Біспецифічне анти-vegf/анти-ang-2 антитіло

Реферат: Винахід стосується біспецифічного антитіла, яке специфічно зв'язується з фактором росту судинного ендотелію людини VEGF і ангіопоетином-2 людини (ANG-2). UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується біспецифічних антитіл проти фактора росту судинного ендотелію (human vascular endothelial growth factor – VEGF/VEGF-A) і проти ангіопоетину-2 людини (angiopoietin-2 – ANG-2), способів їх одержання, фармацевтичних композицій, що містять вказані антитіла, і їх застосування. Попередній рівень техніки Ангіогенез присутній у патогенезі різних захворювань, у тому числі солідних пухлин, внутрішньоочних неоваскулярних синдромів, наприклад, проліферативних ретинопатій або старечої дегенерації сітківки (СДС), ревматоїдного артриту й псоріазу (Folkman J. і ін., J. Biol. Chem. 267, 1992, стор. 10931-10934; Klagsbrun M. і ін., Annu. Rev. Physiol. 53, 1991, стор. 217239; і Garner A. у кн.: "Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach", 1994, під ред. Garner A. і Klintworth G.K., 2-е вид., вид-во Marcel Dekker, Нью-Йорк, стор. 1625-1710). При солідних пухлинах неоваскуляризація забезпечує пухлинним клітинам перевагу в рості й незалежній проліферації в порівнянні з нормальними клітинами. Таким чином, спостерігають кореляцію між щільністю мікросудин у зрізах пухлин і виживаністю пацієнта при раку грудей, а також у деяких інших пухлинах (Weidner N. І ін., N Engl J Med. 324, 1991, стор. 1-8; Horak E.R. і ін., Lancet 340, 1992, стор. 1120-1124; і Macchiarini P. І ін., Lancet 340, 1992, стор. 145-146). VEGF і анти-VEGF антитіла Фактор росту судинного ендотелію людини (Human vascular endothelial growth factor – VEGF/VEGF-A) (SEQ ID No: 105) описаний, наприклад, у роботах Leung D.W. і ін., Science 246, 1989, стор. 1306-1309; Keck P.J. і ін., Science 246, 1989, стор. 1309-1312; Connolly D.T. і ін., J. Biol. Chem. 264, 1989, стор. 20017-20024. VEGF бере участь у регуляції нормального й порушеного ангіогенезу й неоваскуляризації, зв'язаних з пухлинними й внутрішньоочними розладами (Ferrara N. і ін., Endocr. Rev. 18, 1997, стор. 4-25; Berkman R.A. і ін., J. Clin. Invest. 91, 1993, стор. 153-159; Brown L.F. і ін., Human Pathol. 26, 1995, стор. 86-91; Brown L.F. і ін., Cancer Res. 53, 1993, стор. 4727-4735; Mattern J. і ін., Brit. J. Cancer. 73, 1996, стор. 931-934; Dvorak H. і ін., Am. J. Pathol. 146, 1995, стор. 1029-1039). VEGF є гомодимерним глікопротеїном, який виділений з різних джерел. VEGF проявляє високоспецифічну мітогенну дію відносно клітин ендотелію. VEGF має важливі регуляторні функції при формуванні нових кровоносних судин протягом ембріонального утворення й розвитку судин і в процесі ангіогенезу протягом дорослого періоду життя (Carmeliet P. і ін., Nature, 380, 1996, стор. 435-439; Ferrara N. і ін., Nature, 380, 1996, стор. 439-442; огляд Ferrara і Davis-smyth, Endocrine Rev., 18, 1997, стор. 425). Значення дії VEGF показане в дослідженнях, які виявили, що інактивація одного алеля VEGF призводить до загибелі ембріона через недостатній розвиток судинної мережі (Carmeliet P. і ін., Nature, 380, 1996, стор. 435-439; Ferrara N. і ін., Nature, 380, 1996, стор. 439-442). Крім того, VEGF має сильну хемоатрактантну дією відносно моноцитів і може індукувати плазміногенний активатор і інгібітор плазміногенного активатора в клітинах ендотелію, а також може індукувати проникність мікросудин. Через вказану останню активністю VEGF іноді відносять до фактора проникності судин (vascular permeability factor – VPF). Виділення й властивості VEGF розглянуті в оглядах; див. Ferrara N. і ін., J. Cellular Biochem., 47, 1991, стор. 211-218, і Connolly J., Cellular Biochem., 47, 1991, стор. 219-223. В іншому варіанті сплайсинг іРНК одного гена VEGF дає до п'яти ізоформ VEGF. Анти-VEGF нейтралізуючі антитіла супресують ріст різних ліній пухлинних клітин людини в мишах (Kim I. і ін., Nature 362, 1993, стор. 841-844; Warren S.R. і ін., J. Clin. Invest., 95, 1995, стор. 1789-1797; Borgstrom P. і ін., Cancer Res. 56, 1996, стор. 4032-4039; Melnyk O. і ін., Cancer Res. 56, 1996, стор. 921-924). WO 94/10202, WO 98/45332, WO 2005/00900 і WO 00/35956 стосуються антитіл проти VEGF. Гуманізоване моноклональне антитіло бевацизумаб (яке продається під комерційною назвою продукту Аvastin®) є анти-VEGF антитілом, що застосовується при лікуванні пухлин (WO 98/45331). Ранібізумаб (комерційна назва продукту – Lucentis®) є фрагментом моноклонального антитіла, похідним від того ж вихідного антитіла миші, що й бевацизумаб (авастин). Його молекула набагато менше за вихідну молекулу й має спорідненість, достатню для забезпечення більш сильного зв'язування з VEGF-A (WO 98/45331). Цей продукт є анти-ангіогенним засобом, схваленим для лікування "вологого" типу вікової дегенерації жовтої плями (age-related macular degeneration – ARMD), звичайної форми вікової втрати зору. Іншим анти-VEGF антитілом є, наприклад, антитіло HuMab G6-31, описане, наприклад, в US 2007/0141065. ANG-2 і анти-ANG-2 антитіла Ангіопоетин-2 людини (Human angiopoietin-2 – ANG-2) (в іншому варіанті використовують абревіатуру ANGPT2 або ANG2) (SEQ ID No: 106) описаний у роботах Maisonpierre P.C. і ін., Science 277, 1997, стор. 55-60, і Cheung A.H. і ін., Genomics 48, 1998, стор. 389-391. Ангіопоетини-1 і -2 (ANG-1 (SEQ ID No: 107) і ANG-2 (SEQ ID No: 106)) були виявлені як ліганди 1 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для Tie – сімейства тирозинкіназ, які вибірково експресуються в ендотелії судин. Yancopoulos G.D. і ін., Nature 407, 2000, стор. 242-248. У цей час встановлено чотири безумовні представники сімейства ангіопоетину. Ангіопоетин-3 і -4 (Ang-3 і Ang-4) можуть представляти у високому ступені дивергентні аналоги того самого генного локусу в миші й людини. Kim I. і ін., FEBS Let, 443, 1999, стор. 353-56; Kim I. і ін., J Biol Chem 274, 1999, стор. 26523-26528. ANG-1 і ANG-2 спочатку були ідентифіковані в експериментах з культурами тканин як агоніст й антагоніст, відповідно (за ANG-1 див. Davis S. і ін., Cell 87, 1996, стор. 1161-1169; за ANG-2 див. Maisonpierre P.C. і ін., Science 277, 1997, стор. 55-60). Усі відомі ангіопоетини зв'язуються в основному з Tie2, і обидва, Ang-1 і -2, зв'язуються з Tie2 зі спорідненістю 3 нм (Kd). Maisonpierre P.C. і ін., Science 277, 1997, стор. 55-60. Установлене, що Ang-1 підтримує виживаність EC і стимулює цілісність ендотелію, Davis S. і ін., Cell 87, 1996, стор. 1161-1169; Kwak H.J. і ін., FEBS Lett 448, 1999, стор. 249-253; Suri C. і ін., Science 282, 1998, стор. 468-471; Thurston G. і ін., Science 286, 1999, стор. 251 1-14; Thurston G. і ін., Nat. Med. 6, 2000, стор. 460-463, незважаючи на те, що ANG-2 має протилежний ефект і стимулює дестабілізацію й регресію кровоносних судин при відсутності факторів виживання VEGF або основного фактора росту фібрділянкив. Maisonpierre P.C. і ін., Science 277, 1997, стор. 55-60. Однак у результаті багатьох досліджень функції ANG-2 був зроблений висновок про більш складну ситуацію. ANG-2 може бути складним регулятором ремоделювання судин, яке відіграє роль і в поширенні судин, і в регресії судин. Підтверджуючи такі ролі для ANG-2, дослідження експресії показало, що ANG-2 швидко індукується разом з VEGF у дорослих при поширенні судин при ангіогенезі, хоча ANG-2 індукується за відсутності VEGF при регресії судин. Holash J. і ін., Science 284, 1999, стор. 19941998; Holash J. і ін., Oncogene 18, 1999, стор. 5356-5362. Узгоджуючись із контекстно-залежною роллю, ANG-2 специфічно зв'язує з тим же специфічним для ендотелію рецептором, Tie-2, який активується Ang-1, але виявляє контекстно-залежні впливи на його активування. Maisonpierre P.C. і ін., Science 277, 1997, стор. 55-60. Дослідження ангіогенезу в рогівці показали, що й ANG-1, і ANG-2, мають подібні ефекти, діючи синергідно з VEGF з індукції росту нових кровоносних судин. Asahara T. і ін., Circ. Res. 83, 1998, стор. 233-240. Імовірність того, що ця дозо-залежна відповідь ендотелію, підвищується за рахунок спостереження, що полягає в тому, що in vitro при високій концентрації ANG-2 може також бути про-ангіогененним. Kim I. і ін., Oncogene 19, 2000, стор. 4549-4552. У високій концентрації ANG-2 діє як апоптозний фактор виживання для клітин ендотелію під час сироваткового деприваційного апоптозу через активування Tie2 через PI-3 кіназу й метаболічний шлях Akt. Kim I. і ін., Oncogene 19, 2000, стор. 4549-4552. Крім того, за результатами експериментів in vitro був зроблений висновок про те, що при тривалому впливі ефекти ANG-2 можуть поступово зсуватися від ефекту антагоніста до агоністу Tie2, і пізніше може безпосередньо брати участь у формуванні судинних трубок і стабілізації нових судин. Teichert-kuliszewska K. і ін., Cardiovasc. Res. 49, 2001, стор. 659-670. Крім того, якщо клітини ендотелію культивують на фібриновому гелі, також спостерігають активування Tie2 за рахунок ANG-2, що ймовірно означає, що дія ANG-2 може залежати від стану диференціації клітин ендотелію. Teichert-kuliszewska K. і ін., Cardiovasc. Res. 49, 2001, стор. 659670. У клітинах ендотелію мікросудин, культивованих у тривимірному гелі, ANG-2 також може індукувати активування Tie2 і формування структур типу капілярів. Mochizuki Y. і ін., J. Cell. Sci. 115, 2002, стор. 175-183. Застосування 3-d сферичного спільного культивування як моделі дозрівання судин in-vitro, показує, що прямий контакт між клітинами ендотелію й клітинами мезенхіми анулює здатність до реагування на VEGF, хоча наявність VEGF і ANG-2 індукує поширення судин. Korff T. і ін., Faseb J. 15, 2001, стор. 447-457. Etoh T.H. і ін. показали, що в клітин ендотелію, які конститутивно експресують Tie2, регуляція експресії MMP-1, -9 і u-pa сильно підвищується за рахунок ANG-2 у присутності VEGF. Etoh T. і ін., Cancer Res. 61, 2001, стор. 2145-2153. На моделі зіничної мембрани in vivo Lobov I.B. і ін. показали, що ANG-2 у присутності ендогенного VEGF індукує швидке підвищення діаметра капілярів, ремоделюючи базальну пластинку, проліферацію й міграцію клітин ендотелію й стимулює поширення нових кровоносних судин. Lobov I.B. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 2002, стор. 11205-11210. Напроти, ANG-2 індукує загибель клітин ендотелію й регресію судин без ендогенного VEGF. Lobov I.B. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 2002, стор. 11205-11210. Подібним образом на моделі пухлини in vivo Vajkoczy P. і ін. показали, що багатоклітинні агрегати ініціюють ріст судин шляхом ангіогенного поширення через одночасну експресію VEGFR-2 і ANG-2 ендотелієм хазяїна й пухлини. Vajkoczy P. і ін., J. Clin. Invest. 109, 2002, стор. 777-785. Ця модель показує, що мікроциркуляторна частина зростаючих пухлин, що закінчила початковий ріст, відрізняється безперервним ремоделюванням, ймовірно, опосередкованим експресією VEGF і ANG-2. Vajkoczy P. і ін., J Clin. Invest. 09, 2002, стор. 777-785. 2 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дослідження Tie-2 і ангіопоетину-1 на моделі нокаутних мишей показують подібні фенотипи й підтверджують, що фосфорилування Tie-2 після стимуляції ангіопоетином-1 опосередковує ремоделювання і стабілізацію формованих судин, стимулюючи повний розвиток кровоносних судин під час ангіогенезу й підтримку адгезії клітин, що підтримують клітини ендотелію (Dumont J. і ін., Genes & Development, 8, 1994, стор. 1897-1909; Sato T.N., Nature, 376, 1995, стор. 70-74; Thurston G. і ін., Nature Medicine, 6, 2000, стор. 460-463). Приблизно роль ангіопоетину-1 зберігається в дорослих, у яких він експресується в різних місцях і конститутивно (Hanahan D., Science, 277, 1997, стор. 48-50; Zagzag D. і ін., Exp Neurology, 159, 1999, стор. 391-400). Навпаки, експресія ангіопоетину-2 в основному обмежується сайтами судинного ремоделювання, у яких ангіопоетин-2 приблизно блокує конститутивну стабілізації або функцію дозрівання ангіопоетину-1, дозволяючи судинам ревертуватися і залишитися, пластичний стан яких може бути більшою мірою таким, що відповідають на сигнали, що поширюються (Hanahan D., 1997; Holash J. і ін., Orzcogerze 18, 199, стор. 5356-5362; Maisonpierre P.C., 1997). При експресії ангіопоетину-2 при патологічному ангіогенезі встановлено, що багато типів пухлин експресують ангіопоетин-2 (Maisonpierre P.C. і ін., Science 277, 1997, стор. 55-60). Функціональні дослідження показали, що ангіопоетин-2 залучений у пухлинний ангіогенез і встановили асоціацію понадекспресії ангіопоетину-2 з підвищеним ростом пухлин на моделі ксенотрансплантату в мишей (Ahmad S.A. і ін., Cancer Res., 61, 2001, стор. 1255-1259). В інших дослідженнях зв'язують понадекспресію ангіопоетину-2 з пухлинною гіперваскулярністю (Etoh T. і ін., Cancer Res. 61, 2001, стор. 2145-2153; Tanaka F. і ін., Cancer Res. 62, 2002, стор. 124-129). Останнім часом було запропоновано використовувати ангіопоетин-1, ангіопоетин-2 і/або Tie2 як можливі мішені у терапії пухлин. Наприклад, в US 6166185, US 5650490 і US 5814464 описані анти-Tie-2 ліганд і рецепторні антитіла. Дослідження із застосуванням розчинного Tie-2 були описані для зниження числа й розміру пухлин у гризунів (Lin, 1997; Lin, 1998). Siemeister G. і ін., Cancer Res. 59, 1999, стор. 3185-3191, одержали лінії клітин меланоми людини, які експресують позаклітинний домен від Tie-2, ввели їх ін'єкцією голим мишам і описали розчинний Tie-2 для одержання істотного пригнічення росту пухлини й пухлинного ангіогенезу. Обидва розглянуті разом агенти, ангіопоетин-1 і ангіопоетин-2, зв'язуються з Tie-2, і із цих досліджень незрозуміло, чи є ангіопоетин-1, ангіопоетин-2 або Tie-2 привабливою мішенню для протипухлинної терапії. Однак, ефективна терапія проти ангипоетину-2 ймовірно корисна при лікуванні захворювань, наприклад, раку, при якому прогресування залежить від аберантного ангіогенезу, якщо блокований процес може привести до попередження поліпшення захворювання (Follunan J., Nature Medicine. 1, 1995, стор. 27-31). Крім того, деякі групи дослідників повідомляють про застосування антитіл і пептидів, що зв'язуються з ангіопоетином-2. Див., наприклад, US 6166185 і US 2003/10124129, WO 03/030833, WO 2006/068953, WO 03/057134 або US 2006/0122370. Дослідження впливу вогнищевої експресії ангіопоетину-2 показало, що протиборчий ангіопоетин 1/Tie-2 сигнал послабляє щільну судинну структуру, тим самим, піддаючи впливу клітини ендотелію для активації сигналів від індукторів ангіогенезу, наприклад, VEGF (Hanahan D., Science, 277, 1997, стор. 48-50). Такий проангіогенний ефект, що виникає через інгібування ангіопоетину-1, показує, що терапія, спрямована проти ангіопоетину-1, не буде ефективним протипухлинним лікуванням. ANG-2 експресується під час розвитку в місцях ремоделювання кровоносних судин. Maisonpierre P.C. і ін., Science 277, 1997, стор. 55-60. У дорослих індивідуумів експресія ANG-2 обмежена місцями судинного ремоделювання, а також присутня у високо васкуляризованих пухлинах, включаючи гліому, Osada H. і ін., Int. J. Oncol. 18, 2001, стор. 305-309); Koga K. і ін., Cancer Res. 61, 2001, стор. 6248-6254, гепатоклітинну карциному, Tanaka S. і ін., J. Clin. Invest. 103, 1999, стор. 341-345, бородавчастий рак шлунка, Etoh T. і ін., Cancer Res. 61, 2001, стор. 2145-2153; Lee J.H. і ін., Int. J. Oncol. 18, 2001, стор. 355-361, рак щитовидки, Bunone G. і ін., Am J Pathol 155, 1999, стор. 1967-1976, недрібноклітинний рак легень, Wong M.P. і ін., Lung Cancer 29, 2000, стор. 11-22, рак товстої кишки, Ahmad S.A. і ін., Cancer 92, 2001, стор. 1138-1143, рак простати Wurmbach J.H. і ін., Anticancer Res. 20, 2000, стор. 5217-5220. Встановлено, що деякі пухлинні клітини експресують ANG-2. Наприклад, Tanaka S. і ін., J. Clin. Invest. 103, 1999, стор. 341-345, виявили іРНК ANG-2 в 10 з 12 зразків гепатоклітинної карциноми людини (ГКК). Співробітники групи Ellis встановили, що ANG-2 експресується повсюдно в епітелії пухлини. Ahmad S.A. і ін., Cancer 92,2001, 1138-1143. Інші дослідники опублікували подібні результати. Chen L. і ін., J. Tongji Med. Univ. 21, 2001, стор. 228-235. Шляхом виявлення рівнів іРНК ANG-2 в архівованих зразках раку грудей людини, Sfiligoi C. і ін., Int. J. Cancer 103, 2003, стор. 466-474, установили, що іРНК ANG-2 істотно асоційована з інвазією допоміжних лімфатичних вузлів, коротким періодом відсутності хвороби й поганою загальною виживаністю. Tanaka F. і ін., 3 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Cancer Res. 62, 2002, стор. 7124-7129, проаналізували в цілому 236 пацієнтів з недрібноклітинним раком легень (НМКРЛ) на стадіях розвитку захворювання з I по IIIA, відповідно. За допомогою імуногістохімії вони встановили, що 16,9 % пацієнтів НМКРЛ є ANG-2позитивними. Щільність мікросудин для ANG-2-позитивних пухлин суттєво вище, ніж щільність мікросудин в ANG-2-негативних пухлин. Такий ангіогенний ефект ANG-2 спостерігають тільки при високій експресії VEGF. Крім того, позитивна експресія ANG-2 є істотним чинником прогнозування післяопераційного виживання. Tanaka F. і ін., Cancer Res. 62, 2002, стор. 71247129. Однак ними була встановлена відсутність істотної кореляції між експресією Ang-1 і щільністю мікросудин. Tanaka F. і ін., Cancer Res. 62, 2002, стор. 7124-7129. Ці результати означають, що ANG-2 є індикатором поганого прогнозу для пацієнтів з важкими формами деяких типів раку. Раніше, використовуючи модель ANG-2 нокаутних мишей, група під керівництвом Yancopoulo повідомила, що ANG-2 необхідний для постнатального ангіогенезу. Gale N.W. і ін., Dev. Cell 3, 2002, стор. 411-423. Ними було встановлено, що запрограмована в ході розвитку регресія судинної системи склоподібного тіла не відбувається в ANG-2 нокаутних мишей, і їх кровоносні судини сітківки не можуть поширюватися від центральної артерії сітківки. Gale N.W. і ін., Dev. Cell 3, 2002, стор. 411-423. Вони також установили, що делеція ANG-2 приводить до серйозних дефектів у структурі й функції лімфатичної судинної мережі. Gale N.W. і ін., Dev. Cell 3, 2002, стор. 411-423. Генетичне збереження Ang-1 усуває лімфатичні дефекти, але не дефекти ангіогенеза. Gale N.W. і ін., Dev. Cell 3, 2002, стор. 411-423. Peters і ін. повідомляють, що розчинний Tie2, коли вивільняється або як рекомбінантний білок, або у вірусному векторі експресії, інгібує in vivo ріст карциноми молочних залоз миші й меланоми в модельних мишей. Lin P. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1998, стор. 8829-8834; Lin P. і ін., J. Clin. Invest. 100, 1997, стор. 2072-2078. Щільність судин у тканині пухлини, яку лікували вказаним способом, суттєво понизилася. Крім того, розчинний Tie2 блокує ангіогенез у рогівці щура, викликаний кондиціонованими середовищами культур пухлинних клітин. Lin P. і ін., J. Clin. Invest. 100, 1997, стор. 2072-2078. Крім того, Isner і ін. показали, що додавання ANG-2 до VEGF індукує набагато більш тривалий і більшою мірою периферичний процес формування нових судин, ніж додавання тільки одного VEGF. Asahara T. і ін., Circ. Res. 83, 1998, стор. 233240. Надлишок рецептора Tie2 запобігає модулюванню за рахунок ANG-2 індукованого VEGF процесу формування нових судин. Asahara T. і ін., Circ. Res. 83, 1998, стор. 233-240. Siemeister G. і ін., Cancer Res. 59, 1999, стор. 3185-3191, показали на голих мишах із ксенотрансплантатами, що понадекспресія позаклітинних доменів, які зв'язують ліганди, або Flt1, або Tie2, у ксенотрансплантатів, що приводить до істотного пригнічення метаболічного шляху, не може бути компенсована понадекспресією іншого вказаного домену, отже, метаболічний шлях рецептора VEGF і метаболічний шлях Tie2 не слід розглядати як два незалежні медіатори, що мають істотне значення для процесу ангіогенезу in vivo. Siemeister G. і ін., Cancer Res. 59, 1999, стор. 3185-3191. Це підтверджено в декількох наступних публікаціях White R. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 2003, стор. 5028-5033. У цих дослідженнях було показано, що стійкий до нуклеази аптамер РНК, який специфічно зв'язує й інгібує ANG-2, у значній мірі пригнічує процес формування нових судин, індукований bFGF, на моделі ангіогенезу в мікрокишені рогівки щура. Біспецифічні антитіла Останнім часом було створено багато різних структур рекомбінантних антитіл, наприклад, чотиривалентних біспецифічних антитіл, шляхом гібридизації, наприклад, структури антитіла й одноланцюгових доменів (див., наприклад, Coloma M.J. і ін., Nature Biotech 15, 1997, стор. 159163; WO 2001/077342; і Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234). Крім того, декілька інших нових форматів, у яких серцевинна структура антитіла (IgA, IgD, IgE, IgG або IgM) більше не зберігається, наприклад, діатіла, триатіла або тетратіла, мініантитіла, було створено декілька одноланцюгових структур (scFv, Bis-scFv), які можуть зв'язувати два або декілька антигенів (Holliger P. і ін., Nature Biotech 23, 2005, стор. 1126-1136; Fischer N., Léger O., Pathobiology 74, 2007, стор. 3-14; Shen J. і ін., Journal of Immunological Methods 318, 2007, стор. 65-74; Wu C. і ін., Nature Biotech. 25, 2007, стор. 1290-1297). Усі такі формати використовують лінкери, або для гібридизації серцевини антитіла (IgA, IgD, IgE, IgG або IgM) з додатковим зв'язувальним білком (наприклад, scFv), або для гібридизації, наприклад, двох фрагментів Fab або scFv (Fischer N., Léger O., Pathobiology 74, 2007, стор. 314). Слід враховувати, що може бути бажано збереження ефекторних функцій, наприклад, комплементзалежної цитотоксичності (complement-dependent cytotoxicity – CDC) або антитілозалежної клітинної цитотоксичності (antibody-dependent cellular cytotoxicity – ADCC), які опосередковують через зв'язування з рецептором Fc, шляхом підтримки високого ступеня 4 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 подібності із природними антитілами. В WO 2007/024715 повідомляють про імуноглобуліни з доменами подвійної варіабельності як сконструйовані полівалентні і поліспецифічні зв'язувальні білки. Спосіб одержання димер антитіл з біологічною дією описаний в US 6 897044. Конструкція полівалентного FV антитіла, що має принаймні чотири варіабельні домени, які зв'язані між собою через пептидні лінкери, описана в US 7129330. Димерні й полімерні антигензв'язувальні структури описані в US 2005/0079170. Три- або чотиривалентний моноспецифічний антигензв'язувальний білок, що включає три або чотири фрагменти Fab, зв'язані один з одним через з'єднуючі структури, який не є природним імуноглобуліном, описаний в US 6511663. В WO 2006/020258 описані чотиривалентні біспецифічні антитіла, які можуть ефективно експресуватися в прокаріотичних і еукаріотичних клітинах і використовуються в лікуванні й методах діагностики. Спосіб розділення або переважного синтезу димерів, зв'язаних через принаймні один внутрішньоланцюговий дисульфідний зв'язок, від димерів, які не зв'язані через принаймні один внутрішньоланцюговий дисульфідний зв'язок, із суміші, що включає два типи поліпептидних димерів, описаний в US 2005/0163782. Біспецифічні чотиривалентні рецептори описані в US 5959083. Сконструйовані антитіла із трьома або більше функціональними сайтами зв'язування антигену описані в WO 2001/077342. Поліспецифічні й полівалентні антигензв'язувальні поліпептиди описані в WO 1997/001580. В WO 1992/004053 описані гомокон'югати, які звичайно одержують з моноклональних антитіл класу IgG, які зв'язуються з тим же антигенним детермінантом і є ковалентно зв'язаними синтетичному перехресним зв'язком. Олігомерні моноклональні антитіла з високою авідністю відносно антигену, описані в WO 1991/06305, за допомогою чого олігомери, звичайно класу IgG, секретуються, маючи два або декілька мономерів імуноглобуліну, зв'язаних разом для формування чотиривалентних або шестивалентних молекул IgG. Отримані від овець антитіла й сконструйовані конструкції антитіл описані в US 6350860, вони можуть застосовуватися для лікування захворювань, при яких дія інтерферону гама є патогенною. В US 2005/0100543 описані націлювані конструкції, які є полівалентними носіями біспецифічних антитіл, тобто кожна молекула націлюваної конструкції може виступати як носій двох або декількох біспецифічних антитіл. Генетично сконструйовані біспецифічні чотиривалентні антитіла описані в WO 1995/009917. В WO 2007/109254 описані стабілізовані зв'язувальні молекули, які складаються з або включають стабілізований фрагмент scFv. Комбінація інгібіторів VEGF і ANG-2 WO 2007/068895 стосується комбінації антагоніста ANG-2 і VEGF, KDR і/або FLTL антагоністів. WO 2007/089445 стосується комбінацій інгібіторів ANG-2 і VEGF. WO 2003/106501 стосується гібридних білків, що зв'язуються з ангіопоетином і містять домен полімеризації. WO 2008/132568 гібридні білки зв'язуються з ангіопоетином і VEGF. Короткий опис винахід Першим об'єктом за даним винаходом є біспецифічне антитіло, яке специфічно зв'язується з фактором росту судинного ендотелію людини (human vascular endothelial growth factor – VEGF) і з ангіопоетином-2 людини (angiopoietin-2 – ANG-2), що включає перший сайт зв'язування антигену, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий сайт зв'язування антигену, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що i) кожний із вказаних сайтів зв'язування антигену представляє пару варіабельного домену важкого ланцюга антитіла й варіабельного домену легкого ланцюга антитіла; ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17 або SEQ ID NO: 94, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18 або SEQ ID NO: 95, і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 96, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20 або SEQ ID NO: 97, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21 або SEQ ID NO: 98 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 22 або SEQ ID NO: 99; iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 78 або SEQ ID NO: 86, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 79 або SEQ ID NO: 87 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:27, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 64, 5 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 80 або SEQ ID NO: 88, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 28 з мутаціями T92L, H93Q і W94T, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81 або SEQ ID NO: 89, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:29, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 82 або SEQ ID NO: 90, ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:30, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 83 або SEQ ID NO: 91. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що i) кожний із вказаних сайтів зв'язування антигену представляє пару варіабельного домену важкого ланцюга антитіла й варіабельного домену легкого ланцюга антитіла; ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 3, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:5 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:6; або вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 9, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 10 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:11, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 12, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:13 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:14; або вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 17, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 18 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:19, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 20, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:21 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:22; і iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 25, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 26, і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:27, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 28 або SEQ ID NO: 28 з мутаціями T92L, H93Q і W94T, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:29, і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:30. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що i) кожний із вказаних сайтів зв'язування антигену представляє пару варіабельного домену важкого ланцюга антитіла й варіабельного домену легкого ланцюга антитіла; ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23 або SEQ ID NO: 100, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24 або SEQ ID NO: 101, і iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає у варіабельному домені важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 84 або SEQ ID NO: 92, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 32 з мутаціями T92L, H93Q і W94T SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 85 або SEQ ID NO: 93. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1 або SEQ ID NO: 94, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 95 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:3 або SEQ ID NO: 96, у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4 або SEQ ID NO: 97, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO: 98, і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO: 99; iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає як варіабельний домен важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 78 або SEQ ID NO: 86, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 79 або SEQ ID NO: 87, і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 72, SEQ IDNO: 80 або SEQ ID NO: 88, і у 6 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81 або SEQ ID NO: 89, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 82 або SEQ ID NO: 90, і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 83 або SEQ ID NO: 91. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 100, і включає як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 8 або SEQ ID NO: 101, і iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 84 або SEQ ID NO: 92, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 85 або SEQ ID NO: 93. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 78 або SEQ ID NO: 86, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 79 або SEQ ID NO: 87, і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 80 або SEQ ID NO: 88, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81 або SEQ ID NO: 89, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 82 або SEQ ID NO: 90, і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 83 або SEQ ID NO: 91. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає як варіабельний домен важкого ланцюга SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 84 або SEQ ID NO: 92, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 85 або SEQ ID NO: 93. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:3, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:5 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:6; і iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає у варіабельному домені важкого ланцюга CDR3 ділянку послідовності SEQ ID NO: 46, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 47 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 48, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 49, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 50 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 51. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 7, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 8, і iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 52, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 53. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1 або SEQ ID 7 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 NO: 94, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 95 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:3 або SEQ ID NO: 96, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4, або SEQ ID NO: 97, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO: 98, і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO: 99; iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 62 або SEQ ID NO: 86, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 63 або SEQ ID NO: 87 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 64 або SEQ ID NO: 88, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 65 або SEQ ID NO: 89, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 66 або SEQ ID NO: 90 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 67 або SEQ ID NO: 91. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 100, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 8 або SEQ ID NO: 101, і iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 68 або SEQ ID NO: 92, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 69, або SEQ ID NO: 93. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:3, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:5 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:6; iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 62, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 63 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 64, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 65, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 66 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 67. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 7, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 8; і iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 68, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 69. Вказані біспецифічні антитіла є принаймні двовалентними й можуть бути тривалентними, чотиривалентними або полівалентними. Переважно біспецифічне антитіло за даним винаходом є двовалентним, тривалентним або чотиривалентним. Інший об'єкт даного винаходу є молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує ланцюжок вказаного біспецифічного антитіла. Даний винахід також передбачає вектори експресії, що містять вказану нуклеїнову кислоту за даним винаходом, здатні експресувати вказану нуклеїнову кислоту в прокаріотичних або еукаріотичних клітинах-хазяїнах, і клітини-хазяїни вектори, що містять такі, для рекомбінантного вироблення антитіла за даним винаходом. Даний винахід додатково включає прокаріотичні або еукаріотичні клітини-хазяїни, що включають вектор за даним винаходом. Даний винахід також передбачає спосіб одержання біспецифічного антитіла за даним винаходом, що відрізняється експресією нуклеїнової кислоти за даним винаходом в прокаріотичних або еукаріотичних клітинах-хазяїнах і виділенням вказаного біспецифічного антитіла із вказаних клітин або із супернатанту культури клітин. Даний винахід додатково включає антитіло, отримане таким рекомбінантним способом. Іншими об'єктами даного винаходу є фармацевтична композиція, яка включає вказане біспецифічне антитіло, вказана композиція для лікування раку, застосування вказаного біспецифічного антитіла для одержання лікарського засобу для лікування раку, спосіб лікування пацієнта, хворого на рак, шляхом введення вказаного біспецифічного антитіла пацієнтові, який потребує такого лікування. 8 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Біспецифічні антитіла за даним винаходом корисні для хворих людей, які потребують лікування, що націлюється на VEGF і ANG-2. Антитіла за даним винаходом мають нові ознаки й мають властивості відповідно винаходу, що корисні для пацієнта з таким захворюванням, особливо з раковим захворюванням. Несподівано було встановлено, що біспецифічні антитіла за даним винаходом більш ефективні при раковому рості та/або пригніченні ангіогенезу пухлини в порівнянні з комбінацією відповідних моноспецифічних вихідних антитіл. Докладний опис винаходу Одним з варіантів здійснення даного винаходу є біспецифічне антитіло, яке специфічно зв'язується з VEGF людини й ANG-2 людини, що включає перший сайт зв'язування антигену, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий сайт зв'язування антигену, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що відрізняється тим, що i) кожний із вказаних сайтів зв'язування антигену представляє пару варіабельного домену важкого ланцюга антитіла й варіабельного домену легкого ланцюга антитіла; ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17 або SEQ ID NO: 94, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18 або SEQ ID NO: 95, і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 96, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20 або SEQ ID NO: 97, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21 або SEQ ID NO: 98 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 22 або SEQ ID NO: 99; iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 78 або SEQ ID NO: 86, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 79 або SEQ ID NO: 87, і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:27, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 80 або SEQ ID NO: 88, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 28 з мутаціями T92L, H93Q і W94T, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81 або SEQ ID NO: 89, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:29, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 82 або SEQ ID NO: 90, і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:30, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 83 або SEQ ID NO: 91. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що i) кожний із вказаних сайтів зв'язування антигену представляє пару варіабельного домену важкого ланцюга антитіла й варіабельного домену легкого ланцюга антитіла; ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:3, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:5 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:6; або вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 9, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 10, і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:11, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 ділянку послідовності SEQ ID NO: 12, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:13, і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:14; або вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 17, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 18 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:19, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 20, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:21 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:22; і iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 25, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 26 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:27, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 28 або SEQ ID NO: 28 з мутаціями T92L, H93Q і W94T, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:29 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:30. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним 9 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходом відрізняється тим, що i) кожний із вказаних сайтів зв'язування антигену представляє пару варіабельного домену важкого ланцюга антитіла й варіабельного домену легкого ланцюга антитіла; ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23 або SEQ ID NO: 100, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24 або SEQ ID NO: 101, і iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 84 або SEQ ID NO: 92, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 32 з мутаціями T92L, H93Q і W94T SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 85 або SEQ ID NO: 93. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1 або SEQ ID NO: 94, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 95 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:3 або SEQ ID NO: 96, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4 або SEQ ID NO: 97, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO: 98, і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO: 99; iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 78 або SEQ ID NO: 86, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 79 або SEQ ID NO: 87 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 80 або SEQ ID NO: 88, і в варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81 або SEQ ID NO: 89, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 82 або SEQ ID NO: 90, і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 83 або SEQ ID NO: 91. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 100, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 8 або SEQ ID NO: 101, і iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 84 або SEQ ID NO: 92, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 85 або SEQ ID NO: 93. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 78 або SEQ ID NO: 86, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 79 або SEQ ID NO: 87 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 80 або SEQ ID NO: 88, і в варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81 або SEQ ID NO: 89, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 82 або SEQ ID NO: 90 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 83 або SEQ ID NO: 91. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 84 або SEQ ID NO: 92, і як варіабельний 10 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 домен легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 85 або SEQ ID NO: 93. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:3, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:5 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:6; і iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 46, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 47 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 48, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 49, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 50 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 51. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 7, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 8, і iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 52, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 53. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічнеантитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1 або SEQ ID NO: 94, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 95 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:3 або SEQ ID NO: 96, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4 або SEQ ID NO: 97, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO: 98 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO: 99; iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 62 або SEQ ID NO: 86, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 63 або SEQ ID NO: 87 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 64 або SEQ ID NO: 88, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 65 або SEQ ID NO: 89, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 66 або SEQ ID NO: 90 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 67 або SEQ ID NO: 91. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 7, або SEQ ID NO: 100, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 8 або SEQ ID NO: 101, і iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 68, або SEQ ID NO: 92, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 69, або SEQ ID NO: 93. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 3, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 5 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:6; iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 62, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 63 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 64, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 ділянку послідовності SEQ ID NO: 65, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 66 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 67. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає 11 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 7, і варіабельного домену легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 8; і iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 68, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 69. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 3, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO:5 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO:6; і iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає у варіабельному домені важкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 78, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 79 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 80, і у варіабельному домені легкого ланцюга ділянку CDR3 послідовності SEQ ID NO: 81, ділянку CDR2 послідовності SEQ ID NO: 82 і ділянку CDR1 послідовності SEQ ID NO: 83. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється тим, що ii) вказаний перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 7, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 8, і iii) вказаний другий сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, включає як варіабельний домен важкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 84, і як варіабельний домен легкого ланцюга послідовність SEQ ID NO: 85. В іншому варіанті здійснення даного винаходу передбачене біспецифічне антитіло, яке специфічно зв'язується з фактором росту судинного ендотелію(human vascular endothelial growth factor – VEGF) і ангіопоетином-2 людини (angiopoietin-2 – ANG-2), що відрізняється тим, що вихідне анти-ANG-2 антитіло не є антитілом, що специфічно зв'язується з ангіопоетином-1 людини (ANG-1). До типових вихідних антитіл, які специфічно зв'язуються з ANG-2 людини, але не з ANG-1 людини, належать, наприклад, Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07 і переважно Ang2i_LC10, або антитіла, що зв'язуються з тим же епітопом, що й Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07, Ang2i_LC10, переважно антитіла, що зв'язуються з тим же епітопом, що й Ang2i_LC06, або Ang2i_LC10. Таким чином, в одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло специфічно зв'язується з фактором росту судинного ендотелію людини (VEGF) і ангіопоетином-2 людини (ANG-2), але не з ANG-1 людини (або в якому вихідне анти-ANG-2 антитіло не зв'язується специфічно з ангіопоетином-1 людини (ANG-1)) зв'язується з тим же епітопом, що й Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07, Ang2i_LC10, переважно з тим же епітопом, що й Ang2i_LC06 або Ang2i_LC10. Такі біспецифічні антитіла, що специфічно зв'язуються з фактором росту судинного ендотелію людини (VEGF) і ангіопоетином-2 людини (ANG-2), але не з ANG-1 людини (або в якому вихідне анти-ANG-2 антитіло не зв'язується специфічно з ангіопоетином-1 людини (ANG1)), можуть мати поліпшені властивості, наприклад, біологічну або фармакологічну дію, знижену токсичність або фармакокінетичний профіль, у порівнянні з біспецифічними антитілами, що специфічно зв'язуються з фактором росту судинного ендотелію людини (VEGF) і ангіопоетином2 людини (ANG-2), а також з ANG-1 людини. Таким чином, переважний варіант здійснення даного винаходу передбачає біспецифічне антитіло, яке специфічно зв'язується з VEGF людини й ANG-2 людини, що включає перший сайт зв'язування антигену, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий сайт зв'язування антигену, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що відрізняється тим, що другий сайт зв'язування антигену не зв'язується специфічно з ангіопоетином-1 людини (ANG-1). В одному з варіантів здійснення даного винаходу передбачене біспецифічне антитіло, яке специфічно зв'язується з фактором росту судинного ендотелію людини (VEGF) і ангіопоетином2 людини (ANG-2), що включає перший сайт зв'язування антигену, який специфічно зв'язується з VEGF людини, і другий сайт зв'язування антигену, який специфічно зв'язується з ANG-2 людини, що відрізняється тим, що співвідношення величин зв'язувальної спорідненості KD (антигензв'язувальний сайт, специфічний у відношенні VEGF)/KD (антигензв'язувальний сайт, специфічний у відношенні ANG-2) становить 1,0-10,0, переважно 1,5-8,0 (в одному з варіантів здійснення даного винаходу – 5,0-8,0) і переважно абсолютна величина KD знаходиться в -8 -13 діапазоні 10 -10 моля/л. Величини KD визначають за ANG-2/VEGF зв'язуванням BIACORE 12 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (див. приклад 2 і фіг. 15A). Оскільки обидва білки, VEGF людини й ANG-2 людини, виступають як розчинні рецептори-ліганди у сироватці людини приблизно в рівних концентраціях, блокування вказаних обох рецепторів-лігандів біспецифічним антитілом, що відрізняються тим, що співвідношення величин зв'язувальної спорідненості KD (антигензв'язувальний сайт, специфічний у відношенні VEGF)/KD (антигензв'язувальний сайт, специфічний у відношенні ANG-2) становлять 1,0-10,0, переважно 1,5-8,0, і в одному з варіантів здійснення даного винаходу – 5,0-8,0 і може привести до поліпшених властивостей, зв'язаних з антиангіогенними ефектами, пригніченням росту пухлин або з механізмом стійкості під час лікування раку або судинних захворювань за допомогою такого біспецифічного антитіла. Переважно вказане біспецифічне антитіло відрізняється тим, що співвідношення величин зв'язувальної спорідненості KD (антигензв'язувальний сайт, специфічний у відношенні VEGF)/KD (антигензв'язувальний сайт, специфічний у відношенні ANG-2) становить 1,0 – 10,0, переважно 1,5-8,0 (в одному з варіантів здійснення даного винаходу – 5,0-8,0), і вказане біспецифічне антитіло включає як перший сайт зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з VEGF, варіабельний домен важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 7 і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 8, у якості вказаного другого сайту зв'язування антигену, що специфічно зв'язується з ANG-2, a) або варіабельний домен важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 52, і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 53, або б) варіабельний домен важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 84, і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 85. У контексті даного винаходу поняття "антитіло" стосується зв'язувального білку, який включає сайти зв'язування антигену. Поняття "сайт зв'язування" або "сайт зв'язування антигену" у контексті даного винаходу означають ділянку (ділянки) молекули антитіла, з якими фактично зв'язується ліганд. Поняття "сайт зв'язування антигену" стосується варіабельних доменів важкого ланцюга антитіла (VH), і/або варіабельним доменів легкого ланцюга антитіла (VL), або пари VH/VL, і може бути похідним від цілих антитіл або фрагментів антитіл, наприклад, одноланцюгового фрагмента Fv, домену VH і/або домену VL, Fab або (Fab)2. В одному з варіантів здійснення даного винаходу кожний із сайтів зв'язування включає варіабельний домен важкого ланцюга антитіла (VH) і/або варіабельний домен легкого ланцюга антитіла (VL), і переважно сформований парою, що складається з варіабельного домену легкого ланцюга антитіла (VL) і варіабельного домену важкого ланцюга антитіла (VH). Сайт зв'язування антигену й особливо варіабельні домени важкого ланцюга (VH) і/або варіабельні домени легкого ланцюга (VL) антитіла, які специфічно зв'язуються з фактором росту судинного ендотелію (VEGF), можуть бути похідними від a) відомих анти-VEGF антитіл, наприклад, описаних Kim і ін., Nature 362, 1993, стор. 841-844; Warren R.S. і ін., J. Clin. Invest. 95, 1995, стор. 1789-1797; Borgstrom P. і ін., Cancer Res. 56, 1996, стор. 4032-4039; Melnyk O. і ін., Cancer Res. 56, 1996, стор. 921-924, WO 94/10202, WO 98/45332, WO 2005/00900, WO 00/35956 і US 2007/0141065, або б) нових анти-VEGF антитіл, отриманих методами імунізації de novo, використовуючи inter alia або білок VEGF людини, або нуклеїнову кислоту або її фрагменти, або методом фагового дисплею. Сайт зв'язування антигену, і особливо варіабельні домени важкого ланцюга (VH) антитіла й/або варіабельні домени легкого ланцюга (VL) антитіла, які специфічно зв'язуються з ангіопоетином-2 людини (ANG-2) можуть бути похідними від a) від відомих анти-ANG-2 антитіл, наприклад, описаних в WO 03/030833, WO 2006/068953, WO 2006/045049 або US 6166185, або б) з нових анти-ANG-2 антитіл, отриманих, наприклад, методами імунізації de novo, використовуючи inter alia або білок ANG-2 людини, або нуклеїнову кислоту або її фрагменти, або методом фагового дисплею. Специфічністю антитіла позначають вибіркове розпізнавання антитіла для конкретного епітопу антигену. Природні антитіла, наприклад, є моноспецифічними. Поняття "біспецифічні антитіла" за даним винаходом означає антитіла, які мають дві різні специфічності зв'язування антигену. Якщо антитіло має більше однієї специфічності, розпізнавані епітопи можуть бути асоційовані з одним антигеном або більш ніж з одним антигеном. Антитіла за даним винаходом є специфічними для двох різних антигенів, тобто VEGF у вигляді першого антигену, і ANG-2 у вигляді другого антигену. Поняття "моноспецифічне антитіло" у контексті даного винаходу стосується антитіла, яке має один або декілька сайтів зв'язування, кожний з яких зв'язується з тим самим епітопом того самого антигену. Поняття "валентність" у контексті даного винаходу означає наявність специфічного числа сайтів зв'язування в молекулі антитіла. По суті поняття "двовалентний", "чотиривалентний" і "шестивалентний" означають наявність двох сайтів зв'язування, чотирьох сайтів зв'язування й 13 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 шести сайтів зв'язування, відповідно, у молекулі антитіла. Біспецифічні антитіла за даним винаходом є принаймні "двовалентними" і можуть бути "тривалентними" або "полівалентними" (наприклад, "чотиривалентними" або "шестивалентними"). Переважно біспецифічне антитіло за даним винаходом є двовалентним, тривалентним або чотиривалентним. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло є двовалентним. В одному з варіантів здійснення даного винаходу вказане біспецифічне антитіло є тривалентним. В одному з варіантів здійснення даного винаходу антитіло є чотиривалентним. Антитіла за даним винаходом мають два або більше сайтів зв'язування і є біспецифічними. Тобто, антитіла можуть бути біспецифічними навіть у тих випадках, коли є більше двох сайтів зв'язування (тобто якщо антитіло тривалентно або полівалентно). Біспецифічні антитіла за даним винаходом включають, наприклад, полівалентні одноланцюгові антитіла, діантитіла й триантитіла, а також антитіла, що мають структуру константного домену антитіла повної довжини, з якою зв'язані додаткові сайти зв'язування антигену (наприклад, одноланцюговий фрагмент Fv, домен VH і/або домен VL, Fab або (Fab)2) через один або декілька пептидних лінкерів. Антитіла можуть бути повної довжини від одного виду, або химерними, або гуманізованими. В антитіл з більш ніж двома сайтами зв'язування антигену деякі сайти зв'язування можуть бути ідентичними, поки білок має сайти зв'язування для двох різних антигенів. Тобто, якщо перший сайт зв'язування специфічний для VEGF, то другий сайт зв'язування специфічний для ANG-2, і навпаки. Фактор росту судинного ендотелію (VEGF/VEGF-A) (SEQ ID No: 105) описаний, наприклад, Leung D.W. і ін., Science 246, 1989, стор. 1306-1309; Keck P.J. і ін., Science 246, 1989, стор. 13091312, і Connolly D.T. і ін., J. Biol. Chem. 264, 1989, стор. 20017-20024. VEGF бере участь у регуляції нормального й зміненого ангіогенезу й неоваскуляризації, зв'язаних з пухлинами й внутрішньоочними розладами (Ferrara N. і ін., Endocr. Rev. 18, 1997, стор. 4-25; Berkman R.A. і ін., J. Clin. Invest. 91, 1993, стор. 153-159; Brown L.F. і ін., Human Pathol. 26, 1995, стор. 86-91; Brown L.F. і ін., Cancer Res. 53, 1993, стор. 4727-4735; Mattern J. і ін., Brit. J. Cancer. 73, 1996, стор. 931-934; і Dvorak H і ін., Am. J. Pathol. 146, 1995, стор. 1029-1039). VEGF є гомодимерним глікопептидом, виділеним з декількох джерел. VEGF проявляє високоспецифічну мітогенну дію відносно клітин ендотелію. Ангіопоетин-2 людини (ANG-2) (який також позначається "ANGPT2" або "ANG2") (SEQ ID No: 106) описаний Maisonpierre P.C. і ін., Science 277, 1997, стор. 55-60, і Cheung A.H. і ін., Genomics 48, 1998, стор. 389-391. Ангіопоетин-1 і ангіопоетин-2 (ANG-1(SEQ ID No: 107) і ANG-2(SEQ ID No: 106)) описані як ліганди для Tie – сімейства тирозинкіназ, які вибірково експресуються судинним ендотелієм. Yancopoulos G.D. і ін., Nature 407, 2000, стор. 242-248. Зараз відомо чотири характерні представники сімейства ангіопоетину. Ангіопоетин-3 і ангіопоетин-4 (Ang-3 і Ang-4) можуть представляти значно змінені аналоги того ж генного локусу в мишей і людей. Kim I. і ін., FEBS Let, 443, 1999, стор. 353-356; Kim I. і ін., J Biol Chem 274, 1999, стор. 26523-26528. ANG-1 і ANG-2 спочатку були виявлені в експериментах з культурами тканини як агоністи і антагоністи, відповідно (див. по ANG-1: Davis S. і ін., Cell 87, 1996, стор. 1161-1169; і за ANG-2: Maisonpierre P.C. і ін., Science 277, 1997, стор. 55-60). Усі відомі ангіопоетини зв'язуються головним чином з Tie2, і обидва, Ang-1 і Ang-2 зв'язуються з Tie2 зі спорідненістю 3 нМ (Kd). Maisonpierre P.C. і ін., Science 277, 1997, стор. 55-60. Сайти зв'язування антигену антитіл за даним винаходом звичайно містять шість комплементарно детермінуючих ділянок (complementarity determining ділянку – CDR), які впливають на різний ступінь спорідненості сайту зв'язування з антигеном. Є три варіабельні домени CDR важкого ланцюга (CDRH1, CDRH2 і CDRH3) і три варіабельні домени CDR легкого ланцюга (CDRL1, CDRL2 і CDRL3). Довжину CDR і каркасних ділянок (FR) визначають шляхом порівняння з базами даних амінокислотних послідовностей, у яких такі ділянки ідентифікують за варіабельністю серед послідовностей. Також включеними в рамки охоплення даного винаходу є функціональні сайти зв'язування антигену, що складаються із меншого числа CDR (тобто де специфічність зв'язування визначається трьома, чотирма або п'ятьома ділянками CDR). Наприклад, менше ніж повний комплект із 6 CDR може бути достатній для зв'язування. У деяких випадках домену VH або VL може бути достатньо. У деяких варіантах здійснення даного винаходу антитіла за даним винаходом додатково включають константні ділянки імуноглобуліну з одного або декількох класів імуноглобулінів. До класів імуноглобуліну належать ізотипи IgG, IgM, IgA, IgD і IgE, а також у випадку IgG і IgA їх підтипи. У переважному варіанті здійснення даного винаходу антитіло за даним винаходом має константну доменну структуру антитіла типу IgG, але містить чотири сайти зв'язування антигену. Це доповнюється, наприклад, зв'язуванням двох повних сайтів зв'язування антигену (наприклад, одноланцюгового фрагмента Fv), що специфічно зв'язуються з EGFR або з N-, або 14 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з C-кінця важкого або легкого ланцюга повного антитіла, що специфічно зв'язується з ANG-2. В іншому варіанті це доповнюється, наприклад, зв'язуванням двох повних зв'язувальних пептидів, що специфічно зв'язуються з ANG-2 з одним С-кінцем важкого ланцюга повного антитіла, що специфічно зв'язується з VEGF. Чотири сайти зв'язування антигену переважно включають два сайти зв'язування для кожної із двох різних зв'язувальних специфічностей. Поняття "моноклональне антитіло" або "композиція моноклонального антитіла" у контексті даного винаходу стосується одержання молекул антитіла одного амінокислотного складу. Поняття "химерне антитіло" стосується антитіла, що включає варіабельну ділянку, тобто ділянку зв'язування, з одного джерела або виду, і принаймні частину константної ділянки, похідної від іншого джерела або виду, звичайно отриманих методами рекомбінації ДНК. Химерні антитіла, що включають варіабельну ділянку гризуна й константну ділянку людини, є переважними. До інших переважних форм "химерного антитіла", охоплюваним даним винаходом, належать ті форми, у яких константна ділянка була модифікована й змінена відносно вихідного антитіла для вироблення властивостей за даним винаходом, особливо відносно зв'язування C1q і/або зв'язування рецептора Fc (FcR). Такі химерні антитіла також називаються "антитілами перемикання класу". Химерні антитіла є продуктом експресії генів імуноглобуліну, що включають сегменти ДНК, що кодують варіабельні ділянки імуноглобуліну, і сегменти ДНК, що кодують константні ділянки імуноглобуліну. Методи одержання химерних антитіл включають традиційні методики рекомбінації ДНК і трансфекції генів, добре відомі в даній галузі. Див., наприклад, Morrison S.L. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, стор. 68516855; US 5202238 і US 5204244. Поняття "гуманізоване антитіло" стосується антитіл, у яких каркасна ділянка або "ділянки, що комплементарно детермінують (CDR)" модифіковані для включення CDR імуноглобуліну іншої специфічності в порівнянні з CDR імуноглобуліну відмінної специфічності в порівнянні з імуноспецифічністю вихідного імуноглобуліну. У переважному варіанті здійснення даного винаходу CDR миші переносять у каркасну ділянку антитіла людини для одержання "гуманізованого антитіла". Див., наприклад, Riechmann L. і ін., Nature 332, 1988, стор. 323-327; і Neuberger M.S. і ін., Nature 314, 1985, стор. 268-270. Особливо переважні ділянки CDR відповідають ділянкам, що представляють послідовності, які розпізнають антигени, вказані вище, для химерних антитіл. До інших форм "гуманізованого антитіла" у даному винаході належать ті форми, у яких константна ділянка додатково модифікована або змінена в порівнянні з вихідним антитілом для одержання властивостей за даним винаходом, особливо у зв'язку зі зв'язуванням C1q і/або зі зв'язуванням з рецептором Fc (FcR). Поняття "антитіло людини" у контексті даного винаходу стосується антитіл, що мають варіабельні й константні ділянки, що походять від послідовностей імуноглобуліну зародкової лінії людини. Антитіла людини відомі в даній галузі (van Dijk M.A., van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, стор. 368-374). Антитіла людей також можуть бути отримані в трансгенних тваринах (наприклад, мишах), які можуть при імунізації виробляти повний набір або певні антитіла людини при відсутності вироблення ендогенного імуноглобуліну. Перенос генних послідовностей імуноглобуліну зародкової лінії людини в таких мутантних мишей зародкової лінії може привести до вироблення антитіл людини відносно зміненого антигену (див. наприклад, Jakobovits A. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, стор. 2551-2555; Jakobovits A. і ін., Nature 362, 1993, стор. 255-258; Bruggemann M. і ін., Year Immunol. 7, 1993, стор. 33-40). Антитіла людини також можуть бути отримані методом бібліотек фагового дисплею (Hoogenboom H.R., Winter G.J. Mol. Biol. 227, 1992, стор. 381-388; Marks J.D. і ін., J. Mol. Biol. 222, 1991, стор. 581-597). Методи Cole і ін. і Boerner і ін. також застосовні для одержання моноклональних антитіл людини (Cole S.P.C. і ін., Мonoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, стор. 77-96; Boerner P. і ін., J. Immunol. 147, 1991, стор. 86-95). Відповідно до вказаного вище для химерних і гуманізованих антитіл за даним винаходом поняття "антитіло людини", яке використовується в даному винаході, також включає такі антитіла, які модифіковані в константній ділянці для одержання властивостей за даним винаходом, особливо у зв'язку зі зв'язуванням C1q і/або зв'язуванням FcR, наприклад, шляхом "перемикання класу", тобто зміни або мутації частин Fc (наприклад, з IgG1 на IgG4 і/або мутація IgG1/IgG4). Поняття "рекомбінантне антитіло людини" у контексті даного винаходу включає всі антитіла людини, які одержують, експресують, створюють або виділяють методами рекомбінації, наприклад, антитіла, виділені із клітин-хазяїнів, наприклад, клітин NSО або CHO, або із тварини (наприклад, миші), трансгенної за генами імуноглобуліну людини, або антитіла, експресовані із застосуванням вектора рекомбінантної експресії, трансфекованого в клітини-хазяїни. Такі рекомбінантні антитіла людей містять варіабельні й константні ділянки в перевлаштованій формі. Рекомбінантні антитіла за даним винаходом піддають соматичній гіпермутації in vivo. 15 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Таким чином, амінокислотними послідовностями ділянок VH і VL рекомбінантних антитіл є послідовностями, які походять від послідовностей VH і VL зародкової лінії людини або зв'язані з ними, і можуть у нормі не існувати в природі в складі зародкової лінії антитіла людини in vivo. Поняття "варіабельний домен" (варіабельний домен легкого ланцюга (VL), варіабельна ділянка важкого ланцюга (VH)), яке використовується в даному винаході, означає кожну пару легкого й важкого ланцюга, яка бере участь безпосередньо у зв'язуванні антитіла з антигеном. Домени варіабельних легкого й важкого ланцюгів людини мають однакову загальну структуру, і кожний домен включає чотири каркасні ділянки (FR), у яких послідовності у високому ступені консервативні, з'єднані трьома "гіперваріабельними ділянками" (або комплементарно детермінуючими ділянками, CDR). Каркасні ділянки приймають конформацію β-шару, і ділянки CDR можуть формувати петлі, що з'єднують структуру β-шару. Ділянки CDR у кожному ланцюзі підтримуються в тривимірній структурі за рахунок каркасних ділянок і формують разом з ділянками CDR з іншого ланцюга сайт зв'язування антигену. Ділянки CDR3 важкого й легкого ланцюгів антитіла відіграють особливо важливу роль у зв'язувальній специфічності/спорідненості антитіл за даним винаходом й, отже, представляють інший об'єкт за даним винаходом. Поняття "гіперваріабельна ділянка" або "антигензв'язувальна частина антитіла" при використанні в даному винаході стосується амінокислотних залишків антитіла, які відповідають за зв'язування антигену. Гіперваріабельна ділянка включає амінокислотні залишки з "комплементарно детермінуючих ділянок (complementarity determining regions – CDR)». До поняття "каркасні ділянки (Framework – FR)» належать ті ділянки варіабельного домену, які відрізняються від залишків гіперваріабельної ділянки, відповідно описаної в даному винаході. Отже, легкі й важкі ланцюги антитіла включають від N-кінця до C-кінця домени FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 і FR4. Ділянки CDR у кожному ланцюзі відділені такими амінокислотами каркасних ділянок. Особливо CDR3 важкого ланцюга представляють ділянку, яка найбільшим чином впливає на зв'язування антигену. Ділянки CDR і FR визначають за стандартним підходом Kabat і ін., описаним в кн. "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1991, 5-е изд., вид-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Мериленд. Біспецифічні антитіла за даним винаходом включають, крім іншого, такі антитіла, які мають "модифікації консервативної послідовності" (що позначаються "варіантами" біспецифічних антитіл). До них належать модифікації нуклеотидних і амінокислотних послідовностей, які не впливають або не змінюють вказані вище властивості антитіла за даним винаходом. Модифікації можуть бути інтродуковані стандартними методами, відомими в даній галузі, наприклад, наприклад, сайт-направленим мутагенезом і ПЛР-опосередкованим мутагенезом. До консервативних амінокислотних заміщень належать заміщення, при яких амінокислотний залишок заміщений амінокислотним залишком з подібним боковим ланцюгом. Сімейства амінокислотних залишків з подібними боковими ланцюгами описані в даній галузі. Ці сімейства включають амінокислоти з основними боковими ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними боковими ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними боковими ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн, триптофан), неполярними боковими ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцину, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін), бета-розгалуженими боковими ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичними боковими ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Tаким чином прогнозовані амінокислотні залишки у біспецифічному антитілі можуть бути переважно заміщені іншими амінокислотним залишками із сімейства того ж бічного ланцюга. "Варіантом" біспецифічного антитіла в контексті даного винаходу називається молекула, яка відрізняється за амінокислотною послідовністю від "вихідної" амінокислотної послідовності біспецифічного антитіла десятьома, переважно приблизно двомап'ятьма, додаваннями, делеціями та/або заміщеннями в одній або декількох варіабельних ділянках або константних ділянках вихідного антитіла. Амінокислотні заміщення можуть бути отримані мутагенезом, заснованим на молекулярному моделюванні, описаному Riechmann L. і ін., Nature 332, 1988, стор. 323-327, і Queen C. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, стор. 10029-10033. До "варіанта" біспецифічного антитіла за даним винаходом також належать біспецифічні антитіла такого формату, у якому лінкер (якщо він є) модифікований або заміщений іншим лінкером. У контексті даного винаходу поняття "зв'язування" і "специфічне зв'язування" стосується зв'язування антитіла з епітопом антигену (або VEGF людини, або ANG-2 людини) в аналізі in vitro, переважно методом плазмонного резонансу на установці Biacore (фірма GE Healthcare, Упсала, Швеція) (приклад 2), з очищеним антигеном дикого типу. Спорідненість при зв'язуванні 16 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виражають у термінах ka (константа швидкості реакції для асоціації антитіла з комплексу антитіло/антиген), kd (константа дисоціації) і KD (kd/ka). Зв'язування або специфічне зв'язування -8 означає зв'язувальну спорідненість (KD), що становить 10 молів/л або менше, переважно від -9 -13 10 M дo 10 молів/л. Зв'язування антитіла з FcγRIII може бути досліджене методом Biacore (фірма Pharmacia Biosensor AB, Упсала, Швеція). Спорідненість при зв'язуванні виражають у термінах ka (константа швидкості асоціації антитіла з комплексу антитіло/антиген), kd (константа дисоціації) і KD (kd/ka). У контексті даного винаходу поняття "що не зв'язується з ANG-1" або "що не зв'язується специфічно з ANG-1" означає, що антитіло має величину EC50 приблизно 8000 нг/мл в аналізі зв'язування ANG-1 методом ELISA in vitro (за прикладом 9). Поняття "епітоп" стосується якого-небудь поліпептидного детермінанту, здатного специфічно зв'язуватися з антитілом. У деяких варіантах здійснення даного винаходу детермінант епітопу включає хімічно активні групи молекул, наприклад, амінокислоти, бічні ланцюжки цукрів, фосфорил або сульфоніл і, у деяких варіантах здійснення даного винаходу, можуть мати специфічні тривимірні структурні властивості та/або специфічні характеристики заряду. Епітоп є ділянкою антигену, яка зв'язується антитілом. У деяких варіантах здійснення даного винаходу антитіло розглядають як таке, що специфічно зв'язується з антигеном, якщо воно переважно розпізнає антиген-мішень у складній суміші білків і/або макромолекул. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло включає вихідне антитіло повної довжини як основи. Поняття "антитіло повної довжини" означає антитіло, яке складається із двох "важких ланцюгів антитіла повної довжини" і двох "легких ланцюгів антитіла повної довжини". Поняття « важкого ланцюга антитіла повної довжини" стосується поліпептиду, що складається в напрямку від N-кінця до С-кінця з варіабельного домену важкого ланцюга антитіла (VH), константного домену 1 важкого ланцюга антитіла (CH1), шарнірної ділянки антитіла (HR), константного домену 2 важкого ланцюга антитіла (CH2) і константного домену 3 важкого ланцюга антитіла (CH3), який коротко позначається VH-CH1-HR-CH2-CH3; і необов'язково константного домену 4 важкого ланцюга антитіла (CH4) у випадку антитіла підкласу IgE. Переважно « важким ланцюгом антитіла повної довжини" є поліпептид, що складається в напрямку від N-кінця до Скінця з VH, CH1, HR, CH2 і CH3. Поняття « легкого ланцюга антитіла повної довжини" стосується поліпептиду, що складається в напрямку від N-кінця до С-кінця з варіабельного домену легкого ланцюга антитіла (VL) і константного домену легкого ланцюга антитіла (CL), що коротко позначається VL-CL. Константний домен легкого ланцюга антитіла (CL) може бути κ (капа) або ((лямбда). Два ланцюги антитіла повної довжини зв'язані разом через внутрішньополіпептидні дисульфідні зв'язки між доменом CL і доменом CH1 і між шарнірними ділянками важких ланцюгів антитіла повної довжини. Прикладами типового антитіла повної довжини є природні антитіла типу IgG (наприклад, IgG 1 і IgG2), IgM, IgA, IgD і IgE. Антитіла повної довжини за даним винаходом можуть походити від одного виду, наприклад, від людини, або вони можуть бути химерними або гуманізованими антитілами. Антитіла повної довжини за даним винаходом включають два сайти зв'язування антигену, кожний з яких сформований парою VH і VL, причому обидва специфічно зв'язуються з тим самим антигеном. Таким чином, моноспецифічне двовалентне (= повної довжини) антитіло, яке включає перший сайт зв'язування антигену, що й складається із двох легких ланцюгів антитіла й двох важких ланцюгів антитіла, є антитілом повної довжини. C-кінець важкого й легкого ланцюга вказаного антитіла повної довжини означає останню амінокислоту із С-кінця вказаного важкого або легкого ланцюга. N-кінець важкого ланцюга або легкого ланцюга вказаного антитіла повної довжини означає останню амінокислоту з N-кінця вказаного важкого або легкого ланцюга. У переважному варіанті здійснення даного винаходу структури біспецифічних антитіл, а саме по відношенню до біспецифічних антитіл, що специфічно зв'язуються з фактором росту судинного ендотелію людини (human vascular endothelial growth factor – VEGF) і з ангіопоетином-2 людини (angiopoietin-2 – ANG-2) за даним винаходом, є двовалентними антитілами із двома різними специфічностями, наприклад, a) описаними в WO 2009/080251, WO 2009/080252 або WO 2009/080253 (антитіла с заміненими доменами – див. приклад 13) або б) заснованими на scFab-Fc гібридному антитілі, у якому один одноланцюговий фрагмент Fab (у підсумку стабілізований дисульфідним зв'язком) є специфічним у відношенні VEGF, і інший одноланцюговий фрагмент Fab (у підсумку стабілізований дисульфідним зв'язком) є специфічним у відношенні ANG-2 (див. приклад 14) або в) описаними Ridgway J.B., Protein Eng. 9, 1996, стор. 617-621; WO 96/027011; Merchant A.M. і ін., Nature Biotech 16, 1998, стор. 677-681; 17 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Atwell S. і ін., J. Mol. Biol. 270, 1997, стор. 26-35 і EP 1870459A1. В одному з варіантів здійснення даного винаходу вказане біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється включенням амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123 і SEQ ID NO: 124 або їх варіантів. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється включенням амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 і SEQ ID NO: 128 або їх варіантів. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється включенням амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131 і SEQ ID NO: 132 або їх варіантів. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється включенням амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 133, і SEQ ID NO: 134 або їх варіантів. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється включенням амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 135, і SEQ ID NO: 136 або їх варіантів. Ці амінокислотні послідовності засновані на варіабельних доменах важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 7 і варіабельних доменах легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 8 (похідній від бевацизумабу (авастину)) як перший сайт зв'язування антигену з VEGF, і на варіабельних доменах важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 52 і на варіабельних доменах легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 53 (похідній від Ang2i_LC06)) як другий сайт зв'язування антигену з ANG-2. В одному з варіантів здійснення даного винаходу вказане біспецифічне антитіло є тривалентним, що використовує, наприклад, формати, засновані на антитілі повної довжини, що специфічно зв'язується з одним із двох антигенів VEGF або ANG-2, з якими тільки з один Скінця важкого ланцюга гібридизований фрагмент scFab, який специфічно зв'язується з іншим із двох антигенів, VEGF або ANG-2, включаючи методику "виступ-у-впадину", відповідно описану, наприклад, у патентній заявці EP Appl. No 09004909.9 (див. приклад 11), або, наприклад, формати, засновані на антитілі повної довжини, що специфічно зв'язується з одним із двох антигенів, VEGF або ANG-2, з яким тільки з одного С-кінця важкого ланцюга VH або VH-CH1 фрагмента й гібридизовані з іншого С-кінця другого важкого ланцюга VL або VL-CL фрагмента, який специфічно зв'язується з іншим із двох антигенів, VEGF або ANG-2, включаючи методику "виступ-у-впадину", згідно із описом, наприклад, в EP Appl. No 09005108.7 (див. приклад 12). В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється включенням амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, і SEQ ID NO: 117 або їх варіантів. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється включенням амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, і SEQ ID NO: 120 або їх варіантів. Ці амінокислотні послідовності засновані на послідовності SEQ ID NO: 7 варіабельних доменів важкого ланцюга й послідовності SEQ ID NO: 8 варіабельних доменів легкого ланцюга (похідних від бевацизумабу (авастину)) як перший сайт зв'язування антигену, що зв'язується з VEGF, і на послідовності SEQ ID NO: 52 варіабельних доменів важкого ланцюга, і на послідовності SEQ ID NO: 53 варіабельних доменів легкого ланцюга (похідних від Ang2i_LC06)) як другий сайт зв'язування антигену, що зв'язується з ANG-2. Переважними форматами біспецифічного антитіла для біспецифічного антитіла, що специфічно зв'язуються з фактором росту судинного ендотелію (VEGF) і з ангіопоетином-2 людини (ANG-2) за даним винаходом, є чотиривалентні антитіла (TvAb) із двома різними специфічностями згідно з описом, наприклад, в WO 2007/024715, WO 2007/109254 або EP заявка № 09004909.9. Так в одному з варіантів здійснення даного винаходу вказане біспецифічне антитіло є чотиривалентним, у якому використані формати згідно з описом, наприклад, в WO 2007/024715, WO 2007/109254 або EP Appl. No 09004909.9 (див. приклади 1 або 10). В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне чотиривалентне антитіло TvAb-2441-бевацизумаб-LC06 відрізняється включенням пептиду послідовності SEQ ID No: 102 і легкого ланцюга послідовності SEQ ID No: 62 або їх варіантів. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється включенням амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 109, і SEQ ID NO: 110 або їх варіантів. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним 18 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходом відрізняється включенням амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 111, і SEQ ID NO: 112 або їх варіантів. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом відрізняється включенням амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 113, і SEQ ID NO: 114 або їх варіантів. Ці амінокислотні послідовності засновані на варіабельних доменах важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 7 і варіабельних доменах легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 8 (похідних від бевацизумабу (авастину)) як перший сайт зв'язування антигену, що зв'язується з VEGF, і на варіабельних доменах важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 52 і на варіабельних доменах легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 53 (похідних від Ang2i_LC06)) як другий сайт зв'язування антигену, що зв'язується з ANG-2. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне чотиривалентне антитіло TvAb-2441-бевацизумаб-LC08 відрізняється включенням пептиду послідовності SEQ ID No: 103 і легкого ланцюга послідовності SEQ ID No: 62 або їх варіантів. Кожний сайт зв'язування антитіла за даним винаходом може бути сформований парою двох варіабельні доменів, тобто одним варіабельним доменом важкого ланцюга й одним варіабельним доменом легкого ланцюга. Мінімальною детермінантою сайту зв'язування в антитілі є ділянка CDR3 важкого ланцюга. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом є чотиривалентним. В іншому варіанті здійснення даного винаходу вказане чотиривалентне біспецифічне антитіло відрізняється наступними ознаками: воно складається з: a) моноспецифічного двовалентне вихідного антитіла, що складається із двох важких ланцюгів антитіла повної довжини й двох легких ланцюгів антитіла повної довжини, відповідно до чого кожний ланцюг включає тільки один варіабельний домен, б) двох пептидних лінкерів, в) двох моноспецифічних одновалентних одноланцюгових антитіл, кожне з яких складається з варіабельного домену важкого ланцюга антитіла, варіабельного домену легкого ланцюга антитіла й одноланцюгового лінкеру між варіабельним доменом важкого ланцюга вказаного антитіла й варіабельного домену легкого ланцюга вказаного антитіла; і переважно вказані одноланцюгові антитіла зв'язані з тим самим кінцем (C- і N-кінцем) важких ланцюгів моноспецифічного двовалентного антитіла, або, в іншому варіанті, з тим же кінцем (переважно з C-кінцем) легких ланцюгів моноспецифічного двовалентного антитіла, і більш переважно з тим самим кінцем (C- і N-кінцем) важких ланцюгів моноспецифічного двовалентного антитіла. В іншому варіанті здійснення даного винаходу вказане біспецифічне антитіло є чотиривалентним і складається з a) антитіла повної довжини, що включає вказаний сайт зв'язування антигену, що й складається із двох важких ланцюгів антитіла й двох легких ланцюгів антитіла; і б) двох ідентичних одноланцюгових фрагментів Fab, що включають вказаний другий сайт зв'язування антигену, причому вказані одноланцюгові фрагменти Fab за пунктом б) гібридизовані із вказаним антитілом повної довжини за пунктом a) через пептидний конектор з C- або N-кінця важкого або легкого ланцюга вказаного антитіла повної довжини. В іншому варіанті здійснення даного винаходу вказане біспецифічне антитіло є чотиривалентним і складається з a) антитіла повної довжини, що включає вказаний другий сайт зв'язування антигену, що й складається із двох важких ланцюгів антитіла й двох легких ланцюгів антитіла; і б) двох ідентичних одноланцюгових фрагментів Fab, що включають вказаний перший сайт зв'язування антигену, причому вказані одноланцюгові фрагменти Fab за пунктом б) гібридизовані із вказаним антитілом повної довжини за пунктом a) через пептидний конектор з C- або N-кінця важкого або легкого ланцюга вказаного антитіла повної довжини. Переважно вказані одноланцюгові фрагменти Fab за пунктом б) гібридизовані із вказаним антитілом повної довжини за пунктом a) через пептидний конектор із С-кінця важкому ланцюгу або легкому ланцюгу вказаного антитіла повної довжини. В одному з варіантів здійснення даного винаходу два ідентичні одноланцюгові фрагмента Fab, що зв'язуються із другим антигеном, гібридизовані із вказаним антитілом повної довжини через пептидний конектор за C-кінцем кожного, важкого або легкого, ланцюга вказаного антитіла повної довжини. 19 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному з варіантів здійснення даного винаходу два ідентичні одноланцюгові фрагмента Fab, що зв'язуються із другим антигеном, гібридизовані із вказаним антитілом повної довжини через пептидний конектор за C-кінцем кожного важкого ланцюга вказаного антитіла повної довжини. В одному з варіантів здійснення даного винаходу два ідентичні одноланцюгові фрагмента Fab, що зв'язуються із другим антигеном, гібридизовані із вказаним антитілом повної довжини через пептидний конектор за C-кінцем кожного легкого ланцюга вказаного антитіла повної довжини. Такі варіанти здійснення даного винаходу, що включають одноланцюгові фрагменти Fab, більш докладно описані, наприклад, у патентній заявці EP № 09004909.9, включеній в даний винахід у вигляді посилання. Поняття "пептидний лінкер", використовуваний у даному винаході, означає пептид з амінокислотними послідовностями, який переважно є синтетичним. Ці пептидні лінкери за даним винаходом використовують для зв'язування різних антигензв'язувальних сайтів і/або фрагментів антитіла, які у результаті включають різні антигензв'язувальні сайти (наприклад, одноланцюговий фрагмент Fv, антитіла повної довжини, домен VH і/або домен VL, Fab, (Fab)2, частина Fc) разом для формування біспецифічного антитіла за даним винаходом. Пептидилінкери можуть включати одну або декілька з наступних амінокислотних послідовностей, перерахованих у табл. 1, а також інші випадковим чином вибрані амінокислоти. Вказаними пептидами-лінкерами є пептиди з амінокислотною послідовністю принаймні з 5 амінокислот у довжину, переважно принаймні з 10 амінокислот у довжину, більш переважно з 10-50 амінокислот у довжину. Переважно вказані пептиди-лінкери за пунктом б) є пептидами з амінокислотною послідовністю, що складається принаймні з 10 амінокислот. В одному з варіантів здійснення даного винаходу вказаним пептидом-лінкером є (GxS)n з G = гліцином, S = серином, (x = 3 і n=3, 4, 5 або 6) або (x=4 і n=2, 3, 4 або 5), переважно x = 4 і n=2 або 3, більш переважно з x = 4, n = 2 ((G4S)2). До вказаного пептиду-лінкеру (GxS)n можуть бути додані також додаткові G = гліцини, наприклад, GG або GGG. Поняття "одноланцюговий лінкер" у контексті даного винаходу означає пептид з амінокислотними послідовностями, який переважно є синтетичним. Такі одноланцюгові лінкери за даним винаходом використовують для зв'язування доменів VH і VL для формування одноланцюгового фрагмента Fv. Переважно вказаний одноланцюговий лінкер за пунктом в) є пептидом з амінокислотною послідовністю довжиною принаймні 15 амінокислот, більш переважно довжиною принаймні 20 амінокислот. В одному з варіантів здійснення даного винаходу вказаним одноланцюговим лінкером є (GxS)n з G = гліцином, S = серином, (x=3 і n=4, 5 або 6) або (x=4 і n=3, 4 або 5), переважно з x=4, n=4 або 5, більш переважно з x=4, n=4. Крім того, вказані одноланцюгові (одноланцюговий Fv) антитіла переважно стабілізовані дисульфідом. Така додаткова стабілізація одноланцюгового антитіла досягається впровадженням дисульфідного зв'язку між варіабельними доменами одноланцюгових антитіл і описана, наприклад, в WO 94/029350, Rajagopal V. і ін., Prot. Engin. 10(12), 1997, стор. 14531459; Kobayashi H. і ін., Nuclear Medicine & Biology 25, 1998, стор. 387-393; або Schmidt M. і ін., Oncogene 18, 1999, стор. 1711-1721. В одному з варіантів здійснення даного винаходу передбачені стабілізовані дисульфідним зв'язком одноланцюгові (одноланцюгові Fv) антитіла, причому дисульфідний зв'язок між варіабельними доменами одноланцюгового антитіла, включений в антитіло за даним винаходом, незалежно для кожного одноланцюгового антитіла вибраний з: i) положення 44 варіабельного домену важкого ланцюга стосовно варіабельного домену легкого ланцюга в положенні 100, ii) положення 105 варіабельного домену важкого ланцюга стосовно варіабельного домену легкого ланцюга в положенні 43, або iii) положення 101 варіабельного домену важкого ланцюга стосовно варіабельного домену легкого ланцюга в положенні 100. В одному з варіантів здійснення даного винаходу дисульфідний зв'язок між варіабельними доменами одноланцюгових антитіл, включених в антитіло за даним винаходом, знаходиться між варіабельним доменом важкого ланцюга в положенні 44 і варіабельним доменом легкого ланцюга в положенні 100. В одному з варіантів здійснення даного винаходу дисульфідний зв'язок між варіабельними доменами одноланцюгових антитіл, включених в антитіло за даним винаходом, знаходиться між варіабельним доменом важкого ланцюга в положенні 105 і варіабельним доменом легкого ланцюга в положенні 43. Структура такого чотиривалентного варіанта біспецифічного антитіла за даним винаходом, 20 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що специфічно зв'язується з VEGF і ANG-2, у якому одним з антигенів А або Б є VEGF, а іншим антигеном є ANG-2. Структура, заснована на антитілі повної довжини, що специфічно зв'язується з антигеном А, з яким два (необов'язково стабілізованих дисульфідним зв'язком) одноланцюгових фрагменти Fv, що специфічно зв'язуються з антигеном Б, зв'язані через пептидний лінкер; структура наведена як приклад на схемах на фіг. 1 і 2. В одному з варіантів здійснення даного винаходу вказані одноланцюгові (одноланцюгові Fv) антитіла без вказаної необов'язкової дисульфідної стабілізації між варіабельними доменами VH і VL одноланцюгового антитіла (одноланцюгового Fv) є переважними. В іншому варіанті здійснення даного винаходу вказане чотиривалентне біспецифічне антитіло відрізняється тим, що вказане моноспецифічне двовалентне антитіло за пунктом a) специфічно зв'язується з VEGF і вказані два одновалентні моноспецифічних одноланцюгових антитіла за пунктом в) зв'язуються з ANG-2. В іншому варіанті здійснення даного винаходу вказане чотиривалентне біспецифічне антитіло відрізняється тим, що вказане моноспецифічне двовалентне антитіло за пунктом a) специфічно зв'язується з ANG-2 і вказані два одновалентні моноспецифічні одноланцюгові антитіла за пунктом в) зв'язуються з VEGF. Поняття "одноланцюговий фрагмент Fab" (див. фіг. 11) означає поліпептид, що складається з варіабельного домену важкого ланцюга антитіла (VH), константного домену 1 антитіла (CH1), варіабельного домену легкого ланцюга антитіла (VL), константного домену легкого ланцюга антитіла (CL) і лінкеру, причому вказані доменні антитіла й вказаний лінкер зібрані в одному з наступних порядків у напрямку від N-кінця до C-кінця: a) VH-CH1-лінкер-VL-CL, б) VL-CL-лінкерVH-CH1, в) VH-CL-лінкер-VL-CH1 або г) VL-CH1-лінкер-VH-CL; і в якому вказаний лінкер є поліпептидом, що складаються принаймні з 30 амінокислот, переважно з 30-50 амінокислот. Вказані одноланцюгові фрагменти Fab a) VH-CH1-лінкер-VL-CL, б) VL-CL-лінкер-VH-CH1, в) VHCL-лінкер-VL-CH1 і г) VL-CH1-лінкер-VH-CL, стабілізовані через природний дисульфідний зв'язок між доменом CL і доменом CH1. Поняття "N-кінець" означає останню амінокислоту з Nкінця. Поняття "С-кінець" означає останню амінокислоту із С-кінця. У переважному варіанті здійснення даного винаходу вказані домени антитіла й вказаний лінкер у вказаному одноланцюговому фрагменті Fab мають одну з наступних організацій у напрямку від N-кінця до C-кінця: a) VH-CH1-лінкер-VL-CL, або б) VL-CL-лінкер-VH-CH1, більш переважно VL-CL-лінкер-VHCH1. В іншому переважному варіанті здійснення даного винаходу вказані домени антитіла й вказаний лінкер у вказаному одноланцюговому фрагменті Fab мають одну з наступних організацій у напрямку від N-кінця до C-кінця: a) VH-CL-лінкер-VL-CH1 або б) VL-CH1-лінкер-VH-CL. Поняття "пептидний конектор" у контексті даного винаходу означає пептид з амінокислотними послідовностями, які переважно є синтетичними. Такі пептидні конектори за даним винаходом використовують для гібридизації одноланцюгових фрагментів Fab з C- або Nкінця антитіла повної довжини для формування поліспецифічного антитіла за даним винаходом. Переважно вказані пептидні конектори за пунктом б) є пептидами з амінокислотною послідовністю, що становить у довжину принаймні 5 амінокислот, переважно 5-100, більш переважно 10-50 амінокислот. В одному з варіантів здійснення даного винаходу вказаним пептидом конектором є (GxS)n або (GxS)ngm з G = гліцином, S = серином, (x=3 і n=3, 4, 5 і m=0, 1, 2 або 3) або (x=4 і n=2, 3, 4 або 5 і m=0, 1, 2 або 3), переважно x=4 і n=2 або 3, більш переважно з x = 4, n=2. В одному з варіантів здійснення даного винаходу вказаним пептидним конектором є (G4S)2. Поняття "лінкер" у контексті даного винаходу означає пептид, переважно синтезований. Пептиди за даним винаходом використовують для зв'язування a) VH-CH1 з VL-CL, б) VL-CL з VH-CH1, в) VH-CL з VL-CH1 або г) VL-CH1 з VH-CL для формування наступних одноланцюгових фрагментів Fab за даним винаходом a) VH-CH1-лінкер-VL-CL, б) VL-CL-лінкер-VH-CH1, в) VHCL-лінкер-VL-CH1 або г) VL-CH1-лінкер-VH-CL. Вказаний лінкер у складі одноланцюгових фрагментів Fab є пептидом з амінокислотною послідовністю довжиною принаймні 30 амінокислот, переважно довжиною 32-50 амінокислот. В одному з варіантів здійснення даного винаходу вказаним лінкером є (GxS)n з G = гліцином, S = серином, (x=3 і n=8, 9 або 10 і m=0, 1, 2 або 3) або (x=4 і n= 6, 7 або 8 і m=0, 1, 2 або 3), переважно з x = 4, n=6 або 7 і m=0, 1, 2 або 3, більш переважно з x=4, n=7 і m=2. В одному з варіантів здійснення даного винаходу вказаним лінкером є (G4S)6G2. Необов'язково у вказаному одноланцюговому фрагменті Fab крім природного дисульфідного зв'язку між CL-доменом і доменом CH1 варіабельний домен важкого ланцюга антитіла (VH) і 21 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіабельний домен легкого ланцюга антитіла (VL) стабілізовані дисульфідним зв'язком шляхом впровадження дисульфідного зв'язку між наступними положеннями: i) положенням 44 у варіабельному домені важкого ланцюга й положенням 100 у варіабельному домені легкого ланцюга, ii) положенням 105 у варіабельному домені важкого ланцюга й положенням 43 у варіабельному домені легкого ланцюга, або iii) положенням 101 у варіабельному домені важкого ланцюга й положенням 100 у варіабельному домені легкого ланцюга (нумерація завжди наводиться за індексом EU за Kabat). Така додаткова стабілізація дисульфідним зв'язком одноланцюгових фрагментів Fab досягається впровадженням дисульфідного зв'язку між варіабельними доменами VH і VL одноланцюгових фрагментів Fab. Методи впровадження неприродних дисульфідних містків для стабілізації одноланцюгового фрагмента Fv описані, наприклад, в WO 94/029350, Rajagopal V. і ін., Prot. Engin. 1997, стор. 1453-1459, Kobayashi H. і ін, Nuclear Medicine & Biology, 25, 1998, стор. 387-393, або Schmidt M. і ін., Oncogene 18, 1999, стор. 1711-1721. В одному з варіантів здійснення даного винаходу оптимальний дисульфідний зв'язок між варіабельними доменами одноланцюгових фрагментів Fab, включений в антитіло за даним винаходом, знаходиться між положенням 44 у варіабельному домені важкого ланцюга й положенням 100 у варіабельному домені легкого ланцюга. В одному з варіантів здійснення даного винаходу оптимальний дисульфідний зв'язок між варіабельними доменами одноланцюгових фрагментів Fab, включених в антитіло за даним винаходом, знаходиться між положенням 105 у варіабельному домені важкого ланцюга й положенням 43 у варіабельному домені легкого ланцюга (нумерація завжди наводиться за індексом EU за Kabat). В одному з варіантів здійснення даного винаходу одноланцюговий фрагмент Fab без вказаної оптимальної стабілізації дисульфідним зв'язком між варіабельними доменами VH і VL одноланцюгових фрагментів Fab є переважним. Переважно вказаний другий варіант здійснення чотиривалентного біспецифічного антитіла за даним винаходом включає два ідентичні одноланцюгові фрагмента Fab (переважно VL-CLлінкер-VH-CH1), які обидва гібридизовані із двома С-кінцями двох важких ланцюгів або із двома С-кінцями двох легких ланцюгів вказаного антитіла повної довжини за пунктом a). Така гібридизація проводить до двох ідентичних гібридних пептидів (або i) важкого ланцюга й одноланцюгового фрагмента Fab або ii) легкого ланцюга й одноланцюгового фрагмента Fab), які спільно експресуються або з i) легким ланцюгом або важким ланцюгом антитіла повної довжини для одержання біспецифічного антитіла за даним винаходом. В іншому варіанті здійснення даного винаходу вказане біспецифічне антитіло відрізняється тим, що константна ділянка походить від людини. В іншому варіанті здійснення даного винаходу вказане біспецифічне антитіло відрізняється тим, що константна ділянка біспецифічного антитіло за даним винаходом представляє підклас IgG1 людини або підклас IgG1 людини з мутаціями L234A і L235A. В іншому варіанті здійснення даного винаходу вказане біспецифічне антитіло відрізняється тим, що константна ділянка біспецифічного антитіла за даним винаходом антитіло представляє підклас IgG2 людини. В іншому варіанті здійснення даного винаходу вказане біспецифічне антитіло відрізняється тим, що константна ділянка біспецифічного антитіла за даним винаходом представляє підклас IgG3 людини. В іншому варіанті здійснення даного винаходу вказане біспецифічне антитіло відрізняється тим, що константна ділянка біспецифічного антитіла за даним винаходом представляє підклас IgG4 людини, або підклас IgG4 з додатковою мутацією S228P. У цей час установлене, що біспецифічні антитіла проти VEGF людини й ANG-2 людини за даним винаходом мають поліпшені властивості, наприклад, біологічну або фармакологічну дію, фармакокінетичні властивості або токсичність. Вони показують підвищену in vivo дію з пригнічення росту пухлин і/або з пригнічення ангіогенезу пухлин у порівнянні з моноспецифічними вихідними антитілами проти VEGF і ANG-2 (див. приклади 16, 17 і 18: порівняння різних біспецифічних антитіл бевацизумабу-ANG2i-LC06 з моноспецифічними антитілами – тільки з авастином (бевацизумабом), тільки з ANG2i-LC06, або з обома в комбінації). Крім того, слабкий прояв побічних токсичних ефектів (який виражається в поліпшеній масі тіла дослідних тварин, а також менша загибель дослідних тварин при застосуванні in vivo) у порівнянні із застосуванням двох відповідних окремих моноспецифічних антитіл проти VEGF і ANG-2 у комбінації також проявляє перевагу біспецифічних антитіл за даним винаходом. Крім того, біспецифічні антитіла за даним винаходом можуть надати переваги, наприклад, 22 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 знижену дозу й/або частоту введення й одночасно меншу вартість. Поняття "константна ділянка", яке використовується в даному винаході, означає суму доменів антитіла, відмінних від варіабельної ділянки. Константна ділянка безпосередньо не бере участь у зв'язуванні антигену, але проявляє різні ефекторні функції. Залежно від амінокислотної послідовності константної ділянки їх важких ланцюгів антитіла ділять на класи: IgA, IgD, IgE, IgG і IgM, і деякі з них можуть бути додатково поділені на підкласи, наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4, IgA1 і IgA2. Константні ділянки важкого ланцюга, відповідні до різних класів антитіл, називаються α, δ, ε, γ, і μ, відповідно. Константні ділянки легкого ланцюга, виявлені у всіх п'яти класах антитіл, називаються  (капа) і λ (лямбда). Поняття "константна ділянка, що походить від людини", яке використовується в даному винаході, означає константну ділянку важкого ланцюга антитіла людини з підкласів IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4 і/або константну ділянку капа або лямбда легкого ланцюга. Такі константні ділянки відомі в даній галузі й, наприклад, описані Kabat E.A. (см. наприклад Johnson G. і Wu T.T., Nucleic Acids Res. 28, 2000, стор. 214-218; Kabat E.A. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 1975, стор. 2785-2788). Хоча антитіла підкласу IgG4 показують знижене зв'язування з рецептором Fc (FcγRIIIa), антитіла інших підкласів IgG проявляють міцне зв'язування. Однак Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (втрата вуглеводу Fc), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 і His435 є залишками, які у випадку зміни також забезпечують знижене зв'язування з рецептором Fc (Shields R. L. і ін., J. Biol. Chem. 276, 2001, стор. 6591-6604; Lund J. і ін., FASEB J. 9, 1995, стор. 115-119; Morgan A. і ін., Immunology 86, 1995, стор. 319-324; EP 0 307 434). В одному з варіантів здійснення даного винаходу антитіло за даним винаходом має знижене зв'язування з FcR у порівнянні з антитілом IgG1 і моноспецифічним двовалентним (повної довжини) вихідним антитілом у відношенні FcR зв'язування підкласу IgG4, або підкласу IgG1 або IgG2 з мутацією в S228, L234, L235 і/або D265, і/або містить мутацію PVA236. В одному з варіантів здійснення даного винаходу мутаціями в моноспецифічному двовалентному (повної довжини) вихідному антитілі є в IgG4 S228P і в IgG1 L234A і L235A. Константні ділянки важкого ланцюга показані в послідовностях SEQ ID NO: 35 і 36. В одному з варіантів здійснення даного винаходу константна ділянка важкого ланцюга моноспецифічного двовалентного (повної довжини) вихідного антитіла є послідовність SEQ ID NO: 35 з мутаціями L234A і L235A. В іншому варіанті здійснення даного винаходу константна ділянка важкого ланцюга моноспецифічного двовалентного (повної довжини) вихідного антитіла є послідовність SEQ ID NO: 36 з мутацією S228P. В іншому варіанті здійснення даного винаходу константна ділянка легкого ланцюга моноспецифічного двовалентного (повної довжини) вихідного антитіла є ділянкою капа легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 37 або ділянкою лямбда легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 34. Переважно константна ділянка важкого ланцюга моноспецифічного двовалентного (повної довжини) вихідного антитіла є послідовністю SEQ ID NO: 35 або SEQ ID NO: 36 з мутацією S228P. Константна ділянка антитіла безпосередньо бере участь в ADCC (antibody-dependent cellmediated cytotoxicity – антитіло-залежній клітинно-опосередкованій цитотоксичності) і CDC (complement-dependent cytotoxicity – комплемент-залежній цитотоксичності). Активація комплементу (CDC) ініціюється зв'язуванням фактора C1q комплементу з константною ділянкою антитіл більшості підкласів IgG. Зв'язування C1q з антитілом викликається певними міжбілковими взаємодіями за так званим сайтом зв'язування. Такі сайти зв'язування константної ділянки відомі в даній галузі й описані, наприклад, Lukas T.J. і ін., J. Immunol. 127, 1981, стор. 2555-2560; Brunhouse R. і Cebra J.J., Mol. Immunol. 16, 1979, стор. 907-917; Burton D.R. і ін., Nature 288, 1980, стор. 338-344; Thommesen J.E. і ін., Mol. Immunol. 37, 2000, стор. 995-1004; Idusogie E.E. і ін., J. Immunol. 164, 2000, стор. 4178-4184; Hezareh M. і ін., J. Virol. 75, 2001, стор. 12161-12168; Morgan A. і ін., Immunology 86, 1995, стор. 319-324; і EP 0 307 434. Такі сайти зв'язування константної ділянки, наприклад, відрізняються амінокислотами L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 і P329 (нумерація завжди наводиться за індексом EU за Kabat). Поняття "антитілозалежна клітинно-опосередкована цитотоксичність (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity – ADCC)» стосується лізису клітин-мішеней людини антитілом за даним винаходом в присутності ефекторних клітин. ADCC вимірюють переважно шляхом обробки препарату CCR5 експресуючих клітин з антитілом за даним винаходом в присутності ефекторних клітин, наприклад, свіжовиділених МКПК або очищених ефекторних клітин з лейкоцитних плівок, наприклад, моноцитів або природних клітин-кілерів (natural killer – NK) або ліній постійно зростаючих NK. Поняття "комплемент-залежна цитотоксичність – complement-dependent cytotoxicity (CDC)» 23 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 означає процес, ініційований зв'язуванням фактора C1q комплементу із частиною Fc більшості підкласів IgG антитіл. Зв'язування C1q з антитілом викликане певними меж білковими взаємодіями за так званим сайтом зв'язування. Такі сайти зв'язування частини Fc відомі в даній галузі (див. вище). Такі сайти зв'язування частини Fc відрізняються, наприклад, амінокислотами L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 і P329 (нумерація наводиться за індексом EU за Kabat). Антитіла підкласів IgG1, IgG2 і IgG3 звичайно проявляють активацію комплементу, включаючи зв'язування C1q і C3, а IgG4 не активує систему комплементу й не зв'язується з C1q і/або C3. Антитіло за даним винаходом одержують методами рекомбінації. Одним з об'єктів даного винаходу є нуклеїнова кислота, що кодує антитіло за даним винаходом, а іншим об'єктом – клітини, що включають вказану нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло за даним винаходом. Одержання антитіл методами рекомбінації відомо в даній галузі й включає експресію білка в прокаріотичних і еукаріотичних клітинах з наступним виділенням антитіла й звичайно очищенням до фармацевтично прийнятної чистоти. Для експресії антитіл, вказаної вище в клітинах-хазяїнах, нуклеїнові кислоти, що кодують відповідним чином модифіковані легкі й важкі ланцюги, інсертовані у вектори експресії стандартними методами. Експресію проводять у відповідних прокаріотичних або еукаріотичних клітинах-хазяїнах, наприклад, клітинах CHO, клітинах NS0, клітинах SP2/0, клітинах HEK293, клітинах COS, клітинах PER.C6, у клітинах дріжджів або E.coli, і антитіло виділяють із клітин (супернатанту або клітин після лізису). Основні методи рекомбінантного одержання антитіл відомі в даній галузі й описані, наприклад, в оглядових статтях Makrides S.C., Protein Expr. Purif. 17, 1999, стор. 183-202; Geisse S. і ін., Protein Expr. Purif. 8, 1996, стор. 271-282; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16, 2000, стор. 151-160; Werner R.G., Drug Res. 48, 1998, стор. 870-880. Біспецифічні антитіла відповідним чином відокремлюють від культурального середовища за допомогою звичайних методів очищення імуноглобуліну, наприклад, хроматографією на білку Асефарозі, гідроксилапатиті, гель-електрофорезом, діалізом або афінною хроматографією. ДНК і РНК, що кодують моноклональні антитіла, легко виділити й секвенувати за допомогою звичайних методів. Гібридомні клітини можуть служити джерелом таких ДНК і РНК. Після виділення ДНК може бути інсертована у вектори експресії, які потім трансфекують у клітинихазяїни, наприклад, клітини HEK 293, клітини CHO або клітини мієломи, які в інших обставинах не виробляють білок імуноглобулін, для синтезу рекомбінантних моноклональних антитіл у клітинах-хазяїнах. Варіанти (або мутанти) амінокислотних послідовностей біспецифічного антитіла одержують шляхом інтродукції відповідних нуклеотидних змін у ДНК антитіла або шляхом нуклеотидного синтезу. Такі модифікації можуть бути виконані, однак у вкрай обмеженому діапазоні, наприклад, описаному вище. Наприклад, модифікації не змінюють вказані вище властивості антитіла, наприклад, ізотип IgG і зв'язування антигену, але можуть поліпшити вихід рекомбінантного продукту, стабільність білка або сприяти очищенню. Поняття "клітина-хазяїн" у контексті даного винаходу означає який-небудь тип клітинної системи, який може бути сконструйований для вироблення антитіл за даним винаходом. В одному з варіантів здійснення даного винаходу як клітини-хазяїни використовують клітини HEK293 і клітини CHO. У контексті даного винаходу поняття "клітини" і "лінія клітин" використовують взаємозамінно, а також включають наступні генерації цих клітин. Таким чином, поняття "трансформанти" і "трансформовані клітини" включають первинні клітини суб'єкта й культури, похідні від них незалежно від числа пересівань. Також слід враховувати, що всі наступні генерації клітин можуть бути повністю неідентичними за ДНК через ретельно сплановані або випадкові мутації. До цих понять також належать варіанти клітин наступної генерації, які мають ту ж біологічну дію або функцію, що виявляються при скринінгу первинно трансформованих клітин. Експресію в клітинах NS0 описують, наприклад, Barnes L.M. і ін., Cytotechnology 32, 2000, стор. 109-123; Barnes L.M. і ін., Biotech. Bioeng. 73, 2001, стор. 261-270. Короткочасну експресію описують, наприклад, Durocher Y. і ін., Nucl. Acids. Res. 30 E9, 2002. Клонування варіабельних доменів описане Orlandi R. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, стор. 3833-3837; Carter P. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, стор. 4285-4289; Norderhaug L. і ін., J. Immunol. Methods 204, 1997, стор. 77-87. Переважна система короткочасної експресії (HEK 293) описана Schlaeger E.-J. і Christensen K., Cytotechnology 30, 1999, стор. 71-83, і Schlaeger E.-J., J. Immunol. Methods 194, 1996, стор. 191-199. Контрольні послідовності, застосовні для прокаріот, наприклад, включають промотор, необов'язково послідовності оператора й сайту зв'язування рибосоми. Відомо, що еукаріотичні клітини використовують промотори, енхансери й сигнали поліаденілування. 24 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Нуклеїнова кислота є "оперативно зв'язаною", якщо вона встановлена у функціональному зв'язку з іншою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, ДНК передпослідовності або секреторного лідера оперативно зв'язана із ДНК поліпептиду, якщо вона експресується як білокпопередник, який бере участь у секреції поліпептиду; промотор або енхансер оперативно зв'язані з кодуючою послідовністю, якщо вона впливає на транскрипцію послідовності; або сайт зв'язування рибосоми є оперативно зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він розташовується таким чином, щоб сприяти трансляції. Звичайне поняття "оперативно зв'язаний" означає, що послідовності ДНК, будучи зв'язаними, є суміжними, і, у випадку секреторного лідера, стикаються й знаходяться у рамці зчитування. Однак енхансери необов'язково повинні бути суміжними. Зв'язування доповнюється лігуванням за відповідними сайтами рестрикції. Якщо таких сайтів нема, синтетичні олігонуклеотидні праймери або лінкери використовують відповідно до звичайної практики. Очищення антитіл проводять для елімінації клітинних компонентів або інших контамінантів, наприклад, інших нуклеїнових кислот або білків, стандартними методами, що включають обробку лугом/SDS, розшарування при центрифугуванні в градієнті Cscl, колонкову хроматографію, гель-електрофорез в агарозі, і іншими відомими в даній галузі методами. Див. кн.: "Current Protocols in Molecular Biology", 1987, під ред. Ausubel F. і ін., вид-во Greene Publishing and Wiley Interscience, Нью-Йорк. Різні методи були розроблені й широко застосовуються для очищення білка, наприклад, афінна хроматографія з мікробними білками (наприклад, афінна хроматографія з білком А або білком G), іонообмінна хроматографія (наприклад, катіонобмінна хроматографія (карбоксиметильні смоли), аніонообмінна хроматографія (аміноетильні смоли) і хроматографія змішаної дії), тіофільна адсорбція (наприклад, з бета-меркаптоетанолом і іншими SH лігандами), хроматографія гідрофобної взаємодії або ароматичної адсорбції (наприклад, з феніл-сефарозою, аза-аренофільними смолами або м-амінофенілборною кислотою), афінна хроматографія з хелатами металів (наприклад, з Ni(II)- і Cu(II)-афінним матеріалом), ексклюзійна хроматографія й електрофоретичні методи (наприклад, електрофорез, капілярний електрофорез) (Vijayalakshmi M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75, 1998, стор. 93-102). Одним з об'єктів даного винаходу є фармацевтична композиція, яка включає антитіло за даним винаходом. Іншим об'єктом даного винаходу є застосування антитіла за даним винаходом для одержання фармацевтичної композиції. Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб одержання фармацевтичної композиції, що включає антитіло за даним винаходом. В іншому об'єкті даного винаходу передбачена композиція, наприклад, фармацевтична композиція, яка містить антитіло за даним винаходом, перероблене разом з фармацевтичним носієм. В одному з варіантів здійснення даного винаходу біспецифічне антитіло за даним винаходом призначене для лікування раку. Іншим об'єктом даного винаходу є вказана фармацевтична композиція для лікування раку. Іншим об'єктом даного винаходу є застосування антитіла за даним винаходом для одержання лікарського засобу для лікування раку. Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб лікування пацієнта, хворого на рак, шляхом введення антитіла за даним винаходом пацієнтові, який потребує такого лікування. У контексті даного винаходу поняття "фармацевтичний носій" включає який-небудь або всі розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні й протигрибкові агенти, ізотонічні агенти й агенти затримки усмоктування, а також інші фізіологічно сумісні агенти. Переважно носій застосовується для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, парентерального, спінального або епідермального введення (наприклад, ін'єкцією або інфузією). Композиція за даним винаходом може вводитися різними способами, відомими в даній галузі. Фахівцям відомо, що спосіб застосування й/або спосіб введення можуть варіювати залежно від необхідного результату. Для введення сполуки за даним винаходом певними способами введення може знадобитися нанесення покриття на сполуку або спільне введення матеріалу, що попереджає інактивацію сполуки. Наприклад, сполука може вводитися суб'єктові на відповідному носії, наприклад, у ліпосомах або розчиннику. До фармацевтично прийнятних розчинників належать фізіологічний розчин і водні буферні розчини. До фармацевтичних носіїв належать стерильні водні розчини або дисперсії, а також стерильні порошки для швидкого одержання стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій. Застосування таких середовищ і агентів для фармацевтично діючих речовин відоме в даній галузі. У контексті даного винаходу фрази "парентеральне введення" або "введені парентерально" означають способи введення, що відрізняються від введення всередину й місцевого введення, 25 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 звичайно здійснюваного шляхом ін'єкції, і означають, але ними не обмежуються, внутрішньовенне, внутрішньом'язове, внутрішньоартеріальне, інтратекальне, інтракапсулярне, внутрішньоочне, інтракардіальне, внутрішньошкірне, внутрішньоочеревинне, внутрішньотрахеальне, підшкірне, субкутикулярне, внутрішньосуглобове, внутрішньокапсулярне, субарахноїдально, епідурально й надчревне введення ін'єкцією або інфузією. Поняття "рак", яке використовується в даному винаході, стосується проліферативних захворюванням, наприклад, лімфом, лімфоцитарних лейкозів, раку легень, недрібноклітинного раку легень, бронхоальвеолярного раку легень, раку кісток, раку підшлункової залози, раку шкіри, раку голови й шиї, шкірної і внутрішньоочної меланоми, раку матки, раку яєчника, раку прямої кишки, раку анальної ділянки, раку шлунка, раку товстої кишки, раку грудей, раку матки, карциноми фалопієвих труб, карциноми ендометрію, карциноми шийки матки, карциноми піхви, карциноми вульви, ходжкінської лімфоми, раку стравоходу, раку тонкого кишечнику, раку ендокринної системи, раку щитовидки, раку паращитовидки, раку надниркової залози, саркоми м'яких тканин, раку уретри, раку пенісу, раку простати, раку сечового міхура, раку нирки або сечоводу, світлоклітинному раку, карциноми ниркової миски, мезотеліоми, гепатоклітинного раку, раку жовчних шляхів, неоплазм центральної нервової системи (ЦНС), раку хребта, гліоми стовбура мозку, мультиформної гліоми, астроцитоми, шванози, епендимом, медулобластоми, менінгіоми, плоскоклітинної карциноми, пітуїтарної аденоми й саркоми Юінга, включаючи стійкі версії якої-небудь із вказаних вище форм раку або комбінацію вказаних вище однієї або декількох форм раку. Іншим об'єктом даного винаходу є біспецифічне антитіло за даним винаходом або вказана фармацевтична композиція як анти-ангіогенний агент. Такий антиангіогенний агент може застосовуватися для лікування раку, особливо солідних пухлин, і інших судинних захворювань. В одному з варіантів здійснення даного винаходу представлене біспецифічне антитіло за даним винаходом для лікування судинних захворювань. В іншому варіанті здійснення даного винаходу представлена вказана фармацевтична композиція для лікування судинних захворювань. Іншим об'єктом за даним винаходом є застосування антитіла за даним винаходом для одержання лікарського засобу для лікування судинних захворювань. Іншим об'єктом за даним винаходом є спосіб лікування пацієнта із судинними захворюваннями шляхом введення антитіла за даним винаходом пацієнтові, який потребує такого лікування. До поняття "судинні захворювання" належать рак, запальні захворювання, атеросклероз, ішемія, травми, сепсис, хронічне обструктивне захворювання легень (ХОЗЛ), астма, діабет, СДС, ретинопатія, удар, ожиріння, гостре ушкодження легень, крововилив, судинні витікання, наприклад, індуковане цитокіном, алергія, хвороба Грейвса, аутоімунний тиреоїдит Хашимото, ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура, гігантоклітинний артеріїт, ревматоїдний артрит, системний червоний вовчок (ВКВ), вовчанковий нефрит, хвороба Крона, розсіяний склероз, виразковий коліт, особливо солідні пухлини, внутрішньоочні судинні синдроми, наприклад, проліферативні ретинопатії або стареча дегенерація сітківки (СДС), ревматоїдний артрит і псоріаз (Folkman J. і ін., J. Biol. Chem. 267, 1992, стор. 10931-10934; Klagsbrun M. і ін., Annu. Rev. Physiol. 53, 1991, стор. 217-239; і Garner A. у кн.: "Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach", 1994, під ред. Garner A. і Klintworth G.K., 2-е вид., вид-во Marcel Dekker, Нью-Йорк, стор. 1625-1710). Ці композиції також можуть містити ад'юванти, наприклад, консерванти, зволожувальні агенти, емульгуючі агенти й диспергуючі агенти. Гарантованого попередження наявності мікроорганізмів можна досягти й описаними вище процедурами стерилізації, і включенням різних антибактеріальних і протигрибкових агентів, наприклад, парабену, хлорбутанолу, фенолу, сорбінової кислоти й ін. Може бути бажаним включення в композиції ізотонічних агентів, наприклад, цукрів, натрію хлориду й інших. Крім того, пролонговане всмоктування ін'єкційної фармацевтичної форми може бути досягнуте, наприклад, включенням агентів, які відкладають усмоктування, наприклад, моностеарату алюмінію й желатину. Незалежно від вибраного способу введення сполук за даним винаходом, які можуть застосовуватися у відповідній гідратованій формі, і/або фармацевтичних композицій даного винаходу переробляють у фармацевтично прийнятні лікарські форми шляхом звичайних методів, відомих фахівцям у даній галузі. Фактичні рівні дозування діючих інгредієнтів у фармацевтичних композиціях за даним винаходом можуть варіювати таким чином, щоб одержати кількість діючого інгредієнта, ефективну для досягнення необхідної терапевтичної відповіді для конкретного пацієнта, 26 UA 104153 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 композиції й способу введення без токсичності для пацієнта. Вибраний рівень дозування може залежати від різних фармакокінетичних факторів, включаючи дію певних композицій за даним винаходом, способу введення, часу введення, швидкості екскреції певної сполуки, що вводиться, тривалості лікування, інших лікарських засобів, сполук і/або матеріалів, використовуваних у комбінації з певними використовуваними композиціями, віку, статі, маси тіла, стану, загального стану здоров'я й історії хвороби пацієнта, що піддається лікуванню, й інших факторів, відомих у медицині. Композиція повинна бути стерильною й рідкою настільки, щоб композиція могла вводитися шприцом. Крім води носієм переважно є ізотонічний буферний сольовий розчин. Належна плинність може підтримуватися, наприклад, застосуванням покривних матеріалів, наприклад, лецитину, підтримкою необхідного розміру частинок у випадку дисперсії й використанням поверхнево-активних речовин. У багатьох випадках переважно включати в композиції ізотонічні агенти, наприклад, цукри, поліатомні спирти, наприклад, маніт або сорбіт і хлорид натрію. У контексті даного винаходу поняття експресії "клітин", "клітинної лінії" і "культури клітин" використовують взаємозамінно, і всі ці позначення також включають потомство вказаних клітин. Таким чином, терміни "трансформанти" і "трансформовані клітини" включають первинні клітини суб'єкта й отримані від нього культури клітин незалежно від числа пересівань. Також слід враховувати, що все потомство може бути в точності неідентичним за вмістом ДНК через планові або випадкові мутацій. Варіанти потомства клітин, які мають ту ж функцію або біологічну дію, які піддавали скринінгу у вихідних трансформованих клітин, також стосуються вказаних термінів. Якщо маються на увазі інші значення, це буде зрозуміло з контексту. Поняття "трансформація" у контексті даного винаходу стосується процесу переносу векторів/нуклеїнової кислоти в клітину-хазяїна. Якщо клітини без важкоподоланих бар'єрів у вигляді клітинних стінок використовують як клітини-хазяїни, трансфекцію проводять, наприклад, методом осадження фосфатом кальцію, описаним Graham F.L. і Van der Eb A.J., Virology 52, 1978, стор. 546 і наступні. Однак також можуть застосовуватися інші способи інтродукції ДНК у клітини, наприклад, ін'єкцією в ядро або гібридизацією протопластів. Якщо використовують прокаріотичні клітини або клітини з міцною будовою клітинної стінки, наприклад, одним з методів трансфекції є обробка кальцієм, що використовує хлорид кальцію згідно з описом Cohen S.N. і ін, PNAS. 69, 1972, стор. 2110-2114. У контексті даного винаходу поняття "експресія" стосується процесу, за допомогою якого нуклеїнова кислота транскрибується в іРНК, і/або процесу, за допомогою якого транскрибована іРНК (яка також називається транскриптом) послідовно транслюється в пептиди, поліпептиди або білки. Транскрипти й кодовані поліпептиди в сукупності називаються генним продуктом. Якщо полінуклеотид походить від геномної ДНК, експресія в еукаріотичних клітинах може включати сплайсинг іРНК. Поняття "вектор" означає молекулу нуклеїнової кислоти, зокрема яка самореплікується, яка переносить інсертовану молекулу нуклеїнової кислоти в і/або між клітинами-хазяїнами. До цього поняття належать вектори, які діють в основному для інсерції ДНК або РНК у клітину (наприклад, інтеграція в хромосому), реплікації векторів, функція яких переважно полягає в реплікації ДНК або РНК, і вектори експресії, які діють для транскрипції й/або трансляції ДНК або РНК. Також до цього поняття належать вектори, які забезпечують більше однієї з описаних функцій. Поняття "вектор експресії" означає полінуклеотид, який при впровадженні в певні клітинихазяїни, може бути транскрибований і трансльований у поліпептид. Поняття "система експресії" звичайно стосується відповідних клітин-хазяїв, що включають вектор експресії, який може функціонувати для одержання експресованого продукту. Опис амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 CDR3 важкого ланцюга, бевацизумаб CDR2 важкого ланцюга, бевацизумаб CDR1 важкого ланцюга, бевацизумаб CDR3 легкого ланцюга, бевацизумаб CDR2 легкого ланцюга, бевацизумаб CDR1 легкого ланцюга, бевацизумаб Варіабельний домен важкого ланцюга, VEGF>бевацизумаб Варіабельний домен легкого ланцюга, бевацизумаб 50 27 UA 104153 C2 Опис амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 57 SEQ ID NO: 58 SEQ ID NO: 59 SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 61 SEQ ID NO: 62 CDR3 важкого ланцюга, ранібізумаб CDR2 важкого ланцюга, ранібізумаб CDR1 важкого ланцюга, ранібізумаб CDR3 легкого ланцюга, ранібізумаб CDR2 легкого ланцюга, ранібізумаб CDR1 легкого ланцюга, ранібізумаб Варіабельний домен важкого ланцюга, ранібізумаб Варіабельний домен легкого ланцюга, ранібізумаб CDR3 важкого ланцюга, HuMab G6-31 CDR2 важкого ланцюга, HuMab G6-31 CDR1 важкого ланцюга, HuMab G6-31 CDR3 легкого ланцюга, HuMab G6-31 CDR2 легкого ланцюга, HuMab G6-31 CDR1 легкого ланцюга, HuMab G6-31 Варіабельний домен важкого ланцюга, HuMab G6-31 Варіабельний домен легкого ланцюга, HuMab G6-31 CDR3 важкого ланцюга, Mab 536 CDR2 важкого ланцюга, Mab 536 CDR1 важкого ланцюга, Mab 536 CDR3 легкого ланцюга, Mab 536 CDR2 легкого ланцюга, Mab 536 CDR1 легкого ланцюга, Mab 536 Варіабельний домен важкого ланцюга, Mab 536 Варіабельний домен легкого ланцюга, Mab 536 (G4S)4 лінкер Константна ділянка легкого ланцюга лямбда Константна ділянка важкого ланцюга людини, похідна від IgG1 Константна ділянка важкого ланцюга людини, похідна від IgG4 Константна ділянка легкого ланцюга капа CDR3 важкого ланцюга, Ang2s_R3_LC03 CDR2 важкого ланцюга, Ang2s_R3_LC03 CDR1 важкого ланцюга, Ang2s_R3_LC03 CDR3 легкого ланцюга, Ang2s_R3_LC03 CDR2 легкого ланцюга, Ang2s_R3_LC03 CDR1 легкого ланцюга, Ang2s_R3_LC03 Варіабельний домен важкого ланцюга, Ang2s_R3_LC03 Варіабельний домен легкого ланцюга, Ang2s_R3_LC03 CDR3 важкого ланцюга, Ang2i_LC06 CDR2 важкого ланцюга, Ang2i_LC06 CDR1 важкого ланцюга, Ang2i_LC06 CDR3 легкого ланцюга, Ang2i_LC06 CDR2 легкого ланцюга, Ang2i_LC06 CDR1 легкого ланцюга, Ang2i_LC06 Варіабельний домен важкого ланцюга, , Ang2i_LC06 Варіабельний домен легкого ланцюга, Ang2i_LC06 CDR3 важкого ланцюга, Ang2i_LC07 CDR2 важкого ланцюга, Ang2i_LC07 CDR1 важкого ланцюга, Ang2i_LC07 CDR3 легкого ланцюга, Ang2i_LC07 CDR2 легкого ланцюга, Ang2i_LC07 CDR1 легкого ланцюга, Ang2i_LC07 Варіабельний домен важкого ланцюга, Ang2i_LC07 Варіабельний домен легкого ланцюга, Ang2i_LC07 CDR3 важкого ланцюга, Ang2k_LC08 28