю. Поточний максимальний рівень афлатоксину, дозволений для продуктів харчування людей і кормів для тварин, становить 20 мкг/кг (CAST, вище; van Egmond and Jonker. 2004. J. Toxicol. Toxin Rev. 23: 273-293). Хоча мікотоксини неминуче з'являються на сільськогосподарських продуктах, рівень вказаних забруднювачів можна контролювати за допомогою придатних агрономічних методів. Запропоновано декілька стратегій управління рівнями афлатоксину до збирання врожаю (Betran and Isakeit. 2004. Agron. J. 96: 565-570) з різними ступенями успіху. Одна з перспективних стратегій контролю являє собою біологічний контроль з використанням А. flavus, що не утворює токсинів (Dorner, J. W. 2004. J. Toxicol. - Toxin Rev. 23: 425-450). Brown et al. (1991. J. Food Protect. 54: 623-626) продемонстрували, що рівні афлатоксину можна зменшувати шляхом безпосереднього поранення і введення шляхом ін'єкції штаму А. flavus, що не утворює токсинів, у кукурудзяні качани. На відміну від стратегії безпосередньої, механічної доставки Brown et al., частіше використовують непряму доставку у ґрунт. В цьому випадку, інокулят для ґрунту являє собою звичайно агресивний штам А. flavus, що не утворює токсинів, який спочатку культивують на злакових. Вказані гранули служать джерелом поживних речовин для розмноження штаму біологічного контролю А. flavus, їх застосовують для обробки ґрунту цільових врожаїв. Розміщений на гранулах, штам, що не утворює токсинів, рясно утворює спори, розповсюджується за допомогою вітру або води, і конкурує з ендемічними штамами, що утворюють афлатоксин, за ресурси, приводячи до колективного зменшення рівнів афлатоксину. Вказану стратегію обробки ґрунту успішно застосовують для обробки арахісу (Dorner et al. 1992. J. Food Protect. 55: 888-892), бавовни (Cotty, P. J. 1994. Phytopath.84: 1270-1277) та кукурудзи (Dorner et al. 1999. J. Food Protection 62: 650-656). Подібна стратегія використання інокуляції ґрунту була впроваджена для виробництва зерна у дельті Міссісіпі (Abbas et al. 2006. Biocontrol Sci. Tech. 16: 437-449). Дослідження кукурудзи у дельті Міссісіпі ідентифікувало штам А. flavus K49, що не утворює токсинів, який продемонстрував як значне зменшення зараження афлатоксином за чотири роки польових випробувань, так і високий потенціал росту колоній. 1 UA 101164 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Незважаючи на успіх згаданих вище стратегій обробки, існують обмеження, пов'язані із зменшенням, у практиці комерційного сільськогосподарського оточення. Таким чином, залишається необхідність у розробці підходу безпосередньої повітряної доставки з метою ефективного зменшення зараження кукурудзи афлатоксином до збирання врожаю, а також зменшення залежності нанесення від оптимальних природних умов. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Нами розроблено композицію, яка являє собою воднодисперсну композицію у формі гранул, що містить засоби біологічного контролю, які можна застосовувати у вигляді суспензії для розпилення конідій з метою запобігання зараженню афлатоксином продуктів харчування і кормів, і спосіб одержання воднодисперсної композиції у формі гранул. Відповідно до даного відкриття об'єктом даного винаходу є запропонувати воднодисперсну композицію у формі гранул, що містить виділені штами А. flavus, що не утворюють токсинів і афлатоксину, які можуть діяти як засоби біологічного контролю і інгібувати проліферацію грибків, що продукують афлатоксин, таким чином запобігаючи зараженню афлатоксином продуктів харчування і кормів. У переважних варіантах даного винаходу даний штам, що не утворює токсинів, позначений як K49. Також об'єктом даного винаходу є розробка засобів біологічного контролю без втрати життєздатності і з високим ступенем стабільності при зберіганні і у польових умовах. Інший об'єкт даного винаходу являє собою одержання продуктів біологічного контролю, які є чистими, зручними в обігу і володіють відносно низькою фітотоксичністю по відношенню до врожаю. Інший об'єкт даного винаходу являє собою включення засобів біологічного контролю у композиції, які можна застосовувати з традиційними сільськогосподарськими пульверизаторами. Інші об'єкти і переваги даного винаходу стануть очевидними з подальшого детального опису. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Нами розроблено спосіб одержання воднодисперсної композиції у гранулах, що містить штам біологічного контролю А. flavus, який не утворює токсинів. Інокуляцію штаму K49, що не утворює токсинів, як у композиції, так і без неї порівнювали з інокуляцією ґрунту для визначення впливу на потенціал росту колоній і рівні афлатоксину у кукурудзи в полі. Порівняння проводили з метою оцінки підходу безпосередньої доставки для зменшення зараження афлатоксином кукурудзи у період перед збиранням урожаю. Знайдені подібні рівні росту колоній і зменшення кількості афлатоксину при порівнянні розпилення спрею з конідіями у композиції і без композиції. Значення даного відкриття полягає в тому, що може бути розроблений придатний продукт для біологічного контролю з використанням традиційних технологій нанесення, з метою зменшення зараження кукурудзи афлатоксином. Чудове зменшення рівнів афлатоксину та очевидна колонізація штаму біологічного контролю підтримує гіпотезу, що найефективнішим способом зменшення зараження кукурудзи афлатоксином може бути безпосереднє нанесення засобу біологічного контролю на органи, сприйнятливі до афлатоксину, або репродуктивні органи кукурудзи. Звичайно використовують спосіб введення надзвичайно конкурентних штамів А. flavus, що не утворюють токсинів, в ґрунт, і він в результаті дає нижчі концентрації токсинів у врожаях сільськогосподарських культур завдяки штамам Aspergillus, що не утворюють токсинів, і стає біологічно конкурентним щодо мікрофлори ґрунту, запобігаючи включенню штамів, що утворюють токсини, які зустрічаються звичайно в період пізньо-сезонної засухи. Шляхом конкурентного видалення знайдених природно у ґрунті штамів грибів, що утворюють токсини, їх замінюють на штами, що не утворюють токсинів або афлатоксину, введені до ґрунту. Таким чином, в будь-які врожаї, на які впливає пізньо-сезонна засуха, попередньо включають біологічно конкурентні штами, які не можуть утворювати токсини. Однак, використання інокулятів для злакових з метою контролю афлатоксину для кукурудзи має наступні недоліки: 1) застосування твердої матриці може бути незручним для комерційного використання, якщо врожай знаходиться на пізніх стадіях онтогенезу, 2) деякі біотичні, абіотичні, а також погодні чинники можуть обмежити або затримати розпилення конідій з джерел доставки гранул на повітряні ділянки кукурудзи, і 3) можуть виникнути проблеми, пов'язані із здоров'ям і безпекою, через поточну споруляцію на застосованих зернах в полях. Отже, успіх підходу біологічного контролю залежить від динаміки або біологічної конкуренції між штамами А. flavus. Обидва штами K49 з конідіями у композиції і без композиції застосовували до репродуктивних тканин кукурудзи, і порівнювали їх вплив на рівні афлатоксину. При безпосередньому розпиленні на качани кукурудзи як конідії у композиції, так і конідії без 2 UA 101164 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 композиції виявляли високу ефективність з точки зору зменшення зараження кукурудзи афлатоксином. Хоча матеріал композиції був одержаний і зберігався протягом одинадцяти місяців, не було виявлено різниці в ефективності між матеріалом композиції і матеріалом, що складався із свіжозібраних конідій без композиції. Оскільки нанесення свіжо приготованих засобів біологічного контролю навряд буде комерційно придатним варіантом, стабільна композиція, що здатна ефективно здійснювати доставку засобів біологічного контролю, забезпечує важливий і комерційно придатний варіант для контролю афлатоксину для кукурудзи та інших урожайних культур, сприйнятливих до зараження мікотоксинами. Також відрізняється і концентрація матеріалу, що використовується для нанесення. Матеріал композиції за даним дослідженням застосовують у кількості 9 кг/га; а інокуляти, що базуються на внесені гранул у ґрунт, звичайно застосовують в кількостях 20-200 кг/га (Abbas et al. 2006; Cotty; Dorner et al. 1998; вище). Подальша оптимізація композиції, описаної в даному описі, а також методологія, використана при нанесенні за допомогою спрею, може додатково зменшувати кількість композиції, яку необхідно використовувати на одиницю площі, з метою контролю афлатоксину для кукурудзи. Спосіб за даним винаходом придатний для будь-якого сільськогосподарського продукту, що вирощується для споживання людиною та/або харчування тварин та/або пошкоджується токсинами грибків; він може принести користь при безпосередньому нанесенні на цільові ділянки рослин, наприклад, таких як пшениця, бавовна, горіхи і маслини. Для цілей даного винаходу грибкові препарати або сільськогосподарську композицію для біологічного контролю грибків відносять до мікробних препаратів, до яких включені мікроорганізми і які складаються в основному з, або складаються із штамів Aspergillus, що не утворюють токсинів або афлатоксину. Грибкові препарати в композиції можуть містити один або більше штамів, що не утворюють токсинів, або штами Aspergillus, що не утворюють афлатоксину. Штами Aspergillus, що не утворюють токсинів, включають будь-який штам, який не утворює ані афлатоксину, ані циклопіазонової кислоти (ЦПК). Штами Aspergillus, що не утворюють афлатоксину, включають будь-який штам, який не утворює токсин афлатоксин, але який продовжує утворювати циклопіазонову кислоту (ЦПК). Сільськогосподарська композиція для біологічного контролю для цілей даного винаходу включає штам, що не утворює токсинів, або штами або штам грибків, що не утворює афлатоксину, або штами грибків, включених до прийнятних з сільськогосподарської точки зору носіїв, і можуть являти собою будь-який носій, до якого приєднані грибки, причому вказані штами нешкідливі для грибків або врожаїв, які обробляються даною композицією. Приклад штаму, що не утворює токсинів, включає А. flavus K49. Грибки, особливо придатні за даним винаходом, являють собою штами, що володіють характеристиками ідентифікації А. flavus K49, який не утворює токсинів, і позначені як NRRL 30797. Вказані характеристики являють собою нездатність утворювати токсини афлатоксин і ЦПК та здатність до біологічної конкуренції шляхом застосування на ґрунті при вирощуванні сільськогосподарських продуктів. Приклад штаму, що не утворює афлатоксину, включає А. flavus CT3. Грибки, що також є особливо придатними за даним винаходом, являють собою штами, що володіють характеристиками ідентифікації штаму А. flavus CT3, який не утворює афлатоксину, і позначені як NRRL 30798. Вказані характеристики являють собою нездатність утворювати афлатоксин і здатність до біологічної конкуренції при застосуванні на ґрунті при вирощуванні сільськогосподарських продуктів. Якщо штами Aspergillus, що не утворюють токсинів або афлатоксину, культивують як єдині штами на зернах поживних джерел, наприклад пшениці, рису, жита, тощо, вказані поживні 8 джерела, у випадку повного росту колоній, містять приблизно 10 колонієутворюючих одиниць (КУО) грибків на грам поживного джерела. Для вказаних гранульованих поживних джерел, інокульоване зерно інкубують приблизно при 35° C. Після росту протягом 24 годин інокульовану пшеницю струшують вручну і інкубують ще протягом 24 годин, далі гомогенізують шляхом струшування вручну. Ріст колоній штаму інокуляту підтверджують шляхом визначення концентрації афлатоксину в інокулятах. Інокульований продукт можна зберігати при температурі приблизно 5° C протягом приблизно 2 місяців або довше, якщо його висушити при температурі нижче критичного вмісту води. Штами Aspergillus, що не утворюють токсинів або афлатоксину, застосовують до рослин в кількостях, ефективних для зменшення рівнів токсинів в сільськогосподарських продуктах. В даному описі, термін "зменшують рівні токсинів" позначає зменшення кількості токсинів у порівнянні з кількістю, наявність якої очікували би у сільськогосподарських продуктах, не оброблених відповідно до способів за даним винаходом. Для подібних порівнянь можна використовувати будь-який точний спосіб вимірювання і порівняння рівнів токсину, що є очевидним для фахівців у даній галузі. 3 UA 101164 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В даному описі, терміни "в ефективних кількостях" або "ефективна кількість" позначають кількість грибкового препарату, який вводять в тому випадку, коли ефект його введення полягає у зменшенні зараження токсинами сільськогосподарських продуктів. ПРИКЛАДИ Описавши загалом даний винахід, його також можна краще зрозуміти, якщо розглянути посилання на деякі конкретні приклади, які наводяться у даному описі тільки з метою подальшої ілюстрації даного винаходу, вони не мають на меті обмеження контексту даного винаходу, який визначається формулою даного винаходу. ПРИКЛАД 1 Штами Aspergillus flavus До початку проведення досліджень штам K49 А. flavus (NRRL 30797), що не утворює токсинів, і штам F3W4 (NRRL 30796), що не утворює афлатоксину, зберігали на силікагелі при 4° C, і перевіряли щодо відповідних характеристик фенотипу, профілю афлатоксину, склеральних утворень, а також морфології колоній і утворення конідій (Abbas et al. 2006. Biocontrol Science and Technology 16: 437-449). ПРИКЛАД 2 Матеріали композиції і виготовлення воднодисперсних гранул Кальциновану каолінову глину із середнім розміром частинок менше 1 мкм використовували як носій в наступній воднодисперсній композиції у гранулах (ВГ). Натрій карбоксиметилцелюлозу використовували як зв'язуючий засіб на додаток до трегалози. Трегалозу використовували як багатофункціональний компонент композиції. Вказаний дисахарид був стратегічно включений до композиції, щоб служити осмозахисним засобом, адгезивним засобом після використання композиції, і потенційним джерелом поживних речовин для K49. Зокрема, склад сухих інгредієнтів композиції був наступним: 76-90 % Санінтону (Satintone) 5HB як носій, 1-4 % Ніліну (Nilyn) XL 90 як зв'язуючий засіб і 5-20 % трегалози, як осмозахисний засіб, адгезивний засіб після використання композиції і джерело поживних речовин для K49. Сухі інгредієнти змішують до візуально гомогенного стану у високоякісному ножовому міксері, після чого змішують приблизно з 510 мл 0,1 % (мас./об.) пептонного розчину, 8 що містить 5 % загальної кількості сухої трегалози і конідії K49 з концентрацією 4 x 10 КУО/г вологої суміші на 500 г сухих інгредієнтів. Конідії збирали з пластинок, які містили агар солодового екстракту, за допомогою невеликих аліквот 0,1 % пептонного розчину. Таким чином, конідії включали в гранули вказаної композиції. Контрольні гранули без конідій А. flavus одержували і обробляли, як описано вище. В композиції за даним винаходом можна використовувати різні види глини, окрім кальцинованої каолінової глини, тобто можна використовувати будь-яку глину, що має відповідний розмір частинок, тобто, розмір частинок, порівнянний з розміром організму, який є достатньо малим, щоб не призводити до засмічування у системі пульверизатора. Таким чином, можна використовувати інші можливі силікатні глини і глинисті суміші, наприклад, такі, як бентоніт, каолініт і смектити, в тому числі монтморилоніт і бейделіт. Згадані вище суміші одержували окремо за допомогою чашкового гранулятора (LCI Corp), обладнаного штампом 1,2 мм, або 2,0 мм, і висушували під вакуумом до активності води приблизно 0,30. Гранули розміром 2,0 мм і 1,2 мм позначали як Продукт 1 і Продукт 2, відповідно. Гранули зберігали при температурі 4° C протягом приблизно 330 днів, періодично визначаючи протягом вказаного періоду часу виживання репродуктивних колоній А. flavus шляхом їх вміщення до напівселективних середовищ. Зразки у потрійному повторі гомогенізують у водному агарі (0,2 % мас./об.), використовуючи рівномірне струшування (30 хв, 100 ударів/хв), посерійно розбавляли і розміщували у модифікованих рожевих бенгальських середовищах (MDRB; Horn і Dorner. 1998. Mycologia 90: 767-776). Аналіз композиції з конідіями у гранулах відразу після сушіння показав концентрацію > 3 × 8 10 КУО/г. Спостерігали відносно високий рівень виживання штаму А. flavus K49, оскільки не відбувалася подальша втрата життєздатності мікроорганізмів в наступні 11 місяців зберігання K49 у композиції при 4° C (табл. 1). При цьому, спостерігали зменшення кількості життєздатних репродуктивних колоній грибків після 2 років зберігання тільки на 50 %. Гранули у композиції містять включений засіб біологічного контролю, в даному випадку, конідії K49. При контакті з водою (як описано у Прикладі 5) або іншим водним розчином, гранули диспергуються або розпадаються, і вивільняють засіб біологічного контролю для здійснення відповідної функції. 60 4 UA 101164 C2 Таблиця 1 Виживання штаму А. flavus K49у воднодисперсних гранулах. Після сушіння Зберігання при 4° C протягом 20 днів Зберігання при 4° C протягом 330 днів Зберігання при 4° C протягом 745 днів 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Продукт 1 (2,0 мм ВГ) Продукт 2 (1,2 мм ВГ) Колонієутворюючі одиниці A. flavus 1 г 8 8 3,12±0,35 × 10 3,70±0,10 × 10 2,57±0,15 × 10 8 2,95±0,34 × 10 s 3,90±0,36 × 10 8 3,18±0,21 × 10 8 1,66±0,44 × 10 8 1,49±0,20 × 10 8 Надані дані являють собою середні величини трьох повторів ± стандартне відхилення. ПРИКЛАД 3 Приготування конідій і твердого інокуляту Для одержання інокуляту конідій без композиції вміщують запасні культури на 40 пластинок з картопляно-декстрозним агаром (КДА) та інкубують протягом 5-7 днів при температурі 28° C, 2 1 витримуючи їх протягом 12 годин в освітленому місці (165 мкмоль/м /с ) і протягом 12 годин у темряві. Конідії та міцелій видаляють з пластинки за допомогою водного розчину Твіну 20 (0,2 % мас./об.). Вегетативні грибкові структури витягають із суспензії з конідіями шляхом фільтрації через два шари марлі. Щільність конідій визначають шляхом використання гемоцитометру і 6 здійснюють корекцію до досягнення кінцевої концентрації 4,1 × 10 конідій/мл. Пшеницю використовували як інокулят-носій для інокуляції ґрунту, як описано (Abbas et al. 2006, вище). Зерно пшениці гідратували у воді протягом ночі, сушили і обробляли в автоклаві у поліпропіленових пакетах (1 кг на пакет із 200 мл води) протягом 1 години при 121° C. 2 Початковий інокулят А. flavus являв собою 5-денні культури КДА, ділянка 3 см на пакет, які інкубували при 35° C. Після проходження 48 годин при 35° C колонії на пшениці утворилися повністю. Далі вказаний продукт гомогенізували за допомогою ручного струшування і зберігали при температурі 4° C до використання у випробуваннях в умовах практичної роботи. ПРИКЛАД 4 Випробування в польових умовах з використанням техніки інокуляції за допомогою осьових стрижнів Техніку інокуляції за допомогою осьових стрижнів (Windham et al. 2003. J. Toxicol. - Toxin Rev. 22: 313-325) використовували для визначення відносного росту колоній на кукурудзі шляхом її обробки суспензією з конідіями K49 без композиції в порівнянні з композицією ВГ K49 у 2005 р. в ході випробувань в польових умовах, проведених в Стоунвілі і Елізабет (Stoneville і Elizabeth), Міссісіпі. У Стоунвілі використовували стійкий до гліфосату гібрид кукурудзи (Garst 8270 rr), а у випробуваннях Елізабет використовували гібрид з експресованим геном ендотоксину Bacillus thuringiensis (Agrigold A6333 bt). Кукурудзяні качани інокулювали в день 25 після формування маточок у качані (розвиток ядер зерен). Кукурудзяні качани (100 на одну обробку) інокулювали окремо або суспензією з конідіями в композиції (15 г/л), або суспензією з 6 конідіями без композиції (5 × 10 конідій/мл) на стадії формування маточок у качані з використанням осьового стрижня (три ряди з 12 швейних голок довжиною 100 мм, вмонтованих у дерев'яний брусок, кожна з кінчиком розміром 6 мм).Осьові стрижні занурювали у суспензії з конідіями, і стрижні втискали у качани. З різними проміжками часу після інокуляції за допомогою осьових стрижнів збирали по десять інокульованих качанів на обробку і визначали загальну кількість зерен в інокульованій зоні і кількість заражених зерен, базуючись на підрахунку і візуальній оцінці росту грибків на окремих зернах. Подібний кінцевий рівень росту колоній на кукурудзяних качанах за допомогою штаму K49, введеного як з конідіями в композиції, так і з конідіями без композиції спостерігали на двох ділянках в 2005 р. з використанням техніки інокуляції за допомогою осьових стрижнів (табл. 2). Початкова швидкість росту колоній K49 на кукурудзяних качанах, яку спостерігали на ділянці Стоунвіль (гібрид не-BT), була більшою в порівнянні з ділянкою Елізабет (гібрид BT). Випробування у Стоунвілі проводили на 10 днів раніше випробування Елізабет, і кліматичні умови могли вплинули на швидкість росту колоній. Частота росту колоній А. flavus в не інокульованому контролі на ділянці Стоунвіль була більшою, ніж на ділянці Елізабет. Вказану різницю можна віднести на рахунок використання гібриду BT (ділянка Елізабет), який зменшує 5 UA 101164 C2 5 10 частоту появи такого шкідника, як європейський кукурудзяний метелик (Dowd, B. W. 2003. J. Toxicology-Toxin Review 22: 327-350). На ділянці Елізабет на 5-й і 7-й дні після інокуляції спостерігали більш швидкий ріст колоній на кукурудзяних качанах, інокульованих Продуктом 1, в порівнянні з конідіями без композиції, тоді як на ділянці Стоунвіль обидві композиції на 7-й день після інокуляції показали добрий ріст колоній в порівнянні з конідіями без композиції. Кращий ріст колоній штаму K49 спостерігали при використанні Продукту 1 в порівнянні з Продуктом 2 на ділянці Стоунвіль на 5-й день і на ділянці Елізабет на 9-й день після інокуляції. Не виявлено негативного впливу на композицію і старіння композиції (при зберіганні протягом 20 днів) на ріст колоній конідій K49, а при деяких ранніх датах ріст колоній K49 у композиції був більш агресивним, ніж при використанні конідій без композиції. Базуючись на вказаних попередніх результатах, Продукт 1 (діаметром 2,0 мм ВГ) вибраний для застосування на другий рік перевірки поля. Таблиця 2 Ріст колоній на качанах кукурудзи після інокуляції K49, який використовували у вигляді воднодисперсних гранул або вільних конідій, на двох ділянках вирощування. День 2 Елізабет (BT)* Контроль Продукт 1 Продукт 2 Конідії без композиції LSD (Pr> 0,05) # Стоунвіль (RR) Контроль Продукт 1 Продукт 2 Конідії без композиції День 5 Заражені зерна (%) День 7 День 9 День 12 День 14 20 25 30 35 0c 54,1 a 51,1 a 0,8 c 85,7 a 73,1 a 2,1 b 100,0 a 97,2 a 5,0 b 100,0 a 100,0 a 7,5 b 98,1 a 98,1 a 0 34,4 b 67,6 b 100,0 a 100,0 a 92,0 a 16,2 10,0 4,5 8,2 10,8 0,0 b 0,6 b 0,0 b 0,9 c 80,1 a 37,5 b 5,1 c 98,7 a 98,9 a 9,4 b 93,8 a 94,5 a 6,9 b 98,5 a 96,7 a 23,9 b 99,2 a 93,6 a 17,2 a 69,7 a 85,7 b 91,1 a 96,0 a 96,6 a 14,55 15 0 0 0 12,0 8,9 5,2 14,3 Щодня відбирали середні зразки з десяти повторів. Показники, позначені однаковими літерами, значно не відрізняються при 95 % довірчому інтервалі. BT = гібрид, що містить конструкт BT, RR = гібрид, модифікований щодо резистентності до гліфосату. ПРИКЛАД 5 Випробування в польових умовах з контролю афлатоксину і визначення штаму Вивчення в польових умовах проводили у Стоунвілі, Міссісіпі, у 2006 р. з метою оцінки ефективності використання на листі штаму K49 як біологічного контролю, що не утворює токсинів, з метою зменшення зараження штамами А. flavus, що утворюють афлатоксин, і зменшення зараження афлатоксином. Кукурудзу (DK C69-70RR) висаджували 14 квітня 2006 р. в ґрунт, що містить бурий суглинок типу Dundee, у Стоунвілі, Міссісіпі. При цьому використовували експериментальний дизайн повного блоку за допомогою методу сліпої вибірки, який складається з 6 обробок з повторами по 3 блоки. Кожна експериментальна одиниця складалася з трьох рядів довжиною 9,36 м (шириною 1,06 м), з одним обробленим рядом (25-30 рослин по центру) і двома необробленими буферними рядами. Сім обробок складалися з 1) необробленого контролю; 2) ґрунту, інокульованого інокулятом на пшениці зі штамом A. flavus F3W4 (20 кг/га), що не утворює афлатоксин; 3) ґрунту, інокульованого допомогою композицією K49 на пшениці; 4) ґрунту, інокульованого як допомогою F3W4, так і K49 на пшениці; 5) суспензії гранула K49, оброблених екструзією; і 6) суспензії, що складається із суспензії-свіжозібраних конідій K49 для розпилення. 26 червня (на ранній стадії формування маточок) інокулят на пшениці штаму F3W4, що утворює афлатоксин, і штаму K49, що не утворює токсинів, наносили на відповідні пластинки в кількості 20 кг/га. 30 червня (середня стадія формування маточок) наносили інокуляти у вигляді спрею (обробки 5 і 6), використовуючи ручний пульверизатор. Спрей містив 56 г продукту — композиції, суспендованої у 4 л 0,2 % (мас./об.) розчину Твіну 20, який наносили в кількості ~600 мл на ділянку. Розпилення спрямовували на верхню третину рослин, цілячись на качани. Після 6 UA 101164 C2 5 10 15 20 досягнення фізіологічної зрілості (17 серпня), всі качани на відстані 6 м від центру обробленого ряду збирали вручну, сушили, лущили і подрібнювали. Перелік щільності репродукції Aspergillus і опис штаму оцінювали, використовуючи селекційні середовища. Зразки подрібнених зерен гомогенізували у 0,2 % (мас./об.) водному агарі, посерійно розбавляли і вміщували в агар МДРБ (модифікований дихлорнітроаніліном рожевий бенгальський агар). Кількість колонієутворюючих одиниць (КУО) підраховували через 5 днів після інкубації. Тридцять колоній на ділянку вміщували у ЦД-КДА (КДА з 0,3 % Bциклодекстрином) та інкубували протягом 5 днів у повній темряві при температурі 28° C, їх оцінювали щодо продукування афлатоксину, базуючись на пігментації колоній і зміні кольору після впливу на них парів аміаку (Abbas et al. 2004. Canad. J. Microbiol. 50: 193-199). Всі дані з поля, проби на ріст колоній, зменшення кількості Aspergillus і фенотип токсину, а також зараження афлатоксином проаналізовані за допомогою Системи статистичного аналізу PROC GLM (SAS. 2001. SAS® Proprietary Software Release 8.2, Windows, версія 5.1.2600. SAS Institute Inc. Cary, NC). Розділення середніх значень здійснювали, використовуючи найменшу значущу різницю Фішера. Кількість КУО А. flavus, яка є зменшеною у подрібнених зерен кукурудзи, варіювала в межах log 5,4-6,3 репродукції/г зерна, з найвищим показником зменшення для кукурудзи, обробленої спреєм конідій K49 без композиції (табл. 3). Даний рівень росту колоній є набагато вищим, ніж кількості репродукції А. flavus, що знайдені в кукурудзі в попередніх дослідженнях (Abbas et al. 2006, вище), де зменшення варіювало в межах log 3,4-4,4 КУО/г. Найнижча кількість (4-6 %) штаму, що утворює афлатоксин, знайдена при застосуванні спрею K49 у композиції та без неї (табл. 3). При всіх інших видах обробки спостерігали подібний рівень штамів, що утворюють афлатоксин (50-71 %), і на нього істотною мірою не впливала інокуляція ґрунту як штамом K49, що не утворює токсинів, так і штамом F3W4, що утворює токсини. 25 Таблиця 3 Зменшення штамів A. flavus з кукурудзи при різних видах обробки за допомогою інокуляції. Обробка A. flavus (log10 КУО/г) Без інокуляту Інокулят K49 на пшениці Інокулят F3W4 на пшениці Інокулят F3W4+K49 на пшениці Інокулят F3W4 на пшениці + спрей K49 у композиції Інокулят F3W4 на пшениці + конідії K49 без композиції 5,5 bс 5,7 b 5,7 b 5,6 bс Штами, що утворюють токсини (%) 69 a 52 a 71 a 50 a 5,4 c 4b 6,3 a 6b 0,2 42 Найменша значуща різниця (LSD, рівень Pr > 0,05) 30 35 40 Середні показники для трьох повторень, показники, позначені однаковими літерами значно не відрізняються при 95 % довірчому інтервалі. Співвідношення "штами, що не утворюють токсинів / штами, що утворюють токсини" 24:1, 15:1 і 1:1 визначали за допомогою середньої величини кількості КУО і частоти двох фенотипів для спрею у композиції, спрею без композиції і всіх інших видів обробки, відповідно. Попереднє дослідження демонструє, що ріст колоній K49 на кукурудзяних качанах можна підсилити шляхом інокуляції ґрунту (Abbas et al. 2006, вище); однак, у даному дослідженні вказаний факт не спостерігався (табл. 3). Можливе пояснення для вказаної різниці полягає в тому, що в даному дослідженні інокулят K49 для ґрунту застосовували на середній стадії формування маточок; а у попередньому дослідженні інокулят застосовували на стадії V6 онтогенезу. У дослідженнях бавовни Cotty (вище) виявив, що 67 % А. flavus, взятого з бавовняних коробочок, знаходилися в однаковій вегетаційній групі сумісності, як і введений штам, що не утворює токсинів, при його застосуванні у вигляді інокуляту для ґрунту, в порівнянні з 46 % при застосуванні у вигляді інокуляту у формі спрею і 25 % на контрольних необроблених ділянках. Даний факт показує, що нижчий ступінь колонізації штамом біологічного контролю досягався за допомогою використання спрею у вказаних випробуваннях на полях Аризони. 7 UA 101164 C2 5 10 15 20 25 Низький рівень зменшення А. flavus, що не утворює афлатоксин, на кукурудзі, який одержано при обробці спреєм K49 в композиції або без композиції, показує на очевидну колонізацію, ріст колоній і конкурентне витіснення Aspergillus, що утворює токсини, введеним штамом K49, що не утворює токсинів, при його безпосередньому нанесенні на репродуктивні структури кукурудзи. ПРИКЛАД 6 Визначення афлатоксину і зменшення кількості Aspergillus Концентрацію афлатоксину кількісно визначали, використовуючи комерційні набори ELISA (Neogen Corp, Lansing Ml) увідповідності до досліджень Abbas et al. (2002, 2006, вище). Субсерії подрібнених зерен кукурудзи (20 г) у потрійному повторенні екстрагували у 100 мл метанолу (70 %) протягом 30 хв у високоякісному швидкісному шейкері, і очищали шляхом центрифугування (10 хв, 8000хg), і метанольні екстракти аналізували методом ELISA. Ліміт визначення у даному випробуванні становив 5 нг/г загального афлатоксину. У вказаних випробуваннях в польових умовах спостерігали відносно високий рівень зараження афлатоксином з природного джерела зараження на контрольних необроблених ділянках і на контрольних ділянках, де ґрунт інокулювали штамом F3W4, що утворює афлатоксин, на пшениці. Спостерігали 428 і 635 мкг/кг афлатоксину відповідно, причому мала місце широка варіація серед зразків вказаних двох контрольних обробок (табл. 4). Однак, якщо на ґрунт наносили штам K49, що не утворює токсинів, у вигляді заражених зерен пшениці на ділянках, які були необроблені або оброблені одночасно з інокуляцією ґрунту за допомогою F3W4, то рівні афлатоксину значно знижувалися (P 0,05) 30 35 40 Концентрація афлатоксину (мкг/кг) 428 ab 44 c 635 a 223 be 18 c 21 c 287 Середні показники для трьох повторень, показники, позначені однаковими літерами, значно не відрізняються при 95 % довірчому інтервалі. У попередніх дослідженнях, де K49 вводили шляхом нанесення на ґрунт, зараження кукурудзи афлатоксином зменшувалося на 58-76 % щодо необроблених ділянок, де природний афлатоксин зустрічався рясно (Abbas etal. 2006, вище). Якщо ґрунт інокулювали штамом F3W4, що утворює афлатоксин, то одночасна інокуляція K49 на пшениці зменшувала зараження афлатоксином на 74-95 % щодо концентрацій афлатоксину на ділянках, де ґрунт інокулювали тільки F3W4. В інших дослідженнях кількість афлатоксину зменшувалася на 66 і 87 % протягом двох послідовних років на ділянках з кукурудзою, оброблених сумішами рису в рівних пропорціях, у яких вирощували два різні види колоній Aspergillus, що не утворюють афлатоксин, в порівнянні з рівнями афлатоксину на необроблених ділянках з кукурудзою (Dorner et al. 1999, вище). Щодо відсоткових показників зменшення кількості афлатоксину, наші результати 90 і 65 % узгоджуються з попередніми дослідженнями. Хоча нанесення K49 на ґрунт продемонструвало значне зменшення зараження афлатоксином, концентрації афлатоксину залишилися на вищому рівні, ніж ліміти для використання кукурудзи як продукту харчування або корму. 8 UA 101164 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Обробка кукурудзи за допомогою спрею, що містить суспензію з конідіями K49 як в композиції, так і без композиції, на ділянках, де ґрунт інфікований F3W4, що утворює афлатоксин, приводила до зменшення середньої концентрації афлатоксину приблизно до 615 мкг/кг. Конкретно, безпосереднє нанесення K49 як у композиції, так і без композиції на репродуктивні кукурудзяні структури на ділянках з F3W4 у ґрунті значно (P