Пептид, який індукує утворення нейтралізуючих антитіл (варіанти), антитіло, одержане за допомогою вказаного пептиду, імуногенна композиція для індукції нейтралізуючих антитіл, вакцина для профілактики зараженн

Винахід стосується інфекційного агента, який зумовлює "таємну хворобу свиней" - тобто вірусу РРСС, пептидних послідовностей, що ідентифікуються у вірусу РРСС, та включення цих послідовностей у вакцини та діагностичні тести. Вірус РРСС (ВРРСС) є збудником хвороби свиней, яка зараз називається репродуктивно-респіраторним синдромом свиней (РРСС). Цей вірус є агентом-збудником хвороби свиней, відомої приблизно з 1987 року в США і з 1990 року в Європі, яка спочатку була відома під різними найменуваннями, такими як "таємна хвороба свиней", безплідність свиней і респіраторний синдром, а також під численними іншими назвами. Сам по собі вірус також отримав багато назв, серед яких - вірус Lelystad (LV), вірус SIRS і численні інші, однак зараз найбільш вживаними найменуванням є назва "вірус репродуктивно-респіраторного синдрому свиней" (ВРРСС). Він зумовлює викидні та респіраторні патології у свиней; вперше його було виділено в Європі [європейський патент №587780, патент США №5620691], а потім - також в США і багатьох інших країнах світу. ВРРСС - невеликий вірус, що має оболонку, геном якого представлений одноланцюжковим позитивним геномом РНК. Більш прийнятний сайт росту ВРРСС - макрофаги. На доповнення до макрофагів ВРРСС може рости в клітинах лінії CL2621 та інших клітинних лініях, клонованих на основі лінії клітин МА-104 нирки мавп [Benfield et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest., 4, 127-133]. Геном ВРРСС, який представлений поліаденілованою молекулою РНК завдовжки приблизно 15 тисяч нуклеотидів, було секвеновано в 1993 році [Meulenberg et al., 1993, Virology, 192, 62-74]. Нуклеотидна послідовність, організація геному і механізм реплікації показали, що ВРРСС належить до групи невеликих РНК-вірусів, що мають оболонку, з позитивним ланцюгом, позначеним як Arteriviruses. Ця група включає вірус підвищеного титру лактатдегідрогенази (LDV), вірус артериту коней (EAV) і вірус геморагічної пропасниці мавп (SHFV). Ці віруси характеризуються схожою організацією геному, механізмом реплікації, морфологією і амінокислотною послідовністю вірусних білків. Артери-віруси містять геном завдовжки від 12,5 до 15 тисяч нуклеотидів і синтезують з'єднану по 3'-кінцям групу з шести субгеномних РНК в процесі реплікації. Ці субгеномні РНК включають лідерну послідовність, що є похідною від 5'-концевоі ділянки вірусного геному. Кодуючі рамки ORF1a і ORF1b займають приблизно 2/3 всього вірусного геному і кодують РНК-залежну РНК-полімеразу. Шість менших кодуючих рамок (генів) - від ORF2 до ORF7 локалізовані в 3'-частині вірусного геному. Мабуть, гени ORF2-6 кодують білки капсиду, у той час як ORF7 кодує нуклеокапсидний білок [Meulenberg et al., 1995, Virology, 206, 155-163]. BPPCC - перший з артеривірусів, для якого було показано, що всі шість білків, які кодуються відкритими рамками від ORF2 до ORF7, асоційовані безпосередньо з віріоном. При цьому білок N з молекулярною масою 15-кД (що кодується ORF7) і інтегральний мембрани білок Μ 18-кД (продукт ORF6) не є Ν-глікозилованими, у той час як білок GP2 29-30-кД (ORF2), білок GP3 45-50-кД (ORF3), білок GP4 31-35-кД (ORF4) і білок GP5 25-кД (ORF5) глікозиловані по N-сайтам. Ці білки також виявляються в позаклітинному вірусному просторі і в лізатах клітин, інфікованих північноамериканським ізолятом ВРРСС [АТСС №VR2332] та іншими ізолятами ВРРСС [іншими ізолятами цього вірусу є, наприклад, CNCM 1-1140; ЕСАСС V93070108; CNCM 1-1387; CNCM 1-1388; АТСС VR2402; АТСС VR2429; АТСС VR2430; АТСС VR2431; АТСС VR2475; АТСС VR2385, хоча відомі і численні інші приклади]. Раніше заявники описували виділення і охарактеризування панелі ВРРСС-специфічних моноклональних антитіл, які специфічні відносно до GP3, GP4, Μ і N [Van Nieuwstadt et al. , 1996, J. Virol., 70, 4767-4772]. Цікаво, що моноклональні антитіла до білка GP4 були нейтралізуючими: це підтверджує те, що принаймні частина білка-мішені знаходиться на поверхні віріону. Крім того, більшість моноклональних антитіл до білка N реагували зі всіма протестованими ізолятами ВРРСС. Сам по собі репродуктивно-респіраторний синдром є серйозною проблемою свинарства в більшості регіонів світу. Попадання вірусу РРСС в промислове стадо свиней призводить до значних економічних втрат. Діагностика РРСС широко розповсюджена і практикується багатьма ветеринарами і в багатьох лабораторіях. Більшість діагностичних тест-методів, такі як ІРМА, IFT, ІФА, ТІФА, кожний з яких ефективний щодо виявлення приєднаних ферментів або флуорохромів, та інших субстратів, заснована на взаємодії між антигеном ВРРСС і антитілами до ВРРСС з метою визначення присутності або антигену ВРРСС, або антитіл до ВРРСС в конкретному біологічному зразку, такому як проби крові, сироватки, тканини, тканинної рідини, лаважної (промивальної)рідини, сечі, фекалій, при тому, що зразки взяті у призначеної до діагностування тварини (такої як свиня). Антиген і (або) антитіла, які використовуються в цих діагностичних тестах, або діагностичні тести чи набори для діагностики РРСС визначаються лише своїм походженням або своєю реактивністю щодо ВРРСС. В принципі цього достатньо для здійснення скринінга, в якому не вимагається досягнення високого рівня специфічності або чутливості. Однак, поширення вірусу РРСС, яке постійно триває, створює велику проблему для світового свинарства в такій мірі, що визначає нагальну необхідність позбавлятися РРСС в даному стаді свиней повністю, а ще краще - добиватися цього в цілому регіоні або країні, де розвинуте свинарство. Чітким прикладом такої необхідності є програма з викорінення РРСС, розроблена в Данії. Якщо хтось вирішить повністю покінчити з РРСС, йому знадобляться більш специфічні і чутливі діагностичні тести порівняно з тими тестами, які застосовуються сьогодні. Також широко практикується вакцинація проти РРСС. Є ряд прикладів застосування модифікованих живих вакцин, хоча і вбиті вакцини також відомі. Однак, проблема, пов'язана з живими вакцинами взагалі і з живими вакцинами проти РРСС, зокрема, пов'язана з тим, що ці вакцини мають тенденцію розповсюджуватися на невакцинованих тварин, через це призводячи не до скорочення, а до розширення інфекції в стаді свиней і, отже, не дозволяючи досягнути основної мети викорінення вірусу в популяції. У випадку застосування лінії маркерної вакцини, яка могла б за серологічними параметрами бути диференційована від вірусу дикого типу, дана проблема істотною мірою б зменшувалась. Додатковими недоліками є те, що живі вакцини інколи зумовлюють анафілактичні реакції у вакцинованих свиней через вплив неідентифікованих антигенних компонентів. Окрім того, що в цілому вбиті вакцини, як підтверджувалося, спричинюють захист вакцинованої свині, є ще і додаткова перевага, пов'язана з тим, що вони не розповсюджуються від свині до свині, а недоліком вбитих вакцин є те, що ускладненим може бути накопичування достатньої антигенної маси в одній дозі вакцини, необхідній для індукції імунної відповіді, що може вимірюватись і має захисну ефективність. Зокрема, вбиті вакцини, які можуть викликати вимірні титри нейтралізуючих антитіл у свиней, були б більш прийнятними, оскільки заміри цих нейтралізуючих антитіл в популяціях вакцинованих свиней повинні допомогти у визначенні рівня захисту, що досягається вакцинацією, яка проводиться в даному стаді свиней. Крім того, якщо вдається досягнути успіху в накопичуванні необхідної антигенної маси, це також означає, що в даній вакцині наявні маси і інших неідентифікованих антигенів, які також можуть давати анафілактичні реакції, про які говорилось вище. В цьому сенсі було б більш прийнятним знати, який з специфічних сайтів ВРРСС втягнутий в процес нейтралізації, що дало змогу б формувати більш підхожі вакцини, які включають ключові амінокислотні послідовності, що індукують утворення нейтралізуючих антитіл. Позитивною характеристикою вакцин, що застосовуються нині, які основані на ізолятах ВРРСС, виділених у США, є те, що ці вакцини, окрім забезпечення повного захисту від американського вірусу і наявності перехресної реактивності з європейськими ізолятами ВРРСС, містять доки ще неідентифіковані епітопи або антигенні сайти, за якими вони можуть бути діагностовані від європейських ізолятів ВРРСС. Таким самим чином живі вакцини, основані на ізолятах ВРРСС, виділених в Європі, окрім забезпечення повного захисту та імунологічної перехресної реактивності з північноамериканськими ізолятами ВРРСС, містять схожі, але доки неідентифіковані епітопи або антигенні сайти, за якими вони можуть бути диференційовані при порівнянні з ізолятами ВРРСС з США. Якщо будуть доступні серологічні тести, які можуть виявляти відмінності (на основі невеликих відмінностей епітопів у ізолятів ВРРСС) між особинами свиней, які були або вакциновані вакциною на основі американського ізоляту, або заражені європейським штамом ВРРСС дикого типу (при цьому будучи вакцинованими чи ні), або які можуть розмежувати свиней, які були або вакциновані вакциною на основі європейського ізоляту, або заражені американським штамом ВРРСС дикого типу (будучи вакцинованими чи ні), то можуть бути створені маркерні вакцини і відповідні діагностичні тести (які вносять зазначені відрізняльні епітопи або антигенні сайти), які можуть використовуватись в умовах високої довіри до них в програмах з викорінення РРСС. Наприклад, в Данії може стати можливим проведення вакцинації американською вакциною з подальшим вимірюванням рівня антитіл у датських свиней, які продукують винятково до унікальних епітопів європейського ВРРСС дикого типу і не виявляють перехресної реактивності з американськими штамами. Це повинно дозволити проводити однозначну діагностику з подальшим вилученням свиней, заражених вірусом дикого типу з датських стад. Зараз таке розмежування є неможливим через в цілому дуже широку перехресну реактивність між ізолятами ВРРСС. Ясно без подальшого роз'яснення, що програми з таким поєднанням вакцинації і діагностики повинні стати основою для викорінення РРСС і також можуть бути впроваджені в інших країнах, причому, якщо це буде необхідним, з використанням відмінних антигенних сайтів ВРРСС у вакцині і (або) в діагностичному тесті. Цей винахід представляє антигенні сайти, які включають амінокислотні послідовності ВРРСС, що забезпечують покращення вакцин, які виробляються як вбиті або послаблені вакцини, або вакцини на основі методології рекомбінантної ДНК, а також антигенні сайти, які забезпечують покращення діагностичних методів, тестів і наборів для них, і розробку нових способів діагностики, тестів і наборів для них. Штучні зміни або заміни амінокислотних залишків, які зберігають антигенні властивості (що, наприклад, підтверджується реактивністю з поліклональною сироваткою або моноклональними антитілами) і, відповідно, функціональність антигенних сайтів, можуть бути фахівцем у галузі конструювання і синтезу білків легко здійснені відносно послідовностей, для яких відомі наявність антигенного сайта і які представляють якийсь ізолят. Наприклад, деякі амінокислотні залишки можуть бути у рутинний спосіб замінені на схожі: наприклад, основний залишок на інший основний, кислий - на кислий, об'ємні - на об'ємні, гідрофільні і гідрофобні - відповідно, на інші гідрофільні або гідрофобні, і т. і. Також можливі інші менш стандартні, але більш специфічні зміни, які зберігають або навіть покращують антигенні властивості вибраної послідовності. Такі заміни можуть виконуватись за допомогою методу PEPSCAN на основі використання методик заміщення амінокислот і замісного картування [Van Amerongen et al., 1992, Peptide Res., 5, 269-274]. Коротко, амінокислотні залишки в межах антигенних сай-Т1В, що представляються цим винаходом, можуть бути, наприклад, замінені у традиційний спосіб або на основі замісного картування, при тому, що отримані в результаті пептидні послідовності будуть функціонально еквівалентні даному антигенному сайту. Заміщення амінокислот також може бути пов'язане з замінами L- або D-амінокислот. Крім того, амінокислотні послідовності, що представляються даним винаходом, можуть бути доведені навіть до більш високого рівня імуногенності за рахунок приєднання до них ад'ювантів (таких як KLH) , відомих у цій галузі техніки. Додатково, ці пептиди можуть бути зроблені навіть більш імуногенними шляхом перетворення їх на пептиди з однією (такі як тандемні пептиди) або більшим числом послідовностей, що повторюються, а також за допомогою полімеризації або циркуляризації. Хоча раніше було показано, що білок N є імуногенним [Meulenberg, 1995, J. Clin. Diagnosis Lab. Immunol., 2, 652-656; британський патент №2-289279-А] і що існують консервативні і неконсервативні ділянки в складі білка N при порівнянні європейських (LV) і американських (VR2332) штамів (WO 96/04010), заявники в даному тексті вперше показують, які з консервативних і неконсервативних ділянок є антигенними і які з них можуть використовуватись нарізно або в поєднанні одна з одною в якості антигенів для імунізації або в діагностичних тестах. Більше того, тут проводиться ідентифікація тих антигенних ділянок в складі білка N, які включають як лінійні, так і залежні від конформаційного стану епітопи. Білок GP4 є першим структурним білком вірусу РРСС, для якого показано, що він зумовлює продукування антитіл, які здатні нейтралізовувати вірус. Було визначено специфічну ділянку, що складається приблизно з 40 амінокислот, і було встановлене, що вона розміщена на поверхні віріону, визначаючи таким чином мішень для нейтралізуючих антитіл, які потім не дають змогу цьому вірусу інфікувати клітини. Це є багатонадійною новою інформацією, оскільки в цілому вже встановлено, що білок GP5, який є основним структурним білком ВРРСС, найбільш важливий білок - "кандидат", втягнутий у прикріплення до клітини-хазяїна. Цей винахід представляє основний антигенний сайт-нейтралізаційний сайт білка GP4ВРРСС. Даний винахід представляє локалізацію основного нейтралізаційного сайту, важливого для формування ефективних маркерних вакцин, які включають базову (корову) амінокислотну послідовність і амінокислотні послідовності, які фланкують базову амінокислотну послідовність, що представляють ізоляти ВРРСС, при тому, що ці послідовності включають нейтралізаційний сайт білка, який кодується відкритою рамкою ORF4 ВРРСС. За рахунок внесення послідовностей відповідних нейтралізаційних сайтів в різні типи вакцин стає можливим специфічним чином індукувати продукування нейтралізуючих антитіл у вакцинованої свині. Вбиті вакцини, які включають нейтралізаційні сайти, що представляються цим винаходом, сформовані так, щоб індукувати вимірні титри нейтралізуючих антитіл. Зокрема, нейтралізаційний сайт входить до складу послідовності, локалізованої на ділянці відкритої рамки ORF4, що кодує ту ділянку білка ВРРСС, що відповідає ділянці на рівні приблизно від 40-ї до 79-ї амінокислоти в послідовності, знайденої у ізоляту І-1102 ВРРСС. Далі, вибрані амінокислотні послідовності можуть бути зроблені навіть більш імуногенними шляхом змішування цих пептидів з ад'ювантами або іншими носіями, відомими у цій галузі техніки. Сформовані таким чином пептидні композиції використовуються в якості вакцини. Однак, також вибрані амінокислотні послідовності, які включають нейтралізаційний сайт, вносять у векторні вакциноутворюючі системи, що є відокремленими рекомбінантними векторами, похідними від гетерологічних вірусів або бактерій, або відібрані амінокислотні послідовності також у селективний спосіб вносять у векторні системи на основі вірусу ВРРСС або у вакцини, зроблені на його основі. В іншому аспекті даного винаходу амінокислотні послідовності, які знаходяться на ділянці, що відповідає ділянці від 52-ї до 75-ї амінокислоти, більш точно відповідають нейтралізаційному (імуногенному) сайту, що має широку реактивність. Інші варіанти нейтралізаційного сайта, які представляються цим винаходом, можуть бути виявлені у різних відомих ізолятів ВРРСС або ізолятів ВРРСС, які ще будуть знайдені (див., наприклад, експериментальну частину даного тексту). Простим для фахівця, який працює в галузі молекулярної біологи, є порівняння послідовностей, які включають нейтралізаційний сайт, що представляються даним винаходом, з амінокислотною послідовністю білка, що кодується відкритою рамкою ORF4, якогось іншого ізоляту ВРРСС. Цей винахід також представляє амінокислотні послідовності ВРРСС, які покращують діагностичні тести, включаючи антиген- або антитіло-детекційні тести. Даний винахід представляє різні групи антигенних сайтів, призначені для використання нарізно або в поєднанні одна з одною в діагностичних тестах. В цьому сенсі цим винаходом представляються такі діагностичні тести, які використовуються для вирішення різних завдань в польових умовах при проведенні конкретної і диференційної діагностики. Взаємодії "антиген-антитіло" завжди відбиває перехресну реактивність взаємодії "епітоп-антидетермінанта", при тому, взаємодіючі ділянки амінокислотних послідовностей складаються з 5-15 амінокислот. Таким чином, амінокислотні послідовності завдовжки 5-15 амінокислот, що частково або повністю перекриваються з базовими послідовностями антигенних сайтів відповідно до цього винаходу, представляються даним винаходом для внесення до діагностичних тести. Ці амінокислотні послідовності використовуються для вибору або формування антигену або антигенної речовини, що включають ті послідовності, які використовуватимуться в тесті. З іншого боку, цим винаходом також представляються синтетичні антитіла, які реагують з антигенними сайтами, які представляються даним винаходом. Ці сайти або споріднені послідовності реагують з синтетичним антитілом, одержаним в таких системах, як фатові бібліотеки або клональний відбір (важких ланцюгів) антитіл, які включають антитіло подібні молекули, що легко можуть експресуватись в гетерологічних експресійних системах. Одна група, що представляється цим винаходом, включає амінокислотну послідовність, яка відповідає зазначеному нейтралізаційному сайту, що вже пояснювалося вище. Діагностичні тести, які включають цей сайт і (або) специфічні щодо цього сайта антитіла, виявляють нейтралізуючі антитіла у свині. Інша група, що представляється цим винаходом, включає консервативний антигенний сайт з складу білка N. В межах консервативного антигенного сайта даний винахід представляє базову послідовність VNQLCQLLGA або VNQLCQMLGK. Діагностичні тести, які включають цей сайт і (або) антитіла, специфічні щодо цього сайта, виявляють ті антитіла у свиней, які специфічно реагують з більшістю ізолятів ВРРСС. Також представляються такі діагностичні тести, котрі засновані на антитілах до консервативного сайту і націлені на виявлення антигену ВРРСС, що дає змогу за допомогою такого тесту ідентифікувати ізоляти ВРРСС незалежно від їх походження. Інша група, що представляється цим винаходом, включає неконсервативний відмінний антигенний сайт з складу білка N. Діагностичні тести, які включають цей сайт і (або) антитіла, специфічні щодо цього сайта, виявляють ті антитіла свиней, які специфічно реагують з відмінними ізолятами ВРРСС, при тому, що, наприклад, вакциновані тварини можуть бути діагностовані в групі свиней, інфікованих вірусом дикого типу. Також представлені такі діагностичні тести, що ґрунтуються на використанні антитіл до неконсервативного сайту і мають виявляти антиген ВРРСС, що таким чином дозволяє застосовувати цей тест для розмежування ізолятів ВРРСС, що розрізняються. В межах одного такого неконсервативного сайта цей винахід представляє базову послідовність PRGGQAKKKK або PRGGQAKRKK, або PRGGQAKKRK, або GPGKKNKKKN, або GPGKKNKKKT, або GPGKKNRKKN, або GPGKKFKKKN, або GPGKKIKKKN, або GPGQINKKIN. В межах іншого неконсервативного сайта даний винахід представляє базову послідовність MAGKNQSQKK або MPNNNGKQTE, або MPNNNGKQPK, або MPNNNGKQQK, або MPNNNGKQQN, або MPNNNGKQQK, або MPNNNGRQQK. Також штучні зміни, які б зберігали антигенні властивості і таким чином функціональність позначених вище базових послідовностей з меж білків GP4 або N, можуть бути легко внесені будь-яким фахівцем в галузі конструювання і синтезу пептидів згідно з описаним тут вище. Також цей винахід представляє групу, яка включає конформаційні епітопи (які значною мірою варіюються при порівнянні різних ізолятів), що можуть бути знайдені на ділянках, що відповідають ділянкам, які виявляються у ізоляту І-1102 від 51-ї до 68-ї амінокислоти (базова послідовність ізоляту I-1102 PKPHFPLAAEDDIRHHL) або від 79-ї до 90-ї амінокислоти (базова послідовність у ізоляту І-1102 SIQTAFNQGAGT), або від 111-ї до 124-ї амінокислоти (базова послідовність у ізоляту І-1102 HTVRLIRVTSTSAS) у складі білка N. Представлені цим винаходом консервативні і неконсервативні, так само як диференціюючі та конформаційні сайти білка N, ті сайти, які подані в цьому винаході, дають змогу представити діагностичні тести, які однозначно визначають інфекцію вірусом РРСС. Тести сформовані таким чином, щоб уникнути врахування неконсервативних сайтів, що дозволяє виключити отримання несправжньонегативних результатів. Крім того, різні неконсервативні сайти використовуються в розробці диференціюючих тестів, за допомогою яких можна, наприклад, відрізняти вакцинованих свиней від свиней, інфікованих ізолятами ВРРСС дикого типу. Знову ж, як вже говорилося, для фахівця в галузі молекулярної біологи простим є зіставити послідовності, які включають консервативні або неконсервативні, або конформаційні епітопутворюючі сайти, з амінокислотними послідовностями, які кодуються відкритою рамкою ORF7 будь-якого іншого ізоляту ВРРСС. Сайти, що представляються нинішнім винаходом, використовуються в нових "парах" "вакцина/діагностичний тест", призначених для використання в програмах з викорінення вірусу РРСС. Експериментальна частина Матеріали і методи Клітини і віруси Штам Ter Huurne (CNCM І-1102) вірусу РРСС було виділено в 1991 році (Wensvoort et al., 1991). Американський штам цього вірусу (АТСС №VR2332) був виділений Бенфілдом з спі-вавт. (Benfield et al., 1992). Штам NL1 (Голландія, 1991 рік) був виділений в лабораторії заявників, штам NY2 (Англія, 1991 рік) був люб'язно наданий д-ром Дрю (Т. Drew), штам DEN (Данія, 1992 рік) був люб'язно наданий д-ром Ботне-ром (А. Botner), штам LUX (Люксембург, 1992 рік) був люб'язно наданий д-ром Лошем (Losch), штами SPA1 і SPA2 (Іспанія, 1992 рік) був люб'язно наданий, відповідно, д-рами Шокуі і Еспунья (Shokouhi & Espuna) , а штам FRA (Франція, 1992 рік) був люб'язно наданий д-ром Лефорбаном (Y. Leforban). Віруси ВРРСС і VR2332 культивували на клітинах CL2621 згідно з раніше описаним [Van Nieuwstadt et al., 1996]. Сім різних європейських ізолятів культивували з використанням альвеолярних (легеневих) макрофагів свині. Макрофаги підтримували в культурі згідно з раніше описаним [Wensvoort et al., 1991]. Клітини ВНК-21 підтримували в мінімальному середовищі Дальбеко (модифіковане середовище Ігла) з доданням 5% плодової телячої сироватки і антибіотиків. Для експериментів з трансфекції клітини ВНК-21 вирощували в мінімальному середовищі Глазго (Gibco-BRL/Life Technologies Ltd.). Антисироватки В попередніх експериментах використовувались свиняча ан-тисироватка-21 до ВРРСС і антипептидна сироватка кролика (698 і 700). Сироватка 700 сформована до ділянки від 106-ї до 122-ї амінокислоти (CLFYASEMSEKGFKVIF), що кодується відкритою рамкою ORF4 вірусу ВРРСС, і була одержана від кролика. Одержання і охарактеризування моноклональних антитіл були описані раніше (Van Nieuwstadt et al., 1996). Гібридоми були одержані на матеріалі п'яти послідовних експериментів із злиття клітин і були специфічними відносно до білка, що кодується геном ORF4 (моноклональні антитіла 121.4, 122.1, 122.12, 122.20, 122.29, 122.30, 122.59, 122.66, 122.68, 122.70, 122.71, 126.1, 126.7, 130.7, 138.28), або до білка, що кодується геном ORF7 (моноклональні антитіла 122.17, 125.1, 126.9, 126.15, 130.2, 130.4, 131.7, 138.22, WBE1, WBE4, WBE5, WBE6, SDOW17). Моноклональні антитіла серії WBE були люб'язно надані д-ром Дрю з Англії (Dr. Drew, Weybridge, UK) , а моноклональне антитіло SDOW17 було люб'язно надане д-ром Бенфілдом з США (Dr. Benfield, South Dakota, US). Плазмідні конструкції Два олігонуклеотиди, розташовані вище (PRRSV13) і нижче (PRRSV14) кодуючої рамки ORF4, раніше використовувались для ампліфікації і клонування гена ORF4 ізоляту І-1102 до складу плазміди pGEM-4Z з використанням сайтів рестрикції ВатНІ і Hmdlll, внесених до складу цих затравок [Meulenberg et al., 1995]. Одержану плазміду позначили pABV209. Два олігонуклеотиди, які відповідають аналогічним положенням відносно до ініціюючого кодону (PRRSV4) і відносно до термінуючому кодону (PRRSV5) гена ORF4 штаму VR2332 використовувались для ампліфікації ORF4 штаму VR2332 за допомогою ПЛР з ревертуван-ням згідно з методами, описаними в попередніх дослідженнях. Одержаний ПЛР-фрагмент обробляли рестриктазою ВатНІ і частково рестриктазою Hmdlll, з урахуванням того, що ген ORF4 VR2332 має внутрішній HindIII-сайт, і клонували в плазміду pGEM-4Z з одержанням в результаті плазміди, позначеної pABV270. Методики рекомбінантної ДНК здійснювались в основному згідно з описаним у Сембрука з співавт. [Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY]. Нуклеотидна послідовність ORF4 VR2332 в складі pABV-270, визначена за допомогою автоматичного секвенатора (Applied Biosystems), була ідентична опублікованій послідовності [Murtaugh et al., 1995, Arch. ViroL, 140, 1451-1460]. Далі, послідовності ORF4 l-1102 і VR2332 вносили до складу експресуючого вектора pSFV1 вірусу Semliki forest. Плазміди pABV209 і pABV270 обробляли рестриктазами ВаmНІ і Hmdlll (у випадку pABV270 - частково), одержані фрагменти ORF4 обробляли полімеразою Кльонов (Pharmacia) з метою одержання "тупих кінців", після чого їх лігували по Smal-сайту pSFV1, дефосфорилованому телячою кишковою лужною фосфатазою (Pharmacia). Плазміди, які включають ORF4 І-1102 (pABV265) і VR2332 (pABV271) в правильній орієнтації, потім тестували за експресією ними білка GP4. Крім того, були сформовані чотири різні химерні гени ORF4 І1102 і VR2332. Нуклеотидна послідовність ORF4, що кодує амінокислоти 1-39 білка GP4, VR2332, була ампліфікована з складу плазміди pABV270 з використанням олігонуклеотидних зондів PRRSV4 і PRRSV6. Одержаний фрагмент розщепляли рестриктазами ВаmНІ і SacII. Цей фрагмент лігували до складу плазміди pABV209, обробленої рестриктазами ВаmНІ і SacII з метою забезпечення внутрішньорамкового злиття ділянок, що кодують амінокислоти 1-39 білка GP4 VR2332 і амінокислоти 40-183 білка GP4 I-1102, в складі плазміди рАВV306. Нуклеотидна послідовність гена ORF4, що кодує амінокислоти 1-75 білка GP4 VR2332, була ампліфікована з використанням олігонуклеотидів PRRSV4 і PRRSV9 (див. таблиця 2). Цей фрагмент розщепляли рестриктазами ΚpnΙ ι ВаmНІ. Нуклеотидна послідовність гена ORF4, що кодує амінокислоти 80183 білка GP4 I-1102, була ампліфікована з використанням зондів PRRSV4 6 і PRRSV14, а ампліфікований фрагмент розщепляли рестриктазами ΚpnΙ ι ВаmНІ. Обидва фрагменти лігували водночас в плазміду pGEM4Z, оброблену рестриктазами ВаmНІ і Hindlll, в результаті одержали плазміду pABV308. Таким самим шляхом комплементарну конструкцію було створено в складі плазміди pABV314 - вона включала нуклеотидну послідовність, кодуючу амінокислоти 1-79 білка GP4 l-1102, ампліфіковану з використанням зондів PRRSV13 і PRRSV57 та ліговану до складу плазміди pGEM-4Z на фрагмент, кодуючий амінокислоти 76-178 того ж білка VR2332, який було ампліфіковано з використанням зондів PRRSV10 і PRRSV5. Четверта химерна конструкція включала фрагмент, кодуючий амінокислоти 40-79 білка GP4 BPPCC, злитий з фрагментами, кодуючими амінокислоти 1-39 і амінокислоти 76-178 білка GP4 VR2332. Це досягали літуванням BamHI/SacII-фрагменту гена ORF4 з складу pABV270 і SacII/HindIII-фрагменту гена ORF4 з складу pABV314 до складу плазміди pGEM4Z, обробленої рестриктазами ВаmНІ і Hindlll. Цю плазміду було позначено pABV325. Плазміди pABV306, pABV308, pABV314 і pABV325 протестували на точність послідовності шляхом олігонуклеотидного секвенування. Химерні гени ORF4 були перенесені з плазмід pABV306, pABV308, pABV314 і pABV325 у плазміду pSFVI так само, як це було описано для генів ORF4 VR2332 і ВРРСС: в результаті були одержані плазміди pABV296, pABV305, pABV321 і pABV326, відповідно (Фіг.3). Два олігонуклеотиди, розташовані вище (LV108: 5'-GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATGGCCGGTAAAAACCAGAGCC-3') та нижче (LV112: 5'CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCÄCCCTGA-3') гена ORF7, використовувались для ампліфікації і клонування гена ORF7 до складу плазміди pGEM-T з одержанням плазміди pABV431. Послідовності і положення цих та інших олігонуклеотидів, що використовувались для ампліфікації фрагментів гена ORF7, подані в таблиці 1. Крім того, чотири різні химерні конструкції були сформовані з застосуванням ПЛРопосередковуваного мутагенезу. Послідовності, які кодують амінокислоти 25-26, 28-30 (сайт В: Фіг.3) були заміщені відповідними послідовностями білка N вірусу EAV. Це здійснили шляхом ПЛР-ампліфікаци гена ORF7 з використанням зондів LV108 і LV143 (5'TGGGGÄATGGCCAGCCAGTCAATGACCTGTGCCGGATGTTTGGTGCAATGATAAAGTCC-3'). Мутований ДНКфрагмент був внесений в плазміду pABV431 з використанням рестрикційних сайтів MscI і РасІ з одержанням в результаті плазміди pABV455. Ділянка гена ORF7, що кодує амінокислоти 51-67, була заміщена відповідною ділянкою гена ORF7 вірусу LDV. Плазміду pABV431 обробляли рестриктазами EcoNI та СlаІ і лігували на ПЛРфрагмент, одержаний з використанням затравок LV98 (5'CCAGCAACCTAGGGGAGGACAGGCCAAAAAGAAAAAGCAGCCGAAGCTACATTTTCCCATGGCTGGTCCATCTGAC-3') та LV99 (5'-CGTCTGGATCGATTGCAAGCAGAGGGAGCGTTCAGTCTGGGTGAGGACGTGCCGGAGGTCAGATGGACCAGCC-3'), розщеплений тими самими рестриктазами. Одержану плазміду позначили pABV463. Ділянку гена ORF7, що кодує амінокислоти 80-90, заміщали відповідною ділянкою гена ORF7 вірусу LDV. Ген ORE LV було мутовано в умовах ПЛР з затравками LV101 (5'-GCTTGCAGGCGCCCGTGACGCTTTTCAATCAAGGCGGAGGACAGGCGTCGCTTTC-AТССА-3') і LV112. Одержаний фрагмент розщепляли рестриктазами Narl і Расl та лігували на плазміду pABV431, оброблену рестриктазами Clal і Расl. Одержали плазміду pABV453. Нарешті, ділянку, що кодує С-кінцеву частину білка N (амінокислоти 111-128), заміщали на послідовність, кодуючу відповідні амінокислоти білка N вірусу LDV. Ген ORF7 ампліфікували з використанням затравок LV108 і LV102 (5'ATGTCCCGGGCTAAGCGGCGGAGGAATTAGCAGAAGCGTTAATCAGGCGCTGTGTAGCA-GCAACCGGCAG-3') і клонували до складу вектора pGEM-T, в результаті чого була одержана плазміда pABV456. Мутовані гени ORF7 і гени ORF7 дикого типу були вирізані з плазмід pABV431, pABV453, pABV455 і pABV463 дією рестриктаз Расl (утворює "тупі кінці"), Нраl, з плазміди pABV456 - дією НраІ та Swal. Ці гени були послідовно внесені в дефосфорилований Smal-сайт експресуючого вектора pSFVl вірусу Semliki forest. Плазміди pABV470, pABV460, pABV462, pABV518 і pBV471, які включають відповідні гени ORF7, що знаходяться в правильній орієнтації, далі були протестовані по експресії з них білка N. Транскрипція m vitro і трансфекція вірусної ORF7PHK Semlіki forest були описані вище для конструкцій SFV-ORF4. Для клонування генів ORF4 з складу геномів семи різних європейських ізолятів лінії макрофагів були інфіковані штамами NL1, NY2, DEN, FRA, SPA1, SPA2 і LUX та з них виділяли РНК згідно з описаним у Мейленберга з співавт. [Meulenberg et al., 1993]. Гени ORF4 були ампліфіковані за допомогою ПЛР з ревертуванням з використанням олігонуклеотидів PRRSV13 і PRRSV14 і клоновані по ВаmНІ- і HmdIII-сайтам в плазміду pGEM-4Z. Для кожного штаму нуклеотидна послідовність гена ORF4 була визначена в двох клонах, одержаних в двох незалежних ПЛР. Амінокислотні послідовності, розшифровані з цієї нуклеотидної послідовності, були зіставлені з використанням комп'ютерної програми, розробленої для багатолінійного порівняння послідовностей - CLUSTAL (PCGene: Intelligenetics Tm). Транскрипція in vitro і трансфекція РНК SFV-ORF4 Плазміди pSFVl, які включають різні конструкції гена ORF4, були лінеаризовані шляхом розщеплення рестриктазою Spel і трансрибовані in vitro. Синтезованою в результаті РНК трансфікували клітини ВНK-21, що знаходяться в 15-мм лунках 24-лункових планшетів з використанням ліпофектину. Клітини фіксували охолодженою на льоду 50%-вою (об'ємні відсотки) сумішшю метанолу і ацетону, а білок GP4, експресований різними конструкціями гена ORF4, забарвлювали за допомогою моноклональних антитіл в моношаровому імунотесті з приєднанням пероксидази (ІРМА). Для аналізу продуктів експресії генів ORF4 за допомогою імунопреципітації клітини ВНK-21 в кількості 10млн. трансфікували за допомогою електропорації 10мкг тринскрибованої in vitro РНК SFV-ORF4. Піддані електропорації клітини висівали на 3 35-мм лунки 6-лункового планшета і через 18 годин після трансфекції клітини помічали. Метод PEPSCAN Повний набір нонапептидів або додекапептидів, що перекриваються, синтезували, виходячи з амінокислот, похідних від послідовності ORF4 або ORF7 ВРРСС згідно з раніше проведеними визначеннями [Meulenberg et al., 1993]. Синтез пептидів в твердій фазі на поліетиленових шариках і імунний скринінг за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (метод ТІФА) були проведені згідно з встановленими процедурами методу PEPSCAN (Geysen et al., 1984, PNAS, 81, 3998-4002). Результати Раніше заявники описали панель нейтралізуючих моноклональних антитіл, які реагували з білком 31-35-кД ВРРСС, позначеним як GP4, а також панель моноклональних антитіл, реактивних щодо білка N при проведенні аналізу методом Вестерн-блотинга. Для GP4 було показане, що він є глікопротеїном, що кодується геном ORF4, а білок N є нуклеокапсидним білком, який кодується геном ORF7. В експериментах з імунопреципіта-ци з використанням моноклональних антитіл, специфічних для GP4, білок GP4, похідний від лізатів клітин, заражених ВРРСС, переміщався у вигляді окремого бенда, що відповідає молекулярній масі 28кД разом із слабим розмитим бендом, який відповідає більш високій молекулярній масі. Моноклональні антитіла осаджували дифузний (глікозилований) білок GP4 з молекулярною масою близько 31кД з позаклітинного середовища ВРРСС-інфікованих клітин, але не з позаклітинного середовища несправжньоінфікованих клітин. Ідентифікація нейтралізуючого домену в складі GP4 Раніше було продемонстровано, що моноклональні антитіла, специфічні відносно до білка GP4, розпізнають І-1102, але не американський ізолят VR2332 [Van Nieuwstadt et al., 1996]. З метою ідентифікації домену в складі білка GP4, який зв'язує нейтралізуючі моноклональні антитіла, заявники сформували злиті білки GP4 l-1102 та VR2332. Ці білки були експресовані у вірусній експресійній системі Semliki forest, розробленій Лільєстрьомом з співавт. [Liljeström et al., 1991, Biotechnology, 9, 1356-1362]. По-перше, ген ORF4 l-1102 було клоновано до складу pSFVl з одержанням в результаті плазміди pABV265 (Фіг.1). РНК, транскрибована з pABV265, використовувалась для трансфекци клітин ВНK-21, а через 24 години трансфіковані клітини виявляли позитивне забарвлення при використанні панелі з 15 нейтралізуючих моноклональних антитіл. Ці моноклональні антитіла не реагували з клітинами ВНК-21, трансфікованими конструкцією pSFVl-PHK. Рекомбінантний білок GP4 імунопреципітували з використанням моноклонального антитіла 126.1 з помічених L-[35S]-метіоніном клітин ВНК-21, трансфікованих РНК pABV265. Він мав схожий розмір порівняно з цим GP, синтезованим в клітинах CL2621, інфікованих штамом l-1102, і характеризувався приєднанням N-гліканів, чутливих до дії PNGaseF і EndoH. Білок GP4 VR2332 також був клонований в pSFVl, однак цей білок не розпізнався моноклональними антитілами при його експресії в клітинах ВНК-21 (Фіг.1). Для подальшого картування ділянки білка GP4, взаємодіючої з моноклональними антитілами, на основі pSFVl були сконструйовані чотири химерні гени ORF4 І-11022 та VR2332 (Фіг.1). РНК, транскрибовані з плазмід pABV296, pABV305, pABV321 і pABV326, трансфікували з клітинами ВНК-21 з подальшим тестуванням реактивності білків, що експресуються, відносно до GР4-специфічних моноклональних антитіл із застосуванням тесту ІРМА. Параметри відповіді цих 15 моноклональних антитіл були ідентичними: це показало, що дані моноклональні антитіла спрямовані на 40-пептидну ділянку, в складі білка GP4. Продукт експресії плазміди pABV326, який включає амінокислоти 40-79, похідні від білка GP4 ізоляту CNCM l-1102, оточені послідовностями, похідними від білка GP4 VR2332, чітко розпізнавався даною панеллю моноклональних антитіл. Для підтвердження того, що різні білки GP4, особливо ті, які не розпізнавались раніше цими моноклональними антитілами, дійсно були експресовані клітинами ВНК-21, вони були імунопреципіто-вані з лізатів клітин ВНК-21, які перед цим трансфікували РНК, транскрибували in vitro з плазмід pABV265, pABV271, pABV296, pABV305, pABV321 і pABV326. Імунопреципітацію здійснювали з використанням свинячої анти-ВРРСС антисироватки 21 (моноклональне антитіло 126.1) і антипептидних сироваток 698 і 700. Сироватка 700 сформована до амінокислот 106-122 білка GP4 BPPCC ізоляту CNCM I-1102: ця послідовність ідентична послідовності білка GP4 ізоляту АТСС VR2332, за винятком 121-ї амінокислоти. Таким чином, з використанням сироватки 700 імунопреципітували всі білки GP4. Вони не розрізнялись за розміром при аналізі методом електрофорезу в SDS-ΠΑΑΓ, за винятком того, що білки GP4, що експресуються плазмідами pABV305 і pABV271, мали дещо більшу рухливість. Найбільш ймовірно це зумовлене тим, що в послідовності білка VR2332 є ділеція 4 амінокислот порівняно з послідовністю І-1102 на його ділянці 62-64-ї амінокислот (Фіг.3). Повний набір GP4специфічних моноклональних антитіл розпізнавав білки GP4, які експресуються з плазмід pABV265, pABV296, pABV321, pABV326, але не ті, що експресувались з pABV305 і pABV271 - це підтверджує висновки тесту ІРМА (Фіг.3). Сироватка 698 виявила той самий профіль реагування, що і панель моноклональних антитіл. Сироватка 698 сформована до амінокислот 62-77 білка GP4 ВРРСС, які знаходяться в межах ідентифікованого тут нейтралізаційного домену білка GP4. Ця ділянка виявляється значною мірою гетерогенною в складі гена ORF4 VR2332 і, отже, продукти експреси, які включають послідовність цієї ділянки VR2332, не розпізнаються даною сироваткою. Однак, нейтралізуючі поліклональні свинячі сироватки розпізнають білок GP4 І-1102 та химерні білки GP4, а також білок GP4 VR2332: це вказує на те, що в складі свинячих антисироваток до ВРРСС є ряд нейтралізуючих антитіл, які специфічні відносно до нейтралізаційного сайту, що утворюється амінокислотами 40-79 в складі білка GP4. PEPSCAN білків, які кодуються ОRF4 і ORF7 Оскільки п'ятнадцять моноклональних антитіл, реактивних відносно до продукту гена ORF4, реагують з білком GP4 в аналізі методом Вестерн-блотинга, вони, як припускають, повинні розпізнати лінійний епітоп на ділянці амінокислот 40-79 послідовності GP4 у ізоляту І-1102. Для подальшого картування ділянки, що зв'язує моноклональні антитіла, здійснили аналіз методом PEPSCAN, в якому використовували 9-вимірні або 10вимірні полінуклеотиди, що перекриваються, для цієї ділянки. Як припускають, пептиди представляють антигенні сайти тоді, коли піки в даному наборі відтворювано не менше ніж вдвічі за величиною переважають фоновий рівень. Моноклональні антитіла 122-29, 122-30, 122-66, 122-71, 130-7 і 138-28 виявляють позитивну реактивність відносно до одного антигенного сайту, що складається з амінокислот 59-67 (SAAQEKISF) (Фіг.2). Моноклональне антитіло 122-12 лише слабко реагує з цим самим антигенним сайтом, у той час як інші 7 моноклональних антитіл в аналізі методом PEPSCAN були негативними. В аналізі PEPSCAN той самий антигенний сайт ідентифікується поліклональною свинячою сироваткою. Нейтралізуюча сироватка 21, взята на 6-у тижні після зараження свині-21 вірусом ВРРСС, виявляла жорстку реактивність при широкій специфічності щодо антигенного сайту і фланкуючих його ділянок послідовності. Крім того, нейтралізуюча поліклональна свиняча сироватка (va12 і va14), взята на 54-й день після вакцинації з використанням вірусного вектора PRV-ORF4, а також при забої, здійсненому на 30-й день після повторної вакцинації, проведеної на 54й день після першої вакцинації, жорстко реагувала при більш широкій специфічності порівняно з розміром нейтралізаційного антигенного сайта, раніше визначеного за допомогою методу PEPSCAN. У ізоляту І-1102 базова послідовність нейтралізаційного сайта включає амінокислотну послідовність SAAQEKISF, що знаходиться в положеннях 59-67. У інших ізолятів базова послідовність може бути знайдена в такій же амінокислотній ділянці або по сусідству з нею, що знаходиться в складі амінокислотної послідовності, що відповідає нейтралізаційному сайту білка GP4, включаючи, наприклад, такі послідовності, як SAAQEEISF або STAQENISF, або STAQENIPF, або SEESQSVT, або SASEAIR, або SASEAFR, або PAPEAFR, або PAPEAIR, або SAFETFR, або STSEAFR, але при цьому слід очікувати, що інші ізоляти ВРРСС мають відповідні, але при цьому дещо відмінні базові послідовності нейтралізаційного сайта, розташовані в самій ділянці амінокислот 59-67 або поруч з нею в складі амінокислотної послідовності, яка кодується геном ORF4 вірусу ВРРСС ізоляту І-1102. Також штучні зміни, які зберігають антигенні властивості і відповідну функціональність позначених вище базових послідовностей, можуть бути легко виконані фахівцем у галузі конструювання і синтезу пептидів. З урахуванням того, що в тесті PEPSCAN було чітко продемонстровано більш широку реактивність нейтралізуючої поліклональної сироватки, амінокислотні послідовності, які включають амінокислотні базові послідовності і амінокислотні послідовності, які фланкують базові послідовності, різних ізолятів ВРРСС додатково представляють нейтралізаційний антигенний сайт білка ORF4 вірусу ВРРСС. Зокрема, послідовності, які знаходяться в положеннях, що відповідають амінокислотам 40-79, також представляють нейтралізаційний сайт (Фіг.1). Знову ж, штучні зміни, які зберігають антигенні властивості і відповідну функціональність позначених вище антигенних сайтів, можуть бути легко виконані фахівцем у галузі конструювання і синтезу пептидів. Враховуючи широку реактивність поліклональних нейтралізуючих сироваток va12 і va14 (Фіг.2), амінокислотні послідовності в положеннях, що відповідають амінокислотам 5275, більш конкретно представляють широко реактивний нейтралізаційний сайт. Моноклональні антитіла до білка ORF7, реагували в чотирьох різних групах в методі PEPSCAN - групи А(4), В(2), С(3) і D(1). Група 1(D) (до якої, окрім інших, входять моноклональні антитіла 122.17, 130.3, 130.4, 131.7, WBE1, WBE4, WBE6, SDOW17, і включаючи консервативні і неконсервативні реактивні сайти) реагувала з конформаційним епітопом, що не виявляється при PEPSCAN. Група 2(В) (до якої, окрім інших, входять моноклональні антитіла 125.1, 126.9, NS95 і NS99; що реагує зі всіма тестованими ізолятами ВРРСС, визначаючи таким чином консервативний антигенний сайт) вказує на базову послідовність VNQLCQLLGA (що виявляється у ізоляту I-1102 в амінокислотних положеннях 22-32) або VNQLCQMLGK. Група 3(С) (до якої, окрім інших, входить моноклональне антитіло 126.15; яка в основному реактивна відносно до європейських ізолятів ВРРСС, що таким чином визначає диференціюючий антигенний сайт) вказує на базову послідовність PRGGQAKKKK (знайдену у ізоляту І-1102 в амінокислотних положеннях 41-50) або PRGGQAKRKK, або PRGGQAKKRK, або GPGKKNKKKN, або GPGKKNKKKT, або GPGKKNRKKN, або GPGKKFKKKN, або GPGKKIKKKN, або GPGQINKKIN. Група 4(А) (до якої, окрім інших, входить моноклональне антитіло 138.22; яка в основному реагує зі штамами ВРРСС, виділеними в Європі, що таким чином визначає диференціюючий антигенний сайт) вказує на базову послідовність MAGKNQSQKK (знайдену у ізоляту І-1102 в амінокислотних положеннях 1-10) або MPNNNGKQTE, або MPNNNGKQPK, або MPNNNGKQQK, або MPNNNGKQQN, або MPNNNGKQQK, або MPNNNGRQQK. Також штучні зміни, що зберігають антигенні властивості і відповідну функціональність позначених вище антигенних сайтів в складі білка N, можуть легко виконуватись фахівцем у галузі конструювання і синтезу пептидів. Хоча група 1 не представляє лінійні епітопи, порівняння амінокислотних послідовностей ВРРСС і амінокислотних послідовностей вірусу LDV показує, що конформаційні епітопи (які на значному рівні варіюються у різних ізолятів) можуть бути виявлені в положеннях, які відповідають тим, що були знайдені у ізоляту I-1102 в амінокислотних положеннях 51-68 (амінокислотна послідовність ізоляту І-1102 PKPHFPLAAEDDIRHHL) або 79-90 (амінокислотна послідовність ізоляту І-1102 SIQTAFNQGAGT), або 111-124 (амінокислотна послідовність ізоляту І-1102 HTVRLIRVTSTSAS). Також штучні зміни, які зберігають антигенні властивості і відповідну функціональність позначеного вище конформаційного епітопа в складі білка N, можуть легко виконуватись фахівцем в галузі конструювання та синтезу пептидів, особливо тим, який має інформацію, одержану при порівнянні послідовностей ізолятів ВРРСС і при порівнянні послідовностей білка N з такими у інших артеривірусів. Це було визначено в аналізі химерних по LDV/BPPCC білків ORF7, що експресуються, в експресійній системі SFV (сформованій так само, як це було вище описане для гена ORF4) з визначенням їх реактивності з моноклональними антитілами групи 1. Химерні білки N Далі домен D було картовано з використанням конструкцій, які включають ген ORF7 і експресують химерні білки N. Оскільки 6 з десяті моноклональних антитіл до домену D розпізнавали і європейські, і північноамериканські ізоляти ВРРСС, ділянки, які є найбільш консервативними для білка N вірусу LV і північноамериканського прототипу VR2332 (Фіг.4), були мутовані. Нуклеотидні послідовності, кодуючі амінокислоти 51-67, 80-90 і 111-128, замінили на послідовності, які кодують відповідні амінокислоти того ж білка LDV (Фіг.4). Для закінченості також мутували сайт В (амінокислоти 25-30), який також є консервативним у європейських і північноамериканських ізолятів. Оскільки амінокислотна послідовність білка N вірусу LV була по сайту В дуже схожою з такою у білка вірусу LDV, цю ділянку білка N вірусу LV було заміщено ділянкою, що кодує відповідні амінокислоти білка N вірусу EAV (Фіг.4). Коли мутовані білки N і білки N дикого типу були експресовані в клітинах ВНК-21 з використанням вірусної експресійноі системи Semliki forest, здійснювали їх тестування з використанням специфічних щодо білка N моноклональних антитіл в тесті ІРМА: в результаті Dспецифічні моноклональні антитіла реагували ідентично (таблиця 1). Ix зв'язування порушувалося мутаціями на амінокислотних ділянках 51-67 і 80-90, але не мутаціями амінокислотних ділянок 111-128 або 25-30 (сайт В). Як і очікувалося, білки N, що несуть на ділянках амінокислот 51-67 і 80-90 послідовності вірусу LDV, забарвлювались моноклональними антитілами, що представляли групи А, В і С. Однак, число клітин, що забарвлювалися, а також яскравість цього забарвлення були меншими порівняно з тими, що спостерігалися при тестуванні білка N дикого типу і білків N, мутованих по амінокислотній ділянці 25-30 (сайт В) або амінокислотній ділянці 111-128 (таблиця 1). Найбільш імовірним поясненням цього є низький рівень експресії білків N, що включають мутації на амінокислотних ділянках 51-67 або 80-90, оскільки низький вихід цих мутантних білків N порівняно з іншими білками N також спостерігався тоді, коли рівні кількості транскриптів були трансльовані в моделі in vitro (дані не наведені). Як і очікувалося, білок N, що включає послідовності вірусу EAV в сайті В, не розпізнавався моноклокальними антитілами, картованими для сайта В у аналізі методом PEPSCAN, але розпізнавались моноклональними антитілами, які були картовані по сайтам А і С або домену D. Ці дані вказують на те, що епітопи, картовані в домені D, є конформаційно-залежними і включають (частково) амінокислоти 51-67 і 80-90. Сєквенування білка GP4 у рхзних штамів ВРРСС З метою аналізу того, чи є основний нейтралізаційний антигенний сайт, що розпізнається GР4специфічними антитілами, консервативним у різних ізолятів ВРРСС, далі досліджувалась реактивність і нейтралізуюча активність моноклональних антитіл на матеріалі семи європейських штамів цього вірусу. Одержані результати показали, що ці моноклональні антитіла розпізнавали і нейтралізовували інший голландський штам NL1 і британський штам NY, але не датський ізолят DEN, два іспанські ізоляти SPA1 і SPA2, французький ізолят FRA і люксембурзький ізолят LUX. Отже, було виявлено зацікавленість до амінокислотної послідовності ділянки, що є нейтралізаційним сайтом білка GP4 у цих ізолятів. Гени ORF4 клонували за допомогою ПЛР з ревертуванням з використанням затравок, сформованих на основі послідовностей ВРРСС, з подальшим секвенуванням нуклеотидної послідовності. Амінокислотні послідовності білка GP4 різних ізолятів, розшифровані по цим нуклеотидним послідовностям, були на 86-97% ідентичні такій послідовності ізоляту l-1102. Зіставлення цих амінокислотних послідовностей показало, що нейтралізаційний сайт (амінокислоти 40-79) відрізняється більшою мірою, ніж решта частина цього білка. В цій ділянці найбільший рівень відмінностей амінокислотних послідовностей характерний для штамів DAN, SPA1, SPA2 і FRA. Це відповідає виявленню того, що ці штами не нейтралізуються специфічними щодо штаму l-1102 моноклональними антитілами, і додатково підтверджує те, що цей сайт не є висококонсервативним у різних європейських ізолятів. Інша ділянка, що характеризується високим рівнем гетерогенності, була виявлена в Nкінцевій частині білка GP4. Порівняння амінокислотної послідовності білка GP4 ВРРСС і того ж білка штаму VR2332 та інших північноамериканських ізолятів показує, що останні також значною мірою гетерогенні за параметрами нейтралізаційного сайта даного білка. Зіставлення амінокислотних послідовностей дозволяє внести розрив у складі нейтралізаційного сайта у північноамериканських ізолятів (Фіг.3), який погоджується з виявленням того, що жоден з цих ізолятів не розпізнається моноклональними антитілами, що використовувались. В цілому, більш висока гетерогенність відзначалась серед послідовностей американських ізолятів вірусу порівняно з послідовностями європейських ізолятів. Це погоджується з параметрами, характерними для вірусної оболонки, які ідентифікуються, наприклад, для амінокислотних послідовностей білка GP4. Потенціал нейтралізаційного сайта з точки зору розробки вакцин має важливе значення у зв'язку з гетерогенністю структури нейтралізаційного сайта. Порівняння амінокислотних послідовностей білків GP4, які представляють різні європейські штами, показало, що нейтралізаційний сайт був більш гетерогенним, ніж інші ділянки даного білка: це підтверджує те, що цей сайт може використовуватись в імунологічному відборі. Порівняння послідовностей нейтралізаційного сайта у європейських і північноамериканських штамів ВРРСС дозволило ідентифікувати розрив в 4 амінокислоти в послідовності північноамериканського походження порівняно з європейськими штамами, що додатково ілюструє значну амінокислотну гетерогенність ідентифікованого в даному винаході нейтралізаційного сайта ВРРСС. Нейтралізаційний сайт білка GP4, описаний в цьому винаході, є вперше ідентифікованим сайтом у вірусу Lelystad. Для двох інших артеривірусів - EAV і LDV - всі раніше виділені нейтралізуючі моноклональні антитіла були специфічними щодо білка G1/VP3, що кодується геном ORF5 [Deregt et al., 1994; Glaser et al., 1995; Balasuriya et al., 1995; Harty & Plagemann, 1988]. З використанням позбавлених нейтралізаційного сайта мутантів нейтралізаційний сайт картували на амінокислотній ділянці зовнішнього домену білка G1. Аналогічні порівняння послідовностей були проведені по білку ORF7 ВРРСС (Фіг.4) з метою подальшої демонстрації значного рівня амінокислотної змінності ідентифікованого тут консервативного по антигенним властивостям сайта і неконсер-вативних сайтів ВРРСС. В проведених дослідженнях заявники ідентифікували чотири різні антигенні сайти в складі білка N ВРРСС. Три сайти, позначені А, В і С, включали лінійні епітопи, які були картовані по амінокислотним ділянкам 2-12, 25-30 і 40-46, відповідно. З іншого боку, четвертий сайт, позначений як "домен D", включає конформаційно-залежні епітопи, які (частково) включають амінокислоти 5167 і 80-90, Сайти А і С включають епітопи, які консервативні у європейських ізолятів, але не консервативні у північноамериканських ізолятів ВРРСС, сайт В включає епітопи, які є консервативними і у європейських, і північноамериканських ізолятів ВРРСС, в той час як сайт D включає як консервативні, так і неконсервативні для європейських і північноамериканських ізолятів ВРРСС епітопи. Описані тут консервативні сайти в складі білка N мають велике значення з точки зору розробки діагностичних тестів, необхідних для однозначної ідентифікації інфекцій вірусу ВРРСС, при тому, що ці тести повинні забезпечити виключення з використання неконсервативних сайтів, щоб у такий спосіб уникати несправжньо-негативних оцінок в цих тестах. Крім того, інформація про різні неконсервативні антигенні сайти має особливо важливе значення для розвитку ідентифікаційних тестів, за допомогою яких можна, наприклад, відрізняти вакцинованих свиней від свиней, заражених ізолятами вірусу ВРРСС дикого типу. Фігура 1. Схематичне зображення білків G, які експресуються в системі pSFV1, та їх реактивність відносно GP4-специфічних моноклональних антитіл. Позначено індекси плазмід, що несуть різні гени ORF4. Незабарвлені сегменти представляють амінокислотні послідовності, похідні від білка G, що кодується геном ORF4 вірусу ВРРСС; закрашені сегменти представляють амінокислотні послідовності, похідні від білка G, що кодується геном ORF4 штаму VR2332. Нумерація амінокислот проставлена над сегментами. Гени спочатку були внесені в плазміду pGEM-4Z і потім перенесені в експресійну систему pSFV1, яку докладно описано в розділі "Матеріали і методи". Повний набір GР4-специфічних моноклональних антитіл, які ідентично реагували з різними конструкціями в тесті ІРМА, і рівні реактивності позначені як позитивні (+) та негативні (-). Фігура 2. Аналіз методом PEPSCAN GР4-специфічних моноклональних антитіл і поліклональних сироваток з використанням 12-вимірних пептидів, що перекриваються, які покривають амінокислотні залишки 25-94 білка GP4. Показане сканування моноклонального антитіла 130.7 і моноклонального антитіла 138.28, що розпізнають чотири послідовних пептиду (Фіг.2А). П'ять інших моноклональних антитіл (122.29, 122.30, 122.66, 122.71 і 138.28) виявляли схожі параметри специфічності. Показані сканування поліклональних сироваток, взятих у двох особин свиней до імунізації (va12-0 і va14-0), після імунізаци вектором на основі вірусу несправжнього сказу, експре-суючого ORF4 (va12-54 і va14-54), і після вторинного введення вірусу ВРРСС (va12-sl і va14-sl) (Фіг.2А і 2В), а також показане (Фіг.2D) сканування полівалентної свинячий сироватки 21 до вірусу LV (va21). Амінокислотна послідовність реактивних пептидів показана так, що базу загальних амінокислот обведено. Фігура 3. Зіставлення амінокислотних послідовностей білків GP4 (А) і N (В) різних штамів ВРРСС. Показані тільки ті амінокислоти, які відрізняються від послідовності штаму I-1102. Підкреслені базові амінокислотні послідовності, що розпізнаються моноклональними антитілами і (або) поліклональними сироватками в аналізі методом PEPSCAN. Фігура 4. Локалізація антигенних зв'язувальних сайтів в послідовності білка Ν і порівняння амінокислотних послідовностей білка N у північноамериканського штаму VR2332 і вірусу LDV. Антигенні сайти А, В і С та домен D затінені. Сайти А, В та С були ідентифіковані методом PEPSCAN, у той час як сайт D ідентифікували шляхом конструювання химерних білків N. Амінокислотні послідовності LV, які були заміщені відповідними амінокислотними послідовностями LDV з метою картування домену D, підкреслені. Амінокислоти білка N вірусу EAV, що були внесені на ділянці амінокислот 25-30 з метою мутування сайта В, показані під послідовністю LDV. Ідентичні амінокислоти з'єднані вертикальними лініями. Таблиця 1 Забарвлення химерних білків N, що експресуються вірусом Semliki forest в клітинах ВНК-21, в тесті ІРМА Плазміда PÄBV4 70 PÄBV4 62 pABV518 pABV4 60 PABV4 71 Забарвлення з моноклональними антитілами в тесті ІРМА 122.15/130.2/130.4/131.7/131.9/WBE1/WBE4/ Мутація 138.22 125.1/126.9/NS95/NS99 126.15 WBE 5/WBE 6/SDOW17 А В С D +++ +++ ++ +++ 25-30 +++ ++ ++ + 51-67 ++ ++ + 80-90 ++ ++ + 111-124 +++ +++ ++ +++ Таблиця 2 Послідовності затравок, що використовувались в методі ПЛР в процесі клонування генів ORF4 вірусів LV і VR2332 та химерних генів ORF4 в плазмідні вектори pGEM-4Z і pSFV1 Назва Послідовність 3 Рестрикційний сайт, що вноситься а Підкреслені нуклеотиди в названих затравках, які були мутовані порівняно з вихідною послідовністю з метою створення рестрикційних сайтів або послідовностей, що виступають, або для вилучення довгих повторів одного й того самого нуклеотиду. Рестрикційні сайти в затравках показані курсивом.