Моноклональне антитіло, яке специфічно зв’язує alk-1

1. Моноклональне антитіло або його антигензв’язувальна ділянка, що зв'язує ALK-1, що містить важкий ланцюг, який містить SEQ ID NO: 6 і легкий ланцюг, який містить SEQ ID NO: 8. 2. Антитіло або його антигензв’язувальна ділянка за п. 1, де антитіло містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга SEQ ID NO: 2 і амінокислотну послідовність легкого ланцюга SEQ ID NO: 4. 3. Антитіло або його антигензв’язувальна ділянка за п. 1, що містить важкий ланцюг варіабельного домену SEQ ID NO: 6 і легкий ланцюг варіабельного домену SEQ ID NO: 8. 4. Моноклональне антитіло або його антигензв’язувальна ділянка, що зв'язує ALK-1, де моноклональне антитіло містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга SEQ ID NO: 100 і амінокислотну послідовність легкого ланцюга SEQ ID NO: 102. 5. Моноклональне антитіло за п. 1 або 3, де моноклональне антитіло являє собою молекулу IgG1 або IgG2. 6. Моноклональне антитіло або його антигензв’язувальна ділянка, що зв'язує ALK-1, де вказане антитіло містить CDR1, CDR2 та CDR3 важкого та легкого ланцюга варіабельних доменів, переважно SEQ ID NO: 104 та 127. 7. Моноклональне антитіло або антигензв’язувальна ділянка за п. 6, що має щонайменше одну додаткову властивість, вибрану з групи, яка складається з наступного: a) зв'язує позаклітинний домен ALK-1 приматів з величиною авідності, що дорівнює 5 нМ або менше, що визначено за допомогою поверхневого плазмонного резонансу; b) зв'язує позаклітинний домен ALK-1 людини з величиною авідності, що дорівнює 250 пМ або менше, що визначено за допомогою поверхневого плазмонного резонансу; UA (21) a200804286 (22) 06.09.2006 (24) 11.04.2011 (86) PCT/US2006/035096, 06.09.2006 (31) 60/715,292 (32) 07.09.2005 (33) US (46) 11.04.2011, Бюл.№ 7, 2011 р. (72) НОРТ МАЙКЛ АЙДАН, US, АМУНДСОН КАРІН КРІСТІНА, US, БЕДІАН ВАХЕ, US, БЕЛУСКІ ШЕЛЛІ СІМС, US, ХУ-ЛЄУЄ ДАНА ДАН, US, ЦЗЯН СІНЬ, US, КАРЛІЧЕК ШЕННОН МАРІ, US, КЕЛЛЕРМАНН ЗІРІД-АЙМЕЄ, US, ТОМСОН ДЖЕЙМС АРТУР, US, ВАН ЦЗЯНЬІН, US, УІКМАН ГРАНТ РЕЙМОНД, US, ЧЖАН ЦЗИНЧУАНЬ, US (73) ЕМДЖЕН ФРІМОНТ ІНК., US, ПФАЙЗЕР ІНК., US (56) US A 5968752, 19.10.1999. US A1 20030152514, 14.08.2003. US A1 20050054019, 10.03.2005. US B1 6692925, 17.02.2004. FERNANDEZ-L ET AL: "Blood outgrowth endothelial cells from Hereditary Haemorrhagic Telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions" CARDIOVASCULAR RESEARCH, vol. 68, no. 2, 5 July 2005 (2005-07-05), pages 235-248, XP005109413 ISSN: 0008-6363. Anonymous: "Monoclonal anti-human ALK-1 antibody" R&D SYSTEMS INTERNET CITATION 5 October 2005 (2005-10-05), page 1, XP002435275 Retrieved from the Internet: URL:http://www.rndsystems.com/pdf/mab370.pdf> [retrieved on 2007-05-20]. MIYAZONO KOHEI ET AL: "Id: a target of BMP signaling." SCIENCE'S STKE : SIGNAL TRANSDUCTION KNOWLEDGE ENVIRONMENT 24 SEP 2002, vol. 2002, no. 151, 24 September 2002 (2002-09-24), page PE40, XP002435276 ISSN: 15258882. Anonymous: "New Products from R&D Systems, March 2002" R&D SYSTEMS INTERNET CITATION March 2002 (2002-03), pages 1-12, XP002435563 2 (19) 1 3 c) має ступінь дисоціації (kоff) для ALK-1 людини, що дорівнює 5х10-3 с-1 або менший, що визначено за допомогою поверхневого плазмонного резонансу; d) зв'язує ALK-1 приматів з KD, що дорівнює 50 нМ або менше, що визначено за допомогою проточної цитометрії; e) має KD(гризунів)/KD(приматів), яке є більшим ніж 1,5; f) має IC50, що дорівнює 150 нM або менше, що визначено за допомогою інгібування підвищеної регуляції специфічного гена-мішені ALK-1 "наступного етапу сигнального шляху", Id1; g) має IC50, що дорівнює 150 нM або менше, що визначено за допомогою інгібування фосфорилування Smad1, визначеного за допомогою вестернблотингу; h) інгібує ангіогенез судин людини у миші SCID з прищепленою тканиною крайньої плоті людини, в яку внутрішньошкірно імплантували пухлинні клітини меланоми M24met людини, що визначено ІГХ аналізом тесту на CD-31 сигнал людини щонайменше на 40 %, в порівнянні з контрольним зразком; i) інгібує ангіогенез судин людини у миші SCID з прищепленою тканиною крайньої плоті людини, в яку внутрішньошкірно імплантували колаген, що визначено ІГХ аналізом тесту на CD-31 сигнал людини щонайменше на 50 %, в порівнянні з контрольним зразком; j) конкурує за зв’язування ALK-1 з антитілом, вибраним з групи, яка складається з 1.12.1; 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); і 1.12.1(rWT); k) перехресно конкурує за зв’язування ALK-1 з антитілом, вибраним з групи, яка складається з 1.12.1; 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); і 1.12.1(rWT); l) зв'язує той же епітоп ALK-1, що і антитіло, вибране з групи, яка складається з 1.12.1; 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); і 1.12.1(rWT); m) зв'язує ALK-1 з такою ж, по суті, KD, що і антитіло, вибране з групи, яка складається з 1.12.1; 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); і 1.12.1(rWT); і n) зв'язує ALK-1 з такою ж, по суті, koff, що і антитіло, вибране з групи, яка складається з 1.12.1; 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); і 1.12.1(rWT). 8. Антитіло або антигензв’язувальна ділянка за п. 6, що містить VH домен, який є щонайменше на 90 % ідентичним за амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 104. 9. Антитіло або антигензв’язувальна ділянка за п. 6, що містить VL домен, який є щонайменше на 90 % ідентичним за амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 127. 10. Моноклональне антитіло, або його антигензв’язувальна ділянка, що зв'язує ALK-1, де VH та VL домени антитіла містять наступні послідовності, переважно: SEQ ID NOs: 6 та 8; SEQ ID NOs: 10 та 12; SEQ ID NOs: 14 та 16; 94060 4 SEQ ID NOs: 18 та 20; SEQ ID NOs: 22 та 24; SEQ ID NOs: 26 та 28; SEQ ID NOs: 30 та 32; SEQ ID NOs: 34 та 36; SEQ ID NOs: 38 та 40; SEQ ID NOs: 42 та 44; SEQ ID NOs: 46 та 48; SEQ ID NOs: 50 та 52; SEQ ID NOs: 54 та 56; SEQ ID NOs: 58 та 60; SEQ ID NOs: 62 та 64; SEQ ID NOs: 66 та 68; SEQ ID NOs: 70 та 72; SEQ ID NOs: 74 та 76; SEQ ID NOs: 78 та 80; SEQ ID NOs: 82 та 84; SEQ ID NOs: 86 та 88; SEQ ID NOs: 90 та 92; або SEQ ID NOs: 104 та 127. 11. Антитіло або антигензв’язувальна ділянка за п. 6, де вказане антитіло або антигензв’язувальна ділянка містить важкий ланцюг, який кодує VH 431, ген людини. 12. Антитіло або антигензв’язувальна ділянка за п. 6, де вказане антитіло або антигензв’язувальна ділянка містить легкий ланцюг, який кодує Vκ A27 ген людини. 13. Антитіло за будь-яким з пп. 6-12, яке являє собою молекулу IgG, IgM, IgE, IgA або IgD, або їх похідну. 14. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує (1) послідовність важкого ланцюга антитіла, яке специфічно зв’язує ALK-1, де нуклеотидна послідовність є SEQ ID NO: 1, 95 або 128, де вказаний важкий ланцюг, у поєднанні з легким ланцюгом SEQ ID NO: 4, 102, або 102, відповідно, формує антитіло, яке специфічно зв'язує ALK-1; (2) варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, яке специфічно зв’язує ALK-1, де нуклеотидна послідовність є SEQ ID NO: 5, 103 або 129, де важкий ланцюг, який включає вказаний варіабельний домен важкого ланцюга, у поєднанні з легким ланцюгом, який включає варіабельний домен легкого ланцюга SEQ ID NO: 8, 127, або 127, відповідно, формує антитіло, яке специфічно зв'язує ALK-1; (3) послідовність легкого ланцюга антитіла, яке специфічно зв’язує ALK-1, де нуклеотидна послідовність є SEQ ID NO: 3 або 101, де вказаний легкий ланцюг, у поєднанні з важким ланцюгом SEQ ID NO: 2, або 100, відповідно, формує антитіло, яке специфічно зв'язує ALK-1; або (4) варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, яке специфічно зв’язує ALK-1, де нуклеотидна послідовність є SEQ ID NO: 7 або 126, де легкий ланцюг, який включає вказаний варіабельний домен легкого ланцюга, у поєднанні з важким ланцюгом, який включає варіабельний домен важкого ланцюга SEQ ID NO: 6, або 104, відповідно, формує антитіло, яке специфічно зв'язує ALK-1. 15. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує (1) варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, яке специфічно зв’язує ALK-1, де нуклеотидна по 5 94060 6 слідовність є SEQ ID NO: 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, або 89, де важкий ланцюг, який включає вказаний варіабельний домен важкого ланцюга, у поєднанні з легким ланцюгом, який включає варіабельний домен легкого ланцюга SEQ ID NO: 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, або 92, відповідно, формує антитіло, яке специфічно зв'язує ALK-1; або (2) варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, яке специфічно зв’язує ALK-1, де нуклеотидна послідовність є SEQ ID NO:11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87 або 91, де легкий ланцюг, який включає вказаний варіабельний домен легкого ланцюга, у поєднанні з важким ланцюгом, який включає варіабельний домен важкого ланцюга SEQ ID NO: 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, або 92, відповідно, формує антитіло, яке специфічно зв'язує ALK-1. 16. Гібридома, депонована під інвентарним номером ATCC PTA-6808, де гібридома продукує антитіло, яке специфічно зв’язується з ALK-1. 17. Антитіло анти-ALK-1, яке продукується гібридомою за п. 16, або антитіло, яке має такі ж самі амінокислотні послідовності, як вказане антитіло, що продукується, або його антигензв’язувальна ділянка. 18. Моноклональне антитіло або його антигензв’язувальна ділянка, що зв'язують ALK-1, де антитіло або ділянка містять VH, що кодується нуклеотидною послідовністю плазмідної вставки, присутньою в клоні E.coli, депонованому під інвентарним номером ATCC PTA-6864; і VL, що кодується нуклеотидною послідовністю плазмідної вставки, присутньою в клоні E.coli, депонованому під інвентарним номером ATCC PTA-6865. 19. Антитіло або антигензв’язувальна ділянка за п. 1, що містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга і амінокислотну послідовність легкого ланцюга, що вибрані з групи, яка складається з: a) амінокислотної послідовності важкого ланцюга SEQ ID NO: 2 і амінокислотної послідовності легкого ланцюга SEQ ID NO: 102; і b) амінокислотної послідовності важкого ланцюга SEQ ID NO: 100 і амінокислотної послідовності легкого ланцюга SEQ ID NO: 4. 20. Клітина-хазяїн, яка містить послідовності нуклеїнових кислот, що кодують важкий ланцюг або його антигензв'язувальну ділянку, і легкий ланцюг або його антигензв'язувальну ділянку, антитіла за будь-яким з пп. 1-13 і 17-19. 21. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло або антигензв’язувальну ділянку за будь-яким з пп. 1-13 і 17-19 і фізіологічно прийнятний носій. 22. Застосування антитіла або антигензв’язувальної ділянки за будь-яким з пп. 1-13 або 17-19 або фармацевтичної композиції за п. 21 для приготування лікарського засобу для інгібування ангіогенезу у тварин, що потребують цього. За даною заявкою запитується пріоритет відповідно до 35 U.S.С з 119(е) відносно попередньої заявки на патент США 60/715292, поданої 7 вересня 2005 року, зміст якої наведений в даному описі як посилання в повному обсязі. Галузь винаходу Даний винахід стосується моноклональних антитіл людини і їх антигензв'язувальних ділянок, які зв'язують позаклітинний домен (ECD) кінази-1, подібної до рецептора активіну (ALK-1). Винахід також стосується молекул нуклеїнової кислоти, що кодують такі антитіла і антигензв'язувальні ділянки, способів отримання анти-ALK-1 антитіл людини і антигензв'язувальних ділянок, композицій, що містять ці антитіла і антигензв'язувальні ділянки, а також способів застосування антитіл, антигензв'язувальних ділянок і композицій. Рівень техніки винаходу ALK-1 являє собою поверхневий клітинний рецептор типу І рецептора типу 1 трансформуючого фактора росту бета (TGF-бета-1). ALK-1 людини являє собою поліпептид з 503 амінокислот, який включає сигнальну послідовність (амінокислоти: 121), N-кінцевий позаклітинний зв'язувальний ліганд TGF-бета-1 домен або ECD (амінокислоти: 22118), одиничний трансмембранний домен (амінокислоти: 119-141), регуляторний домен, багатий гліцином/серином (GS) (амінокислоти: 142-202) і С-кінцевий домен серинової-треонінової кінази (202-492). Амінокислотна послідовність ALK-1 людини, описана Attisano et al. Cell, 1993, vol. 75, pp. 671-680 містить Ser в положенні 172 (запис в Genbank LI7075), тоді як в патенті США 6316217 заявлена амінокислотна послідовність ALK-1 людини з Thr в положенні 172 (запис в Genbank NM_000020). Ген ACVRL1, що кодує повкорозмірігу ALK-1 людини, описану Attisano et al., доступний на ринку від Invitrogen Inc., клон ID IOH21048. Незважаючи на те, що ALK-1 має загалом 60-80% гомологію з іншими рецепторами типу І (ALK-2 ALK-7), ECD у ALK-1 істотно відрізняється від ECD інших членів сімейства ALK. Наприклад, у людини тільки ECD ALK-2 є значною мірою спорідненими ECD ALK-1 (ідентичність становить приблизно 25% амінокислот). Патент США 6316217; ten Dijke et al. Oncogene, 1993, vol. 8, pp. 2879-2887; Attisano et al. Cell, 1993, vol. 75, pp. 671-680. Зазвичай ліганди суперсімейства TGF-бета виявляють свою біологічну активність за допомогою зв'язування з гетеромерними рецепторними комплексами двох типів (І і II) серинових/треонінових кіназ. Рецептори типу II є конститутивно активними кіназами, які при зв'язуванні ліганду фосфорилюють рецептор типу І. В свою чергу, активовані кінази типу І фосфорилюють сигнальні молекули наступного етапу сигнального шляху, включаючи різні Smad, які переміщаються в ядро і призводять до транскрипційної відповіді. 7 Heldin et al. Nature, 1997, vol. 390, pp. 465-471. В випадку ALK-1, автори винаходу показали, що Smad1 є специфічно фосфорильованою і переміщається в ядро, де безпосередньо регулює експресію сприйнятливих до Smad1 генів Id1 і EphB2. Висока міра експресії і селективність ALK-1 відмічена в ендотеліальних клітинах і інших високо васкуляризованих тканинах, таких як плацента або головний мозок. Автори винаходу продемонстрували за допомогою профілювання Affymetrix i ЗТПЛР в режимі реального часу, що експресія ALK-1 в ендотеліальних клітинах набагато перевершує експресію її со-рецепторів активіну типу II і ендогліну, її ліганду TGF-бета-1 або ALK-5. Мутації ALK1 пов'язані зі спадковою геморагічною телеангієктазією (ННТ), що свідчить про важливу роль ALK-1 для контролю розвитку або відновлення кровоносних судин. Abdalla et al. J. Med Genet, 2003, vol. 40, pp. 494-502; Sadick et al. Hematologica/The Hematology J., 2005, vol. 90, 818-828. Більш того в двох незалежних дослідженнях з нокаутом ALK-1 у мишей були отримані in vivo ключові свідчення ролі ALK-1 в процесі ангіогенезу. Oh et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, vol. 97, pp. 2626-2631; Umess et al. Nature Genetics, 2000, vol. 26, pp. 328-331. Ангіогенез являє собою фізіологічний процес, що полягає в утворенні нових кровоносних судин з попередньо існуючих судин і/або циркулюючих ендотеліальних стволових клітин. Це є нормальним процесом при рості і розвитку, а також при загоєнні ран. Однак це також є обов'язковою стадією при переході пухлин з латентного стану в злоякісний. Hanahan and Folkman, "Patterns and Emerging Mechanisms of the Angiogenic Switch During Tumorigenesis", Cell, 86(3):353-364, 1996; Carmeliet, "Angiogenesis in Health and Disease", Nature Medicine, 9(6):653-660, 2003; Bergers and Benjamin, "Tumoreigenesis and the Angiogenic Switch", Nature Reviews, 3:401-410, 2003. При таких хворобах, як рак, організм втрачає здатність підтримувати збалансований ангіогенез. Нові кровоносні судини живлять уражені тканини, руйнуючи нормальні тканини, і, при деяких ракових захворюваннях, нові судини можуть сприяти виходу пухлинних клітинв кровотік і осіданню їх в інших органах (пухлинні метастази). Інгібітори ангіогенезу, включаючи моноклональні антитіла (мАТ), є багатообіцяючим класом лікарських засобів, направлених проти такого патологічного процесу, для блокування або сповільнення росту пухлини. Крім ролі в розвитку солідних пухлин і метастазів, ангіогенна компонента присутня і при інших важливих станах, наприклад, артриті, псоріазі, неоваскулярній віковій дегенерації жовтої плями і діабетичній ретинопатії. Bonnet et al. "Osteoarthritis, Angiogenesis and Inflammation", Rheumatology, 2005, vol. 44, pp. 7-16; Creamer et al. "Angiogenesis in psoriasis", Angiogenesis, 2002, vol. 5, pp. 231-236; Clavel et al. "Recent data on the role for angiogenesis in rheumatoid arthritis", Joint Bone Spine, 2003, vol. 70, pp. 321-326; Anandarajah et al. "Pathogenesis of psoriatic arthritis", Curr. Opin. Rheumatol., 2004, vol. 16, pp. 338-343; Ng et al. "Targeting angiogenesis, the underlying disorder in neovascular age-related macular degeneration", Can. 94060 8 J. Ophthalmol, 2005, vol. 40, pp. 352-368; Witmer et al. "Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease", Progress in Retinal & Eye Research, 2003, vol. 22, pp. 1-29; Adamis et al. "Angiogenesis and ophthalmic disease", Angiogenesis, 1999, vol. 3, pp. 9-14. Вважають, що анти-ангіогенна терапія буде постійною. Тому, мішені з високо селективною ендотеліальною функцією, такі як ALK-1, є переважними лля зменшення виснаження, що виникає внаслідок побічних ефектів. Крім того, внаслідок істотної відмінності ECD ALK-1 від ECD інших членів сімейства ALK, чекають, що мАТ проти ECD ALK-1 людини, будуть вибірково націлені на ALK1. Виходячи з даних міркувань, моноклональне антитіло проти позаклітинного домену ALK-1, яке може інгібувати димеризацію з рецептором типу II і, в результаті, блокувати фосфорилування Smad1 і транскрипційна відповідь наступного етапу сигнального шляху є надто бажаним. R&D Systems, Inc. виробляє і продає моноклональне антитіло проти ALK-1 людини (кат. № МАВ370), що продукується гібридомою, отриманою від злиття мієломи миші з В-клітинами миші, імунізованої очищеним NSO-похідним рекомбінантним позаклітинним доменом ALK-1 людини. Автори винаходу показали, що це антитіло не нейтралізувало взаємодію між ALK-1 і TGF-бету-1 і не перешкоджає фосфорилуванню Smad1. Була отримана кроляча антисироватка проти синтетичного пептиду, відповідного частині внутрішньоклітинної навколомембранної ділянки ALK-1 (амінокислотні залишки 145-166), зв'язаної з гемоціаніном виноградного равлика (KLH) (патент США 6692925), а також проти цілого позаклітинного домену ALK-1 за винятком лідуючої послідовності (Lux et al., J. Biol. Chem., 1999, vol. 274, pp. 9984-9992). Abdalla et al (Human Mol. Gen., 2000, vol. 9, pp. 1227-1237) повідомляють про отримання поліклональних антитіл проти ALK-1 з використанням конструкції з рекомбінантним вірусом коров'ячої віспи. R&D Systems, Inc. виробляє і продає поліклональні анти-ALK-1 людини антитіла (кат. № AF370), що отримуються від кіз, імунізованих очищеним NSO-похідним рекомбінантним позаклітинним доменом ALK-1 людини. До цього часу не повідомлялося про повністю людські моноклональні антитіла проти ECD ALK-1, і ніхто не показав ефективність будь-якого моноклонального антитіла проти ECD ALK-1 при порушенні ALK-1/TGF-бета-1/Smad1 сигнального шляху. Суть винаходу Даний винахід стосується виділених нейтралізуючих анти-ALK-1 моноклональних антитіл або їх антигензв'язувальних ділянок, які зв'язують ALK-1 приматів, переважно, ECD ALK-1 приматів, більш переважно, ECD ALK-1 людини У переважному варіанті здійснення нейтралізуючі антитіла являють собою повністю людські моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні ділянки. В іншому аспекті даний винахід стосується анти-ALK-1 антитіла або його антигензв'язувальної ділянки, де антитіло або його антигензв'язувальна ділянка блокує ALK-1/TGF-бета-1/Smad1 сигналь 9 ний шлях. У переважному варіанті здійснення антитіла являють собою повністю людські моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні ділянки. В іншому аспекті даний винахід стосується анти-ALK-1 антитіла або його антигензв'язувальної ділянки, де антитіло або його антигензв'язувальна ділянка є антагоністом TGF-бета-1стимульованого ангіогенезу. У переважному варіанті здійснення антитіла являють собою повністю людські моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні ділянки. В іншому аспекті даний винахід стосується повністю анти-ALK-1 людини антитіла або його антигензв'язувальної ділянки, де антитіло або його антигензв'язувальна ділянка є антагоністом TGFбета-1 -стимульованого пухлинного ангіогенезу. В іншому аспекті даний винахід стосується ін'єктованого повністю людського анти-ALK-1 антитіла, що добре переноситься, або його антигензв'язувальної ділянки, де антитіло або його антигензв'язувальна ділянка є антагоністом TGF-бета1-стимульованого ангіогенезу. В іншому аспекті даний винахід стосується анти-ALK-1 антитіла або його антигензв'язувальної ділянки, де антитіло або його антигензв'язувальна ділянка інгібує підвищену регуляцію специфічного гена-мішені ALK-1 "наступного етапу сигнального шляху", Id1. У переважному варіанті здійснення антитіла являють собою повністю людські моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні ділянки. В іншому аспекті даний винахід стосується анти-ALK-1 моноклонального антитіла або його антигензв'язувальної ділянки, де антитіло або його антигензв'язувальна ділянка описують на підставі щонайменше однієї з декількох функціональних властивостей, як описано нижче. Наприклад, в одному з варіантів здійснення антитіло або його антигензв'язувальна ділянка зв'язує позаклітинний домен ALK-1 приматів з величиною авідності, що дорівнює 1 мкМ або менше, що визначено за допомогою поверхневого плазмонного резонансу. У додатковому варіанті здійснення антитіло або ділянка зв'язує позаклітинний домен ALK-1 приматів з величиною авідності меншою, ніж 100 нМ, меншою, ніж 5 нМ, меншою, ніж 1 нМ, меншою, ніж 500 пМ, меншою, ніж 100 пМ, меншою, ніж 50 пМ, меншою, ніж 20 пМ, меншою, ніж 10 пМ, або меншою, ніж 1 пМ, як визначали за допомогою поверхневого плазмонного резонансу. У певних варіантах здійснення величина авідності складає від 0,1 пМ до 1 мкМ. В інших варіантах здійснення величина авідності складає від 1 пМ до 100 нМ. В інших варіантах здійснення величина авідності складає від 1 пМ до 5 нМ. В інших варіантах здійснення величина авідності складає від 1 пМ до 500 пМ. В інших варіантах здійснення величина авідності складає від 1 пМ до 100 пМ. В інших варіантах здійснення величина авідності складає від 1 пМ до 10 пМ. В іншому варіанті здійснення антитіло або його антигензв'язувальна ділянка зв'язує позаклітинний домен ALK-1 людини з величиною авідності, що дорівнює 100 нМ або менше, що визначено за допомогою поверхневого плазмонного резонансу. 94060 10 У додатковому варіанті здійснення антитіло або ділянка зв'язує позаклітинний домен ALK-1 людини з величиною авідності меншою, ніж 10 нМ, меншою, ніж 5 нМ, меншою, ніж 1 нМ, меншою, ніж 500 пМ, меншою, ніж 100 пМ, меншою, ніж 50 пМ, меншою, ніж 20 пМ, меншою, ніж 10 пМ або меншою, ніж 1 пМ, як визначали за допомогою поверхневого плазмонного резонансу. У певних варіантах здійснення величина авідності складає від 1 пМ до 100 нМ. В інших варіантах здійснення величина авідності складає від 1 пМ до 5 нМ. В інших варіантах здійснення величина авідності складає від 1 пМ до 500 пМ. В інших варіантах здійснення величина авідності складає від 1 пМ до 100 пМ. В інших варіантах здійснення величина авідності складає від 1 пМ до 10 пМ. В іншому варіанті здійснення антитіло або його ділянка має ступінь дисоціації (kOff) для ALK-1 людини, що дорівнює 5x10-3 с-1 або менший, як визначено за допомогою поверхневого плазмонного резонансу. Наприклад, в певних варіантах здійснення антитіло або ділянка має kOff для ALK-1 людини менший, ніж 10-3 с-1, менший, ніж 5х10-4 с-1, менший, ніж 10-4 с-1, менший, ніж 5x10-5 с-1, менший, ніжі 10-5 с-1, менший, ніж 5x10-6 с-1. В інших варіантах здійснення kOff складає від 10-6 с-1 до 10-4 с-1. В інших варіантах здійснення kOff складає від 10-6с4 до 5x10-5 с-1. В іншому варіанті здійснення антитіло або його ділянка зв'язує ALK-1 приматів з KD рівною 1000 нМ або меншою. У додатковому варіанті здійснення антитіло або ділянка зв'язує ALK-1 людини з KD меншою, ніж 500 нМ, меншою, ніж 100 нМ, меншою, ніж 50 нМ, меншою, ніж 20 нМ, меншою, ніж 10 нМ або меншою, ніж 1 нМ, як визначали за допомогою поверхневого плазмонного резонансу. У певних варіантах здійснення KD складає від 1 мкМ до 100 нМ. В інших варіантах здійснення KD складає від 100 нМ до 10 нМ. В інших варіантах здійснення KD складає від 50 нМ до 0,1 нМ. Подібні значення KD можна вимірювати за допомогою будь-якого методу, відомого фахівцям в даній галузі, такого як варіанти ELISA, варіанти RIA, проточна цитометрія або поверхневий плазмонний резонанс, такий як BIACORE. В іншому варіанті здійснення антитіло або його ділянка має більшу афінність зв'язування для ALK-1 приматів (KD(Р)), ніж для ALK-1 гризунів (KD(R)). В одному з варіантів здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні ділянки за даним винаходом мають KD(R)/KD(P), більший, або рівний 1,5. У додатковому варіанті здійснення антитіла або їх антигензв'язувальні ділянки за даним винаходом мають KD(R)/KD(P), більший або рівний 2, більший або рівний 3, більший або рівний 5, більший або рівний 10, більший або рівний 20, більший або рівний 50, більший або рівний 100, більший або рівний 200, більший або рівний 500 або більший або рівний 1000. Подібні значення KD як для ALK-1 приматів, так і для ALK-1 гризунів можна вимірювати за допомогою будь-якого методу, відомого фахівцям в даній галузі, такого як проточна цитометрія, ELISA, RIA, або поверхневий плазмонний резонанс, такий як BIACORE. 11 В іншому варіанті здійснення анти-ALK-1 антитіло або його ділянка має ІС50 рівну 500 нМ або меншу, що визначено за їх здатністю інгібувати підвищену регуляцію специфічного гена-мішені ALK-1 "наступного етапу сигнального шляху", Id1. У додатковому варіанті здійснення вказана ІС50 складає менше 300 нМ, менше 200 нМ, менше 150 нМ, менше 100 нМ, менше 50 нМ, менше 20 нМ, менше 10 нМ або менше 1 нМ. У певних варіантах здійснення ІС50 складає від 1 нМ до 500 нМ. В інших варіантах здійснення IС50 складає від 5 нМ до 250 нМ. В інших варіантах здійснення IC50 складає від 10 нМ до 100 нМ. В іншому варіанті здійснення анти-ALK-1 антитіло або його ділянка має ІС50 рівну 250 нМ або меншу, що визначено за їх здатністю інгібувати фосфорилування Smad1, визначеною за допомогою вестерн-блотингу з використанням інфрачервоної системи зображення Odyssey. У додатковому варіанті здійснення вказана ІС50 складає менше 200 нМ, менше 150 нМ, менше 100 нМ, менше 50нМ, менше 20 нМ, менше 10 нМ або менше 1 нМ. У певних варіантах здійснення ІС50 складає від 1 нМ до 250 нМ. В інших варіантах здійснення ІС50 складає від 5 нМ до 200 нМ. В інших варіантах здійснення ІС50 складає від 10 нМ до 100 нМ. В іншому варіанті здійснення анти-ALK-1 антитіло або його ділянка інгібує ангіогенез судин людини у мишей SCID з прищепленою тканиною крайньої плоті людини, в яку внутрішньошкірно імплантували пухлинні клітини меланоми M24met людини, як визначали ІГХ (ІНС) аналізом тесту на людський CD-31 сигнал щонайменше на 40%, в порівнянні з контрольним зразком. У додатковому варіанті здійснення анти-ALK-1 антитіло або його ділянка інгібує ангіогенез судин людини у мишей SCID з прищепленою тканиною крайньої плоті людини, в яку внутрішньошкірно імплантували пухлинні клітини меланоми M24met людини щонайменше на 30% щонайменше на 40% щонайменше на 50% або щонайменше на 60%, в порівнянні з контрольним зразком. В іншому варіанті здійснення анти-ALK-1 антитіло або його ділянка має ЕС50 рівну 500 нМ або менше, що визначено за їх здатністю інгібувати ангіогенез людських судин у мишей SCID з прищепленою тканиною крайньої плоті людини, в яку внутрішньошкірно імплантували пухлинні клітини меланоми M24met людини. У додатковому варіанті здійснення вказана ЕС50 складає менше 400 нМ, менше 300 нМ, менше 200 нМ, менше 150 нМ, менше 100 нМ, менше 50 нМ, менше 25 нМ або менше 5 нМ. У певних варіантах здійснення ЕС50 складає від 5 нМ до 500 нМ. В інших варіантах здійснення ЕС50 складає від 25 нМ до 300 нМ. В інших варіантах здійснення ЕС50 складає від 50 нМ до 150 нМ. В іншому варіанті здійснення анти-ALK-1 антитіло або його ділянка інгібує ангіогенез судин людини у мишей SCID з прищепленою тканиною крайньої плоті людини, в яку внутрішньошкірно імплантували суміш колагену плюс макроваскулярні ендотеліальні клітини людини, що визначено ІГХ аналізом тесту на CD-31 сигнал людини щонайменше на 25%, в порівнянні з контрольним 94060 12 зразком. У додатковому варіанті здійснення антиALK-1 антитіло або його ділянка інгібує ангіогенез судин людини у мишей SCID з прищепленою тканиною крайньої плоті людини, в яку внутрішньошкірно імплантували колаген щонайменше на 50%, в порівнянні з контрольним зразком. У додатковому варіанті здійснення анти-ALK-1 антитіло або його ділянка інгібує, щонайменше на 75%, щонайменше на 80%, щонайменше на 85%, щонайменше на 90% або, щонайменше на 95%, в порівнянні з контролем. В іншому варіанті здійснення анти-ALK-1 антитіло або його ділянка конкурує за зв'язування з ALK-1 з антитілом, вибраним з групи, яка складається з 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1 (M29I/D19A); 1.12.1(М29І); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; і 5.59.1. В іншому варіанті здійснення анти-ALK-1 антитіло або його ділянка перехресно конкурує за зв'язування ALK-1 з антитілом, вибраним з групи, яка складається з 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 і 5.59.1. В іншому варіанті здійснення анти-ALK-1 антитіло або його ділянка зв'язує той же епітоп ALK-1, що і антитіло, вибране з групи, яка складається з 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 і 5.59.1. В іншому варіанті здійснення анти-ALK-1 антитіло або його ділянка зв'язує ALK-1 з такою ж, по суті, KD, що і антитіло, вибране з групи, яка складається з 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 і 5.59.1. В іншому варіанті здійснення анти-ALK-1 антитіло або його ділянка зв'язує ALK-1 з такою ж, по суті, kOff, що і антитіло, вибране з групи, яка складається з 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 і 5.59.1. Додатковий аспект даного винаходу стосується антитіла або його антигензв'язувальної ділянки з щонайменше однією з функціональних властивостей, описаних раніше, і такого, що містить VH домен, який щонайменше на 90% ідентичний по амінокислотній послідовності будь-якій з SEQ ID NO: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 або 104. В одному варіанті здійснення вказаний VH домен є щонайменше на 91%, щонайменше на 93%, щонаймен 13 ше на 95%, щонайменше на 97%, щонайменше на 99% або на 100% ідентичним по амінокислотній послідовності будь-якій з SEQ ID NO: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 або 104. У додатковому варіанті здійснення антитіло або його ділянка має щонайменше одну з функціональних властивостей, описаних раніше, і містить VH домен, який являє собою будь-яку з SEQ ID NO: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 або 104, або відрізняється від будь-якої з SEQ ID NO: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 або 104 тим, що має щонайменше одну консервативну амінокислотну заміну. Наприклад, VH домен може відрізнятися 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 консервативними амінокислотними замінами від будь-якої SEQ ID NO: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 або 104. У додатковому варіанті здійснення будь-яка з цих консервативних амінокислотних замін може мати місце в CDR1, CDR2, і/або CDR3 ділянках. Додатковий аспект даного винаходу стосується антитіла або його антигензв'язувальної ділянки з щонайменше однією з функціональних властивостей, описаних раніше, і такого, що містить VL домен, який є щонайменше на 90% ідентичним по амінокислотній послідовності будь-якій з SEQ ID NO: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 або 127. В одному варіанті здійснення вказаний VL домен щонайменше на 91%, щонайменше на 93%, щонайменше на 95%, щонайменше на 97%, щонайменше на 99% або на 100% ідентичний по амінокислотній послідовності будь-якій з SEQ ID NO: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 або 127. У додатковому варіанті здійснення антитіло або його ділянка має щонайменше одну з функціональних властивостей, описаних раніше, і містить VL домен, який являє собою будь-яку з SEQ ID NO: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 або 127, або відрізняється від будь-якої з SEQ ID NO: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 або 127 тим, що має щонайменше одну консервативну амінокислотну заміну. Наприклад, VL домен може відрізнятися 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 консервативними амінокислотними замінами від будь-якої з SEQ ID NO: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 або 127. У додатковому варіанті здійснення будь-яка з цих консервативних амінокислотних замін може мати місце в CDR1, CDR2, і/або CDR3 ділянках. Інший аспект даного винаходу стосується антитіла або його антигензв'язувальної ділянки з щонайменше однією з функціональних властивостей, описаних раніше, де кожний з VL і VH доменів щонайменше на 90% ідентичний по амінокислотній послідовності VL і VH доменам, відповідно, будьякого з моноклональних антитіл 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 94060 14 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 і 5.59.1. Наприклад, кожний з VL і VH доменів щонайменше на 91%, 93%, 95%, 97%, 99% або 100% ідентичний за амінокислотними послідовностями VL і VH доменам, відповідно, будь-якого з моноклональних антитіл 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(М29І); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 і 5.59.1. Інший аспект даного винаходу стосується моноклонального антитіла або його антигензв'язувальної ділянки, які вибрані з групи, яка складається з: а) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 6, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 8; b) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 10, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 12; с) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 14, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 16; d) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 18, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 20; e) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 22, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 24; f) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 26, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 28; g) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 30, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 32; h) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 34, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 36; і) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 38, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 40; j) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 42, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 44; k) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 46, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 48; l) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 50, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 52; m) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 54, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 56; n) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 58, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 60; о) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 62, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 64; p) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 66, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 68; q) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 70, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 72; r) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 74, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 76; s) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 78, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 80; t) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 82, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 84; u) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 86, і VL домен, як вказано в 15 SEQ ID NO: 88; ν) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 90, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 92; w) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 104, і Vl домен, як вказано в SEQ ID NO: 127; x) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 6, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 127; і у) антитіла або його ділянки, яка містить VH домен, як вказано в SEQ ID NO: 104, і VL домен, як вказано в SEQ ID NO: 8. У додатковому варіанті здійснення для будьякого з антитіл або їх ділянок, як описано вище в групах від а) до v), VH і/або VL домени можуть відрізнятися від певних перерахованих SEQ ID NO з щонайменше однією консервативною амінокислотною заміною. Наприклад, VH і/або VL домени можуть відрізнятися від перерахованих SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 консервативними амінокислотними замінами. У додатковому варіанті здійснення будь-хто з даних консервативних амінокислотних замін може мати місце в CDR1, CDR2, і/або СDR3 ділянках. В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується моноклонального антитіла або його антигензв'язувальної ділянки з щонайменше однією з функціональних властивостей, описаних раніше, де VH домен незалежно вибирають з будьякої SEQ ID NO: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 або 104, або послідовності, яка відрізняється від будь-якої SEQ ID NO: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 або 104 щонайменше однією консервативною амінокислотною заміною, і VL домен незалежно вибирають з будь-якої SEQ ID NO: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 або 127, або послідовності, яка відрізняється від будь-якої SEQ ID NO: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 або 127 щонайменше однією консервативною амінокислотною заміною. Наприклад, VH і VL домени можуть кожний відрізнятися від SEQ ID NO: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 або 104, а також 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 або 127, відповідно, і, 2, З, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 консервативними амінокислотними замінами. У додатковому варіанті здійснення даний винахід стосується моноклонального антитіла або його антигензв'язувальної ділянки з щонайменше однією з функціональних властивостей, описаних раніше, де вказане антитіло або ділянка містить CDR1, CDR2 і CDR3 послідовності VH, незалежно вибрані з CDR1, CDR2, або СDR3 послідовностей важкого ланцюга, відповідно, виявлених в будьякій з SEQ ID NO: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 або 104, або послідовності, яка відрізняється від будьякої з SEQ ID NO: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 або 104 щонайменше однією консервативною амінокислотною заміною. Наприклад, VH CDR1, CDR2 і CDR3 можуть відрізнятися від CDR1, CDR2 і CDR3, відповідно, будь-яка з SEQ ID NO: 6; 10; 14; 94060 16 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 або 104 по 1, 2, З, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 консервативним амінокислотним замінам. У додатковому варіанті здійснення даний винахід стосується моноклонального антитіла або його антигензв'язувальної ділянки з щонайменше однією з функціональних властивостей, описаних раніше, де вказане антитіло або ділянка містить CDR1, CDR2 і CDR3 послідовності VL, незалежно вибрані з CDR1, CDR2, або CDR3 послідовностей легкого ланцюга, відповідно, виявлених в будь-якій з SEQ ID NO: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 або 127, або послідовності, яка відрізняється від будь-якої з SEQ ID NO: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 або 127 щонайменше однією консервативною амінокислотною заміною. Наприклад, VL CDR1, CDR2 і CDR3 можуть відрізнятися від CDR1, CDR2 і CDR3, відповідно, будь-яка з SEQ ID NO: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 або 127 по 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 консервативним амінокислотним замінам. Даний винахід також стосується моноклонального антитіла або його антигензв'язувальної ділянки з щонайменше однією з функціональних властивостей, описаних раніше, де вказане антитіло або антигензв'язувальна ділянка містить VH і VL CDR1, VH і VL CDR2, а також VH і VL CDR3 як виявлено в будь-якому з моноклональних антитіл 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 і 5.59.1. Даний винахід додатково стосується моноклонального антитіла або його антигензв'язувальної ділянки з щонайменше однією з функціональних властивостей, описаних раніше, де вказане антитіло або антигензв'язувальна ділянка містить важкий ланцюг, який кодується VH 4-31, VH 3-11, VH 315, VH 3-33, VH 4-61 або VH 4-59 геном людини. У деяких варіантах здійснення важкий ланцюг кодується VH 3-33 геном людини, D 6-19 геном людини і JH 3B геном людини; VH 4-31 геном людини, D 619 геном людини і JH 4В геном людини; VH 4-61 геном людини, D 6-19 геном людини і JH 4B геном людини; VH 4-31 геном людини, D 3-3 геном людини і JH 3B геном людини; VH 4-31 геном людини і JH 3B геном людини; VH 4-59 геном людини, D 6-19 геном людини і JH 4B геном людини; VH 3-11 геном людини, D 3-22 геном людини і JH 6В геном людини; VH 3-15 геном людини, D 3-22 геном людини і JH 4B геном людини; VH 4-31 геном людини, D 5-12 геном людини і JH 6B геном людини; VH 4-31 геном людини, D 4-23 геном людини і JH 4B геном людини; VH 4-31 геном людини, D 2-2 геном людини і JH 5B геном людини; VH 4-31 геном людини і JH 6B геном людини; VH 3-15 геном людини, D 1-1 геном людини і JH 4B геном людини; VH 3-11 геном людини, D 6-19 геном людини і JH 6B геном людини; VH 3-11 геном людини, D 3-10 геном людини і JH 17 6B геном людини або VH 3-11 геном людини, D 6-6 геном людини і JH 6B геном людини. Даний винахід додатково стосується моноклонального антитіла або його антигензв'язувальної ділянки з щонайменше однією з функціональних властивостей, описаних раніше, де вказане антитіло або антигензв'язувальна ділянка містить легкий ланцюг, який кодується V A27, V A2, V A1, V A3, V B3, V B2, V L1 або V L2 геном людини. У деяких варіантах здійснення легкий ланцюг кодується V L1 геном людини і J 4 геном людини; V A27 геном людини і JK 5 геном людини або J 4 геном людини; V В3 геном людини і JK геном людини; V L2 геном людини і JK геном людини; V A2 геном людини і J 1 геном людини; V A3 геном людини і J 4 геном людини; V А1 геном людини і J 1 геном людини; V B2 геном людини і J 4 геном людини або V A2 геном людини і J1 геном людини. Даний винахід додатково стосується моноклонального антитіла або його антигензв'язувальної ділянки з щонайменше однією з функціональних властивостей, описаних раніше, де вказане антитіло або антигензв'язувальна ділянка містить одну або більше FR1, FR2, FR3 або FR4 амінокислотних послідовностей важкого ланцюга і/або легкого ланцюга, як виявлено в будь-якому з моноклональних антитіл 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(М29І); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 і 5.59.1. Даний винахід також стосується моноклонального антитіла, що містить амінокислотні послідовності, наведені в: a) SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 4; b) SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 102; с) SEQ ID NO: 100 і SEQ ID NO: 4; а також d) SEQ ID NO: 100 і SEQ ID NO: 102. Додатковий варіант здійснення даного винаходу стосується будь-якого з антитіл, описаних раніше, яке являє собою молекулу IgG, IgM, IgE, IgA або IgD, або є його похідним. Наприклад, антитіло може являти собою lgG1 або IgG2. Інший варіант здійснення стосується будьякого з антитіл або антигензв'язувальних ділянок, описаних вище, яке являє собою Fab фрагмент, F(ab')2 фрагмент, Fv фрагмент, одноланцюжковий Fv фрагмент, одноланцюжковий VH фрагмент, одноланцюжковий VL фрагмент, гуманізоване антитіло, химерне антитіло або біспецифічне антитіло. Додатковий варіант здійснення стосується похідного антитіла або антигензв'язувальної ділянки, що містить будь-яке з антитіл або їх ділянок, як описано раніше, і щонайменше один додатковий молекулярний фрагмент. Наприклад, щонайменше один додатковий молекулярний фрагмент може являти собою інше антитіло (наприклад, біспецифічне антитіло або димер), засіб детекції, мітку, цитотоксичний засіб, фармацевтичний засіб і/або білок або пептид, який може опосередковувати зв'язування антитіла або фрагмента антитіла з іншою молекулою (такою як активна зона стрептавідину або полігістидиновий маркер). Наприклад, 94060 18 засоби детекції, які можна використовувати і з якими можна отримувати похідне антитіло або антигензв'язувальну ділянка за винаходом, включають флуоресцентні сполуки, в тому числі флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, 5диметиламін-1-нафталінсульфонілхлорид, фікоеритрин, лантанідні люмінофори і тому подібне. Антитіло також можна мітити ферментами, які застосовують для детекції, такими як пероксидаза хріну, -галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза, глюкозоксидаза, і тому подібне. У додатковому варіанті здійснення антитіла або їх ділянки за даним винаходом можна також мітити біотином або заздалегідь визначеним поліпептидним епітопом, що впізнається вторинним репортером (наприклад, парами послідовностей з лейциновими застібками, ділянками зв'язування для вторинних антитіл, метал-зв'язувальними доменами, епітопними маркерами). У ще додатковому варіанті здійснення даного винаходу з будь-яких антитіл або їх ділянок можна також отримувати похідні за допомогою хімічної групи, такій як поліетиленгліколь (PEG), метилова або етилова група, або вуглеводнева група. У деяких варіантах здійснення анти-ALK-1 антитіла або антигензв'язувальні ділянки, описані в даному описі, зв'язані з твердою підкладкою. У деяких варіантах здійснення С-кінцевий лізин важкого ланцюга будь-якого з анти-ALK-1 антитіл за винаходом є відщепленим. У різних варіантах здійснення винаходу важкий і легкий ланцюги анти-ALK-1 антитіл можуть необов'язково містити сигнальну послідовність. Даний винахід також стосується фармацевтичної композиції, що містить будь-яке з антитіл або їх антигензв'язувальних ділянок, як описано вище, і фармацевтично прийнятний носій. В іншому варіанті здійснення винахід стосується виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує будьяке з антитіл або їх антигензв'язувальних ділянок, як описано в даному описі. В одному з конкретних варіантів здійснення виділена молекула нуклеїнової кислоти має нуклеотидну послідовність, SEQ ID NO: 1, де послідовність кодує важкий ланцюг. В іншому конкретному варіанті здійснення виділена молекула нуклеїнової кисілоти має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO: 3, де послідовність кодує легкий ланцюг. В іншому конкретному варіанті здійснення виділена молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид, що містить відкриту рамку зчитування послідовності кДНК клону, депонованого під інвентарним номером АТСС РТА-6864. В іншому конкретному варіанті здійснення виділена молекула нуклеїнової кислоти містить полінуклеотид, що містить відкриту рамку зчитування послідовності кДНК клону, депонованого під інвентарним номером АТСС РТА-6865. В іншому конкретному варіанті здійснення виділена молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO: 95 або 128, де кожна з послідовностей кодує важкий ланцюг. В іншому конкретному варіанті здійснення виділена молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну 19 послідовність SEQ ID NO: 101, де послідовність кодує легкий ланцюг. Винахід додатково стосується вектора, що містить будь-яку з молекул нуклеїнової кислоти, описаних в даному описі, де вектор необов'язково містить послідовність, яка контролює експресію, функціонально зв'язану з молекулою нуклеїнової кислоти. Інший варіант здійснення стосується клітинихазяїна, що містить будь-який з векторів, описаних в даному описі, або що містять будь-яку з молекул нуклеїнової кислоти, описаних в даному описі. Даний винахід також стосується виділеної клітинної лінії, яка продукує будь-яке з антитіл або антигензв'язувальних ділянок, як описано в даному описі, або яка продукує важкий або легкий ланцюг будьякого з вказаних антитіл або вказаних антигензв'язувальних ділянок. В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способу отримання анти-ALK-1 антитіла або його антигензв'язувальної ділянки, що включає культивування будь-якої з клітингосподарів або клітинних ліній, описаних в даному описі, у відповідних умовах і витягання вказаного антитіла або антигензв'язувальної ділянки. Даний винахід також стосується трансгенної тварини, що не є людиною, або трансгенної рослини, що містить будь-яку з нуклеїнових кислот, описаних в даному описі, де трансгенна тварина, що не є людиною людиною, або трансгенна рослина експресує вказану нуклеїнову кислоту. Даний винахід також стосується способу виділення антитіла або його антигензв'язувальної ділянки, які зв'язують ALK-1, що включає етап виділення антитіла з трансгенної тварини, що не є людиною, або трансгенної рослини, як описано в даному описі. В іншому варіанті здійснення винахід стосується гібридоми, депонованої під інвентарним номером АТСС РТА-6808. Даний винахід також стосується способу визначення того, чи інгібує речовина підвищену регуляцію специфічного гена-мішені ALK-1 "наступного етапу сигнального шляху", Id1, де спосіб включає приведення першого зразка клітин, які експресують Id1, в контакт з речовиною і визначення того, чи інгібується експресія Id1, де знижений рівень експресії Id1 в першому зразку клітин, приведених в контакт з речовиною, в порівнянні з контрольним зразком клітин, свідчить про те, що вказана речовина інгібує експресію Id1. Даний винахід також стосується способу, де речовина являє собою антитіло, яке зв'язує позаклітинний домен ALK- 1. Даний винахід також стосується способу лікування патологічного клітинного росту у ссавця, що включає етап введення вказаному ссавцю будьякого з антитіл або їх антигензв'язувальних ділянок, або будь-якої з фармацевтичних композицій, як описано в даному описі. Даний винахід також стосується способу лікування патологічного клітинного росту у ссавця, за допомогою антитіла або його антигензв'язу вальної ділянки, які зв'язують ALK-1, що включає етапи введення вказаному ссавцеві ефективної кількості будь-якої з молекул 94060 20 нуклеїнової кислоти, описаних в даному описі, у відповідних умовах, які допускають експресію вказаних молекул нуклеїнової кислоти. В іншому варіанті здійснення спосіб лікування патологічного клітинного росту також включає введення кількості однієї або більше речовин, вибраних з протипухлинних засобів, і анти-ангіогенних засобів, інгібіторів передачі сигналу і антипроліферативних засобів, які кількості спільно є ефективними в лікуванні вказаного патологічного клітинного росту. У конкретних варіантах здійснення вказаний патологічний клітинний ріст є раком. Даний винахід також стосується виділеного білка ALK-1 яванського макака, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 93. Даний винахід також стосується виділеної молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 93. Даний винахід також стосується виділеної молекули нуклеїнової кислоти SEQ ID NO: 94. Короткий опис малюнків На Фіг. 1 представлений приклад даних епітопного зв'язування. Антитіло 1.12.1(M29I/D19A) вводили протягом 10 хвилин, а потім протягом ще 10 хвилин вводили антитіло 1.12.1(M29I/D19A). Це визначає максимальну відповідь 20-хвилинного введення даного антитіла. Максимальну відповідь 20-хвилинного введення аналогічним чином визначали для антитіла 1.27.1. Антитіло 1.12.1(M29I/D19A) вводили протягом 10 хвилин, а потім протягом 10 хвилин вводили антитіло 1.27.1. Якщо загальна відповідь знижується між певними максимальними відповідями, значить, два антитіла повинні зв'язувати один і той же епітоп. Якщо загальна відповідь перевищує найбільшу максимальну відповідь, значить, антитіла повинні зв'язувати різні епітопи. Експеримент повторювали, змінюючи порядок введення на зворотний, як описано в прикладі 9. На Фіг. 2 представлений порівняльний аналіз послідовностей білків ALK-1 людини і Суnо. На Фіг. 3 представлене визначення KD зв'язування рекомбінантного антитіла 1.12.1 з ALK-1 клітинної поверхні, (а) людини, (b) Cuno. 1.12.1(rWT) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ. 1.12.1(M29I/D19A) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ, що містить дві специфічні амінокислотні мутації (метіонін в положенні 29 у важкому ланцюгу замінений на ізолейцин і аспарагінова кислота в положенні 19 в легкому ланцюгу замінена на аланін). 1.12.1(М29І) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ, що містить специфічну одиничну амінокислотну мутацію, де метіонін в положенні 29 у важкому ланцюгу замінений на ізолейцин. 1.12.1(D19A) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ, що містить специфічну одиничну амінокислотну мутацію, де аспарагінова кислота в положенні 19 в легкому ланцюгу замінена на аланін. На Фіг. 4 представлені приклади титрований ID1 з використанням Taqman аналізу ID1 для варіантів антитіла 1.12.1. 21 1.12.1 означає варіант мАТ 1.12.1, виділений з гібридоми. 1.12.1(rWT) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ. 1.12.1(M29I/D19A) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ, що містить дві специфічні амінокислотні мутації (метіонін в положенні 29 у важкому ланцюгу замінений на ізолейцин і аспарагінова кислота в положенні 19 в легкому ланцюгу замінена на аланін). 1.12.1(М29І) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ, що містить специфічну одиничну амінокислотну мутацію, де метіонін в положенні 29 у важкому ланцюгу замінений на ізолейцин. 1.12.1 (D19A) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ, що містить специфічну одиничну амінокислотну мутацію, де аспарагінова кислота в положенні 19 в легкому ланцюгу замінена на аланін. На Фіг. 5 представлені приклади титрований ID1 з використанням Taqman аналізу ID1 для варіантів послідовності антитіла 1.12.1 і похідного Fab. 1.12.1 означає варіант мАТ 1.12.1, виділений з гібридоми. 1.12.1(rWT) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ. 1.12.1(М29І) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ, що містить специфічну одиничну амінокислотну мутацію, де метіонін в положенні 29 у важкому ланцюгу замінений на ізолейцин. 1.12.1(D19A) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ, що містить специфічну одиничну амінокислотну мутацію, де аспарагінова кислота в положенні 19 в легкому ланцюгу замінена на аланін. 1.12.1(M29I/D19A) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ, що містить дві специфічні амінокислотні мутації (метіонін в положенні 29 у важкому ланцюгу замінений на ізолейцин і аспарагінова кислота в положенні 19 в легкому ланцюгу замінена на аланін). Fab 1.12.1(M29I/D19A) означає Fab-фрагмент мАТ 1.12.1(М29I/D19А), отриманий розщепленням 1.12.1(M29I/D19A) lgG1 з допомогою папаїну. На Фіг. 6 представлена інтерналізація ALK-1, (а) контрольне нейтралізуюче антитіло, що залишається на поверхні клітини, (b) контрольний поверхневий рецептор ALK-1, що залишається. На Фіг. 7А представлений порівняльний аналіз послідовностей варіабельного домену анти-ALK-1 антитіл за винаходом з гаметичними послідовностями. Мутації відносно гаметичної послідовності показані жирним шрифтом. CDR послідовності підкреслені. На Фіг. 7В представлений порівняльний аналіз передбачених амінокислотних послідовностей варіабельних доменів легкого ланцюга для анти-ALK-1 антитіл 1.12.1, 1.14.1, 1.162.1, 1.31.1, 4.62.1 і 4.72.1 з гаметичною послідовністю А27 V людини. На Фігурах 7С і 7D представлений порівняльний аналіз передбачених амінокислотних послідовностей варіабельних доменів важкого і легкого ланцюга анти-ALK-1 антитіл 1.12.1, 1.151.1, 1,162.1, 1.8.1, 4.24.1, 4.38.1, 4.58.1, 4.62.1, 94060 22 4.68.1, 4.72.1, 5.13.1 і 5.34.1 з гаметичною послідовністю 4-31 VH людини. На Фіг. 8 представлений зразок гістологічного аналізу (фарбування Η & Ε) зрізу прищепленої шкіри людини після хірургічної операції. На Фіг. 9(А) представлене трифарбове фарбування колагену в миші-химері з прищепленою шкірою людини. На Фіг. 9(В) представлено виявлення людських судин в колагеновому гелі, імплантованому в мишу-химеру з прищепленою шкірою крайньої плоті людини. Тех-червоний: судини людини. FITC: судини миші. Жовтий: спільне фарбування. На Фіг. 10 представлене імунофлуоресцентне зображення людських (червоний) і мишачих (зелений) судин пухлини M24met в миші-химері SCID з прищепленою шкірою крайньої плоті людини. На Фіг. 11 представлене ІГХ зображення людських судин (коричневий) пухлини M24met в мишіхимері SCID з прищепленою шкірою крайньої плоті людини. На Фіг. 12 представлені характерні імунофлуоресцентні зображення людських (червоний) і мишачих (зелений) судин контрольної і обробленої антитілом 1.12.1(M29I/D19A) (10 мг/кг) пухлин M24met в миші-химері SCID з прищепленою шкірою крайньої плоті людини. На Фіг. 13 представлене дозо-залежне інгібування росту судин людської пухлини антитілом 1.12.1 (M29I/D19A) на моделі миші-химери SCID з прищепленою шкірою крайньої плоті людини. На Фіг. 14 представлена концентрація антитіла 1.12.1 (M29I/D19A) в плазмі миші SCID. На Фіг. 15 представлена розрахункова ЕС50 для антитіла 1.12.1(M29I/D19A) на моделі SCIDхимери з прищепленою шкірою крайньої плоті людини і пухлиною M24met. Для побудови графіка контрольному значенню 100% була штучно задана сироваткова концентрація рівна 0,1 нМ. Це не змінювало уявну EC50. Докладний опис винаходу Визначення і основні методи Якщо не вказано іншого, значення наукових і технічних термінів, що застосовуються в даному описі, такі, які зазвичай розуміють фахівці в даній галузі. Крім того, якщо за контекстом не потрібно іншого, терміни в однині будуть включати множину, а терміни у множині будуть включати однину. В основному, номенклатура, що використовується застосовно до, і методи, що відносяться до культури клітин і тканин, молекулярної біології, імунології, мікробіології, генетики, а також хімії білків і нуклеїнових кислот і гібридизації, описаних в даному описі, :є добре відомими і використовуються в даних галузях. Способи і методи за даним винаходом, по суті, здійснюють відповідно до загальноприйнятих способів, добре відомих в даній галузі, і як описано в різних літературних джерелах загального і більш спеціального призначення, які цитуються і обговорюються в даному описі, якщо не вказано інше. Дивись, наприклад, Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular 23 Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, і Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003), наведені в даному описі як посилання. Ферментативні реакції і методи очищення застосовують відповідно до інструкцій виробників, як зазвичай прийнято в даній галузі або як описано в даному описі. Номенклатура, що використовується застосовно до, а також лабораторні способи і методи, що відносяться до аналітичної хімії, хімії органічного синтезу, а також медичної і фармацевтичної хімії, описані в даному описі, є добре відомими і використовуються в даних галузях. Наступні терміни, якщо не вказано інакше, треба розуміти в наступних значеннях: Як використовують в даному описі, термін "ALK-1" означає кіназу-1, подібну до рецептора активіну ссавців. Розуміють, що термін ALK-1 відноситься також до рекомбінантної ALK-1 і рекомбінантним химерним формам ALK-1, які можна отримувати стандартними способами рекомбінантної експресії. Як використовують в даному описі, абревіатура "мАТ" означає моноклональне антитіло. Як використовують в даному описі, антитіло, позначене номером, являє собою моноклональне антитіло (мАТ), яке отримали з гібридоми під тим же номером. Наприклад, моноклональне антитіло 1.12.1 отримували з гібридоми 1.12.1. 1.12.1 означає варіант мАТ 1.12.1, який продукує гібридома. 1.12.1(rWT) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ. 1.12.1(M29I/D19A) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ, що містить дві специфічні амінокислотні мутації (метіонін в положенні 29 у важкому ланцюгу замінений на ізолейцин і аспарагінова кислота в положенні 19 в легкому ланцюгу замінена на аланін). 1.12.1(М29І) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ, що містить специфічну одиничну амінокислотну мутацію, де метіонін в положенні 29 у важкому ланцюгу замінений на ізолейцин. 1.12.1(D19A) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ, що містить специфічну одиничну амінокислотну мутацію, де аспарагінова кислота в положенні 19 в легкому ланцюгу замінена на аланін. Як використовують в даному описі, "патологічний клітинний ріст", якщо не вказано інше, означає клітинний ріст, який не залежить від нормальних регуляторних механізмів (наприклад, втрачене контактне інгібування). Як використовують в даному описі, терміном "сусідній" позначають нуклеотидні послідовності, які безпосередньо примикають одна до іншої, без вставок сторонніх нуклеотидів. Як приклад, пентануклеотид 5'-ААААА-3' є сусіднім для тринуклеотиду 5'-ТТТ-3', якщо вони зв'язані таким чином: 5'АААААТТТ-3' або 5'-ТТТААААА-3', але не в тому 94060 24 випадку, якщо вони зв'язані таким чином: 5'- АААААСТТТ-3'. Термін "засіб" вживають в цьому випадку для позначення хімічної сполуки, суміші хімічних сполук, біологічної макромолекули або екстракту, отриманого з біологічних матеріалів. Як використовують в даному описі, під "полегшенням плину" хвороби, порушення або стану розуміють зниження тяжкості симптомів хвороби, порушення або стану. Під цим терміном розуміють, але цим не обмежуючись, вплив на розмір, ріст і/або масу пухлини, поширеність або прогресування метастазів, і тому подібне, у пацієнта в порівнянні з тими ж самими показниками у пацієнта до застосування або у відсутність застосування способу лікування. Як використовують в даному описі, абревіатура "Id1" означає специфічний ген-мішень ALK-1 "наступного етапу сигнального шляху", ген Id1, який є важливим для ангіогенезу. Повідомляли, що ген Id1 контролює каскад реакцій ангіогенезу при певних формах раку, вимикаючи продукцію білка тромбоспондину-1 (TSP-1), природного супресору ангіогенезу. Наприклад, повідомляли, що ген Id1, рівень експресії якого високий при меланомі, ракові грудей, голови і шиї, мозку, шийки матки, простати, підшлункової залози і яєчок, призводить до зниження експресії TSP-1 і збільшення утворення кровоносних судин пухлини. Volpert, Olga V. et al., "Id1 regulates angiogenesis through transcriptional repression of thrombospondin-1", Cancer Cell, Dec. 2002, Vol. 2, pp. 473-483. Як використовують в даному описі, термін "Smad" означає білки з доменом Smad, виявлені у цілого ряду видів від нематод до людини. Ці високо консервативні білки містять N-кінцеву домен МН1, який контактує з ДНК і відділений короткою лінкерною ділянкою від С-кінцевого домену МН2, останній має разючу схожість з forkheadасоційованими (FHA) доменами. FHA і Smad (MH2) домени мають загальною структурою, що складається з сендвіча з одинадцяти бега-ланцюгів в двох площинах з топологією грецького ключа. Білки Smad опосередковують передачу сигналу за допомогою цитокінів TGF-бета/активін/ВМР-2/4 від рецептора Ser/Thr протеїнкіназ на клітинній поверхні до ядра. Smad білки ділять на три функціональних класи: регульовані рецептором Smad (RSmad), включаючи Smad1, -2, -3, -5 і -8, кожний з яких залучений до ліганд-специфічного сигнального каскаду реакцій; со-медіаторні Smad (co-Smad), включаючи Smad4, які взаємодіють з R-Smads для передачі сигналу і інгібіторні Smad (I-Smad), включаючи Smad-6 і -7, які блокують активацію R-Smad і Co-Smad, тим самим негативно регулюючи сигнальні каскади реакцій. Як використовують в даному описі, термін "TGF-бета" означає трансформуючі фактори росту бета, які складають сімейство багатофункціональних цитокінів (TGF-бета 1-5), які регулюють клітинні ріст і диференціацію. Трансформуючий фактор росту (TGF) є одним з багатьох охарактеризованих природних факторів росту. Він може грати важливі ролі в організмі мишей "SCID" з важким комбінованим імунодефіцитом. Багато клітин синтезують 25 TGF-бета, і практично всі мають специфічні рецептори для даного пептиду. TGF-бета регулює дію багатьох інших пептидних факторів росту і визначає позитивний або негативний напрям їх ефектів. TGF-бета являє собою цитокін, що пригнічує пухлини, з дією на епітеліальні клітини, що інгібує ріст. TGF-B може також діяти як стимулятор пухлин, викликаючи епітеліально-мезенхімальний перехід. TGF-B інактивує деякі білки, залучені до прогресії клітинного циклу і тим самим чинить свій вплив, що інгібує ріст, на епітеліальні клітини, викликаючи зупинку їх розвитку на фазі G1 клітинного циклу. Білок функціонує як ди сульфіднозв'язаний гомодимер. Його послідовність характеризується наявністю декількох С-кінцевих залишків цистеїну, які утворюють взаємно з'єднуючі дисульфідні зв'язки, топологічно розташовані у вигляді вузла. Аналогічне розташування у вигляді "цистеїнового вузла" відмічене в структурах деяких ферментних інгібіторів і нейротоксинів, які зв'язуються з потенціалозалежними Са2+ каналами, хоча точна топологія відрізняється. Гени TGF-бета експресуються диференціально, що свідчить про те, що різні види TGF-бета можуть мати різні фізіологічні функції in vivo. Як використовують в даному описі, термін "TGF-бета 1" означає рецептор типу 1 трансформуючого фактора росту, який являє собою пептид розміром 112 амінокислотних залишків, отриманий внаслідок протеолітичного розщеплення з С-кінця білка-попередника. Дослідження рівнів мРНК TGFбета 1 в тканинах дорослих мишей свідчить про те, що експресія має місце переважно в селезінці, легенях і плаценті. Вважають, що TGF-бета 1 грає важливу роль в патологічних процесах. Як використовують в даному описі, термін "SCID" означає мишей з важким комбінованим імунодефіцитом. Як використовують в даному описі, термін "HUVEC" означає ендотеліальні клітини пупкової вени людини. Як використовують в даному описі, "амінокислоти" представлені їх повними назвами, відповідними їм трилітерними кодами, або відповідними їм однолітерними кодами, як вказано в наступній таблиці: Трилітерний Однолітерний код код аспарагінова кислота Asp D глютамінова кислота Glu Ε лізин Lys K аргінін Arg R гістидин His Η тирозин Туr Υ цистеїн Cys З аспарагін Asn Ν глютамін Gln Q серин Ser S треонін Thr T гліцин Gly G аланін Ala Α валін Val V лейцин Leu L Повна назва 94060 26 ізолейцин метіонін пролін фенілаланін триптофан lle Met Pro Phe Trp Ι Μ Ρ F W Як використовують в даному описі, двадцять звичайних амінокислот і їх абревіатури застосовують загальноприйнятим чином. Дивись Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), яка наведена в даному описі як посилання. "Консервативна амінокислотна заміна" являє собою заміну, при якій залишок амінокислоти замінений на інший залишок амінокислоти, що має Rгрупу бічного ланцюга з такими ж хімічними властивостями (наприклад, заряд або гідрофобність). Як правило, консервативна амінокислотна заміна істотно не змінює функціональні властивості білка. У тих випадках, коли дві або більше амінокислотних послідовностей відрізняються одна від одної консервативними замінами, процент ідентичності послідовностей або ступінь схожості можна також коректувати, щоб зробити поправку на консервативну природу заміни. Способи проведення такої корекції добре відомі фахівцям в даній галузі. Дивись, наприклад, Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994). Приклади груп амінокислот, які мають бічні ланцюги зі схожими хімічними властивостями, включають амінокислоти 1) з аліфатичними бічними ланцюгами: гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин; 2) з аліфатичними-гідроксильними бічними ланцюгами: серин і треонін; 3) з амід-вмісними бічними ланцюгами: аспарагін і глютамін; 4) з ароматичними бічними ланцюгами: фенілаланін; тирозин і триптофан; 5) з основними бічними ланцюгами: лізин, аргінін і гістидин; 6) з кислими бічними ланцюгами: аспарагінова кислота і глютамінова кислота і 7) з сірковмісними бічними ланцюгами: цистеїн і метіонін. Переважними групами консервативних амінокислотних замін є: валін-лейцинізолейцин, фенілаланін-тирозин, лізин-аргінін, аланін-валін, глюігамат-аспартат і аспарагінглютамін. Альтернативно, консервативна заміна являє собою будь-яку зміну, що має позитивне значення в матриці логарифмічної правдоподібності РАМ250, описаній в Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992), наведеній в описі як посилання. "Помірно консервативне" заміщення являє собою будь-яку зміну, що має ненегативне значення в матриці логарифмічної правдоподібності РАМ250. У певних варіантах здійснення амінокислотними замінами для анти-ALK-1 антитіла або його антигензв'язувальної ділянки є заміни, які: (1) зменшують чутливість до протеолізу, (2) зменшують схильність до окислення, (3) змінюють афінність зв'язування для утворення білкових комплексів і (4) додають або змінюють інші фізико-хімічні або функціональні властивості подібних аналогів, однак всі ще зберігають специфічне зв'язування з ALK-1. Аналоги можуть містити різні заміни в зви 27 чайній пептидній послідовності. Наприклад, одиничні або множинні амінокислотні заміни, переважно консервативні амінокислотні заміни, можна провести в звичайній послідовності, наприклад у фрагменті поліпептиду за межами домену(ів), що утворюють міжмолекулярні контакти. Можна також провести амінокислотні заміни в домені(нах), що утворюють міжмолекулярні контакти, які можуть підвищувати активність поліпептиду. Консервативна амінокислотна заміна не повинна істотно змінювати структурні характеристики вихідної послідовності; наприклад, амінокислотна заміна не повинна змінювати антипаралельний -шар, який утворює імуноглобулін-зв'язувальний домен, що існує в вихідній послідовності, або руйнувати інші типи вторинної структури, характерні для вихідної послідовності. В основному, гліцин і пролін не треба використовувати в антипаралельному -шарі. Приклади відомих в даній галузі вторинних і третинних структур поліпептидів описані в Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, і Thornton et al., Nature 354:105 (1991) наведених в даному описі як посилання. Схожість послідовностей поліпептидів, яку також називають ідентичністю послідовностей, зазвичай визначають, використовуючи комп'ютерні програми для аналізу структур. Програма для аналізу білків зіставляє схожі послідовності, використовуючи критерії схожості, привласнені різним замінам, делеціям і іншим модифікаціям, включаючи консервативні амінокислотні заміни. Наприклад, GCG містить програми, такі як "Gap" і "Bestfit", які можна застосовувати з параметрами, що використовуються за замовчанням, для визначення гомології послідовностей або ідентичності послідовностей між близькоспорідненими поліпептидами, такими як гомологічні поліпептиди різних видів організмів або між білком дикого типу і його мутантною формою. Дивись, наприклад, GCG, версія 6.1. Поліпептидні послідовності можна також порівнювати, використовуючи FASTA із застосуванням параметрів за замовчанням або рекомендованих параметрів, програма в GCG версії 6.1. FASTA (наприклад, FASTA2 і FASTA3) виконує порівняльний аналіз і визначає процент ідентичності послідовностей в ділянках, що найкращим чином перекриваються в запитаній і такій, що вивчається, послідовностях (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185219 (2000)). Іншим переважним алгоритмом при порівнянні послідовності за винаходом з базою даних, що містить велику кількість послідовностей з різних організмів, є комп'ютерна програма BLAST, особливо blastp або tblastn із застосуванням параметрів за замовчанням. Дивись, наприклад, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389402 (1997); які наведені в даному описі як посилання. Довжина поліпептидних послідовностей, що порівнюються у відношенні гомології, зазвичай повинна складати щонайменше приблизно 16 амі 94060 28 нокислотних залишків, зазвичай, щонайменше приблизно 20 залишків, частіше за всі, щонайменше приблизно 24 залишки, зазвичай, щонайменше приблизно 28 залишків i, переважно, більше ніж приблизно 35 залишків. При пошуку в базі даних, що містить послідовності з великої кількості різних організмів, переважно порівнювати амінокислотні послідовності. Термін "аналог", як використовують в даному описі, означає поліпептиди, які складаються з сегмента довжиною щонайменше 25 амінокислот, який має істотну ідентичність з ділянкою встановленої природної амінокислотної послідовності, і який має щонайменше одну з властивостей природного поліпептиду. Зазвичай поліпептидні аналоги містять консервативну амінокислотну заміну (або вставку або делецію) відносно природної послідовності. Аналоги зазвичай мають довжину щонайменше 20 амінокислот, переважно щонайменше 50 амінокислот або більше, і часто можуть бути такими ж довгими як повнорозмірний природний поліпептид. Пептидні аналоги зазвичай застосовують в фармацевтичній промисловості як не-пептидні лікарські засоби з властивостями, аналогічними таким у матричного пептиду. Дані види непептидних сполук називають "пептидні міметики" або "пептидоміметики". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985); і Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), які наведені в даному описі як посилання. Подібні сполуки часто розробляють за допомогою комп'ютеризованого молекулярного моделювання. Пептидні міметики, які схожі за структурою з пептидами, що терапевтично застосовуються, можна використовувати для отримання еквівалентного терапевтичного або профілактичного ефекту. Зазвичай пептидоміметики є схожими за структурою з еталонним поліпептидом (тобто, поліпептидом, який має біохімічну властивість або фармакологічну активність), таким як антитіло людини, але в якого один або більше пептидних зв'язків необов'язково замінюють на зв'язки, вибрані з групи, яка складається з: -CH2NH-, -CH2S, -СН2-СН2-, СН=СН- (цис і транс), -СОСН2-, -СН(ОН)СН2- і СН2 SO-, способами, добре відомими в даній галузі. Систематичну заміну однієї або більшої кількості амінокислот консенсусної послідовності Dамінокислотами того ж типу (наприклад, D-лізин замість L-лізину) можна використовувати для отримання більш стабільних пептидів. Крім того, пептиди неприродної форми, що мають консенсусну послідовність або варіант послідовності, значною мірою ідентичний консенсусній, можна отримувати способами, відомими в даній галузі (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61. 557 (1992), наведена в даному описі як посилання в повному обсязі); наприклад, додаванням внутрішніх цистеїнових залишків, здатних утворювати внутрішньомолекулярні дисульфідні мости, які циклізують пептид. Інтактне "антитіло" або "імуноглобулін" (Ig) містить щонайменше два важкі (Н) ланцюги (приблизно 50-70 кДа) і два легкі (L) ланцюги (приблизно 25 кДа), зв'язані між собою дисульфідними зв'язками. Існує тільки два типи легких ланцюгів:  29 і . У людей вони схожі, але тільки один тип присутній в кожному антитілі. Важкі ланцюги поділяють на мю, дельта, гамма, альфа або іпсилон, і вони визначають ізотип антитіла як IgM, IgD, IgG, IgA, i IgE, відповідно. Дивись, в основному, Fundamental Immunology СН. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, (для всіх цілей наведену в даному описі як посилання в повному обсязі). У переважному варіанті здійснення антитіло є IgG і являє собою підтип lgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. У більш переважному варіанті здійснення, анти-ALK-1 антитіло являє собою підклас IgG2. Кожний важкий ланцюг складається з варіабельного домену важкого ланцюга (VH) і константної ділянки важкого ланцюга (СН). Константна ділянка важкого ланцюга складається з трьох доменів, СН1, СН2 і СН3. Кожний легкий ланцюг складається з варіабельного домену легкого ланцюга (VL) і константної ділянки легкого ланцюга. Константна ділянка легкого ланцюга складається з одного домену, CL. У складі легкого і важкого ланцюгів варіабельні і константні ділянки сполучені за допомогою "J"-ділянки довжиною приблизно 12 або більше амінокислот, при цьому важкий ланцюг також містить "D''-ділянку довжиною приблизно 3 або більше амінокислот. Ділянки VH і VL можна також поділяти на ділянки гіперваріабельності, звані "ділянками, що визначають комплементарність" (CDR), що перемежовуються з ділянками, які є більш консервативними, званими "каркасними ділянками" (FR). Кожний VH і VL складений з трьох CDR і чотирьох FR, організованих від аміно-кінця до карбоксильного кінця в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Співвідношення амінокислот з кожним доменом знаходиться відповідно до визначень Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991)), або Chothia & Lesk, Biol. 196: 901-917 (1987; Chothia et al., Nature 342: 878-883 (1989). Варіабельні домени кожної пари важкий/легкий ланцюг (VH і VL) утворюють центр зв'язування антитіла, який взаємодіє з антигеном. Таким чином, інтактне антитіло IgG, наприклад, має два центри зв'язування. За винятком біфункціональних або біспецифічних антитіл, два центри зв'язування є однаковими. Константні ділянки антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) і перший компонент (Clq) класичної системи комплементу. Антитіла повинні мати достатню різноманітністю антиген-зв'язування для розпізнавання будьякого можливого патогену (багато V ділянок), при цьому підтримуючи біологічну ефективність їх С ділянок (мало С ділянок). Гени Ig випадковим чином сплайсовані разом з генних сегментів, що дозволяє поєднувати множину V ділянок з невеликою кількістю С ділянок. Генні сегменти, що кодують Ig Η, каппа і лямбда ланцюга, виявлені в трьох різних хромосомах. У процесі розвитку Вклітини ферменти рекомбінази видаляють інтрони і деякі екзони з ДНК і сплайсують сегменти в функціональні гени Ig. 94060 30 Генні сегменти Ig ссавців складають групи "варіабельних" (V), "різноманітності" (D), "зв'язувальних" (J) і "константних" (С) екзонів. Кожний з V каппа (V) сегментів кодує перші два CDR і три FR V ділянки каппа-ланцюга, плюс декілька залишків CDR3. Кожний з J каппа (J) сегментів кодує CDR3, що залишилися і четвертий FR. С каппа (С) кодує повну С ділянку легкого ланцюга каппа. ДНК, що кодує каппа-ланцюг людини, містить приблизно 40 функціональних V каппа (V) сегментів, п'ять J каппа (J) сегментів і один С каппа (С) генний сегмент, а також деякі генні сегменти, які містять стоп-кодони ("псевдогени"). ДНК лямбда () ланцюги людини містить приблизно 30 функціональних V лямбда (V) сегментів і чотири функціональних набори з J лямбда (J) і С лямбда (С) сегментів. Конкретна J лямбда (J) завжди утворює пару з відповідною їй С лямбда (С), на відміну від J каппа (J), всі з яких утворюють пару з тими ж самими С каппа (). ДНК Н-ланцюга людини містить, приблизно, 50 функціональних VH сегментів, 30 DH сегментів і шість JH сегментів. Перші два CDR і три FR варіабельного домену важкого ланцюга кодує VH. CDR3 кодують декілька нуклеотидів VH, всі з DH, і частково JH, тоді як FR4 кодують залишки генного сегмента JH. Існують також окремі генні сегменти в ДНК для кожного домену важкого ланцюга і мембранної ділянки кожного ізотипу, організовані в тому порядку, в якому їх експресують В-клітини. Термін "поліпептид" охоплює природні або штучно отримані білки, білкові фрагменти і поліпептидні аналоги білкової послідовності. Поліпептид може бути мономерним або полімерним. Термін "виділений білок", "виділений поліпептид" або "виділене антитіло" означає білок, поліпептид або антитіло, які, внаслідок їх походження або джерела отримання (1) не є зв'язаними з природними компонентами, які супроводжують їх в їх природному стані, (2) є вільними від інших білків з тих же самих видів, (3) експресовані клітиною з інших видів або (4) не є природними. Таким чином, поліпептид, який є хімічно синтезованим або синтезованим в клітинній системі, відмінній від клітини, з якої він походить природним чином, буде бути "виділеним" з компонентів, зв'язаних з ним природним чином. Білок можна також переводити в стан, в основному вільний від природних компонентів, за допомогою виділення, застосовуючи методи очищення білків, добре відомі в даній галузі. Приклади виділених антитіл включають, але ними не обмежуються, наступні антитіла: антиALK-1 антитіло, яке афінно очищували, використовуючи ALK-1, і анти-ALK-1 антитіло, яке синтезували за допомогою клітинної лінії in vitro. Білок або поліпептид є "по суті чистим", "по суті гомогенним", або "по суті очищеним", якщо щонайменше приблизно від 60 до 75% зразка являє собою один вид поліпептиду. Поліпептид або білок може бути мономерним або багатомерним. По суті чистий поліпептид або білок може зазвичай становити приблизно 50%, 60%, 70%, 80% або 90% в/в білкового зразка, частіше за всі приблизно 95% і 31 переважно може бути більше, ніж 99% чистоти. Чистоту або гомогенність білка можна визначати за допомогою цілого ряду способів, добре відомих в даній галузі, таких як електрофорез білкового зразка в поліакриламідному гелі, з подальшою візуалізацією єдиної поліпептидної смуги при фарбуванні гелю барвником, добре відомим в даній галузі. Для певної мети можна забезпечувати більш високе розрізнення, використовуючи ВЕРХ або інші способи, добре відомі в галузі очищення. Термін "поліпептидний фрагмент", як використовують в даному описі, означає поліпептид, який має аміно-кінцеву і/або карбокси-кінцеву делецію, але де амінокислотна послідовність, що залишилася, є ідентичною відповідним положенням в природній послідовності. У деяких варіантах здійснення довжина фрагментів складає щонайменше 5, 6, 8 або 10 амінокислот. В інших варіантах здійснення довжина фрагментів складає щонайменше 14, щонайменше 20, щонайменше 50 або щонайменше 70, 80, 90, 100, 150 або 200 амінокислот. Термін "аналог" або "поліпептидний аналог", як використовують в даному описі, означає поліпептид, який являє собою сегмент, який істотно ідентичний деякій контрольній аміноцсислотній послідовності і має в основному ту ж саму функцію або активність, що і амінокислотна послідовність порівняння. Зазвичай поліпептидні аналоги містять консервативну амінокислотну заміну (або вставку або делецію) відносно послідовності порівняння. Довжина аналогів може складати щонайменше 20 або 25 амінокислот або щонайменше 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 або 200 амінокислот або довше, і часто можуть бути такими ж довгими як повнорозмірний поліпептид. Деякі варіанти здійснення винаходу включають антитіла з поліпептидних фрагментів або поліпептидного аналога з 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 або 17 замінами відносно гаметичної амінокислотної послідовності. Фахівці в даній галузі, дотримуючись вказівкам в даному описі можуть легко отримати фрагменти або аналоги антитіл або молекул імуноглобулінів. Термін "антигензв'язувальна ділянка" антитіла (або просто "ділянка антитіла"), як використовують в даному описі, означає один або більшу кількість фрагментів антитіла, які зберігають здатність специфічно зв'язувати антиген (наприклад, ALK-1 або ECD ALK-1). Показано, що антигензв'язувальну функцію антитіла можуть виконувати фрагменти повнорозмірного антитіла. Приклади зв'язувальних фрагментів, охоплених терміном "антигензв'язувальна ділянка" антитіла, включають (і) Fabфрагмент, одновалентний фрагмент, що складається з VL, VH, CL і СН1 доменів; (іі) F(ab')2фрагмент, двовалентний фрагмент, що містить два Fab-фрагменти, зв'язані дисульфідним містком в шарнірній ділянці; (ііі) Fd-фрагмент, що складається з VH і СН1 доменів; (iv) Fv-фрагмент, що складається з VL і VH доменів одного плеча антитіла, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), який складається з VH домену; і (vi) виділена ділянка, що визначає комплементарність (CDR). Крім того, хоча два домени Fvфрагмента, VL and VH кодують окремі гени, їх можна з'єднувати, використовуючи способи рекомбі 94060 32 нації із застосуванням синтетичного лінкера, який дозволяє отримувати з них один білковий ланцюг, в якому VL і VH ділянки утворюють пари для отримання одновалентних молекул (відомих як одноланцюжкова Fv (scFv)); дивись, наприклад, Bird et al. Science 242: 423-426 (1988) і Husxon et al. Proc. Nail. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)). Розуміють, що подібні одноланцюжкові антитіла також охоплює термін "антигензв'язувальна ділянка" антитіла. Також охопленими є інші форми одно ланцюжкових антитіл, такі як димери. Димери є двовалентними, біспецифічними антитілами, в яких VH і VL домени експресовані на одному поліпептидному ланцюгу, але з використанням лінкера, який є дуже коротким, щоб допустити утворення пар між двома доменами на одному і тому ж ланцюгу, тим самим змушуючи домени утворювати пари з комплементарними доменами іншого ланцюга і утворюючи два антигензв'язувальні центри (дивись, наприклад, Holliger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); Poljak et al. Structure 2: 1121-1125 (1994)). Більш того антитіло або його антигензв'язувальна ділянка може бути частиною більш великих імунозчеплених молекул, утворених ковалентним або нековалентним зв'язуванням антитіла або ділянки антитіла з однією або більшою кількістю інших білків або пептидів. Приклади подібних імунозчеплених молекул включають використання активної зони стрептавідину для отримання тетравимірної молекули scFv (Kipriyanov et al. Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101 (1995)), а також використання залишку цистеїну, маркерного пептиду і С-кінцевої полігістидинової мітки для отримання двовалентних і біотинільованих молекул scFv (Kipriyanov et al. Mol. Immunol. 31: 10471058 (1994)). Інші приклади включають випадки, коли один або декілька CDR антитіла включені в молекулу або ковалентно, або нековалентно для отримання імуноадгезину, який специфічно зв'язує антиген, який представляє інтерес, такий як ALK-1 або ECD з ALK-1. У таких варіантах здійснення CDR може(уть) бути частиною більшого за розміром поліпептидного ланцюга, може бути ковалентно зв'язана з іншим поліпептидним ланцюгом або може бути включена в склад нековалентно. Ділянки антитіл, такі як Fab або F(ab')2фрагменти можна отримувати з цілих антитіл загальноприйнятими методами, такими як розщеплення цілих антитіл папаїном або пепсином, відповідно. Крім того, антитіла, ділянки антитіл і імунозчеплені молекули можна отримувати, застосовуючи стандартні методи рекомбінантних ДНК, як описано в даному описі. Як використовують в даному описі, термін "антитіло людини" означає будь-яке антитіло, в якому послідовності варіабельного і константного доменів є послідовностями людини. Цей термін охоплює антитіла з послідовностями людських генів, але які змінені, наприклад, для зменшення можливої імуногенності, підвищення афінності, виключення залишків цистеїну, які можуть викликати небажане укладання молекули, і так далі. Термін також охоплює такі антитіла, отримані рекомбінантними способами в клітинах, що не мають відно 33 шення до людини, які можуть здійснювати глікозилування, нетипове для клітин людини. Ці антитіла можна отримувати за допомогою цілого ряду способів, як описано нижче. Як використовують в даному описі, термін "нейтралізуюче антитіло", "інгібіторне антитіло" або антагоністичне антитіло означає антитіло, яке інгібує сигнальний каскад реакцій ALK-1/TGF-бета1/Smad1. У переважному варіанті здійснення антитіло інгібує сигнальний каскад реакцій ALK-1/TGFбета-1/Smad1 щонайменше на приблизно 20%, переважно на 40%, більш переважно на 60%, ще більш переважно на 80% або ще більш переважно на 85%. Нейтралізуючий або інгібувальний потенціал анти-ALK-1 антитіл людини можна визначати, наприклад, за їх здатністю інгібувати підвищену регуляцію специфічного гена-мішені ALK-1 "наступного етапу сигнального шляху", Id1, як представлено в прикладі 12; інгібувати фосфорилування Smad1, що визначають за допомогою вестернблотингу з використанням інфрачервоної системи зображення Odyssey від LI-COR Biosciences, як представлено в прикладі 13. Термін "химерне антитіло", як використовують в даному описі, означає антитіло, яке містить ділянки з двох або більше різних антитіл. Наприклад, одна або більше CDR химерного антитіла можуть походити з анти-ALK-1 антитіла людини. В іншому прикладі всі CDR можуть походити з анти-ALK-1 антитіл людини. В іншому прикладі CDR з більш ніж одного анти-ALK-1 антитіла людини можна комбінувати в химерному антитілі. Наприклад, химерне антитіло може містити CDR1 легкого ланцюга першого анти-ALK-1 антитіла людини, CDR2 легкого ланцюга другого анти-ALK-1 антитіла людини і CDR3 легкого ланцюга третього анти-ALK-1 антитіла людини, a CDR важкого ланцюга можуть походити з однієї або більшої кількості інших антиALK-1 антитіл. Крім того, каркасні ділянки можуть походити з одного з анти-ALK-1 антитіл, з яких взяті одна або більше CDR, або з однієї або більшої кількості інших антитіл людини. Крім того, як обговорювалося в даному описі раніше, химерне антитіло включає антитіло, що містить ділянку, що походить з гаметичних послідовностей більше ніж одного виду. У деяких варіантах здійснення химерне антитіло за винаходом являє собою гуманізоване антиALK-1 антитіло. Гуманізоване анти-ALK-1 антитіло за винаходом містить амінокислотну послідовність однієї або більше каркасних ділянок і/або амінокислотну послідовність з щонайменше однієї ділянки константної ділянки одного або більше анти-ALK-1 антитіл людини за винаходом і також містить послідовності, що походять з анти-ALK-1 антитіла, що не має відношення до людини, наприклад, CDR послідовності. Як використовують в даному описі, термін "ELISA" означає твердофазний імуноферментний аналіз. Цей аналіз добре відомий фахівцям в даній галузі. Приклади даного аналізу можна знайти в Vaughan, TJ. et al., Nature Biotech. 14: 309-314 (1996), а також в прикладі 2 даної заявки. Термін "поверхневий плазмонний резонанс", як використовують в даному описі, означає оптич 94060 34 ний феномен, який дозволяє аналізувати в режимі реального часу біоспецифічні взаємодії за допомогою реєстрації змін білкових концентрацій всередині біосенсорної матриці, наприклад, використовуючи систему BIACORE (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden і Piscataway. Для додаткових описів дивись Jonsson et al., Ann. Biol. Clin. 51: 1926 (1993); Jonsson et al., Biotechniques 11: 620-627 (1991); Jonsson et al., Recognit 8: 125-131 (1995); і Johnsson et al., Anal. Biochem. 198: 268-277 (1991). Термін "афінність" означає міру тяжіння між антигеном і антитілом. Властиве антитілу тяжіння до антигену зазвичай виражають у вигляді константи афінності зв'язування (KD) для конкретної взаємодії антиген-антитіло. Кажуть, що антитіло специфічно зв'язує антиген, коли KD складає 1 мМ, переважно, 100 нМ. Константу афінності зв'язування KD можна виміряти за допомогою поверхневого плазмоннбго резонансу, наприклад, використовуючи систему BIACORE, як обговорюють в прикладах 7 і 8. Термін "kOff" означає константу швидкості дисоціації для конкретної взаємодії антиген-антитіло. Константу швидкості дисоціації kOff можна виміряти за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, наприклад, використовуючи систему BIACORE, як обговорюють в прикладах 7 і 8. Термін "авідність" означає функціональну комбіновану силу зв'язування антитіла з його антигеном, яка заснована як на афінності, так і на валентностях антитіла. Як використовують в даному описі, цей термін описує підвищену афінність, яка має місце внаслідок наявності в імуноглобуліні множинних центрів зв'язування антигену. Як використовують в даному описі, термін "молекулярна селективність" означає афінність зв'язування антитіла для визначеного антигену більшу, ніж для інших антигенів. Наприклад, антитіла за даним винаходом можуть бути селективними для ALK-1 в більшій мірі, ніж для ALK-2 аж до ALK-7, що означає, що афінність зв'язування антитіла для ALK-1 є щонайменше в 2 рази більшою, наприклад, в 4 рази або в 10 разів, або в 50 разів, або в 100 разів або більше, ніж для ALK-2 аж до ALK-7. Такі афінності зв'язування можна вимірювати, використовуючи стандартні методи, відомі фахівцям в даній галузі. Термін "епітоп" включає будь-яку білкову детермінанту, здатну специфічно зв'язувати імуноглобулін або Т-клітинний рецептор, або інакше взаємодіяти з молекулою. Епітопні детермінанти зазвичай складаються з хімічно активних поверхневих угрупувань молекул, таких як амінокислоти або бічні ланцюги вуглеводів або цукру, і зазвичай мають специфічні тривимірні структурні характеристики, а також специфічні зарядні характеристики. Епітоп може бути "лінійним" або "конформаційним". У лінійному епітопі всі точки взаємодії між білком і взаємодіючою молекулою (такою як антитіло) розташовані лінійно вздовж первинної амінокислотної послідовності білка. У конформаційному епітопі точки взаємодії проходять через амінокислотні залишки на білці, які відділені один від одного. Коли потрібний епітоп антигену визначений, стає можливим отримання антитіл до даного епі 35 топу, наприклад, застосовуючи методи за даним винаходом. Альтернативно, в процесі пошуку, отримання і характеристики антитіл можна пролити світло на інформацію про бажані епітопи. Виходячи з даної інформації, потім стає можливим конкурентно відбирати антитіла за зв'язуванням з тим же самим епітопом. Підходом до досягнення цього є проведення досліджень з перехресної конкуренції для виявлення антитіл, які койкурентно зв'язуються по відношенню одне до одного, тобто, антитіла конкурують за зв'язування з антигеном. Високопродуктивний спосіб для "бінінгу" антитіл, заснований на їх перехресній конкуренції, описаний в міжнародній патентній заявці номер WO 03/48731. Як використовують в даному описі, термін "бінінг" означає спосіб групування антитіл, заснований на їх антигензв'язувальних властивостях. Розподіл бінів є до деякої міри довільним, в залежності від того, наскільки різними є картини зв'язування, що спостерігаються для всіх антитіл, що тестуються. Внаслідок цього біни не завжди корелюють з епітопами, визначеними іншими способами, і їх не треба використовувати для визначення епітопів. Термін "конкурувати", як використовують в даному описі відносно антитіла, означає, що перше антитіло або його антигензв'язувальна ділянка конкурує за зв'язування антигену з другим антитілом або його антигензв'язувальною ділянкою, якщо зв'язування першого антитіла з пізнаваним ним епітопом є помітно зниженим в присутності другого антитіла, в порівнянні зі зв'язуванням першого антитіла за відсутності другого антитіла. Альтернативний варіант, коли зв'язування другого антитіла з його епітопом також помітно знижується в присутності першого антитіла, можливий, але не обов'язковий. Тобто, перше антитіло може інгібувати зв'язування другого антитіла з його епітопом без того, щоб друге антитіло інгібувало зв'язування першого антитіла з відповідним йому епітопом. Однак, якщо кожне з антитіл помітно інгібує зв'язування іншого антитіла з пізнаваним їм епітопом або лігандом в тій же самій, більшій або меншій мірі, кажуть, що антитіла "перехресно конкурують" один з одним за зв'язування відповідного ним епітопу(пів). Як конкуруючі, так і перехресно конкуруючі антитіла знаходяться в межах даного винаходу. Безвідносно механізму, що лежить в основі подібної конкуренції або перехресної конкуренції (наприклад, стерична перешкода, конформаційна зміна або'зв'язування із загальним епітопом або його ділянкою, і тому подібне) фахівцеві в даній галузі буде очевидно, виходячи із запропонованих в даному описі ідей, що подібні конкуруючі і/або перехресно конкуруючі антитіла знаходяться в межах даної заявки і можуть бути використані для способів, описаних в даному описі. Термін "полінуклеотид", як вказано в даному описі, означає полімерну форму нуклеотидів довжиною щонайменше 10 основ, або рибонуклеотидів, або дезоксирибонуклеотидів або модифікованої форми будь-якого типу нуклеотиду. Термін охоплює одно- і дволанцюжкові форми. 94060 36 Термін "виділений полінуклеотид", як вказано в даному описі, означає полінуклеотид геномного, кДНК або синтетичного походження, або різні їх поєднання, коли внаслідок свого походження "виділений полінуклеотид" (1) є не зв'язаним з всіма або частиною полінуклеотидів, з якими "виділений полінуклеотид" знаходять в природі, (2) є функціонально зв'язаним з полінуклеотидом, з яким він не зв'язаний в природі, або (3) не зустрічається в природі у вигляді частини більшої за розміром послідовності. Термін "природні нуклеотиди", як використовують в даному описі, включає дезоксирибонуклеотиди і рибонуклеотиди. Термін "модифіковані нуклеотиди", як використовують в даному описі, включає нуклеотиди з модифікованими або заміщеними цукровими групами і тому подібне. Термін "олігонуклеотидні зв'язки", як називають в даному описі, включає зв'язки олігонуклеотидів, такі як фосфортіоат, фосфордитіоат, фосфорселеноат, фосфордиселеноат, фосфоранілотіоат, фосфораніладат, фосфорамідат і тому подібне. Дивись, наприклад, LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); патент США № 5151510; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90: 543 (1990), описи яких наведені в даному описі як посилання в повному обсязі. Олігонуклеотид може містити мітку для виявлення, якщо необхідне. "Функціонально зв'язані" послідовності включають як послідовності, контролюючі експресію, які межують з геном, що представляє інтерес, так і послідовності, контролюючі експресію, які діють в транс положенні або на відстані, контролюючи ген, що представляє інтерес. Термін "послідовність, що контролює експресію", як використовують в даному описі, означає полінуклеотидні послідовності, які необхідні для впливу на експресію і процесинг кодуючих послідовностей, з якими вони зв'язані. Послідовності, контролюючі експресію, включають відповідні послідовності ініціації транскрипції, термінації, промоторні і енхансерні; сигнали ефективного процесингу РНК, такі як сигнали сплайсингу і поліаденілування; послідовності, які стабілізують цитоплазматичну мРНК; послідовності, які посилюють ефективність трансляції (тобто, консенсусна послідовність Kozak); послідовності, які підвищують білкову стабільність; і, коли треба, послідовності, які посилюють білкову секрецію. Природа подібних контролюючих послідовностей розрізнюється в залежності від організму хазяїна; у прокаріот подібні контролюючі послідовності зазвичай містять промотор, рибосомальний зв'язувальний центр і послідовність термінації транскрипції; у еукаріот зазвичай подібні контролюючі послідовності містять промотори і послідовність термінації транскрипції. Передбачають, що термін "контролюючі послідовності" включає, як мінімум, всі компоненти, чия присутність є обов'язковою 37 для експресії і процесингу, і може також включати додаткові компоненти, чия присутність є корисною, наприклад, лідерні послідовності і послідовності злиття. Термін "вектор", я|к використовують в даному описі, означає молекулу нуклеїнової кислоти, здатну транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона зв'язана. У деяких варіантах здійснення вектор являє собою плазміду, тобто, кільцевий дволанцюжковий фрагмент ДНК, в який можна лігувати додаткові сегменти ДНК. У деяких варіантах здійснення вектор являє собою вірусний вектор, де додаткові сегменти ДНК можна лігувати у вірусний геном. У деяких варіантах здійснення вектори є здатними до автономної реплікації в клітині-хазяїні, в яку їх ввели (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальну точку початку реплікації і епісомальні вектори ссавців). В інших варіантах здійснення вектори (наприклад, неепісомальні вектори ссавців) можуть вбудовуватися в геном клітини-хазяїна при введенні в клітинухазяїн, і внаслідок цього реплікуються разом з геномом хазяїна. Більш того певні вектори здатні направляти експресію генів, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори в даному описі називають "рекомбінантні експресуючі вектори" (або просто "експресуючі вектори"). Термін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн"), як використовують в даному описі, означає клітину, в яку ввели рекомбінантний експресуючий вектор. Потрібно розуміти, що "рекомбінантна клітина-хазяїн" і "клітинахазяїн" означає не тільки клітину конкретного індивіда, але також потомство такої клітини. Оскільки певні модифікації можуть мати місце в наступних поколіннях внаслідок або мутації, або впливу факторів навколишнього середовища, таке потомство може, звичайно, не бути ідентичним батьківській клітині, однак як і раніше знаходиться в межах терміну "клітина-хазяїн", як використовують в даному описі. Як використовують в даному описі, термін "гаметична" означає нуклеотидні послідовності і амінокислотні послідовності генів і генних сегментів антитіл, при їх передачі від батьків потомству через статеві клітини. Така гаметична послідовність відрізняється від нуклеотидної послідовності, що кодує антитіла в зрілих В-клітинах, яка змінювалася внаслідок випадків рекомбінації і гіпермутації в процесі дозрівання В-клітини. Антитіло, яке "кодує" конкретну гамета, має нуклеотидну або амінокислотну послідовністю, яка в найбільшій мірі співпадає з нуклеотидною послідовністю даної гамети або амінокислотною послідовністю, яку вона визначає. Такі антитіла часто є мутовані в порівнянні з гйметичною послідовністю. Термін "процентна ідентичність послідовності" в контексті послідовностей нуклеїнових кислот означає залишки в двох послідовностях, які є однаковими при проведенні аналізу на максимальний збіг. Довжина послідовності, яку порівнюють на ідентичність, може складати відрізок в щонайменше приблизно дев'яти нуклеотидів, зазвичай щонайменше приблизно 18 нуклеотидів, частіше за всі щонайменше приблизно 24 нуклеотиди, ти 94060 38 пово щонайменше приблизно 28 нуклеотидів, більш типово щонайменше приблизно 32 нуклеотидів і переважно щонайменше приблизно 36, 48 або більше нуклеотидів. Існує цілий ряд різних алгоритмів, відомих в даній галузі, які можна використовувати для визначення ідентичності нуклеотидних послідовностей. Наприклад, полінуклеотидні послідовності можна порівнювати, використовуючи FASTA, Gap або Bestfit, які являють собою програми в Wisconsin Package версія 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, яка включає, наприклад, програми FASTA2 і FASTA3, виконує порівняльний аналіз і визначає процентну ідентичність послідовностей в ділянках, що найкращим чином перекриваються в запитаній і такій, що вивчається, послідовностях (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998); наведені в даному описі як посилання). Якщо не вказано інше, застосовують параметри за замовчанням для конкретної програми або алгоритму. Наприклад, процентну ідентичність послідовностей між послідовностями нуклеїнових кислот можна визначати, використовуючи FASTA з її параметрами за замовчанням (розрядність 6 і NOPAM фактор для матриці кількісної оцінки) або використовуючи Gap з її параметрами за замовчанням, як запропоновано в GCG версія 6.1, наведені в даному описі як посилання. Посилання на нуклеотидну послідовність охоплює і її комплемент, якщо не вказано інше. Так, посилання на нуклеїнову кислоту, що має конкретну послідовність, потрібно розуміти як таку, що охоплює комплементарний їй ланцюг з її комплементарною послідовністю. Термін "значна схожість" або "значна схожість послідовностей", коли мова йде про нуклеїнову кислоту або її фрагмент, означає, що при оптимальному проведенні порівняння, з урахуванням відповідних нуклеотидних вставок або делецій, з іншою нуклеїновою кислотою (або її комплементарним ланцюгом), має місце ідентичність нуклеотидних послідовностей рівна щонайменше приблизно 85%, переважно, щонайменше приблизно 90%, і більш переважно, щонайменше приблизно 95%, 96%, 97%, 98% або 99% нуклеотидних основ, як визначають за допомогою добре відомого алгоритму ідентичності послідовностей, такого як FASTA, BLAST або Gap, як обговорювали вище. Термін "процентна ідентичність послідовності" в контексті амінокислотних послідовностей означає залишки в двох послідовностях, які є однаковими при проведенні аналізу на максимальний збіг. Довжина послідовності, яку порівнюють на ідентичність, може складати відрізок в щонайменше приблизно п'ять амінокислот, зазвичай, щонайменше приблизно 20 амінокислот, частіше за всі, щонайменше приблизно 30 амінокислот, типово, щонайменше приблизно 50 амінокислот, більш типово, щонайменше приблизно 100 амінокислот, і ще більш типово, щонайменше приблизно 150, 200 або більше амінокислоти. Існує цілий ряд різ 39 них алгоритмів, відомих в даній галузі, які можна використовувати для визначення ідентичності амінокислотних послідовностей. Наприклад, амінокислотні послідовності можна порівнювати, використовуючи FASTA, Gap або Bestfit, які являють собою програми в Wisconsin Package версія 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. Застосовно до поліпептидів, термін "значна ідентичність" або "значна схожість" означає, що дві амінокислотні послідовності, при оптимальному порівняльному аналізі, такому як за допомогою програм GAP або BESTFIT із застосуванням значень пропусків за замовчанням, наданих програмами, мають щонайменше 70%, 75% або 80% ідентичність послідовностей, переважно, щонайменше 90% або 95% ідентичність послідовностей, і більш переважно, щонайменше 97%, 98% або 99% ідентичність послідовностей. У певних варіантах здійснення позиції залишків, які не є ідентичними, розрізнюються внаслідок консервативних амінокислотних замін. Термін "сигнальна послідовність", також звана сигнальним пептидом, лі дер ним пептидом, означає сегмент розміром приблизно від 15 до 30 амінокислот на N-кінці білка, який дає можливість білка секретуватися (пройти через клітинну мембрану). Після того, як білок секретований, сигнальна послідовність віддаляється. Як використовують в даному описі, терміни "мітка" або "мічений" означає введення до складу антитіла іншої молекули. В одному варіанті здійснення мітка являє собою детектований маркер, наприклад, введення до складу радіоактивно міченої амінокислоти або приєднання до поліпептиду біотинільованих фрагментів, які можна виявити за допомогою міченого авідину (наприклад, стрептавідину, що містить флуоресцентний маркер або ферментативну активність, яку можна виявити оптичними або колориметричним способами). В іншому варіанті здійснення мітка або маркер можуть бути терапевтичними, наприклад, лікарський кон'югат або токсин. Різні способи мічення поліпептидів і глікопротеїнів відомі в даній галузі і їх можна застосовувати. Приклади міток для поліпептидів включають, але ними не обмежуються наступні мітки: радіоактивні ізотопи або радіонукліди (наприклад, 3Н, 14С, 15N, 35S, 90Y, 99Тс, 111Іn, 125І, 131І), флуоресцентні мітки (наприклад, FITC, родамін, лантанідні люмінофори), ферментативні мітки (наприклад, пероксидаза хріну, -галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза), хемілюменісцентні маркери, біотинілові групи, заздалегідь визначені поліпептидні епітопи, що пізнаються вторинним репортером (наприклад, парами послідовностей з лейциновими застібками, ділянками зв'язування для вторинних антитіл, метал-зв'язувальними доменами, епітопними маркерами), магнітні засоби, такі як хелати гадолінію, токсини, такі як коклюшний токсин, таксол, цитохалазин В, граміцидін D, бромистий етидій, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксіантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин D,1дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, 94060 40 тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин, а також їх аналоги і гомологи. У деяких варіантах здійснення мітки приєднують за допомогою спейсерних ділянок різної довжини для зменшення потенційних стеричних перешкод. Термін "примат" означає ссавця роду приматів, який включає людиноподібних і промавп, який характеризується вдосконаленим розвитком рук і ніг, вкороченою мордою і великим мозком. Ссавці роду приматів включають людей, людиноподібних мавп, мавп і промавп, або нижчих приматів. "Терапевтично ефективна кількість" означає таку кількість введеного терапевтичного засобу, яка полегшує до певної міри один або більше симптомів хвороби, на яку направлено лікування. Застосовно до лікування раку, терапевтично ефективна кількість означає таку кількість, яка має щонайменше один з наступних ефектів: зменшення розміру пухлини; інгібування (а саме, уповільнення росту до певної міри, переважно зупинку) метастазування пухлини; інгібування до певної міри (а саме, сповільнення росту до певної міри, переважно зупинку) росту пухлини і полегшення до певної міри (або, переважно, зняття) одного або більше симптомів, пов'язаних з раком. "Лікувати", "лікування" і "виліковування" означає спосіб полегшення або усунення біологічного порушення і/або супутніх йому симптомів. Застосовно до раку, ці терміни просто означають, що шанси на виживання хворого, що страждає на рак, зростають або що один або більше симптомів хвороби будуть зменшені. "Приведення в контакт" означає зведення разом антитіла або його антигензв'язувальної ділянки за даним винаходом і мішеневу ALK-1 або її епітоп таким чином, що антитіло може впливати на біологічну активність ALK-1. Таке "приведення в контакт" можна здійснювати "in vitro", тобто в пробірці, чашці Петрі або тому подібне. У пробірці в контакт можна приводити тільки антитіло або його антигензв'язувальну ділянка і ALK-1 або її епітоп, або контакт може зачіпати цілі клітини. Клітини можна також підтримувати або вирощувати в чашках для клітинних культур і приводити їх в контакт з антитілами або їх антигензв'язувальними ділянками в даному середовищі. У даному контексті, здатність конкретного антитіла або його антигензв'язувальної ділянки впливати на хворобу, пов'язану з ALK-1, тобто, ІС50 антитіла, можна визначати раніше, ніж намагатися застосовувати дане антитіло in vivo з більш складними живими організмами. Для клітин поза організмом існує множина способів, і вони добре відомі фахівцям в даній галузі, приводити ALK-1 в контакт з антитілами або їх антигензв'язувальними ділянками. Абревіатура "FACS" означає сортування флуоресцентно активованих клітин. Абревіатуру FACS і проточну цитометрію використовують як взаємозамінні. Флуоресцентне мічення дозволяє дослідити клітинну структуру і функцію. Імунофлуоресценція, застосування, що найбільш широко використовується, включає фарбування клітин антитілами, кон'югованими з флуоресцентними барвниками, такими як флуоресцеїн і фікоеритрин. Даний спосіб часто використовують, щоб мітити 41 молекули на поверхні клітин, однак антитіла можна напра'вляти на мішені в цитоплазмі. При прямий імунофлуоресценції антитіло з молекулою є напряму кон'юговане з флуоресцентним барвником, і клітини забарвлюють в один етап. При посередній імунофлуоресценції первинне антитіло не мітять і додають друге флуоресцентно кон'юговане антитіло, яке є специфічним для першого антитіла. Анти-ALK-1 антитіла Даний винахід стосується виділених нейтралізуючих анти-ALK-1 моноклональних антитілі або їх антигензв'язувальних ділянок, які зв'язують ALK-1 приматів, переважно ECD ALK-1 приматів, більш переважно ECD ALK-1 людини. У переважному варіанті здійснення винахід стосується виділених нейтралізуючих антитіл, які являють собою повністю моноклональні антитіла людини або їх антигензв'язувальні ділянки. Переважно антитіла людини являють собою рекомбінантні анти-ALK-1 антитіла людини, які мають більшу афінність для ALK-1, ніж для ALK-2 аж до ALK-7. У деяких варіантах здійснення анти-ALK-1 антитіла людини отримують, імунізуючи трансгенну тварину, що не є людиною, наприклад, кролика, чий геном містить гени імуноглобулінів людини, так що трансгенна тварина продукує антитіла людини. Різні аспекти винаходу відносяться до таких антитіл і антигензв'язувальних ділянок, і фармацевтичних композицій з них, а також до нуклеїнових кислот, рекомбінантних експресуючих векторів і клітин-хазяїв для отримання таких антитіл і антигензв'язувальних ділянок. Способи застосування антитіл і антигензв'язувальних ділянок за даним винаходом для скасування сигнального каскаду реакцій ALK-1/TGF-бета1/Smad1 або для виявлення ALK-1 in vitro або in vivo, також охоплені даним винаходом. Анти-ALK-1 антитіло за винаходом може містити каппа- або лямбда-легкий ланцюг людини або амінокислотну послідовність, що походить від них. У деяких варіантах здійснення, що включають легкий ланцюг каппа, варіабельний домен легкого ланцюга (VL) кодує А27, А2, А1, A3, B3, В2, L1 або L2 V ген людини. У деяких варіантах здійснення легкий ланцюг кодує V L1 ген людини і JK 4 ген людини; V A27 ген людини і J 5 ген людини або J 4 ген людини; V B3 ген людини і J 1 ген людини; V L2 ген людини і J 3 ген людини; V A2 ген людини і JK 1 ген людини; V A3 ген людини і JK 4 ген людини; V Α1 ген людини і JK 1 ген людини; V B2 ген людини і JK 4 ген людини; або V A2 ген людини і J 1 ген людини. У деяких варіантах здійснення VL анти-ALK-1 антитіла містить одну або більше амінокислотних замін, делецій або вставок (додатків), відносно гаметичної амінокислотної послідовності V. У деяких варіантах здійснення VL анти-ALK-1 антитіла містить 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 амінокислотних замін відносно гаметичної амінокислотної послідовності V. У деяких варіантах здійснення одна або більше замін відносно гаметичної послідовності знаходяться в CDR ділянках легкого ланцюга. У деяких варіантах здійснення амінокислотні заміни в V відносно гаметичної по 94060 42 слідовності знаходяться на одній абобільшій кількості тих же самих позицій, що заміни відносно гаметичної послідовності, виявлені в одній або більшій кількості VL антитіл, запропонованих в даному описі, як показано, наприклад, на Фіг. 7. У деяких варіантах здійснення амінокислотні зміни знаходяться на одній або більшій кількості тих же самих положень, але зачіпають інші заміни, ніж в антитілі порівняння. У деяких варіантах здійснення амінокислотні заміни відносно гаметичної послідовності знаходяться в одному або більше тих же самих положень, що і заміни відносно гаметичної послідовності в будь-якому з VL антитіл 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 і 5.59.1, однак заміни можуть являти собою консервативні амінокислотні заміни в таких положеннях відносно амінокислоти в антитілі порівняння. Наприклад, якщо конкретне положення в одному з цих антитіл є зміненим відносно гаметичної і являє собою глютамат, то можна зробити заміну на аспартат на даному положенні. Аналогічно, якщо амінокислотна заміна в порівнянні з гаметичною послідовністю в ілюстративному антитілі являє собою серин, можна консервативно замінити треоніном серин в даному положенні. Консервативні амінокислотні заміни обговорені вище. У деяких варіантах здійснення анти-ALK-1 антитіло містить амінокислотну послідовність легкого ланцюга, відповідної SEQ ID NO: 4. В інших варіантах здійснення легкий ланцюг має амінокислотну послідовність легкого ланцюга антитіла 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(М29І); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 або 5:59.1. У деяких варіантах здійснення легкий ланцюг анти-ALK-1 антитіла людини містить VL амінокислотну послідовність антитіла 1.12.1 (SEQ ID NO: 8); 1.11.1 (SEQ ID NO: 12); 1.13.1 (SEQ ID NO: 16); 1.14.1 (SEQ ID NO: 20); 1.151.1 (SEQ ID NO: 24); 1.162.1 (SEQ ID NO: 28); 1.183.1 (SEQ ID NO: 32); 1.8.1 (SEQ ID NO: 36); 1.9.1 (SEQ ID NO: 40); 4.10.1 (SEQ ID NO: 44); 4.24.1 (SEQ ID NO: 48); 4.38.1 (SEQ ID NO: 52); 4.58.1 (SEQ ID NO: 56); 4.62.1 (SEQ ID NO: 60); 4.68.1 (SEQ ID NO: 64); 4.72.1 (SEQ ID NO: 68); 5.13.1 (SEQ ID NO: 72); 5.34.1 (SEQ ID NO: 76); 5.53.1 (SEQ ID NO: 80); 5.56.1 (SEQ ID NO: 84); 5.57.1 (SEQ ID NO: 88) або 5.59.1 (SEQ ID NO: 92); або вказана амінокислотна послідовність має аж до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 консервативних амінокислотних замін і/або загалом аж до 3 неконсервативних амінокислотних замін. В інших варіантах здійснення легкий ланцюг анти-ALK-1 антитіла людини містить VL амінокислотну послідовність антитіла 1.27.1; 1.29.1 або 1.31.1. У деяких варіантах здійснення легкий ланцюг має амінокислотну послідовність від початку CDR1 до кінця CDR3 будь-якого з вищезгаданих антитіл. 43 У деяких варіантах здійснення легкий ланцюг може мати амінокислотною послідовністю ділянок CDR1, CDR2 і CDR3, незалежно вибраними з ділянок CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга, відповідно, двох або більше моноклональних. антитіл, вибраних з 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 або 5.59.1, або вказаних CDR ділянок, кожна з яких має менше 3 або менше 2 консервативних амінокислотних замін і/або загалом три або менше неконсервативні амінокислотні заміни. У певних варіантах здійснення легкий ланцюг анти-ALK-1 антитіла містить амінокислотні послідовності ділянок CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга антитіла, вибрану з 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(М29І); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 або 5.59.1, або вказаних CDR ділянок, кожна з яких має менше 3 або менше 2 консервативних амінокислотні замінами і/або загалом три або менше неконсервативні амінокислотні заміни. Що стосується важкого ланцюга, то в деяких варіантах здійснення варіабельний домен (VH) кодує VH 4-31, VH 3-11, VH 3-15, VH 3-33, VH 4-61 або VH 4-59 ген людини. У деяких варіантах здійснення VH послідовність анти-ALK-1 антитіла містить одну або декілька амінокислотних замін, делецій або вставок (додатків), в збірному значенні званих "мутаціями", відносно гаметичної амінокислотної послідовності VH. У деяких варіантах здійснення варіабельний домен важкого ланцюга містить 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або 11 мутацій відносно гаметичної амінокислотної послідовності VH. У деяких варіантах здійснення мутація(і) являють собою неконсервативні заміни в порівнянні з гам етичною амінокислотною послідовністю. У деяких варіантах здійснення мутації знаходяться в CDR ділянках важкого ланцюга. У деяких варіантах здійснення важкий ланцюг кодує VH 3-33 ген людини, D 6-19 ген людини і JH 3B ген людини; VH 4-31 ген людини, D 6-19 ген людини і JH 4B ген людини; VH 4-61 ген людини, D 6-19 ген людини і JH 4В ген людини; VH 4-31 ген людини, D 3-3 ген людини і JH 3B ген людини; VH 4-31 ген людини і JH 3B ген людини; VH 4-59 ген людини, D 6-19 ген людини і JH 4B ген людини; VH 3-11 ген людини, D 3-22 ген людини і JH 6B ген людини; VH 3-15 ген людини, D 3-22 ген людини і JH 4B ген людини; VH 4-31 ген людини, D 5-12 ген людини і JH 6B ген людини; VH 4-31 ген людини, D 4-23 ген людини і JH 4B ген людини; VH 4-31 ген людини, D 2-2 ген людини і JH 5B ген людини; VH 4-31 ген людини і JH 6B ген людини; VH 3-15 ген людини, D 1-1 ген людини і JH 4B ген людини; VH 3-11 ген людини, D 619 ген людини і JH 6B ген людини; VH 3-11 ген людини, D 3-10 ген людини і JH 6B ген людини; або VH 3-11 ген людини, D 6-6 ген людини і JH 6B ген людини. 94060 44 У деяких варіантах здійснення амінокислотні заміни знаходяться на одній або більшій кількості тих самих положень, що і заміни відносно гаметичної послідовності в будь-якій одній або більшій кількості VH антитіл 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 або 5.59.1. У деяких варіантах здійснення амінокислотні зміни знаходяться на одній або більшій кількості тих же самих позицій, але зачіпають інші заміни, ніж в антитілі порівняння. У деяких варіантах здійснення важкий ланцюг має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2. В інших варіантах здійснення важкий ланцюг має амінокислотну послідовність важкого ланцюга антитіла 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 або 5.59.1. У деяких варіантах здійснення важкий ланцюг має VH амінокислотну послідовність антитіла 1.12.1 (SEQ ID NO: 6); 1.11.1 (SEQ ID NO: 10); 1.13.1 (SEQ ID NO: 14); 1.14.1 (SEQ ID NO: 18); 1.151.1 (SEQ ID NO: 22); 1.162.1 (SEQ ID NO: 26); 1.183.1 (SEQ ID NO: 30); 1.8.1 (SEQ ID NO: 34); 1.9.1 (SEQ ID NO: 38); 4.10.1 (SEQ ID NO: 42); 4.24.1 (SEQ ID NO: 46); 4.38.1 (SEQ ID NO: 50); 4.58.1 (SEQ ID NO: 54); 4.62.1 (SEQ ID NO: 58); 4.68.1 (SEQ ID NO: 62); 4.72.1 (SEQ ID NO: 66); 5.13.1 (SEQ ID NO: 70); 5.34.1 (SEQ ID NO: 74); 5.53.1 (SEQ ID NO: 78); 5.56.1 (SEQ ID NO: 82); 5.57.1 (SEQ ID NO: 86) або 5.59.1 (SEQ ID NO: 90); або вказана амінокислотна послідовність VH має аж до 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10 або 11 консервативних амінокислотних замін і/або загалом аж до 3 неконсервативних амінокислотних замін. В інших варіантах здійснення важкий ланцюг має VH амінокислотну послідовність антитіла 1.27.1; 1.29.1 або 1.31.1. У деяких варіантах здійснення важкий ланцюг має амінокислотну послідовність від початку CDR1 до кінця CDR3 будь-якого з вищезгаданих антитіл. У деяких варіантах здійснення важкий ланцюг являє собою CDR1, CDR2 і CDR3 ділянки важкого ланцюга антитіла 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.ί(Μ29Ι); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 або 5.59.1, або вказані CDR ділянки, кожна з яких і має менше 8, менше 6, менше 4 або менше 3 консервативних амінокислотних замін і/або загалом три або менше неконсервативних амінокислотних замін. У деяких варіантах здійснення CDR ділянки важкого ланцюга незалежно вибрані з CDR ділянок двох або більше антитіл, вибраних з антитіл 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 або 5.59.1. В 45 94060 іншому варіанті здійснення антитіло містить легкий ланцюг, як описано вище, і важкий ланцюг, як описано вище. У додатковому варіанті здійснення ділянки CDR легкого ларцюга і CDR важкого ланцюга є ділянками одного і того ж антитіла. У різних варіантах здійснення анти-ALK-1 антитіла мають повнорозмірну амінокислотну послідовність важкого ланцюга і повнорозмірну амінокислотну послідовність легкого ланцюга, VH і VL амінокислотні послідовності, амінокислотні послідовності CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга і CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга, або амінокислотну послідовність важкого ланцюга від початку CDR1 до кінця CDR3 і амінокислотну послідовність легкого ланцюга від початку CDR1 до кінця CDR3 анти-ALK-1 антитіла, запропонованого в даному описі. Один тип амінокислотної заміни, яку можна здійснювати, являє собою заміну в антитілі одного або більше цистеїнів, які можуть бути хімічно активними, на інший залишок, такий як, без обмежень, аланін або серин. В одному варіанті здійснення існує заміна неканонічного цистеїну. Заміну можна здійснювати в CDR або каркасній ділянки варіабельного домену, або в константному домені антитіла. У деяких варіантах здійснення цистеїн є канонічним. Інший тип амінокислотної заміни, яку можна здійснювати, являє собою видалення можливих протеолітичних центрів в антитілі. Такі центри можуть знаходитися в CDR або каркасній ділянці варіабельного домену або в константному домені антитіла. Заміна залишків цистеїну і видалення протеолітичних центрів можуть зменшити ризик гетерогенності антитільного продукту і, тим самим, підвищити його гомогенність. Інший тип амінокислотної заміни являє собою видалення пар аспарагін-гліцин, які утворюють потенційні центри деза 46 мідування, за допомогою зміни одного або обох залишків. У деяких варіантах здійснення С-кінцевий лізин у важкому ланцюгу анти-ALK-1 антитіла за винаходом є розщепленим. У різних варіантах здійснення винаходу важкий і легкий ланцюги анти-ALK-1 антитіл можуть, за бажанням, містити сигнальну послідовність. В одному з аспектів винахід стосується двадцяти п'яти інгібіторних анти-ALK-1 моноклональних антитіл людини і гібридомних клітинних ліній, які продукують їх. У певних варіантах здійснення антитіла за даним винаходом являють собою IgG, позначені як: 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(М29І); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 і 5.59.1. У переважних варіантах здійснення анти-ALK-1 антитіло людини являє собою антитіло 1.12.1, 1.12.1(M29I/D19A), 1.12.1(M29I), 1.12.1(D19A), 1.27.1, 1.14.1, 1.162.1, 1.31.1,4.62.1 або 4.72.1. Антитіла розпізнають експоновані на поверхні епітопу антигенів як ділянки з лінійною (первинною) послідовністю або структурною (вторинною) послідовністю. ВІАcore використовували для визначення функціонального розташування епітопів і визначення епітопної винятковості анти-ALK-1 антитіл, запропонованих за даним винаходом. У таблиці 1 представлені ідентифікаційні номери послідовностей (SEQ ID NO) нуклеїнових кислот, що кодують повнорозмірні важкі і легкі ланцюги варіантів антитіла 1.12.1 і ділянок, що містять варіабельний домен анти-ALK-1 антитіл за винаходом, а також відповідні виведені амінокислотні послідовності. Таблиця 1 Ідентифікаційні номери послідовностей (SEQ ID NO) Антитіло 1.11.1 1.12.1(M29I/D19А) 1.12.1 1.12.1(rWT) 1.13.1 1.14.1 1.151.1 1.162.1 1.183.1 1.8.1 1.9.1 4.10.1 4.24.1 4.38.1 4.58.1 4.62.1 4.68.1 Повний розмір Важкий Легкий ДНК Білок ДНК Білок 1 95 128 2 100 100 3 101 101 4 102 102 Ділянка, що містить V домен Важкий Легкий ДНК Білок ДНК Білок 9 10 11 12 5 6 7 8 103 104 126 127 129 104 126 127 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 47 94060 48 Продовження таблиці 1 4.72.1 5.13.1 5.34.1 5.53.1 5.56.1 5.57.1 5.59.1 65 69 73 77 81 85 89 66 70 74 78 82 86 90 67 71 75 79 83 87 91 68 72 76 80 84 88 92 1.12.1(M29I/D19A) означає анти-ALK-1 антитіло, що містить специфічну одиничну амінокислотну мутацію у важкому ланцюгу, де метіонін в положенні 29 замінений на ізолейцин, і специфічну одиничну амінокислотну мутацію в легкому ланцюгу, де аспарагінова кислота в положенні 19 замінена на аланін, як описано в прикладі 4. 1.12.1 означає варіант мАТ 1.12.1, виділений з гібридоми. 1.12.1(rWT) означає варіант мАТ 1.12.1, експресоване рекомбінантне мАТ, описане в прикладі 3. Винахід також стосується варіантів важкого і/або легкого ланцюга певних вищеперелічених анти-ALK-1 антитіл людини, що містять одну або більше амінокислотних модифікацій. У позначенні даних варіантів перша літера являє собою однолітерний символ амінокислоти природного ланцюга антитіла, число означає позицію амінокислоти (де позиція "один" являє собою N-кінцеву амінокислоту FR1), і друга літера являє собою однолітерний символ амінокислоти варіанту. У наступних додаткових варіантах здійснення винахід стосується антитіл, що мають амінокислотні послідовності варіабельного домену з більше, ніж 80%, більше, ніж 85%, більше, ніж 90%, більше, ніж 95%, більше, ніж 96%, більше, ніж 97%, більше, ніж 98% або більше, ніж 99% ідентичністю послідовності по відношенню до амінокислотної послідовності варіабельного домену будь-якої з вищеперелічених анти-ALK-1 антитіл людини. Клас і підклас анти-ALK-1 антитіл Клас і підклас анти-ALK-1 антитіл можна визначати будь-яким способом, відомим в даній галузі. В основному, клас і підклас антитіла можна визначати, використовуючи антитіла, які є специфічними для конкретного класу і підкласу антитіла. Такі антитіла є комерційно доступними. Клас і підклас можна визначати з допомогою ELISA, вестерн-блотингу, а також інших методів. Альтернативно, клас і підклас антитіла можна визначати, секвенуючи всі або частини константних доменів важкого і/або легкого ланцюгів антитіл, порівнюючи їх амінокислотні послідовності з відомими амінокислотними послідовностями різних класів і підкласів імуноглобулінів і визначаючи клас і підклас антитіл. Клас антй-ALK-1 антитіла, отриманого як описано вище, можна змінювати на іншій. В одному аспекті винаходу, молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує VL або VH виділяють, застосовуючи способи, добре відомі в даній галузі, так, що вона не містить послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують CL або СН. "Antibody Engineering" (Kontermann & Dubel, Eds., Springer-Verlag, Berlin (2001)). Молекули нуклеїнової кислоти, що кодують VL або VH потім оперативно приєднують до послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує CL або СН, відповідно, з молекули імуноглобулінів іншого класу. Це можна здійснити, використовуючи вектор або молекулу нуклеїнової кислоти, яка являє собою CL або СН ланцюг, як описано вище. Наприклад, клас анти-ALK-1 антитіла, яке спочатку являло собою IgM, можна змінити на IgG. Більш того зміну класу можна застосовувати, щоб перетворити один підклас IgG на іншій, наприклад, з lgG1 в IgG2. Переважний спосіб отримання антитіла за винаходом, що представляє собою потрібний ізотип, включає етапи виділення молекули нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг анти-ALK-1 антитіла і нуклеїнової кислоти, що кодує легкий ланцюг анти-ALK-1 антитіла, отримання варіабельного домену важкого ланцюга, лігування варіабельного домену важкого ланцюга з константним доменом важкого ланцюга потрібного ізотипу, експресування легкого ланцюга і лігованого важкого ланцюга в клітині і збору анти-ALK-1 антитіла потрібного ізотипу. У деяких варіантах здійснення анти-ALK-1 антитіло являє собою моноклональне антитіло. АнтиALK-1 антитіло може являти собою молекулу IgG, IgM, IgE, IgA або IgD. У переважному варіанті здійснення анти-ALK-1 антитіло є IgG і являє собою підклас lgG1, IgG2, IgG3, IgG4. В іншому переважному варіанті здійснення антитіло являє собою підклас IgG2. Ідентифікація епітопів ALK-1, що пізнаються анти-ALK-1 антитілами Винахід стосується анти-ALK-1 моноклонального антитіла людини, яке зв'язує ALK-1 і конкурує або перехресно конкурує з, і/або зв'язує той же епітоп, що і: (а) антитіло, вибране з 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(М29І); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1 і 5.59.1; (b) антитіло, яке містить варіабельний домен важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність VH домену в будь-якій з SEQ ID NO: 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 або 104, (с) антитіло, яке містить варіабельний домен легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність VL домену в будь-якій з SEQ ID NO: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 або 127, і (d) антитіло, яке містить як варіабельний домен важкого ланцю 49 га, як визначено в (b), так і варіабельний домен легкого ланцюга, як визначено в (с). Визначати, чи зв'язує антитіло той самий епітоп або чи конкурує перехресно за зв'язування з анти-ALK-1 антитілом, можна способами, відомими в даній галузі. В одному варіанті здійснення анти-ALK-1 антитілу за винаходом дають зв'язати ALK-1 в умовах насичення і потім вимірюють здатність антитіла, що тестується, зв'язувати ALK-1. Якщо антитіло, що тестується, здатне зв'язувати ALK-1 в той же час, що і анти-ALK-1 антитіло порівняння, значить, антитіло, що тестується, зв'язує інший епітоп, ніж анти-ALK-1 антитіло порівняння. Однак якщо антитіло, що тестується, не здатне зв'язувати ALK-1 в той же час, значить, антитіло, що тестується, зв'язує той же епітоп, епітоп, що перекривається, або епітоп, який знаходиться в безпосередній близькості від епітопу, зв'язаного анти-ALK-1 антитілом за винаходом. Даний експеримент можна провести, використовуючи ELISA, RIA, BIACORE, або проточну цитометрію. Щоб визначити, чи конкурує перехресно анти-ALK-1 антитіло з іншим анти-ALK-1 антитілом, можна застосовувати спосіб конкуренції, описаний вище, в двох напрямах, тобто, визначаючи, чи блокує відоме антитіло антитіло, що тестується, і навпаки. У переважному варіанті здійснення експеримент проводять, використовуючи BIACORE. Афінність зв'язування анти-ALK-1 антитіл з ALK-1 Афінність зв'язування (KD) і константу дисоціації (kOff) анти-ALK-1 антитіла або його антигензв'язувальної ділянки з ALK-1 можна визначати способами, відомими в даній галузі. Афінність зв'язування можна визначати за допомогою варіантів ELISA, RIA, проточної цитометрії або поверхневого плазмонного резонансу, такого як BIACORE. Константу дисоціації можна визначати за допомогою поверхневого плазмонного резонансу. Переважно афінність зв'язування і константу дисоціації вимірюють за допомогою поверхневого плазмонного резонансу. Більш переважно афінність зв'язування і константу дисоціації вимірюють з допомогою BIACORE. Можна визначати, чи має антитіло, в основному, такий же KD, що і антиALK-1 антитіло, використовуючи способи, відомі в даній галузі. Такі способи визначення KD і kOff можна використовувати під час початкової стадії відбору, а також під час подальших стадій оптимізації. Інгібування активності ALK-1 анти-ALK-1 антитілом Анти-ALK-1 моноклональні антитіла, які інгібують зв'язування ALK-1, можна визначати, застосовуючи цілий ряд аналізів. Наприклад, нейтралізуючі анти-ALK-1 антитіла можна визначати за інгібуванням ними підвищеної регуляції специфічного тена-мішені ALK-1 "наступного етапу сигнального шляху", Id1, як описано в прикладі 12. Переважні анти-ALK-1 антитіла мають ІС50 не більшу, ніж 500 нМ, 300 нМ, 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 20 нМ, 10 нМ, або 1 нМ. Можна також визначати здатність анти-ALK-1 антитіла інгібувати фосфорилування Smad1, що визначається з допомогою вестерн-блотингу з ви 94060 50 користанням інфрачервоної системи зображення Odyssey, як описано в прикладі 13. У різних варіантах здійснення анти-ALK-1 антитіло має ІС50 в даному аналізі не більшою, ніж 250 нМ, 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 20 нМ, 10 нМ, або 1 нМ. Інгібування ангіогднезу анги-ALK-1 антитілом В іншому варіанті здійснення анти-ALK-1 антитіло або його ділянка інгібує ангіогенез людських судин, як показано на миші SCID з прищепленою тканиною крайньої плоті людини, в яку внутрішньошкірно імплантували пухлинні клітини меланоми M24met людини, як визначали ІГХ аналізом тесту на CD-31 сигнал людини щонайменше на 40%, в порівнянні з контрольним зразком, як описано в прикладі 17 і представлено в таблиці 13. В іншому варіанті здійснення анти-ALK-1 антитіло або його ділянка інгібує ангіогенез людських судин, як показано на миші SCID з прищепленою тканиною крайньої плоті людини, в яку внутрішньошкірно імплантували колаген, як визначали ІГХ аналізом тесту на CD-31 сигнал людини щонайменше на 50%, в порівнянні з контрольним зразком, як описано в прикладі 16 і представлено в таблиці 12. Видова і молекулярна вибірковість В іншому аспекті винаходу анти-ALK-1 антитіла виявляють як видову, так і молекулярну вибірковість. Дотримуючись ідей даного опису, можна визначати видову або молекулярну вибірковість анти-ALK-1 антитіла, застосовуючи способи, добре відомі в даній галузі. Наприклад, можна визначати видову вибірковість, використовуючи вестернблотинг, поверхневий плазмонний резонанс, наприклад, BIAcore, ELISA, імунопреципітацію або RIA. У деяких варіантах здійснення анти-ALK-1 антитіло зв'язує ALK-1 приматів з KD, яка є щонайменше в два рази менша, ніж його KD для ALK-1 гризунів. У додатковому варіанті здійснення KD для ALK-1 приматів є щонайменше в 3 рази, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 100 разів, щонайменше в 200 разів, щонайменше в 500 разів або щонайменше в 1000 меншою, ніж його KD для ALK-1 гризунів, як визначали проточною цитометрією. В інших варіантах здійснення анти-ALK-1 антитіло має вибірковість для ALK-1 більшу, ніж для ALK-2 аж до ALK-7. У деяких варіантах здійснення анти-ALK-1 антитіло не виявляє будь-якого відчутного специфічного зв'язування з будь-яким іншим білком, крім ALK-1. Переважно, анти-ALK-1 антитіло зв'язує ECD ALK-1 людини. Способи отримання антитіл і продукуючі антитіло клітинні лінії Імуноген ALK-1 У деяких варіантах здійснення імуноген ALK-1, або антиген, являє собою виділену і/або очищену ALK-1. У переважних варіантах здійснення імуноген ALK-1 являє собою ALK-1 людини. У переважних варіантах здійснення імуноген ALK-1 являє собою ECD ALK-1 людини. ALK-1 людини, або її антигенні ділянки можна отримувати способами, добре відомими фахівцям в даній галузі, або можна придбати у комерційних постачальників. Амінокислотна і нуклеотидна послідовності ALK-1 люди 51 ни є відомими (дивись, наприклад, інвентарний номер реєстру Genbank L17075). Ген ACVRL1, що кодує повнорозмірну ALK-1, є комерційно доступним у Invitrogen Inc., ID клону IOН21048. Наприклад, R&D Systems, Inc. продає рекомбінантну химеру ALK-1/Fc людини (кат. № 370-AL), отриману за допомогою експресії в клітинній лінії мишачої мієломи послідовності ДНК, що кодує амінокислотні залишки 1-118 ECD ALK-1, де послідовність ДНК була злита з послідовністю ДНК, що кодує Fc фрагмент IgG людини через послідовність ДНК, що кодує поліпептидний лінкер. Рекомбінантна зріла химера ALK-1/Fc людини являє собою дисульфідно-зв'язаний гомодимерний білок, що має Asp 22 на аміно-кінці. Крім того, в прикладі 1 описують отримання ALK-1 ECD His-Tag білка, який використовували для отримання гібридом, що продукують анти-ALK-1 антитіла за даним винаходом. В інших варіантах здійснення антиген ALK-1 являє собою клітину, яка експресує або надмірно експресує ALK-1. В інших варіантах здійснення антиген ALK-1 являє собою рекомбінантний білок, що експресується в дріжджах, клітинах комах, бактеріях, таких як Е. coli, або інших джерелах за допомогою рекомбінантних методів. Імунізація У деяких варіантах здійснення людські антитіла отримують імунізацією антигеном ALK-1 трансгeнної тварини, що не є людиною, яка містить в своєму геномі деякі або всі локуси важкого ланцюга і легкого ланцюга імуноглобуліну людини. У переважному варіанті здійснення твариною, що не належить до людського роду, є тварина XENOMOUSE. (Abgenix, Inc., Fremont, CA). Миші XENOMOUSE являють собою штучно створені лінії мишей, які містять великі фрагменти локусів важкого ланцюга і легкого ланцюга імуноглобуліну людини, і в яких порушена продукція мишачих антитіл. Дивись, наприклад, Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994) і патенти США 5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598, 6130364, 6162963 і 6150584. Дивись також WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560, і WO 00/037504. В іншому аспекті винахід стосується способу отримання анти-ALK-1 антитіл з відмінних від мишей тварин, що не належать до людського роду, за допомогою імунізації антигеном ALK-1 трансгенної тварини, що не є людиною, яка містить локуси імуноглобуліну людини. Таких тварин можна створювати із застосуванням способів, описаних у вищезгаданих документах. Способи, описані в даних документах можна модифікувати, як описано в патенті США 5994619, який наведении в даному описі як посилання. Патент США 5994619 описує способи отримання нових клітин і клітинних ліній з культивованою внутрішньою клітинною масою (СІСМ), отриманих від свиней і корів, а також трансгенних клітин СІСМ, в які вставили гетерологічну ДНК. Трансгенні клітини СІСМ можна використовувати для отримання клонованих трансгенних ембріонів, плодів і потомства. У патенті '619 також 94060 52 описують способи отримання трансгенних тварин, які здатні передавати гетерологічну ДНК своєму потомству. У переважних варіантах здійснення даного винаходу тварини, що не належать до людського роду, являють собою ссавців, зокрема, щурів, овець, свиней, кіз, велику рогату худобу, коней або курей. Миші XENOMOUSE продукують репертуар повністю антитіл людини, що відповідає дорослій людині, і виробляють антиген-специфічні антитіла людини. У деяких варіантах здійснення миші XENOMOUSE містять приблизно 80% V-генного репертуару антитіл людини внаслідок введення мегабазних гаметичної конфігурації фрагментів локусів важкого ланцюга і локусів легкого каппаланцюга людини в дріжджову штучну хромосому (YAC). В інших варіантах здійснення миші XENOMOUSE також містять приблизно всі локуси легкого лямбда-ланцюга людини. Дивись Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green and Jakobovits, J. Exp. Med. 18%: 483-495 (1998), і WO 98/24893, опис яких наведений як посилання. У деяких варіантах здійснення тварини, що не належать до людського роду, що мають, генами імуноглобулінів людини, являють собою тварин, які мають "мінілокус" імуноглобуліну людини. При "мінілокусному" підході екзогенний локус Ig імітують за допомогою включення окремих генів з локусу Ig. Таким чином, один або більше генів VH, один або більше генів DH, один або більше генів JH, константний домен мю і другий константний домен (переважно константний домен гамма) вставляють в конструкт для введення тварині. Даний підхід описаний, в числі іншого, в патентах США №№ 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5591669, 5612205, 5721367, 5789215 і 5643763, наведених в даному описі як посилання. В іншому аспекті винахід стосується способу отримання гуманізованих анти-ALK-1 антитіл. У деяких варіантах здійснення тварин, що не належать до людського роду, імунізують антигеном ALK-1, як описано нижче, в умовах, які роблять можливим продукцію антитіл. Клітини, що продукують антитіла, виділяють з тварин і нуклеїнові кислоти, що кодують важкий і легкий ланцюги анти-ALK-1 антитіла, що представляє інтерес, виділяють з виділених клітин, що продукують антитіла, або з іморталізованої клітинної лінії, отриманої з таких клітин. Дані нуклеїнові, кислоти потім конструюють, застосовуючи методи, відомі фахівцям в даній галузі, і як також описано нижче, щоб зменшити кількість послідовності, що не стосується людини, тобто, щоб гуманізувати антитіло для зниження імунної відповіді у людей. Імунізувати тварин можна будь-яким способом, відомим в даній галузі. Дивись, наприклад, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Способи імунізації тварин, що не належать до людського роду, таких які миші, щури, вівці, кози, свині, велика рогата худоба і коні, добре відомі в даній галузі. Дивись, наприклад, Harlow and Lane, вище, а також патент США 5994619. У переважному варіанті 53 здійснення антиген ALK-1 вводять з ад'ювантом для стимулювання імунної відповіді. Типові ад'юванти включають повний або неповний ад'ювант Фрейнда, RIBI (мурамілдипептиди) або ISCOM (імуностимулюючі комплекси). Подібні ад'юванти можуть захистити поліпептид від швидкого поширення, ізолюючи його в локальному депо, або вони можуть містити речовини, які стимулюють хазяїна секретувати фактори, що є хемотоксичними для макрофагів і інших компонентів імунної системи. Переважно, якщо вводять поліпептид, схема імунізації включає два або більше введень поліпептиду протягом декількох тижнів. У прикладі 2 пояснюють спосіб отримання анти-ALK-1 моноклональних антитіл в мишах XENOMOUSE. Отримання антитіл і продукуючих антитіла клітинних ліній Після імунізації тварини антигеном ALK-1, від даної тварини можна отримувати антитіла і/або продукуючі антитіла клітинні лінії. У деяких варіантах здійснення сироватку, що містить анти-ALK-1 антитіла, отримували від тварини шляхом відбору крові або забою даної тварини. Сироватку можна застосовувати в тому вигляді, в якому її отримали від тварини, можна отримувати з сироватки імуноглобулінову фракцію або з сироватки можна очищувати анти-ALK-1 антитіла. У деяких варіантах здійснення з клітин, виділених з імунізованої тварини, отримували продукуючі антитіла клітинні лінії. Після імунізації тварину забивали і В-клітини з лімфатичних вузлів і/або селезінки іморталізували способами, відомими в даній галузі. Способи іморталізували клітин включають, але не обмежуються їх трансфекцією онкогенами, їх інфікуванням онкогенними вірусами і їх культивуванням в умовах, вибіркових для іморталізованих клітин, впливом на них канцерогенних або мутагенних сполук, гібридизацією їх з іморталізованими клітинами, наприклад, з мієломними клітинами, і інактивацією гена-супресору пухлин. Дивись, наприклад, вище: Harlow and Lane. Якщо застосовують злиття з мієломними клітинами, переважно, щоб мієломні клітини не секретували імуноглобулінові поліпептиди (несекретуюча клітинна лінія). Скринінг іморталізованих клітин проводили з допомогою ALK-1 або її фрагмента. У переважному варіанті здійснення первинний скринінг проводили за допомогою імуноферментного аналізу (ELISA) або радіоімунного аналізу. Приклад скринінгу за допомогою ELISA наведений в WO 00/37504, наведеному в даному описі як посилання. Клітини, що продукують анти-ALK-1 антитіла, наприклад гібридоми, вибирали, клонували і потім проводили скринінг на наявність бажаних характеристик, включаючи стійкий ріст, високу продукцію антитіл і бажані характеристики антитіл, як додатково обговорюють нижче. Гібридоми можна нарощувати in vivo у сингенних тварин, у тварин, в яких відсутня імунна система, наприклад, у голих мишах, або клітинних культурах in vitro. Способи селекції, клонування і нарощування гібридом добре відомі фахівцям в даній галузі. У переважному варіанті здійснення імунізованою твариною є тварина, що не є людиною, яка 94060 54 експресує гени імуноглобулінів людини, і селезінкові В-клітини зливають з лінією мієломних клітин того ж біологічного вигляду, що і тварина, що не є людиною. У більш переважному варіанті здійснення імунізованою твариною є миша XENOMOUSE, а лінія мієломних клітин являє собою несекретуючу мієлому мишей. У ще більш переважному варіанті здійснення лінія мієломних клітин є P3-X63Ag8.653 (Американська колекція типових культур). Дивись, наприклад, Приклад 2. Таким чином, в одному варіанті здійснення винахід стосується способів отримання клітинної лінії, яка продукує моноклональне антитіло людини або його фрагмент, направлене проти ALK-1, що включає: а) імунізацію описаної в даному описі трансгенної тварини, що не є людиною, ALK-1, частиною ALK-1, або клітинами або тканиною, що експресує ALK-1; (b) надання трансгенній тварині можливості нарощувати імунну відповідь до ALK-1; (с) виділення з трансгенної тварини клітин, що продукують антитіла; (d) іморталізацію клітин, що продукують антитіла; (e) створення індивідуальних моноклональних популяцій іморталізованих клітин, що продукують антитіла і (f) скринінг іморталізованих клітин, що продукують антитіла, для виявлення антитіла, направленого проти ALK-1. В іншому аспекті винахід стосується клітинної лінії, яка продукує анти-ALK-1 антитіло людини. У деяких варіантах здійснення клітинна лінія є гібридомною клітинною лінією. У деяких варіантах здійснення гібридоми являють собою гібридоми миші, як описано вище. В інших варіантах здійснення гібридоми виготовляють у відмінних від людини і миші біологічних видах, таких як щури, вівці, свині, кози, корови або коні. В іншому варіанті здійснення гібридоми є гібридомами людини. В іншому варіанті здійснення трансгенну тварину імунізують антигеном ALK-1, первинні клітини, наприклад, В-клітини селезінки або периферичної крові виділяють з імунізованої трансгенної тварини і визначають індивідуальні клітини, що продукують антитіла, специфічні для бажаного антигену. Виділяють поліаденіловану мРНК з кожної індивідуальної клітини і проводять полімеразну ланцюгову реакцію із зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР) (RT-PCR), використовуючи смислові праймери, які комплементарні послідовностям варіабельного домену, наприклад, вироджені праймери, що розпізнають гени більшості або всіх FR1 ділянок варіабельних доменів важкого і легкого ланцюга людини і антисмислових праймерів, які комплементарні послідовностям константної або зв'язуючої ділянки. Потім, кДНК варіабельних доменів важкого і легкого ланцюга клонують і експресують в будь-якій відповідній клітині-хазяїні, наприклад, мієломній клітині, у вигляді химерних антитіл з відповідними константними ділянками імуноглобулінів, такими як константні домени важкого ланцюга і  або  ланцюга. Дивись Babcook, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Set USA 93:7843-48, 1996, наведену в даному описі як посилання. Анти-ALK-1 антитіла потім можна визначати і виділяти, як описано в даному описі. В іншому варіанті здійснення можна застосовувати методи фагового дисплею, щоб отримати 55 бібліотеки, що містять репертуар антитіл з різними афінностями до ALK-1. Для отримання подібних репертуарів немає необхідності іморталізувати Вклітини від імунізованої тварини. Точніше, первинні В-клітини можна використрвувати безпосередньо як джерело ДНК. Суміш кДНК з В-клітин, наприклад, отриманих з селезінок, застосовують для отримання експресуючої бібліотеки, наприклад, бібліотеки фагового дисплею, трансфекованої в Е.coli. Отримані клітини тестують на імунореактивність до ALK-1. Способи визначення високоафінних людських антитіл з таких бібліотек описані Griffiths et al., EMBO J., 13: 3245-3260 (1994); Nissim et al., там же, стор. 692-698 і Griffiths et al., там же, 12: 725-734, які наведені в даному описі як посилання. Зрештою, визначають клони з бібліотеки, які мають афінності зв'язування антигену бажаної величини, і ДНК, що кодує продукт, відповідальний за таке зв'язування, відновлюють і готують для стандартної рекомбінантної експресії. Бібліотеки фагових дисплеїв також можна створювати за допомогою заздалегідь підготовлених нуклеотидних послідовностей і провести скринінг схожим чином. Загалом, кДНК, що кодують важкий і легкий ланцюги, постачають незалежно або зв'язують для отримання Fv аналогів для виробництва в фаговій бібліотеці. Потім проводять скринінг фагових бібліотек на антитіла з найбільшими афінностями для ALK-1, і з відповідного клону відновлюють генетичний матеріал. Подальші раунди скринінгу можуть збільшити афінність виділених оригінальних антитіл. Нуклеїнові кислоти, вектори, клітина-хазяїні і рекомбінантні способи отримання антитіл Нуклеїнові кислоти Даний винахід також охоплює молекули нуклеїнової кислоти, що кодують анти-ALK-1 антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти. У деяких варіантах здійснення різні молекули нуклеїнової кислоти кодують важкий ланцюг і легкий ланцюг анти-ALK-1 імуноглобуліну. В інших варіантах здійснення одна і та ж молекула нуклеїнової кислоти кодує важкий ланцюг і легкий ланцюг антиALK-1 імуноглобуліну. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельний домен легкого ланцюга (Vl), використовує А27, А2, А1, A3, B3, В2, L1 або L2 V ген людини, а також J5, J1, J3 або J4 ген людини. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти використовує А27 V ген людини і J5 ген людини. В інших варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти використовує А2 ген людини і J1 ген людини. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти, що кодує легкий ланцюг, кодує амінокислотну послідовність, що містить 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 замін відносно гаметичної амінокислотної послідовності(тей). У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність VL, що містить 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 консервативних амінокислотних замін і/або 1, 2 або 3 неконсервативні заміни в порівнянні з гаметичними VL і JK послідовностями. Заміни можуть бути в CDR 94060 56 ділянках, каркасних ділянках або в константному домені. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти кодує амінокислотну прслідовність VL, що містить одну або більше мутацій відносно гаметичної послідовності, які ідентичні мутаціям відносно гаметичної послідовності, виявленим в VL будь-якого з антитіл: 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; або 5.59.1. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти кодує щонайменше три амінокислотні заміни в порівнянні з гаметичною послідовністю, які ідентичні мутаціям відносно гаметичної послідовності, виявленим в VL будь-якого з антитіл: 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; або 5.59.1. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91 або 126, яка кодує амінокислотну послідовність VL моноклонального антитіла 1.12.1(M29I/D19A), 1.11.1, 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 5.59.1 або 1.12.1. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність однієї з SEQ ID NO: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 або 127. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну поєлідовність SEQ ID NO: 3 або її частини. У деяких варіантах здійснення нуклеїнова кислота кодує амінокислотну послідовність легкого ланцюга одного, двох або всіх трьох CDR вказаного антитіла. У деяких варіантах здійснення вказана частина кодує прилеглу ділянка від CDR1-CDR3 легкого ланцюга антиАLK-1 антитіла. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти кодує амінокислотну послідовність VL, яка є щонайменше на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% або 99% ідентичною амінокислотній послідовності VL будь-якого з антитіл 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; або 5.59.1, або амінокислотної послідовності VL ділянки SEQ ID NO: 4. Молекули нуклеїнових кислот за винаходом включають нуклеїнові кислоти, які гібридизуються в надто жорстких умовах, такі як ті, що описані вище, або які є щонайменше на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% або 99% ідентичними нуклеїновій кислоті, що кодує амінокислотну пос 57 лідовність VL ділянки SEQ ID NO: 8; 12; 16; 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48; 52; 56; 60; 64; 68; 72; 76; 80; 84; 88; 92 або 126, або нуклеїновій кислоті, що містить нуклеотидну послідовність VL ділянки SEQ ID NO: 4. В інших переважних варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти кодує варіабельний домен важкого ланцюга (VH), який використовує генні послідовності VH 4-31, VH 3-11, VH 3-15, VH 333, VH 4-61 або VH 4-59 людини, або послідовність, що походить від вказаних. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти використовує VH 4-31 ген людини, DH6-19 ген і JH4B ген людини. У деяких· варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти кодує амінокислотну послідовність, що містить 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або 11 мутацій в порівнянні з гаметичною амінокислотною послідовністю V, D, або J ген людини. У деяких варіантах здійснення вказані мутації знаходяться в VH ділянці. У деяких варіантах здійснення вказані мутації знаходяться в CDR ділянках. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти кодує послідовність VH, що містить одну або більше амінокислотних мутацій в порівнянні з гаметичною VH послідовністю, які ідентичні амінокислотним мутаціям, виявленим в VH будь-якого з моноклональних антитіл 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); U2.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; або 5.59.1. У деяких варіантах здійснення нуклеїнова кислота кодує щонайменше три амінокислотні мутації в порівнянні з гаметичними послідовностями, які ідентичні щонайменше трьом амінокислотним мутаціям, виявленим в одному з вищеперелічених моноклональних антитіл. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 5, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, або 103, яка кодує амінокислотну послідовність VH моноклонального антитіла 1.12.1(M29I/D19A); 1.11.1; 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; 5.59.1 або 1.12.1. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність однієї з SEQ ID NO: 2; 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 або 104. У різних переважних варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти містить щонайменше частину нуклеотидної послідовності SEQ ID NO: 1 або 95. У деяких варіантах здійснення вказана частина кодує VH ділянку, CDR3 ділянка, всі три CDR ділянки або дотична ділянка, що включає CDR1-CDR3. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти кодує амінокислотну послідовність VH, яка є щонайменше на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% або 99% ідентичних 94060 58 амінокислотних послідовності VH будь-якій з SEQ ID ΝO: 2; 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90 або 104. Молекули нуклеїнової кислоти за винаходом включають нуклеїнові кислоти, які гібридизуються в надто жорстких умовах, такі як ті, що описані вище, або які є щонайменше на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% або 99% ідентичними нуклеїновій кислоті, що кодує амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2; 6; 10; 14; 18; 22; 26; 30; 34; 38; 42; 46; 50; 54; 58; 62; 66; 70; 74; 78; 82; 86; 90, 100 або 104, або її VH ділянки, або нуклеїновій кислоті, що містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 95, 103, 128, або 129, або нуклеотидні послідовності, які кодують її VH ділянку. В іншому варіанті здійснення нуклеїнова кислота кодує повнорозмірний важкий ланцюг антитіла, вибраного з групи, яка складається з 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(М29І/О19А); 1.12.1(М29І); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; і 5.59.1, або важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2. Крім того, нуклеїнова кислота може містити нуклеотидну послідовність SEQ ID NO: 1 або 95. Молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує важкий або легкий ланцюг анти-ALK-1 антитіла або його ділянок, можна виділяти з будь-якого джерела, що продукує таке антитіло. У різних варіантах здійснення молекули нуклеїнової кислоти виділяють з В-клітини, що експресує анти-ALK-1 антитіло, виділеної з тварини, імунізованої ALK-1, або з іморталізованої клітини, що походить з такої Вклітини. Способи виділення нуклеїнових кислот, що кодують антитіло, добре відомі в даній галузі. Дивись, наприклад, Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, мРНК можна виділяти і використовувати, щоб отримувати кДНК для використання в полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР) або кДНКклонування генів антитіл. У переважному варіанті здійснення молекулу нуклеїнової кислоти виділяють з гібридоми, яка як один з її партнерів злиття має клітину трансгенної тварини, що не є людиною, де клітина продукує імуноглобулін людини. У ще більш переважному варіанті здійснення клітину, що продукує імуноглобулін людини, виділяють з тварини XENOMOUSE. В іншому варіанті здійснення клітину, що продукує імуноглобулін людини, виділяють з трансгенної тварини, що не є людиною, відмінною від миші, як описано вище. В іншому варіанті здійснення нуклеїнову кислоту виділяють з не-трансгенної тварини, що не є людиною. Молекули нуклеїнової кислоти, виділені з не-трансгенної тварини, що не є людиною, можна використовувати, наприклад, для гуманізованих антитіл, які містять одну або більше амінокислотних послідовностей анти-ALK-1 антитіла людини за даним винаходом. 59 У деяких варіантах здійснення нуклеїнова кислота, що кодує важкий ланцюг анти-ALK-1 антитіла за винаходом, може містити нуклеотидну послідовність, що кодує VH домен за винаходом, приєднану в тій же рамці зчитування до нуклеотидної послідовності, що кодує константний домен важкого ланцюга з будь-якого джерела. Схожим чином, молекула нуклеїнової кислоти, що кодує легкий ланцюг анти-ALK-1 антитіла за винаходом, може містити нуклеотидну послідовність, що кодує VL домен за винаходом, приєднану в тій же рамці зчитування до нуклеотидом послідовності, що кодує константний домен легкого ланцюга з будьякого джерела. У додатковому аспекті даного винаходу молекули нуклеїнової кислоти, що кодують варіабельний домен важкого (VH) і/або легкого (VL) ланцюгів "перетворюють" на повнорозмірні гени антитіла. В одному варіанті здійснення молекули нуклеїнової кислоти, що кодують VH або VL домени, перетворюють на повнорозмірні гени антитіла шляхом вставки в експресуючий вектор, що вже кодує константний домен важкого ланцюга (СН), або константний домен легкого ланцюга (CL), відповідно, таким чином що VH сегмент є функціонально зв'язаним з СН сегментом(ами) всередині вектора, і/або VL сегмент є функціонально зв'язаним з CL сегментом всередині вектора. В іншому варіанті здійснення молекули нуклеїнової кислоти, що кодують VH і/або VL домени, перетворюють на повнорозмірні гени антитіла шляхом приєднання, наприклад, лігування, молекули нуклеїнової кислоти, що кодує VH і/або VL домени до молекули нуклеїнової кислоти, що кодує СН і/або CL домен за допомогою стандартних методів молекулярної біології. Послідовності нуклеїнової кислоти генів константних доменів важкого і легкого ланцюга імуноглобулінів людини відомі фахівцям. Дивись, наприклад, Kabat et. al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. No. 913242, 1991. Молекули нуклеїнових кислот, що кодують повнорозмірні віажкі і/або легкі ланцюги, можна потім експресувати в клітині, в яку їх ввели, і виділяти анти-ALK-1 антитіла. Молекули нуклеїнових кислот можна застосовувати для рекомбінантної експресії великих кількостей анти-ALK-1 антитіл. Молекули нуклеїнових кислот також можна зартосовувати для отримання химерних антитіл, біспецифічних антитіл, одноланцюжковйх антитіл, імуноадгезинів, димерів, мутантних антитіл і похідних антитіл, як описано нижче. Якщо молекули нуклеїнової кислоти походять від нетрансгенної тварини, що не є людиною, то молекули нуклеїнової кислоти можна застосовувати для гуманізації антитіл, так само, як описано нижче. В іншому варіанті здійснення молекулу нуклеїнової кислоти за винаходом застосовують як пробу або ПЛР-праймер для специфічної послідовності антитіла. Наприклад, нуклеїнову кислоту можна використовувати як пробу в діагностичних способах або як ПЛР-праймер для ампліфікації ділянок ДНК, які можна використовувати, крім іншого, для виділення додаткових молекул нуклеїнової кислоти, що кодують варіабельні домени анти-ALK-1 94060 60 антитіл. У деяких варіантах здійснення молекули нуклеїнової кислоти є олігонуклеотидами. У деяких варіантах здійснення олігонуклеотиди походять з високоваріабельних доменів важкого і легкого ланцюгів антитіла, що представляє інтерес. У деяких варіантах здійснення олігонуклеотиди кодують всі або частину однієї або більше CDR антитіл 1.11.1; 1.12.1; 1.12.1(rWT); 1.12.1(M29I/D19A); 1.12.1(M29I); 1.12.1(D19A); 1.13.1; 1.14.1; 1.151.1; 1.162.1; 1.183.1; 1.27.1; 1.29.1; 1.31.1; 1.8.1; 1.9.1; 4.10.1; 4.24.1; 4.38.1; 4.58.1; 4.62.1; 4.68.1; 4.72.1; 5.13.1; 5.34.1; 5.53.1; 5.56.1; 5.57.1; або 5.59.1, або їх варіанти, як описано в даному описі. Вектори Даний винахід стосується векторів, що містять молекули нуклеїнової кислоти, які кодують важкий ланцюг анти-ALK-1 антитіла за винаходом або їх антигензв'язувальну ділянку. Даний винахід також стосується векторів, що містять молекули нуклеїнової кислоти, які кодують легкий ланцюг таких антитіл або їх антигензв'язувальну ділянку. Винахід також стосується векторів, що містять молекули нуклеїнової кислоти, що кодують злиті білки, модифіковані антитіла, фрагменти антитіл і їх зонди. У деяких варіантах здійснення анти-ALK-1 антитіла за винаходом або антигензв'язувальні ділянки експресують шляхом вставки ДНК, що кодують часткову або повнорозмірні легкий і важкий ланцюги, отримані як вказано вище, в експресуючі вектори таким чином, що дані гени є функціонально зв'язаними з необхідними послідовностями контролю експресії, такими як послідовності контролю транскрипції і трансляції. Експресуючі вектори включають плазміди, ретровіруси, аденовіруси, аденоасоційовані віруси (AAV), віруси рослин, такі як вірус мозаїки кольорової капусти, вірус тютюнової мозаїки, косміди, YAC, епісоми, отримані з EBV, і тому подібне. Ген антитіла лігують у вектор таким чином, що послідовності контролю транскрипції і трансляції всередині вектора виконують призначену функцію регулювання транскрипції і трансляції гена антитіла. Експресуючий вектор і послідовності контролю експресії вибирають так, щоб вони були сумісними з тією кліткою-хазяїном, що використовується для експресії. Ген легкого ланцюга антитіла і ген важкого ланцюга антитіла можна вставляти в окремі вектори. У переважному варіанті здійснення обидва гени вставляють в один і той же експресуючий вектор. Гени антитіла вставляють в експресуючий вектор стандартними способами (наприклад, лігування комплементарних сайтів рестрикції на фрагменті гена антитіла і вектора, або лігування за тупими кінцями, якщо відсутні сайти рестрикції). Придатним вектором є такий, що кодує функціонально повну послідовність СН або CL імуноглобуліну людини з відповідними сайтами рестрикції, сконструйованими так, щоб будь-яку послідовність VH або VL можна було легко вставити і експресувати, як описано вище. У таких векторах звичайно відбувається сплайсинг між донорним сайтом сплайсингу у J ділянки, що вбудовується, і акцепторним сайтом сплайсингу, попереднім домену С людини, а також за сайтами сплайсингу, які існу