Cd154-зв’язувальний білок та його застосування

Реферат: Винахід належить до CD154-зв’язувального білка (антитіла), молекули нуклеїнової кислоти, що його кодує, вектора, клітини-хазяїна, способу одержання антитіла, композиції та застосування даного білка у приготуванні лікарського засобу для лікування або профілактики стану, порушення або захворювання людини, опосередкованого у цілому або частково сигнальним шляхом за участі CD40. UA 100513 C2 (12) UA 100513 C2 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 За даною заявкою вимагається пріоритет за попередньою заявкою на патент США № 60/920495, поданою 27 березня 2007, попередньою заявкою на патент США № 60/919938, поданою 22 березня 2007, і попередньою заявкою на патент США № 60/919816, поданою 22 березня 2007. Зміст заявок США № 60/920495, 60/919938 і 60/919816 у повному обсязі включений у даний документ за допомогою посилання. Галузь техніки, якої стосується винахід Даний винахід стосується зв'язувальних білків, що включають антитіла, похідні антитіл і фрагменти антитіл, які специфічно зв'язуються з білком CD154 (CD40L). Також даний винахід стосується химерного, гуманізованого і повністю людського антитіла, похідного антитіла або фрагмента антитіла, які специфічно зв'язуються з епітопом, з яким специфічно зв'язується гуманізований Fab-фрагмент, що містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга SEQ ID NO:1, і що містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга SEQ ID NO:2. CD154-зв'язувальні білки за даним винаходом можуть виявляти знижену ефекторну функцію у порівнянні з другим анти-CD154-антитілом. CD154-зв'язувальні білки за даним винаходом є придатними для діагностичних і терапевтичних способів, наприклад, при лікуванні і профілактиці захворювань, включаючи такі, у розвитку яких беруть участь небажані імунні реакції у відповідь, які опосередковуються взаємодіями CD154-CD40. Рівень техніки Генерація гуморальних і клітинних імунних реакцій регулюється взаємодією активованих Тклітин-хелперів з антигенпрезентуючими клітинами ("APC") і ефекторними Т-клітинами. Активація Т-клітин-хелперів залежить не тільки від взаємодії з антигенспецифічним рецептором Т-клітин ("TCR") із його спорідненим пептидом-лігандом МНС, але також є необхідними скоординовані зв'язування та активація під дією ряду адгезії клітин і костимулювальних молекул. Наприклад, дивися Salazar-Fontana L.I. і Bierer B.E., 2001, Curr. Opin. Hemat. 8:5. Однією критичною костимулювальною молекулою є CD154, трансмембранний білок типу II, + який експресується на поверхні CD4 Т-клітин залежним від активації, обмеженим у часі чином. + CD154 також експресується, після активації, на субпопуляції CD8 Т-клітин, базофілах, гладких клітинах, еозинофілах, природних клітинах-кілерах, В-клітинах, макрофагах, дендритних клітинах і тромбоцитах. Протирецептором CD154, тобто CD40, є мембранний білок типу I, який конститутивно і на високому рівні експресується на поверхні клітин багатьох типів, включаючи APC. Дивися, наприклад, Foy T.M. et al., 1996, Ann. Rev. Immunol., 14:591. Сигнальний шлях через CD40 за участю CD154 ініціює каскад подій, які призводять до + активації клітин, що несуть CD40-рецептор, та оптимального CD4 Т-клітинного праймування. Конкретніше, зв'язування CD154 із CD40 стимулює диференціювання В-клітин у клітини, що секретують антитіла, і В-клітини пам'яті. Дивися, наприклад, Burkly L.C., 2001, In Adv. Exp. Med. Bio., vol. 489., D.M.Monroe et al., eds., Kluwer Academic/Plenum Publishers, p. 135 (далі у тексті "Burkly, вище"). Крім того, взаємодія CD154-CD40 стимулює розвиток клітинних імунних реакцій за допомогою активації макрофагів і дендритних клітин і продукцію природних клітин-кілерів і цитотоксичних Т-лімфоцитів. Дивися, наприклад, Burkly, вище. Важлива роль CD154 у регуляції функції гуморальних і клітинних імунних реакцій викликала великий інтерес до застосування інгібіторів даного шляху для терапевтичної імуномодуляції. Було показано, що анти-CD154-антитіла мають цілющі властивості на широкому ряді моделей імунної відповіді на інші терапевтичні білки або генну терапію, алергени, при автоімунних захворюваннях і трансплантації. Дивися, наприклад, патент США № 5474771, Burkly, вище. Було показано, що взаємодія CD40-CD154 є важливою при декількох індукованих в експерименті автоімунних захворюваннях, де було встановлено, що індукцію захворювання можна блокувати антагоністами CD154 під час введення антигену (Burkly, вище). Також було показано пригнічення розвитку захворювання з використанням антагоністів CD154 на моделях спонтанного автоімунного захворювання на тваринах. Дивися, наприклад, Burkly, вище. У цей час існує потреба в удосконалених анти-CD154-антитілах із вищою афінністю зв'язування і меншими небажаними побічними ефектами. Підвищені "ефекторні функції", такі як пряма цитотоксичність, комплементзалежна цитотоксичність ("CDC"), антитілозалежна цитотоксичність ("ADCC") та аномальна продукція антитіл, являють собою небажані побічні ефекти, що можуть бути пов'язані з застосуванням терапевтичних антитіл. Декілька ефекторних функцій антитіл опосередковуються, принаймні, частково Fcрецепторами (FcR), які зв'язуються з Fc-ділянкою антитіла в константному домені типового імуноглобуліну. Існує ряд Fc-рецепторів, які є специфічними для різних класів імуноглобулінів. Дані класи імуноглобулінів включають IgG, IgE, ІgA, IgM і IgD. Класи імуноглобулінів додатково підрозділяють на підкласи: IgG розділяють на чотири підкласи (IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4) і ІgA підрозділяють на два підкласи (ІgA1 і ІgA2). Існує три відомих рецептори для IgG: FcRI (CD64), 1 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 FcRII (CD32) і FcRIII (CD16). Кожен підклас FcR кодується двома або трьома генами, і альтернативний сплайсинг РНК призводить до утворення безлічі транскриптів і широкої різноманітності ізоформ FcR. Як правило, імуноглобуліни являють собою молекули Y-подібної форми, що містять два ідентичні важкі ланцюги і два ідентичні легкі ланцюги. Дисульфідні зв'язки зв'язують разом пари важкого і легкого ланцюгів, у також два важкі ланцюги. Кожен ланцюг складається з одного варіабельного домену, який варіює за послідовністю і є відповідальним за зв'язування з антигеном; ці домени відомі, як VH- і VL-домени для важкого і легкого ланцюгів відповідно. У легкому ланцюзі є один константний домен (CL) і у важкому ланцюзі знаходиться три константних домени (СН1, СН2 і СН3). Молекули, що містять усі варіабельні і константні домени, можна віднести до цілих антитіл. Залишки у варіабельних доменах антитіла звичайно нумерують відповідно до системи, розробленої Kabat et al. Дана система була представлена в Kabat et al., 1987 у Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (далі у тексті "Kabat et al., вище"). Дана система нумерації використовується в цьому документі, за винятком тих випадків, коли зазначено інакше. Слід зазначити, що позначення залишків відповідно до системи Kabat не завжди безпосередньо відповідає лінійній нумерації амінокислотних залишків. Фактична лінійна амінокислотна послідовність може містити менше, або, навпроти, більше амінокислот у порівнянні зі строгою нумерацією за Kabat, що відповідає укороченню або вставці структурного компонента, каркасної ділянки або ділянки (CDR) основної структури варіабельного домену, що визначає комплементарність. Правильну нумерацію залишків за Kabat можна визначити для даного антитіла вирівнюванням гомологічних залишків у послідовності антитіла зі "стандартною", нумерованою за Kabat послідовністю. У варіабельних доменах є три ділянки, які є гіперваріабельними за послідовністю в чотирьох більш консервативних каркасних ділянках. Дані гіперваріабельні ділянки CDR в основному відповідальні за розпізнавання антигену. Ділянки CDR варіабельного домену важкого ланцюга розташовані в залишках 31-35 (CDR-Н1), залишках 50-65 (CDR-Н2) і залишках 95-102 (CDR-Н3) відповідно до системи нумерації Kabat. Однак відповідно до системи Chothia (Chothia C. and Lesk A.M., J. Mol. Biol., 1987, 196:901-917) петля, еквівалентна CDR-Н1, поширюється від залишку 26 до залишку 32. Таким чином, "CDR-Н1", у тому значенні, в якому цей термін використовується в даному документі, також включає CDR, розташований у залишках 26-35, як описано при сполученні системи нумерації за Kabat і топологічного визначення петлі за Chothia. Ділянки CDR варіабельного домену легкого ланцюга розташовані в залишках 24-34 (CDR-L1), залишках 50-56 (CDR-L2) і залишках 89-97 (CDR-L3) відповідно до системи нумерації Kabat. Незважаючи на те, що природні антитіла, у вигляді цілих антитіл або у вигляді фрагментів, що зберігають специфічні зв'язувальні властивості, спочатку були одержані від одного виду, генно-інженерні антитіла можуть походити від більш ніж одного виду тварин, наприклад, химерні антитіла. До цього часу, головним чином, були одержані химерні мишачі/людські антитіла і мишачі/антитіла приматів, які відрізняються від людини, хоча, можливі інші видові гібридні комбінації. У цей час відомо багато інших конфігурацій природних і генно-інженерних поліпептидів антитіл та їхніх похідних, і фрагментів. Загальною властивістю для усіх є те, що поліпептид або поліпептиди зберігають специфічність зв'язування антигену за допомогою одного або більше доменів, що зв'язуються з епітопом. Крім зв'язування з епітопом функціональні властивості поліпептиду антитіла можуть розрізнятися залежно від того, які інші послідовності присутні, наприклад, Fc-домени або інші послідовності, які активують ефекторні функції і/або взаємодіють з іншими клітинними шляхами. CD154-зв'язувальні білки, які містять епітоп-зв'язувальні домени (такі як ділянки CDR або варіабельні домени), включені в основу або каркас, які відрізняються від імуноглобулінів (дивися, наприклад, Binz et al., 2005, Nat. Biotech., 23:1257-1268; Hosse et al., 2006, Protein Science, 15:14-27), можуть виявляти знижені ефекторні функції. Бажано мати нові зв'язувальні білки, які специфічно перешкоджають зв'язуванню CD154 з CD40, і знижують або елімінують у прямому напрямку функції комплексу CD154-CD40. Було б бажаним мати CD154-зв'язувальні білки, такі як анти-CD154-антитіла, зі зниженими ефекторними функціями у порівнянні з відомими анти-CD154-антитілами. Суть винаходу Даний винахід стосується рішення даних та інших проблем одержанням зв'язувального білка, такого як виділене, рекомбінантне або синтетичне антитіло, або його фрагмент або похідне, які специфічно зв'язуються з білком CD154, який може являти собою людський білок CD154. Анти-CD154-антитіла за винаходом, включаючи їхні фрагменти і похідні, можуть являти собою моноклональні, поліклональні, мишачі, химерні, приматизовані, гуманізовані або 2 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 повністю людські антитіла. Анти-CD154-антитіла за винаходом можуть бути мультимерними, гетеродимерними, гемідимерними, моновалентними, бівалентними, тетравалентними, біспецифічними і можуть включати одноланцюгові антитіла; та їхні похідні. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальні білки, наприклад, анти-CD154-антитіла, за даним винаходом, мають високу селективність стосовно CD154 і, у деяких варіантах здійснення, також мають одну або більше знижених ефекторних функцій порівняно, наприклад, з анти-CD154-антитілом 5с8 (продукованим гібридомою, депонованою в АТСС під інвентарним номером НВ 10916, як описано в патенті США № 5474771; або гуманізоване антитіло 5с8). Деякі з CD154-зв'язувальних білків, наприклад, анти-CD154-антитіла, за винаходом є моновалентними стосовно зв'язування з CD154. CD154-зв'язувальні білки та анти-CD154-антитіла (включаючи фрагменти і похідні антитіл) за винаходом є придатними для інгібування зв'язування CD154 із CD40 і роблять це з високою специфічністю, наприклад, зі значенням IC50 у межах від 20 пкМ до 1,5 мкМ, включно. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальні білки, наприклад, анти-CD154-антитіла за винаходом можуть мати значення IC50 у межах від 20 пкМ до 500 пкМ, 50 пкМ до 500 пкМ або від 100 пкМ до 500 пкМ. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальні білки та анти-CD154-антитіла (включаючи фрагменти і похідні антитіл) за винаходом по суті не чинять агоністичної дії на активність CD40. Деякі варіанти здійснення даного винаходу стосуються CD154-зв'язувальних білків, наприклад, анти-CD154-антитіл, які виявляють високу афінність до людського CD154. Наприклад, у деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-CD154антитіло, дисоціює від людського CD154 (людського CD40L) зі значенням KD у межах від 50 нМ до 1 пкМ включно за даними поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, Biacore). Наприклад, KD для людського CD154 може складати від 50 пкМ до 1 пкМ, від 20 пкМ до 1 пкМ або навіть від 10 пкМ до 1 пкМ. У деяких варіантах здійснення KD для людського CD154 складає менше ніж 20 пкМ. В інших варіантах здійснення KD для людського CD154 складає менше ніж 10 пкМ. У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується CD154-зв'язувального білка, наприклад, анти-CD154-антитіла, який, коли знаходиться в насичувальних концентраціях або вище для зв'язування з CD154, ґрунтуючись на його афінності зв'язування, здатний блокувати зв'язування антитіла 5с8 із CD154, у тому випадку, коли його додають до CD154 першим, і також здатний витісняти антитіло 5с8, зв'язане з CD154, у тому випадку, коли його додають до CD154 після антитіла 5с8. У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білком CD154 і яке містить або складається з послідовності(ей) однієї або декількох CDR (Н) важкого ланцюга, вибраних із CDR-H1 (SEQ ID NO:3), CDR-H2 (SEQ ID NO:4) і CDR-H3 (SEQ ID NO:5). У додаткових варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається, принаймні, із двох CDR, вибраних із CDR-H1 (SEQ ID NO:3), CDR-H2 (SEQ ID NO:4) і CDR-H3 (SEQ ID NO:5). У ще одних варіантах здійснення зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовностей усіх трьох CDR H, які являють CDR-H1 (SEQ ID NO:3), CDR-H2 (SEQ ID NO:4) і CDR-H3 (SEQ ID NO:5). У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білком CD154 і який містить або складається з послідовності(ей) однієї або декількох CDR (L) легкого ланцюга, вибраних із CDR-L1 (SEQ ID NO:6), CDR-L2 (SEQ ID NO:7) і CDR-L3 (SEQ ID NO:8). У додаткових варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається, принаймні, із двох CDR, вибраних із CDR-L1 (SEQ ID NO:6), CDR-L2 (SEQ ID NO:7) і CDR-L3 (SEQ ID NO:8). У ще одних варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовностей усіх трьох CDR L, вибраних із CDR-L1 (SEQ ID NO:6), CDR-L2 (SEQ ID NO:7) і CDR-L3 (SEQ ID NO:8). У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білком CD154 і містить або складається з однієї або декількох із CDR-L1 (SEQ ID NO:6), CDR-L2 (SEQ ID NO:7) і CDR-L3 (SEQ ID NO:8), і де зв'язувальний білок або антитіло додатково містить або складається з CDR-Н1 (SEQ ID NO:3), CDR-Н2 (SEQ ID NO:4) і CDR-Н3 (SEQ ID NO:5). У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білком CD154, де CD154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності VH, вибраної з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 і SEQ ID NO:11. У деяких інших варіантах здійснення даний винахід стосується 3 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язувального білка, наприклад, антитіла, яке специфічно зв'язується з білком CD154, де CD154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності важкого ланцюга, вибраної з SEQ ID NO:12 і SEQ ID NO:13. У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білком CD154, де CD154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності V L, вибраної з SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:14. У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білком CD154, де CD154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності легкого ланцюга SEQ ID NO:13. У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білком CD154, де CD154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності V L, вибраної з SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:14, і послідовності VH, вибраної з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 і SEQ ID NO:11. У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, яке специфічно зв'язується з білком CD154, де CD154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності легкого ланцюга SEQ ID NO:15 і послідовності важкого ланцюга, вибраної з SEQ ID NO:12 і SEQ ID NO:13. В інших варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності легкого ланцюга SEQ ID NO:15 і послідовності важкого ланцюга SEQ ID NO:13. В інших варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білком CD154 і який містить або складається з послідовності(ей) однієї або декількох CDR (Н) важкого ланцюга, вибраних із CDR-H1 (SEQ ID NO:42), CDR-H2 (SEQ ID NO:43) і CDR-H3 (SEQ ID NO:44). У додаткових варіантах здійснення зв'язувальний білок або антитіло містить або складається, принаймні, із двох CDR, вибраних із CDR-H1 (SEQ ID NO:42), CDR-H2 (SEQ ID NO:43) і CDR-H3 (SEQ ID NO:44). У ще одних варіантах здійснення зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовностей усіх трьох CDR Н, які являють CDR-H1 (SEQ ID NO:42), CDR-H2 (SEQ ID NO:43) і CDR-H3 (SEQ ID NO:44). У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з білком CD154, де зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності(ей) однієї або декількох CDR (L) легкого ланцюга, вибраних із CDR-L1 (SEQ ID NO:45), CDR-L2 (SEQ ID NO:46) і CDR-L3 (SEQ ID NO:47). У додаткових варіантах здійснення зв'язувальний білок або антитіло містить або складається, принаймні, із двох CDR, вибраних із CDR-L1 (SEQ ID NO:45), CDR-L2 (SEQ ID NO:46) і CDR-L3 (SEQ ID NO:47). У ще одних додаткових варіантах здійснення зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовностей усіх трьох CDR L, які являють CDR-L1 (SEQ ID NO:45), CDR-L2 (SEQ ID NO:46) і CDR-L3 (SEQ ID NO:47). У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок або анти-CD154-антитіло за даним винаходом містить комплементарну послідовність, що містить або складається з однієї або декількох CDR легкого ланцюга CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, відповідно наведених вище, або комплементарну послідовність, що містить або складається з однієї або декількох CDR важкого ланцюга CDR-Н1, CDR-Н2 і CDR-Н3, відповідно наведених вище. Таким чином, у деяких варіантах здійснення зв'язувальний білок або антитіло за даним винаходом містить або складається з CDR-H1 (SEQ ID NO:42), CDR-H2 (SEQ ID NO:43) і CDR-H3 (SEQ ID NO:44) і CDRL1 (SEQ ID NO:45), CDR-L2 (SEQ ID NO:46) і CDR-L3 (SEQ ID NO:47). У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується CD154-зв'язувального білка, наприклад, анти-CD154-антитіла, де зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з наступних послідовностей трьох CDR L: CDR-L1 (SEQ ID NO:45), CDR-L2 (SEQ ID NO:46) і CDRL3 (SEQ ID NO:47) і де зв'язувальний білок або антитіло додатково містить або складається з наступних послідовностей трьох CDR H: CDR-H1 (SEQ ID NO:42), CDR-H2 (SEQ ID NO:43) і CDR-H3 (SEQ ID NO:44). У додаткових варіантах здійснення даний винахід стосується зв'язувального білка, наприклад, антитіла, який специфічно зв'язується з CD154 та який містить або складається з послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга (VL) SEQ ID NO:54. Також винахід стосується CD154-зв'язувального білка або анти-CD154-антитіла, які містять або складаються з послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга (VН) SEQ ID NO:56. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок або анти-CD154-антитіло за винаходом може містити або складатися з послідовності VL SEQ ID NO:54 і послідовності VН SEQ ID NO:56. В інших варіантах здійснення даний винахід стосується CD154-зв'язувального білка, наприклад, анти-CD154-антитіла, який специфічно зв'язується з CD154, де CD154 4 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язувальний білок або анти-CD154-антитіло містить або складається з послідовності(ей) однієї або декількох CDR (Н) важкого ланцюга, вибраних із CDR-H1 (SEQ ID NO:48), CDR-H2 (SEQ ID NO:49) і CDR-H3 (SEQ ID NO:50). У додаткових варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок або анти-CD154-антитіло містить або складається, принаймні, із двох CDR, вибраних із CDR-H1 (SEQ ID NO:48), CDR-H2 (SEQ ID NO:49) і CDR-H3 (SEQ ID NO:50). У ще одних варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок або анти-CD154-антитіло містить або складається з послідовностей усіх трьох CDR, які являють CDR-H1 (SEQ ID NO:48), CDR-H2 (SEQ ID NO:49) і CDR-H3 (SEQ ID NO:50). У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується CD154-зв'язувального білка, наприклад, анти-CD154-антитіла, який специфічно зв'язується з білком CD154, де CD154зв'язувальний білок або анти-CD154-антитіло містить або складається з послідовності(ей) однієї або декількох CDR (L) легкого ланцюга, вибраних із CDR-L1 (SEQ ID NO:51), CDR-L2 (SEQ ID NO:52) і CDR-L3 (SEQ ID NO:53). У додаткових варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок або анти-CD154-антитіло містить або складається, принаймні, із двох CDR, вибраних із CDR-L1 (SEQ ID NO:51), CDR-L2 (SEQ ID NO:52) і CDR-L3 (SEQ ID NO:53). У ще одних варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок або анти-CD154-антитіло містить або складається з послідовностей усіх трьох CDR L, які являють CDR-L1 (SEQ ID NO:51), CDR-L2 (SEQ ID NO:52) і CDR-L3 (SEQ ID NO:53). У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-CD154-антитіло, за даним винаходом містить комплементарну послідовність, що містить або складається з однієї або декількох CDR легкого ланцюга CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, відповідно наведених вище, або комплементарну послідовність, що містить або складається з однієї або декількох CDR важкого ланцюга CDR-Н1, CDR-Н2 і CDR-Н3, відповідно наведених вище. Таким чином, у деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом містить або складається з CDR Н, вибраних із CDR-H1 (SEQ ID NO:48), CDR-H2 (SEQ ID NO:49) і CDR-H3 (SEQ ID NO:50), і CDR L, вибраних із CDR-L1 (SEQ ID NO:51), CDR-L2 (SEQ ID NO:52) і CDR-L3 (SEQ ID NO:53). У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується CD154-зв'язувального білка, наприклад, анти-CD154-антитіла, де CD154-зв'язувальний білок або анти-CD154-антитіло містить або складається з послідовностей усіх трьох CDR L, що являють CDR-L1 (SEQ ID NO:51), CDR-L2 (SEQ ID NO:52) і CDR-L3 (SEQ ID NO:53) і де зв'язувальний білок, наприклад, антитіло, додатково містить або складається з послідовностей усіх трьох CDR H, які являють CDR-H1 (SEQ ID NO:48), CDR-H2 (SEQ ID NO:49) і CDR-H3 (SEQ ID NO:50). У додаткових варіантах здійснення даний винахід стосується CD154-зв'язувального білка, наприклад, анти-CD154-антитіла, яке специфічно зв'язується з CD154, де CD154-зв'язувальний білок або анти-CD154-антитіло містить або складається з послідовності VL SEQ ID NO:58. У додаткових варіантах здійснення антитіло містить або складається з послідовності V Н SEQ ID NO:60. У додаткових варіантах здійснення антитіло містить або складається з послідовності V Н SEQ ID NO:60 і послідовності VL SEQ ID NO:58. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовність легкого ланцюга SEQ ID NO:62 і послідовність важкого ланцюга SEQ ID NO:65. В інших варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовність легкого ланцюга SEQ ID NO:63 і послідовність важкого ланцюга SEQ ID NO:66. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовність легкого ланцюга SEQ ID NO:68 і послідовність важкого ланцюга SEQ ID NO:71. В інших варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовністьлегкого ланцюга SEQ ID NO:69 і послідовність важкого ланцюга SEQ ID NO:72. В інших варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок містить, принаймні, одну з послідовностей SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71 і SEQ ID NO:72. Послідовності CDR SEQ ID NO:3-8 одержані з щурячого моноклонального антитіла 342. В альтернативному варіанті здійснення винаходу анти-CD154-антитіло являє собою щуряче антитіло 342, що містить послідовність VH-домену SEQ ID NO:29 і послідовність VL-домену SEQ ID NO:30. Також винахід стосується молекули виділеної, рекомбінантної або синтетичної ДНК, яка містить або складається, принаймні, з однієї послідовності, вибраної з SEQ ID NO:31 і SEQ ID NO:32. Додатково надається вектор, що містить, принаймні, одну послідовність, вибрану з SEQ ID NO:33 і SEQ ID NO:34. Також винахід стосується CD154-зв'язувальних білків, наприклад, анти-CD154-антитіл, які селективно зв'язуються з тим же самим епітопом, що і будь-яке з анти-CD154-антитіл, розкритих у даному документі (наприклад, антитіла 342, 381 і 338 та їхні послідовності, що зв'язуються з епітопом). Зокрема, антитіла 342 і 338 за даним винаходом виявляють аналогічні зв'язувальні CD154 властивості, коли використовуються у ролі першого або другого антитіл у конкурентних 5 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тестах з анти-CD154-антитілом 5с8, як описано в даному документі. Таким чином, у деяких варіантах здійснення винахід стосується CD154-зв'язувальних білків і анти-CD154-антитіл, що зв'язуються з тим же самим епітопом, що і гуманізоване антитіло, що містить послідовність важкого ланцюга SEQ ID NO:12 або SEQ ID NO:13 і містить послідовність легкого ланцюга SEQ ID NO:15 (Fab- і Fab-фрагменти 342), і яке виявляє аналогічні зв'язувальні CD154 властивості в тому випадку, коли використовуються у ролі перших або других антитіл у конкурентних тестах з анти-CD154-антитілом 5с8, як описано в даному документі. В інших варіантах здійснення винахід стосується CD154-зв'язувальних білків і анти-CD154-антитіл, які зв'язуються з тим же самим епітопом, що і гуманізоване антитіло, що містить послідовність V Lдомену SEQ ID NO:58 і послідовність VН-домену SEQ ID NO:60 (варіабельні послідовності антитіла 338), і які виявляють аналогічні зв'язувальні CD154 властивості в конкурентних тестах з анти-CD154-антитілом 5с8, як описано в даному документі. У будь-якому з описаних вище варіантів здійснення, що стосуються CD154-зв'язувального білка за винаходом, зв'язувальний білок може бути ПЕГільований. У варіантах здійснення, в яких CD154-зв'язувальний білок є анти-CD154-антитілом, поліпептидом антитіла або його фрагментом або похідним, антитіло може бути ПЕГільоване у важкому ланцюзі, легкому ланцюзі або обох ланцюгах. Також даний винахід стосується молекули виділеної, рекомбінантної і/або синтетичної ДНК, що містить або складається, принаймні, з однієї послідовності, вибраної з SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 і SEQ ID NO:25. У деяких варіантах здійснення даний винахід також стосується молекули виділеної, рекомбінантної і/або синтетичної ДНК, що містить або складається, принаймні, з однієї послідовності, вибраної з SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:70 і SEQ ID NO:73. У ще одних варіантах здійснення винахід стосується молекули виділеної, рекомбінантної і/або синтетичної ДНК, що містить або складається, принаймні, з однієї послідовності, вибраної з SEQ ID NO:28 і SEQ ID NO:41. Також даний винахід стосується вектора, який містить будь-яку з молекул виділеної, рекомбінантної і/або синтетичної ДНК за даним винаходом. В одному варіанті здійснення вектор містить, принаймні, одну послідовність, вибрану з SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 і SEQ ID NO:41. У додаткових варіантах здійснення даний винахід стосується молекули виділеної, рекомбінантної і/або синтетичної ДНК, що містить або складається, принаймні, з однієї послідовності, вибраної з SEQ ID NO:55 і SEQ ID NO:57. У деяких варіантах здійснення винахід стосується молекули виділеної, рекомбінантної і/або синтетичної ДНК, що містить або складається з обох послідовностей SEQ ID NO:55 і SEQ ID NO:57. У додаткових варіантах здійснення даний винахід стосується молекули виділеної, рекомбінантної і/або синтетичної ДНК, що містить або складається, принаймні, з однієї послідовності, вибраної з SEQ ID NO:59 і SEQ ID NO:61. У деяких варіантах здійснення винахід стосується молекули виділеної, рекомбінантної і/або синтетичної ДНК, що містить або складається з обох послідовностей SEQ ID NO:59 і SEQ ID NO:61. У будь-якому з варіантів здійснення винаходу, що стосуються CD154-зв'язувальних білків і анти-CD154-антитіл, які містять послідовності, що вносять свій внесок у забезпечення ефекторних функцій, зазначені зв'язувальні білки та анти-CD154-антитіла можутьбути додатково вибрані або сконструйовані для вияву зниженої ефекторної функції у порівнянні з анти-CD154-антитілом з Fс-ділянкою, як описано в даному документі. Наприклад, CD154зв'язувальні білки та анти-CD154-антитіла, які не містять послідовностей Fс-ділянки або константної ділянки або в яких відсутні послідовності функціональних Fс-ділянок або константної ділянки, можуть бути вибрані для використання за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальні білки та анти-CD154-антитіла за винаходом є моновалентними стосовно зв'язування з CD154 і переважно виявляють знижені ефекторні функції при введенні суб'єкту у порівнянні з CD154-зв'язувальним білком порівняння, таким як бівалентне анти-CD154-антитіло. У деяких інших варіантах здійснення послідовності Fс-ділянки або константної ділянки, якщо вони присутні в CD154-зв'язувальному білку, наприклад, поліпептиді анти-CD154-антитіла, можуть бути вибрані або сконструйовані для змісту однієї або більше модифікацій (наприклад, амінокислотних замін, вставок, аддуктів або делецій), що призведе до зниження або елімінації однієї або більше ефекторних функцій у порівнянні з контрольним анти-CD154-антитілом, що містить нативні, вихідні або немодифіковані послідовності Fc-ділянки або константної ділянки. 6 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення даного винаходу Fc-ділянка, у тому випадку, коли вона є, являє собою Fc-ділянку з або одержану з IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4 антитіла. У деяких варіантах здійснення можна використовувати гібридні Fc-ділянки, тобто IgG1/IgG4 гібридні Fcпослідовності. У конкретних варіантах здійснення Fc-ділянка містить Fc-послідовності IgG4 або вона одержана з IgG4-антитіла. Необхідно розуміти, що можна використовувати будь-яку гібридну комбінацію між різними Fc-ділянками, яка призводить до зниження однієї або більш ефекторних функцій за даним винаходом. У деяких інших варіантах здійснення зменшують або елімінують глікозильовані Fc-ділянки антитіла або змінюють профіль глікозилювання антитіла, як описано далі в даному документі. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок або поліпептид анти-CD154-антитіла містить CH2-домен із Fc-ділянкою, що містить модифікацію з модифікацією в або поблизу консервативного сайта N-зв'язаного глікозилювання. Модифікація в консервативному сайті Nзв'язаного глікозилювання може включати мутацію в або поблизу сайта глікозилювання важкого ланцюга, де мутація знижує, змінює або попереджає глікозилювання в сайті. У додаткових варіантах здійснення модифікація включає мутацію N298Q (N297 при використанні EU нумерації Kabat). У деяких варіантах здійснення модифікація включає видалення гліканів у C H2-домені або їхніх фрагментах. У деяких альтернативних варіантах здійснення модифікація попереджає утворення зрілого N-глікану в сайті глікозилювання. У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується CD154-зв'язувального білка, наприклад, анти-CD154-антитіла, що містить послідовність CDR3 важкого ланцюга, вибрану з SEQ ID NO:5, 44 і 50, і варіантну Fc-ділянку, де варіантна Fc-ділянка містить перший амінокислотний залишок і сайт N-глікозилювання, де перший амінокислотний залишок модифікований зміною бічного ланцюга або амінокислотною заміною для досягнення підвищеного стеричного розміру або підвищеного електростатичного заряду у порівнянні з немодифікованим першим амінокислотним залишком, зі зниженням тим самим рівня або зміною іншим чином глікозилювання в сайті N-глікозилювання. У деяких з даних варіантів здійснення варіантна Fc-ділянка надає знижену ефекторну функцію у порівнянні з контрольною, неваріантною Fc-ділянкою. У деяких варіантах здійснення винахід стосується CD154-зв'язувального білка, наприклад, анти-CD154-антитіла, що містить послідовність CDR3 важкого ланцюга, вибраного з SEQ ID NO:5, 44 і 50, і варіантну Fc-ділянку, де варіантна Fc-ділянка містить перший амінокислотний залишок і сайт N-глікозилювання, де перший амінокислотний залишок містить тіол цистеїн зі зниженням тим самим рівня або зміною іншим чином глікозилювання в сайті N-глікозилювання, де варіантна Fc-ділянка надає знижену ефекторну функцію. У деяких варіантах здійснення перший амінокислотний залишок і сайт N-глікозилювання анти-CD154-антитіл, що містять варіантні Fc-ділянки, описані вище, знаходяться поблизу або в мотиві N-зв'язаного глікозилювання. У додаткових варіантах здійснення мотив N-зв'язаного глікозилювання містить амінокислотну послідовність NXT або NXS. У деяких варіантах здійснення мотив N-зв'язаного глікозилювання містить амінокислотну послідовність NXT. У деяких варіантах здійснення сайт N-глікозилювання розташований в амінокислоті 297 за системою нумерації Kabat. У додаткових варіантах здійснення перший модифікований амінокислотний залишок являє амінокислоту 299 за системою нумерації Kabat. У деяких з описаних вище варіантів здійснення знижена ефекторна функція, що виявляється будь-яким з антитіл або фрагментів антитіл, що містять зв'язувальні білки, описані в даному документі, являє знижене зв'язування з Fc-рецептором (FcR). У деяких варіантах здійснення Fcрецептор (FcR) вибраний із FcRI, FcRII і FcRIII, і одного або більше їхніх підтипів, наприклад, таких як FcRIIа. У деяких варіантах здійснення зв'язування з FcR нижче, принаймні, приблизно в 1,5 рази або більше, приблизно в 2 рази або більше, приблизно в 3 рази або більше, приблизно в 4 рази або більше, приблизно в 5 разів або більше, приблизно в 6 разів або більше, приблизно в 7 разів або більше, приблизно в 8 разів або більше, приблизно в 9 разів або більше, приблизно в 10 разів або більше, приблизно в 15 разів або більше, приблизно в 50 разів або більше або приблизно в 100 разів або більше. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-CD154-антитіло, за винаходом з однією або більше зниженими ефекторними функціями, описаними в даному документі, не зв'язується зі специфічним ефекторним рецептором або підтипом ефекторного рецептора. У деяких із даних варіантів здійснення CD154-зв'язувальний білок, наприклад, антиCD154-антитіло, не зв'язується з FcRIIa. У деяких варіантах здійснення знижена ефекторна функція, що виявляється будь-яким одним з антитіл, описаних у даному документі, являє знижене зв'язування з білком комплементу. У деяких варіантах здійснення білок комплементу являє C1q. У деяких варіантах 7 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здійснення зв'язування з білком комплементу нижче, принаймні, приблизно в 1,5 рази або більше, приблизно в 2 рази або більше, приблизно в 3 рази або більше, приблизно в 4 рази або більше, приблизно в 5 разів або більше, приблизно в 6 разів або більше, приблизно в 7 разів або більше, приблизно в 8 разів або більше, приблизно в 9 разів або більше, приблизно у 10 разів або більше, приблизно в 15 разів або більше. У додаткових варіантах здійснення даного винаходу CD154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-CD154-антитіло, за винаходом містить одну або більше модифікацій або варіацій Fcділянки, не глікозильований і виявляє одну або більше знижених ефекторних функцій при введенні суб'єкту. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-CD154-антитіло, за винаходом викликає менше тромбоемболічних ускладнень у порівнянні із введенням антиCD154-антитіла 5с8 при введенні суб'єкту. У деяких варіантах здійснення даного винаходу модифікований перший амінокислотний залишок CD154-зв'язувальних білків або анти-CD154-антитіл, що містять варіантні Fc-ділянки, описані в даному документі, зв'язаний із функціональною групою. У додаткових варіантах здійснення функціональна група являє блокувальну групу, детектовану групу, діагностичну групу або терапевтичну групу або їхні комбінації. Блокувальна група у деяких варіантах здійснення, може являти, наприклад, цистеїновий аддукт, змішаний дисульфід, поліетиленгліколь або поліетиленгліколь-малеімід. Детектована група, у деяких варіантах здійснення, може являти, наприклад, флуоресцентну групу, люмінесцентну групу або ізотопну групу. У варіантах здійснення, в яких використовується діагностична група, то діагностична група може бути здатною виявляти наявність стану, захворювання або порушення. В інших варіантах здійснення можна використовувати терапевтичну групу, наприклад, таку як протизапальний засіб, протипухлинний засіб, засіб для лікування нейродегенеративного захворювання, антитіло, яке є селективним для молекули, що відрізняється від CD154, або протиінфекційний засіб. У деяких варіантах здійснення даного винаходу CD154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-CD154-антитіло, містить модифікований амінокислотний залишок, де модифікація забезпечує сайт-спрямоване кон'югування білка або антитіла з функціональною групою, таке як сайт-спрямоване пегілювання. У деяких варіантах здійснення модифікований амінокислотний залишок являє залишок цистеїну, модифікований цистеїновим або змішаним дисульфідним аддуктом. Таким чином, у деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок являє поліпептид анти-CD154-антитіла, що пегільований за модифікованим амінокислотним залишком, наприклад, за залишком цистеїну або лізину. У деяких варіантах здійснення антиCD154-антитіло є Fab- або Fab-фрагментом, пегільованим ПЕГ-малеімідом. Також даний винахід стосується нуклеїнової кислоти, наприклад, послідовностей ДНК, що кодують CD154-зв'язувальні білки, наприклад, анти-CD154-антитіла, за винаходом. Послідовності ДНК за даним винаходом можуть включати синтетичну ДНК, наприклад, одержану хімічною обробкою, кДНК, геномну ДНК або будь-яку їхню комбінацію. Даний винахід додатково стосується клонуючих або експресуючих векторів, що містять одну або більше нуклеїнових кислот, наприклад, послідовності ДНК за даним винаходом. Також винахід стосується, у деяких варіантах здійснення, вектора, що містить будь-яку із синтетичних, виділених і/або рекомбінантних нуклеїнових кислот, описаних вище. Даний винахід також стосується клітини-хазяїна, що містить послідовність ДНК або вектор за винаходом. У деяких аспектах даний винахід стосується способу одержання CD154зв'язувального білка, наприклад, анти-CD154-антитіла, що включає культивування клітинихазяїна, що містить будь-який із векторів, описаних вище, в умовах, придатних для продукції CD154-зв'язувального білка або анти-CD154-антитіла клітиною-хазяїном. У деяких варіантах здійснення спосіб включає виділення CD154-зв'язувального білка або анти-CD154-антитіла з культури клітин-хазяїнів. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок, анти-CD154-антитіло або нуклеїнову кислоту за даним винаходом мітять детектованим маркером, який може являти собою радіоактивний ізотоп, фермент, барвник або біотин. У деяких інших варіантах здійснення антитіло за даним винаходом кон'югують, принаймні, з одним іншим терапевтичним засобом, який, наприклад, може являти собою радіоактивний ізотоп, радіонуклід, токсин, токсоїд, поліпептид або фрагмент не специфічного до CD154 антитіла (наприклад, одержавши при цьому біспецифічне або мультиспецифічне антитіло) або хіміотерапевтичний засіб. У ще одних варіантах здійснення антитіло за даним винаходом кон'югують із візуалізуючим агентом, який може являти групу для мічення. Агент для мічення також може являти біотин, флуоресцентну або люмінесцентну групу, радіоактивну групу, гістидинову мітку або пептидну мітку. 8 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Також даний винахід стосується варіантів послідовностей CD154-зв'язувальних білків, наприклад, анти-CD154-антитіл, описаних у даному документі, послідовностей нуклеїнових кислот, які їх кодують. Варіанти послідовностей за винаходом переважно мають, принаймні, 90 %, 91 %, 92 %, 93 % або 94 % ідентичність із поліпептидом за винаходом або з послідовністю нуклеїнової кислоти, яка кодує його. Переважніше, варіант послідовності має, принаймні, 95 %, 96 %, 97 % або 98 % ідентичність на рівні амінокислот або нуклеїнових кислот. Найбільш переважний варіант послідовності за винаходом переважно має, принаймні, 99 %, 99,5 %, 99,9 % ідентичність із поліпептидом за винаходом або з послідовністю нуклеїнової кислоти, яка кодує його. Отже, даний винахід стосується виділеного білка, що містить послідовність, яка, принаймні, на 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9 або 100 % ідентична послідовності SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71 або SEQ ID NO:72. У деяких варіантах здійснення поліпептид химерного, гуманізованого або людського антиCD154-антитіла за винаходом являє, наприклад, dAb, Fab, Fab, scFv, Fv, зв'язаний через дисульфід Fv, або містить один варіабельний домен імуноглобуліну, такий як VH- або VL- домен, що є специфічним або моновалентним стосовно зв'язування CD154. Деякі CD154-зв'язувальні білки, наприклад, поліпептиди химерних, гуманізованих або людських анти-CD154-антитіл за винаходом містять одну, дві або більше ділянки CDR за винаходом та альтернативну основу або універсальні каркасні послідовності. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальні білки та анти-CD154-антитіла за винаходом містять єдиний варіабельний домен, вибраний із варіабельної ділянки важкого ланцюга (VH) і варіабельної ділянки легкого ланцюга (VL). Також винахід стосується CD154-зв'язувального білка, наприклад, поліпептиду химерного, гуманізованого або людського анти-CD154-антитіла, яке є моновалентним стосовно зв'язування з CD154, яке кон'юговане з функціональною групою, що призводить до підвищення його часу напівжиття в умовах in vivo у порівнянні з тим самим поліпептидом без функціональної групи. У деяких варіантах здійснення функціональна група включає або складається з поліетиленгліколю. У деяких варіантах здійснення функціональна група включає або складається з молекули альбуміну, такого як людський сироватковий альбумін. Отже, винахід стосується зв'язаного з ПЕГом CD154-зв'язувального білка, наприклад, зв'язаного з ПЕГом поліпептиду химерного, гуманізованого або людського анти-CD154-антитіла, який специфічно і моновалентно зв'язується з CD154, і який має збільшений час напівжиття в умовах in vivo у порівнянні з тим же поліпептидом без зв'язаного поліетиленгліколю. Також даний винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить, принаймні, один CD154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-CD154-антитіло, за даним винаходом, яка може, у деяких варіантах здійснення, додатково містити фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтична композиція за винаходом може необов'язково додатково містити додаткову біологічно активну сполуку або терапевтичний засіб, наприклад, таку як імуносупресивна або імуномодулююча сполука або засіб; або діагностичний засіб. У деяких варіантах здійснення композиція містить терапевтично ефективну кількість пегільованого анти-CD154-Fab-антитіла, що має специфічність до епітопу анти-CD154-антитіла 342 або 338, описаних у даному документі. Додатково даний винахід стосується способу лікування або профілактики стану, порушення, захворювання в людини, опосередкованого в цілому або частково сигнальним шляхом за участю CD40, або симптому будь-якого зі згаданого вище, де спосіб включає стадію введення суб'єкту, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить CD154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-CD154-антитіло, за даним винаходом, таким чином, що забезпечується лікування або профілактика стану, захворювання або порушення. Також даний винахід стосується способу інгібування або профілактики імунної, автоімунної або запальної реакції у відповідь, опосередкованої в цілому або частково сигнальним шляхом за участю CD40, або симптому будь-якого зі згаданого вище, де спосіб включає стадію введення суб'єкту, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить CD154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-CD154-антитіло, за даним винаходом, таким чином, що забезпечується терапевтична або профілактична реакція у 9 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідь. У деяких варіантах здійснення спосіб використовують для лікування суб'єкта, що має симптоми або якому поставлений діагноз системного червоного вовчака (SLE). В інших варіантах здійснення спосіб використовують для лікування суб'єкта, що має симптоми або якому поставлений діагноз ревматоїдного стану, наприклад, такого як ревматоїдний артрит (RA). Даний винахід стосується поліпептиду людського антитіла, що є моновалентним стосовно зв'язування з CD154. У деяких варіантах здійснення поліпептид людського антитіла, який є моновалентним стосовно зв'язування з CD154, коли знаходиться в насичувальних концентраціях або вище для зв'язування з CD154, ґрунтуючись на його афінності зв'язування, блокує зв'язування антитіла 5с8 із CD154, у тому випадку, коли його додають до CD154 першим, і витісняє антитіло 5с8, зв'язане з CD154, у тому випадку, коли його додають після антитіла 5с8. У деяких варіантах здійснення поліпептид людського антитіла зв'язаний з ПЕГом. У деяких варіантах здійснення поліпептид людського антитіла не містить Fc-домену. У деяких з описаних вище варіантів здійснення CD154-зв'язувальний білок або поліпептид людського антитіла не витісняє CD154, зв'язаний із CD40. У деяких варіантах здійснення винахід стосується пегільованого анти-CD154-Fab-антитіла, яке є моновалентним стосовно зв'язування з CD154 і додатково стосується способів лікування або профілактики одного або більше симптомів артриту, такого як ревматоїдний артрит, або системного червоного вовчака (SLE), що включає стадію введення суб'єкту, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить пегільоване антиCD154-Fab-антитіло, таким чином, що забезпечується терапевтична або профілактична реакція у відповідь. Короткий опис фігур На фіг.1 наведена таблиця з амінокислотними послідовностями ділянок (CDR) анти-CD154антитіл 342, 381 і 338, що визначають комплементарність. На фіг.2 наведена таблиця з амінокислотними і відповідними нуклеотидними послідовностями VH- і VL-доменів щурячого анти-CD154-антитіла 342. Підкреслені послідовності відповідають нуклеотидній послідовності, що кодує лідерний (тобто сигнальний) пептид. На фіг.3 наведена таблиця з амінокислотними і відповідними нуклеотидними послідовностями людських акцепторних каркасних ділянок, використаних для одержання гуманізованих анти-CD154-антитіл у прикладах. На фіг.4 наведена таблиця з амінокислотними і відповідними нуклеотидними послідовностями VH- і VL-доменів, в яких CDR антитіла 342 були пересаджені в каркасні ділянки, наведені на фіг.3. На фіг.5 наведена таблиця з амінокислотними і відповідними нуклеотидними послідовностями VH-доменів антитіла 342 (VH3 g1 і VH4 g1), в яких CDR антитіла 342 були пересаджені в людські акцепторні каркасні ділянки та в яких були збережені деякі ключові донорні залишки. На фіг.6 наведена таблиця з амінокислотними і відповідними нуклеотидними послідовностями домену VL антитіла 342 (VK1 g1), в яких CDR антитіла 342 були пересаджені в людські акцепторні каркасні ділянки та в яких були збережені деякі ключові донорні залишки. На фіг.7 наведена таблиця з послідовностями для повного легкого ланцюга (варіабельної і константної ділянок легкого ланцюга) і ділянок важкого ланцюга антитіла 342. Підкреслені послідовності, що відповідають сигнальному/лідерному пептидам. На фіг.8 показана нуклеотидна послідовність експресуючих інсертів, які використовували для одержання варіантів Fab (SEQ ID NO:28) і Fab (SEQ ID NO:41) пересадженого 342 gL4gH1. Підкреслені сигнальна/лідерна послідовності і виділені великими літерами і жирним шрифтом сайти рестрикції (використані для клонування в експресуючий вектор E. coli, як описано в прикладі 2). На фіг.9 показане вирівнювання амінокислотної послідовності легкого і важкого ланцюгів щурячого анти-CD154-антитіла 342 (донорного антитіла) із людськими каркасними (акцепторними) ділянками зародкової лінії, використаними при гуманізації антитіла 342. "Легкий ланцюг антитіла 342" являє собою послідовність щурячого V L-домену. "Важкий ланцюг антитіла 342" являє послідовність щурячого VН-домену. Залишки CDR виділені жирним шрифтом і підкреслені. Показано акцепторну каркасну ділянку легкого ланцюга (2 1 1 О12; SEQ ID NO:35) і важкого ланцюга (1-1 3-66; SEQ ID NO:37 і 1-1 4-59; SEQ ID NO:39). Також показані тільки пересаджені CDR у людські акцепторні каркасні ділянки зародкової лінії (VK1 g3, VH3 g7 і VH4 g6). У деяких гуманізованих важких і легких ланцюгах зберігаються донорні залишки антитіла 342 у каркасній ділянці, і дані ключові залишки донорної каркасної ділянки виділені курсивом і жирним шрифтом. Донор VK1 gL4 являє R38, Y71 і S85. Донор VН3 gH1 являє V24, M48, G49, 10 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 T83 і V78. Донор VН4 gH1 являє M48, R71 і V78. Наведені SEQ ID NO для легких ланцюгів у порядку зверху вниз: SEQ ID NO:30 ("342"), SEQ ID NO:35 ("2 1 1 О12"), SEQ ID NO:14 ("342 gL3") і SEQ ID NO:2 ("342 gL4"). Наведені SEQ ID NO для важких ланцюгів (пересаджені VH3) у порядку зверху вниз: SEQ ID NO:29 ("342"), SEQ ID NO:37 ("1-1 3-66"), SEQ ID NO:10 ("342 gH7") і SEQ ID NO:1 ("342 gH1"). Наведені SEQ ID NO для важких ланцюгів (пересаджені VH4) у порядку зверху вниз: SEQ ID NO:29 ("342"), SEQ ID NO:39 ("1-1 4-59"), варіант SEQ ID NO:9 ("VH4 gH6" (SEQ ID NO:74)) і варіант SEQ ID NO:11 ("VH4 gH1" (SEQ ID NO:75)). Варіанти SEQ ID NO:9 і SEQ ID NO:11, наведені на фіг.9, починаються з амінокислоти "Е" (замість "Q", як має місце відповідно на фіг.4 і 5) для експресії в E. coli. Отже, нуклеотидні послідовності, що відповідають даним мутантної SEQ ID NO:9 і 11, відрізняються від нуклеотидних послідовностей SEQ ID NO:19 і SEQ ID NO:21 тим, що вони починаються з нуклеотиду "g" замість "с". На фіг.10 наведені амінокислотні і відповідні нуклеотидні послідовності VH- і VL-доменів анти-CD154-антитіла 381. Підкреслені амінокислотні послідовності CDR. На фіг.11 наведені амінокислотні і відповідні нуклеотидні послідовності V H- і VL-доменів анти-CD154-антитіла 338. Підкреслені амінокислотні послідовності CDR. На фіг.12 наведена таблиця з переліком антитіл щура проти людського CD154, виділені методом добору антитіл лімфоцитів (SLAM). У таблиці наведені значення K d і IC50, одержані для даних антитіл при постановці аналізу Biacore, тестів зі зв'язуванням CD40 і тестів із активації ICAМ-1. Виділено дані, одержані з антитілом 342. На фіг.13 наведені амінокислотні і відповідні нуклеотидні послідовності легкого каппаланцюга аглікозильованого анти-CD154-антитіла hu5c8 (hu5c8 aglyP-huIgG4). На фіг.14 наведені амінокислотні і відповідні нуклеотидні послідовності важкого ланцюга аглікозильованого анти-CD154-антитіла hu5c8 (hu5c8 aglyP-huIgG4). Введені мутації для одержання аглікозильованого варіанта (S228P/T299A згідно з EU номенклатурою Kabat; залишки 226 і 297) підкреслені і виділені жирним шрифтом у послідовності зрілого білка. На фіг.15 наведені амінокислотні і відповідні нуклеотидні послідовності легкого каппаланцюга аглікозильованого анти-CD154-антитіла hu342 (hu342 aglyP-huIgG4). На фіг.16 наведені амінокислотні і відповідні нуклеотидні послідовності важкого ланцюга аглікозильованого анти-CD154-антитіла hu342 (hu342 aglyP-huIgG4). Уведені мутації для одержання аглікозильованого варіанта (S228P/T299A відповідно до номенклатури Kabat EU; залишки 226 і 297) підкреслені і виділені жирним шрифтом у послідовності зрілого білка. На фіг.17 наведені зразкові Fab-фрагменти і гель, що показує сайт-спрямоване пегілювання Fab-фрагмента анти-CD154-антитіла. Fab-фрагмент пегілювали взаємодією ПЕГ-малеіміду з одним залишком цистеїну в шарнірній ділянці. На фіг.18 наведена таблиця зі значеннями Kd і IC50, одержаними при постановці аналізу Biacore, тестів зі зв'язуванням CD40, тестів з активації ICAМ-1 і конкурентних тестів із CD40 для різних варіантів здійснення гуманізованого антитіла 342 gL4gH1, включаючи Fabфрагменти і кон'югати антитіло-ПЕГ. На фіг.19 наведені два графіки значень титру анти-ТТ (правцевого токсоїду) IgG як функції часу в макак циномолгус, які одержували контрольний фізіологічний розчин або різні дози антиCD154-антитіла. На верхньому графіку наведені значення титру IgG для періоду 0-20 діб після введення антитіла і зараження ТТ (первинна імунна відповідь) і на нижньому графіку наведені значення для періоду 30-50 діб після введення антитіла і другого зараження ТТ на 30 добу. На фіг.20 наведений графік значень титру анти-ТТ (правцевого токсоїду) IgG як функції часу в макак циномолгус, які одержували різні формати анти-CD154-антитіл в однократній дозі (20 мг/кг для hu5c8, аглікозильного антитіла 5c8 і аглікозильного антитіла 342 і 40 мг/кг для 342 Fab-ПЕГ і 342 DFM-ПЕГ). DFM-ПЕГ являє фрагмент антитіла, в якому два Fab-фрагменти зшиті ПЕГільованим дималеімідним містком. На фіг.21 наведений графік значень титру анти-ТТ (правцевого токсоїду) ІgМ як функції часу в макак циномолгус, які одержували контрольний фізіологічний розчин або різні дози антиCD154-антитіла. На графіку наведені значення титру IgМ для періоду 0-20 діб після стимуляції ТТ (первинна відповідь). На фіг.22 наведені порівняльні дані з фармакокінетики антитіла 342 Fab-ПЕГ і антитіла hu5c8 у макак циномолгус. На фіг.23 наведені результати аналізу проточною цитометрією перехресного блокування зв'язування міченого 342 Fab з експресуючими CD154 клітинами Jurkat D1.1, попередньо зв'язаними з неміченим першим анти-CD154 Fab, як зазначено на кожній панелі (23А – А33; 23В – 338; 23С – 402; 23D – 381; 23Е – 300; 23F – 294; 23G – 335; 23H – 303) (дивися приклад 9). А33 являє підібране за ізотипом контрольне антитіло, і показано, що в даному випадку неспецифічне перехресне блокування відсутнє. 11 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На фіг.24 наведені результати аналізу проточною цитометрією перехресного блокування зв'язування міченого hu5c8 Fab з експресуючими CD154 клітинами Jurkat D1.1, попередньо зв'язаними з неміченим першим анти-CD154-Fab, як зазначено на кожній панелі (24А – 338; 24В – 402; 24С – 381; 24D – 303; 24Е – 335; 24F – 300; 24G – 294; 24H – A33) (дивися приклад 9). А33 являє підібране за ізотипом контрольне антитіло, і показано, що в даному випадку неспецифічне перехресне блокування відсутнє. На фіг.25 A–F наведені результати аналізу конкурентного зв'язування з використанням Biacore® різних форм антитіл 342 і hu5c8 із розчинним білком CD154 (ECD) або комплексом CD40:CD154. FL-повнорозмірне антитіло. CD40hFc – людський злитий білок CD40. На фіг.26 наведений графік, що показує результати тесту агрегації тромбоцитів, описаного в прикладі 11 (тест 1), що був проведений з hu5c8 анти-CD154-антитілом, 342 Fab-ПЕГ антиCD154-антитілом і контрольним антитілами. На першій панелі наведені результати, одержані з комплексами CD40L, утвореними цільним IgG, і на другій панелі комплекси, утворені Fab-ПЕГ або диFab-ПЕГ. На третій панелі наведені результати, одержані з триFаb-ПЕГ та аглікозильованим анти-CD154-антитілом hu342. На фіг.27 наведений графік, що показує результати тесту агрегації тромбоцитів, описаного в прикладі 11 (тест 2), який був проведений із позитивними і негативними контрольними антитілами. Результати показують, що агрегація тромбоцитів специфічно підсилюється під дією комплексів позитивного контрольного анти-CD154-антитіла і рекомбінантного людського розчинного CD40L (sCD154). На фіг.28 показане вирівнювання амінокислотних послідовностей людського (SEQ ID NO:76) і мишачого розчинного CD40L (SEQ ID NO:77). Відмінності між людськими і мишачими послідовностями зазначені червоним кольором. Послідовності епітопу Hu5c8 зазначені синім кольором. Внутрішні залишки відзначені “”. Відібрано шість ділянок (1-6) послідовності, де людські послідовності введені в розчинний мишачий CD40L. На фіг.29 наведені результати постановки конкурентної ELISA для демонстрації перехресного блокування 342 Fab і hu5c8 Fab (дивися приклад 14). На фіг.29А наведені результати титрування біотин-342 Fab на CD154. Концентрація 1 нМ знаходиться в лінійній частині кривої. На фіг.29В наведені результати титрування біотин-hu5c8 Fab на CD154. Концентрація 0,3 нМ знаходиться в лінійній частині кривої. На фіг.29С показане перехресне блокування біотин-342 і біотин-5с8 під дією неміченого 342 Fab. Сh342 Fab являє собою химерний 342 Fab. На фіг.29D показане перехресне блокування біотин-342 під дією неміченого 5с8 Fab. Детальний опис винаходу Для більш повного розуміння описаного в даному документі винаходу нижче наводиться детальний опис. Якщо не зазначено інакше, то всі технічні і наукові терміни, використані в даному документі, мають ті ж значення, що звичайно розуміються фахівцями в галузі, якої стосується даний винахід. Нижче описані зразкові методи і матеріали, хоча, у практиці даного винаходу також можна використовувати методи і матеріали, аналогічні або еквівалентні описаним у даному документі, і вони зрозумілі фахівцям у даній галузі. У даній заявці є звертання до різних патентів, публікацій і літературних джерел. Розкриття даних патентів, публікацій і літературних джерел у повному обсязі включено в даний документ до відома. Класичні літературні джерела, в яких викладені основні принципи технології рекомбінантної ДНК, відомі фахівцям у даній галузі, включають Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1998 and Supplements to 2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989); Kaufman et al., Eds., Handbook of Molecular and Cellular Methods In Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991). Класичні літературні джерела, в яких викладені основні принципи імунології, відомі фахівцям у даній галузі, включають Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1999); і Roitt et al., Immunology, 3d Ed., MosbyYear Book Europe Limited, London (1993). Класичні літературні джерела, в яких викладені основні принципи медичної фізіології і фармакології, відомі фахівцям у даній галузі, включають Fauci et th al., Harrison's Principles of Internal Medicine, 14 Ed., McGraw-Hill Companies, Inc. (1998). Визначення У тому значенні, в якому термін "CD154-зв'язувальний білок" використовується в даному документі, то він включає будь-яку молекулу, у тому числі, антитіло, яка специфічно зв'язується або має антагоністичну дію стосовно CD154. Таким чином, у тому значенні, в якому даний 12 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 термін використовується в даному документі, то анти-CD154-антитіло являє один клас білків, що специфічно зв'язуються з CD154. CD154-зв'язувальний білок за винаходом може включати, принаймні, одну, переважно дві, три або більше CDR, розкритих у даному документі. CD154зв'язувальний білок або інший такий антагоніст CD154 може включати молекули, які не є класичними фрагментами або похідними антитіл, але які, проте, містять амінокислотні послідовності і/або хімічні структури, що надають специфічність зв'язування з епітопом CD154. Такі антагоністи CD154 можна одержати, наприклад, з альтернативної основи (дивися, наприклад, Binz et al., 2005, Nat. Biotech., 23:1257-1268 і Hosse et al., 2006, Protein Science, 15:14-27). Такий CD154-зв'язувальний білок або антагоніст може бути злитий із Fc-ділянкою антитіла, яка у функціональному відношенні є недостатньою, або з гетерологічною функціональною групою, описаною в даному документі, із метою підвищення часу напівжиття і/або поліпшення інших in vivo властивостей CD154-зв'язувального білка. CD154-зв'язувальні білки можуть містити, принаймні, одну з CDR, описаних у даному документі, включену в біологічно сумісну каркасну структуру. В одному прикладі біологічно сумісна каркасна структура включає поліпептид або його фрагмент, який є достатнім для утворення конформаційно стабільної структурної основи або каркаса, або основи, яка здатна до розміщення однієї або більше послідовностей амінокислот, які зв'язуються з антигеном (наприклад, CDR, варіабельний домен і т.д.) у локалізованій ділянці поверхні. Такі структури можуть являти природний поліпептид або "складку" поліпептиду (структурний мотив), або можуть мати одну або більше модифікацій, таких як додавання, делеції або заміни амінокислот у порівнянні з природним поліпептидом або "складкою" поліпептиду. Дані основи можна одержати з поліпептиду від будь-якого виду (або від більше ніж одного виду), такого як людина, інший ссавець, інша хребетна, безхребетна, рослина, бактерія або вірус. Як правило, біологічно сумісні каркасні структури засновані на білкових носіях або кістяках інших, ніж імуноглобулінові домени. Наприклад, можна використовувати такі на основі фібронектину, анкирину, ліпокаліну, неокарзиностаїну, цитохрому b, CPI "цинкового пальця", PSTI, закрученої спіралі, LACI-DI, Z-домену і доменів тендрамізату (дивися,наприклад, Nygren and Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469). У тому значенні, в якому термін "антитіло" використовується стосовно винаходу, то він включає виділене, рекомбінантне або синтетичне антитіло, кон'югат антитіла або похідне антитіла. Термін "антитіло" часто призначається для включення фрагмента антитіла, у тому числі, антигензв'язувального фрагмента, якщо не зазначено інакше або розуміється інакше за контекстом. Антигензв'язувальний фрагмент конкурує з інтактним антитілом за специфічне nd зв'язування. Дивися в загальному Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul W., ed., 2 ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Антигензв'язувальні фрагменти можна одержати методами рекомбінантної ДНК або ферментативним або хімічним розщепленням інтактних антитіл. У деяких варіантах здійснення антигензв'язувальні фрагменти включають Fab, F(ab) 2, Fab, F(ab)2, F(ab)3, Fd, Fv, однодоменні антитіла (dAb), інші моновалентні і дивалентні фрагменти, що визначають комплементарність ділянки (CDR), одноланцюгові антитіла (наприклад, scFv, scFab і scFab∆C), химерні антитіла, діантитіла (diabody), триантитіла (triabody), мініантитіла (minibody), наноантитіла (nanobody) і поліпептиди, які містять, принаймні, фрагмент антитіла, який є достатнім для надання здатності до специфічного зв'язування антигену з поліпептидом; і злиті конструкції і похідні описаного вище. Дивися, наприклад, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23:1126-1136 (2005) і Hust et al., BMC Biotech., 7:14 (2007). "Fd-фрагмент" являє фрагмент антитіла, що складається з VH і СН1 доменів; "Fv-фрагмент" складається з VL і VH доменів одного плеча антитіла; "scFv-фрагмент" являє одноланцюгове антитіло, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (VH) і варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL), з'єднані пептидним лінкером; "scFab-фрагмент" є одноланцюговим антитілом, що містить фрагмент важкий (Fd), з'єднаний із легким ланцюгом за допомогою пептидного лінкеру; "scFab∆C”-фрагмент являє варіант scFab без цистеїну (дивися, наприклад, Hust et al., вище); і "dAb-фрагмент" (однодоменне антитіло) містить один варіабельний домен (наприклад, VH- або VL- домен) (Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989)). Крім того, сюди входять діантитіла і триантитіла. Діантитіла і триантитіла за даним винаходом включають, наприклад, гомодимерні і гетеродимерні діантитіла і триантитіла. Наприклад, у деяких варіантах здійснення варіабельні домени, що входять до складу триантитіла, можуть зв'язуватися з трьома різними епітопами або з ідентичними епітопами. Якщо не зазначено інакше або розуміється інакше за контекстом, то "антитіло" за даним винаходом включає цілі антитіла та їхні будь-які антигензв'язувальні фрагменти, похідні і варіанти антитіл, які можуть містити одну або більш модифікацій (наприклад, амінокислотну вставку, делецію, заміну, посттрансляційну модифікацію або її відсутність і т.д.), включаючи 13 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кон'югати антитіл (тобто антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, кон'юговані або зв'язані з функціональною групою). Похідні антитіл, включаючи кон'югати антитіл, можуть бути засновані на або можуть містити антигензв'язувальний фрагмент за винаходом, що специфічно зв'язується з CD154. Крім того, описані вище варіанти здійснення антитіл можуть являти мишачі антитіла, антитіла хом'яка, козячі, кролячі, химерні, гуманізовані або повністю людські антитіла, їхні фрагменти, похідні або кон'югати. Очевидно, зрозуміло, що в деяких аспектах винаходу термін "антитіло" може виключати один або більше варіантів здійснення антитіла, згаданих вище; такі обставини будуть зрозумілі фахівцям у даній галузі. Термін "пегілювання", "поліетиленгліколь" або "ПЕГ" включає поліалкіленгліколь або його похідне, з або без застосування агентів, що сполучають, або дериватизації групами, що сполучають або активують (наприклад, тіолом, трифлатом, трезилатом, азирдином, оксираном або переважно малеімідом, наприклад, ПЕГ-малеімідом). Інші відповідні поліалкіленгліколі включають, не обмежуючись цим, малеімідомонометокси-ПЕГ, активований ПЕГ пропіленгліколь, але також заряджені або нейтральні полімери наступних типів: декстран, коломінова кислота, або інші полімери на основі вуглеводів, полімери амінокислот і біотин та інші похідні афінних реагентів. Термін "ефекторна функція" стосується функціональної здатності або Fc-ділянки константної ділянки антитіла зв'язуватися з білками і/або клітинами імунної системи. У даній галузі добре відомі антитіла зі зниженою ефекторною функцією і методи конструювання таких антитіл (дивися, наприклад, WO 05/18572, WO 05/03175 і патент США № 6242195) і вони детально описані в даному документі. Типові ефекторні функції включають здатність зв'язуватися з білком комплементу (наприклад, білком комплементу Clq) і/або Fc-рецептором (FcR) (наприклад, FcRI, FcRII, FcRIIa, FcRIII і/або FcRIIIb). Функціональні наслідки здатності зв'язуватися з однією або більше зазначених вище молекул включають, не обмежуючись цим, опсонізацію, фагоцитоз, антигензалежну клітинну цитотоксичність (ADCC), комплементзалежну цитотоксичність (CDC) і/або модифікацію ефекторних клітин. Зниження ефекторної функції стосується зниження однієї або більше біохімічної або клітинної активності, ідукованої принаймні, частково зв'язуванням FcR із його близьким рецептором або білком комплементу, або ефекторною клітиною, з одночасним збереженням антигензв'язувальної активності варіабельної ділянки антитіла (або його фрагмента), проте, зі зниженою, аналогічною, ідентичною або підвищеною афінністю зв'язування. Конкретні антитіла за винаходом виявляють знижену ефекторну функцію. Зниження ефекторної функції, наприклад, зв'язування Fc-ділянки з Fc-рецептором або білком комплементу, може виражатися в кратному зниженні (наприклад, зниженні в 1,5 рази, 2 рази тощо) і його можна розрахувати, ґрунтуючись, наприклад, на відсотковому зниженні активності зв'язування за даними тестів оцінки зв'язування, відомих у даній галузі (дивися, наприклад, заявку WO 05/18572). Якщо не потрібно інакше за контекстом, то терміни в однині будуть включати терміни в множині, і терміни в множині будуть включати терміни в однині. У даній заявці і формулі винаходу слово "містити" або його варіації, такі як "містить" або "що містить" означають включення визначеного цілого числа або групи цілих чисел, але не означає виключення будь-якого іншого цілого числа або групи цілих чисел. CD154 CD154 відомий у даній галузі під декількома іншими назвами, такими як ліганд CD40 (CD40L), CD40 протирецептор (CD40CR), gp39, T-BAM, молекула, що активує Т-клітини, TRAF, TNF-зв'язаний білок активації (TRAP) і член 5 надсімейства лігандів фактора некрозу пухлин (TNFSF5) (Gauchat et al., 1993, FEBS Lett., 315:259-266; Graf et al., Europ. J. Immun., 22:31913194; Hollenbaugh et al., 1992, EMBO J., 11:4313-4321). У заявці дані терміни використовуються взаємозамінно. CD154-зв'язувальні білки, включаючи антитіла, за даним винаходом специфічно зв'язуються з людським CD154 і можуть перехресно реагувати і, отже, специфічно зв'язуватися з CD154 інших видів. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальні білки, включаючи антитіла, за даним винаходом специфічно зв'язуються з людським CD154, мишачим CD154 або CD154 примату, що не стосується людини. Анти-CD154-антитіла і CD154-зв'язувальні білки У тому значенні, в якому термін "анти-CD154-антитіло" використовують у даному документі, то він стосується молекули імуноглобуліну, яка здатна специфічно зв'язуватися з епітопом в антигені CD154. Анти-CD154-антитіла можуть являти інтактні імуноглобуліни, одержані з природних джерел або з рекомбінантних джерел, і вони можуть являти імунореактивні ділянки інтактних імуноглобулінів. Як правило, антитіла є тетрамерами імуноглобулінових молекул. Отже, і це стосується усіх варіантів здійснення або способів за даним винаходом, "антиCD154-антитіло" включає (якщо не зазначено інакше або у випадках, коли це слід розуміти 14 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інакше за контекстом) моноклональне антитіло, поліклональне антитіло, мишаче антитіло, антитіло хом'яка, козяче антитіло, кроляче антитіло, химерне антитіло, приматизоване антитіло, гуманізоване антитіло, (повністю) людське антитіло, мультимерне антитіло, гетеродимерне антитіло, гемідимерне антитіло, бі-, три- або тетравалентне антитіла, біспецифічне антитіло, одноланцюгове антитіло (наприклад, scFv, scFab і scFabC), біс-scFv, діантитіло, триантитіло або тетрантитіло, однодоменні антитіла з однією ділянкою і модифіковані Fab-фрагменти. У деяких варіантах здійснення анти-CD154-антитіло є антитілом, що містить тільки один варіабельний домен імуноглобуліну. Отже, моновалентні антитіла включають антитіла, що містять тільки один варіабельний домен імуноглобуліну (тобто одну варіабельну ділянку легкого ланцюга або важкого ланцюга) і які специфічно зв'язуються з CD154. Крім того, анти-CD154антитіла за винаходом можуть бути моновалентними, дивалентними або мультивалентними стосовно зв'язування з CD154. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-CD154-антитіло, зі зниженою ефекторною функцією містить будь-який фрагмент анти-CD154-антитіла, який є достатнім для підтримування специфічного зв'язування з антигеном CD154. Наприклад, антитіло може містити тільки один варіабельний домен імуноглобуліну – VH- або VL- домен. Отже, у деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-CD154антитіло, є фрагментом антитіла. Фрагменти антитіла включають, наприклад, Fab-фрагмент, F(ab)2-фрагмент, Fab-фрагмент, F(ab)2-фрагмент, F(ab)3-фрагмент, одноланцюговий F(v)фрагмент або Fv-фрагмент, і фрагменти будь-якого з зазначених вище, що зв'язуються з епітопом (дивися, наприклад, Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23(9):1126-1136). Фрагменти антитіл за даним винаходом детальніше описані нижче. В одному прикладі CD154-зв'язувальні білки або анти-CD154-антитіла являють антитіла (наприклад, антитіла підтипу IgG4) або фрагменти (наприклад, Fab-фрагменти), які містять нативну або модифіковану шарнірну ділянку. Описано ряд модифікованих шарнірних ділянок, наприклад, у патенті США № 5677425, заявках WO 99/15549 і WO 98/25971. В іншому прикладі антитіла за винаходом модифіковані в їхніх константних ділянках, як, наприклад, антитіла, описані в заявках WO 05/003169, WO 05/003170 і WO 05/003171. Будь-які з наведених вище анти-CD154-антитіл, похідних антитіл або фрагментів антитіл можна використовувати для одержання кон'югатів антитіл за даним винаходом. Будь-які з наведених вище антитіл, фрагментів або кон'югатів можуть виявляти знижену ефекторну функцію у порівнянні з другим анти-CD154-антитілом. Молекули антитіл за винаходом можуть походити з будь-якого класу (наприклад, IgG, IgE, IgM, IgD або IgA) або підкласу молекул імуноглобулінів. Домени константної ділянки антитіла, якщо вони є, можуть бути вибрані з урахуванням передбачуваної функції молекули антитіла. Наприклад, домени константної ділянки можуть являти домени IgA, IgD, IgE, IgG або IgM людини. Зокрема, можна використовувати домени константної ділянки людського IgG, особливо IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4. Ізотипи IgG2 і IgG4 можна використовувати в деяких варіантах здійснення, де молекула антитіла призначається для терапевтичних застосувань, при яких бажані знижені або еліміновані ефекторні функції антитіла. Альтернативно можна використовувати ізотипи IgG1 і IgG3, коли молекула антитіла призначається для терапевтичних цілей, для яких вимагаються ефекторні функції антитіла. У деяких варіантах здійснення одну або більше CDR CD154-зв'язувального білка, наприклад, анти-CD154-антитіла, за винаходом можна включити в один або більше імуноглобулінових доменів, універсальних каркасних структур, білкових носіїв або інших біологічно сумісних каркасних структур на основі білкових носіїв або інших каркасів ніж імуноглобулінові домени (Nygren & Uhlen, 1997, Curr. Opin. Strural. Biol., 7:463-469; Saragovi et al., 1992, Bio/Technology, 10:773-779; Skerra, 2000, J. Mol. Recognition, 13:167-187). У деяких варіантах здійснення CDR анти-CD154-антитіла включають в універсальну каркасну структуру (тобто каркасну структуру, яку можна використовувати для створення повної варіабельності функцій, специфічностей і властивостей, які спочатку підтримуються великою колекцією різних каркасів, дивися патент США № 6300064). В інших варіантах здійснення можна використовувати альтернативні основи (дивися, наприклад, Binz et al., 2005, Nat. Biotech., 23:1257-1268 Hosse і et al., 2006, Protein Science, 15:14-27) для створення CD154-зв'язувальних білків за винаходом. Також термін "анти-CD154-антитіло" включає синтетичне антитіло або рекомбінантне антитіло, яке одержане з використанням технології рекомбінантної ДНК, наприклад, таке як антитіло, експресоване бактеріофагом. Термін "анти-CD154-антитіло" також слід розуміти, як такий, що містить антитіло, яке одержане синтезом молекули ДНК, що кодує антитіло, і молекула даної ДНК експресує білок антитіла або амінокислотну послідовність, що визначає антитіло, де ДНК або амінокислотна послідовність одержані з використанням технології 15 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 синтетичної ДНК або амінокислотної послідовності, яка доступна і добре відома в даній галузі. В одному варіанті здійснення винахід стосується "анти-CD154-антитіла", що є моноклональним антитілом. Моноклональне антитіло стосується антитіла, одержаного з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, що складають популяцію, є ідентичними за винятком можливих природних мутацій, які можуть бути присутніми у мінорних кількостях. Прикметник "моноклональне" вказує на природу антитіла, як одержаного по суті з гомогенної популяції антитіл, і це не слід розглядати як обов'язкове одержання антитіла якимнебудь конкретним методом. Наприклад, моноклональні антитіла для застосування за даним винаходом можна одержати гібридомним методом (із використанням мишачої або людської гібридоми), вперше описаним Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), або можна одержати методами рекомбінантної ДНК (дивися, наприклад, патент США № 4816567). "Моноклональні антитіла" також можна виділити з фагових бібліотек антитіл із використанням методів, описаних, наприклад, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) і Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991). Також слід розуміти, що деякі варіанти здійснення даного винаходу стосуються композицій, що містять одне або більше різних моноклональних антитіл, які специфічно зв'язуються з CD154, тобто композиції поліклональних антитіл, що містять безліч моноклональних антитіл із різними специфічностями до епітопів. В іншому варіанті здійснення винаходу "анти-CD154-антитіло" стосується антитіла, яке є химерним антитілом, або похідного антитіла або кон'югату або його антигензв'язувального фрагмента. Як правило, химерні антитіла містять варіабельні ділянки важкого і/або легкого ланцюга, що включають залишки CDR і каркасної ділянки одного виду (як правило, миші), злиті з константними ділянками іншого виду (як правило, людини). Дані химерні мишачі/людські антитіла містять приблизно 75 % людських і 25 % мишачих амінокислотних послідовностей. Людські послідовності являють константні ділянки антитіла, у той час як мишачі послідовності являють варіабельні ділянки (і таким чином, містять антигензв'язувальні сайти) антитіла. В іншому варіанті здійснення CD154-зв'язувальні білки, анти-CD154-антитіла за даним винаходом включають антитіла, похідні антитіл і антигензв'язувальні фрагменти, що містять варіабельний домен, що включає каркасні ділянки з одного антитіла, і ділянки CDR – з іншого антитіла. У конкретнішому варіанті здійснення CD154-зв'язувальні білки та анти-CD154-антитіла за даним винаходом включають химерні антитіла, що містять каркасні ділянки і ділянки CDR із різних людських антитіл. Способи одержання всіх химерних антитіл, описаних вище, добре відомі фахівцям у даній галузі. Дивися, наприклад, патент США № 5807715; Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81(21):6851-5; Sharon et al., 1984, Nature, 309(5966):364-7; Takeda et al., 1985, Nature, 314(6010):452-4. У деяких варіантах здійснення даного винаходу анти-CD154-антитіло, яке зв'язується з CD154, одержують методом відбирання антитіл лімфоцитів (SLAM) (Babcook et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-7848; WO 92/02551; de Wildt et al., 1997, J. Immunol. Methods, 207:61-67 і Lagerkvist et al., 1995, BioTechniques, 18:862-869), за допомогою яких можна виділити клітини будь-якого виду, що продукують високоафінні антитіла під час імунних відповідей в умовах in vivo. Інші методи включають описані de Wildt et al., 1997, J. Immunol. Methods, 207:6167 і Lagerkvist et al., 1995, BioTechniques, 18(5):862-869. Зазначені вище методи засновані на виділенні окремих продукуючих антитіла клітин, які потім піддають клональній експансії з наступним скринінгом на клони, які продукують анти-CD154-антитіла, із наступною ідентифікацією послідовності генів їхньої варіабельної ділянки важкого ланцюга (VH) і легкого ланцюга (VL). Конкретний метод скринінгу детально описаний у WO 04/051268. Таким чином, виділяють В-клітини, які є позитивними на антитіла проти CD154. В-клітини можуть походити від людини, миші, щура, хом'яка, кролика, кози або іншого виду ссавців. Гени антитіл у даних Вклітинах можна клонувати і експресувати у клітині-хазяїні, наприклад, із використанням звичайної технології рекомбінантної ДНК. У деяких варіантах здійснення клітиною-хазяїном є E. coli. Інші клітини-хазяїни детально описані нижче. Антитіла (які включають фрагменти антитіл, такі як Fab-фрагменти), експресовані в даних клітинах, можна виділити звичайними методами. Якщо антитіла походять із джерела, що відрізняється від людини, то їх можна піддати гуманізації звичайними методами, такими як мутагенез їхніх генів. Потім гуманізовані антитіла можна експресувати у клітині-хазяїні і потім можна виділити. Моноклональні антитіла можна одержати будь-яким методом, відомим у даній галузі, таким як гібридомний метод (Kohler & Milstein, 1975, 256:495-497), триомний метод, метод людських Вклітинних гібридом (Kozbor et al., Immunology Today, 1983, 4, 72) і EBV-гібридомний метод (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985). У даній 16 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 галузі добре відомі методи створення та одержання рекомбінантних антитіл (дивися, наприклад, патент США № 4816397; патент США № 6331415; Simmons et al., 2002, Journal of Immunological Methods, 263, 133-147; WO 92/02551; Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3833; Reichmann et al., 1988, Nature: 322, 323; патент США № 5585089; WO 91/099967; Mountain and Adair, 1992, Biotechnolog. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142; Verma et al., 1998, J. Immunol. Methods, 216:165-181; Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotech., 23(9):1126-1136). Антитіла за даним винаходом також можна одержати з використанням різних методів фагового дисплея, відомих у даній галузі, і вони включають описані Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182:41-50; Ames et al., 1995, I. Immunol. Methods, 184: 177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24: 952-958; Persic et al., 1997, Gene, 187: 9-18; і Burton et al., 1994, Advances in Immunol., 57: 191-280; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; і WO 95/20401; і патенти США № 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 і 5969108. Також можна використовувати трансгенних (наприклад, генно-інженерних) мишей або інші організми, включаючи інших ссавців, для одержання зв'язувальних білків і антитіл за даним винаходом (дивися, наприклад, патент США № 6300129). Наприклад, відомо, що можна одержати мишей із метою заміщення тільки варіабельних ділянок мишачих імунних локусів (сегменти V, D, і J важкого ланцюга, сегменти V і J легкого ланцюга) на відповідні людські варіабельні послідовності, для одержання великих кількостей високоафінних антитіл із людськими варіабельними послідовностями (дивися, наприклад, патент США № 6586251; патент США № 6596541 і патент США № 7105348). У ще одному варіанті здійснення даного винаходу "анти-CD154-антитіло" стосується антитіла, похідного або кон'югату антитіла, або антигензв'язувального фрагмента, які піддалися приматизації або гуманізації. Приматизовані і гуманізовані антитіла, як правило, включають CDR важкого і/або легкого ланцюга з мишачого антитіла, пересадженого в каркасну V-ділянку антитіла примату, який відрізняється від людини, або людини, які звичайно додатково містять людську константну ділянку. Дивися, наприклад, Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; патенти США № 6054297; 5821337; 5770196; 5766886; 5821123; 5869619; 6180377; 6013256; 5693761 і 6180370. Логічним обґрунтуванням застосування таких приматизованих або гуманізованих антитіл є збереження (людської) антигенної специфічності мишачого антитіла, яку надають мишачі CDR, з одночасним зниженням імуногенності мишачого антитіла (мишаче антитіло буде викликати імунну відповідь проти нього у видів, які відрізняються від миші) за допомогою використання якнайбільше людських каркасних послідовностей. Такі антитіла можна застосовувати при лікуванні людини з метою зведення до мінімуму або усунення небажаних побічних ефектів, таких як імунні реакції у відповідь. Описані антитіла, що містять донорні CDR, пересаджені з антиген-специфічних антитіл, які відрізняються від людських, на гомологічні акцепторні каркасні ділянки від примату, який відрізняється від людини, зі зниженою імуногенністю в людей (заявки на патент США 2005/0208625; 2002/0062009; патент США № 7338658). Отже, гуманізовані форми антитіл, які відрізняються від людських (наприклад, мишачих), є специфічними химерними імуноглобулінами, ланцюгами імуноглобулінів або їх фрагментами (такими як Fv, Fab, Fab, F(ab)2 або іншими антигензв'язувальними послідовностями антитіл), які містять послідовності, одержані з імуноглобулінових послідовностей, які відрізняються від людських, і людських імуноглобулінових послідовностей. У своїй більшості гуманізовані антитіла являють людські імуноглобуліни (реципієнтне антитіло), в яких залишки з ділянок (CDR) реципієнтного антитіла, що визначають комплементарність, заміщені на залишки CDR від видів, які відрізняються від людини (донорне антитіло), таких як миша, щур або кролик, із бажаною специфічністю, афінністю або ємністю. У деяких випадках залишки каркасної Fv-ділянки (FR) людського імуноглобуліну заміщають на відповідні залишки FR, які відрізняються від людських. Крім того, гуманізоване антитіло може містити залишки, які неможливо знайти ні в реципієнтному антитілі, ні в імпортованих послідовностях CDR або FR. Дані модифікації проводять для додаткової обробки та оптимізації функціональної здатності антитіла. У цілому гуманізоване антитіло може містити по суті всі, принаймні, один і, як правило, два варіабельних домени, в яких усі або по суті всі ділянки CDR відповідають таким в імуноглобуліні, який відрізняється від людського, і всі або по суті всі залишки FR являють такі консенсусної послідовності людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло необов'язково може також містити, принаймні, ділянку константної ділянки імуноглобуліну (Fc), як правило, таку людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло (яке включає, наприклад, фрагменти антитіла, або похідні кон'югати антитіла) можна одержати технологією рекомбінантної ДНК, в якій деякі або всі амінокислоти 17 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 легкого і важкого ланцюга людського імуноглобуліну, які не вимагаються для зв'язування антигену (наприклад, константні ділянки і каркасні ділянки варіабельного домену) використовують для заміни відповідних амінокислот із легкого і важкого ланцюга близького антитіла, який відрізняється від людського. Способи одержання гуманізованих антитіл добре відомі фахівцям у галузі антитіл. Дивися, наприклад, ЕР 239400; Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86:10029; Orlandi et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86:3833; патент США № 6180370 і ЕР 519596, в яких описана зміна антитіл через поверхневі залишки. Отже, в одному варіанті здійснення даного винаходу анти-CD154-антитіло стосується гуманізованого антитіла (яке включає, без обмеження, гуманізований антигензв'язувальний фрагмент і похідне або кон'югат гуманізованого антитіла), яке одержують трансплантацією мишачих або щурячих (або інших нелюдських) CDR у людське антитіло. Конкретніше, дану гуманізацію антитіла проводять у такий спосіб: (1) виділяють кДНК, що кодують варіабельні домени важкого і легкого ланцюга, з гібридоми або В-клітин, що секретують антитіло; (2) визначають секвенуванням послідовності ДНК варіабельних доменів, що включають CDR; (3) ДНК, що кодують CDR, переносять у відповідні ділянки послідовності, що кодує варіабельні домени важкого і легкого ланцюга людського антитіла сайт-спрямованим мутагенезом, і (4) додають сегменти гена людської константної ділянки бажаного ізотипу (наприклад, 1 для СН і  для CL). Нарешті, гени гуманізованих важкого і легкого ланцюгів коекспресують у клітинаххазяїнах ссавців (наприклад, клітинах СНО або NSO) для одержання розчинного гуманізованого антитіла. Однак пряме перенесення CDR у людську каркасну ділянку призводить до втрати афінності зв'язування антигену в одержаного зв'язувального білка або антитіла. Втрата афінності зв'язування антигену може мати місце, оскільки в деяких близьких антитілах деякі амінокислоти в константних ділянках взаємодіють із CDR і, таким чином, впливають на афінність зв'язування антигену біля антитіла в цілому. У таких випадках фахівець зрозуміє, що буде критичним ввести "зворотні мутації" у каркасні ділянки акцепторного антитіла для збереження антигензв'язувальної активності близького антитіла. Загальні підходи проведення зворотних мутацій добре відомі фахівцям у даній галузі. Дивися, наприклад, Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86:10029; Co et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88:2869-2873; WO 90/07861; Tempest 1991, Biotechnology, 9:266-271. Приклади зворотних мутацій антитіл за даним винаходом включають такі залишки, показані на фіг.9, під назвою донори. У деяких варіантах здійснення зв'язувальний білок або антитіло за даним винаходом може містити домен VH, який не є варіабельним доменом верблюжого або мишачого імуноглобуліну. У деяких варіантах здійснення поліпептид антитіла містить V H-домен, який не містить одну або більше амінокислот, які є специфічними для варіабельних доменів верблюжого імуноглобуліну у порівнянні з людськими VH-доменами. В одному варіанті здійснення даного винаходу "анти-CD154-антитіло" стосується антитіла (яке включає антигензв'язувальний фрагмент і похідне або кон'югат антитіла), яке є повністю людським. Повністю "людське" антитіло містить поліпептид антитіла або варіабельний домен імуноглобуліну, який має послідовність, одержану з людського імуноглобуліну (наприклад, одержану з кодуючої послідовності людського імуноглобуліну). Термін "людське антитіло" включає, наприклад, антитіла з варіабельною і константною ділянками (якщо присутні), одержані з людських імуноглобулінових послідовностей зародкової лінії. У тому значенні, в якому термін "людські" використовується в даному документі стосовно антитіла або фрагмента, такого як варіабельний домен, то він не включає антитіло від іншого виду, наприклад, миші, що було "гуманізоване" за допомогою перенесення послідовностей людської константної ділянки на поліпептид антитіла (тобто заміщенням константних ділянок, які відрізняються від людських, на людські константні ділянки), або за допомогою перенесення послідовностей людської каркасної ділянки V-домену у варіабельний домен імуноглобуліну від ссавця, який відрізняється від людини (наприклад, заміщенням каркасних ділянок V-домену, які відрізняються від людських, на людські каркасні ділянки). Описані способи гуманізації варіабельних ділянок імуноглобуліну за допомогою раціональної модифікації залишків, що визначають комплементарність (заявка на патент США 2006/0258852). У деяких варіантах здійснення людські антитіла включають амінокислотні залишки, які не кодуються людськими імуноглобуліновими послідовностями зародкової лінії (наприклад, мутації, уведені випадковим або сайт-специфічним мутагенезом в умовах in vitro, або соматичною мутацією в умовах in vivo). У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-CD154-антитіла, що містить варіабельну ділянку з однією або більше каркасними 18 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ділянками (наприклад, FW1, FW2, FW3 і/або FW4), що мають амінокислотну послідовність, яка є такою же, як амінокислотна послідовність відповідної каркасної ділянки, кодованої сегментом гена людського антитіла зародкової лінії, або амінокислотні послідовності однієї або більше зазначених каркасних ділянок, що у цілому містять до 5 амінокислотних відмінностей у порівнянні з амінокислотною послідовністю зазначеної відповідної каркасної ділянки, кодованої сегментом гена людського антитіла зародкової лінії. У додаткових варіантах здійснення амінокислотні послідовності каркасних ділянок (FW1, FW2, FW3 і/або FW4) варіабельного домену є такими ж, як амінокислотні послідовності відповідних каркасних ділянок, кодованих сегментом гена людського антитіла зародкової лінії, або послідовності FW1, FW2, FW3 і/або FW4 у цілому містять до 10 амінокислотних відмінностей у порівнянні з послідовностями відповідних каркасних ділянок, кодованих сегментом гена людського антитіла зародкової лінії. Зразкові сегменти гена антитіла зародкової лінії включають, наприклад, DP47, DP45, DP48 і DPK9 (заявка на патент США 2006/00627784) і сегменти, що кодують акцепторні каркасні послідовності, описані в прикладах і наведені на фігурах. У деяких варіантах здійснення людське антитіло (яке включає фрагмент антитіла або послідовність варіабельного домену) має, принаймні, 85 % ідентичність амінокислотної послідовності (у тому числі, наприклад, 87 %, 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % або вище ідентичність послідовностей) із природним людським антитілом. Повністю людські або людські антитіла можна одержати з трансгенних (наприклад, генноінженерних, таких як нок-ін) мишей, що несуть гени людського антитіла (що несуть екзони варіабельної ділянки (V), різноманітності (D), сполуки (J) і константної ділянки (C)) або людські V-, D- і Галуз-J-ділянки з людських клітин. Наприклад, у даний час можливо одержати генноінженерних тварин (наприклад, мишей), які здатні, при імунізації, продукувати повний репертуар людських антитіл за відсутності ендогенної продукції імуноглобулінів (дивися, наприклад, Jakobovits et al., PNAS, 90:2551, 1993; Jakobovits et al., Nature, 362:255-258, 1993; Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33, 1993 і Duchosal et al., Nature, 355:258, 1993). Можна одержати трансгенну лінію мишей (наприклад, генно-інженерних, включаючи нок-аут, нок-ін, заміщення генів тощо) із послідовностями генів із нереаранжованих генів людських імуноглобулінів. Людські послідовності можуть кодувати важкі і легкі ланцюги людських антитіл і вони будуть функціонувати правильно в мишей, піддаючи реаранжуванню з одержанням широкого репертуару антитіл, аналогічних до таких у людей. Генно-інженерних мишей можна імунізувати білком-мішенню (наприклад, CD154, його фрагментами або клітинами, експресуючими CD154) з одержанням широкого спектра специфічних антитіл і кодуючих їх РНК. Нуклеїнові кислоти, що кодують компоненти ланцюгів таких антитіл, потім можна клонувати із тварини у векторний дисплей. Як правило, клонують окремі популяції нуклеїнових кислот, що кодують послідовності важкого і легкого ланцюгів і потім окремі популяції рекомбінують при уставлянні у вектор таким чином, щоб будь-яка дана копія вектора одержувала випадкову комбінацію важкого і легкого ланцюгів. Вектор сконструйований для експресії ланцюгів антитіла таким чином, щоб їх можна було зібрати і розташувати на зовнішній поверхні упаковки дисплея, що містить вектор. Наприклад, ланцюги антитіла можна експресувати у вигляді злитих конструкцій із білком оболонки фага із зовнішньої поверхні фага. Потім упаковку дисплея можна піддати скринінгу для розташування антитіл, що зв'язуються з мішенню. Крім того, людські антитіла можна одержати з бібліотек фагового дисплея (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597, 1991; Vaughan et al., Nature Biotech., 14:309, 1996; патент США № 6300064). Можна створити синтетичні фагові бібліотеки, в яких використовуються рандомізовані комбінації V-ділянок синтетичних людських антитіл. Можна провести відбір повністю людських антитіл із використанням антигену, в яких V-ділянки за своєю природою є дуже близькими до людських. Дивися патенти США № 6794132, 6680209, 4634666 і Ostberg et al., 1983, Hybridoma, 2:361-367. Одержання людських антитіл також дивися в Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156, 1997; Green and Jakobovits, J. Exp. Med., 188:483-495. Додатково людські антитіла обговорюються та описані в патентах США № 5939598 і 6673986. Також дивися патенти США № 6114598, 6075181 і 6162963. Також дивися патенти США № 6150584, 6713610, 6657103, заявки на патент США 2003/0229905 А1, 2004/0010810 А1, 2004/0093622 А1, 2006/0040363 А1, 2005/0054055 А1, 2005/0076395 А1 і 2005/0287630 А1. Також дивися ЕР 0463151 В1, WO 94/02602, WO 96/34096 і WO 98/24893. В альтернативному підході інші автори використовували "мінілокусний" підхід. При мінілокусному підході імітують екзогенний локус Ig за допомогою включення ділянок (окремих генів) з локусу Ig. Таким чином, один або більше VH-генів, один або більше DH-генів, один або більше JH-генів, mu-генів константної ділянки і другої константної ділянки (переважно 19 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 константної гамма-ділянки) формують у конструкцію для вставки тварині. Даний підхід описаний, наприклад, у патентах США № 5545807, 5545806, 5625825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5591669, 5612205, 5721367, 5789215 і 5643763. Також дивися патенти США № 5569825, 5877397, 6300129, 5874299, 6255458 і 7041871, розкриття яких у повному обсязі включено в даний документ до відома. Також дивися ЕР 0546073, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 92/14436, WO 97/13852 і WO 98/24884. Також дивися Taylor et al. (1992, Nuc. Acids Res., 20:6287); Chen et al. (1993, Int. Immunol., 5:647); Tuaillon et al. (1993, PNAS USA, 90:3720-4); Choi et al. (1993, Nature Genetics, 4:117); Lonberg et al. (1994, Nature, 368:856-859); Taylor et al. (1994, International Immunology, 6:579-591) і Tuaillon et al. (1995, J. Immunol., 154:6453-65), Fishwild et al. (1996, Nature Biotechnology, 14:845) і Tuaillon et al. (2000, Eur. J. Immunol., 10:2998-3005). У конкретнішому варіанті здійснення даного винаходу повністю людські антитіла одержують із використанням праймованих в умовах in vitro людських спленоцитів (Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147:86-95). У конкретнішому варіанті здійснення даного винаходу повністю людські антитіла одержують клонуванням репертуару (Persson et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88:2432-2436; Huang and Stollar, 1991, J. Immunol. Methods, 141:227-236). Крім того, у патенті США 5798230 описане одержання людських моноклональних антитіл з В-клітин людини, де людські В-клітини, продукуючі антитіла, імморталізують зараженням вірусом Епштейна-Барра, або їхніх похідних, які експресують ядерний антиген 2 віруса Епштейна-Барра ("EBNA2"), білок, необхідний для імморталізації. Потім "відключають" функцію EBNA2, що призводить до підвищення продукції антитіл. Інші способи одержання повністю людських антитіл включають застосування тварин, які відрізняються від людини, в яких є інактивовані локуси ендогенного Ig і які є трансгенними для нереаранжованих генів важкого і легкого ланцюга людського антитіла. Таких трансгенних тварин можна піддати імунізації активованими Т-клітинами або білком D1.1 (патенти США № 5474771; 6331433 і 6455044) і гібридоми можна одержати з В-клітин, одержаних від них. У даній галузі детально описані ці методи. Дивися, наприклад, різні публікації/патенти, що стосуються трансгенних мишей, що містять мінілокуси людського Ig, включаючи патент США № 5789650; різні публікації/патенти щодо мишей XENOMOUSE®, включаючи патенти США № 6075181, 6150584 і 6162963; Green, 1997, Nature Genetics, 7:13-21; Mendez, 1997, Nature Genetics, 15:14656, і різні публікації/патенти, що стосуються "трансомних" мишей, включаючи ЕР 843961 і Tomizuka et al., 1997, Nature Genetics, 16:1433-43. CD154-зв'язувальні білки та анти-CD154-антитіла за даним винаходом також стосуються білків або антитіл, що перехресно блокують зв'язування, або зв'язувальним білків або антитіл, які зв'язуються з одним і тим самим епітопом або які зв'язуються з дуже близьким епітопом або епітопом, який перекривається, що і будь-які антитіла, описані в даному документі. Білки або антитіла, що перехресно блокують зв'язування, можуть конкурентно інгібувати або блокувати зв'язування будь-якого з антитіл, описаних у даному документі. У деяких варіантах здійснення винахід стосується CD154-зв'язувальних білків і анти-CD154-антитіл, які зв'язуються з одним і тим самим епітопом, що і гуманізоване антитіло, що містить послідовність важкого ланцюга SEQ ID NO:12 або SEQ ID NO:13 і містить послідовність легкого ланцюга SEQ ID NO:15 (Fab- і Fabфрагменти антитіла 342), і яке виявляє аналогічні стосовно CD154 зв'язувального властивості в конкурентних тестах з анти-CD154-антитілом 5с8, описаним у даному документі. В інших варіантах здійснення винахід стосується CD154-зв'язувальних білків і анти-CD154-антитіл, які зв'язуються з тим самим епітопом, що і гуманізоване антитіло, що містить послідовність VLдомену SEQ ID NO:58 і послідовність VН-домену SEQ ID NO:60 (послідовності варіабельної ділянки антитіла 338) і які виявляють аналогічні стосовно CD154 зв'язувальні властивості в конкурентних тестах з анти-CD154-антитілом 5с8, описаним у даному документі. У деяких варіантах здійснення даного винаходу CD154-зв'язувальний білок, наприклад, анти-CD154-антитіло, виявляє високу афінність для людського CD154. Наприклад, у деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок дисоціює від людського CD154 (людського CD40L) зі значенням Kd у межах від 50 нМ до 1 пкМ включно за даними поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, Biacore). Наприклад, Kd для людського CD154 може складати від 25 нМ до 1 пкМ, від 10 нМ до 1 пкМ, від 5 нМ до 1 пкМ, від 1 нМ до 1 пкМ, від 0,5 нМ до 1 пкМ, від 0,1 нМ до 1 пкМ, від 75 пкМ до 1 пкМ, від 50 пкМ до 1 пкМ, від 20 пкМ до 1 пкМ або навіть від 10 пкМ до 1 пкМ. В інших варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок за даним винаходом дисоціює від людського CD154 зі значенням Kd у межах від 500 пкМ до 1 пкМ включно за даними поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, Biacore). У деяких варіантах здійснення Kd для людського CD154 дорівнює менше 50 пкМ. Наприклад, у деяких 20 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок дисоціює від людського CD154 зі значенням K d меншим 20 пкМ. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок дисоціює від людського CD154 зі значенням Kd меншим 10 пкМ. У деяких варіантах здійснення CD154зв'язувальний білок зв'язується з CD154 з високою афінністю, але не витісняє зв'язаний CD154 від CD40. Афінність антитіла можна підвищити способами, відомими в даній галузі (дивися, наприклад, Clark et al., 2006, Protein Sci., 15(5):949-60, у даному джерелі описане підвищення афінності антитіла з використанням заснованого на структурі комп'ютерного аналізу, і Chao et al., 2006, Nat. Protoc., 1:755-768, у даному джерелі описані методи виділення і конструювання scFv з бажаними властивостями з використанням дисплея на поверхні дріжджів). У тих випадках, коли бажано підвищити афінність антитіл за винаходом, що містять одну або більше зазначених вище CDR, то такі антитіла з підвищеною афінністю можна одержати з використанням ряду протоколів дозрівання афінності, включаючи, але не обмежуючись цим, збереження CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254:392-403, 1995), поворот ланцюгів (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783, 1992), застосування мутантних штамів E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250:350-368, 1996), поворот ДНК (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8:724-733, 1997), фаговий дисплей (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256:7-88, 1996) і ПЛР (Crameri et al., Nature, 391:288-291, 1998). Усі дані методи дозрівання афінності обговорюються Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16:535-539, 1998). Таким чином, винахід стосується варіантів послідовностей антитіл за винаходом, що специфічно зв'язуються з CD154. Такі варіанти послідовностей містять одну або більше напівконсервативних або консервативних замін у їхній послідовності, і такі заміни переважно істотно не впливають на бажану активність поліпептиду. Заміни можуть бути природними або їх можна ввести, наприклад, за допомогою мутагенезу (наприклад, Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem., 253:6551). Наприклад, амінокислоти гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин часто можна замістити на інші амінокислоти (амінокислоти, що мають аліфатичні бічні ланцюги). З даних можливих замін переважно, щоб гліцин та аланін використовували для заміни на іншу амінокислоту (оскільки вони мають відносно короткі бічні ланцюги) і щоб валін, лейцин і ізолейцин використовували для заміни на іншу амінокислоту (оскільки вони мають великі аліфатичні бічні ланцюги, що є гідрофобними). Інші амінокислоти, які часто можна замінити на іншу амінокислоту, включають, але не обмежуються цим: - фенілаланін, тирозин і триптофан (амінокислоти, що мають ароматичні бічні ланцюги); - лізин, аргінін і гістидин (амінокислоти, що мають основні бічні ланцюги); - аспартат і глутамат (амінокислоти, що мають кислі бічні ланцюги); - аспарагін і глутамін (амінокислоти, що мають амідні бічні ланцюги); і - цистеїн і метіонін (амінокислоти, що мають сірковмісні бічні ланцюги). Афінність зв'язування CD154-зв'язувальних білків, наприклад, анти-CD154-антитіл, за даним винаходом також можна представити у відносних показниках або при порівнянні з афінністю зв'язування другого антитіла, яке також специфічно зв'язується з CD154 (наприклад, другого анти-CD154-антитіла, яке є CD154-специфічним, котре можна віднести в даному документі до "другого CD154-специфічного антитіла"). У деяких варіантах здійснення CD154-специфічне антитіло може являти антитіло 5с8 (продуковане гібридомою, депонованою в АТСС під інвентарним номером НВ 10916, описаною в патенті США № 5474771) або гуманізоване антитіло 5с8. В інших варіантах здійснення друге CD154-специфічне антитіло може являти будь-яке з антитіл за винаходом, таке як 342, 381, 338, 294, 295, 300, 335, 303 або 402 (фіг.12). Отже, деякі варіанти здійснення даного винаходу стосуються анти-CD154-антитіла, що зв'язується з людським CD154 з вищою афінністю у порівнянні з антитілом 5с8 або з K D, яка нижче ніж KD антитіла 5с8. У деяких варіантах здійснення анти-CD154-антитіло за даним винаходом також інгібує активність CD154 або блокує взаємодію CD154:CD40 у більшому ступені у порівнянні з другим CD154-специфічним антитілом, таким як 5с8, в еквімолярних концентраціях. Відносну здатність анти-CD154-антитіла блокувати взаємодію CD154:CD40 можна оцінити будь-яким доступним методом аналізу, наприклад, таким як тест позитивної регуляції ICAM-1, описаний у даному документі та у тестах конкурентного зв'язування. Отже, у деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальні білки та анти-CD154-антитіла (включаючи фрагменти і похідні антитіл) за винаходом є придатними для інгібування зв'язування CD154 з CD40 і роблять це з високою специфічністю, наприклад, зі значенням IC 50 у межах від 10 пкМ до 1,5 мкМ, включно. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальні білки, наприклад, анти-CD154-антитіла, за винаходом можуть мати значення IC50 у межах від 10 пкМ до 500 пкМ, від 50 пкМ до 500 пкМ, від 100 пкМ до 500 пкМ, від 250 пкМ до 750 пкМ, від 500 пкМ до 1 мкМ або від 750 пкМ до 1,5 мкМ. У додаткових варіантах здійснення анти-CD154-антитіло по суті не має агоністичну дію стосовно активності CD40 або не активує сигнальний шлях за участю CD40. У деяких варіантах здійснення анти-CD154-антитіло за даним винаходом чинить 21 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антагоністичну дію на активність CD154 або CD40 або обох молекул. Отже, деякі варіанти здійснення даного винаходу стосуються CD154-зв'язувальних білків і анти-CD154-антитіл, які зв'язуються з людським CD154 з вищою або однаковою афінністю у порівнянні з другим CD154-специфічним антитілом (наприклад, антитілом 5с8 або гуманізованим антитілом 5с8), або зі значенням KD, яке нижче або дорівнює KD другого CD154специфічного антитіла, де анти-CD154-антитіло по суті не інгібує взаємодію CD154:CD40 у порівнянні з другим CD154-специфічним антитілом. Такі антитіла можуть бути придатними, наприклад, для постановки тесту зв'язування і як діагностичні реагенти. Зразкові антитіла, що виявляють високу афінність для людського CD154, але мають нижчий ступінь інгібування взаємодії CD154:CD40 у порівнянні з другим CD154-специфічним антитілом, є антитілами 381 і 338, описаними в даному документі. Наприклад, даний винахід стосується анти-CD154-антитіл, що специфічно зв'язуються з людським CD154 з вищою або однаковою афінністю (у порівнянні з другим CD154-специфічним антитілом, наприклад, таким як гуманізоване антитіло 5с8), але яке блокує взаємодію CD154:CD40 у меншому ступені, ніж це робить друге CD154-специфічне антитіло. У додаткових варіантах здійснення дані анти-CD154-антитіла, які інгібують зв'язування CD154 (CD40L) з CD40 у меншому ступені, ніж це робить друге CD154-специфічне антитіло, також по суті не чинять агоністичної дії стосовно активності CD40 або не активують сигнальний шлях за участю CD40. Наприклад, такі антитіла, якщо їх застосовують у тесті оцінки ефективності в умовах in vitro, як описано в прикладі 7, можуть не виявляти статистично значимого агоністичної дії у порівнянні з контрольною обробкою або можуть виявляти агоністичну дія на рівні 1 %, 2 %, 3 %, 5 % або 10 % у порівнянні з позитивним контролем (наприклад, лігандом CD154). Vidalain et al. (The EMBO Journal, 2000, 19:3304-3313) і Pearson et al. (International Immunology, 2001, 13:273-283) описують сигнальний шлях CD40 і також наводять тести, які можна використовувати для визначення того, блокується або інгібується, або ні, взаємодія CD154:CD40, і в якому ступені. У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-CD154-антитіла, що містить, принаймні, одну CDR, вибрану з CDR-Н1 (SEQ ID NO:3), CDR-Н2 (SEQ ID NO:4) і CDR-Н3 (SEQ ID NO:5). Переважно антитіло містить, принаймні, дві CDR, вибрані з CDR-Н1 (SEQ ID NO:3), CDR-Н2 (SEQ ID NO:4) і CDR-Н3 (SEQ ID NO:5) і переважніше всі три дані CDR-Н1, CDR-Н2 і CDR-Н3. В іншому варіанті здійснення анти-CD154-антитіло за винаходом, містить, принаймні, одну CDR, вибрану з CDR-L1 (SEQ ID NO:6), CDR-L2 (SEQ ID NO:7) і CDR-L3 (SEQ ID NO:8). Переважно антитіло містить, принаймні, дві CDR, вибрані з CDR-L1 (SEQ ID NO:6), CDR-L2 (SEQ ID NO:7) і CDR-L3 (SEQ ID NO:8) і переважніше всі три дані CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3. У додаткових варіантах здійснення антитіло містить усі три CDR-Н1, CDR-Н2 і CDR-Н3 (SEQ ID NO:3-5) і всі три CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3 (SEQ ID NO:6-8). У додаткових варіантах здійснення анти-CD154-антитіло містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга однієї з SEQ ID NO:1, 9, 10 або 11 і містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга однієї з SEQ ID NO:2 або 14. У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-CD154-антитіла, що містить, принаймні, одну CDR, вибрану з CDR-Н1 (SEQ ID NO:42), CDR-Н2 (SEQ ID NO:43) і CDR-Н3 (SEQ ID NO:44). Переважно антитіло містить, принаймні, дві CDR, вибрані з CDR-Н1 (SEQ ID NO:42), CDR-Н2 (SEQ ID NO:43) і CDR-Н3 (SEQ ID NO:44) і переважніше всі три дані CDR-Н1, CDR-Н2 і CDR-Н3. В іншому варіанті здійснення анти-CD154-антитіло за винаходом, містить, принаймні, одну CDR, вибрану з CDR-L1 (SEQ ID NO:45), CDR-L2 (SEQ ID NO:46) і CDR-L3 (SEQ ID NO:47). Переважно антитіло містить, принаймні, дві CDR, вибрані з CDR-L1 (SEQ ID NO:45), CDR-L2 (SEQ ID NO:46) і CDR-L3 (SEQ ID NO:47) і переважніше всі три дані CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3. У додаткових варіантах здійснення антитіло містить усі три CDR-Н1, CDR-Н2 і CDR-Н3 (SEQ ID NO:42-44) і всі три CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3 (SEQ ID NO:45-47). У додаткових варіантах здійснення анти-CD154-антитіло містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга SEQ ID NO:56 і містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга SEQ ID NO:54. У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-CD154-антитіла, що містить, принаймні, одну CDR, вибрану з CDR-Н1 (SEQ ID NO:48), CDR-Н2 (SEQ ID NO:49) і CDR-Н3 (SEQ ID NO:50). Переважно антитіло містить, принаймні, дві CDR, вибрані з CDR-Н1 (SEQ ID NO:48), CDR-Н2 (SEQ ID NO:49) і CDR-Н3 (SEQ ID NO:50) і переважніше всі три дані CDR-Н1, CDR-Н2 і CDR-Н3. В іншому варіанті здійснення анти-CD154-антитіло за винаходом, містить, принаймні, одну CDR, вибрану з CDR-L1 (SEQ ID NO:51), CDR-L2 (SEQ ID NO:52) і CDR-L3 (SEQ ID NO:53). 22 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Переважно антитіло містить, принаймні, дві CDR, вибрані з CDR-L1 (SEQ ID NO:51), CDR-L2 (SEQ ID NO:52) і CDR-L3 (SEQ ID NO:53) і переважніше всі три дані CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3. У деяких варіантах здійснення антитіла містять комплементарну послідовність, що включає одну або більше CDR легкого ланцюга CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, відповідно наведені вище, або комплементарну послідовність, що включає одну або більше CDR важкого ланцюга CDRН1, CDR-Н2 і CDR-Н3, відповідно наведених вище. Таким чином, у деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом містить CDR-H1 (SEQ ID NO:48), CDR-H2 (SEQ ID NO:49) або CDR-H3 (SEQ ID NO:50) і CDR-L1 (SEQ ID NO:51), CDR-L2 (SEQ ID NO:52) або CDR-L3 (SEQ ID NO:53). У додаткових варіантах здійснення антитіло містить усі три CDR-Н1, CDR-Н2 і CDR-Н3 (SEQ ID NO:48-50) і всі три CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3 (SEQ ID NO:51-53). У додаткових варіантах здійснення анти-CD154-антитіло містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга SEQ ID NO:60 і/або містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга SEQ ID NO:58. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовність легкого ланцюга SEQ ID NO:62 і послідовність важкого ланцюга SEQ ID NO:65. В інших варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовність легкого ланцюга SEQ ID NO:63 і послідовність важкого ланцюга SEQ ID NO:66. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовність легкого ланцюга SEQ ID NO:68 і послідовність важкого ланцюга SEQ ID NO:71. В інших варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовність легкого ланцюга SEQ ID NO:69 і послідовність важкого ланцюга SEQ ID NO:72. У ще одних варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок за даним винаходом містить послідовності SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71 або SEQ ID NO:72. Даний винахід також стосується зв'язувального CD154 білка, що переважно має, принаймні, 90 %, 91 %, 92 %, 93 % або 94 % ідентичність із CD154-зв'язувальним білком за винаходом. Переважніше CD154-зв'язувальний білок має, принаймні, 95 %, 96 %, 97 % або 98 % ідентичність. Найбільше переважно CD154-зв'язувальний білок має, принаймні, 99 %, 99,5 %, 99,9 % ідентичність із CD154-зв'язувальним білком за винаходом. CD154-зв'язувальні білки за винаходом можуть містити послідовність варіабельного домену, принаймні, на 85 % ідентичну варіабельному домену SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58 або SEQ ID NO:60, або її однієї або більш CDR. Інші варіанти здійснення винаходи стосуються біспецифічних антитіл. Біспецифічні антитіла є моноклональними, переважно людськими або гуманізованими, антитілами, що мають специфічність зв'язування, принаймні, до двох антигенів. Їх можна використовувати самостійно або змішаними в композиції, що містить поліклональні популяції. У даному винаході одна зі специфічностей зв'язування являє таку для антигену CD154, у той час як інша специфічність зв'язування є такою для будь-якого іншого антигену, і переважно для білка або рецептора клітинної поверхні, або субодиниці рецептора. Наприклад, інша специфічність зв'язування може бути лігандом, вибраним із людського сироваткового альбуміну (HSA), TNF(, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-, CD2, CD4, CD8, CTLA4, LFA1, LFA3 і VLA4. В інших варіантах здійснення даного винаходу анти-CD154-антитіло містить сайт зв'язування близького ліганду. Близький ліганд (наприклад, поліпептид) здатний зв'язуватися з функціональними членами репертуару незалежно від специфічності ліганду-мішені. Отже, близький ліганд можна використовувати для або ідентифікації добору (наприклад, при очищенні або скринінгу) функціональних членів репертуару (таких як панель або група антитіл, незалежно від специфічності зв'язування антигену в антитіла). Близькі ліганди включають, наприклад, протеїн А, протеїн G і протеїн L. Попередній відбір членів фагової бібліотеки за допомогою близьких лігандів описаний у заявці WO 99/20749. Фрагменти антитіл Також даний винахід стосується антигензв'язувальних або епітопзв'язувальних фрагментів анти-CD154-антитіла. Усі способи і реагенти, описані вище, стосовно анти-CD154-антитіл можна в однаковому ступені використовувати для одержання і застосування фрагментів анти-CD154антитіл за винаходом. У деяких варіантах здійснення даного винаходу фрагменти анти-CD154-антитіла включають гетеродимерні комплекси антитіл і гібридні антитіла, такі як біспецифічні антитіла, гемідимерні антитіла, мультивалентні антитіла (тобто тетравалентні антитіла) та одноланцюгові антитіла. Гемідимерне антитіло складається з Fc-ділянки та одного Fab-фрагмента. Одноланцюгове антитіло складається з варіабельних ділянок, зв'язаних білковими спейсерами, в один білковий 23 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ланцюг. У деяких варіантах здійснення даного винаходу фрагменти анти-CD154-антитіла за винаходом також можуть включати білки, що містять один або більше імуноглобулінових легких ланцюгів і/або важких ланцюгів, такі як мономери і гомо- або гетеромультимери (наприклад, димери або тримери) даних ланцюгів, де дані ланцюги необов'язково зв'язані дисульфідним зв'язком або зв'язані інакше. Дані антитіла можуть бути здатні зв'язуватися з одним або більше антигенами. У деяких варіантах здійснення даний винахід включає антигензв'язувальні фрагменти цілісних антитіл, такі фрагменти антитіла, як Fab, F(ab) 2, Fab, F(ab)2, F(ab)3, Fv, Fd, dAb, діатіла, мінітіла або нанотіла. Також даний винахід стосується фрагментів, що містять тільки один варіабельний домен, такий як VH- або VL-домен, або фрагмента, що містить тільки домен важкого ланцюга або легкого ланцюга. Фрагменти можуть бути гуманізованими або повністю людськими. Також даний винахід включає антигензв'язувальні фрагменти, які складаються з альтернативних основ (дивися, наприклад, Binz, вище і Hosse, вище) або які містять універсальний каркас. Також даний винахід стосується кон'югатів, що містить будь-який антигензв'язувальний фрагмент або CD154-зв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з CD154, кон'югований ковалентно або нековалентно, або прямо опосередковано, із функціональною групою, наприклад, такий як білок-носій або ПЕГ. Анти-CD154-антитіла за даним винаходом включають дивалентні антитіла. Так, у деяких варіантах здійснення винахід стосується фрагмента дивалентного анти-CD154-антитіла, що містить два важких ланцюги антитіла і, принаймні, одну полімерну молекулу в ковалентному зв'язку, де кожен важкий ланцюг ковалентно зв'язаний з іншим, принаймні, за допомогою одного містка між ланцюгами, який відрізняється від дисульфідного, що з'єднує атом сірки залишку цистеїну в одному ланцюзі з атомом сірки залишку цистеїну в іншому ланцюзі, де залишки цистеїну розташовані поза доменом варіабельної ділянки кожного ланцюга, який відрізняється тим, що, принаймні, один місток між ланцюгами, який відрізняється від дисульфідного, містить ковалентно зв'язану полімерну молекулу. У тому значенні, в якому термін "який відрізняється від дисульфідного" використовується в даному документі, то він означає, що містки S-S, наприклад, типу звичайно наявного в антитілах, виключаються. Однак місток між ланцюгами типу, що є у фрагменті за винаходом, може бути зв'язаним із важким ланцюгом за допомогою зв'язку S-S, описаного нижче. У загальному кожна полімерна молекула у фрагменті дивалентного антитіла за винаходом утворює частину містка між ланцюгами. Кожен місток служить для зв'язування двох важких ланцюгів і в кожному ланцюзі він буде ковалентно зв'язаний з атомом сірки залишку цистеїну. Як правило, ковалентний зв'язок буде являти дисульфідний зв'язок або у конкретних варіантах здійснення зв'язок сірка-вуглець. Зразкові структури дивалентних антитіл дивися в WO 99/64460 і WO 05/061005. Також винахід стосується анти-CD154-антитіла, що є моновалентним антитілом або моновалентним антигензв'язувальним фрагментом. У тому значенні, в якому термін "моновалентний" використовується в даному документі, то він означає, що дане антитіло або антигензв'язувальний фрагмент (наприклад, Fv, одноланцюговий scFv, dAb, Fab, Fab, Fd, scFab, scFab∆C і т.д.) можуть зв'язуватися тільки з однією молекулою їхньої мішені. Звичайно природні антитіла є дивалентними у тому відношенні, що вони мають два антигензв'язувальних плеча, де кожне містить VH- і VL- домен. Дивалентне антитіло може зв'язуватися з двома окремими молекулами того самого антигену, у тому випадку коли не відсутня стерична перешкода. На противагу "моновалентне" антитіло має антигензв'язувальний сайт для мішені. Антигензв'язувальний домен моновалентного антитіла може містити V H- і VL- або домен може містити тільки один імуноглобуліновий варіабельний домен, тобто V H- або VL- домен, який має здатність зв'язуватися з CD154 без необхідності у відповідному VH- або VL-домені. Таким наведеним як приклад моновалентним антитілом є Fd-фрагмент, що містить один імуноглобуліновий варіабельний домен і який може зв'язуватися тільки з однією молекулою CD154 антитіла. У моновалентного антитіла відсутня здатність перехресно зв'язуватися з молекулами одного антигену. Даний винахід стосується анти-CD154-антитіла, де антитіло специфічно зв'язується з епітопом, з яким специфічно зв'язується гуманізований Fab- або Fab-фрагмент із послідовністю важкого ланцюга відповідно SEQ ID NO:12 або 13 і послідовністю легкого ланцюга SEQ ID NO:15. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом являє фрагмент антитіла з послідовністю варіабельної ділянки важкого ланцюга SEQ ID NO:1, 9, 10 або 11 і з послідовністю варіабельної ділянки легкого ланцюга SEQ ID NO:2 або 14. В інших варіантах здійснення антитіло за даним винаходом являє фрагмент антитіла з послідовністю важкого ланцюга SEQ ID NO:12 або 13 і з послідовністю легкого ланцюга SEQ ID NO:15. 24 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності легкого ланцюга SEQ ID NO:15 і послідовності важкого ланцюга SEQ ID NO:13. У деяких варіантах здійснення CD154-зв'язувальний білок або антитіло містить або складається з послідовності легкого ланцюга SEQ ID NO:15 і послідовності важкого ланцюга SEQ ID NO:12. В альтернативних варіантах здійснення винахід стосується фрагмента антитіла, що містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга SEQ ID NO:56 і містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга SEQ ID NO:54. В інших варіантах здійснення антитіло за даним винаходом являє фрагмент антитіла, що містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга SEQ ID NO:60 і містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга SEQ ID NO:58. В одному варіанті здійснення даний винахід стосується Fab- або F(ab)2- або F(ab)3фрагмента, що специфічно зв'язується з CD154. Даний Fab- або F(ab)2- або F(ab)3-фрагмент може бути гуманізований і може містити послідовність важкого ланцюга, який містить або складається з послідовності SEQ ID NO:13, і може включати послідовність легкого ланцюга, який містить або складається з послідовності SEQ ID NO:15. У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується анти-CD154-антитіла, яке не містить Fc-домен. Таке антитіло або фрагмент без Fc-ділянки можуть бути моновалентними, дивалентними або додатково мультивалентними. Також даний винахід стосується антитіл або фрагментів антитіл, які специфічно зв'язуються з епітопом, з яким специфічно зв'язуються Fab- або F(ab)2-, або F(ab)3-фрагменти, описані вище. Дані антитіла або фрагменти антитіл можна ідентифікувати в тесті перехресного зв'язування, описаному в даному документі (приклад 9). Дані антитіла або фрагменти антитіл можуть бути виділеними, рекомбінантними або синтетичними та їх можна приєднати до другої молекули з утворенням кон'югата антитіла. Антитіла зі зниженою ефекторною функцією Взаємодія антитіл і комплексів антиген-антитіло з клітинами імунної системи призводить до "запуску" різних реакцій у відповідь, що стосуються в даному документі ефекторних функцій. IgG-антитіла активують ефекторні шляхи імунної системи за допомогою зв'язування з членами сімейства клітинних поверхневих рецепторів Fc і з C1q системи комплементу. Лігування ефекторних білків кластерними антитілами "запускає" різні реакції у відповідь, що включають вивільнення запальних цитокінів, регуляцію продукції антигенів, ендоцитоз і загибель клітин. У деяких клінічних застосуваннях дані реакції у відповідь є критичними для прояву ефективності моноклонального антитіла. В інших – вони провокують розвиток небажаних побічних ефектів, таких як запалення та елімінація клітин, що несуть антиген. Отже, даний винахід додатково стосується CD154-зв'язувальних білків, включаючи антитіла, зі зміненими, наприклад, зниженими ефекторними функціями. Важливо, що знижена ефекторна функція не обов'язково призводить до зменшення здатності анти-CD154-антитіла інгібувати одне або кілька захворювань за допомогою блокування взаємодії CD154:CD40 (дивися заявку WO 05/03175, яка в повному обсязі включена в даний документ до відома). Анти-CD154-антитіла зі зниженою ефекторною функцією (наприклад, опосередкованими Fcділянкою ефекторними функціями; дивися нижче) є особливо бажаними для застосування в суб'єктів, в яких існує потенційна імовірність прояву небажаної тромбоемболічної активності. Додатково знижена ефекторна функція анти-CD154-антитіл може призвести до зниження або усунення інших потенційних небажаних ефектів, що виникають при терапії анти-CD154антитілами, таких як делеція активованих Т-клітин та інших популяцій клітин, індукованих на експресію CD154, або Fc-залежна активація моноцитів/макрофагів. Ефекторну функцію анти-CD154-антитіла за даним винаходом можна визначити з використанням багатьох відомих тестів. Ефекторна функція анти-CD154-антитіла може бути знижена стосовно другого анти-CD154-антитіла. В одних варіантах здійснення друге антиCD154-антитіло може являти собою будь-яке антитіло, яке специфічно зв'язується з CD154. У деяких варіантах здійснення друге анти-CD154-антитіло може являти собою антитіло 5с8 (продуковане гібридомою, депонованою в АТСС під інвентарним номером НВ 10916, описане в патенті США № 5474771) або гуманізоване антитіло 5с8. В інших варіантах здійснення друге CD154-специфічне антитіло може бути будь-яким з антитіл за винаходом, таким як 342, 381, 338, 294, 295, 300, 335, 303 або 402 (фіг.12). У ще одних варіантах здійснення, у тому випадку, коли анти-CD154-антитіло, що цікавить, піддалося модифікації з метою зниження ефекторної функції, то друге антитіло може являти немодифікований або вихідний варіант антитіла. Ефекторну функцію анти-CD154-антитіла за даним винаходом також можна оцінити, наприклад, за визначенням рівня агрегації або активації тромбоцитів, викликаним обробкою 25 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 анти-CD154-антитілом, у порівнянні з контрольним антитілом. Отже, у деяких варіантах здійснення анти-CD154-антитіла за даним винаходом не опосередковують або не підсилюють агрегацію або активацію тромбоцитів у стандартному тесті агрегації або активації тромбоцитів. В інших варіантах здійснення анти-CD154-антитіла опосередковують нижчий рівень агрегації або активації тромбоцитів у порівнянні з другим анти-CD154-антитілом (наприклад, 5с8 або гуманізованим 5с8). Ефекторні функції, які наводять у ролі прикладу, включають зв'язування з Fc-рецептором, фагоцитоз, апоптоз, прозапальні реакції у відповідь, негативну регуляцію клітинних поверхневих рецепторів (наприклад, В-клітинного рецептора; BCR) і т.д. Інші ефекторні функції включають антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC), за допомогою якої антитіла зв'язуються з Fc-рецепторами на цитотоксичних Т-клітинах, природних клітинах-кілерах (NK) або макрофагах, призводячи до загибелі клітин, і комплементзалежну цитотоксичність (CDC), при якій загибель клітин індукується за допомогою активації каскаду комплементу (дивися огляд Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234, 1997; Ward and Ghetie, Therapeutic Immunol., 2:77-94, 1995; і Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-492, 1991)). Як правило, для прояву таких ефекторних функцій потрібно, щоб Fc-ділянка сполучалася із зв'язувальною ділянкою (наприклад, варіабельним доменом антитіла), та їх можна оцінити з використанням стандартних методів, які відомі в даній галузі (дивися, наприклад, заявку WO 05/018572, WO 05/003175 і патент США № 6242195). Ефекторні функції можна "скасувати" при використанні фрагментів без Fc-домену, таких як Fab, F(ab)2 або одноланцюговий Fv. Альтернативою є використання підтипу IgG4 антитіла, який зв'язується з FcRI, але який слабко зв'язується з C1q і FcRII і FcRIII. Підтип IgG2 також має знижене зв'язування з Fc-рецепторами, але зберігає здатність до значного зв'язування з алотипом Н131 FcRIIа і C1q. Таким чином, необхідні додаткові зміни в послідовності FcR для елімінації зв'язування з усіма Fc-рецепторами і з C1q. Декілька ефекторних функцій, включаючи ADCC, опосередковуються Fc-рецепторами (FcR), які зв'язуються з Fc-ділянкою антитіла. Афінність антитіла для конкретного FcR і, отже, ефекторну активність, опосередковану антитілом, можна модулювати зміною амінокислотної послідовності і/або посттрансляційними модифікаціями Fc-ділянки і/або константної ділянки антитіла. FcR визначаються їхньою специфічністю для ізотипів імуноглобулінів; Fc-рецептори для IgG-антитіл стосуються FcR, для IgE до FcεR, для IgA до FcR і т.д. Було встановлено три підкласи FcR: FcRI (CD64), FcRII (CD32) і FcRIII (CD16). FcRII і FcRIII мають два типи: FcRІІА (CD32) і FcRІІВ (CD32); і FcRІІІА (CD16а) і FcRIIIB (CD16b). Оскільки кожен підклас FcR кодується двома або трьома генами, та альтернативний сплайсинг РНК призводить до численних транскриптів, то існує широка різноманітність ізоформ FcR. Наприклад, FcRII (CD32) включає ізоформи lla, llb1, llb2, llb3 і llc. Сайт зв'язування в людських і мишачих антитілах для FcR раніше був картований до так називаної "нижньої шарнірної ділянки", що складається з залишків 233-239 (EU нумерація за th системою Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 Rd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991; Woof et al., Molec. Immunol., 23:319-330, 1986; Duncan et al., Nature, 332:563, 1988; Canfield and Morrison, J. Exp. Med., 173:1483-1491, 1991; Chappel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9036-9040, 1991). Залишки 233-239, Р238 і S239 знаходяться серед тих, які згадуються у ролі тих, що беруть участь у зв'язуванні. Іншими раніше згадуваними ділянками, що, можливо, беруть участь у зв'язуванні з FcR, є: G316-K338 (людський IgG) для людського FcRI (тільки при порівнянні послідовностей; мутанти по заміні не оцінювалися) (Woof et al., Molec. Immunol., 23:319-330, 1986); K274-R301 (людський IgG1) для людського FcRIII (ґрунтуючись на пептидах) (Sarmay et al., Molec. Immunol, 21:43-51, 1984; і Y407-R416 (людський IgG) для людського FcRIII (ґрунтуючись на пептидах) (Gergely et al., Biochem. Soc. Trans., 12:739-743, 1984) і Shields et al., J. Biol. Chem., 276:6591-6604, 2001; Lazar G.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:4005-4010, 2006). Дані та інші ділянки амінокислотних залишків, що беруть участь у зв'язуванні з FcR, можуть бути очевидними фахівцям у даній галузі за даними дослідження кристалічної структури комплексів Ig-FcR (дивися, наприклад, Sondermann et al., 2000, Nature, 406(6793):267-73 і Sondermann et al., 2002, Biochem. Soc. Trans., 30(4):481-6). Отже, анти-CD154-антитіла за даним винаходом включають модифікації одного або більше зазначених вище залишків. Інші відомі підходи зниження ефекторної функції mAb включають мутування амінокислот на поверхні mAb, які беруть участь в ефекторних взаємодіях зв'язування (Lund J. et al., 1991, J. Immunol., 147(8):2657-62; Shields R.L. et al., 2001, J. Biol. Chem., 276(9):6591-604); і використання комбінацій послідовностей сегментів різних підтипів (наприклад, комбінації IgG2 і IgG4) з 26 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одержанням більш істотного зниження зв'язування з Fc-рецепторами у порівнянні з одним підтипом (Armour et al., Eur. J. Immunol., 1999, 26:2613-1624; Mol. Immunol., 40, 2003, 585-593). У даній галузі відома велика кількість варіантів Fc-ділянки зі зміненою і/або зниженою афінністю для Fc-рецепторів деяких або всіх підтипів (і в такий спосіб для ефекторних функцій). Дивися, наприклад, заявки на патент США 2007/0224188; 2007/0148171; 2007/0048300; 2007/0041966; 2007/0009523; 2007/0036799; 2006/0275283; 2006/0235208; 2006/0193856; 2006/0160996; 2006/0134105; 2006/0024298; 2005/0244403; 2005/0233382; 2005/0215768; 2005/0118174; 2005/0054832; 2004/0228856; 2004/132101; 2003/158389; також дивися патенти США № 7183387; 6737056; 6538124; 6528624; 6194551; 5624821; 5648260. При CDC комплекс антитіло-антиген зв'язується з комплементом, призводячи до активації каскаду комплементу і генерації атаки мембрани комплексом. Активація класичного шляху комплементу ініціюється зв'язуванням першого компонента системи комплементу (C1q) з антитілами (відповідного підкласу), які зв'язані з їхнім антигеном; таким чином, активація каскаду комплементу частково регулюється афінністю зв'язування імуноглобуліну з білком C1q. Для активації каскаду комплементу необхідно, щоб C1q зв'язався, принаймні, із двома молекулами IgG1, IgG2 або IgG3, але тільки з однією молекулою з ІgМ, приєднаною до антигенної мішені (Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology, 2:77-94, 1995, p. 80). Для оцінки активації комплементу можна провести тест CDC, наприклад, описаний Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163, 1996. Було висловлене припущення, що різні залишки молекули IgG беруть участь у зв'язуванні з C1q, включаючи залишки Glu318, Lys320 і Lys322 у СН2-домені, амінокислотний залишок 331, розташований у максимальній близькості до того ж бета ланцюга, залишки Lys235 і Gly237, розташовані в нижній шарнірній ділянці, і залишки 231-238, розташовані в N-кінцевій ділянці в СН2-домені (дивися, наприклад, Xu et al., J. Immunol., 150:152A (Abstract), 1993, WO 94/29351; Tao et al., J. Exp. Med., 178:661-667, 1993; Brekke et al., Eur. J. Immunol., 24:2542-47, 1994; Burton et al., Nature, 288:338-344, 1980; Dunkan and Winter, Nature, 332:738-40, 1988; Idusogie et al., J. Immunol., 164:4178-4184, 2000; патенти США № 5648260 і 5624821). Як приклад: в IgG1 дві мутації в СООН кінцевої ділянки СН2-домену людського IgG1 – K322A і Р329А – не активують шлях CDC і було показано, що вони призводять до більш ніж 100-кратного зниження зв'язування C1q (патент США № 6242195). Таким чином, у деяких варіантах здійснення винаходу можна модифікувати, замістити або видалити один або більше даних залишків або один або більше амінокислотних залишків можна вставити з метою зниження активності CDC антитіл проти CD154, описаних у даному документі. Наприклад, у деяких варіантах здійснення може бути бажаним знизити або елімінувати ефекторну функцію(ї) даних антитіл для зниження або елімінації імовірності активування імунних реакцій у відповідь. Антитіла зі зниженою ефекторною функцією також можуть знизити ризик розвитку тромбоемболічних ускладнень у суб'єктів, що одержують антитіла. У деяких інших варіантах здійснення даний винахід стосується анти-CD154-антитіла, яке виявляє знижене зв'язування з одним або більше Fc-рецепторами, але яке зберігає його здатність зв'язуватися з комплементом (наприклад, в аналогічному або, у деяких випадках, меншому ступені у порівнянні з нативним, немутантним або вихідним анти-CD154-антитілом). Отже, анти-CD154-антитіло за даним винаходом може зв'язуватися та активувати комплемент, одночасно виявляючи знижене зв'язування з FcR, наприклад, таким як FcRIIa (наприклад, FcRIIa, експресованим на тромбоцитах). Таке антитіло зі зниженим зв'язуванням або антитіло, яке не зв'язується з FcRIIa (наприклад, таким як FcRIIa, експресованим на тромбоцитах), але яке може зв'язуватися з C1q та активувати каскад комплементу, принаймні, до деякої міри буде знижувати ризик розвитку тромбоемболічних ускладнень, одночасно зі збереженням бажаних ефекторних функцій. В альтернативних варіантах здійснення анти-CD154-антитіло за даним винаходом показує знижене зв'язування з одним або більше FcR, але зберігає здатність зв'язуватися з одним або іншим FcR. Дивися, наприклад, заявки на патент США 2007/0009523, 2006/0194290, 2005/0233382, 2004/0228856 і 2004/0191244, в яких описуються різні амінокислотні модифікації, що призводять до одержання антитіл зі зниженим зв'язуванням з FcRI, FcRII і/або FcRIII, а також амінокислотні заміни, які забезпечують підвищене зв'язування з одним FcR, але знижене зв'язування з іншим FcR. Отже, ефекторні функції, у забезпеченні яких бере участь константна ділянка анти-CD154антитіла, можна модулювати зміною властивостей константної ділянки і Fc, зокрема. У деяких варіантах здійснення анти-CD154-антитіло зі зниженою ефекторною функцією порівнюють із другим антитілом з ефекторною функцією і яке може бути немутантним, нативним або вихідним антитілом (наприклад, антитілом 342 або антитілом 5с8, яке описане в патенті США № 5474771), що містить константну ділянку або Fc-ділянку, яка опосередковує ефекторну функцію. 27 UA 100513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У конкретних варіантах здійснення модуляція ефекторної функції включає ситуації, при яких активність скасовується або повністю відсутня. Нативна послідовність Fc-ділянки або константної ділянки містить амінокислотну послідовність, ідентичну до амінокислотної послідовності Fc-ділянки або константної ділянки ланцюга, що виявляється в природних умовах. Переважно контрольна молекула, використовувана для оцінки відносної ефекторної функції, містить той же тип/підтип Fc-ділянки, що і тестоване або мутантне антитіло. Варіантна або змінена Fc-ділянка або константна ділянка містить амінокислотну послідовність, яка відрізняється від такої нативної послідовності ділянки важкого ланцюга в результаті, принаймні, однієї амінокислотної модифікації (наприклад, такої як посттрансляційна модифікація, амінокислотна заміна, вставка або делеція). Отже, мутантна константна ділянка може містити одну або більше амінокислотних замін, делецій або вставок, які призводять до змінених посттрансляційних модифікацій, що включають, наприклад, змінений профіль глікозилювання. Вихідне антитіло або Fc-ділянка являє, наприклад, варіант, що має нормальну ефекторну функцію, використовуваний для конструювання константної ділянки (тобто Fc-ділянки) зі зміненою, наприклад, зниженою ефекторною функцією. Антитіла зі зміненою (наприклад, зниженою або елімінованою) ефекторною функцією(іями) можна одержати конструюванням або продукцією антитіл з варіантною константною ділянкою, Fc-ділянкою або ділянкою важкого ланцюга. Можна використовувати технологію рекомбінантної ДНК і/або культивування клітин і умови експресії для одержання антитіл зі зміненою функцією і/або активністю. Наприклад, технологію рекомбінантної ДНК можна використовувати для конструювання однієї або більше амінокислотних замін, делецій або вставок в ділянках (наприклад, таких як Fc-ділянка або константна ділянка), що впливають на функції антитіл, включаючи ефекторні функції. Альтернативно можна забезпечити зміни в посттрансляційних модифікаціях, таких як профілі глікозилювання (дивися нижче), за допомогою маніпуляцій із клітинами-хазяїнами і культивуванням клітин і умовами експресії, за допомогою яких одержують антитіло. Зміни амінокислот, такі як амінокислотні заміни, можуть призвести до зміни ефекторної функції анти-CD154-антитіл за даним винаходом без зміни афінності зв'язування антигену. Описані вище амінокислотні заміни (зокрема, Glu318, Lys320, Lys322, Lys235, Gly237, ДО332 і Р329) наприклад, можна використовувати для одержання антитіл зі зниженою ефекторною функцією. В інших варіантах здійснення амінокислотні заміни можна провести для одного або більше наступних амінокислотних залишків: 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 і 322 константної ділянки важкого ланцюга (дивися патенти США № 5624821 і 5648260). Такі заміни можуть змінити ефекторну функцію з одночасним збереженням при цьому активності зв'язування антигену. Зміна за однією або більше амінокислотами 234, 235, 236 і 237 може знизити афінність зв'язування Fc-ділянки з FcRI-рецептором у порівнянні з немодифікованим або немутантним антитілом. Амінокислотні залишки 234, 236 і/або 237 можна піддати заміщенню, наприклад, на аланін, і амінокислотний залишок 235 можна замістити, наприклад, на глутамін. В іншому варіанті здійснення анти-CD154-антитіло може містити заміну Leu у положенні 234 на Ala, заміну Leu у положенні 235 на Glu, і заміну Gly у положенні 237 на Ala. Додатково або альтернативно можна змінити амінокислотні залишки в Fc-ділянці в положеннях 318, 320 і 322. Дані амінокислотні залишки, що є висококонсервативними в мишачому і людському IgG, опосередковують зв'язування комплементу. Було показано, що зміна даних амінокислотних залишків знижує зв'язування з C1q, але не змінює зв'язування з антигеном, зв'язування з протеїном А або здатність Fc-ділянки зв'язуватися з мишачими макрофагами. В іншому варіанті здійснення анти-CD154-антитіло за даним винаходом являє собою імуноглобулін IgG4, що містить заміни, які знижують або елімінують ефекторну функцію. Fcділянка IgG4 анти-CD154-антитіла за винаходом може містити одну або більше з наступних замін: заміну проліну на глутамат у залишку 233, аланіну або валіну на фенілаланін у залишку 234 та аланіну або глутамату на лейцин у залишку 235 (EU нумерація за Kabat E.A. et al., 1991, вище). Крім того, видалення сайта N-зв'язаного глікозилювання в Fc-ділянці IgG4 заміною Ala на Asn у залишку 297 (EU нумерація) може додатково знизити ефекторну функцію та елімінувати будь-яку залишкову ефекторну активність, що може мати місце. Іншим зразковим мутантом IgG4 зі зниженою ефекторною функцією є варіант підтипу IgG4, що містить мутації S228P і L235E (РЕ мутація) у константній ділянці важкого ланцюга. Дана мутація призводить до забезпечення зниженої ефекторної функції. Дивися патенти США № 5624821 і 5648260. Іншою зразковою мутацією в IgG4, яка призводить до зниження ефекторної функції, є S228P/T229A, описана в даному документі. 28