Біспецифічне двовалентне антитіло анти-vegf/анти-ang-2

Реферат: Винахід належить до біспецифічного двовалентного антитіла проти фактора росту ендотелію судин людини (VEGF/VEGF-A) і проти ангіопоетину-2 людини (ANG-2), способу його отримання, фармацевтичної композиції, що містить це антитіло, і до його застосування. UA 110932 C2 (12) UA 110932 C2 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід належить до біспецифічних, двовалентних антитіл проти фактора росту ендотелію судин людини (VEGF / VEGF-A) і проти ангіопоетіна-2 людини (ANG-2), до способів їх отримання, до фармацевтичних композицій, що містять ці антитіла, і до їх застосувань. Попередній рівень техніки Ангіогенез залучений в патогенез ряду розладів, які включають солідні пухлини, внутрішньоочні неоваскулярні синдроми, такі як проліферативні ретинопатії або вікова макулярна дегенерація (ВМД), ревматоїдний артрит і псоріаз (Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M., et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239; і Garner, A., Vascular diseases, in: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G. K. (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710). У разі солідних пухлин неоваскуляризація дає можливість пухлинним клітинам набувати перевагу зростання і проліферативну автономію в порівнянні з нормальними клітинами. Відповідно, спостерігається кореляція між щільністю мікросудин в зрізах пухлин і виживанням пацієнта, як при раку молочної залози, так і при декількох інших пухлинах (Weidner, N., et al., N Engl J Med. 324 (1991) 1-8; Horak, E.R., et al., Lancet 340 (1992) 1120-1124; і Macchiarini, P., et al., Lancet 340 (1992) 145-146). VEGF і антитіла проти VEGF Фактор росту ендотелію судин людини (VEGF / VEGF-A) (SEQ ID No: 105) описаний, наприклад, у Leung, DW, et al., Science 246 (1989) 1306-9; Keck, PJ, et al., Science 246 (1989) 1309-12 і Connolly, DT, et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24. VEGF залучений в регуляцію нормального і аномального ангіогенезу і неоваскуляризації, асоційовану з пухлинами та внутрішньоочними розладами (Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. +18 (1997) 4-25; Berkman, RA, et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, LF, et al., Human Pathol. +26 (1995) 86-91; Brown, LF, et al., Cancer Res. +53 (1993) 4727-4735; Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934; та Dvorak, HF, et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039). VEGF являє собою гомодімерний глікопротеїн, який виділено з декількох джерел. VEGF проявляє високо специфічну мітогенну активність до ендотеліальних клітин. VEGF має важливі регуляторні функції у формуванні нових кровоносних судин в процесі ембріонального васкулогенеза і в ангіогенезі протягом дорослого життя (Carmeliet, P., et al., Nature, 380 (1996) 435-439; Ferrara, N., et al., Nature, 380 (1996) 439442; огляд в Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25). Значимість ролі, яку відіграє VEGF, продемонстрована в дослідженнях, які показують, що інактивація єдиної алелі VEGF призводить в результаті до ембріональної летальності внаслідок нездатності до розвитку судинної мережі (Carmeliet, P., et al., Nature, 380 (1996) 435-439; Ferrara, N., et al., Nature, 380 (1996) 439-442). Крім того, VEGF має сильну хемоаттрактантну активність щодо моноцитів, можуть індукувати активатор плазміногену та інгібітор активатора плазміногену в ендотеліальних клітинах, а також можуть індукувати проникність мікросудин. У зв'язку з останньою активністю іноді на нього посилаються як на фактор проникності судин (VPF). Зроблено огляд виділення і властивостей VEGF; див. Ferrara, N., et al., J. Cellular Biochem., 47 (1991) 211-218 і Connolly, DT, J. Cellular Biochem., 47 (1991) 219-223. Альтернативний сплайсинг мРНК єдиного гена VEGF утворюють п'ять ізоформ VEGF. Нейтралізуючі антитіла проти VEGF придушують ріст ряду пухлинних клітинних ліній людини у мишей (Kim, KJ, et al., Nature 362 (1993) 841-844; Warren, SR, et al., J. Clin. Invest. +95 (1995) 1789-1797; Borgstrom, P., et al., Cancer Res. +56 (1996) 4032-4039; та Melnyk, O., et al., Cancer Res. 56 (1996) 921-924). WO 94/10202, WO 98/45332, WO 2005/00900 і WO 00/35956 відносяться до антитіл проти VEGF. Гуманізоване моноклональне антитіло бевацизумаб (наявне у продажу під торговою назвою Авастин ®) являє собою антитіло проти VEGF, вживане в протипухлинної терапії (WO 98/45331). Ранібізумаб (торгова назва Луцентіс ®) являє собою фрагмент моноклонального антитіла, що має походження від того ж батьківського антитіла, що і бевацизумаб (Авастин). Він набагато менше батьківської молекули і має дозрілу спорідненість, що забезпечує більш сильне зв'язування з VEGF-A (WO 98/45331). Він є антиангіогенним, що схвалено для лікування "вологого" типу вікової макулярної дегенерації (ВМД), поширеної форми вікової втрати зору. Іншим антитілом проти VEGF є, наприклад, HuMab G6-31, описане, наприклад, в US 2007/0141065. ANG-2 та антитіла проти ANG-2 Ангіопоетін-2 людини (ANG-2) (альтернативно скорочений як ANGPT2 або ANG2) (SEQ ID No: 106) описаний в Maisonpierre, PC, et al, Science 277 (1997) 55-60 і Cheung, AH, et al., Genomics 48 (1998) 389-91. Ангіопоетіни-1 і -2 (ANG-1 (SEQ ID No: 107) і ANG-2 (SEQ ID No: 106)) були відкриті як ліганди до Tie, сімейству тирозинкіназ, які селективно експресуються всередині ендотелію судин. Yancopoulos, GD, et al., Nature 407 (2000) 242-48. В даний час існує 1 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 чотири точно визначених члена сімейства ангіопоетинів. Ангіопоетин-3 і -4 (Ang-3 і Ang-4) можуть являти собою широко діверговані копії одного і того ж генного локусу у миші і людини. Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I., et al., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28. ANG-1 і ANG-2 були початково ідентифіковані в експериментах на тканинних культурах як агоніст і антагоніст, відповідно (див. для ANG-1: Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69; та для ANG-2: Maisonpierre, PC, et al., Science 277 (1997) 55-60). Всі відомі ангіопоетини зв'язуються, насамперед, з Tie2, і обидва Ang-1 і -2 зв'язуються з Tie2 зі спорідненістю 3 нМ (Kd). Maisonpierre, PC, et al., Science 277 (1997) 55-60. Було показано, що Ang-1 підтримує виживання EC і стимулює цілісність ендотелію, Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69; Kwak, HJ, et al., FEBS Lett 448 (1999) 249-53; Suri, C., et al., Science 282 (1998) 468-71; Thurston, G., et al., Science 286 (1999) 2511-2514; Thurston, G., et al., Nat. Med. 6 (2000) 460-63, тоді як ANG-2 мав протилежний ефект і стимулював дестабілізацію і регресію кровоносних судин у відсутність чинників виживання VEGF або основного фактора росту фібробластів. Maisonpierre, PC, et al., Science 277 (1997) 55-60. Однак багато досліджень функції ANG-2 дозволили припустити більш складну ситуацію. ANG-2 може бути комплексним регулятором ремоделювання судин, який грає роль як в спрутінгу судин, так і в регресії судин. На підтвердження таких ролей для ANG-2, експресійні аналізи виявили, що ANG-2 швидко індукується, разом з VEGF, в моделях ангіогенного спрутінга у дорослих, тоді як ANG-2 індукується у відсутність VEGF в моделях васкулярної регресії. Holash, J., et al., Science 284 (1999) 1994-98; Holash, J., et al., Oncogene 18 (1999) 535662. Відповідно до контекстно-залежної ролі, ANG-2 специфічно зв'язується з одним і тим же рецептором ендотеліальної специфічності, Tie-2, який активується Ang-1, але має контекстнозалежні ефекти на його активацію. Maisonpierre, PC, et al., Science 277 (1997) 55-60. Аналізи ангіогенезу рогівки показали, що і ANG-1, і ANG-2 мають подібні ефекти, діючи синергічно з VEGF, по стимуляції росту нових кровоносних судин. Asahara, T., et al., Circ. Res. 83 (1998) 233-40. Питання про можливість того, що існує дозозалежна ендотеліальна відповідь, було викликане в результаті спостереження, що in vitro при високій концентрації ANG-2 може також бути проангіогенним. Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52. При високій концентрації ANG-2 діє як фактор виживання апоптозу для ендотеліальних клітин у процесі апоптозу, обумовленого сироватковим голодуванням, за допомогою активації Tie2 через біохімічний шлях кінази PI-3 і Akt. Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52. Інші експерименти in vitro дозволили припустити, що під час пролонгованої дії ефекти ANG-2 можуть зазнавати поступовий зсув від ефекту антагоніста до ефекту агоніста Tie2, і в більш пізні моменти часу вони можуть вносити безпосередній внесок у формування судинної трубки і стабілізації нової кровоносної судини. Teichert-Kuliszewska, K., et al., Cardiovasc. Res. 49 (2001) 659-70. Крім того, якщо EC культивували на фібриновому гелі, активацію Tie2 за рахунок ANG-2 також спостерігали, що, можливо, припускає, що дія ANG-2 може залежати від стадії диференціації EC. Teichert-Kuliszewska, K., et al., Cardiovasc. Res. 49 (2001) 659-70. В EC мікросудин, культивованих в тривимірному колагеновому гелі, ANG-2 також може індукувати активацію Tie2 і стимулювати утворення капілляроподобних структур. Mochizuki, Y., et al., J. Cell. Sci. 115 (2002) 175-83. Використання 3-D сферичної спільної культури в якості in-vitro моделі дозрівання кровоносних судин продемонструвало, що прямий контакт між EC та мезенхімними клітинами знищує реактивність щодо VEGF, тоді як присутність VEGF і ANG-2 індукує спрутінг. Korff, T., et al., Faseb J. 15 (2001) 447-57. Автори Etoh, T.H. et al. продемонстрували, що в EC, які конститутивно експресують Tie2, експресія MMP-1, -9 І u-PA зазнавала сильну понижувальну регуляцію ANG-2 в присутності VEGF. Etoh, T., et al., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53. На моделі in vivo зрачкової перетинки Lobov, IB et al. показали, що ANG2 в присутності ендогенного VEGF стимулює швидке збільшення діаметра капіляра, ремоделювання базальної пластинки, проліферацію та міграцію ендотеліальних клітин, а також стимулює спрутінг нових кровоносних судин. Lobov, I.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 11205-10. Навпаки, ANG-2 стимулює загибель ендотеліальних клітин і регресію судин без ендогенного VEGF. Lobov, I.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 11205-10. Подібним чином, в моделі пухлини in vivo автори Vajkoczy, P., et al. продемонстрували, що багатоклітинні агрегати ініціюють ріст кровоносних судин шляхом ангіогенного спрутінга за допомогою одночасної експресії VEGFR-2 і ANG-2 ендотелієм господаря і пухлини. Vajkoczy, P., et al., J. Clin. Invest. 109 (2002) 777-85. Дана модель проілюструвала, що встановлена мережа мікросудин зростаючих пухлин характеризується безперервним ремоделюванням, імовірно опосередкованим експресією VEGF і ANG-2 (Vajkoczy, P., et al., J. Clin. Invest. 109 (2002) 77785). Дослідження Tie-2 і ангіопоетіна-1 на нокаут-мишах показують подібні фенотипи і дозволяють припустити, що стимульоване ангіопоетином-1 фосфорилювання Tie-2 2 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 опосередковує ремоделювання і стабілізацію судини що розвивається, стимулюючи дозрівання кровоносної судини в процесі ангіогенезу, і збереження клітинної адгезії, підтримуваної ендотеліальними клітинами (Dumont, DJ, et al., Genes & Development, 8 (1994) 1897-1909; Sato, TN, Nature, 376 (1995) 70-74; (Thurston, G., et al., Nature Medicine 6 (2000) 460-463). Вважають, що роль ангіопоетіна-1 консервативна у дорослих, де він експресується широко і конститутивно (Hanahan, D., Science, 277 (1997) 48-50; Zagzag, D., et al., Exp Neurology 159 (1999) 391-400). Навпаки, експресія ангіопоетину-2, в основному, обмежена сайтами ремоделювання судин, де, як вважають, вона блокує конститутивну функцію ангіопоетину-1 по стабілізації або дозрівання, що дає можливість кровоносним судинам повернутися в пластичний стан, який може бути більш реактивним на сигнали спрутінга, або залишатися в ньому (Hanahan, D., 1997; Holash, J., et al., Oncogene 18 (199) 5356-62; Maisonpierre, PC, 1997). У дослідженнях експресії ангіопоетину-2 при патологічному ангіогенезі виявлено, що багато типів пухлин проявляють експресію ангіопоетину-2 кровоносних судин (Maisonpierre, PC, et al., Science 277 (1997) 55-60). Функціональні дослідження дозволяють припустити, що ангіопоетін-2 залучений в пухлинний ангіогенез, і пов'язують гіперекспресію ангіопоетину-2 з підвищеним пухлинним ростом у мишачою моделі ксенотрансплантата (Ahmad, SA, et al., Cancer Res., 61 (2001) 1255-1259). Інші дослідження пов'язують гіперекспресію ангіопоетину-2 з гіперваскулярністю пухлини (Etoh, T., et al., Cancer Res. +61 (2001) 2145-53; Tanaka, F., et al., Cancer Res. +62 (2002) 7124-7129). В останні роки ангіопоетін-1, ангіопоетін-2 і / або Tie-2 запропоновані в якості можливих протиракових терапевтичних мішеней. Наприклад, в кожному з US 6166185, US 5650490 і US 5814464 розкриті антитіла проти ліганда і рецептора Tie-2. У дослідженнях з використанням розчинного Tie-2 повідомляли про зниження числа і розміру пухлин у гризунів (Lin, 1997; Lin 1998). Автори Siemeister, G., et al., Cancer Res. 59:3 (1999) 3185-91 створили лінії клітин меланоми людини, що експресують позаклітинний домен Tie-2, ін'єктували їх бестімусним мишам і повідомили, що розчинний Tie-2 призводить в результаті до значимого інгібування пухлинного росту і пухлинного ангіогенезу. З урахуванням того, що і ангіопоетін-1, і ангіопоетін-2 зв'язується з Tie-2, з цих досліджень незрозуміло, чи буде ангіопоетін-1, ангіопоетін-2 або Tie-2 привабливою мішенню для протиракової терапії. Однак вважають, що ефективна терапія проти ангіопоетину-2 корисна при лікуванні захворювань, таких як рак, при яких прогресування залежить від аберантного ангіогенезу, де блокування цього процесу може привести до запобігання прогресивного розвитку захворювання (Folkman, J., Nature Medicine. 1 (1995) 27-31). Крім того, деякі групи повідомили про застосування антитіл і пептидів, які зв'язуються з ангіопоетином-2. Див, наприклад, US 6166185 і US 2003/10124129. WO 03/030833, WO 2006/068953, WO 03/057134 або US 2006/0122370. Дослідження ефекту осередкової експресії ангіопоетину-2 показало, що антагонізація сигналу ангіопоетину-1/Tie-2 послаблює жорстку структуру судин, піддаючи за допомогою цього EC впливу активуючих сигналів від індукторів ангіогенезу, наприклад, VEGF (Hanahan, D., Science, 277 (1997) 48-50). Цей проангіогенний ефект, що є результатом інгібування ангіопоетину-1, вказує на те, що терапія проти ангіотензину-1 не буде ефективною протираковою терапією. ANG-2 експресується в процесі розвитку в сайтах, де відбувається ремоделювання кровоносних судин. Maisonpierre, PC, et al., Science 277 (1997) 55-60. У дорослих індивідуумів експресія ANG-2 обмежена сайтами ремоделювання кровоносних судин, а також у високо васкуляризованих пухлинах, включаючи гліому, Osada, H., et al., Int. J. Oncol. 18 (2001) 305-09); Koga, K., et al., Cancer Res. 61 (2001) 6248-54, печінково-клітинний рак, Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 341-45, карциному шлунка, Etoh, T., et al., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53; Lee, J.H., et al., Int. J. Oncol. 18 (2001) 355-61, пухлина щитовидної залози, Bunone, G., et al., Am J Pathol 155 (1999) 1967-76, недрібноклітинний рак легені, Wong, MP, et al., Lung Cancer 29 (2000) 11-22, і рак ободової кишки, Ahmad, SA, et al., Cancer 92 (2001) 1138-43, і простати, Wurmbach, JH, et al., Anticancer Res. 20 (2000) 5217-20. Виявлено, що деякі пухлинні клітини експресують ANG-2. Наприклад, Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 341-45 виявили мРНК ANG-2 в 10 з 12 зразків печінково-клітинного раку людини (HCC). Група Ellis 'повідомила, що ANG-2 експресується повсюдно в епітелії пухлини. Ahmad, S.A., et al., Cancer 92 (2001) 1138-43. Інші дослідники повідомляли про подібні відкриття. Chen, L., et al., J. Tongji Med. Univ. 21 (2001) 22835. В результаті визначення рівнів мРНК ANG-2 в архівованих зразках пухлин молочної залози людини Sfiligoi, C., et al., Int. J. Cancer 103 (2003) 466-74 повідомили, що мРНК ANG-2 в значній мірі пов'язана з супутньою інвазією лімфовузлів, коротким періодом часу без захворювання і поганою загальною виживаністю. Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-29 проведено огляд сумарно 236 пацієнтів з недрібноклітинним раком легенів (НДКРЛ) з патологічною стадією I-IIIA, відповідно. Використовуючи іммуногістохімію, вони виявили, що 16,9 % з пацієнтів з 3 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 НДКРЛ були позитивними по ANG-2. Щільність мікросудин для пухлини, позитивною по ANG-2, значно вища, ніж для негативних по ANG-2. Такий ангіогенний ефект ANG-2 спостерігали тільки тоді, коли експресія VEGF була високою. Крім того, позитивна експресія ANG-2 була значущим чинником для передбачення поганою післяопераційної виживаності. Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-7129. Однак вони не виявили значиму кореляцію між експресією Ang-1 і щільністю мікросудин. Tanaka, F., et al., Cancer Res. 62 (2002) 7124-7129. Ці результати дозволяють припустити, що ANG-2 є індикатором пацієнтів з поганим прогнозом при декількох типах раку. Нещодавно, використовуючи модель нокаут-мишей за ANG-2, група Yancopoulos 'повідомила, що ANG-2 потрібно для постнатального ангіогенезу. Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23. Вони показали, що програмована в процесі розвитку регресія судинної мережі гіалоідної мембрани в оці не відбувається у нокаут-мишей за ANG-2, і кровоносні судини їх сітківки нездатні до спрутінга з центральної ретинальної артерії. Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23. Ці автори також виявили, що делеція ANG-2 призводить в результаті до глибоких дефектів у структуруванні та функції мережі лімфатичних судин. Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23. Генетичний порятунок Ang-1 коригує лімфатичні дефекти, але не дефекти ангіогенезу. Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23. Peters з співавторами повідомили, що розчинний Tie2 при доставці або у вигляді рекомбінантного білка, або у вірусному експресійному векторі інгібує in vivo ріст карциноми молочної залози миші і меланоми в мишачих моделях. Lin, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 8829-34; Lin, P., et al., J. Clin. Invest. 100 (1997) 2072-78. Щільності кровоносних судин в пухлинних тканинах, оброблених таким чином, були значно знижені. Крім того, розчинний Tie2 блокував ангіогенез рогівки щурів, стимульований середовищем, кондиціонованих пухлинними клітинами. Lin, P., et al., J. Clin. Invest. 100 (1997) 2072-78. Крім того, Isner і його групою продемонстровано, що додавання ANG-2 до VEGF стимульовано значно більш тривалу і більш більшою мірою кільцеву неоваскуляризацію, ніж тільки VEGF. Asahara, T., et al., Circ. Res. 83 (1998) 233-40. Надлишок розчинного рецептора Tie2 перешкоджав модулювання VEGFіндукованої неоваскуляризації ANG-2. Asahara, T., et al., Circ. Res. 83 (1998) 233-40. Siemeister, G., et al., Cancer Res. 59:3 (1999) 3185-91 за допомогою ксенотрансплантатів бестімусних мишей показали, що гіперекспресія позаклітинних ліганд-зв'язуючих доменів або Flt-1, або Tie2 в ксенотрансплантатом, що приводить в результаті до значимого інгібування біохімічного шляху, не може компенсуватися один одним, що дозволяє припустити, що біохімічний шлях рецептора VEGF і біохімічний шлях Tie2 слід вважати двома незалежними медіаторами, істотними для процесу ангіогенезу in vivo. Siemeister, G., et al., Cancer Res. 59:3 (1999) 3185-91. Це доведено недавньою публікацією White, R., R., et al.,, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003) 5028-33. У їх дослідженні було продемонстровано, що стійкий до нуклеаз аптамери РНК, який специфічно зв'язує і інгібує ANG-2, значимо інгібує неоваскуляризацію, індуковану bFGF, в моделі ангіогенезу мікродівертікулів рогівки щурів. Біспецифічні антитіла У недавньому минулому розроблено широке розмаїття форматів рекомбінантних антитіл, наприклад, чотирьохвалентні біспецифічні антитіла, шляхом злиття, наприклад, IgG-формату антитіла і одноланцюгових доменів (див., наприклад, Coloma, MJ, et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163; WO 2001/077342; та Morrison, SL, Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234). Також розроблено кілька інших нових форматів, де серцевинна структура антитіла (IgA, IgD, IgE, IgG або IgM) більше не зберігається, як, наприклад, діа-, тріал-або тетратіла, мінітіла, кілька одноланцюгових форматів (scFv, Bis-scFv), які здатні до зв'язування двох або більше ніж двох антигенів (Holliger, P., et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., Léger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297). У всіх таких форматах використовують лінкери, або для злиття серцевини антитіла (IgA, IgD, IgE, IgG або IgM) з іншим зв'язуючим білком (наприклад, scFv), або для злиття, наприклад, двох Fab фрагментів або scFv (Fischer, N., Léger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14). Слід пам'ятати, що в одному випадку бажано зберегти ефекторні функції, такі як, наприклад, комплемент-залежну цитотоксичність (CDC) або антитілозалежна клітинна цитотоксичність (ADCC), які опосередковані зв'язуванням рецептора Fc, шляхом збереження високого ступеня подібності антитілам, що зустрічаються в природі. У WO 2007/024715 описані імуноглобуліни з подвійним варіабільним доменом, як сконструйовані полівалентні і поліспецифічні зв'язуючі білки. Спосіб одержання біологічно активних димерів антитіла описаний в US 6897044. Конструкція FV полівалентного антитіла, що має щонайменше чотири варіабельних домена, які пов'язані один з одним за допомогою 4 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пептидних лінкерів, описана в US 7129330. Димерні і мультімерні антигензв'язуючі структури описані в US 2005/0079170. Трьох-або чотиривалентний моноспецифічний антигензв'язуючий білок, що містить три або чотири Fab фрагмента, пов'язані один з одним ковалентно за допомогою сполучної структури, де цей білок не є природним імуноглобуліном, описаний в US 6511663. У WO 2006/020258 описані чотирьохвалентні біспецифічні антитіла, які можуть ефективно експресуватися в прокаріотичних і еукаріотичних клітинах, і корисні в терапевтичних і діагностичних методах. Спосіб поділу або переважного синтезу димерів, які зв'язані за допомогою щонайменше одного міжланцюгового дисульфідного зв'язку, і димерів, які не зв'язані за допомогою щонайменше одного міжланцюгового дисульфідного зв'язку, з суміші, що містить ці два типи поліпептидних димерів, описаний в US 2005/0163782. Біспецифічні тетравалентні рецептори описані в US 5959083. Сконструйовані антитіла з трьома або більшою кількістю функціональних антигензв'язуючих сайтів описані в WO 2001/077342. Поліспецифічні і полівалентні антигензв'язуючі поліпептиди описані в WO 1997/001580. У WO 1992/004053 описані гомокон'югати, типово отримані з моноклональних антитіл класу IgG, які зв'язуються з однією і тією ж антигенною детермінантою, і ковалентно пов'язані у вигляді синтетичного зшивання. Олігомерні моноклональні антитіла з високим авідітетом до антигену описані в WO 1991/06305, де секретуються олігомери, типово класу IgG, що мають два або більше ніж два іммуноглобулінових мономера, асоційовані разом з утворенням четирехвалентних або шестивалентних молекул IgG. Антитіла, отримані від вівці, і сконструйовані конструкції антитіл описані в US 6350860, де їх можна застосовувати при лікуванні захворювань, де активність інтерферону гамма є патогенною. У US 2005/0100543 описані направлені конструкції, які є полівалентними носіями біспецифічних антитіл, тобто кожна молекула конструкції що спрямовується може служити в якості носія двох або більше ніж двох біспецифічних антитіл. Генетично сконструйовані біспецифічні чотирьохвалентні антитіла описані в WO 1995/009917. У WO 2007/109254 описані стабілізовані зв'язуючі молекули, які складаються з стабілізованого scFv або включають його. Комбінація інгібіторів VEGF і ANG-2 WO 2007/068895 належить до комбінації антагоніста ANG-2 і VEGF, антагоністів KDR і / або FLTL. WO 2007/089445 належить до комбінацій інгібіторів ANG-2 і VEGF. WO 2003/106501 належить до злитих білків, що зв'язуються з ангіопоетином і містить домен мультімерізаціі. WO 2008/132568 належить до злитих білків, що зв'язуються з ангіопоетином і VEGF. WO 2003/020906 належить до полівалентних білкових кон'югатів з множинними лігандзв'язуючими доменами рецепторів. WO 2009/136352 належить до антиангіогенних сполук. Короткий виклад суті винаходу Винахід направлено на біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризується тим, що i) перший антигензв'язуючий сайт містить в якості вариабельного домена важкого ланцюга (VH) SEQ ID NO: 1 і в якості вариабельного домена легкого ланцюга (VL) SEQ ID NO: 2; та ii) другий антигензв'язуючий сайт містить в якості вариабельного домена важкого ланцюга (VH) SEQ ID NO: 3 і в якості вариабельного домена легкого ланцюга (VL) SEQ ID NO: 4. В одному аспекті винаходу біспеціфічне антитіло у відповідності з винаходом характеризується змістом a) важкого ланцюга і легкої ланцюга першого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з VEGF; та b) модифікованого важкої ланцюга і модифікованого легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з ANG-2, де константні домени CL і CH1 замінені один одним. В одній формі здійснення таке біспеціфічне, двовалентне антитіло характеризується змістом a) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 7 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 5 в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і b) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 8 в якості модифікованого важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 6 в якості модифікованого легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла. В одній формі здійснення таке біспеціфічне, двовалентне антитіло характеризується змістом a) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 11 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 9 в якості легкого ланцюга 5 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 першого повнорозмірного антитіла, і b) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 12 в якості модифікованого важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 10 в якості модифікованого легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла. В одній формі здійснення таке біспеціфічне, двовалентне антитіло характеризується змістом a) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 15 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 13 в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і b) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 16 в якості модифікованого важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 14 в якості модифікованого легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла. Наступними аспектами винаходу є: фармацевтична композиція, що містить біспеціфічне антитіло, дана композиція для лікування раку, застосування даного біспецифічного антитіла для отримання лікарського засобу для лікування раку, спосіб лікування пацієнта, страждаючого раком, шляхом введення даного біспецифічного антитіла пацієнту, потребуючого такого лікування. Наступними аспектами винаходу є: фармацевтична композиція, що містить біспеціфічне антитіло, дана композиція для лікування судинних захворювань, застосування даного біспецифічного антитіла для отримання лікарського засобу для лікування судинних захворювань, спосіб лікування пацієнта, страждаючого судинним захворюванням, шляхом введення даного біспецифічного антитіла пацієнту, потребуючому в такому лікуванні. Наступним аспектом винаходу є молекула нуклеїнової кислоти, що кодує ланцюг біспецифічного антитіла у відповідності з винаходом. Далі у винаході запропоновані експресійні вектори, що містять нуклеїнову кислоту у відповідності з винаходом, здатні експресувати цю нуклеїнову кислоту в прокаріотичній або еукаріотичній клітині-господарі, і клітини-господарі, що містять такі вектори, для рекомбінантного продукування біспецифічного антитіла у відповідності з винаходом. Далі винахід включає прокаріотичну або еукаріотичну клітину-господаря, що містить вектор у відповідності з винаходом. Далі винахід включає спосіб отримання біспецифічного антитіла у відповідності з винаходом, який характеризується експресією нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу в прокаріотичній або еукаріотичній клітині-господарі і виділення біспецифічного антитіла з клітини або з супернатанту клітинної культури. Далі винахід включає антитіло, одержане таким способом отримання біспецифічного антитіла. Відповідно, однією формою здійснення винаходу є біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризується змістом амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8. Відповідно, однією формою здійснення винаходу є біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризується змістом амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 і SEQ ID NO: 12. Відповідно, однією формою здійснення винаходу є біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризується змістом амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 і SEQ ID NO: 16. Біспецифічні, двовалентні антитіла у відповідності з винаходом проявляють корисні ефекти для пацієнтів-людей, що потребують терапії, спрямованої на VEGF і ANG-2. Антитіла відповідно до винаходу мають у високому ступені цінні властивості, що дають користь пацієнтові, страждаючому таким захворюванням, зокрема, страждаючому на рак. Біспецифічні антитіла у відповідності з винаходом високо ефективні при інгібуванні пухлинного росту і / або інгібуванні пухлинного ангіогенезу або судинних захворювань. Біспецифічні, двовалентні антитіла відповідно до винаходу проявляють цінні фармакокінетичні /-динамічні властивості, такі як, наприклад, стабільність, хороший (тобто повільний) кліренс (наприклад, при низьких дозах). Біспецифічні антитіла у відповідності з винаходом високо ефективні при a) інгібуванні пухлинного росту (наприклад, за допомогою біспецифічних антитіл відповідно до винаходу стаз пухлини може бути вже досягнутий при більш низьких концентраціях у 6 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 порівнянні з комбінацією двох моноспецифічних антитіл (наприклад, в моделях пухлин Colo205 і KPL-4 Прикладу 9 і 10 стаз пухлини був вже досягнутий при 10 мг / кг XMAb1 в порівнянні з комбінацією 10 мг / кг ANG2i-LC06+10 мг / кг авастину), та / або b) інгібуванні пухлинного ангіогенезу або судинних захворювань (наприклад, максимальні антиангіогенні ефекти за допомогою біспецифічних антитіл відповідно до винаходу могли бути вже досягнуті при більш низьких концентраціях у порівнянні з комбінацією двох моноспецифічних антитіл (наприклад, в аналізі ангіогенезу рогівки миші Прикладу 8 максимальний антиангіогенний ефект був вже досягнутий при 10 мг / кг XMAb1 в порівнянні з комбінацією 10 мг / кг ANG2i-LC06+10 мг / кг авастину). Опис графічних матеріалів Фіг. 1 Приблизний формат двовалентного біспецифічного антитіла для прикладів XMab, що включає домени CH3, модифіковані як виступи-во-западини. Фіг. 2a Приблизний формат двовалентного біспецифічного антитіла для прикладів OAscFab, що включає домени CH3, модифіковані як виступи-во-западини. Фіг. 2b Приблизний формат двовалентного біспецифічного антитіла для прикладу OAscXFab1, що включає домени CH3, модифіковані як виступи-во-западини. Фіг. 2c Приблизний формат двовалентного біспецифічного антитіла для прикладів OAscXFab2 і OAscXFab3, що включає домени CH3, модифіковані як виступи-во-западини. Фіг. 3 Одночасне зв'язування XMab1 з VEGF (перша стадія) з наступним зв'язуванням з hAng-2 (друга стадія). Фіг. 4 Принцип ELISA для кількісного визначення зв'язування активних антитіл mAb. Фіг. 5 Калібрувальна крива ELISA для кількісного визначення зв'язування активних антитіл XMab1. Фіг. 6 Аналіз ангіогенезу рогівки миші - інгібування проростання судин з лімба рогівки в напрямку градієнта VEGF введенням біспецифічного антитіла у відповідності з винаходом. Фіг. 7 Аналіз ангіогенезу рогівки миші - інгібування ангіогенезу / проростання судин з лімба рогівки в напрямку градієнта VEGF введенням біспецифічного антитіла у відповідності з винаходом - Порівняння біспецифічного антитіла XMab1, Mab ANG2iLC06 (LC06), Mab бевацизумабу (авастину) і комбінації ANG2i-LC06 і Mab бевацизумабу (авастину). Фіг. 8 Інгібування пухлинного росту in vivo в ксенотрансплантатом миші колоректального раку людини Colo205 (дрібні пухлини) біспецифічним антитілом відповідно до винаходу Порівняння біспецифічного антитіла XMab1, Mab ANG2i-LC06 (LC06), Mab бевацизумабу (авастину) і комбінації ANG2i-LC06 і Mab бевацизумабу (авастину). Фіг. 9 Інгібування пухлинного росту in vivo в ксенотрансплантатом миші колоректального раку людини Colo205 (великі пухлини) біспецифічним антитілом відповідно до винаходу Порівняння біспецифічного антитіла XMab1, Mab ANG2i-LC06 (LC06), Mab бевацизумабу (авастину) і комбінації ANG2i-LC06 і Mab бевацизумабу (авастину). Фіг. 10 Інгібування пухлинного росту in vivo в ксенотрансплантатом миші раку молочної залози людини KPL-4 (дрібні пухлини) біспецифічним антитілом відповідно до винаходу Порівняння біспецифічного антитіла XMab1, Mab ANG2i-LC06 (LC06), Mab бевацизумабу (авастину) і комбінації ANG2i-LC06 і Mab бевацизумабу (авастину). Фіг. 11 Інгібування пухлинного росту in vivo в ксенотрансплантатом миші раку молочної залози людини KPL-4 (великі пухлини) біспецифічним антитілом відповідно до винаходу Порівняння біспецифічного антитіла XMab1, Mab ANG2i-LC06 (LC06), Mab бевацизумабу (авастину) і комбінації ANG2i-LC06 і Mab бевацизумабу (авастину). Фіг. 12 Інгібування пухлинного росту in vivo в ксенотрансплантатом миші раку шлунка N87 біспецифічним антитілом відповідно до винаходу - Порівняння біспецифічного антитіла XMab1, Mab ANG2i-LC06 (LC06), Mab бевацизумабу (авастину) і комбінації ANG2i-LC06 і Mab бевацизумабу (авастину). Детальний опис винаходу Винахід направлено на біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини. Характеризується тим, що 7 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 i) перший антигензв'язуючий сайт містить в якості варіабельного домена важкого ланцюга (VH) SEQ ID NO: 1 і в якості варіабельного домена легкого ланцюга (VL) SEQ ID NO: 2; та ii) другий антигензв'язуючий сайт містить в якості варіабельного домена важкого ланцюга (VH) SEQ ID NO: 3 і в якості варіабельного домена легкого ланцюга (VL) SEQ ID NO: 4. В одному аспекті винаходу біспеціфічне антитіло відповідно до винаходу характеризується змістом a) важкого ланцюга і легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з VEGF; b) модифікованого важкого ланцюга і модифікованого легкого ланцюга повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з ANG-2, де константні домени CL і CH1 замінені один одним. Даний формат біспецифічного, двовалентного антитіла для біспецифічного антитіла, специфічно зв'язується з фактором росту ендотелію судин людини (VEGF) і ангіопоетином-2 (ANG-2) людини, описаний в WO 2009/080253 (див. приблизну схему при включенні доменів CH3, модифікованих як виступи-во-западини, на Фіг. 1). Антитіла, засновані на даному форматі біспецифічного, двовалентного антитіла, названі XMab в прикладах даного винаходу. В одній формі здійснення таке біспеціфічне, двовалентне антитіло характеризується змістом a) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 7 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 5 в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і b) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 8 в якості модифікованого важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 6 в якості модифікованого легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла. В одній формі здійснення таке біспеціфічне, двовалентне антитіло характеризується змістом a) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 11 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 9 в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і b) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 12 в якості модифікованого важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 10 в якості модифікованого легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла. В одній формі здійснення таке біспеціфічне, двовалентне антитіло характеризується змістом a) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 15 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 13 в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і b) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 16 в якості модифікованого важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 14 в якості модифікованого легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла. В одній формі здійснення таке біспеціфічне, двовалентне антитіло характеризується змістом a) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 19 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 17 в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і b) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 20 в якості модифікованого важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 18 як модифікованого легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла. В одній формі здійснення таке біспеціфічне, двовалентне антитіло характеризується змістом a) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 23 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 21 в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і b) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 24 в якості модифікованого важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 22 в якості модифікованого легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла В одній формі здійснення таке біспеціфічне, двовалентне антитіло характеризується змістом a) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 27 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 25 в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і b) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 28 в якості модифікованого важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26 в якості модифікованого легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла. Відповідно, однією формою здійснення винаходу є біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий 8 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризується змістом амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8. Відповідно, однією формою здійснення винаходу є біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризується змістом амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 і SEQ ID NO: 12. Відповідно, однією формою здійснення винаходу є біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризується змістом амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 і SEQ ID NO: 16. Відповідно, однією формою здійснення винаходу є біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризується змістом амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 і SEQ ID NO: 20. Відповідно, однією формою здійснення винаходу є біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризується змістом амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 і SEQ ID NO: 24. Відповідно, однією формою здійснення винаходу є біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризується змістом амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 і SEQ ID NO: 28. В іншому аспекті винаходу біспеціфічне антитіло відповідно до винаходу характеризується змістом a) важкого ланцюга і легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з VEGF; b) важкого ланцюга і легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з ANG-2, де N-кінець важкого ланцюга сполучений з C-кінцем легкого ланцюга за допомогою пептидного лінкера. Орієнтовна схема даного формату біспецифічного, двовалентного антитіла для даного біспецифічного антитіла, специфічно зв'язується з фактором росту ендотелію судин людини (VEGF) і ангіопоетином-2 (ANG-2) людини, показаний на Фіг. 2a, що включає домени CH3, модифіковані як виступи-во-западини. Антитіла на основі даного формату біспецифічного, двовалентного антитіла названі OAscFab в прикладах даного винаходу. В одній формі здійснення таке біспеціфічне, двовалентне антитіло характеризується змістом a) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 30 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 31 в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і b) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 29 в якості важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, з'єднаної з легким ланцюгом другого повнорозмірного антитіла за допомогою пептидного лінкера. В одній формі здійснення таке біспеціфічне, двовалентне антитіло характеризується змістом a) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 33 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла і амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 34 в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і b) амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 32 в якості важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, з'єднаної з легким ланцюгом другого повнорозмірного антитіла за допомогою пептидного лінкера. В одній формі здійснення варіабельний домен важкого ланцюга (VH) антитіла і варіабельний домен легкого ланцюга (VL) антитіла важкого і легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла стабілізовані дисульфідом шляхом введення дисульфідного зв'язку між нижченаведеними положеннями: становищем варіабельного домена важкого ланцюга 44 і становищем варіабельного домена легкого ланцюга 100 (нумерація завжди відповідно до індексу EU по Kabat; (Kabat, EA, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 9 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))). Така додаткова дисульфідна стабілізація досягається введенням дисульфідного зв'язку між варіабельних доменів VH і VL важкого і легкого ланцюга другий повнорозмірного антитіла. Методи введення неприродних дисульфідних містків для стабілізації описані, наприклад, в WO 94/029350, Rajagopal, V., et al, Prot. Engin. 10 (1997) 1453-59; Kobayashi, et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25 (1998) 387-393; або Schmidt, M., et al., Oncogene 18 (1999) 1711-1721. Таким чином, в одній формі здійснення таке біспеціфічне, двовалентне антитіло характеризується змістом дисульфідного зв'язку між варіабельними доменами важкого і легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, яка знаходиться між становищем 44 варіабельного домена важкого ланцюга і положенням 100 варіабельного домена легкого ланцюга, і включає a) амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 36 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 37 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і b) амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 35 в якості важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, з'єднаної з легким ланцюгом другого повнорозмірного антитіла за допомогою пептидного лінкера. В іншому аспекті винаходу біспеціфічне антитіло відповідно до винаходу характеризується змістом a) важкого ланцюга і легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з VEGF; b) важкого ланцюга і легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з ANG-2, де N-кінець важкого ланцюга сполучений з C-кінцем легкого ланцюга за допомогою пептидного лінкера, і де варіабельні домени VL і VH замінені один одним. Орієнтовна схема даного формату біспецифічного, двовалентного антитіла для даного біспецифічного антитіла, специфічно зв'язується з фактором росту ендотелію судин людини (VEGF) і ангіопоетином-2 (ANG-2) людини, показана на Фіг. 2b, включаючи домени CH3, модифіковані як виступи-во-западини. Антитіла на основі даного формату біспецифічного, двовалентного антитіла названі в прикладах OAscXFab1. В одній формі здійснення таке біспеціфічне антитіло характеризується змістом a) SEQ ID NO: 39 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і SEQ ID NO: 40 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і b) SEQ ID NO: 38 в якості важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, з'єднаної з легким ланцюгом другого повнорозмірного антитіла за допомогою пептидного лінкера. В іншому аспекті винаходу біспеціфічне антитіло відповідно до винаходу характеризується змістом a) важкого ланцюга і легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з VEGF; b) важкого ланцюга і легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з ANG-2, де N-кінець важкого ланцюга сполучений з C-кінцем легкого ланцюга за допомогою пептидного лінкера; та де константні домени CL і CH1 замінені один одним. Орієнтовна схема даного формату біспецифічного, двовалентного антитіла для даного біспецифічного антитіла, специфічно зв'язується з фактором росту ендотелію судин людини (VEGF) і ангіопоетином-2 (ANG-2) людини, показана на Фіг. 2c, включаючи домени CH3, модифіковані як виступи-во-западини. Антитіла на основі даного формату біспецифічного, двовалентного антитіла названі в прикладах OAscXFab2 і OAscXFab3. В одній формі здійснення таке біспеціфічне антитіло характеризується змістом a) SEQ ID NO: 42 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і SEQ ID NO: 43 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і b) SEQ ID NO: 41 в якості важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, з'єднаної з легким ланцюгом другого повнорозмірного антитіла за допомогою пептидного лінкера. В одній формі здійснення таке біспеціфічне антитіло характеризується змістом a) SEQ ID NO: 45 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і SEQ ID NO: 46 в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, і b) SEQ ID NO: 44 в якості важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, з'єднаної з легким ланцюгом другого повнорозмірного антитіла за допомогою пептидного лінкера. Відповідно, однією формою здійснення винаходу є біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризується 10 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 змістом амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 і SEQ ID NO: 31. Відповідно, однією формою здійснення винаходу є біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризується змістом амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 і SEQ ID NO: 34. Відповідно, однією формою здійснення винаходу є біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризується змістом амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 37. Відповідно, однією формою здійснення винаходу є біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризується змістом амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 і SEQ ID NO: 40. Відповідно, однією формою здійснення винаходу є біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризується змістом амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 і SEQ ID NO: 43. Відповідно, однією формою здійснення винаходу є біспеціфічне, двовалентне антитіло, що містить перший антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий антигензв'язуючий сайт, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризується змістом амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 і SEQ ID NO: 46. Переважно домени CH3 біспецифічного, двовалентного антитіла у відповідності з винаходом змінені за допомогою технології "виступи-во-западини", яка детально описана з кількома прикладами, наприклад, в WO 96/027011, Ridgway JB, et al., Protein Eng 9 (1996) 617621; та Merchant, AM, et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681. При даному способі поверхні взаємодії двох доменів CH3 змінені, щоб підвищити гетеродімерізацію обох важких ланцюгів, що містять ці два домена CH3. Кожен з двох доменів CH3 (двох важких ланцюгів) може являти собою "виступ", тоді як інший представляє собою "западину". Введення дисульфідного містка стабілізує гетеродімери (Merchant, AM, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) і підвищує вихід. У бажаному аспекті винаходу все біспецифічні антитіла у відповідності з винаходом характеризуються тим, що кожен домен CH3 важкого ланцюга і домен CH3 іншої важкої ланцюга збігаються на кордоні, яка містить вихідну межу між доменами CH3 антитіла; де межа змінена таким чином, що сприяє утворенню біспецифічного антитіла, де це зміна характеризується тим, що: a) домен CH3 однієї важкого ланцюга змінений, таким чином, що в межах вихідної кордону домена CH3 однієї важкого ланцюга, яка збігається з вихідною межею домена CH3 іншої важкої ланцюга в межах біспецифічного антитіла, амінокислотний залишок замінений амінокислотним залишком, що має більший обсяг бічного ланцюга, створюючи за допомогою цього виступ в межах кордону домена CH3 однієї важкого ланцюга, який може бути розташований в порожнині всередині кордону домена CH3 іншої важкої ланцюга і b) домен CH3 іншої важкої ланцюга змінений, таким чином, що в межах вихідної кордону домена CH3 однієї важкого ланцюга, яка збігається з вихідною межею домена CH3 іншої важкої ланцюга в межах біспецифічного антитіла, амінокислотний залишок замінений амінокислотним залишком, мають менший об'єм бічного ланцюга, створюючи за допомогою цього порожнина в межах кордону домена CH3, всередині якої може бути розташований виступ в межах кордони першого домена CH3. Таким чином, антитіло відповідно до винаходу переважно характеризується тим, що кожен домен CH3 важкого ланцюга повнорозмірного антитіла a) і домен CH3 важкого ланцюга повнорозмірного антитіла b) збігається на кордоні, яка містить зміна у вихідній кордоні між доменами CH3 антитіла; де i) у домені CH3 однієї важкого ланцюга амінокислотний залишок замінений амінокислотним залишком, що має більший обсяг бічного ланцюга, створюючи за допомогою цього виступ в межах кордону домена CH3 однієї важкого ланцюга, який може бути розташований в порожнині всередині кордону домена CH3 11 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 іншої важкої ланцюга, і де ii) у домені CH3 іншої важкої ланцюга амінокислотний залишок замінений амінокислотним залишком, мають менший об'єм бічного ланцюга, створюючи за допомогою цього порожнина в межах кордону домена CH3, всередині якої може бути розташований виступ в межах кордони першого домена CH3. Переважно амінокислотний залишок, що має більший обсяг бічного ланцюга, вибраний з групи, що складається з аргініну (R), фенілаланіну (F), тирозину (Y), триптофану (W). Переважно амінокислотний залишок, який має менший об'єм бічного ланцюга, вибраний з групи, що складається з аланіну (A), серину (S), треоніну (T), валіну (V). В одному аспекті винаходу обидва домена CH3 додатково змінені шляхом введення цистеїну (C) в якості амінокислоти у відповідних положеннях кожного домена CH3, так що може утворитися дисульфідний місток між обома доменами CH3. В одній формі здійснення біспеціфічне антитіло містить мутацію T366W в домені CH3 "ланцюга виступу" і мутації T366S, L368A, Y407V в домені CH3 "ланцюга западини". Додатковий межцепочечний дисульфідних місток між доменами CH3 можна також використовувати (Merchant, AM, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681), наприклад, шляхом введення мутації Y349C в домен CH3 "ланцюга виступу" і мутації E356C або мутації S354C в домен CH3 "ланцюга западини". В іншій формі здійснення біспеціфічне антитіло відповідно до винаходу містить мутації Y349C, T366W в одному з двох доменів CH3 і мутації E356C, T366S, L368A, Y407Vв іншому з двох доменів CH3. В іншій кращою формою здійснення біспеціфічне антитіло містить мутації Y349C, T366W в одному з двох доменів CH3 і мутації S354C, T366S, L368A, Y407V в іншому з двох доменів CH3 (де додаткова мутація Y349C в одному домені CH3 і додаткова мутація E356C або S354C в іншому домені CH3 утворюють міжланцюговий дисульфідний місток) (нумерація завжди відповідає індексу EU по Kabat; (Kabat, EA, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) )). Але також альтернативно або додатково можна використовувати інші технології виступи-у-западини, як описано в EP 1870459 A1. Таким чином, іншим прикладом для біспецифічного антитіла є мутації R409D; K370E в домені CH3 "ланцюга виступу" і мутації D399K; E357K в домені CH3 "ланцюга западини" (нумерація завжди відповідає індексу EU по Kabat; (Kabat, EA, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))). В іншій формі здійснення біспеціфічне антитіло містить мутацію T366W в домені CH3 "ланцюга виступу" і мутації T366S, L368A, Y407V в домені CH3 "ланцюга западини" і додатково мутації R409D; K370E в домені CH3 "ланцюга виступу" і мутації D399K; E357K в домені CH3 "ланцюга западини". В іншій формі здійснення біспеціфічне антитіло містить мутації Y349C, T366W в дном з двох доменів CH3 і мутації S354C, T366S, L368A, Y407V в іншому з двох доменів CH3, або тривалентне, біспеціфічне антитіло містить мутації Y349C, T366W в одному з двох доменів CH3 і мутації S354C, T366S, L368A, Y407V в іншому з двох доменів CH3 і додатково мутації R409D; K370E в домені CH3 "ланцюга виступу" і мутації D399K; E357K в домені CH3 "ланцюга западини". - В одній формі здійснення винаходу біспеціфічне антитіло відповідно до винаходу характеризується тим, що має одним або більш ніж одним з нижчеописаних властивостей (визначених в аналізах, які описані в прикладах 3-7): біспеціфічне, двовалентне антитіло зв'язується з VEGF зі значенням KD зв'язує спорідненості 5 нМ або менше; - біспеціфічне, двовалентне антитіло зв'язується з ANG-2 зі значенням KD зв'язує спорідненості 5 нМ або менше; - біспеціфічне, двовалентне антитіло інгібує ANG-2-індуковане фосфорилювання Tie2 в клітинах HEK293, трансфіцірованних Tie2, з IC50 15 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 10 нМ або менше); - біспеціфічне, двовалентне антитіло інгібує зв'язування ANG-2 з Tie2 з IC50 20 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 15 нМ або менше); - біспеціфічне, двовалентне антитіло інгібує зв'язування VEGF з рецептором VEGF з IC50 20 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 15 нМ або менше); - біспеціфічне, двовалентне антитіло інгібує VEGF-індуковану проліферацію клітин HUVEC з IC50 10 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 5 нМ або менше). В одній формі здійснення біспеціфічне, двовалентне антитіло характеризується змістом 12 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 першого антигензв'язуючого сайту, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другого антигензв'язуючих сайту, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризуються тим, що i) перший антигензв'язуючий сайт містить в якості варіабельного домена важкого ланцюга (VH) SEQ ID NO: 1 і в якості варіабельного домена легкого ланцюга (VL) SEQ ID NO: 2; та ii) другий антигензв'язуючий сайт містить в якості варіабельного домена важкого ланцюга (VH) SEQ ID NO: 3 і в якості варіабельного домена легкого ланцюга (VL) SEQ ID NO: 4; і має одним або більш ніж одним з нижчеописаних властивостей (визначених в аналізах, які описані в прикладах 3-7): - біспеціфічне, двовалентне антитіло зв'язується з VEGF зі значенням KD зв'язує спорідненості 5 нМ або менше; - біспеціфічне, двовалентне антитіло зв'язується з ANG-2 зі значенням KD зв'язує спорідненості 5 нМ або менше; - біспеціфічне, двовалентне антитіло інгібує ANG-2-індуковане фосфорилювання Tie2 в клітинах HEK293, трансфіцірованних Tie2, з IC50 15 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 10 нМ або менше); - біспеціфічне, двовалентне антитіло інгібує зв'язування ANG-2 з Tie2 з IC50 20 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 15 нМ або менше); - біспеціфічне, двовалентне антитіло інгібує зв'язування VEGF з рецептором VEGF з IC50 20 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 15 нМ або менше); - біспеціфічне, двовалентне антитіло інгібує VEGF-індуковану проліферацію клітин HUVEC з IC50 10 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 5 нМ або менше). В одному аспекті винаходу таке біспеціфічне антитіло відповідно до винаходу характеризується змістом a) важкого ланцюга і легким ланцюга першого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з VEGF; b) модифікованого важкого ланцюга і модифікованого легкого ланцюга повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з ANG-2, де константні домени CL і CH1 замінені один одним; і має одним або більш ніж одним з нижчеописаних властивостей (визначених в аналізах, які описані в прикладах 3-7): біспеціфічне, двовалентне антитіло зв'язується з VEGF зі значенням KD зв'язує спорідненості 5 нМ або менше; - біспеціфічне, двовалентне антитіло зв'язується з ANG-2 зі значенням KD зв'язує спорідненості 5 нМ або менше; - біспеціфічне, двовалентне антитіло інгібує ANG-2-індуковане фосфорилювання Tie2 в клітинах HEK293, трансфіцірованних Tie2, з IC50 15 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 10 нМ або менше); - біспеціфічне, двовалентне антитіло інгібує зв'язування ANG-2 з Tie2 з IC50 20 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 15 нМ або менше); - біспеціфічне, двовалентне антитіло інгібує зв'язування VEGF з рецептором VEGF з IC50 20 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 15 нМ або менше); біспеціфічне, двовалентне антитіло інгібує VEGF-індуковану проліферацію клітин HUVEC з IC50 10 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 5 нМ або менше). В одній формі здійснення біспеціфічне, двовалентне антитіло характеризується змістом першого антигензв'язуючого сайту, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другого антигензв'язуючих сайту, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризуються тим, що i) перший антигензв'язуючий сайт містить в якості варіабельного домену важкого ланцюга (VH) SEQ ID NO: 1 із заміною не більше ніж одного амінокислотного залишку в CDR і в якості варіабельного домену легкого ланцюга (VL) SEQ ID NO: 2 з заміною не більше ніж одного амінокислотного залишку в CDR; та ii) другий антигензв'язуючий сайт містить в якості варіабельного домену важкого ланцюга (VH) SEQ ID NO: 3 із заміною не більше ніж одного амінокислотного залишку в CDR і в якості варіабельного домену легкого ланцюга (VL) SEQ ID NO: 4 із заміною не більше ніж одного амінокислотного залишку в CDR. В одній формі здійснення біспецифічне, двовалентне антитіло характеризується змістом першого антигензв'язуючого сайту, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другого антигензв'язуючого сайту, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що характеризуються тим, що 13 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 i) перший антигензв'язуючий сайт містить в якості варіабельного домену важкого ланцюга (VH) SEQ ID NO: 1 із заміною не більше ніж одного амінокислотного залишку в CDR і в якості варіабельного домену легкого ланцюга (VL) SEQ ID NO: 2 з заміною не більше ніж одного амінокислотного залишку в CDR; та ii) другий антигензв'язуючий сайт містить в якості варіабельного домену важкого ланцюга (VH) SEQ ID NO: 3 із заміною не більше ніж одного амінокислотного залишку в CDR і в якості варіабельного домену легкого ланцюга (VL) SEQ ID NO: 4 із заміною не більше ніж одного амінокислотного залишку в CDR; і має один або більше ніж один з нижчеописаних властивостей (визначених в аналізах, які описані в прикладах 3-7): - біспецифічне, двовалентне антитіло зв'язується з VEGF зі значенням KD зв'язує спорідненості 5 нМ або менше; - біспецифічне, двовалентне антитіло зв'язується з ANG-2 зі значенням KD зв'язує спорідненості 5 нМ або менше; - біспецифічне, двовалентне антитіло інгібує ANG-2-індуковане фосфорилювання Tie2 в клітинах HEK293, трансфіцірованних Tie2, з IC50 15 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 10 нМ або менше); - біспецифічне, двовалентне антитіло інгібує зв'язування ANG-2 з Tie2 з IC50 20 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 15 нМ або менше); - біспецифічне, двовалентне антитіло інгібує зв'язування VEGF з рецептором VEGF з IC50 20 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 15 нМ або менше); - біспецифічне, двовалентне антитіло інгібує VEGF-індуковану проліферацію клітин HUVEC з IC50 10 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 5 нМ або менше). В одному аспекті винаходу біспецифічне антитіло відповідно до винаходом характеризується змістом a) важкого ланцюга і легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з VEGF, і де важкий ланцюг першого повнорозмірного антитіла містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 7 із заміною не більше ніж одного амінокислотного залишку в CDR, і легкий ланцюг першого повнорозмірного антитіла містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 5 з заміною не більше ніж одного амінокислотного залишку в CDR, і b) модифікованого важкого ланцюга і модифікованого легкого ланцюга повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з ANG-2, де константні домени CL і CH1 замінені один одним, і де модифікований важкий ланцюг другого повнорозмірного антитіла містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8 із заміною не більше ніж одного амінокислотного залишку в CDR, і модифікований легкий ланцюг другого повнорозмірного антитіла містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 6 із заміною не більше ніж одного амінокислотного залишку в CDR. В одному аспекті винаходу біспецифічне антитіло відповідно до винаходу характеризується змістом a) важкого ланцюга і легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з VEGF, і де важкий ланцюг першого повнорозмірного антитіла містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 7 із заміною не більше ніж одного амінокислотного залишку в CDR, і легкий ланцюг першого повнорозмірного антитіла містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 5 з заміною не більше ніж одного амінокислотного залишку в CDR, і b) модифікованого важкого ланцюга і модифікованого легкого ланцюга повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з ANG-2, де константні домени CL і CH1 замінені один одним, і де модифікований важкий ланцюг другого повнорозмірного антитіла містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8 із заміною не більше ніж одного амінокислотного залишку в CDR, і модифікований легкий ланцюг другого повнорозмірного антитіла містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 6 із заміною не більше ніж одного амінокислотного залишку в CDR; і має один або більш ніж один з нижчеописаних властивостей (визначених в аналізах, які описані в прикладах 3-7): - біспецифічне, двовалентне антитіло зв'язується з VEGF зі значенням KD зв'язує спорідненості 5 нМ або менше; - біспецифічне, двовалентне антитіло зв'язується з ANG-2 зі значенням KD зв'язуючої спорідненості 5 нМ або менше; - біспецифічне, двовалентне антитіло інгібує ANG-2-індуковане фосфорилювання Tie2 в 14 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітинах HEK293, трансфікованих Tie2, з IC50 15 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 10 нМ або менше); - біспецифічне, двовалентне антитіло інгібує зв'язування ANG-2 з Tie2 з IC50 20 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 15 нМ або менше); - біспецифічне, двовалентне антитіло інгібує зв'язування VEGF з рецептором VEGF з IC50 20 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 15 нМ або менше); - біспецифічне, двовалентне антитіло інгібує VEGF-індуковану проліферацію клітин HUVEC з IC50 10 нМ або менше (в одній формі здійснення з IC50 5 нМ або менше). Як використовують в даній заявці, "антитіло" належить до зв'язуючого білка, який містить антигензв'язуючі сайти. Терміни "зв'язуючий сайт" або "антигензв'язуючий сайт", як використовують в даній заявці, означає ділянку (ділянки) молекули антитіла, з яким дійсно зв'язується ліганд. Термін "антигензв'язуючий сайт" включає варіабельні домени важкого ланцюга антитіла (VH) і варіабельні домени легкого ланцюга антитіла (VL) (пару VH / VL)). Специфічність антитіла належить до селективного розпізнавання антитілом певного епітопа антигену. Природні антитіла, наприклад, є моноспецифічними. "Біспецифічні антитіла" відповідно до винаходу являють собою антитіла, які мають дві різні антигензв'язуючі специфічності. Антитіла за даним винаходом специфічні до двох різних антигенів, VEGF в якості першого антигену і ANG-2 в якості другого антигену. Термін "моноспецифічне" антитіло, як використовують в даній заявці, означає антитіло, яке має одну або більше ніж один зв'язуючий сайт, кожен з яких зв'язується з один і тим же епітопом одного і того ж антигену. Термін "валентний", як використовують у цій заявці, означає присутність вказаного числа зв'язуючих сайтів в молекулі антитіла. Як такі, терміни "двовалентне", "чотирьохвалентне" і "шестивалентне" означають присутність двох зв'язують сайтів, чотирьох зв'язують сайтів і шести зв'язують сайтів, відповідно, в молекулі антитіла. Біспецифічні антитіла у відповідності з винаходом є "двовалентними". Термін "VEGF", як використовують в даній заявці, належить до фактору росту ендотелію судин людини (VEGF / VEGF-A) (SEQ ID NO: 47), який описаний, наприклад, у Leung, DW, et al., Science 246 (1989) 1306-9; Keck, PJ, et al., Science 246 (1989) 1309-12 і Connolly, DT, et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24. VEGF залучений в регуляцію нормального і аномального ангіогенезу і неоваскуляризації, асоційованої з пухлинами та внутрішньоочного розладами (Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. +18 (1997) 4-25; Berkman, RA, et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153159; Brown, LF, et al., Human Pathol. +26 (1995) 86-91; Brown, LF, et al., Cancer Res. +53 (1993) 4727-4735; Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934; and Dvorak, HF, et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039). VEGF являє собою гомодімерний глікопротеїн, який виділено з декількох джерел. VEGF проявляє високо специфічну мітогенного активністьу відношенні ендотеліальних клітин. Термін "ANG-2", як використовують в даній заявці, належить до ангіопоетину-2 (ANG-2) людини (альтернативно скорочується як ANGPT2 або ANG2) (SEQ ID NO: 48), який описаний, наприклад, у Maisonpierre, PC, et al, Science 277 (1997) 55-60 і Cheung, AH, et al., Genomics 48 (1998) 389-91. Ангіопоетіни-1 і -2 були відкриті як ліганди до Tie, сімейству тирозинкінази, які селективно експресуються в межах ендотелію кровоносних судин. Yancopoulos, GD, et al., Nature 407 (2000) 242-48. Зараз існує чотири окремих члена сімейства ангіопоетинів. Ангіопоетін-3 і -4 (Ang-3 і Ang-4) можуть являти собою широко дівергіровавшіе копії локусу одного і того ж гена у миші і людини. Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I., et al., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28. ANG-1 і ANG-2 були початково ідентифіковані в експериментах на тканинних культурах як агоніст і антагоніст, відповідно (див. для ANG-1: Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69; та для ANG-2: Maisonpierre, PC, et al., Science 277 (1997) 55-60). Всі відомі ангіопоетіни зв'язуються, головним чином, з Tie2, і як Ang-1, так і -2 зв'язуються з Tie2 зі спорідненістю 3 нМ (Kd). Maisonpierre, PC, et al., Science 277 (1997) 55-60. Антигензв'язуючі сайти біспецифічного антитіла щодо винаходу містять шість ділянок, що визначають комплементарність (CDR), які вносять вклад в ступені спорідненості які варіюють, зв'язуючого сайту до антигену. Існує три CDR варіабельного домену важкого ланцюга (CDRH1, CDRH2 і CDRH3) і три CDR варіабельного домену легкого ланцюга (CDRL1, CDRL2 і CDRL3). Ступінь CDR і каркасних областей (FR) визначається шляхом порівняння зі скомпільованою базою даних амінокислотних послідовностей, в яких ці області визначені згідно з варіабельністю серед послідовностей. Також включеними в обсяг винаходу є функціональні антигензв'язуючі сайти, що складаються з меншого числа CDR (тобто, де специфічність котра зв'язує визначається трьома, чотирма або п'ятьма CDR). Наприклад, неповний набір 6 CDR може бути достатній для зв'язування. У деяких випадках достатньо домену VH або VL. 15 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антитіла щодо винаходу додатково містять константні області імуноглобуліну одного або більш ніж одного класу імуноглобулінів. Класи імуноглобулінів включають ізотипи IgG, IgM, IgA, IgD і IgE і, в разі IgG і IgA, їх підтипи. Терміни "моноклональних антитіл" або "композиція моноклонального антитіла", як використовують в даній заявці, відносяться до препарату молекул антитіла однієї амінокислотної композиції. Термін "химерне антитіло" належить до антитіла, що містить варіабельну ділянку, тобто зв'язуючу ділянку, з одного джерела або виду і щонайменше ділянку константної області, що має походження з іншого джерела або виду, звичайно отриманого методами рекомбінантних ДНК. Химерні антитіла, що містять варіабельну ділянку миші і константну область людини, є кращими. Іншими переважними формами "химерних антитіл", охопленими даним винаходом, є форми, в яких константна область модифікована або змінена в порівнянні з вихідним антитілом для отримання властивостей відповідно до винаходу, зокрема, щодо зв'язування C1q і / або зв'язування Fc рецептора (FcR). Такі химерні антитіла також називають "антитілами з переключеним класом". Химерні антитіла є продуктом експресованих генів імуноглобулінів, що містять сегменти ДНК, які кодують варіабельні ділянки імуноглобулінів, і сегменти ДНК, які кодують константні області імуноглобулінів. Способи отримання химерних антитіл, що включають загальноприйняті методи рекомбінантних ДНК і трансфекції генів, добре відомі в даній області техніки. Див, наприклад, Morrison, SL, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5202238 і US 5204244. Термін "гуманізоване антитіло" належить до антитіл, в яких каркасні області або "дільниці, що визначають комплементарність" (CDR) модифіковані таким чином, що вони містять CDR імуноглобуліну іншої специфічності в порівнянні зі специфічністю батьківського імуноглобуліну. У переважній формі здійснення CDR миші прищеплюють на каркасну область людського антитіла з отриманням "гуманізованого антитіла". Див, наприклад, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; та Neuberger, MS, et al., Nature 314 (1985) 268-270. Особливо переважні CDR відповідають репрезентативним послідовностям, що розпізнають антигени, зазначеним вище для химерних антитіл. Іншими формами "гуманізованих антитіл", охопленими даним винаходом, є форми, в яких константна область додатково модифікована або змінена в порівнянні з вихідним антитілом для отримання властивостей згідно з винаходом, зокрема, щодо зв'язування C1q і / або зв'язування Fc рецептора (FcR). Термін "людське антитіло", як використовують в даній заявці, мають на увазі як такий що включає антитіла, які мають варіабельні і константні області, що мають походження від послідовностей імуноглобулінів зародкової лінії людини. Людські антитіла добре відомі на рівні техніки (van Dijk, MA, and van de Winkel, JG, Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Людські антитіла можуть бути також отримані в трансгенних тварин (наприклад, мишах), які після імунізації здатні до продукування повного репертуару або до селекції людських антитіл у відсутність продукування ендогенного імуноглобуліну. Перенесення генетичної інформації імуноглобуліну зародкової лінії людини в таких мишей, мутантних по зародковій лінії, призведе в результаті до продукування людських антитіл після антигенної стимуляції (див., наприклад, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Людські антитіла можна також продукувати в бібліотеках фагового дисплея (Hoogenboom, HR, and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, JD, et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Методи Cole, A., et al. and Boerner, P., et al. також доступні для отримання людських моноклональних антитіл (Cole, A., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Liss, AL, p. +77 (1985); та Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Як вже згадано для химерних і гуманізованих антитіл у відповідності з винаходом, термін "людське антитіло", як використовують в даній заявці, також включає такі антитіла, які модифіковані в константної області для отримання властивостей згідно з винаходом, зокрема, щодо зв'язування C1q і / або зв'язування FcR, наприклад, шляхом "перемикання класу", тобто зміни або мутації ділянок Fc (наприклад, з IgG1 на IgG4 і / або мутації IgG1/IgG4). Термін "рекомбінантне людське антитіло", як використовують в даній заявці, мають на увазі як такий що включає всі людські антитіла, які отримують, експресують, створюють або виділяють рекомбінантними методами, як, наприклад, антитіла, виділені з клітини-господаря, такий як клітина NSO або CHO, або з тваринного (наприклад, миші), яке є трансгенним по генам імуноглобулінів людини, або антитіла, експресувати з використанням рекомбінантного експресійного вектора, трансфікованного в клітину-господаря. Такі рекомбінантні людські антитіла мають варіабельні і константні області в перебудованій формі. Рекомбінантні людські антитіла у відповідності з винаходом піддані соматичній сверхмутаціі in vivo. Таким чином, 16 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотні послідовності ділянок VH і VL рекомбінантних антитіл являють собою послідовності, які, хоча мають походження від послідовностей VH і VL зародкової лінії людини і споріднені їм, можуть не існувати в природі в межах репертуару антитіл зародкової лінії людини in vivo. "Варіабельний домен" (варіабельний домен легкого ланцюга (VL), варіабельний домен важкого ланцюга (VH), як використовують в даній заявці, означає ділянку кожної з пари важкого і легкого ланцюгів, який безпосередньо залучений в зв'язування антитіла з антигеном. Домени вариабельной легкого та важкого ланцюга мають одну і ту ж загальну структуру, і кожен домен містить чотири каркасних (FR) ділянки, послідовності яких є широко консервативними, з'єднані трьома "гіперваріабельними ділянками" (або ділянками визначення комплементарності, CDR). Каркасні ділянки приймають конформацію b-шару, а CDR можуть утворювати петлі, що з'єднують структуру b-шару. CDR в кожному ланцюзі утримуються в своїй тривимірній структурі каркасними ділянками і разом утворюють з CDR від іншого ланцюга антигензв'язуючий сайт. Ділянки CDR3 важкої і легкого ланцюга антитіла відіграють особливо важливу роль у зв'язуючій специфічності / спорідненості антитіл у відповідності з винаходом і, отже, становлять наступний об'єкт винаходу. Терміни "гіперваріабельна ділянка" або "антигензв'язуюча ділянка антитіла" при використанні в даній заявці належать до амінокислотних залишків антитіла, які відповідальні за зв'язування антигену. Гіперваріабельна область містить амінокислотні залишки від "ділянок, що визначають комплементарність" або "CDR". "Каркасні" або "FR" ділянки являють собою ті ділянки варіабельного домену, які відрізняються від каркасних ділянок, як визначено в даній заявці. Таким чином, важкі і легкі ланцюги антитіла містять від N-до C-кінця домени FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 і FR4. CDR на кожному ланцюзі розділені такими каркасними амінокислотами. Зокрема, CDR3 важкого ланцюга є ділянкою, яка вносить найбільший вклад в зв'язування антигену. Ділянки CDR і FR визначають у відповідності зі стандартним визначенням Kabat, EA, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) (включаючи нумерацію відповідно до EU індексом по Kabat (скорочено нумерацію по Kabat в даній заявці нижче)). Як використовують в даній заявці, термін "зв'язування" або "специфічне зв'язування" належить до зв'язування антитіла з епітопом антигену (або VEGF людини, або ANG-2 людини) в аналізі in vitro, переважно в аналізі плазмонного резонансу (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden) (Приклад 3) з очищеним антигеном дикого типу. Спорідненість зв'язування визначають термінами ka (константа швидкості асоціації антитіла з комплексу антитіло / антиген), kD (константа дисоціації) і KD (kD/ka). В одній формі здійснення зв'язування або специфічне -9 зв'язування означає зв'язує спорідненість (KD) 10-8 моль / л або менше, переважно від 10 M -13 до 10 моль/л. Термін "епітоп" включає будь-яку поліпептидну детермінанту, здатну до специфічного зв'язування з антитілом. У деяких формах здійснення епітопна детермінанта включає хімічно активні поверхневі групування молекул, таких як амінокислоти, цукрові бічні ланцюги, фосфорил або сульфоніл, і в деяких формах здійснення можуть мати специфічні тривимірні структурні характеристики або специфічні характеристики заряду. Епітопом є ділянка антигену, який зв'язується антитілом. У деяких формах здійснення вказано, що антитіло специфічно зв'язує антиген, коли воно переважно розпізнає його антиген-мішень у комплексній суміші білків і / або макромолекул. Термін "повнорозмірне антитіло" означає антитіло, яке складається з двох "повнорозмірних важких ланцюгів антитіла" і двох "повнорозмірних легких ланцюгів антитіла" (див. фіг. 1). "Повнорозмірний важкий ланцюг антитіла" являє собою поліпептид, що складається в напрямку від N-кінця до C-кінця з варіабельного домену важкого ланцюга антитіла (VH), константного домену 1 важкого ланцюга антитіла (CH1), шарнірної області (HR) антитіла, константного домену 2 важкого ланцюга антитіла (CH2) і константного домену 3 важкого ланцюга антитіла (CH3), скорочено VH-CH1-HR-CH2-CH3; та необов'язково константного домену 4 важкого ланцюга антитіла (CH4) у разі антитіла підкласу IgE. Переважно "повнорозмірний важкий ланцюг антитіла" являє собою поліпептид, що складається в напрямку від N-кінця до C-кінця з VH, CH1, HR, CH2 і CH3. "Повнорозмірний легкий ланцюг антитіла" являє собою поліпептид, що складається в напрямку від N-кінця до C-кінця з варіабельного домену легкого ланцюга антитіла (VL) і константного домену легкого ланцюга антитіла (CL), скорочено VL-CL. Константний домен легкого ланцюга антитіла (CL) може являти собою κ (каппа) або λ (лямбда). Два повнорозмірні ланцюги антитіла зв'язані разом за допомогою міжполіпептідних дисульфідних зв'язків між доменом CL і доменом CH1 і між шарнірними областями повнорозмірних важких ланцюгів антитіла. Прикладами типових повнорозмірних антитіл є природні антитіла, такі як IgG 17 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (наприклад, IgG1 і IgG2), IgM, IgA, IgD і IgE. Повнорозмірні антитіла у відповідності з винаходом можуть бути від одного виду, наприклад, людини, або вони можуть являти собою химеризовані або гуманізовані антитіла. Повнорозмірні антитіла у відповідності з винаходом містять два антигензв'язуючих сайта, кожен з яких утворений парою VH і VL, які обидва специфічно зв'язуються з один і тим же антигеном. C-кінець важкого або легкого ланцюга даного повнорозмірного антитіла означає останню амінокислоту на C-кінці даного важкого або легкого ланцюга. N-кінець важкого або легкого ланцюга даного повнорозмірного антитіла означає останню амінокислоту на N-кінці даної важкого або легкого ланцюга. Термін "пептидний лінкер", як використовують у межах винаходу, означає пептид з амінокислотними послідовностями, які переважно мають синтетичне походження. Ці пептиди згідно з винаходом використовують для з'єднання C-кінця легкого ланцюга з N-кінцем важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла (яке специфічно зв'язується з другим антигеном) за допомогою пептидного лінкера. Пептидний лінкер в межах важкого і легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла являє собою пептид з амінокислотної послідовністю довжиною щонайменше 30 амінокислот, переважно довжиною від 32 до 50 амінокислот. В одній формі здійснення пептидний лінкер являє собою пептид з амінокислотної послідовністю довжиною від 32 до 40 амінокислот. В одній формі здійснення даний лінкер являє собою (GxS) n, де G = гліцин, S = серин (x=3, n=8, 9 або 10 і m=0, 1, 2 або 3) або (x=4 і n=6, 7 або 8 і m=0, 1, 2 або 3), переважно де x=4, n=6 або 7 і m=0, 1, 2 або 3, більш переважно де x=4, n=7 і m=2. В одній формі здійснення даний лінкер являє собою (G4S)6G2. Термін "константна область", як використовують у межах цієї заявки, позначає суму доменів антитіла, що відрізняються від варіабельної галузі. Константна область не залучена безпосередньо в зв'язування антигену, але виявляє різні ефекторні функції. В залежності від амінокислотної послідовності константної області їх важких ланцюгів, антитіла діляться на класи: IgA, IgD, IgE, IgG та IgM, і деякі з них можуть бути додатково розділені на підкласи, такі як IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4, IgA1 і IgA2. Константні області важких ланцюгів, які відповідають різним класам антитіл, називають α, δ, ε, γ і μ, відповідно. Константні області легкого ланцюга, які можна знайти у всіх п'яти класах антитіл, називають κ (каппа) і λ (лямбда). Термін "константна область людського походження", як використовують у цій заявці, означає константну область важкого ланцюга людського антитіла підкласу IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4 і / або константну область легкого ланцюга капа або лямбда. Такі константні галузі добре відомі на рівні техніки і описані, наприклад, Kabat, EA (див., наприклад, Johnson, G., and Wu, TT, Nucleic Acids Res. +28 (2000) 214-218; Kabat, EA, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788). Переважно біспецифічні, двовалентні антитіла у відповідності з винаходом мають константну область підкласу IgG1 людини. Хоча антитіла підкласу IgG4 проявляють знижене зв'язування з Fc рецептором (FcgRIIIa), антитіла інших підкласів IgG проявляють зв'язування. Однак Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (втрата вуглеводу Fc), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 і His435 є залишками, які при їх зміні забезпечують також знижене зв'язування з Fc рецептором (Shields, RL, et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0307434). В одній формі здійснення антитіло згідно з винаходом має знижене зв'язування з FcR в порівнянні з антитілом IgG1, і біспецифічне, двовалентне антитіло належить відносно зв'язування з FcR до підкласу IgG4 або до підкласу IgG1 з мутацією в S228, L234, L235 і / або D265, і / або містить мутацію PVA236. В одній формі здійснення мутації в біспецифічному, двовалентному антитілі знаходяться в IgG4 S228P і L235E і в IgG1 L234A і L235A. В іншому аспекті винаходу біспецифічне, двовалентне антитіло характеризується змістом a) важкого ланцюга і легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з першим антигеном; b) важкого ланцюга і легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з другим антигеном, де N-кінець важкого ланцюга сполучений з C-кінцем легкого ланцюга за допомогою пептидного лінкера; та де варіабельні домени VL і VH або константні домени CL і CH1 замінені один одним. Переважно домени CH3 даного формату біспецифічного, двовалентного антитіла змінені за допомогою технології "виступи-у-западини", яка детально описана з кількома прикладами, наприклад, в WO 96/027011, Ridgway JB, et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621; та Merchant, AM, et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681. При даному способі поверхні взаємодії двох доменів CH3 змінені, щоб підвищити гетеродімерізацію обох важких ланцюгів, що містять ці два домену CH3. Кожен з двох доменів CH3 (двох важких ланцюгів) може являти собою "виступ", тоді як іншої 18 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 представляє собою "западину". Введення дисульфідного містка стабілізує гетеродімери (Merchant, AM, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 2635) і підвищує вихід. Додаткові подробиці і форми здійснення див. вище. Інший аспект винаходу становить біспецифічне, двовалентне антитіло, що характеризується змістом a) важкого ланцюга і легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з першим антигеном; b) важкого ланцюга і легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з другим антигеном, де N-кінець важкого ланцюга сполучений з C-кінцем легкого ланцюга за допомогою пептидного лінкера; та де варіабельні домени VL і VH замінені один одним. Орієнтовна схема даного формату біспецифічного, двовалентного антитіла показана на Фіг. 2b, включаючи домени CH3, модифіковані як виступи-у-западини. Антитіла на основі даного формату біспецифічного, двовалентного антитіла названі в прикладах OAscXFab1. В одній формі здійснення таке біспецифічне антитіло характеризується змістом a) в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла SEQ ID NO: 39, та в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла SEQ ID NO: 40, та b) в якості важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, сполученого з легкого ланцюгом другого повнорозмірного антитіла через пептидний лінкер, SEQ ID NO: 38. Інший аспект винаходу становить біспецифічне, двовалентне антитіло, що характеризується змістом a) важкого ланцюга і легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з першим антигеном; b) важкого ланцюга і легкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, яке специфічно зв'язується з другим антигеном, де N-кінець важкого ланцюга сполучений з C-кінцем легкого ланцюга за допомогою пептидного лінкера; та де константні домени CL і CH1 замінені один одним. Орієнтовна схема даного формату біспецифічного, двовалентного антитіла показана на Фіг. 2c, включаючи домени CH3, модифіковані як виступи-у-западини. Антитіла на основі даного формату біспецифічного, двовалентного антитіла названі в прикладах OAscXFab2 і OAscXFab3. В одній формі здійснення таке біспецифічне антитіло характеризується змістом a) в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла SEQ ID NO: 42, та в якості легкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла SEQ ID NO: 43, та b) в якості важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, сполученого з легким ланцюгом другого повнорозмірного антитіла через пептидний лінкер, SEQ ID NO: 41. В одній формі здійснення таке біспецифічне антитіло характеризується змістом a) в якості важкого ланцюга першого повнорозмірного антитіла SEQ ID NO: 45, та в якості легким ланцюга першого повнорозмірного антитіла SEQ ID NO: 46, та b) в якості важкого ланцюга другого повнорозмірного антитіла, сполученого з легким ланцюгом другого повнорозмірного антитіла через пептидний лінкер, SEQ ID NO: 44. Антитіло згідно з винаходом продукують рекомбінантними методами. Таким чином, один аспект цього винаходу становить нуклеїнова кислота, що кодує антитіло згідно з винаходом, і наступний аспект становить клітина, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло згідно з винаходом. Способи рекомбінантного продукування широко відомі на рівні техніки і включають експресію білка в прокаріотичних і еукаріотичних клітинах з подальшим виділенням антитіла і зазвичай очищенням до фармацевтично прийнятної чистоти. Для експресії антитіл, як згадано вище, в клітині-господарі нуклеїнові кислоти, що кодують відповідним чином модифіковані легкі і важкі ланцюги, вбудовують в експресійні вектори стандартними способами. Експресію здійснюють в підходящих прокаріотичних і еукаріотичних клітинах-хазяїнах, таких як клітини CHO, клітини NS0, клітини SP2 / 0, клітини HEK293, клітини COS, клітини PER.C6, клітини дріжджів або E.coli, і антитіло виділяють з клітин (супернатанту або клітин після лізису). Загальні способи рекомбінантного продукування антитіл добре відомі на рівні техніки і описані, наприклад, в оглядових статтях Makrides, SC, Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880. Відповідно до однієї форми здійснення знаходиться спосіб отримання біспецифічного антитіла у відповідності з винаходом, який включає стадії a) трансформації клітини-господаря векторами, що містять молекули нуклеїнової кислоти, 19 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що кодують дане антитіло; b) культивування клітини-господаря в умовах, які дають можливість синтезу даного молекули антитіла; та c) виділення даного молекули антитіла з культури. Біспецифічні антитіла відповідним чином відокремлюють від культурального середовища загальноприйнятими методами очищення імуноглобулінів, такими як, наприклад, білок Aсефароза, хроматографія на гідроксиапатит, гель-електрофорез, діаліз або афінна хроматографія. ДНК і РНК, що кодує Моноклональні антитіла, легко виділяють і секвенують з використанням загальноприйнятих методів. Клітини гібридоми можуть служити в якості джерела такої ДНК і РНК. Як тільки ДНК виділена, її можна вбудовувати в експресійні вектори, які потім трансфікують в клітини-господарі, такі як клітини HEK 293, клітини CHO або клітини мієломи, які інакше не продукують білок імуноглобулін, щоб отримати синтез рекомбінантних моноклональних антитіл у клітинах-хазяїнах. Варіанти (або мутанти) амінокислотної послідовності біспецифічного антитіла одержують шляхом введення відповідних змін нуклеотидів в ДНК антитіла або шляхом нуклеотидного синтезу. Такі модифікації можна здійснювати, однак, тільки в дуже обмеженому діапазоні. Наприклад, модифікації не змінюють вищезгадані характеристики антитіла, такі як ізотипи IgG і зв'язування антигену, але можуть поліпшувати вихід рекомбінантного продукування, стабільність білка, або полегшувати очистку. Термін "клітина-хазяїн", як використовують у цій заявці, означає будь-який вид клітинної системи, яка може бути сконструйована для одержання антитіл у відповідності з цим винаходом. В одній формі здійснення в якості клітин-господарів використовують клітини HEK293 і клітини CHO. Як використовують в даній заявці, вирази "клітина", "клітинна лінія" та "клітинна культура" використовують як взаємозамінні, і всі такі позначення включають потомство. Таким чином, вирази "трансформанти" і "трансформовані клітини" включають первинні клітинисуб'єкти та культури, отримані від них, незалежно від числа пересівань. Також зрозуміло, що все потомство може не бути точно ідентичним за змістом ДНК за рахунок навмисних чи випадкових мутацій. Включені варіанти потомства, які мають таку ж функцію або біологічну активність на підставі скринінгу, що і початково трансформована клітина. Експресія в клітинах NS0 описана, наприклад, Barnes, LM, et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, LM, et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. Транзитна експресія описана, наприклад, Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. Клонування варіабельних доменів описано Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; та Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Бажана транзитна експресійної системи (HEK 293) описана Schlaeger, E.-J. і Christensen, K. в Cytotechnology 30 (1999) 71-83 і Schlaeger, E.-J. в J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199. Контрольні послідовності, які придатні для прокаріотів, наприклад, включають промотор, необов'язково операторну послідовність і сайт зв'язування рибосоми. Відомо, що еукаріотичні клітини використовують промотори, енхансери і сигнали поліаденілування. Нуклеїнова кислота "оперативно зчеплена", коли вона поміщена в функціональні взаємини з іншого нуклеїново-кислотною послідовністю. Наприклад, ДНК для препослідовності або секреторного лідера оперативно зчеплена з ДНК для поліпептиду, якщо вона експресується у вигляді пробілка, який бере участь у секреції поліпептиду; промотор або енхансер оперативно зчеплений з кодуючою послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію послідовності; або сайт зв'язування рибосоми оперативно зчеплений з кодуючою послідовністю, якщо він знаходиться в такому положенні, щоб сприяти трансляції. В цілому, "оперативно зчеплений" означає, що послідовності ДНК, які є зчепленими, є безперервними, а в разі секреторного лідера безперервними і знаходяться в одній рамці зчитування. Однак енхансери необов'язково повинні бути безперервними. Зчеплення здійснюють шляхом лігування в зручних сайтах рестрикції. Якщо таких сайтів не існує, використовують синтетичні олігонуклеотидні адаптери або лінкери відповідно до загальноприйнятої практики. Очистку антитіл здійснюють з метою видалення клітинних компонентів або інших забруднюючих речовин, наприклад, інших клітинних нуклеїнових кислот або білків, стандартними методами, включаючи обробку лугом / ДСН, Бендінг CsCl, колонкова хроматографія, електрофорез в агарозному гелі та інше добре відомі в даній галузі техніки. Див Ausubel, F., et al., Ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Добре розроблені і широко поширені різні методи, використовувані для очищення білка, такі як афінна хроматографія з білками мікроорганізмів (наприклад, афінна хроматографія з білком A або білком G), іонообмінна хроматографія (наприклад, катіонообмінна (карбоксиметилові смоли), аніонообмінних (аміноетилові смоли) і 20 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 комбінована обмінна), тіофільне поглинання (наприклад, з бета-меркаптоетанолом та іншими SH лігандами), хроматографія гідрофобної взаємодії або ароматична адсорбційна хроматографія (наприклад, з фенілсефарозою, аза-аренофільними смолами або метаамінофенілбороновою кислотою), афінна хроматографія з хелати металів (наприклад, з Ni (II) - і Cu (II)-аффінним матеріалом), ексклюзіонна хроматографія і електрофоретичні методи (такі як гель-електрофорез, капілярний електрофорез) (Vijayalakshmi, MA, Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102). Тепер виявлено, що біспецифічні антитіла проти VEGF людини і ANG-2 людини відповідно до цього винаходу мають цінні характеристики, такі як висока стабільність, і цінніи фармакокінетичні / фармакодинамічні властивості, такі як, наприклад, хороший (тобто повільний) кліренс (наприклад, в низьких дозах). Біспецифічні, двовалентні антитіла у відповідності з винаходом проявляють користь для пацієнтів-людей, що потребують терапії, спрямованої на VEGF і ANG-2. Крім того, вони мають біологічну або фармакологічну активність і виявляють інгібування пухлинного росту і / або інгібування пухлинного ангіогенезу in vivo. Біспецифічні антитіла у відповідності з винаходом високоефективні при a) інгібуванні пухлинного росту (наприклад, з біспецифічними антитілами відповідно до винаходу стаз пухлини може бути вже досягнутий при більш низьких концентраціях у порівнянні з комбінацією двох моноспецифічних антитіл (наприклад, в моделях пухлин COLO205 і KPL4 Прикладу 9 і 10 стаз пухлини був уже досягнутий з 10 мг / кг XMAb1 в порівнянні з комбінацією 10 мг / кг ANG2i-LC06+10 мг / кг авастину), та / або b) інгібуванні пухлинного ангіогенезу або судинних захворювань (наприклад, максимальні антиангіогенні ефекти з біспецифічними антитілами відповідно до винаходу можуть бути вже досягнуті при більш низьких концентраціях у порівнянні з комбінацією двох моноспецифічних антитіл (наприклад, в аналізі ангіогенезу рогівки миші Прикладу 8 максимальний антиангіогенним ефект був вже досягнутий з 10 мг / кг XMAb1 в порівнянні з комбінацією 10 мг / кг ANG2i-LC06+10 мг / кг авастину). Нарешті, двовалентне біспецифічне антитіло проти VEGF людини і ANG-2 людини відповідно до цього винаходу може мати цінний профіль ефективності / токсичності може забезпечувати корисні ефекти для пацієнта, що потребує терапії проти VEGF і проти ANG-2. Один аспект винаходу становить фармацевтична композиція, що містить антитіло відповідно до винаходу. Інший аспект винаходу становить застосування антитіла у відповідності з винаходом для отримання фармацевтичної композиції. Наступний аспект винаходу становить спосіб отримання фармацевтичної композиції, що містить антитіло відповідно до винаходу. В іншому аспекті в цьому винаході запропонована композиція, наприклад, фармацевтична композиція, що містить антитіло відповідно до цього винаходу, приготовлена разом з фармацевтично прийнятним носієм. Одну форму здійснення винаходу становить біспецифічне антитіло відповідно до винаходу для лікування раку. Інший аспект винаходу становить фармацевтична композиція для лікування раку. Інший аспект винаходу становить застосування антитіла у відповідності з винаходом для отримання лікарського засобу для лікування раку. Інший аспект винаходу становить спосіб лікування пацієнта, страждаючого на рак, шляхом введення антитіла у відповідності з винаходом пацієнту, потребуючому в такому лікуванні. Інший аспект винаходу становить фармацевтична композиція для попередження метастазів. Винахід включає біспецифічне антитіло відповідно до винаходу для попередження метастазів. Інший аспект винаходу становить застосування антитіла у відповідності з винаходом для отримання лікарського засобу для попередження метастазів. Інший аспект винаходу становить спосіб попередження метастазів у пацієнта, страждаючого первинним раком, шляхом введення біспецифічного антитіла у відповідності з винаходом пацієнту, потребуючому в такому превентивне лікування. Автори винаходу змогли показати високоефективне попередження спонтанних метастазів / вторинних пухлин in vivo в ортотопічній і в підшкірній моделі раку (див. Приклад 9) (в протилежність експериментальної моделі, де ракові клітини ін'єктують i.v. Дана модель подібна клінічної ситуації, де клітини діссемінують з первинної пухлини і метастазують у вторинний орган, такий як легеня або печінка (де вторинні пухлини). Термін "метастаз" відповідно до винаходу належить до переміщення ракових клітин з первинної пухлини в один або більш ніж один сайт в іншому місці у пацієнта, де потім розвиваються вторинні пухлини. Способи визначення того, метастазував рак, чи ні, відомі в 21 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 даній галузі техніки і включають сканування кісток, рентген грудної клітки, КТ сканування, МРТ сканування і тести на пухлинні маркери. Термін "попередження метастазів" або "попередження вторинних пухлин", як використовують в даній заявці, має таке ж значення і належить до профілактичного агенту проти метастазів у пацієнта, який страждає на рак, інгібуючи або зменшуючи таким шляхом подальше переміщення ракових клітин з первинної пухлини в один або більш ніж один сайт в іншому місці у пацієнта. Це означає, що метастаз первинної пухлини або раку попереджається, сповільнюється або зменшується, і, отже, розвиток вторинних пухлин попереджається, сповільнюється або зменшується. Переважно метастаз, тобто вторинні пухлини, легені попереджаються або зменшуються за рахунок того, що метастатичне переміщення ракових клітин з первинної пухлини в легені попереджається або зменшується. Як використовують в даній заявці, "фармацевтичний носій" включає будь-яке і всі розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні та протигрибкові агенти, ізотонічні агенти і агенти, що уповільнюють всмоктування, тощо, які є фізіологічно сумісними. Переважно носій придатний для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, парентерального, спінального або епідермального введення (наприклад, шляхом ін'єкції або інфузії). Композицію за даним винаходом можна вводити різноманітними способами, відомими в даній галузі техніки. Як зрозуміло фахівцям в даній галузі техніки, шлях і / або режим введення варіює залежно від бажаних результатів. Щоб ввести з'єднання по винаходу певними шляхами введення, може бути необхідно покрити з'єднання речовиною, яка запобігає його інактивацію, або вводити спільно з ним. Наприклад, з'єднання можна вводити суб'єкту у відповідному носії, наприклад, в ліпосоми, або розріджувачі. Фармацевтично прийнятні розріджувачі включають фізіологічний розчин і водні буферні розчини. Фармацевтичні носії включають стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для приготування стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій безпосередньо перед застосуванням. Використання таких середовищ і агентів для фармацевтично активних речовин відомо в даній галузі техніки. Вирази "парентеральне введення" і "вводиться парентерально", як використовують в даній заявці, означає режими введення, інші, ніж ентеральне і місцеве введення, зазвичай шляхом ін'єкції, і включає без обмеження внутрішньовенно, внутрішньом'язово, внутрішньоартеріально, подоболонково, інтракапсулярно, внутрішньоочно, внутрішньосерцево, внутришкірно, внутрішньочеревно, транстрахеально, підшкірно, субкутікулярно, внутрішньосуглобово, субкапсулярно, субарахноїдально, інтраспінально, епідуральну і інтрастернальну ін'єкцію і інфузію. Термін рак, як використовують в даній заявці, належить до проліферативних захворювань, таких як лімфоми, лімфоцитарні лейкози, рак легені, недрібноклітинний рак легені (НДКРЛ), бронхіолоальвеолярний рак легені, рак кістки, рак підшлункової залози, рак шкіри, рак голови чи шиї, підшкірна або внутрішньоочна меланома, рак матки, рак яєчника, рак прямої кишки, рак анальної області, рак шлунка, рак ШКТ, рак ободової кишки, рак молочної залози, рак шийки матки, карцинома фаллопієвих труб, карциноми ендометрія, карцинома шийки матки, карцинома піхви, карцинома вульви, хвороба Ходжкіна, рак стравоходу, рак тонкого кишечника, рак ендокринної системи, рак щитовидної залози, рак паращитовидної залози, рак наднирника, саркома м'якої тканини, рак уретри, рак пеніса, рак простати, рак сечового міхура, рак нирки або сечоводу, нирково-клітинний рак, карцинома ниркової балії, мезотеліома, печінково-клітинний рак, рак жовчного міхура, новоутворення центральної нервової системи (ЦНС), пухлини хребетного стовпа, гліома стовбура головного мозку, поліморфна гліобластома, астроцитоми, шваноми, епендимоми, медулобластома, менінгіоми, лускатій-клітинні карциноми, аденома гіпофіза та саркома Юінга, включаючи важко піддаються лікуванню варіанти будь-якого з вищевказаних раків або комбінацію одного або більше ніж одного з вищевказаних раків. Інший аспект винаходу становить біспецифічне антитіло відповідно до винаходу або фармацевтична композиція в якості антиангіогенним агента. Такий антиангіогенним агент можна застосовувати для лікування раку, зокрема, солідних пухлин, і інших судинних захворювань. Одну форму здійснення винаходу становить біспецифічне антитіло відповідно до винаходу для лікування судинних захворювань. Інший аспект винаходу становить фармацевтична композиція для лікування судинних захворювань. Інший аспект винаходу становить застосування антитіла у відповідності з винаходом для отримання лікарського засобу для лікування судинних захворювань. Інший аспект винаходу становить спосіб лікування пацієнта, страждаючого судинними захворюваннями, шляхом введення антитіла у відповідності з винаходом пацієнту, 22 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 потребуючому в такому лікуванні. Термін "судинні захворювання" включає рак, запальні захворювання, атеросклероз, ішемію, травму, сепсис, ХОЗЛ, астму, діабет, ВМД, ретинопатію, удар, ожиріння, гостре легеневе пошкодження, кровотеча, судинний витік, наприклад, індуковану цитокінами, алергію, хвороба Грейвса, аутоімунний тиреоїдит Хасімото, ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура, гігантоклітинний артеріїт, ревматоїдний артрит, системний червоний вовчак (ВКВ), вовчаковий нефрит, хвороба Крона, розсіяний склероз, неспецифічний виразковий коліт, особливо для солідних пухлин, внутрішньоочні неоваскулярной синдроми, такі як проліферативні ретинопатії або вікова макулярна дегенерація (ВМД), ревматоїдний артрит і псоріаз (Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M., et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239; та Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, GK, (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp 1625-1710). Дані композиції можуть також містити ад'юванти, такі як консерванти, зволожуючі агенти, емульгуючі агенти і диспергуючі агенти. Запобігання присутності мікроорганізмів можна забезпечити як методами стерилізації, див. вище, так і шляхом включення різних антибактеріальних і протигрибкових агентів, наприклад, парабену, хлорбутанолу, фенолу, сорбінової кислоти і тому подібного. Може бути також бажаним включати в композиції ізотонічні агенти, такі як цукри, хлорид натрію тощо. Крім того, пролонговане всмоктування ін'єкційної фармацевтичної форми може бути викликано шляхом включення агентів, які уповільнюють всмоктування, таких як моностеарат алюмінію і желатин. Незалежно від обраного шляху введення, з'єднання за даним винаходом, які можна використовувати в підходящої гідратованій формі, і / або фармацевтичні композиції за даним винаходом включають в фармацевтично прийнятні лікарські форми загальноприйнятими способами, відомими фахівцям в даній галузі техніки. Фактичні рівні дози активних інгредієнтів у фармацевтичних композиціях за даним винаходом можуть варіювати таким чином, щоб отримати кількість активного інгредієнта, ефективне для досягнення бажаної терапевтичної відповіді для конкретного пацієнта, композиції та режиму введення, яка не є токсичним для пацієнта. Обраний рівень дози залежить від ряду фармакокінетичних факторів, які включають активність конкретних застосовуваних композицій за даним винаходом, шлях введення, час введення, швидкість виділення конкретного застосовуваного з'єднання, тривалість лікування, інші лікарські засоби, з'єднання та / або речовини, використовувані в комбінації з конкретними застосовуваними композиціями, вік, стать, масу, стан, загальний стан здоров'я і анамнез пацієнта, що підлягає лікуванню, і подібні фактори, добре відомі в медичних галузях. Композиція повинна бути стерильною і текучою до такої міри, щоб цю композицію можна було доставляти через шприц. Крім води, носій бажано представляє собою ізотонічний забуференний фізіологічний розчин. Відповідну плинність можна підтримувати, наприклад, шляхом використання покриття, такого як лецитин, за рахунок збереження необхідного розміру частинок у випадку дисперсії і шляхом використання сурфактантів. У багатьох випадках переважно включати в композицію ізотонічні агенти, наприклад, цукри, багатоатомні спирти, такі як маніт або сорбіт, і хлорид натрію. Як використовують в даній заявці, вирази "клітина", "клітинна лінія" та "клітинна культура" використовують як взаємозамінні, і всі такі позначення включають потомство. Таким чином, слова "трансформанти" і "трансофрмірованние клітини" включають первинну клітину-суб'єкт і культури, що мають походження від неї, незалежно від числа пересівань. Також зрозуміло, що всі потомство може не бути точно ідентичним за змістом ДНК за рахунок навмисних чи випадкових мутацій. Включені варіанти потомства, які мають таку ж функцію або біологічну активність на підставі скринінгу, що і початково трансформована клітина. Де увазі окремі позначення, буде зрозуміло з контексту. Термін "трансформація", як використовують в даній заявці, належить до процесу переносу векторів / нуклеїнової кислоти в клітину-господаря. Якщо в якості клітин-господарів використовують клітини без важко переборних бар'єрів клітинної стінки, трансфекції здійснюють, наприклад, методом кальційфосфатної преципітації, як описано Graham, FL, van der Eb, AJ, Virology 52 (1973) 546-467. Однак можна також використовувати інші способи введення ДНК в клітини, такі як ядерна ін'єкція або злиття протопластів. Якщо використовують прокаріотичні клітини або клітини, які містять суттєві конструкції клітинної стінки, один з методів трансфекції є, наприклад, обробка кальцієм з використанням хлориду кальцію, як описано Cohen, SN, et al., PNAS. 69 (1972) 2110-2114. Як використовують в даній заявці, "експресія" належить до процесу, за допомогою якого 23 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеїнова кислота транскрибується в мРНК і / або до процесу, за допомогою якого транскрибувати мРНК (також звана транскриптом) згодом транслюється в пептиди, поліпептиди або білки. Транскрипти і закодовані поліпептиди всі разом називають генним продуктом. Якщо полінуклеотид має походження з геномної ДНК, експресія в еукаріотичній клітині може включати сплайсинг мРНК. "Вектор "являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, зокрема, що самореплікується, яка переносить вбудовану молекулу нуклеїнової кислоти в клітини-господарі та / або між ними. Цей термін включають вектори, які діють, в основному, для вбудовування ДНК або РНК в клітину (наприклад, хромосомної інтеграції), вектори, що реплікується, які діють, в основному, для реплікації ДНК або РНК, і експресійні вектори, які діють для транскрипції і / або трансляції ДНК або РНК. Включені також вектори, які забезпечують більш ніж одну з описаних функцій. "Експресійний вектор" являє собою полінуклеотид, який при введенні в відповідну клітинугосподаря може транскрибувати і транслюватиметься в поліпептид. "Експресійна система" зазвичай належить до підходящої клітини-господаря, що містить експресійний вектор, який може діяти для виходу бажаного продукту експресії. Наведені нижче приклади, перелік послідовностей і графічні матеріали запропоновані, щоб сприяти розумінню даного винаходу, дійсний обсяг якого представлений в прикладеній формулі винаходу. Зрозуміло, що в вищевикладених способах можна виробляти модифікації без відхилення від суті винаходу. Опис переліку послідовностей (амінокислотні послідовності) SEQ ID NO:1 варіабельный домен важкого ланцюга VH of бевацизумаб SEQ ID NO:2 варіабельный домен легкого ланцюга VL бевацизумаб SEQ ID NO:3 варіабельный домен важкого ланцюга VH of E6Q SEQ ID NO:4 варіабельный домен легкого ланцюга VL of E6Q SEQ ID NO: 5 XMab1 – легкий ланцюг SEQ ID NO: 6 XMab1 – легкий ланцюг SEQ ID NO: 7 XMab1 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 8 XMab1 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 9 XMab2 – легкий ланцюг SEQ ID NO: 10 XMab2 – легкий ланцюг SEQ ID NO: 11 XMab2 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 12 XMab2 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 13 XMab3 – легкий ланцюг SEQ ID NO: 14 XMab3– легкий ланцюг SEQ ID NO: 15 XMab3 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 16 XMab3 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 17 XMab4 – легкий ланцюг SEQ ID NO: 18 XMab4– легкий ланцюг SEQ ID NO: 19 XMab4 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 20 XMab4 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 21 XMab5 – легкий ланцюг SEQ ID NO: 22 XMab5 – легкий ланцюг SEQ ID NO: 23 XMab5 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 24 XMab5 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 25 XMab6 – легкий ланцюг SEQ ID NO: 26 XMab6 – легкий ланцюг SEQ ID NO: 27 XMab6 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 28 XMab6 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 29 OAscFab1 – важкий ланцюг і легкий ланцюг, з'єднані пептидом SEQ ID NO: 30 OAscFab1 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 31 OAscFab1 – легкий ланцюг SEQ ID NO: 32 OAscFab2 – важкий ланцюг і легкий ланцюг, з'єднані пептидом SEQ ID NO: 33 OAscFab2 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 34 OAscFab2 – легкий ланцюг SEQ ID NO: 35 OAscFab3 – важкий ланцюг і легкий ланцюг, з'єднані пептидом SEQ ID NO: 36 OAscFab3 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 37 OAscFab3 – легкий ланцюг SEQ ID NO:38 OAscXFab1 – важкий ланцюг і легкий ланцюг, з'єднані пептидом SEQ ID NO: 39 OAscXFab1 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 40 OAscXFab1 – легкий ланцюг 24 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO: 41 OAscXFab2 – важкий ланцюг і легкий ланцюг, з'єднані пептидом SEQ ID NO: 42 OAscXFab2 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 43 OAscXFab2 – легкий ланцюг SEQ ID NO: 44 OAscXFab3 – важкий ланцюг і легкий ланцюг, з'єднані пептидом SEQ ID NO: 45 OAscXFab3 – важкий ланцюг SEQ ID NO: 46 OAscXFab3 – легкий ланцюг SEQ ID NO: 47 Фактор росту ендотелія судин людини (VEGF) SEQ ID NO: 48 Ангіопоетин-2 людини (ANG-2) Експериментальні методи Приклади Матеріали і загальні методи Загальна інформація щодо нуклеотидних послідовностей легких і важких ланцюгів імуноглобулінів людини наведена в: Kabat, EA, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Амінокислоти ланцюгів антитіла пронумеровані і названі відповідно до нумерації EU (Edelman, GM, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, EA, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)). Методи рекомбінантних ДНК Для маніпуляцій з ДНК використані стандартні методи, як описано в Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Молекулярно-біологічні реагенти використовували відповідно до інструкцій виготовлювача. Синтез генів Бажані генні сегменти можуть бути отримані з олігонуклеотидів, отриманих шляхом хімічного синтезу. Генні сегменти, які фланковані унікальними сайтами ендонуклеаз рестрикції, збирали шляхом відпалу та лігування нуклеотидів, включаючи ПЦР ампліфікації, а потім клонували допомогою вказаних сайтів рестрикції, наприклад, KpnI / SacI або AscI / PacI, в клонуючому векторі pGA4 на основі pPCRScript (Stratagene). Послідовності ДНК субклонованих генних фрагментів підтверджували за допомогою секвенування ДНК. Фрагменти для генного синтезу замовляли у відповідності з наведеними описами в Geneart (Regensburg, Germany). Всі генні сегменти, які кодують легкі і важкі ланцюги біспецифічних антитіл Ang-2/VEGF, синтезували з 5'-кінцевою послідовністю ДНК, що кодує лідерний пептид (MGWSCIILFLVATATGVHS), який направляє білки на секрецію в еукаріотичних клітинах, і з унікальними сайтами рестрикції на 5 'і 3 'кінцях синтезованого гена. Послідовності ДНК, що несуть важкі ланцюги, стабілізовані дисульфідами та модифіковані як "виступи-у-западини", були сконструйовані з мутаціями S354C і T366W в "виступах" важкого ланцюга і мутаціями Y349C, T366S, L368A і Y407V під "западинах" важкого ланцюга. Визначення послідовності ДНК Послідовності ДНК визначали за допомогою двохниткового секвенування, проведеного в MediGenomix GmbH (Martinsried, Germany) або Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Germany). Аналіз послідовності ДНК і білка і управління даними послідовностей Для створення, картування, аналізу, анотації та ілюстрації послідовностей використовували програмне забезпечення GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) версія 10.2, і Infomax's Vector NT1 Advance suite, версія 8.0. Експресійні вектори Для експресії бажаних варіантів антитіл використовували експресійні плазміди для транзитної експресії (наприклад, в клітинах HEK293 EBNA або HEK293-F) або для стабільної експресії (наприклад, в клітинах CHO) на основі або організації кДНК з промотором CMV-інтрон A, або геномної організації з промотором CMV (наприклад, Фіг. 2B). Крім експресійної касети антитіла, вектори містили: - точку початку реплікації, яка дає можливість реплікації цієї плазміди в E. coli, і ген β- лактамази, який надає стійкість до ампцілліну в E. coli. Транскрипційна одиниця гена антитіла складається з наступних елементів: - унікальний сайт(и) рестрикції на 5" кінці, - негайно-раній енхансер і промотор від цитомегаловірусу людини, - з наступною послідовністю Інтрона A в разі організації кДНК, - 5’- нетрансльовану область гена антитіла людини, - сигнальну послідовність важкого ланцюга імуноглобуліну, - ланцюг антитіла людини (важкий ланцюг, модифікований важкий ланцюг або легкий 25 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ланцюг) або у вигляді кДНК, або у вигляді геномної організації, з екзон-інтронною організацією імуноглобуліну, - 3’- етрансльовану область з послідовністю сигналу поліаденілування, - унікальний сайт(и) рестрикції на 3" кінці. Для транзитних і стабільних трансфекцій великі кількості плазмід отримували шляхом отримання плазмідних препаратів з трансформованих культур E. coli (Nucleobond AX, MachereyNagel). Методи клітинних культур Стандартні методи клітинних культур використовували, як описано в Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc… Транзитні трансфекції в системі HEK293-F Рекомбінантні варіанти імуноглобулінів експресували шляхом транзитної трансфекції клітин ембріональних нирок людини 293-F, використовуючи експресійної систему FreeStyle ™ 293 у відповідності з інструкцією виробника (Invitrogen, USA). Коротко, суспензію клітин FreeStyle™ 293-F культивували в експресійному середовищі FreeStyle™ 293 при 37 °C/8 % CO2, та клітини 6 висівали у свіже середовище при щільності 1-2 × 10 життєздатних клітин / мл на добу трансфекції. Комплекси DNA-293fectin ™ готували в середовищі Opti-MEM I (Invitrogen, USA), використовуючи 325 мкл 293fectin ™ (Invitrogen, Germany) та 250 мкг плазмідної ДНК важкого і легкого ланцюга в молярному відношенні 1:1 для кінцевого обсягу трансфекції 250 мл для моноспецифічних батьківських антитіл. Комплекси "виступи-у-западини" ДНК-293fectin з двома важкими ланцюгами і одним легким ланцюгом готували в середовищі Opti-MEMÒ I (Invitrogen, USA), використовуючи 325 мкл 293fectin™ (Invitrogen, Germany) і 250 мкг плазмідної ДНК важкого ланцюга "виступи-у-западини" 1 і 2 та легкого ланцюга, зазвичай у молярному відношенні 1:1:1, для кінцевого обсягу трансфекції 250 мл (OAscFab і OAscXFab). Для оптимізації виходу експресії це відношення можна варіювати. Комплекси XMab ДНК-293fectin готували в середовищі Opti-MEMÒ I (Invitrogen, USA), використовуючи 325 мкл 293fectin ™ (Invitrogen, Germany) та 250 мкг плазмідної ДНК важкого ланцюга "виступи-у-западини" 1 і 2 і легкого ланцюга в молярному відношенні 1:1:1, для кінцевого обсягу трансфекції 250 мл. Для оптимізації виходу експресії це відношення можна варіювати. Супернатант клітинної культури, що містять антитіло, збирали через 7 діб після трансфекції шляхом центрифугування при 14000 g протягом 30 хвилин і фільтрували через стерильний фільтр (0,22 мкм). Супернатант зберігали при -20° C до очищення. Визначення білка Концентрацію білка очищених антитіл та їх похідних визначали шляхом визначення оптичної щільності (OD) при 280 нм, використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції, обчислений на підставі амінокислотної послідовності відповідно до Pace, CN, et. al., Protein Science 4 (1995) 2411-1423. Визначення концентрації антитіла в супернатантах Концентрацію антитіл та їх похідних в супернатантах клітинних культур визначали шляхом іммунопреціпітаціі з гранулами агарози з білком A (Roche). 60 мкл агарозном гранул з білком A промивають три рази в TBS-NP40 (50 мМ Тріс, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1 % Нонідет-P40). Потім 115 мл супернатанту клітинної культури наносять на агарозні гранули з білком A, врівноважені в TBS-NP40. Після інкубації протягом 1 год. при кімнатній температурі гранули промивають на фільтраційній колонці Ultrafree-MC (Amicon) один раз 0,5 мл TBS-NP40, двічі 0,5 мл 2x фосфатно-сольового буфера (2xФСБ, Roche) і короткочасно чотири рази 0, 5 мл 100 мМ Naцитратом pH 5,0. Пов'язане антитіло елююють додаванням 35 мкл буфера для зразків NuPAGE ® LDS (Invitrogen). Половину зразка об'єднують з відновлюючим агентом для зразка NuPAGE ® або залишають невідновленним, відповідно, і нагрівають протягом 10 хв при 70° C. Потім 20 мкл наносять на 4-12 % Біс-Тріс ДСН-ПААГ NuPAGE ® (Invitrogen) (з буфером MOPS для непоновлення ДСН-ПААГ і з буфером MES з антиоксидантною добавкою для буфера пробігу NuPAGE ® (Invitrogen) для відновленого ДСН-ПААГ) і забарвлюють Кумассі синім. Концентрацію антитіл та їх похідних в супернатантах клітинних культур вимірювали шляхом хроматографії білок A-ВЕРХ. Коротко, супернатанти клітинних культур, що містять антитіла та їх похідні, які зв'язуються з білком A, наносили на колонку HiTrap білок A (GE Healthcare) в 50 мМ K2HPO4, 300 мМ NaCl, pH 7,3 і елюювалі з матриксу 550 мМ оцтової кислотою, pH 2,5 на системі ВЕРХ Dionex. Елюйований білок визначали кількісно за допомогою поглинання УФ світла і інтегрування площ піків. Очищене стандартне антитіло IgG1 служило в якості стандарту. Альтернативно концентрацію антитіл та їх похідних в супернатантах клітинних культур вимірювали шляхом сендвіч-аналізу IgG ELISA. Коротко, 96-лункові мікротитраційні планшети 26 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 StreptaWell з високим зв'язуванням стрептавідіну A (Roche) покривали 100 мкл / лунка біотінілованою іммобілізованою молекулою IgG проти людини F (ab ') 2 BI (Dianova) при 0,1 мкг / мл в протягом 1 год. при кімнатній температурі або альтернативно протягом ночі при 4° C і послідовно промивали три рази 200 мкл / лунка ФСБ, 0,05 % Твін (ФСБT, Sigma). 100 мкл / лунка серійних розведень в ФСБ (Sigma) відповідних супернатант клітинних культур, що містять антитіло, додавали в лунки і інкубували протягом 1-2 год. на струшувач для мікротитраційних планшетів при кімнатній температурі. Лунки промивали три рази 200 мкл / лунка ФСБT, і пов'язане антитіло виявляли за допомогою 100 мкл F (ab ') 2 POD (Dianova) при 0,1 мкг / мл в якості ідентифікуючого антитіла протягом 1-2 год. на струшувач для мікротитраційних планшетів при кімнатній температурі. Незв'язане ідентифікуюче антитіло відмивали три рази 200 мкл / лунка ФСБT, і пов'язане ідентифікуюче антитіло виявляли шляхом додавання 100 мкл ABTS / лунка. Визначення поглинання здійснювали на спектрометрі Tecan Fluor при довжині хвилі вимірювання 405 нм (еталонна довжина хвилі 492 нм). Очистка біспецифічних антитіл Біспецифічні антитіла очищали з супернатантів клітинних культур шляхом афінної хроматографії, використовуючи білок A-сефарозуTM (GE Healthcare, Sweden) і ексклюзійну хроматографію Superdex200. Коротко, стерильно профільтрувати супернатанти клітинних культур наносили на колонку HiTrap ProteinA HP (5 мл), врівноважену буфером ФСБ (10 мМ Na2HPO4, 1 мМ KH2PO4, 137 мМ NaCl та 2,7 мМ KCl, pH 7,4). Незв'язані білки відмивали буфером для врівноваження. Антитіло і варіанти антитіла елюювалі 0,1 M цитратним буфером, pH 2,8, і фракції, що містять білок, нейтралізували 0,1 мл 1 M Тріс, pH 8,5. Потім елюйовані білкові фракції об'єднували, концентрували за допомогою центрифугового фільтрувального пристрою Amicon Ultra (MWCO: 30 K, Millipore) до обсягу 3 мл і наносили на колонку для гельфільтрації Superdex200 HiLoad 120 мл 16/60 (GE Healthcare, Sweden), врівноважену 20 мМ гістидином, 140 мМ NaCl, pH 6,0. Фракції, що містять очищені біспецифічні антитіла менше ніж з 5 % високомолекулярних агрегатів, об'єднували і зберігали у вигляді малих аліквотах за 1,0 мг / мл при -80° C. ДСН-ПААГ електрофорез Систему готового гелю NuPAGE ® (Invitrogen) використовували відповідно до інструкції виробника. Зокрема, використовували готові 4-20 % Тріс-гліцінові гелі NuPAGE ® Novex ® та Тріс-гліцінові буфер пробігу з ДСН Novex ® (див., наприклад, Фіг. 3). Відновлення зразків було досягнуто шляхом додавання агента для відновлення зразків NuPAGE ® перед проведенням гель-електрофорезу. Аналітична ексклюзійна хроматографія Ексклюзійну хроматографію для визначення агрегації і олігомерного стану антитіл проводили за допомогою хроматографії ВЕРХ. Коротко, антитіла, очищені білком A, наносили на колонку Tosoh TSKgel G3000SW в 300 мМ NaCl, 50 мМ KH2PO4/K2HPO4, pH 7,5 на системі ВЕРХ Agilent 1100 або на колонку Superdex 200 (GE Healthcare) в 2x ФСБ на системі ВЕРХ Dionex. Елюйований білок визначали кількісно шляхом поглинання в УФ світлі і інтегрування площ піків. Стандарт для гель-фільтрації BioRad 151-1901 служив в якості стандарту (див., наприклад, Фіг. 4). Мас-спектрометрія Сумарну деглікозільовану масу кроссоверних антитіл визначали і підтверджували за допомогою мас-спектрометрії з іонізацією електророзпиленням (ІЕР-МС). Коротко, 100 мкг очищених антитіл деглікозілювали 50 мЕ N-глікозідази F(PNGaseF, ProZyme) в 100 мМ KH2PO4/K2HPO4, pH 7 при 37° C протягом 12-24 год. при концентрації білка аж до 2 мг / мл, а потім знесолюючих за допомогою ВЕРХ на колонці Sephadex G25 (GE Healthcare). Масу відповідних важких і легких ланцюгів визначали за допомогою ІЕР-МС після деглікозілювання і відновлення. Коротко, 50 мкг антитіла в 115 мкл інкубували з 60 мкл 1M TCEP і 50 мкл 8 M гуанідину гідрохлориду з подальшим знесоленням. Сумарну масу і масу відновлених важких і легких ланцюгів визначали за допомогою ІЕР-МС на системі МС Q-Star Elite, обладнаної джерелом NanoMate. Одержання клітинної лінії HEK293-Tie2 З метою визначення взаємодії антитіл до ангіопоетину-2 зі стимульованим ANGPT2 фосфорилюванням Tie2 і зв'язування ANGPT2 з Tie2 на клітинах була отримана рекомбінантна клітинна лінія HEK293-Tie. Коротко, плазміду на основі pcDNA3 (RB22-pcDNA3 Topo hTie2), що кодує повнорозмірний Tie2 людини (SEQ ID 108) під контролем промотора CMV і маркер стійкості до неоміцину, трансфікували, використовуючи FuGENE (Roche Applied Science) в якості реагенту трансфекції, в клітини HEK293 (ATCC), і стійкі клітини відбирали в DMEM з 10 % 27 UA 110932 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 FCS, 500 мкг / мл G418. Індивідуальні клони виділяли за допомогою циліндра для клонування, а потім аналізували на експресію Tie2 за допомогою FACS (сортування флуоресцентноактивованих клітин). Клон 22 був ідентифікований як клон з високою і стабільною експресією Tie2 навіть у відсутність G418 (HEK293-Tie2 клон 22). Потім HEK293-Tie2 клон 22 використовували для клітинних аналізів: індукованого ANGPT2 фосфорилювання Tie2 і клітинного аналізу зв'язування ліганда ANGPT2. Аналіз індукованого ANGPT2 фосфорилювання Tie2 Інгібування індукованого ANGPT2 фосфорилювання Tie2 антитілами до ANGPT2 вимірювали відповідно до описаного нижче принципу аналізу. HEK293-Tie2 клон 22 стимулювали ANGPT2 протягом 5 хвилин у відсутність або у присутності ANGPT2, і P-Tie2 визначали кількісно за допомогою сендвіч-аналізу ELISA. Коротко, 2 × 105 клітин HEK293-Tie2 клон 22 на лунку вирощували протягом ночі на покритому полі-D-лізином 96 лунковому мікротитраційному планшеті в 100 мкл DMEM, 10 % FCS, 500 мкг / мл генетіціна. На наступну добу готували титраційний ряд антитіл ANGPT2 в мікротитраційному планшеті (4-кратно концентровані, 75 мкл кінцевий обсяг / лунка, два повтори) і змішували з 75 мкл розведення ANGPT2 (R & D systems # 623-AN) (3,2 мкг / мл в як розчин 4-кратної концентрації). Антитіла і ANGPT2 попередньо інкубували протягом 15 хв при кімнатній температурі. 100 мкл суміші додавали до клітин HEK293-Tie2 клон 22, (попередньо інкубували протягом 5 хв з 1 мМ NaV3O4, Sigma # S6508) і інкубували протягом 5 хв при 37° C. Потім клітини промивали 200 мкл охолодженого в льоду ФСБ + 1 мМ NaV3O4 на лунку і піддавали лізису шляхом додавання 120 мкл буфера для лізису (20 мМ Тріс, pH 8,0, 137 мМ NaCl, 1 % NP-40, 10 % гліцерин, 2 мМ ЕДТА, 1 мМ NaV3O4, 1 мМ ФМСФ і 10 мкг / мл апротиніну) на лунку на льоду. Клітини піддавали лізису протягом 30 хв при 4° C на струшувач для мікротитраційних планшетів, і 100 мкл лізату переносили безпосередньо на мікротітраціонний планшет для p-Tie2 ELISA (R & D Systems, R & D # DY990) без попереднього центрифугування і без визначення сумарного білка. Кількості PTie2 визначали кількісно відповідно до інструкцій виробника, і значення IC50 для інгібування визначали, використовуючи плагін аналізу XLfit4 для Excel (одноцентровую модель дозавідповідь 205). Значення IC50 можна порівнювати всередині експерименту, але вони можуть варіювати від одного експерименту до іншого. Аналіз індукованої VEGF проліферації HUVEC Індукована VEGF проліферація HUVEC (ендотеліальні клітини пупкової вени людини, Promocell # C-12200) була обрана для вимірювання клітинної функції антитіл до VEGF. Коротко, 5000 клітин HUVEC (низьке число пасажів, не більше 5 пасажів) на 96 лунок інкубували в 100 мкл виснаженого середовища (EBM-2 ендотеліальне базове середовище 2, Promocell # C22211, 0,5 % FCS, пеніцилін / стрептоміцин) в покритому колагеном I 96-лунковому мікротитраційному планшеті BD Biocoat Collagen (BD # 354407/35640) протягом ночі. Концентрації антитіла, що варіюється змішували з rhVEGF (кінцева концентрація 30 нг / мл, BD # 354107) і попередньо інкубували протягом 15 хвилин при кімнатній температурі. Потім суміш додавали до клітин HUVEC і інкубували їх протягом 72 год. при 37° C, 5 % CO2. На добу аналізу планшет врівноважували до кімнатної температури протягом 30 хв і визначали життєздатність / проліферацію клітин, використовуючи набір для люмінесцентного аналізу життєздатності клітин CellTiter-GloTM у відповідності з керівництвом (Promega, # G7571/2/3). Люмінесценцію визначали на спектрофотометрі. Приклад 1a Експресія та очистка молекул біспецифічного, двовалентного антитіла, що з обміном доменів XMab У відповідності з методами, описаними вище в матеріалах і методах, молекули біспецифічного, двовалентного антитіла з обміном доменів XMab1, XMab1 і XMab3 експресували і очищали. Ділянки VH і VL (SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2) засновані на бевацизумаб. Ділянка VH (SEQ ID NO: 3) був отриманий шляхом мутації E6Q (вихідна амінокислота глутамінова кислота (E) в положенні 6 була замінена глутаміном (Q)) послідовності VH ANG2i-LC06 (яка описана в заявці PCT № PCT/EP2009 / 007182 (WO2010/040508), і яка являє собою фрагмент, підданий подальшому дозріванню, послідовності, отриманої за допомогою фагового дисплея). Ділянка VL (SEQ ID NO: 4) був отриманий з послідовностей VL ANG2i-LC06 (див. заявку PCT № PCT/EP2009/007182 (WO2010/040508)). Молекули біспецифічного, двовалентного антитіла з обміном доменів XMab1, XMab2 і XMab3 експресували і очищали. Релевантні амінокислотні послідовності легким і важкого ланцюга цих біспецифічних, двовалентних антитіл представлені в SEQ ID NO: 5-8 (XMab1), в SEQ ID NO: 9-12 (XMab2) і в SEQ ID NO: 13-16 (XMab3). Приблизну структуру див. на Фіг. 1. 28