Анти-vegf антитіло та його застосування

Реферат: Винахід належить до антитіл, що специфічно зв'язуються з фактором росту ендотелію судин (VEGF), та застосування таких антитіл для лікування хвороб, пов'язаних з активністю та/або надвиробництвом VEGF. UA 104626 C2 (12) UA 104626 C2 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ця заявка претендує на привілеї, що надаються у зв'язку з поданням попередньої заявки 35 U.S.C. § 119(e) of U.S. provisional application no. 61/218,005, яка була подана 17.06. 2009, та зміст якої надано тут у якості посилання у своєї повноті. Заява містить перелік послідовностей, внесених на розгляд у EFS-Web та наданих тут у своєї повноті у якості посилання. Вказана копія ASCII, отримана 15.06. 2010, має назву 381493PC.txt та має розмір 141,482 байтів. Заявлений винахід стосується анти-vegf антитіл, фармацевтичних композицій, що містять анти-vegf антитіла, та терапевтичного застосування таких антитіл. Ангіогенез є привабливою терапевтичною мішенню завдяки його участі у різноманітних патологічних станах, в тому числі у пухлинному рості, проліферативних ретинопатіях, вікової макулярної дегенерації, при ревматоїдному артриті (RA) та псоріазі (Folkman et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:10931-10934). Перша ознака специфічних молекулярних ангіогенних факторів заснована на спостереженні сильної неоваскулярної відповіді, індукованої трансплантованими пухлинами. Відомо, що ангіогенез є важливим для росту більшості первинних пухлин та їх подальшого метастазування. Існують багато молекул, пов'язаних з позитивною регуляцією ангіогенезу, в тому числі трансформуючий фактор росту (TGF)-α, TGF-β, фактор росту гепатоцитів (HGF), α- фактор некрозу пухлин, ангіогенін, інтерлейкін (IL)-8 та судинний ендотеліальний фактор росту (VEGF, також відомий, як VEGFA, або судинний фактор проникності (VPF)) (Ferrara et al., 2003, Nature Medicine 9:669-676). Білки VEGF є важливими сигнальними білками, що беруть участь у нормальному ембріональному васкулогенезі (утворенні de novo ембріональної циркуляторної системи) та аномальному ангіогенезі (зростання кровоносних судин з попередньо існуючої судинної мережі) (Ferrara et al., 1996, Nature 380:439-442; Dvorak et al., 1995, Am. J. Pathol. 146:1029-1039). VEGF пов'язаний з твердими пухлинами та гематологічними онкозахворюваннями, міжочними неоваскулярними синдромами, запаленням та набряком мозку та патологією жіночого репродуктивного тракту (Ferrara et al., 2003, Nature Medicine 9:669-676). мРНК VEGF має надлишкову експресію у багатьох пухлинах людини, в тому числі у пухлинах легенів, молочної залози, шлунково-кишкового тракту, нирок, підшлункової залози та яєчників (Berkman et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:153-159). Збільшення кількості VEGF у водній та рідкій частині склоподібного тіла очей пов'язане з різними ретинопатіями (Aiello et al., 1994, N. Engl. J. Med. 331:1480-1487). Вікова макулярна дегенерація (AMD), головна причина втрати зору у похилому віці відбувається завдяки неоваскулярізації та судинному витоку. Була показана локалізація VEGF у хороїдальних неоваскулярних мембранах у пацієнтів, хворих на AMD (Lopez et al., 1996, Invest. Ophtalmo.Vis. Sci. 37:855-868). Родина гену VEGF охоплює прототипичний член VEGFA, а також VEGFB, VEGFC, VEGFD, та плацентарний фактор росту (PLGF). Ген VEGFA людини являє собою вісім екзонів, відокремлених сімома інтронами. Існують щонайменш шість різних ізоформ VEGF, як-то: VEGF121, VEGF145, VEGF162, VEGF165, VEGF165b, VEGF183, VEGF189, та VEGF206, де нижні індекси відносяться до числа амінокислот, що залишилися після сигнального розщеплення. Нативний VEGF є гомодимерним гепарин-зв'язуючим глікопротеїном (Ferrara et al., 2003, Nature Medicine 9:669-676) у 45kDa. VEGF (особливо VEGFA) зв'язується з двома спорідненими рецепторними тирозин-кіназами, VEGFR-1 (що також відома, як Flt-1) та VEGFR-2 (що також відома, як Flk-1, або як кіназний доменний регіон (KDR), або CD309). Кожен рецептор має сім позаклітинних та один трансмембранний регіон. VEGF також зв'язується з нейропілінами NRP1 (також відомий, як рецептор судинного ендотеліального клітинного фактора росту 165 (VEGF165R) або CD304) та NRP2 (також відомий, як рецептор 2 судинного ендотеліального клітинного фактора росту 165 (VEGF165R2)). Враховуючи його центральну роль у регуляторному ангіогенезі, VEGF є привабливою мішенню для терапевтичного втручання. Крім того, для лікування неопластичних захворювань зараз розробляються різноманітні терапевтичні стратегії, що ставлять за мету блокування VEGF або його рецепторної сигнальної системи. Анти-vegf антитіло Бевацизумаб, також знане, як rhuMAb VEGF або Avastin®, є рекомбінантним гуманізованим анти-vegf моноклональним антитілом, що отримано та продається компанією Genentech (Presta et al., 1997, Cancer Res. 57:4593-4599). Для отримання цього препарату, регіони, що визначають компліментарність (CDR) мишачого анти-vegf моноклонального антитіла A.4.6.1 були щеплені у каркасні та сталий IgG регіон людини. Далі, для поліпшення зв'язування, у молекулу ввели додаткові мутації за межами CDR, з отриманням антитіла, у якому ~93 % амінокислотної послідовності походить від IgG1 людини та ~7 % послідовності походить від мишачого антитіла A.4.6.1. Бевацизумаб має молекулярну масу близько 149,000 Да та є глюкозилованим. Ранібізумаб є афінно-дозрілим Fab фрагментом, що походить від Бевацизумаб. Ранібізумаб 1 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 має вищу афінність до VEGF та менший розмір, що дозволяє йому краще проникати у сітківку, лікуючи таким чином очну неоваскулярізацію, пов'язану з AMD (Lien та Lowman, In: Chernajovsky, 2008, Therapeutic Antibodies. Handbook of Experimental Pharmacology 181, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 131-150). Ранібізумаб розроблений та постачається компанією Genentech під торгівельною маркою Lucentis®. Лікування пацієнтів, хворих на рак з застосуванням режиму, що містить Avastin® веде до побічних ефектів, в тому числі до артеріальної гіпертензії, протеїнурії, тромбоемболії, кровотечі та кардіотоксичності (Blowers & Hall, 2009, Br. J. Nurs. 18(6):351-6, 358). Також, незважаючи на те, що він є гуманізованим антитілом, Бевацизумаб може проявляти імунну відповідь при введенні людині. Така імунна відповідь може призводити до опосередкованого імунним комплексом усунення антитіл або фрагментів з обігу та робить повторне введення терапевтично неприйнятним, тим самим знижуючи терапевтичну користь для пацієнта та обмежуючи повторне введення антитіла. Відповідно, існує потреба у отриманні поліпшених анти-vegf антитіл або фрагментів для подолання однієї або декількох цих проблем, наприклад, шляхом отримання варіантів з вищою, ніж у препарату Бевацизумаб афінністю, що можна буде вводити у зменшених дозах, або варіанти зі зменшеною імуногенністю та іншими побічними діями, порівняно з Бевацизумаб. Цитування або виявлення будь - яких посилань в розділі 3 або в будь-якому іншому розділі цієї заявки не може тлумачитися як визнання того, що таке посилання є придатним у якості обмежувальної частини формули винаходу цієї заявки. Ця заявка стосується варіантів анти-vegf антитіла Бевацизумаб зі зменшеною імуногенністю та/або поліпшеною афінністю до VEGF порівняно з Бевацизумаб або Ранібізумаб. Бевацизумаб має три важколанцюгових CDR, позначених тут (у порядку від аміно- до карбоксильного кінця) як CDR-H1, CDR-H2, та CDR-H3, та три легколанцюгових CDR, позначених тут (у порядку від аміно- до карбоксильного кінця) як CDR-L1, CDR-L2, та CDR-L3. Послідовності CDR Бевацизумаб наведені у Фіг. 1A та 1B, та їх нумерування наведено у Таблиці 1 (для важколанцюгових CDR) та у Таблиці 2 (для легколанцюгових CDR). Споріднене антитіло, Ранібізумаб, отримано шляхом афінного дозрівання Бевацизумаб. Ранібізумаб має ідентичні до Бевацизумаб послідовності CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 та CDR-H2, але відрізняється від Бевацизумаб у послідовностях CDR-H1 та CDR-H3. Важко- та легколанцюгові послідовності Ранібізумаб наведені у Фіг. 1C та CDR наведені у Фіг. 1D. Антитіла винаходу мають в цілому щонайменш одне амінокислотне заміщення у щонайменш одному важколанцюговому CDR порівняно з Бевацизумаб та Ранібізумаб. У деяких аспектах, анти-vegf антитіла містять щонайменш одне заміщення порівняно з Бевацизумаб або Ранібізумаб, вибране від N31F у CDR-H1; K64S у CDR-H2; K64Q у CDR-H2; Y53F у CDR-H2; H97E у CDR-H3; H97D у CDR-H3; H97P у CDR-H3; Y98F у CDR-H3; Y99E у CDR-H3; Y99D у CDR-H3; S100aG у CDR-H3, та T51A у CDR-L2. У інших аспектах, анти-vegf антитіла містять щонайменш одне заміщення, вибране від Таблиць 8 та 9. Додаткові мутації, що можуть бути включеними для поліпшення афінності варіантного антитіла можуть являти собою деімунізуючі заміщення, як-то описані у Таблиці 6, а також інші мутації, наприклад, заміщення, що не порушують здатність антитіла приєднуватися до VEGF, в тому числі, але без обмеження, мутації, описані у Таблицях 10 та 11, або відомі мутації, як-то мутації, описані у Таблицях 12-112-9 та 13. Додаткові мутації, що можуть бути включеними, але без обмеження, описані у Таблицях 14-16. У певних втіленнях, анти-vegf антитіла винаходу містять комбінацію заміщень, вибраних з Таблиці 7, та, вибірково, одну або декілька додаткових мутацій, наприклад, вірогідні заміщення деімунізування, як-то описані у Таблиці 6, а також інші мутації, наприклад, заміщення, що не порушують здатність антитіла приєднуватися до VEGF, в тому числі, але без обмеження, мутації, описані у Таблицях 10 та 11, або відомі мутації, як-то, мутації, описані у Таблицях 12-112-9 та 13. Додаткові мутації, що можуть бути включені у анти-vegf антитіла винаходу, охоплюють, але без обмеження, мутації, описані у Таблицях 14-16. У інших втіленнях, анти-vegf антитіла винаходу містять одне або декілька з наступних CDR заміщень: K64S (CDR-H2), K64Q (CDR-H2), Y53F та K64Q (CDR-H2), H97E та Y98F (CDR-H3), або T51A (CDR-L2). Анти-vegf антитіла можуть також вибірково містити одну або декілька додаткових мутацій або комбінацій мутацій, вибраних від однієї або від декількох Таблиць 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12-1-12-9, або 13-16. Додаткові заміщення CDR можуть містити N31F (CDR-H1), H97E (CDR-H3), H97D (CDR-H3), H97P (CDR-H3), Y99E (CDR-H3), Y99D (CDR-H3), S100aG (CDR-H3) де у позиції 3 у CDR-H3, вибірково, не знаходиться тирозин, T28P, N31F, N31G та N31M (CDR-H1), H97A, H97Q, H97S, H97T, S100aD, S100aE, та S100Av (CDR-H3), T30W, T30R або T30Q (CDR-H1), Y53F, T58F, 2 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 A61G, A61K, A61R, A61H, A61Y, K64G, K64E, R65L, R65T, R65A, R65E, та R65D (CDR-H2), та Y98F та Y100eF (CDR-H3). CDR вибірково містять одну або декілька додаткових мутацій або комбінацій мутацій, вибраних від однієї або декількох з Таблиць s6, 7, 8, 9, 10, 11, 12-1-12-9 та 13. Додаткові заміщення можуть містити заміщення важколанцюгових CDR, в тому числі комбінації заміщень, вибрані від: (a) N31F у CDR-H1, H97D у CDR-H3, Y99D у CDR-H3, та S100aG у CDR-H3; (b) N31F у CDR-H1, H97P у CDR-H3, Y99D у CDR-H3, та S100aG у CDR-H3; (c) N31F у CDR-H1, H97P у CDR-H3, та Y99E у CDR-H3; (d) N31F у CDR-H1, H97E у CDR-H3, та Y99E у CDR-H3; (e) N31F у CDR-H1, H97D у CDR-H3, та Y99E у CDR-H3; (f) N31F у CDR-H1, H97E у CDR-H3, Y99D у CDR-H3, та S100aG у CDR-H3; (g) N31F у CDR-H1, Y99D у CDR-H3, та S100aG у CDR-H3; (h) N31F у CDR-H1, H97P у CDR-H3, та Y99D у CDR-H3; (i) N31F у CDR-H1, H97D у CDR-H3, та S100aG у CDR-H3; (j) N31F у CDR-H1 та S100aG у CDR-H3; або (k) N31F у CDR-H1, H97P у CDR-H3, та S100aG у CDR-H3. Додаткові вибіркові заміщення можуть містити одну або декілька додаткових мутацій або комбінацій мутацій, вибраних від однієї або декількох з Таблиць 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12-1-12-9 та 13. Ще додаткові важколанцюгові заміщення можуть містити щонайменш одне заміщення, вибране від A61F у CDR-H2, A61E у CDR-H2, A61D у CDR-H2, D62L у CDR-H2, D62G у CDR-H2, D62Q у CDR-H2, D62T у CDR-H2, D62K у CDR-H2, D62R у CDR-H2, D62E у CDR-H2, D62H у CDR-H2, K64S у CDR-H2, K64V у CDR-H2, K64Q у CDR-H2, R65V у CDR-H2, R65F у CDR-H2, R65H у CDR-H2, R65N у CDR-H2, R65S у CDR-H2, R65Q у CDR-H2, R65K у CDR-H2, R65I у CDR-H2, та Y98H у CDR-H3. Вибірково, може бути включена одна або декілька додаткових мутацій, або комбінацій мутацій, вибраних від однієї, або від декількох з Таблиць 7, 8, 9, 10, 11, 12-1-12-9 та 13. У деяких аспектах, антитіла винаходу мають VH та VL послідовності, що мають щонайменш 80 % тотожності (та, у певних втіленнях, щонайменш 85 %, щонайменш 90 %, щонайменш 95 %, щонайменш 98 %, або щонайменш 99 % тотожності) до VH та VL послідовностей Бевацизумаб або Ранібізумаб, та містить щонайменш одне амінокислотне заміщення у щонайменш одному CDR порівняно з Бевацизумаб або Ранібізумаб. У інших аспектах, антитіла винаходу мають VH та VL послідовності, що мають щонайменш 80 % тотожності (та у певних втіленнях, щонайменш 85 %, щонайменш 90 %, щонайменш 95 %, щонайменш 98 %, або щонайменш 99 % тотожності) до VH та VL послідовностей Бевацизумаб або Ранібізумаб, та містять щонайменш одне амінокислотне заміщення у щонайменш одному каркасному регіоні порівняно з Бевацизумаб або Ранібізумаб. У певних втіленнях, відсоток тотожності для важкого ланцюга та легкого ланцюга порівняно з VH та VL послідовностями Бевацизумаб або Ранібізумаб є незалежно вибраним від щонайменш 80 %, щонайменш 85 %, щонайменш 90 %, щонайменш 95 % тотожності, або щонайменш 99 % тотожності. У деяких аспектах, антитіла винаходу мають VH та/або VL послідовності, що мають щонайменш 95 %, щонайменш 98 % або щонайменш 99 % тотожності до VH та/або VL послідовностей Бевацизумаб або Ранібізумаб. У деяких аспектах, антитіла винаходу мають до 17 амінокислотних заміщень у своїх CDR порівняно з Бевацизумаб або Ранібізумаб. Варіантні антитіла з 17 амінокислотними заміщеннями, що підтримують їх здатність зв'язуватися з мішенню отримали, як вказано у Bostrom et al., 2009, Science 323:1610-14. У певних втіленнях, анти-vegf антитіло винаходу має, незалежно одне від іншого: - до одного, до двох, до трьох, до чотирьох, до п'яти, до шести, до сімох, до вісьмох, до дев'яти або до десяти CDR-H1 заміщень порівняно з відповідними CDR Бевацизумаб або Ранібізумаб; - до одного, до двох, до трьох, до чотирьох, до п'яти, до шести, до сімох, до вісьмох, до дев'яти, до десяти, до одинадцяти до дванадцяти, до тринадцяти, до чотирнадцяти, до п'ятнадцяти, до шістнадцяти або до сімнадцяти CDR-H2 заміщень порівняно з відповідними CDR Бевацизумаб або Ранібізумаб; - до одного, до двох, до трьох, до чотирьох, до п'яти, до шести, до сімох, до вісьмох, до дев'яти, до десяти, до одинадцяти до дванадцяти, до тринадцяти або до чотирнадцяти CDR-H3 заміщень порівняно з відповідними CDR Бевацизумаб або Ранібізумаб; - до одного, до двох, до трьох, до чотирьох, до п'яти, до шести, до сімох, до вісьмох, до дев'яти, до десяти або до одинадцяти CDR-L1 заміщень порівняно з відповідними CDR Бевацизумаб або Ранібізумаб; - до одного, до двох, до трьох, до чотирьох, до п'яти, до шести, або до сімох CDR-L2 заміщень порівняно з відповідними CDR Бевацизумаб або Ранібізумаб; - до одного, до двох, до трьох, до чотирьох, до п'яти, до шести, до сімох, до вісьмох або до дев'яти CDR-L3 заміщень порівняно з відповідними CDR Бевацизумаб або Ранібізумаб. 3 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заявлений винахід також стосується фармацевтичних композицій, що містять модифіковані анти-vegf антитіла. У деяких аспектах, фармацевтичні композиції мають підвищену афінність до VEGF та/або зменшену імуногенність порівняно з Бевацизумаб або Ранібізумаб. Нуклеїнові кислоти, що містять нуклеотидні послідовності, що кодують наведені тут антиvegf антитіла винаходу являють собою вектори, що містять нуклеїнові кислоти. Додатково, тут передбачено прокаріотичні та еукаріотичні клітини-хазяї, трансформовані з вектором, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує анти-vegf антитіло, а також еукаріотичні (як-то клітини ссавців) клітини-хазяї, розроблені для експресії нуклеотидної послідовності. Також надано способи отримання анти-vegf антитіл шляхом культивування клітин-хазяїв. Анти-vegf антитіла винаходу є корисними у лікуванні захворювань на рак (наприклад, карциноми товстої кишки, карциноми прямої кишки, недрібноклітинного раку легенів, та раку молочної залози), захворювань сітківки (наприклад, вікової макулярної дегенерації ("AMD")), та імунних розладів (наприклад, ревматоїдного артриту). У деяких аспектах, анти-vegf антитіла винаходу можуть бути застосовані у зменшених дозах порівняно з Бевацизумаб або Ранібізумаб, наприклад, щонайменш 10 %, щонайменш 20 %, щонайменш 30 %, щонайменш 40 %, щонайменш 50 %, щонайменш 60 %, щонайменш 70 %, щонайменш 80 % або щонайменш 90 % нижчих дозах. Слід зазначити, що невизначені та визначений артиклі застосовуються в цій заявці, як це прийнято в патентних заявках, для позначення однини або множини, якщо в контексті чітко не вказано іншого. Додатково, вираз “ або ”, застосований в цій заяві, як взагалі у патентних заявах, означає диз'юнктивне “ або “ або сполучне “ та “. Всі згадані у цій заяві публікації включені тут шляхом посилання. Будь-яке обговорення документів, актів, матеріалів, приладів, статей тощо включене в цю специфікацію виключно з метою забезпечення контексту для цієї заявки. Не слід розуміти як визнання, що будь-яке або всі ці питання утворюють частину основи обмежувальної частини формули винаходу або були поширені загальні знання в області, що мають відношення до цього винаходу, що існували будь-де до дати пріоритету цієї заявки. Особливості та переваги винаходу стануть ще більш очевидними з подальшого докладного опису варіантів його здійснення. Стислий опис таблиць та фігур. Таблиця 1 показує нумерування амінокислот у важколанцюгових CDR Бевацизумаб. CDR 13 наведених, як SEQ ID NOS:3-5, відповідно. Таблиця 2 показує нумерування амінокислот у легколанцюгових CDR Бевацизумаб. CDR 1-3 наведених, як SEQ ID NOS:6-8, відповідно. Таблиця 3 показує VL пептиди Бевацизумаб, перевірені на імуногенність. Таблиця 4 показує VH пептиди Бевацизумаб, перевірені на імуногенність. + Таблиця 5 показує ідентифіковані епітопні регіони CD4 T клітин у Бевацизумаб. CDR регіони підкреслено. Таблиця 6 показує вірогідні мутації у CDR-H2 та CDR-H3 для зниження імуногенністі Бевацизумаб. Нумерування амінокислот у Таблиці 6 відповідає нумеруванню у важкому ланцюзі Бевацизумаб по Kabat. Таблиця 7 показує амінокислотні заміщення у важколанцюговому CDR Бевацизумаб, що ведуть до поліпшення d KD, що було досліджено шляхом поверхневого плазмонного резонансу. Δ kon має відношення до кратного поліпшення у k on (мутант/WT). Δ koff має відношення до кратного поліпшення у koff (WT/мутант). Δ KD має відношення до поліпшення у KD у мутанта, відносно до дикого типу. Нумерування амінокислот у Таблиці 7 відповідає нумеруванню у важкому ланцюзі Бевацизумаб по Kabat. Таблиця 8 показує мутації у важколанцюговому CDR Бевацизумаб, де попередні дослідження зв'язування вказують на збільшення афінності щодо VEGF (дані не представлені). Нумерування амінокислот у Таблиці 8 відповідає нумеруванню у важкому ланцюзі Бевацизумаб по Kabat. Таблиця 9 показує мутації у важколанцюговому CDR Бевацизумаб, де попередні дослідження зв'язування вказують на збільшення афінності щодо VEGF (дані не представлені). Нумерування амінокислот у Таблиці 9 відповідає нумеруванню у важкому ланцюзі Бевацизумаб по Kabat. Таблиця 10 показує мутації у важколанцюговому CDR Бевацизумаб, які не впливають на зв'язування та можуть бути включені в антитіла винаходу. Нумерування амінокислот у Таблиці 10 відповідає нумеруванню у важкому ланцюзі Бевацизумаб по Kabat. Таблиця 11 показує мутації у легколанцюговому CDR Бевацизумаб, які не впливають на зв'язування та можуть бути включені в антитіла винаходу. Нумерування амінокислот у 4 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Таблиці 11 відповідає нумеруванню у легкому ланцюзі Бевацизумаб по Kabat. Таблиці 12-1-12-9 показують відомі мутації у важколанцюговому CDR Бевацизумаб, які можуть бути включені в антитіла винаходу. Кожен рядок у Таблицях 12-1-12-9 містить окремий відомий варіант. Для кожного варіанту, відомі CDR послідовності заштриховані. Ідентифікатори послідовності для кожного варіанту, ідентифікованого у Таблицях 12-1-12-9 наведені у Таблицях 20-1-20-9, відповідно. У колонці CDR-H1 надано часткову послідовність CDR-H1. Останній аспарагін CDR-H1 не показаний. Ця часткова послідовність відповідає SEQ ID NO:411. Хоча відомі мутації у CDR-H1 наведені у контексті цієї часткової послідовності, слід зазначити, що мутації існують у контексті повнорозмірного CDR. Таблиця 13 показує відомі мутації у легколанцюговому CDR Бевацизумаб, що можуть бути включені у антитіла винаходу. Кожен рядок у Таблиці 13 містить окремий відомий варіант. Для кожного варіанту, відомі послідовності CDR заштриховані. Ідентифікатори послідовності для кожного варіанту, ідентифікованого у Таблиці 13 наведені у Таблиці 20-10. Таблиця 14 показує пептиди VH CDR2 Бевацизумаб, перевірені на імуногенність, де незмінні залишки SEQ ID NO:62 позначені пустим полем. Також надані результати аналізу CD4+T клітин. Таблиця 15 показує пептиди VH CDR3 Бевацизумаб, перевірені на імуногенність, де незмінні залишки SEQ ID NO:74 позначені пустим полем. Також надані результати аналізу CD4+T клітин. Таблиця 16 показує пептиди VL CDR2 Бевацизумаб, перевірені на імуногенність, де незмінні залишки SEQ ID NO:25 позначені пустим полем. Також надані результати аналізу CD4+T клітин. Таблиця 17 показує вибрані модифікації епітопів для трьох епітопів CD4+T клітин у Бевацизумаб. Таблиця 18 показує мутанти одиничного змінного регіону та пов'язану з ними оцінку середньої інтенсивності флуоресценції (MFI). Таблиця 19 показує мутанти комбінованого змінного регіону та пов'язану з ними EC 50. Таблиці 20-1-20-10 показують SEQ ID NOS, де відомі, відповідні до CDR Бевацизумаб варіанти перелічені у Таблицях 12-1-12-9 та Таблиці 13, відповідно. N/A вказує на невідому послідовність CDR. Фіг. 1A-1D. Фіг.1A показує амінокислотні послідовності змінних регіонів важкого та легкого ланцюгів Бевацизумаб, SEQ ID NO:1 та SEQ ID NO:2, відповідно, з CDR регіонами, виділеними жирним, підкресленим текстом. На Фіг.1B показані послідовності CDR та відповідні ідентифікатори послідовності Бевацизумаб. Фіг.1C показує амінокислотні послідовності важкого та легкого ланцюгів Ранібізумаб, SEQ ID NO:9 та SEQ ID NO:10, відповідно, з CDR регіонами, виділеними жирним, підкресленим текстом. Фіг. 1D показує послідовності CDR та відповідні ідентифікатори послідовності Ранібізумаб. Фіг. 2A-2B. показує відповіді VL пептиду Бевацизумаб. Фіг. 2A показує відсоток донорних відповідей VL пептиду з індексом стимулювання у 2.95 або вище. N=99 донорів. Фіг. 2B показує середній індекс стимулювання для всіх 99 донорів для кожного пептиду плюс або мінус стандартна похибка. Фіг. 3A-3B показує відповіді VH пептиду Бевацизумаб. Фіг. 3A показує відсоток донорних відповідей VH пептиду з індексом стимулювання у 2.95 або вище. N=99 донорів. Фіг. 3B показує середній індекс стимулювання для всіх 99 донорів для кожного пептиду плюс або мінус стандартна похибка. Фіг. 4A-4C показує CD4+T клітинні відповіді до мутантних епітопних пептидів Бевацизумаб. Середні відповіді до немодифікованих батьківських епітопних послідовностей позначені відкритими позначками. Великими кружками позначені вибрані змінення, вказані у Таблиці 17. Фіг. 4A стосується VH CDR2 пептидів; Фіг. 4B стосується VH CDR3 пептидів; та Фіг. 4C стосується VL CDR2 пептидів. Ця заявка стосується анти-vegf антитіл. Якщо не зазначено іншого, термін “ антитіло ” (Ab) має відношення до імуноглобулінової молекули, що специфічно зв'язується, або здатна імунологічно реагувати з певним антигеном та містить поліклональні, моноклональні, отримані з застосуванням генетично-інженерних способів та інші модифіковані форми антитіл, в тому числі, але без обмеження, химерні антитіла, гуманізовані антитіла, гетерокон'югатні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла, діатіла, тріатіла, та тетратіла), та антиген - зв'язуючи фрагменти антитіл, в тому числі, наприклад, фрагменти Fab', F(ab') 2, Fab, Fv, rIgG, та scFv. Крім того, якщо не зазначено іншого, термін “ моноклональне антитіло ” (mAb) охоплює інтактні молекули, а також фрагменти антитіла (як-то, наприклад, Fab та F(ab')2 фрагменти), що здатні специфічно зв'язуватися з білком. Fab та F(ab') 2 фрагменти, що втратили Fc фрагмент інтактного антитіла, більш швидко виводяться з кровообігу тварини, та можуть мати менш 5 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 неспецифічне тканинне зв'язування, ніж інтактне антитіло (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316). Термін “ scFv ” має відношення до одноланцюгового антитіла Fv, у якому змінні домени важкого ланцюга та легкого ланцюга від традиційного антитіла об'єднуються з утворенням одного ланцюга. Посилання до “ VH ” мають відношення до змінного регіону імуноглобулінового важкого ланцюга антитіла, в тому числі, важкого ланцюга Fv, scFv, або Fab. Посилання до “ VL ” мають відношення до змінного регіону імуноглобулінового легкого ланцюга, в тому числі, легкого ланцюга Fv, scFv, dsFv або Fab. Антитіла (Abs) та імуноглобуліни (Igs) є глікопротеїнами, що мають однакові структурні характеристики. У той час, як антитіла проявляють специфічність зв'язування до певної мішені, імуноглобуліни охоплюють як антитіла, так і інші подібні до антитіл молекули, що втратили цільову специфічність. Нативні антитіла та імуноглобуліни звичайно являють собою гетеротетрамерні глікопротеїни масою приблизно 150,000 Да, що складаються з двох ідентичних легких (L) ланцюгів та двох ідентичних важких (H) ланцюгів. Кожен важкий ланцюг має змінний домен (VH) на N" - кінці, що знаходиться за певною кількістю сталих доменів. Кожен легкий ланцюг має змінний домен на N" - кінці (VL) та сталий домен на С" - кінці. Анти-vegf антитіла винаходу приєднуються до VEGF людини та інгібують VEGF рецепторну активність у клітині. Анти-vegf антитіла винаходу містять регіони, що визначають компліментарність (CDR), що споріднені по послідовності до CDR антитіл Бевацизумаб (також відомого, як Avastin®) та/або Ранібізумаб (також відомого, як Lucentis®). CDRs також відомі у якості гіперзмінних регіонів у змінних доменах легкого та важкого ланцюгів. Більш висококонсервативні частки змінних доменів мають назву каркасного регіону (FR). Як відомо, положення амінокислоти/границя розмежування гіперзмінного регіону антитіла може змінюватися в залежності від контексту та різних відомих визначень. Деякі позиції в межах змінного домену можуть бути розглянуті у вигляді гібридних гіперзмінних позицій, де ці позиції можуть, як вважається, заходитися у межах гіперзмінного регіону з одним набором критеріїв, у той час, як ті, що знаходяться за межами гіперзмінного регіону, підпадають під інший набор критеріїв. Одна або декілька цих позицій може також бути знайденою у розширених гіперзмінних регіонах. Винахід стосується антитіл, що містять модифікації у цих гібридних гіперзмінних позиціях. Кожен змінний домен нативного важкого та легкого ланцюгів містить чотири FR регіони, значною мірою шляхом прийняття бета-шарової конфігурації, об'єднаної трьома CDR, що утворюють петлі зв'язування, та у деяких випадках утворюють частину бета-шарової структури. CDR у кожному ланцюзі утримуються разом в тісній близькості FR регіонами у порядку FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, та, з CDR від іншого ланцюга, вони сприяють утворенню сайту зв'язування антитіла (Див. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987). Як тут застосовано, нумерування імуноглобулінових амінокислотних залишків зроблено відповідно до системи нумерування імуноглобулінових амінокислотних залишків від Kabat et al., якщо не зазначено іншого. Послідовності змінних регіонів важкого та легкого ланцюга Бевацизумаб представлені, як SEQ ID NO:1 та SEQ ID NO:2, відповідно. Послідовності змінних регіонів важкого та легкого ланцюгів також зображені у Фіг. 1A. Послідовності CDR Бевацизумаб та їх відповідні ідентифікатори наведені у Фіг. 1B. Будь-які нуклеотидні послідовності, що кодують SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:2 можуть бути застосовані у композиціях та способах заявленого винаходу. Послідовності важкого та легкого ланцюгів Ранібізумаб представлені, як SEQ ID NO:9 та SEQ ID NO:10, відповідно. Послідовності важкого та легкого ланцюгів також зображені у Фіг.1C. Послідовності CDR Ранібізумаб та їх відповідні ідентифікатори наведені у Фіг.1D. Будь-які нуклеотидні послідовності, що кодують SEQ ID NO:9 або SEQ ID NO:10 можуть бути застосовані у композиціях та способах заявленого винаходу Заявлений винахід також стосується фрагментів антитіла анти-vegf, що містять послідовності CDR, споріднені з послідовностями CDR Бевацизумаб та Ранібізумаб. Термін “ фрагмент антитіла ” має відношення до частки повнорозмірного антитіла, головним чином до регіону, що зв'язує мішень або змінного регіону. Приклади фрагментів антитіл охоплюють фрагменти Fab, Fab', F(ab')2 та Fv. “ Fv ” фрагмент є мінімальним фрагментом антитіла, що містить повний сайт розпізнавання та зв'язування мішені. Цей регіон містить димер одного важколанцюгового та одного легколанцюгового змінного домену у тісній, нековалентній асоціації (VH–VL димер). Саме у цей конфігурації три CDR кожного змінного домену взаємодіють для визначення цільового сайту зв'язування на поверхні VH-VL димера. Часто, шість CDR утворюють цільову специфічність зв'язування з антитілом. Проте, у деяких випадках навіть одиничний змінний домен (або половина Fv, що містить тільки три специфічних для мішені 6 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CDR) може мати здатність розпізнавати та зв'язувати мішень. “ Одноланцюговий Fv ” або “ scFv ” фрагмент антитіла містить VH та VL домени антитіла у єдиному поліпептидному ланцюзі. Звичайно, поліпептид Fv додатково містить поліпептидний лінкер між VH та VL доменом, що дозволяє scFv утворювати бажану структуру для зв'язування мішені. “ Однодоменні антитіла ” складаються з одиничних VH або VL доменів, що проявляють достатню афінність до мішені. У певному втіленні, однодоменним антитілом є антитіло верблюдових (Див.,наприклад, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25–38). Fab фрагмент містить сталий домен легкого ланцюга та перший сталий домен (CH 1) важкого ланцюга. Fab' фрагменти відрізняються від Fab фрагментів додаванням декількох залишків на С’-кінці важколанцюгового CHl домену, в тому числі одного або декількох цистеїнів від шарнірного регіону антитіла. F(ab') фрагменти були отримані розщепленням дисульфідних зв'язків у шарнірних цистеїнах продукту травлення пепсину F(ab') 2. Додаткові хімічні зчеплення фрагментів антитіла відомі фахівцям у цій галузі. У деяких втіленнях, анти-vegf антитіла винаходу є моноклональними антитілами. Термін “моноклональне антитіло ”, як тут застосовано, не обмежується антитілами, що отримані за допомогою гібридомної технології. Термін “ моноклональне антитіло ” має відношення до антитіла, що походить від одиничного клону, в тому числі від будь-якого еукаріотичного, прокаріотичного, або фагового клону, а не від способу, за допомогою якого воно було отримано. Моноклональні антитіла, корисні у зв'язку з заявленим винаходом можна отримати шляхом застосування різноманітних відомих у цій галузі способів, в тому числі застосуванням гібридом, способами рекомбінантного або фагового дисплею, або застосуванням їх комбінацій. Анти-vegf антитіла винаходу охоплюють химерні, приматизовані, гуманізовані, або людські антитіла. Анти-vegf антитіла винаходу можуть бути химерними антитілами. Термін “ химерне ” антитіло, як тут застосовано, має відношення до антитіл, що мають змінні послідовності, що походять від не-людинного імуноглобуліну, як-то від щурячого або мишачого антитіла, та сталі регіони імуноглобуліну людини, звичайно вибрані від зразка людського імуноглобуліну. Способи отримання химерних антитіл відомі у цій галузі. Див.,наприклад, Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; U.S. Pat. Nos. 5,807,715; 4,816,567; та 4,816397, що включені тут у вигляді посилання у своєї повноті. Ати-vegf антитіла винаходу можуть бути гуманізованими. “ Гуманізовані ” форми нелюдинних (наприклад, мишачих) антитіл являють собою химерні імуноглобуліни, імуноглобулінові ланцюги або їх фрагменти (як-то Fv, Fab, Fab', F(ab')2 або інші мішень зв'язуючи субдомени антитіл), що містять мінімальні послідовності, що походять від нелюдинного імуноглобуліну. Взагалі, гуманізоване антитіло буде містити в значній мірі всі, щонайменш один, та звичайно два змінних домену, у яких всі, або практично всі CDR регіони відносяться до не-людинного імуноглобуліну, та всі, або практично всі FR регіони являють собою послідовність імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло може також містити щонайменш частку імуноглобулінового сталого регіону (Fc), звичайно, консенсусну послідовність імуноглобуліну людини. Способи гуманізування антитіла відомі у цій галузі. Див., наприклад, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7; U.S. Patent Nos: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; та 6,180,370 to Queen et al.; EP239400; PCT publication WO 91/09967; U.S. Patent No. 5,225,539; EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973; та U.S. Patent No. 5,565,332, всі включені тут шляхом посилання у своєї повноті. Анти-vegf антитіла винаходу можуть бути людськими антитілами. Повнорозмірні людські анти-vegf антитіла можуть бути бажаними для терапевтичного лікування людей. Як тут застосовано, “ людські антитіла ” охоплюють антитіла, що мають амінокислотну послідовність імуноглобуліну людини та охоплюють антитіла, отримані від бібліотек імуноглобуліну людини або від тварин, трансгенних на один або декілька імуноглобулінів людини, що не здатні експресувати ендогенні імуноглобуліни. Людські антитіла можна отримати за допомогою багатьох відомих у цій галузі способів, в тому числі застосуванням фагового дисплею, застосуванням бібліотек антитіл, що походять від послідовностей імуноглобуліну людини. Див U.S. Patent Nos. 4,444,887 та 4,716,111; та PCT publications WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; та WO 91/10741, всі включені тут шляхом посилання у своєї повноті. Людські антитіла також можна отримати шляхом застосування трансгенних мишей, нездатних експресувати функціональні ендогенні імуноглобуліни, але здатних експресувати гени імуноглобуліну людини. Див., наприклад, PCT publications WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; U.S. Patent Nos. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; та 5,939,598, всі 7 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включені тут шляхом посилання у своєї повноті. На додачу, такі компанії, як-то Medarex (Princeton, NJ), Astellas Pharma (Deerfield, IL), Amgen (Thousand Oaks, CA) та Regeneron (Tarrytown, NY) можуть бути залучені для отримання людських антитіл, спрямованих проти вибраного антигену шляхом застосування технологій, подібних вищезазначеним. “ Повні “ людські антитіла, що впізнають вибраний епітоп можуть бути отримані шляхом застосування способу, знаного, як “ керований відбір. ” При такому способі, вибране не-людинне моноклональне антитіло, наприклад, мишаче, застосовують для керованого відбору повністю людського антитіла з впізнаванням того же самого епітопа (Jespers et al., 1988, Biotechnology 12:899-903). Анти-vegf антитіла винаходу можуть бути приматизованими. Термін “ приматизоване антитіло ” має відношення до антитіла, що містить змінні регіони мавпи та сталі регіони людини. Способи отримання приматизованих антитіл відомі у цій галузі. Див., наприклад, U.S. Patent Nos. 5,658,570; 5,681,722; та 5,693,780, що включені тут у вигляді посилання у своєї повноті. Анти-vegf антитіла винаходу можуть бути біспецифічними антитілами. Бiспецифічні антитіла - це моноклональні, часто людинного походження або гуманізовані антитіла, що мають зв'язуючи специфічності для щонайменш двох різних антигенів. У заявленому винаході, одна зі зв'язуючих специфічностей може бути спрямованою до VEGF, а інша - до будь-якого іншого антигену, наприклад, до білка клітинної поверхні, рецептора, субодиниці рецептора, тканевоспецифічного антигену, білка вірусного походження, білка вірусної оболонки, білка бактеріального походження, або білка бактеріальної поверхні, тощо. У певному втіленні, антитіло винаходу є біспецифічним антитілом зі зв'язуючими специфічностями до VEGF та до CD3. Анти-vegf антитіла винаходу охоплюють дериватизовані антитіла. Наприклад, але без обмеження, дериватизовані антитіла звичайно модифікують шляхом глікозілювання, ацетілювання, пегілювання, фосфорилювання, амідування, дериватизацією відомими захисними/блокуючими групами, протеолітичним розщепленням, приєднанням до клітинного ліганду або до іншого білка (див. розділ для обговорення кон'югатів антитіла), тощо. Будь-які численні хімічні модифікації можуть бути проведені за допомогою відомих способів, в тому числі, але без обмеження, специфічного хімічного розщеплення, ацетилювання, формілірування, метаболічного синтезу тунікоміцину, тощо. На додачу, похідна може містити одну або декілька штучних амінокислот, наприклад, при застосуванні технології ambrx (Див., наприклад, Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13(10):1011-2). У іншому втіленні винаходу, анти-vegf антитіла або їх фрагменти можуть бути антитілами або фрагментами антитіл, чия послідовність була модифікована для змінення щонайменш однієї опосередкованої сталим регіоном біологічної ефекторної функції відносно відповідної послідовності дикого типу. Наприклад, у деяких втіленнях, анти-vegf антитіло винаходу може бути модифікованим для зменшення щонайменш однієї опосередкованої сталим регіоном біологічної ефекторної функції відносно немодифікованого антитіла, наприклад, зменшенням зв'язування з Fc рецептором (FcγR). Зв'язування з FcγR може бути зменшено шляхом мутації сегмента сталого регіону імуноглобуліну антитіла у окремих регіонах, необхідних для взаємодії FcγR (Див., наприклад, Canfϊeld and Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491; та Lund et al., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662). Зменшення FcγR - зв'язуючої здатності антитіла може також зменшити інші ефекторні функції, що залежать від FcγR взаємодії, як-то опсонізацію, фагоцитоз та антигензалежну клітинну цитотоксичність ("ADCC"). У інших втіленнях, анти-vegf антитіло винаходу може бути модифіковано для отримання або поліпшення щонайменш однієї опосередкованої сталим регіоном біологічної ефекторної функції відносно немодифікованого антитіла, наприклад, посилення FcγR взаємодії (Див.,наприклад, US 2006/0134709). Наприклад, анти-vegf антитіло винаходу може мати сталий регіон, що зв'язується з FcγRIIA, FcγRIIB та/або FcγRIIIA з афінністю, вищою, ніж відповідна у сталому регіоні дикого типу. Отже, антитіла винаходу можуть мати змінення біологічної активності, що веде до підвищеної або зменшеної опсонізації, фагоцитозу, або ADCC. Такі змінення відомі у цій галузі. Наприклад, модифікації антитіл, що зменшують активність ADCC описані у U.S. Patent No. 5,834,597. Стандартний варіант, що знижує ADCC відповідає “ мутант 3 ”, показаний у Фіг. 4 у U.S. Patent No. 5,834,597, у якому видалено залишок 236 та залишки 234, 235 та 237 (застосоване EU нумерування) заміщені на аланіни. У деяких втіленнях, анти-vegf антитіла винаходу мають низькі рівні або втрату фукози. Антитіла, яким бракує фукози були корельовані з підсиленою ADCC (активністю, особливо при низьких дозах антитіл. Див. Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al., 8 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-73.). Способи отримання антитіл, яким бракує фукози, полягають у підрощуванні в клітинах мієломи щурів YB2/0 (ATCC CRL 1662). Клітини YB2/0 експресують низькі рівні мРНК FUT8, що кодує α-1,6-фукозилтрансферазу, фермент, необхідний для фукозилювання поліпептидів. У іншому аспекті, анти-vegf антитіла або їх фрагменти можуть бути антитілами або фрагментами антитіл, що були модифікованими для підвищення або зменшення їх зв'язуючих афінностей до сивороткового Fc рецептора, FcRn, наприклад шляхом мутування сегмента імуноглобулінового сталого регіону в окремих регіонах, що беруть участь у взаємодіях FcRn (Див.,наприклад, WO 2005/123780). У окремих втіленнях, анти-vegf антитіло класу IgG мутовано таким чином, що заміщено щонайменш один з амінокислотних залишків 250, 314, та 428 сталого регіону важкого ланцюга або окремо, або у будь-яких його комбінаціях, як-то особливі комбінації у позиціях 250 та 428, або у позиціях 250 та 314, або у позиціях 314 та 428, або у позиціях 250, 314, та 428, з позиціями 250 та 428. Для позиції 250, заміщуючий амінокислотний залишок може бути будь-яким амінокислотним залишком, крім треоніну, в тому числі, але без обмеження, аланіном, цистеїном, аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою, фенілаланіном, гліцином, гістидином, ізолейцином, лізином, лейцином, метіоніном, аспарагіном, проліном, глутаміном, аргініном, серином, валіном, триптофаном або тирозином. Для позиції 314, заміщуючий амінокислотний залишок може бути будь-яким амінокислотним залишком, крім лейцину, в тому числі, але без обмеження, аланіном, цистеїном, аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою, фенілаланіном, гліцином, гістидином, ізолейцином, лізином, метіоніном, аспарагіном, проліном, глутаміном, аргініном, серином, треоніном, валіном, триптофаном або тирозином. Для позиції 428, заміщуючий амінокислотний залишок може бути будь-яким амінокислотним залишком, крім метіоніну, в тому числі, але без обмеження, аланіном, цистеїном, аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою, фенілаланіном, гліцином, гістидином, ізолейцином, лізином, лейцином, аспарагіном, проліном, глутаміном, аргініном, серином, треоніном, валіном, триптофаном або тирозином. Особливі комбінації прийнятних амінокислотних заміщень ідентифіковані у Таблиці 1 U.S. Patent No. 7,217,797, яка включена тут у якості посилання у своєї повноті. Такі мутації підсилюють зв'язування антитіла з FcRn, що захищає антитіло від деградації та збільшують його період напівжиття. У деяких інших аспектах, анти-vegf антитіло має одну або декілька амінокислот, вставлених у один або декілька його гіперзмінних регіонів, наприклад, як описано у Jung and Plückthun, 1997, Protein Engineering 10(9):959–966; Yazaki et al., 2004, Protein Eng Des. Sel. 17(5):481–9. Epub 2004 Aug 17; та у US 2007/0280931. У різних втіленнях, анти-vegf антитіла або їх фрагменти можуть бути антитілами або фрагментами антитіл, що модифіковані для підвищення експресїі у гетерологічних хазяях. У певних втіленнях, анти-vegf антитіла або їх фрагменти можуть бути антитілами або фрагментами антитіл, що модифіковані для підвищення експресії та/або секреції від гетерологічних клітин-хазяїв. У деяких втіленнях, анти-vegf антитіла або їх фрагменти модифіковані для підвищення експресії у бактеріях, як-то E. coli. У інших втіленнях, анти-vegf антитіла або їх фрагменти модифіковані для підвищення експресії у дріжджах (Kieke et al., 1999, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:5651-5656). У інших втіленнях, анти-vegf антитіла або їх фрагменти модифіковані для підвищення експресії у клітинах комах. У додаткових втіленнях, анти-vegf антитіла або їх фрагменти модифіковані для підвищення експресії у клітинах ссавців, як-то клітинах CHO. У деяких втіленнях, анти-vegf антитіла або їх фрагменти можуть бути антитілами або фрагментами антитіл, модифікованими для підвищення стійкості антитіл при їх виробництві. У деяких втіленнях, антитіла або їх фрагменти можуть бути модифіковані з заміщенням однієї або декількох амінокислот, сприйнятливих до не-ензиматичного деамідування, як-то аспарагін або глютамін, на амінокислоти, що не зазнають деамідування (Huang et al., 2005, Anal. Chem. 77:1432-1439). У інших втіленнях, антитіла або їх фрагменти можуть бути модифікованими з заміщенням однієї або декількох амінокислот, сприйнятливих до окислення, як-то метіоніну, цистеїну або триптофану, на амінокислоту, що не так легко піддається окисленню. У певних інших втіленнях, антитіла або їх фрагменти можуть бути модифікованими з заміщенням однієї або декількох амінокислот, сприйнятливих до циклізації, як-то аспарагіну або глютамінової кислоти на амінокислоту, що не так легко піддається циклізації. Заявлений винахід охоплює молекули нуклеїнових кислот та клітини-хазяї, що кодують антиvegf антитіла винаходу. Анти-vegf антитіло винаходу може бути отримано шляхом рекомбінантної експресії генів легкого та важкого ланцюгів імуноглобуліну у клітині-хазяї. Для рекомбінантної експресії антитіла, хазяйську клітину трансфікують одним або декількома рекомбінантними векторами 9 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 експресії, що несуть фрагменти ДНК, що кодують легкий та важкий ланцюги імуноглобуліну антитіла таким чином, що легкий та важкий ланцюги експресуються у клітині-хазяї, та, вибірково, секретуються у середовище, у якому культивували клітини-хазяї та з якого ці антитіла можуть бути відновлені. Для отримання генів важкого та легкого ланцюга антитіла, включення цих генів у рекомбінантні вектори експресії та введення цих векторів у клітини-хазяї застосовують стандартні способи рекомбінантної ДНК, як-то описані у Molecular Cloning; Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook, Fritsch та Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Protocols у Молекулярн Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Greene Publishing Associates, 1989) та у U.S. Patent No. 4,816,397. У одному втіленні, анти-vegf антитіла подібні до Бевацизумаб або Ранібізумаб, але зі змінами у одному або у декількох CDR. У іншому втіленні, анти-vegf антитіла подібні до Бевацизумаб або Ранібізумаб, але зі змінами у одному або декількох каркасних регіонів. У іншому втіленні, анти-vegf антитіла подібні до Бевацизумаб або Ранібізумаб, але зі змінами у одному або декількох CDR та у одному або декількох каркасних регіонів. Подібні антитіла разом позначені тут як ті, що мають “ Бевацизумаб – споріднені ” або “ Ранібізумаб – споріднені ” послідовності та іноді позначені просто як анти-vegf антитіла винаходу. Для отримання нуклеїнових кислот, що кодують анти-vegf антитіла, спочатку отримують ДНК фрагменти, що кодують змінні регіони легкого та важкого ланцюга. Ці ДНК можуть бути отримані шляхом ампліфікації та модифікацією ДНК зародкової лінії або кДНК, що кодують змінні послідовності легкого та важкого ланцюгів, наприклад, шляхом застосування полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Також відомі послідовності ДНК зародкової лінії для людських генів змінного регіону важкого та легкого ланцюга (Див.,наприклад, базу даних "VBASE" послідовності зародкової лінії людини; Див. також Kabat, E. A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health та Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 22T:116-198; та Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836; зміст кожної включений тут шляхом посилання). Фрагмент ДНК, що кодує важкий або легкий ланцюг змінного регіону Бевацизумаб або Ранібізумаб можна синтезувати та застосувати в якості зразка для мутагенезу для отримання варіанту за допомогою, як описано тут, звичайних способів мутагенезу. Альтернативно, фрагмент ДНК, що кодує варіант може бути безпосередньо синтезований. Після отримання фрагментів ДНК, що кодують анти-vegf VH та VL сегменти, ці фрагменти ДНК можуть бути додатково змінені за допомогою стандартних способів рекомбінантної ДНК, наприклад, для перетворення генів змінного регіону на повнорозмірні ланцюгові гени антитіла, гени Fab фрагмента або ген scFv. Під час цих маніпуляцій, VL- або VH-, що кодують фрагмент ДНК оперативно приєднуються до іншого фрагмента ДНК, що кодує інший білок, як-то сталий регіон антитіла або гнучкий лінкер. Термін “ оперативно приєднується, ” як застосовано у цьому контексті, призначений для позначення того, що два фрагмента ДНК з'єднуються таким чином, що амінокислотні послідовності, що кодуються двома фрагментами ДНК залишаються у межах рамки зчитування. Виділена ДНК, що кодує VH регіон може бути перетворена на повнорозмірний ген важкого ланцюга за допомогою оперативного приєднання ДНК, що кодує VH, до іншої молекули ДНК, що кодує сталі регіони важкого ланцюга (CHl, CH2, CH3 та, вибірково, CH4). Послідовності генів сталого регіону важкого ланцюга людини відомі у цій галузі (Див.,наприклад, Kabat, E.A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) та фрагменти ДНК, що охоплюють ці регіони можуть бути отримані за допомогою стандартної ПЛР-ампліфікації. Сталий регіон важкого ланцюга може бути сталим регіоном IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM або IgD, але у певних втіленнях він може бути сталим регіоном IgG1 або IgG4. Для фрагмента Fab гена важкого ланцюга, ДНК, що кодує VH- може бути оперативно приєднана до іншої молекули ДНК, що кодує тільки сталий регіон CH1 важкого ланцюга. Виділена ДНК, що кодує VL регіон може бути перетворена на повнорозмірний ген легкого ланцюга (а також Fab гена легкого ланцюга) шляхом оперативного приєднання ДНК, що кодує VL- до іншої молекули ДНК, що кодує сталий регіон CL легкого ланцюга. Послідовності генів сталого регіону легкого ланцюга людини відомі у цій галузі (Див.,наприклад, Kabat, E. A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)) та фрагменти ДНК, що охоплюють ці регіони можуть бути отримані шляхом стандартної ПЛР ампліфікації. Сталий регіон легкого ланцюга може бути сталим регіоном каппа або лямбда, але у певних втіленнях це сталий регіон каппа. Для отримання scFv гена, фрагменти ДНК, що кодують VH- та VL- оперативно приєднують до іншого фрагмента, що кодує гнучкий лінкер, наприклад, що кодує амінокислотну послідовність 10 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (Gly4~Ser)3, таким чином, що VH та VL послідовності можуть бути експресовані у вигляді суцільного одноланцюгового білка, з VL та VH регіонами, з'єднаними через гнучкий лінкер (Див.,наприклад, Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554). Для експресії анти-vegf антитіла винаходу, ДНК, що кодують частковий або повнорозмірний легкий та важкий ланцюги, отриману, як описано вище, вставили у вектори експресії таким чином, щоб гени були оперативно приєднані до транскрипційної та трансляційної контрольних послідовностей. У цьому контексті, термін “ оперативно приєднується, ” призначений для позначення того, що ген антитіла вбудовано у вектор таким чином, що транскрипційні та трансляційні контрольні послідовності в межах вектора обслуговують їх передбачувані функції регулювання транскрипції та трансляції гена антитіла. Вектор експресії та контрольні послідовності експресії вибирають таким чином, щоб була сумісність з експресією застосованої клітини-хазяя. Ген легкого ланцюга антитіла та ген важкого ланцюга антитіла можуть бути вставлені у окремі вектори, або, більш звичайно, обидва гени вставляють в той же самий вектор експресії. Гени антитіла вставляють у вектор експресії за допомогою стандартних способів (наприклад, лігуванням комплементарних сайтів рестрикції фрагмента гена антитіла та вектора, або, якщо сайти рестрикціїї відсутні, лігуванням тупих кінців). Перед вставленням послідовностей легкого або важкого ланцюга анти-vegf антитіла винаходу, вектор експресії вже може нести послідовність сталого регіону антитіла. Наприклад, один підхід до перетворення анти-vegf VH та VL послідовностей у повнорозмірні гени антитіла полягає у вставці їх у вектори експресії, що вже кодують сталий регіон важкого ланцюга та сталий регіон легкого ланцюга, відповідно, таким чином, що VH сегмент буде оперативно приєднаним до CH сегмента (ів) в межах вектора та VL сегмент буде оперативно приєднаним до CL сегмента в межах вектора. Додатково або альтернативно, рекомбінантний вектор експресії може кодувати сигнальний пептид, що полегшує секрецію ланцюга антитіла від клітини-хазяя. Ген ланцюга антитіла може бути клонований у вектор таким чином, що сигнальний пептид буде приєднаним в межах рамки зчитування до N’- кінця гена ланцюга антитіла. Сигнальний пептид може бути імуноглобуліновим сигнальним пептидом або гетерологічним сигнальним пептидом (тобто, сигнальним пептидом від не- імуноглобулінового білка). На додачу до генів ланцюга антитіла, рекомбінантні вектори експресії винаходу несуть регуляторні послідовності, що контролюють експресію генів ланцюга антитіла у клітині-хазяї. Термін “ регуляторна послідовність ” призначений для позначення промоторів, підсилювачів та інших елементів, що контролюють експресію (наприклад, сигналів поліаденілування), транскрипцію або трансляцію генів ланцюга антитіла. Такі регуляторні послідовності описані, наприклад, у Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990). Фахівцям відомо, що конструкція вектора експресії, в тому числі відбір регуляторних послідовностей може залежати від таких факторів, як здатність клітини-хазяя до трансформації, від рівня експресії бажаного білка, тощо. Прийнятні регуляторні послідовності для експресії клітин-хазяїв ссавців містять вірусні елементи, що спрямовують високі рівні експресії білку у клітинах ссавців, як-то промотори та/або підсилювачі, що походять від цитомегаловірусу (CMV) (як-то CMV промотор/підсилювач), вірусу SV40 (як-то SV40 промотор/підсилювач), аденовірусу, (наприклад, головний пізній промотор аденовірусу (AdMLP)) та поліоми. Для додаткового опису вірусних регуляторних елементів та їх послідовностей, див., наприклад, U.S. Patent No. 5,168,062 by Stinski, U.S. Patent No. 4,510,245 by Bell et al., and U.S. Patent No. 4,968,615 by Schaffner et al., На додачу до генів ланцюга антитіла та регуляторних послідовностей, рекомбінантні вектори експресії винаходу можуть нести додаткові послідовності, як-то послідовності, що регулюють реплікацію вектора у клітини-хазяї (наприклад, реплікатори) та здатні до відбору маркерні гени. Здатні до відбору маркерні гени полегшують відбір клітини-хазяя, до якої має бути введений вектор (Див., наприклад, U.S. Patents Nos. 4,399,216, 4,634,665 та 5,179,017, all by Axel et al.). Наприклад, звичайно, здатні до відбору маркерні гени надають клітині-хазяю, до якої має бути введений вектор, стійкість до лікарських препаратів, як-то до G418, пуроміцину, бластицидину, гідроміцину або метотрексату. Прийнятні здатні до відбору маркерні гени охоплюють ген дигідрофолат-редуктази (DHFR) (для застосування у DHFR - клітинах - хазяях з метотрексатною селекцією/ ампліфікацією) та neo ген (для G418 селекції). Для експресії легкого та важкого ланцюгів, вектор(и) експресії, що кодують важкі та легкі ланцюги, трансфікують у клітині-хазяї за допомогою стандартних способів. Різні форми терміну “ трансфекція ” призначені для охоплення різноманітних способів, що звичайно застосовують для введення екзогенної ДНК у прокаріотичні або еукаріотичні клітини-хазяї, наприклад, електропорацію, 11 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ліпофекцію, преципітацію фосфатом кальцію, DEAE - декстранову трансфекцію та под. Можна експресувати антитіла винаходу у прокаріотичних, або у еукаріотичних клітинаххазяях. У певних втіленнях, експресія антитіла виконується у еукаріотичних клітинах, наприклад, клітинах-хазяях ссавців, для оптимальної секреції вірно структурованого та імунологічно активного антитіла. Стандартними клітинами-хазяями ссавців для експресії рекомбінантних антитіл винаходу є клітини яєчника китайського хом'ячка (клітини CHO) (в тому числі клітини DHFR CHO, описані у Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, що застосовують зі здатним до відбору DHFR - маркером, наприклад, як описано у Kaufman and Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621), клітини мієломи NS0, клітини COS, клітини 293 та клітини SP2/0. Коли рекомбінантні вектори експресії, що кодують гени антитіла вводять у клітини-хазяї ссавців, антитіла отримують шляхом культивування клітини-хазяя протягом періоду часу, достатнього для створення експресії антитіла у клітини-хазяї або секреції антитіла у культуральному середовищі, у якому ростуть клітини-хазяї. Антитіла можуть бути відновлені з культурального середовища шляхом застосування стандартних способів очищення білка. Клітини-хазяї можуть також бути застосовані для отримання часток інтактних антитіл, як-то фрагментів Fab або молекул scFv. Зрозуміло, що варіації вищезазначеної процедури знаходяться в межах заявленого винаходу. Наприклад, вони можуть бути бажаними для трансфекції клітин-хазяїв з ДНК, що кодує або легкий ланцюг або важкий ланцюг (але не обидва) анти-vegf антитіла цього винаходу. Способи рекомбінантної ДНК також можуть бути застосовані для видалення деякої, або всієї ДНК, що кодує легкий або важкий ланцюг (або обидва), яка не є необхідною для зв'язування з VEGF. Молекули, що експресовані від такої усіченої молекули ДНК також охоплюються антитілами винаходу. На додачу, можуть бути отримані біфункціональні антитіла, у яких один важкий та один легкий ланцюг являють собою антитіло винаходу та інший важкий та легкий ланцюг є специфічними для іншого, ніж VEGF антигену за допомогою зшивання антитіла винаходу з іншим антитілом шляхом стандартних хімічних способів зшивання. Біфункціональні антитіла також можуть бути отримані за допомогою експресії нуклеїнових кислот, розроблених для кодування біфункціонального антитіла. У деяких втіленнях, антитіла подвійної специфічності, тобто, антитіла, що зв'язують VEGF та неспоріднений антиген за допомогою певного сайту зв'язування, можуть бути отримані шляхом мутування амінокислотних залишків у легкому ланцюзі та/або важколанцюгових CDR. У різних втіленнях, антитіла подвійної специфічності, що зв'язують два антигену, як-то HER2 та VEGF, можуть бути отримані шляхом мутування амінокислотного залишку на периферії сайту зв'язування антигену (Bostrom et al., 2009, Science 323:1610-1614). Антитіла подвійної специфічності можуть бути отримані за допомогою експресії нуклеїнових кислот, розроблених для кодування антитіла подвійної специфічності. Для рекомбінантної експресії анти-vegf антитіла винаходу, клітини-хазяї можуть бути співтрансфіковані з двома векторами експресії винаходу, де перший вектор кодує поліпептид, що походить від важкого ланцюга та другий вектор кодує поліпептид, що походить від легкого ланцюга. Звичайно, кожен з двох векторів по окремості містить селективний маркер. Альтернативно, може бути застосований одиничний вектор, що кодує обидва поліпептиду важкого та легкого ланцюгів. Після отримання нуклеїнових кислот, що кодують одну або декілька часток анти-vegf антитіла, у кодуючу послідовність можуть бути введені додаткові зміни або мутації, наприклад, для отримання нуклеїнових кислот, що кодують антитіла з різними послідовностями CDR, антитіла зі зменшеною афінністю до Fc рецептора, або антитіла різних субкласів. Анти-vegf антитіла винаходу можуть також бути отримані шляхом хімічного синтезу nd (наприклад, за допомогою способів, описаних у Solid Phase Peptide Synthesis, 2 ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). Варіантні антитіла також можуть бути отримані шляхом застосування вільної від клітин платформи (Див.,наприклад, Chu et al., 2001, Biochemia No. 2 (Roche Molecular Biologicals)). Після отримання анти-vegf антитіл винаходу за допомогою рекомбінантної експресії, вони можуть бути очищені шляхом будь-якого відомого способу очищення імуноглобулінових молекул, наприклад, за допомогою хроматографії (наприклад, іонообмінної, афінної, особливо з афінністю для VEGF після відбору білка А або білка G та хроматографією на колонці), центрифугування, диференційної розчинності або з застосуванням будь-якого іншого стандартного способу очищення білка. Додатково, анти-vegf антитіла заявленого винаходу або їх фрагменти можуть бути злиті з описаними тут гетерологічними поліпептидними послідовностями або іншим відомим у цій галузі чином для сприяння очищення. 12 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Після виділення, анти-vegf антитіло може бути додатково очищено, якщо це бажано, наприклад, шляхом високоефективної рідинної хроматографії. (Див., Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology (Work and Burdon, TM eds., Elsevier, 1980), або гель-фільтраціонною хроматографією на колонці Superdex 75 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden). У деяких втіленнях, анти-vegf антитіла винаходу мають певні біологічні активності, як-то конкурування з Бевацизумаб або Ранібізумаб за зв'язування до VEGF або нейтралізація активності VEGF. Відповідно, у певних втіленнях, анти-vegf антитіла винаходу конкурують з Бевацизумаб або Ранібізумаб за зв'язування до VEGF. Здатність конкурувати за зв'язування до VEGF може бути перевірена за допомогою конкурентного аналізу. В одному з прикладів конкурентного аналізу, VEGF прив'язують до твердої поверхні, наприклад, до мікролункового планшета, шляхом контакту планшета з розчином VEGF (наприклад, при концентрації 1 мкг/мл у PBS протягом ночі при 4 °C). Планшет промивають (наприклад, 0.1 % Tween 20 у PBS) та блокують (наприклад, у Superblock, Thermo Scientific, Rockford, IL). Суміш недонасиченої кількості біотінільованого Бевацизумаб (80 нг/мл) або еквівалентної кількості біотінільованого Ранібізумаб та неміченого Бевацизумаб (або Ранібізумаб в залежності від обставин) (“ референсне ” антитіло) або конкуруючого анти-vegf антитіла (“ тестове ” антитіло) в серійному розведенні (наприклад, при концентрації у 2.8 мкг/мл, 8.3 мкг/мл, або 25 мкг/мл) в ІФА буфері (наприклад, 1 % BSA та 0.1 % Tween 20 у PBS) додають до лунок та планшети інкубують протягом години з обережним струшуванням. Планшети знову промивають, до кожної лунки додають 1мкг/мл HRPкон'югованого стрептавідину, розведеного у ІФА буфері та планшети інкубують протягом години. Потім планшети ще раз промивають та зв'язані антитіла визначають додаванням субстрату (наприклад, TMB, Biofx Laboratories Inc., Owings Mills, MD). Реакцію зупиняють шляхом додавання стоп - буфера (наприклад, Bio FX Stop Reagents, Biofx Laboratories Inc., Owings Mills, MD) та абсорбцію вимірюють при 650 нм за допомогою мікропланшетного рідера (наприклад, VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Варіації цього аналізу конкуренції також можуть бути застосовані для перевірки конкуренції між анти-vegf антитілом винаходу та Бевацизумаб або Ранібізумаб. Наприклад, у деяких аспектах, анти-vegf антитіло застосовують у якості референсного антитіла та Бевацизумаб або Ранібізумаб застосовують у якості тестового антитіла. Додатково, замість розчинного VEGF, може бути застосований зв'язаний з мембраною VEGF, що експресується на клітинній поверхні (наприклад, поверхні клітин ссавців) у культуральному середовищі. Інші формати для аналізу конкуренції також відомі у цій галузі та можуть бути застосовані. У різних втіленнях, анти-vegf антитіло винаходу зменшує зв'язування міченого Бевацизумаб або Ранібізумаб принаймні на 30 %, принаймні на 40 %, принаймні на 50 %, принаймні на 60 %, принаймні на 70 %, принаймні на 80 %, принаймні на 90 %, принаймні на 95 %, принаймні на 99 %, або у відсотках в діапазоні від будь-якого з вищевказаних значень (наприклад, анти-vegf антитіло винаходу зменшує зв'язування міченого Бевацизумаб або Ранібізумаб на 50 % - 70 %) при застосуванні антитіла з концентрацією 0.08 мкг/мл, 0.4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл або з концентрацією у діапазоні між будь-якими з вищевказаних значень (наприклад, з концентрацією у діапазоні від 2 мкг/мл до 10 мкг/мл). У інших втіленнях, Бевацизумаб або Ранібізумаб зменшує зв'язування міченого анти-vegf антитіла винаходу принаймні на 40 %, принаймні на 50 %, принаймні на 60 %, принаймні на 70 %, принаймні на 80 %, принаймні на 90 %, у відсотках у діапазоні від будь-якого з вищевказаних значень (наприклад, Бевацизумаб або Ранібізумаб зменшує зв'язування міченого анти-vegf антитіла винаходу на 50 % - 70 %) при застосуванні Бевацизумаб або Ранібізумаб з концентрацією 0.4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл, 50 мкг/мл, 250 мкг/мл або з концентрацією у діапазоні між будь-якими з вищевказаних значень (наприклад, з концентрацією у діапазоні 2 мкг/мл - 10 мкг/мл). У інших аспектах, анти-vegf антитіло винаходу інгібує (або нейтралізує) активність VEGF в аналізах in vitro, як-то клітинної проліферації або клітинної міграції. Наприклад, у одному втіленні, активність VEGF аналізують у вигляді індукування проліферації ендотеліальної клітини ("EC") (Див., наприклад, протокол у Qin et al., 2006, J. Biol. Chem. 281:32550-32558). У іншому втіленні, активність VEGF аналізують у вигляді індукування міграції EC (Див., наприклад, протокол скарифікаційного аналізу in vitro, описаний у Liang et al., 2007, Nat. Protoc. 2:329-333). У певному втіленні, анти-vegf антитіло перевіряють на здатність зворотної проліферації та клітинної міграції, стимульовану VEGF та дeлокалізацію щільного з'єднання білків, індукованого VEGF165 у іморталізованих ендотеліальних клітинах сітківки корів (Deissler et al., 2008, British Journal of Ophthalmology 92:839-843). У іншому втіленні, нейтралізацію активності VEGF 13 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 досліджували з застосуванням репортерного аналізу (Див.,наприклад, Yohno et al., 2003, Biological & Pharmaceutical Bulletin 26(4):417-20 та U.S. Patent No. 6,787,323). Інші формати аналізів нейтралізації VEGF також відомі у цій галузі та можуть бути застосовані. У різних втіленнях, анти-vegf антитіло винаходу нейтралізує VEGF принаймні на 30 %, принаймні на 40 %, принаймні на 50 %, принаймні на 60 %, принаймні на 70 %, принаймні на 80 %, принаймні на 90 % у відсотках у діапазоні від будь-якого з вищевказаних значень (наприклад, анти-vegf антитіло винаходу нейтралізує активність VEGF на 50 % - 70 %) при застосуванні антитіла з концентрацією у 2 нг/мл, 5 нг/мл, 10 нг/мл, 20 нг/мл, 0.1 мкг/мл, 0.2 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 20 мкг/мл або з концентрацією у діапазоні між будь-якими з вищевказаних значень (наприклад, з концентрацією у діапазоні 1-5 мкг/мл). У деяких втіленнях, анти-vegf антитіло винаходу є щонайменш у 0.7 разів ефективніше, у 0.8 разів ефективніше, у 0.9 разів ефективніше, у 1 раз ефективнішим, у 1.1 рази ефективнішим, у 1.25 разів ефективнішим, у 1.5 рази ефективнішим, у 2 рази ефективнішим, у 5 разів ефективнішим, у 10 разів ефективнішим, у 20 разів ефективнішим, у 50 разів ефективнішим, у 100 разів ефективнішим, у 200 разів ефективнішим, у 500 разів ефективнішим, у 1000 разів ефективнішим, ніж Бевацизумаб або Ранібізумаб у нейтралізації VEGF, або мають ефективність при нейтралізації VEGF відносно Бевацизумаб або Ранібізумаб у діапазоні між будь-якою парою з вищевказаних значень (наприклад, у 0.9-5 разів ефективнішим, ніж Бевацизумаб або Ранібізумаб, або у 2-50 разів ефективнішим, ніж Бевацизумаб або Ранібізумаб у нейтралізації VEGF). У деяких втіленнях, анти-vegf антитіла винаходу мають високу зв'язуючу афінність до VEGF. У певних втіленнях, анти-vegf антитіла заявленого винаходу мають специфічні постійні швидкості асоціації (значення kon або ka), постійні швидкості дисоціації (значення k off або kd), постійні афінності (значення KA), постійні дисоціації (значення KD) та/або значення IC50. У різних втіленнях, постійні зв'язування для взаємодії анти-vegf антитіл з VEGF рецептором можуть бути визначені шляхом застосування поверхневого плазмонного резонансу, наприклад, у відповідності зі способом, наданим у Karlsson et al., 1991, J. Immunol. Methods 145:229-240. У деяких аспектах, такі значення вибрані від наступних втілень. У специфічному втіленні, анти-vegf антитіло винаходу зв'язується з VEGF з k on у щонайменш 4 -1 -1 4 -1 -1 5 -1 -1 5 -1 -1 10 M s , щонайменш 5 × 10 M s , щонайменш 10 M s , щонайменш 5 × 10 M s , 6 -1 -1 6 -1 -1 7 -1 -1 7 щонайменш 10 M s , щонайменш 5 × 10 M s , щонайменш 10 M s , щонайменш 5 × 10 M 1 -1 8 -1 -1 8 -1 -1 9 -1 -1 s , щонайменш 10 M s , щонайменш 5 × 10 M s , щонайменш 10 M s or з kon в будь-якому 5 6 -1 -1 діапазоні між будь-якою парою з вищевказаних значень (наприклад, 5 × 10 -5 × 10 M s або 7 8 -1 -1 10 -10 M s ). -3 -1 У іншому втіленні, анти-vegf антитіло винаходу зв'язується з VEGF з рівнем k off у 10 s або -4 -1 -4 -1 -5 -1 -5 -1 менше, 5 × 10 s або менше, 10 s або менше, 5 × 10 s або менше, 10 s або менше, -6 -1 -6 -1 -7 -1 -7 -1 -8 -1 5×10 s або менше, 10 s або менше, 5 × 10 s або менше, 10 s або менше, 5 × 10 s або -8 -1 менше, 10 s або менше, або з рівнем k off у будь-якому діапазоні між будь-якою парою з -4 -6 -1 -3 -5 -1 вищевказаних значень (наприклад, 5 × 10 -10 s , або 10 -5 × 10 s ). У іншому втіленні, анти-vegf антитіло винаходу зв'язується з VEGF з KA (kon/koff) у 8 -1 9 -1 10 -1 10 -1 11 щонайменш 10 M , щонайменш 5 × 10 M , щонайменш 10 M , щонайменш 5 × 10 M , 10 -1 11 -1 12 -1 12 -1 13 -1 M , щонайменш 5 × 10 M , щонайменш 10 M , щонайменш 5 × 10 M , щонайменш 10 M , 13 -1 14 -1 14 -1 15 -1 щонайменш 5 × 10 M , щонайменш 10 M , щонайменш 5 × 10 M , щонайменш 10 M або 9 з KA в будь-якому діапазоні між будь-якою парою з вищевказаних значень (наприклад, 5 × 10 -1 11 -1 11 -1 14 -1 M -10 M , або 10 M -5 × 10 M ). -8 У інших втіленнях, анти-vegf антитіло винаходу зв'язується з VEGF з K D (koff/kon) у 10 M або -9 -9 -10 -10 менше, 5 × 10 M або менше, 10 M або менше, 5 × 10 M або менше, 10 M або менше, -11 -11 -12 -12 -13 5 × 10 M або менше, 10 M або менше, 5 × 10 M або менше, 10 M або менше, 5 × 10 M -13 -14 -14 -15 або менше, 10 M або менше, 5 × 10 M або менше, 10 M або менше, 5 × 10 M або -15 менше, 10 M або менше, або з KD в будь-якому діапазоні між будь-якою парою з -9 -12 -11 M -13 вищевказаних значень (наприклад, 5 × 10 -5 × 10 M, або від 5 × 10 -5 × 10 M). У певних втіленнях, значення KD (koff/kon) визначають за допомогою добре відомих або описаних тут аналізів, наприклад, ІФА, ізотермальною титраційною калориметриєю (ITC), аналізом флуоресцентної поляризації або будь-якими іншими біосенсорами, як-то BIAcore. У деяких втіленнях, анти-vegf антитіло винаходу зв'язується з VEGF та інгібує зв'язування 7 VEGF до рецептора VEGF (Flt-1 або Flk-1) при значенні IC50, меншим, ніж 5 × 10 нМ, меншим, 7 6 6 5 ніж 10 нМ, меншим, ніж 5 × 10 нМ, меншим, ніж 10 нМ, меншим, ніж 5 × 10 нМ, меншим, ніж 5 4 4 3 10 нМ, меншим, ніж 5 × 10 нМ, меншим, ніж 10 нМ, меншим, ніж 5 × 10 нМ, меншим, ніж 3 2 10 нМ, меншим, ніж 5 × 10 нМ, меншим, ніж 100 нМ, меншим, ніж 90 нМ, меншим, ніж 80 нМ, 14 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 меншим, ніж 70 нМ, меншим, ніж 65 нМ, меншим, ніж 60 нМ, меншим, ніж 50 нМ, меншим, ніж 40 нМ, меншим, ніж 30 нМ, меншим, ніж 25 нМ, меншим, ніж 20 нМ, меншим, ніж 15 нМ, меншим, ніж 12 нМ, меншим, ніж 10 нМ, меншим, ніж 5 нМ, меншим, ніж 1 нМ, меншим, ніж -1 -1 -2 -2 5 × 10 нМ, меншим, ніж 10 нМ, меншим, ніж 5 × 10 нМ, меншим, ніж 10 нМ, меншим, ніж -3 -3 -4 -4 5 × 10 нМ, меншим, ніж 10 нМ, меншим, ніж 5 × 10 нМ, або меншим, ніж 10 нМ, або з IC50 в 7 будь-якому діапазоні між будь-якою парою з вищевказаних значень (наприклад, 5 × 10 -50 нМ, -3 або 15 нМ - 5 × 10 нМ). IC50 може бути виміряне добре відомими або описаними тут способами, наприклад, ІФА. У інших втіленнях, анти-vegf антитіло винаходу зв'язується з VEGF та нейтралізує активність VEGF у біоаналізі (наприклад, проліферацію або міграцію EC) зі значенням IC 50 меншим, ніж 7 7 6 6 5 × 10 нМ, меншим, ніж 10 нМ, меншим, ніж 5 × 10 нМ, меншим, ніж 10 нМ, меншим, ніж 5 5 4 4 5 × 10 нМ, меншим, ніж 10 нМ, меншим, ніж 5 × 10 нМ, меншим, ніж 10 нМ, меншим, ніж 3 3 2 5 × 10 нМ, меншим, ніж 10 нМ, меншим, ніж 5 × 10 нМ, меншим, ніж 100 нМ, меншим, ніж 90 нМ, меншим, ніж 80 нМ, меншим, ніж 70 нМ, меншим, ніж 65 нМ, меншим, ніж 60 нМ, меншим, ніж 50 нМ, меншим, ніж 40 нМ, меншим, ніж 30 нМ, меншим, ніж 25 нМ, меншим, ніж 20 нМ, меншим, ніж 15 нМ, меншим, ніж 12 нМ, меншим, ніж 10 нМ, меншим, ніж 5 нМ, меншим, ніж -1 -1 -2 1 нМ, меншим, ніж 5 × 10 нМ, меншим, ніж 10 нМ, меншим, ніж 5 × 10 нМ, меншим, ніж -2 -3 -3 -4 10 нМ, меншим, ніж 5 × 10 нМ, меншим, ніж 10 нМ, меншим, ніж 5 × 10 нМ, або меншим, ніж -4 10 нМ або з IC50 в будь-якому діапазоні між будь-якою парою з вищевказаних значень 7 -3 (наприклад, 5 × 10 -50 нМ, або 15 нМ - 5 × 10 нМ). Аналіз нейтралізації зразків, що може бути застосований для вимірювання IC50 анти-vegf антитіла описаний у Розділі 6.3 нижче. У деяких втіленнях, анти-vegf антитіло зв'язується з VEGF та інгібує зв'язування VEGF з Flt1, Flk-1 або обома, або інгібує активність VEGF в аналізі нейтралізації VEGF, при значенні IC50 між приблизно1 пМ та приблизно 1 мкМ. У певних втіленнях, анти-vegf антитіло зв'язується з VEGF та інгібує зв'язування VEGF з Flt-1, Flk-1 або обома, або інгібує активність VEGF в аналізі нейтралізації VEGF, при значенні IC50 між 10 пМ та 100 нМ, між 100 пМ та 10 нМ, між 200 пМ та 5 нМ, між 300 пМ та 4 нМ, між 500 пМ та 3 нМ, між 750 пМ та 2 нМ, між 1 нМ та 20 нМ, між 500 пМ та 40 нМ, між 50 пМ та 50 нМ, між 250 пМ та 100 нМ, та між 100 нМ та 1 мкМ, або з IC50 в будь-якому діапазоні між будь-якою парою з вищевказаних значень (наприклад, 10 пМ - 50 нМ, або 750 пМ - 2 нМ). У деяких аспектах вищевказаних втілень, IC 50 вимірюють у присутності VEGF з концентрацією 0.001мкМ, 0.005 мкМ, 0.01 мкМ, 0.05 мкМ, 0.1мкМ, 0.5 мкМ, 1 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 30 мкМ, 40 мкМ, 50 мкМ, 60 мкМ, 70 мкМ, 80 мкМ, 90 мкМ, 100 мкМ, 200 мкМ, 300 мкМ, 400 мкМ, 500 мкМ, 600 мкМ, 700 мкМ, 800 мкМ, 900 мкМ, 1000 мкМ або з концентрацією в будьякому діапазоні між будь-якою парою з вищевказаних значень (наприклад, 0.01-50 мкМ або 10100 мкМ). У деяких втіленнях, кінетичні властивості антитіла винаходу порівняні з, або поліпшені відносно до Бевацизумаб або Ранібізумаб у порівняльному аналізі. Наприклад, у певних втіленнях, анти-vegf антитіло винаходу зв'язується з VEGF зі значенням k on у діапазоні приблизно 0.5x-1000x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, наприклад, k on=0.5x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, kon=0.75x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=0.9x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, kon=1x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=1.1x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, kon=1.2x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=1.3x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=1.4x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=1.5x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=1.75x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=2x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=2.25x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=2.5x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=3x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=4x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=5x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, kon=7.5x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=10x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, kon=15x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=20x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, kon=50x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=75x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, kon=100x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=150x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, kon=200x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=200x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб або kon у діапазоні між будь-якою парою вищевказаних значень, наприклад, k on=2x75x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=5x-100x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, k on=0.5x1000x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, kon=0.75x-200x kon Бевацизумаб або Ранібізумаб, тощо. У деяких втіленнях, анти-vegf антитіло винаходу зв'язується з VEGF зі значенням koff у діапазоні 0.001x-3x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, наприклад, k off=0.002x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, koff=0.005x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, k off=0.0075x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, koff=0.01x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, koff=0.025x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, koff=0.05x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, k off=0.075x koff Бевацизумаб або 15 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ранібізумаб, koff=0.1x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, k off=0.25x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, koff=0.5x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, k off=0.75x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, koff=0.9x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, k off=1x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, koff=1.1x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, k off=1.25x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, k off=1.5x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, k off=1.75x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, k off=4x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, k off=3x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, k off=2x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, koff=3x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, або k off у діапазоні між будь-якою парою вищевказаних значень, наприклад, k off=0.01x-1.1x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, koff=0.05x-1.25x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, k off=0.1x-0.9x koff Бевацизумаб або Ранібізумаб, тощо. У інших втіленнях, анти-vegf антитіло винаходу зв'язується з VEGF з KA (kon/koff) у діапазоні 0.25x-1000x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, наприклад, KA=0.5x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=0.75x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=1x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=2x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=4x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=10x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=15x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=20x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=30x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=40x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=50x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=100x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=250x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=500x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=750x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=1000x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, або KA у діапазоні між будь-якою парою вищевказаних значень, наприклад, KA=0.75x-10 5x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=1x-100x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=10x-20x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=4x-50x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, KA=2x-20x KA Бевацизумаб або Ранібізумаб, або будь-яким значенням або величиною, що може бути обчислена від наведених тут значень k on та koff. У інших втіленнях, анти-vegf антитіло винаходу зв'язується з VEGF з KD (koff/kon) у діапазоні 0.001 x-10x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, наприклад, KD=0.001x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=0.005x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=0.01x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=0.05x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=0.075x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=0.1x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=0.2x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=0.3x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=0.4x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=0.5x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=0.6x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=0.7x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=0.8x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=0.9x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=1x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=1.5x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=2x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=4x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=7.5x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=10x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, або KD у діапазоні між будь-якою парою вищевказаних значень, наприклад, KD=0.01x-2x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=0.1x-1.5x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=0.7x-4x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, KD=0.2x-2x KD Бевацизумаб або Ранібізумаб, або будь-яким значенням або величиною, що може бути обчислена від наведених тут значень kon та koff. У деяких втіленнях, анти-vegf антитіло винаходу зв'язується з VEGF та інгібує зв'язування VEGF до Flt-1, Flk-1 або до обидвох, або нейтралізує активність VEGF при значенні IC 50 у діапазоні 0.001x-10x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, наприклад, IC50=0.001x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=0.005x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=0.01x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=0.05x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=0.075x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=0.1x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=0.2x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=0.3x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=0.4x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=0.5x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=0.6x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=0.7x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=0.8x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=0.9x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=1x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=1.5x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=2x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=4x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=7.5x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=10x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб або IC50 у діапазоні між будь-якою парою вищевказаних значень, наприклад, IC50=0.01x-2x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=0.1x-1.5x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=0.7x-4x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб, IC50=0.2x-2x IC50 Бевацизумаб або Ранібізумаб. У певних втіленнях, одиничне заміщення CDR може привести до вищезгаданих відмінностей у IC 50 порівняно з Бевацизумаб або Ранібізумаб, в той час, як анти-vegf антитіло винаходу може містити таке заміщення та ще до 16 додаткових заміщень CDR порівняно з Бевацизумаб або Ранібізумаб. У деяких аспектах, ця заявка стосується анти-vegf антитіл, що мають зменшену 16 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імуногенність порівняно з Бевацизумаб або Ранібізумаб. Ця заявка стосується анти-vegf антитіл, що мають одиничні або множинні амінокислотні заміщення у їх CDR та/або каркасних регіонах порівняно з CDR Бевацизумаб, де щонайменш одне заміщення зменшує імуногенність антитіла порівняно з Бевацизумаб або Ранібізумаб. У певних втіленнях, зменшення імуногенності є результатом одної або декількох амінокислотних заміщень, що веде до усунення або до послаблення дії одного або декількох T - клітинних епітопів. У деяких аспектах, анти-vegf антитіла винаходу, що мають зменшену імуногенність мають порівняну з Бевацизумаб або Ранібізумаб або поліпшену біологічну активність, наприклад, афінність до VEGF або нейтралізацію активності VEGF. Такі властивості можуть бути перевірені, наприклад, за допомогою способів, описаних у Розділі 6.3 вище. У деяких втіленнях, імуногенність анти-vegf антитіла винаходу зменшена відносно антитіла Бевацизумаб або Ранібізумаб. Такі антитіла головним чином мають варіантні послідовності відносно змінного регіону важкого та/або легкого ланцюга у регіонах, що відповідають SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:62 та/або SEQ ID NO:74. Антитіла, головним чином, мають одне, два або три амінокислотні заміщення у однієї, двох або у всіх трьох послідовностях, що відповідають SEQID NO:25, SEQ ID NO:62, та SEQ ID NO:74, хоча тут передбачено до чотирьох або п'яти заміщень у одному, двох або всіх трьох регіонах. Як застосовано у заявленому винаході, варіант зі “ зменшеною імуногенністю ” має відношення до анти-vegf антитіла з варіантною послідовністю у регіоні, що відповідає SEQID NO:25, SEQ ID NO:62, та/або SEQ ID NO:74, яке проявляє зменшену проліферативну відповідь у мононуклеарних клітинах периферичної крові порівняно з пептидом SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:62, або SEQ ID NO:74, відповідно. Типовий аналіз проліферації, що може бути застосований для оцінки проліферативної відповіді наведено у Розділі 7 нижче. Зменшена проліферативну відповідь може бути відображена у вигляді відсотка респондерів, індексу стимуляції, або обома критеріями. У інших втіленнях, порівняно з пептидом, що має послідовність SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:62, або SEQ ID NO:74, варіантна послідовність веде до щонайменш на 25 % меншої кількості респондерів, до щонайменш на 30 %, до щонайменш на 35 %, до щонайменш на 40 %, до щонайменш на 45 %, до щонайменш на 50 %, до щонайменш на 60 %, до щонайменш на 65 %, до щонайменш на 70 %, до щонайменш на 75 %, до щонайменш на 80 %, до щонайменш на 85 %, до щонайменш на 90 %, до щонайменш на 95 %, 100 % меншої кількості респондерів, або до зменшення респондерів у діапазоні між будь-якими з вищевказаних значень, наприклад, 25 % - 75 %, 50 % - 90 %, 60 % - 100 %, 70 % - 90 %, тощо. У інших втіленнях, варіантна послідовність веде до індексу стимулювання, що буде принаймні на 5 % меншим, принаймні на 10 % меншим, принаймні на 15 % меншим, принаймні на 20 % меншим, принаймні на 25 % меншим, принаймні на 30 % меншим, принаймні на 35 % меншим або принаймні на 40 % меншим, ніж індекс стимулювання, викликаний пептидом SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:62, або SEQ ID NO:74, відповідно, або веде до зменшення індексу стимулювання у діапазоні між будь-яким з вищевказаних значень порівняно з пептидом SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:62, або SEQ ID NO:74, наприклад, на 5 % - 20 % менше, на 10 % - 30 % менше, на 25 % - 35 % менше, на 30 % - 40 % менше, тощо. Стандартні втілення прийнятних анти-vegf антитіл зі зменшеною імуногенністю порівняно з Бевацизумаб або Ранібізумаб охоплюють одне або декілька заміщень або комбінацій заміщень CDR, наведених у Таблиці 6. Вибірково, анти-vegf антитіла зі зменшеною імуногенністю порівняно з Бевацизумаб або Ранібізумаб містять одне або декілька додаткових заміщень, як-то мутації CDR, наведені у будь-якої з Таблиць 7-13, одиночних, або у комбінації. Додаткові стандартні втілення можливих анти-vegf антитіл зі зменшеною імуногенністю порівняно з Бевацизумаб або Ранібізумаб стосуються або заміщень, або комбінацій заміщень CDR, наведених у Таблицях 14–16. Деякі бажані втілення анти-vegf антитіл зі зменшеною імуногенністю порівняно з Бевацизумаб або Ранібізумаб наведені у Таблиці 19. Анти-vegf антитіла винаходу містять кон'югати антитіла, що модифіковані, наприклад, ковалентним прикріпленням будь-якого типу молекул до антитіла таким чином, що ковалентне прикріплення не перешкоджає зв'язуванню до VEGF. [0100] У деяких аспектах, анти-vegf антитіло винаходу може бути кон'югованим до ефекторної групи або мітки. Термін “ ефекторна група ”, як тут застосовано, охоплює, наприклад, антинеопластичні агенти, Ліки, токсини, біологічно активні білки, наприклад, ферменти, інші антитіла або фрагменти антитіл та синтетичні або природні полімери, нуклеїнові кислоти (наприклад, ДНК та РНК), радіонукліди, особливо радіойодиди, радіоізотопи, хелатуючі метали, наночастинки та репортерні групи, як-то флуоресцентні суміші або суміші, що можуть бути визначені за допомогою ЯМР або ЕПР- спектроскопії. 17 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У одному прикладі, анти-vegf антитіла можуть бути кон'юговані до ефекторної групи, як-то цитотоксичного агента, радіонукліду або групи ліків для змінення даної біологічної відповіді. Ефекторна група може бути білком або поліпептидом, як-то, наприклад, та без обмеження, токсином (як-то абрин, рицин A, екзотоксин Pseudomonas або дифтерійний токсин), сигнальною молекулою (як-то α-інтерферон, β- інтерферон, фактор росту нервів, тромбоцитарний фактор росту або тканинний активатор плазміногену), тромботичним агентом або анти - ангіогенним агентом (наприклад, ангіостатином або ендостатином) або модифікатором біологічної відповіді, як-то цитокіном або фактором росту (наприклад, інтерлейкін-1 (IL-I), інтерлейкін-2 (IL-2), інтерлейкін-6 (IL-6), гранулоцитарний колонієстімулюючій фактор макрофагів (GM-CSF), гранулоцитарний колонієстімулюючій фактор (G-CSF), або фактор росту нервів (NGF)). У іншому прикладі ефекторними групами можуть бути цитотоксини або цитотоксичні агенти. Приклади цитотоксинів та цитотоксичних агентів охоплюють таксол, цитохалазин, граміцидин D, бромистий етидій, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дігідроксі антрацин діон, мітоксантрон, мітраміцин, актіноміцін D, 1дигідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол, пуроміцин та їх аналоги та гомологи. Ефекторні групи також охоплюють, але без обмеження, антиметаболіти (наприклад, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тіогуанін, цитарабін, 5- фторурацил декарбазин), алкілуючі агенти (наприклад, мехлоретамін, тіоепа хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) та ломустін (CCNU), циклофосфамід, бісульфан, дибромоманітол, стрептозотоцин, мітоміцин С5 та цис - дихлородіамін платінум (II) (DDP) цисплатін), антрацикліни (наприклад, даунорубіцин (стара назва дауноміцин) та доксорубіцин), антибіотики (наприклад, дактиноміцин (стара назва актиноміцин), блеоміцин, мітраміцин, антраміцин (AMC), каліхеаміцини або дуокарміцини), та анти-мітотичні агенти (наприклад, вінкристин та вінбластин). 111 90 Інші ефекторні групи можуть містити радіонукліди, як-то, але без обмеження, Індій, Ітрій, 177 213 252 192 188 188 Лютецій , Вісмут , Каліфорній , Ірідій Вольфрам /Реній та Ліки, як-то, але без обмеження, алкілфосфохоліни, інгібітори топоізомерази I, таксоїди та сурамін. Способи кон'югації таких ефекторних груп з антитілами добре відомі (Див.,наприклад, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., at pp. 623-53 (Robinson et al., eds., 1987)); Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58 та Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics 83:67-123). У одному прикладі, анти-vegf антитіло або його фрагмент з'єднані ковалентним зв'язком (наприклад, пептидним зв'язком), через N’-кінець або C’- кінець антитіла або внутрішньо до амінокислотної послідовності іншого білка (або його частки; наприклад, частки білка у щонайменш 10, 20 або 50 амінокислот). Антитіло або його фрагмент може бути приєднаним до іншого білка за N’-кінець сталого домену антитіла. Для отримання таких конструкцій можуть бути застосовані способи рекомбінантної ДНК, наприклад, описані у WO 86/01533 та EP0392745. У іншому прикладі, ефекторна молекула може підвищити час напіввиведення in vivo, та/або збільшити постачання антитіл крізь епітеліальний бар'єр до імунної системи. Приклади прийнятних ефекторних молекул цього типу охоплюють полімери, альбумін, альбумін-зв'язуючи білки або альбумін-зв'язуючи суміші, як-то описані у WO 2005/117984. У деяких аспектах, анти-vegf антитіло кон'юговано до маленької молекули токсину. У певних стандартних втіленнях, анти-vegf антитіло винаходу кон'юговано до пептидних аналогів або похідних доластатину або долостатину, наприклад, до ауристатину (U.S. Pat. Nos. 5,635,483 та 5,780,588). Лікарська група доластатину або ауристатину може бути прикріплена до антитіла через його N’-кінець, C’-кінець або внутрішньо (WO 02/088172). Стандартні втілення ауристатину містять N’-кінцеве приєднання монометилауристатинових лікарських груп DE та DF, як наведено у U.S. Patent No. 7,498,298, що наданий тут у своєї повноті у якості посилання (наприклад, виявлення лінкерів та способів отримання монометилвалінових сумішей, як-то MMAE та MMAF кон'югованих до лінкерів). У інших стандартних втіленнях, маленькі молекули токсинів охоплюють, але без обмеження, каліхеаміцин, маітанзин (U.S. Pat. No. 5,208,020), трихотен та CC1065. У одному втіленні винаходу, антитіло кон'юговано до однієї або до декількох молекул маітанзину (наприклад, біля 1-10 молекул маітанзину на молекулу антитіла). Маутанзин може, наприклад, бути перетворений на May-SS-Me, який, у свою чергу, може бути скорочений до May-SH3 та реагувати з антитілом (Chari et al., 1992, Cancer Research 52: 127-131) з отриманням гібридного кон'югату маітанзонід – антитіло або маітанзонід -Fc. Структурні аналоги каліхеаміцину, що 1 1 1 також можуть бути застосовані, охоплюють, але без обмеження, γ 1 , γ3 , N-ацетил- γ1 , PSAG, та 1 θ1 , (HiнМ et al., 1993, Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al., 1998, Cancer Research 58:29252928; U.S. Patent No. 5,714,586; U.S. Patent No. 5,712,374; U.S. Patent No. 5,264,586; U.S. Patent 18 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 No. 5,773,001). Антитіла винаходу також можуть бути кон'юговані до ліпосом для цільової доставки (Див.,наприклад, Park et al., 1997, Adv. Pharmacol. 40:399–435; Marty & Schwendener, 2004, Methods in Molecular Medicine 109:389-401). У одному прикладі, антитіла заявленого винаходу можуть бути прикріплені до полі (етиленгліколь) (PEG) групи. У одному окремому прикладі антитіло являє собою фрагмент антитіла та PEG групи, що можуть бути прикріплені за будь-який прийнятний амінокислотний бічний ланцюг або термінальну амінокислотну функціональну групу, розміщену у фрагменті антитіла, наприклад, будь-яку вільну аміно, іміно, тіолову, гідроксильну або карбоксильну групу. Така амінокислота може природно траплятися у фрагменті антитіла або може бути вбудована у фрагмент шляхом застосування способів рекомбінантної ДНК. Див., наприклад, U.S. Patent No. 5,219,996. Кілька сайтів може бути застосовано для прикріплення двох або більше молекул PEG. PEG-групи можуть бути ковалентно приєднані через тіолову групу щонайменш одного цистеїнового залишку, розміщеного у фрагменті антитіла. Коли тіолову групу застосовують у якості точки прикріплення, відповідно активуються ефекторні групи, наприклад, тіолові селективні похідні, як-то малеіміди та цистеїнові похідні, що можуть бути застосовані. У певному прикладі, кон'югат анти-vegf антитіла є модифікованим Fab' фрагментом, який є PEGільованим, тобто, має PEG (полі(етиленгліколь)), ковалентно прикріплений до нього, наприклад, способом, наведеним у EP0948544. Див. також Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, New York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris and S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D.C., 1997); and Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam and A. Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998); and Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545. PEG може бути прикріпленим до цистеїну у шарнірному регіоні. У одному прикладі, PEG-модифікований Fab' фрагмент має малеімідну групу, ковалентно приєднану до одиничної тіолової групи у модифікованому шарнірному регіоні. До малеімідної групи може бути ковалентно приєднаний лізиновий залишок та до кожної аміногрупи лізинового залишку може бути прикріплений метоксиполі(етиленгліколь) полімер, що має молекулярну вагу приблизно 20,000 Да. Загальна молекулярна вага прикріпленого до Fab' фрагмента PEG може сягати приблизно 40,000 Да. Слово “ мітка ”, застосоване тут, має відношення до здатної до виявлення суміші або композиції, що може бути прямо або непрямо кон'югованою з анти-vegf антитілом винаходу. Мітка може бути самостійно здатною до виявлення (наприклад, мітки - радіоактивні ізотопи або флуоресцентні мітки) або, у випадку ензиматичної мітки, вона може каталізувати хімічну перебудову субстратної суміші або здатної до виявлення композиції. Корисні флуоресцентні групи охоплюють, але без обмеження, флуоресцеїн, флуоресцеїну ізотіоціанат, родамін, 5 диметиламин -1- нафталенсульфоніл хлорид, фікоеритрин тощо. Корисні ензиматичні мітки охоплюють, але без обмеження, лужну фосфатазу, пероксидазу хрону, глюкозооксидазу тощо. Додаткові кон'югати анти-vegf антитіла, що корисні, зокрема, для діагностичних цілей, описані у Розділі нижче. Анти-vegf антитіла винаходу, в тому числі ті, що були модифіковані, наприклад, шляхом біотинілювання, пероксидазою хрону, або будь-якою іншою здатною до виявлення групою (в тому числі групами, описаними у Розділі), можуть бути з успіхом застосовані для діагностичних цілей. Зокрема, анти-vegf антитіла можуть бут застосовані, наприклад, але без обмеження, для очищення або визначення VEGF діагностичними способами in vitro та in vivo. Наприклад, антитіла застосовують у імуноаналізах для кількісного та якісного вимірювання рівнів VEGF у біологічних зразках. Див.,наприклад, Harlow et al., Antibodies: Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988), що включено тут шляхом посилання у своєї повноті. Заявлений винахід додатково охоплює антитіла або їх фрагменти, кон'юговані до діагностичного агента. Антитіла можуть бути діагностично застосовані, наприклад, для визначення інтересуючої експресії у певних клітинах, тканинах або сироватці; або для моніторингу розвитку або прогресії імунологічної відповіді у якості частини процедури клінічних випробувань для, наприклад, визначення ефективності обраного режиму лікування. Визначення може бути полегшене шляхом зв'язування антитіла до здатної до виявлення речовини. Приклади здатних до виявлення речовин охоплюють різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні матеріали, люмінесцентні матеріали, біолюмінесцентні матеріали, радіоактивні матеріали, позитронно-активні метали з застосуванням різних позитронно-активних томографій та не-радіоактивні парамагнітні іони металів. Здатна до виявлення речовина може бути сполученою або кон'югованою або прямо до антитіла (або його фрагмента) або непрямим 19 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 шляхом, через посередника (як-то, наприклад, відомий у цій галузі лінкер) з застосуванням відомих фахівцям способів. Приклади ензиматичних міток охоплюють люциферази (наприклад, люцифераза світляка та бактеріальна люцифераза; U.S. Patent No. 4,737,456), люциферин, 2,3дигідрофталазиндіони, малатдегідрогеназу, уреазу, пероксидазу, як-то пероксидазу хрону (HRPO), лужну фосфатазу, β - галактозидазу, ацетилхолінестеразу, глюкоамілазу, лізоцим, оксидази сахаридів (наприклад, глюкозооксидазу, галактозооксидазу та глюкозо-6-фосфат дегідрогеназу), гетероциклічні оксидази (як-то уріказу та ксантиноксидазу), лактопероксидазу, мікропероксидазу тощо. Приклади прийнятних комплексів простетичних груп охоплюють стрептавідин/біотин та авідин/біотин; приклади прийнятних флуоресцентних матеріалів охоплюють умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїн ізотіоціанат, родамін, дихлоро-тріазиніламіно-флуоресцеїн, дансилхлорид або фікоеритрин; приклади люмінесцентних матеріалів охоплюють люмінол; приклади біолюмінесцентних матеріалів охоплюють люциферазу, 125 люциферин та екворин; та приклади прийнятних радіоактивних матеріалів охоплюють Йод, 131 111 99 Йод, Індій або Tехнецій. Винахід стосується визначення експресії VEGF, що полягає у контактуванні біологічного зразка (клітин, тканини, або рідини організму пацієнта) з застосуванням одного або декількох анти-vegf антитіл винаходу (вибірково, кон'югованого до здатної до виявлення групи), та у визначенні, чи є зразок позитивним стосовно VEGF експресії, або, якщо зразок змінено (наприклад, зменшено або збільшено), у порівнянні експресії з контрольним зразком. Захворювання, що можуть бути діагностовано за допомогою даних способів охоплюють, але без обмеження, наведені тут. У певних втіленнях, тканиною або рідиною тіла є периферична кров, лейкоцити периферичної крові, біопсичні тканини, як-то біопсичний матеріал легенів або шкіри, та тканина. Анти-vegf антитіла винаходу можуть бути застосовані для лікування різних новоутворень або не-неопластичних станів, що характеризуються патологічним ангіогенезом. Антитіла винаходу корисні у лікуванні пухлин, у якому ангіогенез грає важливу роль у пухлинному рості, в тому числі у захворюванні на рак та у доброякісних пухлинах. Приклади захворювань на рак, що можуть бути піддані лікуванню, охоплюють, але без обмеження, карциному, лімфому, бластому, саркому та лейкемію. Більш конкретні приклади таких захворювань на рак охоплюють рак плоских клітин, рак легенів (в тому числі дрібноклітинний рак легенів, недрібноклітинний рак легенів, аденосаркому легенів та плоскоклітинну карциному легенів), рак очеревини, гепатоцелюлярний рак, рак шлунку (у тому числі шлунково - кишковий рак), рак підшлункової залози, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчників, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак товстої кишки, колоректальний рак, рак сечового міхура, рак молочної залози, рак товстої кишки, рак товстої кишки, ендометріальну карциному або карциному матки, карциному слинних залоз, рак нирки, рак печінки, рак передміхурової залози, рак вульви, рак щитовидної залози, карциному печінки та різні види раку голови та шиї, а також лімфому B-клітин (в тому числі уповільнену фолікулярну не-ходжкінську лімфому (NHL); малу лімфоцитичну (SL) NHL; середньої важкості фолікулярну NHL; середньої важкості дифузну NHL; дуже агресивну імунобластичну NHL; дуже агресивну лімфобластичну NHL; дуже агресивну дрібноклітинну NHL з нерозсіченими ядрами; масивне ураження NHL; лімфому мантійних клітин; СНІД-споріднену лімфому та макроглобулінемію Вальденстрема); хронічну лімфоцитарну лейкемію (CLL); гостру лімфобластичну лейкемію (ALL); волосатоклітинний лейкоз; хронічну міелобластичну лейкемію та післятрансплантаційний лімфопроліферативний розлад (PTLD), а також аномальну судинну проліферацію, пов'язану з факоматозом, набряк (наприклад, пов'язаний з пухлинами мозку), та синдром Мейгса. Зокрема, захворювання на рак, що піддаються лікуванню антитілами винаходу охоплюють рак молочної залози, колоректальний рак, рак прямої кишки, недрібноклітинний рак легенів, не-ходжкінську лімфому (NHL), рак нирок, рак передміхурової залози, рак печінки, рак підшлункової залози, саркому м'яких тканин, саркому Капоші, карциноїдну карциному, рак голови та шиї, меланому, рак яєчників, мезотеліому, та міеломну хворобу. У деяких втіленнях, анти-vegf антитіла винаходу застосовують для лікування колоректального раку у людині. Заявлений винахід охоплює анти-ангіогенну терапію, стратегію лікування раку, що ставить за мету інгібування розвитку пухлинних кровоносних судин, необхідних для забезпечення споживними речовинами для підтримки росту пухлин. Так як ангіогенез бере участь у первинному пухлинному рості та у розвитку метастазів, антіангіогенне лікування, що надається винаходом, здатне до інгібування неопластичного росту пухлин у первинній локалізації а також попередження метастазів пухлин у місцях вторинної локалізації. Не - неопластичні стани, що піддаються лікуванню антитілами винаходу охоплюють захворювання сітківки (наприклад, вікова макулярна дегенерація) та імунні та запальні 20 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 захворювання (наприклад, ревматоїдний артрит, псоріаз, атеросклероз, діабет та інші проліферативні ретинопатії, в тому числі ретинопатію недоношених, ретролетальну фіброплазію, неоваскулярну глаукому, вікові макулярні дегенерації, гіперплазію щитовидної залози (в тому числі захворювання Граве), трансплантацію рогівки та інших тканин, хронічні запалення, легеневі запалення, нефротичний синдром, прееклампсію, асцит, ексудативний перикардит (як-то пов'язаний з перикардитом), та плевральний випіт). Відповідно, ця заявка стосується способів лікування будь-яких вищевказаних захворювань у пацієнта, який цього потребує, що полягають у: введенні пацієнту анти-vegf антитіл винаходу, де, вибірково, вказане введення повторюють, наприклад, через одну добу, дві доби, три доби, п'ять днів, один тиждень, два тижня, три тижні, один місяць, п'ять тижнів, шість тижнів, сім тижнів, вісім тижнів, два місяці або через три місяці. Повторне введення може бути з тою саме або з іншою дозою. Введення може бути повторено один раз, два, три рази, чотири рази, п'ять разів, шість разів, сім разів, вісім разів, дев'ять разів, десять разів та більше. Наприклад, відповідно до певних схем дозування, пацієнт отримує анти-vegf терапію на подовжений період часу, наприклад, на 6 місяців, 1 рік, або більше. Кількість анти-vegf антитіла, що вводять пацієнту у певних втіленнях дорівнює терапевтично ефективній кількості. Як тут застосовано, “ терапевтично ефективна ” кількість VEGF антитіла може бути введена у вигляді одиничної дози або протягом курсу терапевтичної схеми лікування, наприклад, протягом тижневого, двох -, трьохтижневого курсу, протягом місяця, трьох, шести місяців, протягом року або ще довше. Стандартні терапевтичні схеми лікування описані у розділі нижче. Відповідно до заявленого винаходу, лікування захворювання охоплює лікування пацієнтів, яким вже поставлено діагноз, що мають будь-яку форму захворювання у будь-якій клінічній стадії або у будь-якому прояві; затримку початку або еволюції або загострення або погіршення симптомів або ознаків захворювання; та/або попередження та/або зниження тяжкості захворювання. “ Суб'єкт ” або “ пацієнт ”, до якого вводять анти-vegf антитіло винаходу переважно є ссавцем, як-то не-приматом (наприклад, корови, свині, коні, кішки, собаки, щури тощо.) або приматом (наприклад, мавпою або людиною). У певних втіленнях, суб'єкт або пацієнт є людиною. У деяких аспектах, людина є педіатричним пацієнтом. У інших аспектах, людина є дорослим пацієнтом. Передбачено композиції, що містять анти-vegf антитіло винаходу та, вибірково, один або декілька додаткових терапевтичних агентів, як-то комбінації терапевтичних агентів, описаних у розділі нижче. Композиції, як правило, будуть постачатися у вигляді частини стерильної, фармацевтичної композиції, що звичайно буде містити фармацевтично прийнятний носій. Ця композиція може бути у будь-якій прийнятній формі (у залежності від бажаного способу введення пацієнту). Анти-vegf антитіла винаходу можуть бути введені пацієнту різними шляхами, як-то перорально, трансдермально, підшкірно, інтраназально, внутрішньовенно, інтрацеребровентрикулярно, внутрішньом'язово, внутрішньоочно, місцево та інтратекально. Більш прийнятний шлях введення у будь-якому випадку буде залежати від окремого антитіла, суб'єкту, від природи та тяжкості захворювання та фізичного стану суб'єкта. Для лікування показань, крім захворювань сітківки, ефективна доза анти-vegf антитіла винаходу може бути у діапазоні 0.1-75 мг/кг на одиницю (наприклад, болюс) введення, багаторазовими введеннями або суцільним введенням, або до досягнення концентрації сироватки у 0.01-5000 мкг/мл на одиницю (наприклад, болюс) введення, з застосуванням багаторазовими введеннями або суцільним введенням, або у будь-якому ефективному діапазоні або значенні у ньому в залежності від стану, який лікують, шляху введення та віку, ваги та стану суб'єкта. У певних втіленнях, наприклад для лікування раку, кожна доза може бути у діапазоні 0.1-50 мг на кг маси тіла, наприклад, 3-25 мг на кг маси тіла. Антитіло може бути отримано у вигляді водного розчина та введено шляхом підшкірної ін'єкції. Для лікування захворювань сітківки (наприклад, вікової макулярної дегенерації (AMD), дозування відповідно призводить до концентрації введеного у око анти-vegf антитіла у водній рідині, що дорівнює 1-50 мкг/мл. Для лікування AMD, кожна доза може дорівнювати 0.1-1 мг, наприклад, 0.25-0.5 мг. Антитіло може бути отримано у вигляді водного розчину та введено шляхом інтравітреальної ін'єкції. Фармацевтичні композиції можуть бути зручно представлені у вигляді одиниць дозування, що містять попередньо визначену кількість анти-vegf антитіл винаходу на дозу. Така одиниця може містити, наприклад, але без обмеження, 0.1 мг - 5 г, наприклад, 1 мг - 1 г або 10-50 мг. Фармацевтично прийнятні носії для застосування у винаході можуть бути різноманітними по формі, залежачи, наприклад, від стану, що підлягає лікуванню або шляху введення. 21 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Терапевтичні препарати анти-vegf антитіл винаходу можуть бути отримані для зберігання у вигляді ліофілізованих препаратів або водних розчинів шляхом перемішування антитіл, що мають бажаний ступінь чистоти з вибірковими фармацевтично-прийнятними носіями, допоміжними речовинами або стабілізаторами, що звичайно застосовують у цій галузі (всі з яких зазначені тут як “ носії ”), як-то буферизуючими агентами, стабілізуючими агентами, консервантами, ізотонічними агентами, неіонними детергентами, антиоксидантами та іншими різними добавками. Див., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980). Такі добавки повинні бути нетоксичними для реципієнтів у застосованих дозуваннях та концентраціях. Буферні агенти допомагають підтримувати pH у діапазоні, що майже відповідає фізіологічному стану. Вони можуть бути у наявності з концентрацією у діапазоні 2 мM-50 мM. Прийнятні буферні агенти для застосування з заявленим винаходом охоплюють органічні та неорганічні кислоти та їх солі, як-то, цитратні буфери (наприклад, суміш цитрату мононатрію з цитратом динатрію, суміш лимонної кислоти з цитратом тринатрію, суміш лимонної кислоти з цитратом мононатрію, тощо.), сукцинатні буфери (наприклад, суміш бурштинової кислоти з сукцинатом мононатрію, суміш бурштинової кислоти з гідроксидом натрію, наприклад, суміш бурштинової кислоти з сукцинатом динатрію, тощо.), тартратні буфери (наприклад, суміш винної кислоти з тартратом натрію, суміш винної кислоти з тартратом калію, суміш винної кислоти з гідроксидом натрію, тощо.), фумаратні буфери (наприклад, суміш фумарової кислоти з фумаратом мононатрію, суміш фумарової кислоти з фумаратом динатрію, тощо.), глюконатні буфери (наприклад, суміш глюконової кислоти з глюконатом натрію, суміш глюконової кислоти з гідроксидом натрію, суміш глюконової кислоти з глюконатом калію, тощо.), оксалатні буфери (наприклад, суміш щавлевої кислоти з оксалатом натрію, суміш щавлевої кислоти з гідроксидом натрію, суміш щавлевої кислоти з оксалатом калію, тощо.), лактатні буфери (наприклад, суміш молочної кислоти з лактатом натрію, суміш молочної кислоти з гидроксидом натрію, суміш молочної кислоти з лактатом калію, тощо.) та ацетатні буфери (наприклад, суміш оцтової кислоти з ацетатом натрію, суміш оцтової кислоти з гідроксидом натрію, тощо.). Додатково можуть бути застосовані фосфатні буфери, гістидинові буфери та триметиламінові солі, як-то Tris. Консерванти можуть бути додані для уповільнення мікробного росту у кількостях у діапазоні від 0.2 %-1 % (мас/обс). Прийнятні для застосування з заявленим винаходом консерванти охоплюють фенол, бензиловий спирт, мета- крезол, метилпарабен, пропілпарабен, октадецилметилбензил хлорид амонію, бензалконієві галогеніди (наприклад, хлорид, бромід та йодид), хлорил гексаметонію та алкілпарабени, як-то метил- або пропілпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, та 3-пентанол. Ізотонічні агенти, що іноді відомі як “ стабілізатори ” можуть бути додані для забезпечення ізотонічності рідкої композиції заявленого винаходу та охоплюють багатоатомні цукроспирти, наприклад, трьохатомні або вищі цукроспирти, як-то гліцерин, еритритол, арабітол, ксилітол, сорбітол та манітол. Стабілізатори відносяться до широкої категорії допоміжних речовин, функція яких може бути різною, від наповнювача до добавки для розчинення терапевтичного агента або для перешкоджання денатурації або прилипання до стінки контейнера. Типові стабілізатори можуть бути багатоатомними цукроспиртами (перераховані вище); амінокислотами, як-то аргініном, лізином, гліцином, глютаміном, аспарагіном, гістидином, аланіном, орнітином, L-лейцином, 2-фенілаланіном, глютаміновою кислотою, треоніном, тощо.,органічними цукрами або цукроспиртами, як-то лактоза, трегалоза, стахиоза, маніт, сорбіт, ксиліт, рибітол, міонізитол, галактитол, гліцерин тощо, в тому числі циклітолами, як-то інозитол; поліетиленгліколем; амінокислотними полімерами; сірковмісними відновниками, як-то сечовина, глютатіон, тіоктова кислота, тіоглюколат натрію, тіогліцерин, α-монотіогліцерин та тіосульфат натрію; поліпептидами з низькою молекулярною масою (наприклад, пептиди у 10 залишків або менше); білками, як-то сиворотковий альбумін людини, бичачий сиворотковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідролітичними полімерами, як-то полівінілпіролідон, моносахаридами, як-то ксилоза, маноза, фруктоза, глюкоза; дисахаридами, як-то лактоза, мальтоза, цукроза; трисахариди, як-то рафіноза; та полісахариди, як-то декстран. Стабілізатори можуть бути присутні у діапазоні 0.110,000 ваги на частину ваги активного білка. Також можуть бути додані неіонні поверхнево-активні речовини або детергенти (також відомі, як “ агенти змочування ”). Ці агенти додають для того, щоб допомогти розчинити терапевтичний агент а також для захисту терапевтичного білка проти індукованої перемішуванням агрегації. Крім того, вони дозволяють препарату піддаватися механічним подразненням його поверхні без виникання денатурації білка. Прийнятні неіонні поверхневоактивні речовини охоплюють полісорбати (20, 80, тощо.), поліоксамери (184, 188 тощо.), 22 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 плюронові поліоли, поліоксиетиленсорбітанові моноефіри (TWEEN®-20, TWEEN®-80, тощо.). Неіонні поверхнево-активні речовини можуть бути присутніми у діапазоні приблизно 0.051.0 мг/мл, наприклад, приблизно 0.07 мг/мл - 0.2 мг/мл. Додаткові різні допоміжні речовини охоплюють наповнювачі (наприклад, крохмаль), хелатуючі агенти (наприклад, EDTA), антиоксиданти (наприклад, аскорбінова кислота, метіонін, вітамін E), та співрозчинники. Також препарат може містити комбінацію терапевтичного агента на додаток до анти-vegf антитіла винаходу. Приклади прийнятних комбінацій терапевтичних агентів наведені у Розділі нижче. Схема дозування для підшкірного введення може змінюватися від щоденного прийому до одноразового у кожні шість місяців в залежності від кількості клінічних факторів, в тому числі від типу захворювання, тяжкості захворювання, та чутливості пацієнта до анти-vegf антитіла. Дозування анти-vegf антитіла винаходу, що має бути введеним буде змінюватися у відповідності до певного антитіла, типу захворювання (наприклад, рак, запалення, тощо.), від суб'єкта та тяжкості захворювання, від фізичного стану суб'єкта та терапевтичної схеми лікування (наприклад, від того, яку комбінацію терапевтичного агента застосовують), та від вибраного шляху введення; відповідне дозування може бути легко визначено фахівцем. Фахівцям буде зрозуміло, що оптимальна кількість та проміжки індивідуальних дозувань анти-vegf антитіл винаходу будуть визначені в залежності від характеру та ступеню стану, який лікують, форми, шляху та точки введення та від віку та стану окремого суб'єкту, якого лікують, та що в кінцевому рахунку визначати відповідні дози, що будуть застосовані, буде лікар. Це дозування може бути повторено стільки разів, скільки необхідно. Якщо виникають побічні дії, то кількість дози та/або частота дозування може бути змінена або зменшена, у відповідності з нормальною клінічною практикою. Нижче описані комбінаторні способи, у яких можуть бути застосовані анти-vegf антитіла винаходу. Комбінаторні способи винаходу полягають у введенні пацієнту щонайменш двох агентів, перший з яких є анти-vegf антитілом винаходу та другий з яких є комбінацією терапевтичного агента. Анти-vegf антитіло та комбінація терапевтичного агента можуть бути введені одночасно, послідовно або окремо. Способи комбінаторної терапії заявленого винаходу можуть привести до значно вищого ефекту, ніж адитивний, надаючи терапевтичні переваги там, де анти-vegf антитіло або комбінацію терапевтичного агента вводять у кількості, що є тільки терапевтично ефективною. У даних способах, анти-vegf антитіло винаходу та комбінація терапевтичного агента можуть бути введені одночасно, у комбінації, або послідовно. Як тут застосовано, вважається, що антиvegf антитіло винаходу та комбінацію терапевтичного агента вводять послідовно, якщо їх ввели пацієнту у той же день, наприклад, під час того ж візиту пацієнта. Послідовне введення може відбуватися з інтервалом у 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 годин. На відміну, вважається, що анти-vegf антитіло винаходу та комбінацію терапевтичного агента вводять по окремості, якщо їх вводять пацієнту у різні дні, наприклад, анти-vegf антитіло винаходу та комбінація терапевтичного агента може бути введена з інтервалами у одну, дві, три доби, один або два тижні, або з інтервалом у місяць. У способах заявленого винаходу, введення анти-vegf антитіла винаходу може передувати або слідувати за введенням комбінації терапевтичного агента. У якості необмеженого прикладу, анти-vegf антитіло винаходу та комбінація терапевтичного агента можуть бути введені одночасно протягом певного періоду часу, за яким іде другий період часу, у якому чергується введення анти-vegf антитіла винаходу та комбінації терапевтичного агента. Зважаючи на потенційні синергетичні дії введення анти-vegf антитіла винаходу та комбінації терапевтичного агента, такі агенти можуть бути введені у таких кількостях, що, якщо один або обидва агенти вводять по окремості, вони(він) не будуть терапевтично ефективними. У деяких аспектах, комбінація терапевтичного агента являє собою анти-ангіогенний агент, анти-ревматичні ліки, анти-запальний агент, хемотерапевтичний агент, радіотерапевтичний, імуносупресивний агент або цитотоксичні ліки. Передбачено, що при застосуванні для лікування різних захворювань, анти-vegf антитіла винаходу зможуть бути комбіновані з іншими терапевтичними агентами, прийнятними для тих же само або подібних захворювань. При застосуванні для лікування раку, антитіла заявленого винаходу можуть бути застосовані у комбінації зі звичайними методами лікування раку, як-то хірургією, радіо - та хіміотерапією або їх комбінаціями. У деяких інших аспектах, інші терапевтичні агенти, корисні для комбінації пухлинної терапії з антитілом винаходу охоплюють антагоністи, наприклад, антитіла. інших факторів, що беруть участь у рості пухлин, як-то EGFR, ErbB2 (також відомий, як Her2), ErbB3, ErbB4, або TNF-α. 23 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Іноді, для лікування захворювань на рак та імунних захворювань, може бути корисним введення пацієнту одного або декількох цитокінів. У бажаному втіленні, антитіло VEGF вводять разом з агентом інгібування росту. Прийнятними дозуваннями для агента інгібування росту є ті, що застосовуються в даний час та можуть бути знижені завдяки комбінованій дії (синергії) агента інгібування росту та анти-vegf антитіла. Для лікування захворювань на рак, імунних захворювань та захворювань сітківки, відповідно можуть бути застосовані анти-запальні агенти у комбінації з анти-vegf антитілами винаходу. Анти-запальні агенти містять, але без обмеження, ацетамінофен, димедрол, меперидин, дексаметазон, пентазу, месалазин, асакол, кодеїну фосфат, бенорилат, фенбуфен, парацетамол, диклофенак, етодолак, індометацин, аспірин та ібупрофен. Для лікування захворювань на рак, у комбінації з анти-vegf антитілами винаходу можуть відповідно бути застосовані хіміотерапевтичні агенти. Хіміотерапевтичні агенти охоплюють, але без обмеження, радіоактивні молекули, токсини, що також відомі, як цитотоксини або цитотоксичні агенти, що охоплюють будь-які агенти, що негативно впливають на життєздатність клітин, агенти, ліпосоми або інші везикули, що містять хіміотерапевтичні суміші. Приклади прийнятних хіміотерапевтичних агентів охоплюють, але без обмеження, 1- дигідротестостерон, 5-фторурацил, дакарбазин, 6-меркаптопурин, 6- тіогуанін, актиноміцин D, адріаміцин, алдеслейкин, анти-α5β1 інтегринове антитіло, агенти алкілування, алопуринол натрію, алтретамін, аміфостин, анастрозол, антраміцин (АМС)) анти-мітотичні агенти, цисдихлородіаміно платину (II) (DDP) цисплатин, діамо дихлоро платину, антрацикліни, антибіотики, антиметаболіти, аспарагіназу, живі BCG (інтравезикально), бетаметазон натрій фосфат та бетаметазон ацетат, бікалутамід, блеоміцину сульфат, бусульфан, лейковорин кальцію, каліхеаміцин, капецитабін, карбоплатин, ломустин (CCNU), кармустин (BSNU), хлорамбуцил, цисплатин, кладрибін, колхіцин, кон'юговані естрогени, циклофосфамід, цитарабін, цитохалазин Б, цитоксан, дакарбазин, дактиноміцин (стара назва актиноміцин), даунірубіцину HCL, даунірубіцину цитрат, деніелейкін дифтитокс, декстразоксан, дибромоманітол, дигідрокси антрацин діон, доцетаксел, доластерону мезилат, доксорубіцину HCL, дронабінол, E. coli L-аспарагіназу, еолоциксимаб, еметин, епоетин - альфа, Erwinia L аспарагіназу, етерифіковані естрогени, естрадіол, естрамустину фосфат натрію, бромистий етидій, етиніл естрадіол, етідронат, етопозид-фолинова кислота, етопозиду фосфат, філграстим, флоксуридин, флуконазол, флударабінфосфат, фторурацил, флутамід, фолієву кислоту, гемцитабин HCL, глюкокортикоїди, гозереліну ацетат, граміцидин D, гранісетрон HCL, гідроксімочевіну, ідарубіцин HCL, іфосфамід, інтерферон α-2b, іринотекан HCL, летрозол, лейковорин кальцію, лейпроліду ацетат, левамізол HCL, лідокаїн, ломустін, маїтанзиноїд, мехлоретамін HCL, медроксипрогестерону ацетат, мегестролу ацетат, мелфалан HCL, меркаптопурин, месну, метотрексат, метилтестостерон, мітраміцин, мітоміцин С, мітотан, мітоксантрон, нілутамід, октреотиду ацетат, тондансетрон HCL, паклітаксел, памідронат динатрію, пентостатин, пілокарпін HCl, плиміцин, поліферосан 20 з кармустиновим імплантом, порфімер натрію, новокаїн, прокарбазин HCl, пропранолол, ритуксимаб, сарграмостим, стрептозотоцин, тамоксифен, таксол, теніпозід, тенопозид, тестолактон, тетракаїн, тіоепа хлорамбуцил, тіогуанін, тіотепа, топотекан HCL, тореміфену цитрат, трастузумаб, третиноїн, валрубіцин, вінбластину сульфат, вінкристину сульфат, та вінорельбіну тартрат. Будь-який анти-ангіогенний агент може бути застосований у поєднанні з анти-vegf антитілами винаходу, в тому числі, ті, що перелічені у Carmeliet та Jain, 2000, Nature 407:249257. У певних втіленнях, анти-ангіогенний агент є іншим антагоністом VEGF або рецептором антагоніста VEGF, як-то варіанти VEGF, розчинні рецепторні фрагменти VEGF, аптамери, що здатні блокувати VEGF або VEGFR, нейтралізуючі анти-VEGFR антитіла, низькомолекулярні інгібітори тирозинкіназ VEGFR та будь-які їх комбінації. Альтернативно або додатково, пацієнту може бути спів-введено два або більше анти-vegf антитіл. У деяких втіленнях, може бути застосована гормональна терапія у поєднанні з анти-vegf антитілами винаходу. У деяких втіленнях, гормональна терапія полягає у застосуванні одного або декількох агентів, що інгібують естроген та/або прогестерон від сприяння зростанню ракових клітин, наприклад, селективний модулятор естроген-рецептора, як-то тамоксифен, інгібітор ароматази, як-то анастрозоль (Arimidex®) або летрозоль (Femara), інактиватор ароматази, як-то екземестан (Aromasin®), або агент, що інгібує продукування естрогену, як-то госерелин (Zoladex). У інших втіленнях, гормональна терапія охоплює один або декілька агентів, що інгібують продукування яєчниками гормонів. У деяких аспектах, анти-vegf антитіло може бути застосовано у поєднанні з маленькою білковою молекулою інгібітору тирозинкінази (PTK). У деяких втіленнях, PTK інгібітор є 24 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 специфічним для VEGF рецептора тирозинкінази. у інших втіленнях, PTK інгібітор зв'язується з більш ніж одним з родини VEGF рецепторів тирозинкіназ (наприклад, VEGFR-1, VEGFR-2). У інших втіленнях, білкові інгібітори тирозинкінази є корисними у композиціях та способах винаходу, що містять інгібітори PTK, які не здатні селективне зв'язуватися з родиною VEGF рецепторів тирозинкіназ, але зв'язуються з доменами тирозинкінази інших родин білків, як-то HER2, HER3, HER4, PDGFR, та/або Raf. У деяких втіленнях, тирозинкіназа є рецептором тирозинкінази, тобто, є внутрішньоклітинним доменом великого білка, що має зовнішньоклітинний ліганд - зв'язуючий домен та активується зв'язуванням одного або декількох лігандів. У певних втіленнях, білок тирозинкінази не є рецептором тирозинкінази. PTK інгібітори для застосування у способах заявленого винаходу охоплюють, але без обмеження, гетфітніб (ZD-1839, Iressa®), ерлотиніб (OSI-1774, Tarceva™), канертиніб (CI-1033), вандетаніб (ZD6474, Zactima®), тирфостин AG-825 (CAS 149092-50-2), лапатиніб (GW-572016), сорафеніб (BAY43-9006), AG-494 (CAS 133550-353), RG-13022 (CAS 149286-90-8), RG-14620 (CAS 136831-49-7), BIBW 2992 (Tovok), тирфостин 9 (CAS 136831-49-7), тирфостин 23 (CAS 118409-57-7), тирфостин 25 (CAS 118409-58-8), тирфостин 46 (CAS 122520-85-8), тирфостин 47 (CAS 122520-86-9), тирфостин 53 (CAS 12252090-5), бутеїн (1-(2,4-дигідроксифеніл)-3-(3,4-дигідроксифеніл)-2-пропен-1-один 2′,3,4,4′-тетрагідроксихалкон; CAS 487-52-5), циркумін ((E, E)-1,7-біс(4-гідрокси-3метоксифеніл)-1,6-гептадіен-3,5-діон; CAS 458-37-7), N4-(1-бензил-1H-індазол-5-іл)-N6,N6диметил-піридо[3,4-d]піримідин-4,6-діамін (202272-68-2), AG-1478, AG-879, циклопропанкарбонова кислота -(3-(6-(3-трифлуорометил-феніламіно)-піримідин-4-іламіно)феніл)-амід (CAS 879127-07-8), N8-(3-хлоро-4-флуорофеніл)-N2-(1-метилпіперидин-4-іл)піримідо[5,4-d]піримідин-2,8-діамін, 2HCl (CAS 196612-93-8), 4-(4-бензилоксіаніліно)-6,7диметоксиxіназолін (CAS 179248-61-4), N-(4-((3-хлоро-4-флуорофеніл)аміно)піридо[3,4d]піримідин-6-іл)2-бутинамід (CAS 881001-19-0), EKB-569, HKI-272, та HKI-357. У певному втіленні, анти-vegf антитіло винаходу застосовують у комбінації з внутрішньовенною хіміотерапією на основі 5-флуороурацилу. Ця комбінація є прийнятною для, зокрема, терапії першої або другої лінії пацієнтів з метастатичною карциномою прямої або товстої кишки. У іншому певному втіленні, анти-vegf антитіло винаходу застосовують у комбінації з карбоплатином та паклітакселем. Ця комбінація є прийнятною для, зокрема, терапії першої лінії пацієнтів з неоперабельним, місцево-поширеним, рецидивним або метастатичним неплоскоклітинним, не-дрібноклітинним раком легенів. У іншому певному втіленні, анти-vegf антитіло винаходу застосовують у комбінації з паклітакселем. Ця комбінація є прийнятною для, зокрема, лікування пацієнтів, які не отримали хіміотерапії для метастатичного HER2-негативного раку молочної залози. Для лікування захворювань сітківки, анти-vegf антитіла винаходу можуть бути застосовані у комбінації з E10030, пегільованим аптамером анти-тромбоцитарного фактора росту (PDGF); з ARC1905, пегільованим аптамером, що поцілює компонент C5 комплементарного каскаду; та з Волоциксимаб, моноклональним антитілом, що поцілює α5β1 інтегриновий трансмембранний рецептор; з фотодинамічною терапією з Visudyne® (PDT); або Macugen®, аптамером (пегаптаніб натрію). Ця заявка стосується терапевтичних схем лікування, що містять введення анти-vegf антитіл винаходу. Терапевтичні схеми лікування будуть змінюватися в залежності від віку та ваги пацієнта та стану захворювання. Терапевтична схема лікування може тривати від двох тижнів до невизначеного часу. У певних втіленнях, терапевтична схема лікування триває від двох тижнів до 6 місяців, від 3 місяців до 5 років, від 6 місяців до 1 або до 2 років, від 8 місяців до 18 місяців, тощо. Терапевтична схема лікування може бути з незмінною або з багаторазовозмінною схемою дозування. Для дозування у стандартних схемах лікування, описаних нижче, анти-vegf антитіло може бути введено у вигляді стерильного, вільного від консервантів розчину для підшкірного введення. Для лікування метастатичного колоректального раку, анти-vegf антитіло винаходу вводять внутрішньовенно з дозою 0.5-15 мг/кг кожні два тижня з болюс-IFL (схеми лікування іринотесканом, 5-флуоурацилом та лейковорином). У певних втіленнях, доза дорівнює 1-4 мг/кг, 2-6 мг/кг, 0.5-3 мг/кг, 1-10 мг/кг, 3-4.8 мг/кг або 1-4.5 мг/кг кожні два тижні з болюс - IFL. У іншому втіленні, для лікування метастатичного колоректального раку, анти-vegf антитіло винаходу вводять внутрішньовенно з дозою 1-30 мг/кг кожні два тижня з FOLFOX4 (схеми лікування оксаліплатином, лейковорином та флуоурацилом). У певних втіленнях, доза дорівнює 2-9 мг/кг, 3-12 мг/кг, 1-7.5 мг/кг, 2-20 мг/кг, 6-9.75 мг/кг або 4-9.5 мг/кг кожні два тижні з FOLFOX4. 25 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для лікування неплоскоклітинного недрібноклітинного раку легенів, анти-vegf антитіло винаходу вводять внутрішньовенно з дозою 2-40 мг/кг кожні три тижні з карбоплатином/паклітакселем. У певних втіленнях, доза дорівнює 5-14 мг/кг, 4-20 мг/кг, 1017.5 мг/кг, 7-14 мг/кг, 10-30 мг/кг або 3-30 мг/кг кожні три тижня з карбоплатином/паклітакселем. Для лікування метастатичного раку молочної залози, анти-vegf антитіло винаходу вводять внутрішньовенно з дозою 0.5-20 мг/кг кожні два тижня з паклітакселем. У певних втіленнях, доза дорівнює 1-4 мг/кг, 2-6 мг/кг, 0.5-3 мг/кг, 1-10 мг/кг, 3-4.8 мг/кг або 1-4.5 мг/кг кожні два тижня з паклітакселем. Для лікування метастатичного раку молочної залози, анти-vegf антитіло винаходу вводять внутрішньовенно з дозою 0.5-20 мг/кг кожні два тижня у вигляді монотерапії. У певних втіленнях, доза дорівнює 1-4 мг/кг, 2-6 мг/кг, 0.5-3 мг/кг, 1-10 мг/кг, 3-4.8 мг/кг або 1-4.5 мг/кг кожні два тижня у вигляді монотерапії. Для лікування вікової макулярної дегенерації (AMD), анти-vegf антитіло винаходу вводять з дозою 0.1-1 мг інтравітреальною ін'єкцією раз у місяць (приблизно 28 діб). У певних втіленнях, доза (інтравітреальною ін'єкцією раз у місяць (приблизно 28 діб) дорівнює 0.1-0.4 мг, 0.2-0.6 мг, 0.1-0.25 мг, 0.25-0.5 мг, 0.25-0.75 мг, або 0.3-0.45 мг. У певному втіленні, пацієнт, якого лікують анти-vegf антитілом винаходу, має мокрий AMD. У іншому специфічному втіленні, пацієнт має сухий AMD. Заявлений винахід стосується фармацевтичних наборів, що містять анти-vegf антитіла (в тому числі кон'югати антитіл) винаходу. Фармацевтичний набор являє собою пакування, що містить анти-vegf антитіла винаходу (наприклад, або у ліофілізованій формі, або у вигляді водного розчину) та одне або декілька з наступного: - Комбінацію терапевтичного агента, наприклад, як описано у розділі вище; - Пристрій для введення анти-vegf антитіла, наприклад, шприц-ручка, голка та/або шприц; та - Фармацевтично прийнятну воду або буфер для ресуспендування антитіла, якщо антитіло є у ліофілізованій формі. У деяких аспектах, кожна одинична доза анти-vegf антитіла пакується по окремості та набор може містити одну або декілька одиничних доз (наприклад, дві, три, чотири, п'ять, вісім, десять або більше одиничних доз). У певному втіленні, одна або декілька одиничних доз розміщена по окремості у шприц або шприц-ручку. Також цій винахід стосується діагностичних наборів, що містять анти-vegf антитіла (в тому числі кон'югати антитіл) винаходу. Діагностичний набор являє собою пакування, що містить анти-vegf антитіло винаходу (наприклад, або у ліофілізованій формі, або у вигляді водного розчину) та один або декілька реагентів, корисних для проведення діагностичного аналізу. Коли анти-vegf антитіло є міченим з ферментом, набор може містити необхідні для ферменту субстрати та спів-фактори (наприклад, субстрат-попередник, що надає здатний до виявлення хромофор або флуорофор). Додатково, набор може містити інші добавки, як-то стабілізатори, буфери (наприклад, блокуючий буфер або буфер лізису), тощо. У певних втіленнях, анти-vegf антитіло, розміщене у діагностичному наборі, імобілізовано на твердій поверхні, або тверда поверхня (наприклад, скло) на яку антитіло може бути імобілізовано, входить у набор. Відносні кількості різних реагентів можуть бути істотно змінені для забезпечення в розчині концентрацій реагентів, що значно оптимізують чутливість аналізу. У певному втіленні, антитіло та один або декілька реагентів можуть бути надані (по окремості або комбіновано) у вигляді сухих порошків, звичайно ліофілізованих, в тому числі допоміжні речовини, які при розчиненні будуть надавати відповідну концентрацію розчину реагенту. Приклад 1. Ідентифікація Т-клітинних епітопів Бевацизумаб. Пептиди синтезували з застосуванням багатоконтактного формату від Mimotopes (Adelaide, Australia). Послідовності V регіонів легкого та важкого ланцюга Бевацизумаб синтезували у вигляді 15-мерних пептидів, що перекриваються дванадцятьма амінокислотами (Таблиці 3 та 4) в цілому на 69 пептидів. Пептиди отримали у ліофілізованому стані та ресуспендували у DMSO (Sigma-Aldrich) з концентрацією приблизно 1-2 мг/мл. Запас пептидів зберігали у замороженому стані при –20ºC. Донорську лейкоцитарну плівку отримали від Stanford Blood Center, Palo Alto, CA. Матеріал лейкоцитарної плівки розвели 1:1 обс:обс з DPBS, що не містив кальцію або магнію. Розведений матеріал лейкоцитарної плівки (25-35 мл) розмістили (як нижній шар) у 50 мл конічні туби для центрифугування (Sarsted або Costar) з 12.5 мл FicollPaque-PLUS (GE Healthcare). Зразки центрифугували при 900 g протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC) відібрали з поверхні розділу. DPBS додали до кінцевого обсягу у 50 мл та клітини центрифугували при 350 g протягом 5 хвилин. Гранульовані клітини 26 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ресуспендували у DPBS та перелічили. 8 Для виділення дендритних клітин, культуральні флакони T75 (Costar) засіяли 10 свіжовиділених PBMC у загальному обсязі 30 мл середовища AIM V (Invitrogen). Надлишок PBMC заморозили при –80ºC у 90 % телячій ембріональній сироватці (FCS), 10 % DMSO 7 (5 × 10 клітин /мл). Флакони T75 інкубували при 37ºC у 5 % CO2 протягом двох годин. Неприкріплені клітини видалили та прикріплений моношар промили DPBS. Для відрізнення дендритних клітин від моноцитів, додали 30 мл середовища AIM V, що містило 800 одиниць/мл GM-CSF (R and D Systems) та 500 одиниць/мл IL-4 (R and D Systems). Флакони інкубували протягом 5 днів. На 5 добу додали IL-1α (Endogen) та TNFα (Endogen) до 50 пг/мл та 0.2 нг/мл. Флакони інкубували більше двох днів. На 7 добу, дендритні клітини зібрали додаванням 3 мл 100 мМ EDTA, що містив 0.5-1.0 мг мітоміцину C (Sigma-Aldrich) до кінцевої концентрації у 10 мМ EDTA та 16.5-33 мкг/мл мітоміцину C. Флакони інкубували додатково одну годину при 37ºC та 5 % CO2. Дендритні клітини зібрали та промили 2-3 рази у середовищі AIM V. На 7 добу, попередньо заморожені автологічні PBMC піддали швидкому таненню на водяній бані при 37ºC. Клітини негайно розвели у DPBS або у середовищі AIM V та центрифугували при + 350g протягом 5 хвилин. CD4 клітини збагатили шляхом негативного відбору з застосуванням + + магнітних кульок (Easy-Sep CD4 kit, Stem Cell Technologies). Автологічні CD4 T клітини та 5 + 4 дендритні клітини співкультурували з кількістю 2 × 10 CD4 T клітин на 2 × 10 дендритних клітин на лунку у 96-лункових планшетах з круглим дном (Costar 9077). Пептиди додали до концентрації приблизно 5 мкг/мл. Контрольні лунки містили тільки 0.25 % DMSO (Sigma) за обсягом. Позитивні контрольні лунки містили 0.25 % DMSO та 1 мкг/мл токсину правця (List Biologicals або CalBioChem). Культури інкубували протягом 5 днів. На 5 добу, додали по 0.25 мкКі на лунку міченого тритієм тимідину (Amersham або GE Healthcare). На 6 добу культури зібрали з застосуванням збирача Packard Filtermate Cell. Підрахунок сцинтиляції проводили за допомогою сцинтиляційного лічильника Wallac MicroBeta 1450 (Perkin Elmer). Середні значення оточення CPM обчислили з застосуванням усереднення індивідуальних результатів від 6 до 12 подвійних значень. Значення CPM чотирьох позитивних контрольних лунок усереднили. Подвійні або потрійні лунки для кожного пептиду також усереднили. Значення індексу стимулювання для позитивного контролю та пептидних лунок обчислили діленням середнього експериментального значення CPM на середні контрольні значення. Для включення в набір даних було також необхідно додати індекс стимулювання, вищий ніж 3.0 позитивного контролю (анатоксин правця). Відмічено відповідь для будь-якого пептиду, що призвела до індексу стимулювання у 2.95 або вище. Пептиди перевірили застосуванням зразків периферичної крові від групи з 99 донорів. Відповіді до всіх пептидів скомпілювали. Для кожного перевіреного пептиду обчислили відсоток донорних результатів, що відповідав індексу стимулювання у 2.95 або вище. Додатково, також обчислили середній індекс стимулювання для всіх донорів. + Епітопні пептиди CD4 T клітин ідентифікували за допомогою аналізу відсотка відповідей до пептидів в межах набору з 99 донорів. Середній відсоток відповіді та стандартну похибку обчислили для всіх перевірених пептидів, описуючи V регіони важкого та легкого ланцюгів Бевацизумаб. Розмір відповіді, вищий за фонову відповідь або такий, що дорівнював середній + фоновій відповіді плюс три стандартні відхилення вважався потенційним епітопом CD4 T клітин. Для V регіону легкого ланцюга Бевацизумаб було перевірено 32 пептиду (Таблиця 3) з відсотковим результатом середньої фонової відповіді у 2.1+2.7 %. Три стандартних відхилення вище фону сягали 10.2 %. Один пептид у позиції 13 (Q40-T54) показав цей рівень відповіді у базі даних пептидів легкого ланцюга Бевацизумаб, з розміром відповіді у 15.2 % (Фіг. 2A). Для V регіону важкого ланцюга Бевацизумаб було перевірено 37 пептидів (Таблиця 4) з відсотковим результатом середньої фонової відповіді у 2.8+3.1. Три стандартних відхилення вище фону сягали 12.1 %. Один пептид в межах бази даних важкого ланцюга Бевацизумаб, #18 (N52-R56), показав відсоток відповіді у 16.2 % (Фіг. 3A). Другий пептид у позиції #30 бази даних важкого ланцюга показав рівень відповіді у 9.1 % та вважався епітопом завдяки підвищеному індексу стимулювання (див. нижче). Середній індекс стимулювання було обчислено для всіх пептидів у базі даних. Пептид 13 легкого ланцюга мав високий середній індекс стимулювання у 1.82+0.24 s.e.m. (Фіг. 2B). Пептид #18 важкого ланцюга мав значення середнього індексу стимулювання у 2.16+0.35 s.e.m. (Фіг. 3B). Пептид у позиції #30 повернувся до середнього індексу стимулювання у 1.45+0.18 s.e.m. (Фіг. 3B) через підвищений середній індекс стимулювання та рівень відповіді вище середнього. + Пептид у позиції #30 був включений при визначенні CD4 T клітинного епітопного змісту V регіону цього антитіла. Всі ці значення індексу стимулювання були значно вищими, ніж середній індекс стимулювання для всіх пептидів у двох базах даних (1.14+0.07 для всіх 69 пептидів 27 UA 104626 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 важкого та легкого ланцюга). Ці дані свідчать, що існують три CD4+T клітинних епітопних регіона у V регіоні Бевацизумаб (Таблиця 5). У VL регіоні, епітоп знайдено у пептидній позиції 13, що охоплює каркас 2 та дві амінокислоти від CDR2. Послідовність містить мишачу зворотню мутацію, (V46) вставлену у послідовність під час гуманізації. У Таблиці 5 підкреслено амінокислоти, що походять від CDR. У важкому ланцюзі було ідентифіковано два епітопних пептидних регіону. Сильніший епітоп у позиції #18 охоплює всі CDR2. Другий епітопний пептидний регіон охоплює каркас 3 та амінокислоти CDR3. Бевацизумаб піддали мутаційному аналізу (Див. Приклад 2 нижче). На основі досліджень антиген-зв'язування, що проводили у поєднанні з мутаційним аналізом, було визначено, що набір вірогідних амінокислотних заміщень в межах регіону CDR-H2 та CDR-H3 не в змозі значно зменшити афінність антитіла до VEGF (Таблиця 6). Ці амінокислотні заміщення перевірили окремо та у комбінації для визначення варіантів Бевацизумаб зі зменшеною імуногенністю порівняно з антитілом дикого типу. Приклад 2. Ідентифікація варіантів Бевацизумаб з підвищеною афінністю до VEGF. Антитіло Бевацизумаб піддали всебічному мутаційному аналізу для ідентифікації мутантів, що мали підвищену афінність до VEGF порівняно з Бевацизумаб. Підвищена афінність вірогідних високоафінних до VEGF мутантів порівняно з Бевацизумаб аналізували на BIAcore для підтвердження їх зв'язуючих характеристик. 15 констрактів варіантного VH регіону Бевацизумаб клонували разом з немодифікованим VL регіоном у IgG1- людини, що містили плазміду, здатну до експресії шляхом тимчасової трансфекції у клітинних лініях 293T/17 та антитіла очистили афінністю білка А або білка G. Афінність антитіла до VEGF (R&D systems, Minneapolis, MN) визначили з застосуванням системи поверхневого плазмонного резонансу BIAcore 2000 та 3000 (BIAcore, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Поліклональне анти-людинне Fc антитіло кози (Jackson Immunoresearch) спочатку імобілізували до біосенсорної поверхні шляхом застосування стандартних амінозв'язуючих реагентів BIAcore (N-етил-N'-диметиламіно-пропілкарбодиімід, EDC; Nгідроксисукцинімід, NHS; та етанол амін HCl, pH 8.5), з подальшим захопленням анти-vegf антитіл (Бевацизумаб та варіанти Бевацизумаб) на паралельні поверхні з низькою швидкістю потоку у 5 мкл/хв. RL був на низькому рівні для мінімізації авидності через димерну природу VEGF. Негативним контролем була референтна поверхня без захоплених антитіл. Далі VEGF ввели до всіх потоків клітин зі швидкістю потоку у 50 мкл/хв. протягом двох хвилин для моніторингу асоціації, після чого досліджували фазу дисоціації з застосуванням 25-хвилинного протоку рухливого буферу HBS-P (10 мM HEPES, 150 мM хлориду натрію, 0.005 % P-20, pH 7.4). На кожному циклі VEGF у 6 різних концентраціях у діапазоні 0 нМ - 512нМ чотириразовими збільшеннями наносили на поверхню. Поверхню регенерували з 1.5 % H3PO4 з швидкістю потоку у 100 мкл/хв двома короткими імпульсами у кінці кожного циклу. Дані зв'язування підібрали до 1:1 моделі Лангмюра для отримання постійних зв'язування від програмного забезпечення BIAevaluate. У кожному аналізі було застосовано подвійне посилання для усунення фонових відповідей від референсної поверхні та від самого буферу у якості контролю. Всі кінетичні дані зв'язування аналізували щонайменш трьома окремими визначеннями. Результати відображені у вигляді арифметичних чисел та у вигляді – кратного поліпшення відносно дикого типу. Майже всі перелічені варіанти мають покращені розміри асоціації (k on) та дисоціації (koff) порівняно з Бевацизумаб або з диким типом (Таблиця 7). Кінцеві значення афінності для варіантів були порядку 0.1 нМ та сягали 0.08 нМ для варіанта, що відповідає SEQID NO:82. Ці значення відрізнялися від Бевацизумаб, що мав виміряну у цих дослідженнях афінність у 1.9 нМ. Таблиці 8 та 9 показує додаткові важколанцюгові варіанти, що, як показали попередні дослідження зв'язування, мають більш високу афінність до VEGF, ніж Бевацизумаб (дані не представлені). У Таблиці 10 наведені важколанцюгові варіанти, що, як показали попередні дослідження зв'язування, мають афінність до VEGF, подібну до Бевацизумаб (дані не представлені). У Таблиці 11 наведені легколанцюгові варіанти, що, як показали попередні дослідження зв'язування, мають афінність до VEGF, подібну до Бевацизумаб (дані не представлені). Приклад 3. Відбір деімунізованих варіантних пептидів. Були отримані варіантні пептиди (Таблиці 14–16), що відповідають імуногенним регіонам Бевацизумаб (див. Приклад 1). Варіантні пептиди відібрали на основі всебічного мутаційного аналізу, описаного у Прикладі 2, у якому ідентифіковані модифікації CDR практично не зменшують зв'язуючу афінність Бевацизумаб до VEGF. В загальній складності синтезували та перевірили 77 пептидів, спираючись на дослідження 28