Спосіб лікування хронічної серцевої недостатності препаратами з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин

Реферат: Винахід належить до кардіології та клітинної терапії, його застосовують для лікування пацієнтів, хворих на хронічну серцеву недостатність (ХСН) різного ґенезу. Спосіб включає приготування двох препаратів з матеріалу ембріофетального походження. Стовбурові клітини виділені з матеріалу фетуса людини 5-9 тижня гестації і знаходяться у вигляді кріоконсервованих суспензій стовбурових клітин, одна з яких містить стовбурові клітини з фетальної печінки, а друга суспензія містить стовбурові клітини з фетального серця; та щонайменше одне введення вказаних суспензій стовбурових клітин. Причому суспензію стовбурових клітин з фетальної печінки вводять шляхом внутрішньовенно в об'ємі, не меншому за 0,1 мл, з кількістю 6 ядровмісних клітин не менше за 52,05×10 в 1 мл за одне введення, а суспензію стовбурових клітин з фетального серця - підшкірно в об'ємі, не меншому за 0,6 мл, з кількістю клітин не 6 менше за 2,73×10 в 1 мл за одне введення. При цьому вказані суспензії стовбурових клітин вводять одночасно з проведенням стандартної медикаментозної терапії, а перед введенням суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки додатково виконують премедикацію. UA 110531 C2 (12) UA 110531 C2 UA 110531 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі медицини, а саме: до кардіології та клітинної терапії, та може бути використаний при лікуванні пацієнтів, хворих на хронічну серцеву недостатність (ХСН) різноманітного ґенезу шляхом введення препаратів з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин у вигляді суспензій, що містять стовбурові клітини на фоні стандартної терапії. Відомо, що серцево-судинні захворювання займають перше місце серед причин смерті в загальній популяції людей та є однією з основних проблем закладів охорони здоров'я всіх економічно розвинених країн світу [1]. За оцінками Всесвітньої організації охорони здоров'я, в 2012 році від серцево-судинних захворювань померло 17,3 млн. людей, що становило 30 % всіх випадків смерті в світі. Ця проблема різною мірою торкається країн з низьким і високим рівнем доходів. Більше 80 % випадків смерті в країнах з високим прибутком припадає на серцевосудинні захворювання, причому рівень смертності від цих хвороб майже однаковий для жінок і чоловіків. До 2030 року близько 23,6 млн. осіб помиратиме щороку від серцево-судинних захворювань, головним чином, від хвороб серця та інсульту, які залишаються, за прогнозом, єдиними основними причинами смерті [1]. ХСН - це стан, обумовлений недостатньою силою скорочення серцевого м'яза для вигнання крові з лівого шлуночка (ЛШ), внаслідок чого органи і тканини зазнають нестачі кисню та поживних речовин. Кардіоміоцити - клітини міокарду, що вже відмерли, використовуючи тільки стандартну медикаментозну терапію, відновити неможливо [3]. Хворим на ХСН проводять симптоматичну терапію, застосовують спеціальні дефібрилятори [2], але, попри досягнення медичної науки, кількість пацієнтів збільшується з кожним роком. У міжнародних клініко-епідеміологічних дослідженнях показано, що останніми десятиліттями показник виявлення ХСН різко зростає, що пов'язують із "старінням" населення, поліпшенням діагностики і лікування захворювань серцево-судинної системи, які призводять до розвитку ХСН (насамперед, ішемічна хвороба серця (ІХС), інфаркт міокарда, артеріальна гіпертензія). Прогноз при ХСН залишається несприятливим. Летальність при клінічно вираженій ХСН становить 40-66 % на рік, що перевищує летальність, наприклад, від бронхогенного раку легень і раку передміхурової залози й корелює зі ступенем вираження ХСН, становлячи при серцевій недостатності (СН) IV функціонального класу (ФК) 50 %, при III ФК - 40% і II ФК - 30 % на рік. ХСН може ускладнювати перебіг будь-якого захворювання серця, однак найчастішими причинами її розвитку є ІХС й артеріальна гіпертензія. Згідно із сучасною нейрогуморальною теорією, ХСН розвивається за єдиними патофізіологічними законами, незалежно від етіології ушкодження міокарда. При ХСН спостерігаються порушення основних функцій серця: скорочення (систолічна дисфункція) і/або розслаблення (діастолічна дисфункція). Основними причинами ХСН з переважно систолічною дисфункцією шлуночків є: 1) вогнищеві ураження міокарда зі зменшенням маси життєздатного міокарда: інфаркт міокарда, постінфарктний кардіосклероз і дифузний кардіосклероз; 2) дифузні ураження міокарда: міокардити й значна частина кардіоміопатій, у тому числі ятрогенних. Головними причинами ХСН з первинним розвитком діастолічної дисфункції є захворювання, що супроводжуються порушенням наповнення шлуночків серця: 1) стеноз лівого або правого передсердно-шлуночкових отворів; 2) констриктивний і ексудативний перикардити, кіста або пухлина перикарда; 3) захворювання з підвищеною жорсткістю камери й (або) міокарда шлуночків унаслідок його гіпертрофії, поширеного фіброзу (склерозу) або інфільтративного ураження: артеріальна гіпертензія, рестриктивна кардіоміопатія (ендоміокардіальний фіброз), амілоїдоз та інші інфільтративні ураження міокарда, фіброеластоз, деякі випадки ІХС [5]. Отже, постійне збільшення частоти смертності внаслідок серцево-судинних захворювань в загальній популяції стимулює дослідників світу до розробки принципово нових, доступних та ефективних методів лікування хворих з ХСН. Новим напрямом в лікуванні цієї проблеми може бути застосування в комплексній терапії суспензій, що містять фетальні стовбурові клітини (ФСК). За даними деяких поодиноких досліджень, ФСК мають змогу диференціюватися в кардіоміоцити, кількість яких при ХСН зменшена [4]. Внаслідок цього збільшується маса м'язової тканини міокарда, покращується скоротлива властивість міокарда [6]. Причому скоротлива функція серця залежить від кількості функціонуючих кардіоміоцитів, які електромеханічно інтегровані між собою спеціалізованими контактами в ділянці вставкових дисків, в складі яких є fascia adherens (зона прикріплення міофібрил), щільові контакти, десмосоми [5]. Десмосоми і fascia adherens виконують механічну функцію, тобто фіксують кардіоміоцити між собою, а щільовим контактам відводиться роль провідника електричних імпульсів. Електромеханічна інтеграція кардіоміоцитів - це основа скоординованої активності 1 UA 110531 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 міокарда, за рахунок якої серцевий м'яз працює, як цілісна одиниця. Виходячи з цього, успіх введення кардіоміоцитів визначається тим, чи зможуть вони взаємодіяти з м'язовими клітинами хворого та мікрооточенням [3]. Відомий спосіб лікування некомпенсованої хронічної серцевої недостатності, що включає призначення інгібіторів ангіотензинперетворювального ферменту, бета-блокаторів, діуретиків, серцевих глікозидів та антиоксидантів (деклараційний патент України на корисну модель № 13991, дата публікації - 17.04.2006 р., кл. МПК А61Р 9/00). Причому як антиоксидант призначають корвітин. Зазначений спосіб лікування забезпечує швидкий антиоксидантний ефект при загостренні ХСН. Недоліком відомого способу є недостатня ефективність лікування ХСН, обумовлена недостатнім впливом на відновлення скоротливої здатності міокарда. Найбільш близьким до способу лікування ХСН, що заявляється, є спосіб лікування ХСН, що включає приготування препаратів у вигляді суспензії стовбурових клітин та введення вказаних суспензій кріоконсервованих стовбурових клітин в нативну і/або стенозовану коронарну артерію і/ або аортокоронарний шунт в фізіологічному розчині з концентрацією клітинних елементів 1-15 млн. клітин на 1 кг ваги хворого (патент Російської Федерації на винахід № 2299073, дата публікації - 20.05.2007 р., кл. МПК: А61K 35/48, А61Р9/04). При цьому інтраміокардіальне введення клітинної суспензії здійснюють під час традиційних хірургічних втручань на відкритому серці. Причому як стовбурові клітини для приготування суспензії використовують мезенхімальні стовбурові клітини (МСК), виділені із фетального чи донорського матеріалу. Як фетальний матеріал використовують тканини на строках гестації: печінка 5-8 тижнів, тимус 18-20 тижнів, кістковий мозок 17-20 тижнів, підшкірна жирова тканина 17-19 тижнів. Як донорський матеріал використовують кістковий мозок, підшкірну жирову тканину, тимус (у дітей 6 років), що забирають у хворого для наступної аутотрансплантації. Зазначений спосіб дозволяє комплексно впливати на міокард хворого з ХСН, зокрема, при проведенні традиційних хірургічних втручань на відкритому серці. Недоліком відомого способу є висока складність введення клітинних суспензій, особливо при хірургічному втручанні, що може зумовити побічні ефекти та ускладнення, а отже, обмежує його застосування. Задачею цього винаходу є удосконалення способу лікування ХСН препаратами з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин, в якому за рахунок запропонованої послідовності проведення лікування з використанням суспензій підібраного складу, забезпечується висока ефективність лікування хворих з ХСН, обумовленою різким зниженням скоротливої здатності міокарда. Це забезпечує поліпшення скоротливої функції серця та поліпшення регуляції процесів ремоделювання ЛШ шляхом заміщення клітин, що не здатні скорочуватися, некротичних або склерозованих тканин без необхідності підбору донора за антигенами гістосумісності. Крім того, поліпшується систолічна функція міокарда ЛШ шляхом збільшення кількості скоротливих клітинних елементів в міокарді та/або шляхом підвищення функціонального резерву кардіоміоцитів реципієнта за рахунок стимуляції в них процесів внутрішньоклітинної регенерації. Поставлена задача вирішується запропонованим способом лікування ХСН препаратами з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин, що включає приготування препаратів у вигляді кріоконсервованої суспензії, яка містить стовбурові клітини, та щонайменше одне введення вказаних кріоконсервованих суспензій стовбурових клітин, в якому виготовляють два препарати у вигляді кріоконсервованої суспензії стовбурових клітин, виділених з матеріалу фетуса людини 5-9 тижня гестації, одна з яких містить стовбурові клітини з фетальної печінки, а друга суспензія містить стовбурові клітини з фетального серця, причому суспензію стовбурових клітин з фетальної печінки вводять шляхом внутрішньовенного введення 6 в об'ємі, не меншому за 0,1 мл, з кількістю ядровмісних клітин не менше за 52,05×10 в 1 мл за одне введення, а суспензію стовбурових клітин з фетального серця вводять підшкірно в об'ємі, 6 не меншому за 0,6 мл з кількістю клітин не менше за 2,73×10 в 1 мл за одне введення, причому вказані суспензії стовбурових клітин вводять одночасно з проведенням стандартної медикаментозної терапії, а перед введенням суспензії стовбурових клітин фетальної печінки додатково виконують премедикацію. Причому як стандартну медикаментозну терапію призначають інгібітори ангіотензинперетворюючого ферменту і/або антагоністи рецепторів до ангіотензину II, антагоністи рецепторів до альдостерону, сечогінні, бета адреноблокатори, серцеві глікозиди, антиагреганти або непрямі антикоагулянти. Суспензію стовбурових клітин з фетальної печінки, як правило, вводять разом із фізіологічним розчином натрію хлориду зі швидкістю 20-40 крапель за хвилину. 2 UA 110531 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 При цьому премедикацію виконують шляхом внутрішньовенного введення 10 мг димедролу і 30 мг преднізолону. Перед введенням суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки та суспензії стовбурових клітин з фетального серця додатково виконують клінічне, лабораторне, та інструментальне обстеження стану хворого. Перед проведенням лікування та через 1, 3 та 6 місяців після введення суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки та суспензії стовбурових клітини з фетального серця здійснюють контроль активності патологічного процесу за клінічними, лабораторними та інструментальними показниками. Ми встановили, що за рахунок введення принаймні двох суспензій стовбурових клітин ембріофетального походження, а саме внутрішньовенного введення суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки людини 5-9 тижня гестації в об'ємі, не меншому за 0,1 мл, з кількістю 6 ядровмісних клітин не менше за 52,05×10 в 1 мл за одне введення та підшкірного введення суспензії стовбурових клітин з фетального серця людини 5-9 тижня гестації в об'ємі, не 6 меншому за 0,6 мл, з кількістю клітин не менше за 2,73×10 в 1 мл за одне введення, забезпечується цілеспрямований вплив на морфо-функціональний стан ЛШ серця, що сприяє поліпшенню скоротливої функції серця та регуляції процесів ремоделювання ЛШ (за даними ехокардіографічного (ЕхоКГ) дослідження), шляхом заміщення клітин, що не здатні скорочуватися, некротичних або склерозованих тканин. Причому відновлення функції міокарду може досягатися шляхом збільшення кількості скоротливих клітинних елементів в міокарді та/або шляхом підвищення функціонального резерву кардіоміоцитів реципієнта за рахунок стимуляції в них процесів внутрішньоклітинної регенерації. При цьому виключається необхідність підбору донора за антигенами гістосумісності та забезпечується можливість введення суспензії стовбурових клітин фетальної печінки повторно. Крім того, проведення премедикації перед введенням суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки дозволяє запобігти виникненню алергічних реакцій та запобігти відторгненню стовбурових клітин з фетальної печінки організмом хворих під час проведення лікування. Причому, введення вказаних двох суспензій стовбурових клітин одночасно з проведенням стандартної медикаментозної терапії дозволяє підсилити ефективність лікування ХСН, в результаті чого зменшуються клінічні прояви ХСН, та поліпшуються показники при додаткових методах дослідження. При цьому використання саме фетальної печінки та фетального серця для отримання стовбурових клітин з метою приготування лікувальних препаратів у вигляді суспензій обумовлено їх пластичністю, зокрема, здатністю таких клітин зазнавати змін та диференціації у відповідь на навколишній вплив або відповідно до їх внутрішньої програми. Відомо, що клітини ембріофетального походження здатні до росту, розмноження, диференціації, міграції та встановлення зв'язків з іншими клітинами. Порівняно з клітинами зрілих тканин, вони мають кращу здатність до проліферації. Їх введення є ефективнішим також з огляду на утворення великої кількості ростових факторів. Клітини фетальної печінки можуть виробляти значну кількість стимулюючих речовин, таких як ангіогенний і нейротрофічний фактори, що сприяють їх виживанню та росту, проліферації, диференціації та можуть стимулювати регенерацію за рахунок оточуючих клітин хазяїна. Крім цього, клітини фетальної печінки мають здатність виживати при нижчому рівні кисню, ніж їх повністю диференційовані аналоги, що робить їх стійкими до ішемічного ушкодження як під час маніпуляцій in vitro, так і після внутрішньовенного введення. Проліферуючі або незрілі клітини фетальної печінки переважно не мають довгих відростків або сильної міжклітинної адгезії і, таким чином, зазнають менших пошкоджень під час приготування суспензії клітин. Ці властивості дозволяють вводити клітини фетальної печінки шляхом внутрішньовенної ін'єкції суспензії [2]. Вказані характеристики можуть пояснити і підвищене виживання клітин і тканин фетальної печінки в порівнянні з дорослими після кріоконсервації. Спосіб комплексного лікування ХСН препаратами з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин здійснюють таким чином. Виготовляють два препарати у вигляді суспензії стовбурових клітин, одна з яких містить стовбурові клітини з фетальної печінки, а друга суспензія містить стовбурові клітини з фетального серця. Для цього в умовах операційної, з дотриманням правил асептики та антисептики, одержують ембріофетальний матеріал, а саме тканину печінки, тканину серця фетусів людини від 5 до 9 тижнів гестації, які загинули внаслідок медичного аборту в випадках, коли вагітність переривали за соціальними показниками, при відсутності патології розвитку чи інфікованості фетуса та письмової інформованої згоди жінки - донора. Далі вилучені тканини ембріофетального походження поміщають в стерильне транспортне середовище розчину 3 UA 110531 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Хенкса з антибіотиком. В стерильних умовах тканини сепарують та гомогенізують в розчині Хенкса. Отриману суспензію клітин піддають фільтрації та кріоконсервують. Як кріопротектор використовують диметилсульфоксид. Далі готову клітинну суспензію розливають в кріопробірки об'ємом 0,3-1,0 мл. Кріоконсервування суспензії стовбурових клітин проводять у камері програмного заморожувача за визначеною програмою. Таке кріоконсервування забезпечує практично необмежене довгострокове зберігання вказаної суспензії, дозволяє протягом необхідного часу дослідити препарат у вигляді клітинної суспензії на бактеріологічну та вірусологічну безпеку, визначити якісні та кількісні показники клітинної суспензії, сформувати банк клітинних суспензій стовбурових клітин, відповідно до визначених вимог до клітинного препарату. При формуванні банку клітинних суспензій з тканин ембріофетального походження для лікування хворих на ХСН суспензія стовбурових клітин з фетальної печінки та суспензія стовбурових клітин з фетального серця повинна мати такі параметри: вміст ядровмісних клітин (підраховують загальну кількість ядровмісних клітин, в одиниці об'єму за допомогою клітинного аналізатора чи візуально під мікроскопом в лічильній камері) повинен становити не менше за 6 52,05×10 в 0,1 мл суспензії для клітин з фетальної печінки за одне введення, та не менше за 6 2,73×10 в 1 мл за одне введення для клітин з фетального серця; вміст живих клітин після кріоконсервування - не менше 70 %. Суспензії, що містять стовбурові клітини з фетальної печінки та стовбурові клітини з фетального серця, зберігають в кріобанку в рідкому азоті при температурі -196 °С. Пробірки, що містять суспензію кріоконсервованих стовбурових клітин з фетальної печінки та суспензію кріоконсервованих стовбурових клітин з фетального серця, безпосередньо перед введенням виймають з рідкого азоту, занурюють у водяну баню при температурі +37 °С та витримують до появи рідкої фази. Подальші маніпуляції проводять при кімнатній температурі з суворим дотриманням правил асептики. Час перебування розмороженої суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки та розмороженої суспензії стовбурових клітин з фетального серця при кімнатній температурі не повинен перевищувати 10 хвилин. При цьому перед введенням здійснюють додатковий контроль якості суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки та суспензії стовбурових клітин з фетального серця, зокрема, проводять мікроскопію та здійснюють підрахунок кількості життєздатних клітин за допомогою автоматичного клітинного аналізатора. Перед початком проведення комплексного лікування хворих на ХСН шляхом введення суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки та суспензії стовбурових клітин з фетального серця виконують клінічне, лабораторне та інструментальне обстеження стану хворого та здійснюють контроль активності патологічного процесу за отриманими результатами. Одночасно з введенням суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки та введенням суспензії стовбурових клітин з фетального серця проводять стандарту медикаментозну терапію, що включає призначення інгібіторів ангіотензинперетворюючого ферменту і/або антагоністів рецепторів до ангіотензину II, антагоністів рецепторів до альдостерону, сечогінних, бета адреноблокаторів, серцевих глікозидів, антиагрегантів або непрямих антикоагулянтів. Далі перед введенням суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки з метою запобігання виникненню алергічних реакцій під час лікування виконують премедикацію шляхом внутрішньовенного введення 10 мг димедролу і 30 мг преднізолону через систему для переливання крові. Після чого, разом із фізіологічним розчином натрію хлориду, вводять суспензію стовбурових клітин з фетальної печінки шляхом внутрішньовенного введення зі швидкістю 20-40 крапель за хвилину. При цьому об'єм лікувальної дози суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки для одного введення підбирають індивідуально, але не менше за 0,1 6 мл, з кількістю ядровмісних клітин не менше за 52,05×10 в 1 мл за одне введення. Суспензію стовбурових клітини з фетального серця вводять підшкірно в об'ємі, не меншому за 0,6 мл, з 6 кількістю клітин не менше за 2,73×10 в 1 мл за одне введення. Така кількість клітин забезпечує високу ефективності лікування хворих на ХСН. Після введення суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки та суспензії стовбурових клітин з фетального серця хворий знаходиться під спостереженням. Причому, через 1 місяць після проведення лікування, а потім кожні три місяці здійснюють контроль проявів патологічного процесу за клінічними, лабораторними та інструментальними показниками. При цьому точки спостереження вибирають, згідно з протоколом клінічного застосування препарату з матеріалу ембріофетального походження та виділених з нього клітин, розробленим на основі клінічного досвіду. Ефективність лікування хворих з ХСН оцінюють на основі динамічних змін загальноклінічного обстеження, фізичних можливостей хворих, що вивчались за величиною індексу 4 UA 110531 C2 5 10 15 20 активності DASI (The Duke Activity Status Index), проведеної електрокардіографії (ЕКГ) в 12 відведеннях, допплер ЕхоКГ, визначеної відстані 6-ти хвилинної ходи, проведеного вимірювання мозкового натрійуретичного пептиду (NT-proBNP), що проводили всім хворим перед лікуванням та через 1, 3 та 6 місяців після лікування. З 2012 по 2013 роки у клініці клітинної терапії, відповідно до способу комплексного лікування хворих з ХСН, що заявляється, було проліковано 167 хворих з кардіальною патологією, що супроводжувалась ХСН. З них було відібрано 20, що увійшли до основної групи (ОГ). Розподіл хворих був наступним: 20 пацієнтів основної групи (ОГ), які отримували лікування суспензією стовбурових клітин з фетальної печінки та суспензією стовбурових клітин з фетального серця на тлі стандартної медикаментозної терапії, та контрольна група (КГ) - 20 осіб, пролікованих лише стандартною медикаментозною терапією. У всіх хворих ОГ спостерігався синдром раннього післятрансфузійного покращення: відбувалося поліпшення загального стану, зменшення задишки, серцебиття, набряків нижніх кінцівок. Вже через 3 місяці спостерігалось покращення показників, які досліджувались: збільшення індексу DASI та збільшення толерантності до фізичного навантаження (6-ти хвилинний тест), збільшення фракції викиду (ФВ) та зменшення КДО (кінцево-діастолічного об'єму) ЛШ, а також відбулися зміни лабораторних показників - зменшився рівень NT-proBNP (таблиця 1). Після введення суспензії стовбурових клітин з фетальної печінки та суспензії стовбурових клітин з фетального серця в жодному випадку не спостерігались ускладнення чи побічні явища, в тому числі реакція «трансплантат проти хазяїна» (РТПГ). Таблиця 1 Зміни показників комплексної клінічної оцінки та морфо-функціонального стану міокарду ЛШ у хворих із ХСН контрольної та основної груп Дослідження ОГ до лікування Індекс DASI, 15,2±1,85 бали М±m 6-хвилинний 30,0±4,54 тест, м М±m К до лікування ОГ через 1 міс. 15,4±1,48 23,5±3,41* 16,82±0,38*# 24,8±3,37* 20,99±1,20* 31,5±4,86 ФВ ЛШ, % 30 36,1±2,88 КДО, мл 25 36,8±2, 94 222,8 ±19,3 225,1±17,6 КГ через 1 ОГ через 3 КГ через 3 міс. міс. міс. ОГ через 6 міс. КГ через 6 міс. 25,3±3,40* 21,54±0,26*# 167,4±6,24** 325,0±13,16 213,75±10,25 375,0±13,61* 285,25±7,04** ## ** **## * ## 40,23±0,33*$ 37,1±2,87 35,89±0,26 40,5±2,39* 38,82±0,25 44,5±1,62*$ # 177,1±11,3** 200,37±1,93** 205,3±10,1 212,64±3,53 192,7±7,6 204,99±3,70 $ $ 220,5±7,38** Примітка: *- р